CN1452617A - 酸敏感化合物、其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

含有至少一个亲水取代基和酸敏感环状原酸酯的新的酸敏感化合物及其盐。这些化合物包括至少一个亲水取代基和酸敏感环状原酸酯。这些化合物可用于与生物活性物质形成偶联物(脂质体、复合物、纳颗粒等)并将生物活性物质释放在pH为酸性的细胞组织或区室中，这些化合物或者作为非离子表面活性剂用于稳定包封生物活性物质的颗粒并随后在酸性介质中使其去稳定，或者，作为共价连接治疗性分子的载体，将治疗性分子释放到pH为酸性的细胞组织或区室中。

Description

酸敏感化合物、其制备方法和用途
本发明涉及酸敏感化合物及其制备方法。这些化合物包括至少一个亲水取代基和酸敏感环状原酸酯。这些化合物可用于与生物活性物质形成偶联物(脂质体、复合物、纳米颗粒等)并将生物活性物质释放在pH为酸性的细胞组织或区室中，这些化合物或者作为非离子表面活性剂用于稳定包封生物活性物质的颗粒并随后在酸性介质中使其去稳定，或者，作为共价连接治疗性分子的载体，将治疗性分子释放到pH为酸性的细胞组织或区室中。
将生物活性物质释放到相对于生理正常酸度而言酸度增加的组织或细胞中是已知的难题，并是众多研究的主题，但至今还没有完全令人满意的结果。因此，设计出了许多pH-敏感脂质体，利用特定组织或核内体的酸化作用来释放生物活性物质。
例如，Yatvin等人(Science，Vol.210，1980，pp.1253-4)设计出了能够插入到常规脂质体的脂质双分子层中的下式pH-敏感脂质：
存在于该脂质中的高半胱氨酸是pH中性或碱性的开环式高半胱氨酸，此时，它与完全插入到脂质体双分子层中的脂肪酸相似。在该pH值下，其以闭环式存在：其随后形成环状硫代内酯，从而与使脂质体双分子层去稳定并进而释放出活性物质的中性脂质相类似。该分子能使药用分子在pH低于生理pH的身体部位(例如，原发性瘤、转移瘤或者发炎或感染部位)释放。
US5965434提出了含有下式阳离子pH-敏感亲水部分的两性脂质：其中R1和R2独立地表示CH3(CH2)14、CH3(CH2)12、CH3(CH2)7CHCH(CH2)7，R3表示取代基1-甲基咪唑、咪唑、4，9-二氧代-1，12-十二烷二胺、半胱胺、1-(3-氨基丙基)咪唑、吗啉、4-氨基吡啶、吡啶、胍、肼、硫脲鎓盐或哌嗪。
这些化合物具有下述特性：当pH从8.0降至4.5时，这些化合物总体所带正电荷(在化合物R3位置上)增加。这种电荷变化导致脂质体构型转换，从而释放其内含物。因此，这些脂质能使药用分子或核酸释放到pH至多为4.5的酸性介质中。
此外，WO97/31624提出了含有可以在细胞质中降解的乙烯基醚官能的pH敏感磷脂(“可触发(triggerable)脂质”)，其具有下列通式：
Figure A0181520000072
其中p和q是0或1，p和q中的至少一个为1，R1和R2独立地表示具有12-24个碳原子的烷基或烯烃，R选自2-氨基乙基、2-(三甲基氨基)-乙基、2-(N，N-二甲基氨基)乙基、2-(三甲基铵)乙基、2-羧基-2-氨基乙基、琥珀酰氨基乙基或肌醇基(inosityl)。
这些磷脂与自身与细胞受体配体复合的其它磷脂混合，形成能够在酸性pH下进行构型转换的的脂质体。这种脂质体能够包封许多治疗性物质和包封用于基因疗法的核酸。
还公开过另一种方法(Kratz等人，Crit.Rev.Ther. Drug CarrierSyst.1999，16(3)，pp.245-88)，其中，治疗性分子通过酸敏感键共价连接到聚合物上，以确保治疗性分子在聚合共轭物细胞内在化后释放到弱酸性瘤组织中或释放到核内体和溶菌体中。为此，公开了许多适用的键，例如，缩醛、二硫化物、腙、顺-aconitrile、三苯甲基或硅烷基化醚键。
然而，至今开发出的所有pH-敏感化合物的缺点是其敏感度不可调节。因此，拥有如下酸不稳定化合物将是特别有利的，所述酸不稳定化合物的敏感度能够根据，例如，靶组织或细胞、待释放生物活性物质或预计的用途进行调节。更一般地说，拥有易于制备并且尤其对核酸转染有效的新pH-敏感化合物是有利的。
为了解决上述难题，本申请人开发了一系列新的酸敏感化合物，其特征在于，所述化合物含有环状原酸酯和至少一个亲水取代基，所述亲水取代基选自聚亚烷基二醇、单或多糖、亲水治疗性分子或多胺类基团。
借助酸敏感环状原酸酯功能，所述化合物可用于生物活性物质的载体化和使生物活性物质释放到身体酸性部位。本发明化合物是极其有利的，因为这些化合物的pH-敏感度可以根据中心碳原子上的取代基和原酸酯环的大小进行调节。因此，这些化合物的水解动力学可以变化很大，从而可以调节释放生物活性物质所需的时间。此外，本发明酸敏感化合物具有另一个优点，即，其在酸性介质中以自动催化方式发生降解。实际上，本发明酸敏感化合物的部分降解导致酸逐渐释放(例如，当起始化合物衍生自原甲酸酯时，释放的酸为甲酸，或者，当起始化合物衍生自原乙酸酯时，释放的酸为乙酸，或者，当起始化合物衍生自原苯甲酸酯时，释放的酸为苯甲酸)，从而引起pH值下降，更进一步促进了化合物降解。
更具体地讲，本发明酸敏感化合物具有下列通式：其中：·  g是可以为0、1、2、3或4的整数，·  G表示氢原子、含有1-6个碳原子的饱和或不饱和的直链或支链烷基或表示芳基，·  G1和G2表示：(a)其中一个为选自多胺类基团的亲水取代基，另一个为选自单链或双链烷基、甾类衍生物或疏水树状聚合物的疏水取代基，或者(b)其中一个为含有10-24个碳原子并任选含有一个或多个不饱和部分的疏水直链烷基，另一个为下列通式所示的基团：其中i是包含端点在内的1-4的整数，j是包含端点在内的9-23的整数，并且亲水取代基选自多胺类基团，或者(c)其中一个为选自聚亚烷基二醇或者单或多糖的亲水取代基，另一个为选自聚亚烷基亚胺的取代基，或者(d)其中一个为选自聚亚烷基二醇或者单或多糖的亲水取代基，另一个为疏水取代基，其选自单链或双链烷基、甾类衍生物、疏水树状聚合物或选自单链或双链烷基、甾类衍生物或疏水树状聚合物和具有1-20个单体单元的聚亚烷基二醇分子之间的共价共轭物，或者(e)其中一个为选自聚亚烷基二醇或者单或多糖的亲水取代基，另一个为治疗性分子，或者(f)其中一个为具有亲水特性的治疗性分子，另一个为选自单链或双链烷基、甾类衍生物或疏水树状聚合物的疏水取代基。
选择原酸酯中心碳原子上的取代基G，以调节本发明酸敏感化合物的敏感度。基团G越是给电子，则化合物酸敏感性越高，而基团G越是吸电子，则化合物的酸敏感性越低。因此，看来基团G的选择对于确定和调节通式(I)酸敏感化合物的特性尤为重要。根据本发明的优选方案，G选自氢原子、含有1-6个碳原子的饱和或不饱和的直链或支链烷基或芳基。在更为有利的方案中，G选自氢、甲基、乙基或苯基。
对本发明来说，术语“芳基”指的是一价芳族烃基。本发明的芳基一般含有6-14个碳原子。优选，本发明芳基选自苯基，萘基，例如，1-萘基或2-萘基，联苯基，例如，2-联苯基、3-联苯基或4-联苯基，蒽基或芴基。更优选为苯基。芳基，尤其苯基，可以被取代或不被取代，例如，单取代、二取代、三取代或四取代，取代基可以相同或不同。优选，所述取代基选自卤原子、(C1-C8)烷基或(C1-C8)烷氧基。对于单取代苯基，所述取代基可以在2位、3位或4位取代，对于二取代苯基，所述取代基可以位于2，3位，2，4位，2，5位，2，6位，3，4位或者3，5位。对于三取代苯基，所述取代基可以位于例如2，3，4位，2，3，5位，2，4，5位，2，4，6位，2，3，6位或者3，4，5位。
视情况而定，取代基G1和G2或者直接连接到环状原酸酯上，或者通过本领域技术人员已知的“间隔”分子间接连接到环状原酸酯上。所述“间隔”分子不仅能够确保取代基G1和G2与原酸酯连接，而且使得所述取代基远离环状原酸酯，从而减少了酸敏感环状原酸酯与其取代基之间的任何不需要的相互作用。根据取代基G1或G2的特性，优选的间隔分子可以选自例如烷基(1-6个碳原子)、羰基、酯、醚、酰胺、氨基甲酸酯或硫代氨基甲酸酯键、甘油、脲、硫脲或这些基团中一些基团的组合。例如，当疏水取代基是甾类衍生物时，间隔分子可以是-N-C(O)-O-型的氨基甲酸酯键，或者，当疏水取代基是双链烷基时，间隔分子可以选自-烷基-C(O)-N表示的基团，然后，两个烷基链被固定到氮原子上。
根据本发明的优选实施方案，多胺类基团可以定义为含有至少3个碳原子和其中至少一个亚甲基可以被任选被(例如甲基)取代的氨基代替，并且末端甲基被一个或多个选自(伯、仲、叔或季)胺、胍或环状胍的基团取代的直链或支链烷基。优选，这些多胺类基团选自文献例如WO96/17823、WO97/18185、WO98/54130或WO99/51581中公开的用于核酸载体化的已知多胺类基团。尤其是，所述多胺类基团可以包括例如下列通式所示的多胺：其中，-R表示氢原子，但是有一个基团R不存在，该不存在的R表示连接环状原酸酯的共价键-n是1-9的整数-m是包含端点在内的2-6的整数，在不同的基团-(CH)m-NH-中，m值可以相同或不同。
根据另一实施方案，所述多胺类基团还可以包括下列通式所示的多胺基团：其中，一R1，R2，R3各自独立地表示氢原子或基团-(CH2)q-NRR＝，q可以在1，2，3，4，5和6之间变化，并且不同基团R1，R2和R3中的q的变化是各自独立的，R和R＝各自独立地表示氢原子或基团-(CH2)q＝-NH2，q＝可以在1，2，3，4，5和6之间变化，并且不同基团R和R＝中的q的变化是各自独立的，-m和p各自独立地表示1-6的整数，和-n表示0-6的整数，当n大于1时，m可以取不同的值，并且通式中R3的含义可以不同，当n为0时，R1和R2中的至少一个不是氢。
根据本发明的另一实施方案，多胺类基团还可以用上一个通式所示的取代基表示，不过R和R＝各自独立地表示氢原子或式(1)的基团：
Figure A0181520000121
其中r是包含端点在内的0-6的整数，基团R5各自独立地是氢原子、烷基、氨基甲酸酯和任选被卤代的脂族或芳族酰基，当然，R1，R2和R3中的至少一个含有至少一个式(1)基团。
由此得到含有一个或多个末端胍官能的多胺类基团。
根据本发明的另一个实施方案，多胺类基团还可以表示上文所述的多胺基团，不过末端基团为通式(2)所示的环状胍类基团(代替胺或胍)：其中：·  m和n各自独立地是包含两端点在内的0-3的整数并且m+n大于或等于1，·  R1表示通式(3)基团：
Figure A0181520000123
其中p和q各自独立地是包含两端点在内的0-10的整数，Y表示羰基、氨基、甲基氨基或亚甲基，不同基团[(CH2)p-Y]中的Y可以不同，(*)表示氢原子或共价键，显然，R1可以与通式(2)的任何原子相连，包括Z，并且式(2)中存在单一一个R1基团。·  X表示基团NR2或CHR2，R2是氢原子或者是与上文定义的R1基团相连的键，·  基团 表示：* 第1种情况：通式(4)所示的基团：
Figure A0181520000132
其中W′表示CHR_或NR_，R″和R_各自独立地表示氢原子、甲基或与上文定义的基团R1相连的键，或者，* 第2种情况：通式(5)所示的基团：
Figure A0181520000133
其中W′表示CHR_或NR_，R′和R_各自独立地表示氢原子、甲基或与上文定义的基团R1相连的键。
一般，还可以采用本领域技术人员已知的用于结合核酸(尤其是通过静电相互作用)的任何其它多胺类基团。
对本发明来说，所谓的“单链或双链烷基”指的是由一个或两个具有10-24个碳原子并任选含有一个或多个不饱和部分的直链烷基构成的疏水基团。对于双链烷基，其可以包括例如与氮原子相连进而形成了二烷基氨基取代基的二烷基链，该二烷基链是例如具有10-24个碳原子并任选具有一个或多个不饱和部分的直链烷基。所述双链烷基还可以包括饱和或不饱和脂肪酸，例如，棕榈酸、油酸、硬脂酸或豆蔻酸。优选，所述单链或双链烷基具有12-18个碳原子，更优选，所述单链或双链烷基选自(每个烷基链)具有12、14、16或18个碳原子的基团。
对本发明来说，所谓的“甾类衍生物”指的是选自例如甾醇、甾类和甾类激素的取代基。更优选，甾类衍生物选自胆甾醇、胆甾烷醇、3-αa-5-环-5-αa-胆甾烷-6-βb-醇、胆酸、胆甾醇甲酸酯、甲酸胆甾烷基酯、3αa，5-环-5αa-胆甾烷-6βb-基甲酸酯、胆甾醇胺、6-(1，5-二甲基己基)-3a，5a-二甲基十六氢化环戊-[a]环丙[2，3]环戊[1，2-f]萘-10-基-胺、胆甾烷基胺或者地塞米松。
本发明的疏水树状聚合物优选自疏水聚(烷基醚)或疏水聚(芳基醚)。在特别有利的实施方案中，本发明的疏水树状聚合物选自聚(苄基醚)。
对本发明来说，聚亚烷基二醇优选自平均分子量为102-105道尔顿(Da)并任选与导向成分共价连接的聚亚烷基二醇。在特别有利的实施方案中，本发明聚亚烷基二醇选自平均分子量为102-105Da，优选为500-105Da的聚乙二醇。
对本发明来说，所谓的“单或多糖”指的是由一个或多个糖构成并任选与导向成分共价连接的分子。可以举出的实例是吡喃糖类和呋喃糖类，如葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖、果糖或麦芽糖、乳糖、蔗糖(saccharose)、蔗糖(sucrose)、岩藻糖、纤维二糖、阿洛糖、昆布二糖、龙胆二糖、槐糖、蜜二糖等等。此外，还可以包括所谓的“复合”糖类，即，相互间共价偶合的若干个糖，每个糖优选自上文列举的糖。作为合适的多糖，可以列举葡聚糖、α-直链淀粉、支链淀粉、果聚糖、甘露聚糖、木聚糖和阿拉伯聚糖(arabinan)。优选，本发明的单或多糖选自药理上适用的天然或市售衍生物，如天然糖类、环糊精或葡聚糖。
根据本发明的另一实施方案，聚亚烷基二醇或单或多糖可以任选与导向成分共价连接。在这种情况下，导向成分可以包括胞外导向成分，其能使本发明酸敏感化合物或含有本发明酸敏感化合物的组合物定位到特定细胞类型或特定目标组织(肿瘤细胞、肝细胞、造血细胞等)，或者，可以包括胞内导向成分，其能够定位某些优选的细胞区室(线粒体、核等)。
在本发明能够使用的导向成分中，可以列举的导向成分有糖、肽、蛋白质、寡核苷酸、脂质、神经介质、激素、维生素或其衍生物。优选，导向成分包括糖、肽、维生素或蛋白质，例如，抗体或抗体片段、细胞受体的配体或其片段、受体或受体片段。例如，可以包括用于生长因子受体、细胞因子受体、细胞凝集素类受体或叶酸受体的配体或者对诸如整联蛋白的粘着蛋白的受体具有亲和力且具有RGD序列的配体。还可以是用于运铁蛋白、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白的受体或是叶酸转运蛋白。导向成分还可以是能导向凝集素的糖或是抗体Fab片段或单链抗体(ScFv)，所述凝集素是例如脱唾液酸糖蛋白受体或诸如唾液酸路易斯X的syalyde受体。
对本发明来说，所谓的“聚亚烷基亚胺”指的是WO96/02655中描述的聚合物，即，含有下列通式所示的单体单元的聚合物：其中R可以是氢原子或下式基团，
Figure A0181520000152
并且n是2-10的整数，p和q是整数，并且p+q之和能满足聚合物平均分子量为100-107Da。
当然，在上式中，不同单元-NR-(CH2)n-之间的n值可以不同。这样，上式所示的基团合在一起可以是均聚物或杂聚物。选用商用聚亚烷基亚胺是有利的。最优选聚乙烯亚胺(PEI)，尤其是PEI 25K(平均分子量为25KDa的PEI)、PEI50K、PEI100K或PEI200K。
对本发明来说，所谓的“治疗性分子”指的是可以预防或治疗病变的分子，病变表现为身体部位中的酸度增加(相对于生理正常酸度)。所述身体部位尤其是指，但不仅仅是指：
-肿瘤，尤其是肿瘤细胞以及这些肿瘤附近的正常细胞(例如，肿瘤的内皮细胞)，较之生理正常酸度，它们具有较高的局部酸度(N.Raghunand等人，Drug Resistance Updates，2000，3，pp.30-38)，
-受局部缺血影响的肌肉，例如，心肌，其中酸中毒在一定程度上由糖类或脂肪酸类碳氢化合物无氧发酵产生的乳酸引起，
-炎症部位，其中由于巨噬细胞消耗大量氧气而产生了过氧化物离子，
-或者组织，其中代谢性、传染性或炎性病症引起局部酸中毒。
根据本发明的另一实施方案，本发明的“治疗性分子”通过在酸性细胞区室中释放，例如，在酸性细胞核内体中释放，可以预防或治疗病变。
治疗性分子可以选自例如肽、寡肽、蛋白质、抗原、抗体、酶及其抑制剂、激素、抗生素、镇痛药、支气管扩张药、抗菌剂、抗高血压药、心血管剂、作用于中心神经系统的试剂、抗组胺药、抗抑郁药、安定药、抗惊厥剂、抗炎物、兴奋剂、止吐剂、利尿剂、镇痉剂、抗局部缺血剂、限制细胞死亡的试剂或抗癌剂。
此外，所谓的“生物活性物质”是指选自上文定义的治疗性分子或核酸的物质。
对本发明来说，所谓的“核酸”指的是脱氧核糖核酸和核糖核酸。其可以包括天然或人工序列，尤其是基因组DNA(gDNA)、互补DNA(cDNA)、信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、杂合序列或合成或半合成序列、修饰的寡核苷酸或未修饰的寡核苷酸。这些核酸可以是例如人类、动物、植物、细菌、病毒或合成起源的核酸。它们可以采用本领域技术人员已知的任一技术获得，尤其可以采用筛选文库法、化学合成法或采用包括化学修饰或酶修饰由筛选文库获得的序列的混合方法。它们可以是修饰化学的。
特别是对于脱氧核糖核酸，它们可以是单链或双链短寡核苷酸或较长序列。尤其，核酸由，例如，质粒、载体、游离体或表达盒组成是有利的。这些脱氧核糖核酸尤其可以携带在靶细胞中功能性或非功能性复制源点、一个或多个标记基因、调节转录或复制的序列、所需的治疗性基因、修饰或未修饰的反义序列或者结合其它细胞组件的区域。
优选，核酸含有由一个或多个所需的治疗性基因组成的表达盒，所述基因在一个或多个在靶细胞中具有活性的启动子和转录终止子的控制之下。
对本发明来说，所谓的“感兴趣基因的表达盒”指的是可以在特异性限制位点插入载体中的DNA片段。DNA片段包括编码RNA的核酸序列或者所需的核酸肽，并且还包括表达所述序列所需的序列(激活剂、启动子、聚腺苷酸化序列等)。盒和限制位点应确保表达盒插入到用于转录和翻译的合适可读框中。
表达盒通常包括携带一个或多个所需的治疗性基因的质粒或游离体。其实例可以是WO96/26270和WO97/10343中描述的质粒，在本发明中引作参考。
对本发明来说，所谓的“感兴趣治疗性基因”尤其是指编码具有疗效的蛋白产物的任何基因。编码的蛋白产物尤其可以是蛋白质或肽。该蛋白产物相对于靶细胞可以是外源、同源或内源，亦即，当靶细胞未发生病变时，该蛋白产物是在靶细胞中正常表达的产物。此时，通过修饰或过量表达所述蛋白质，蛋白质的表达可以例如补偿细胞中的不当表达或补偿钝化或弱活性蛋白质的表达。感兴趣治疗性基因还可以编码细胞蛋白质突变体，其具有例如增加的稳定性或改进的活性。相对于靶细胞，蛋白产物还可以是异源的。此时，表达的蛋白质能够例如补充或提供细胞中不足的活性以对抗病变，或刺激免疫应答。
在本发明的治疗性物质中，尤其可以列举的实例是酶、血液衍生物、激素、淋巴因子、白介素、干扰素或TNF(例如：FR92/03120)、生长因子、神经递质(neuromediator)或其前体或合成酶、营养因子(例如，BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5或HARP/pleiotrophin)、载脂蛋白(例如，ApoAI、ApoAIV或ApoE：FR91/11947)、肌营养不良蛋白或微肌营养不良蛋白(FR91/11947)、囊性纤维化相关蛋白CFTR、肿瘤抑制基因(例如p53，Rb、RaplA、DCC或k-rev：FR93/04745)、凝固所涉及的基因编码因子(因子VII、VIII、IX)、DNA修复涉及的基因、自杀基因(胸苷激酶、胞嘧啶脱氨基酶)、血红蛋白或其它蛋白载体基因、代谢酶、分解代谢酶等。
感兴趣的治疗性核酸还可以是基因或反义序列，其在靶细胞中的表达可以控制基因表达或细胞mRNA转录。例如，根据EP140 308中描述的技术，所述序列能在靶细胞中被转录为RNA，该RNA与细胞mRNA互补，从而阻断mRNA转译为蛋白质。治疗性基因还可以包括编码核酶的序列，该核酶能够选择性分解靶RNA(EP321 201)。
如上所述，核酸还可以包括一个或多个编码抗原性肽的基因，所述肽在人类或动物体内产生免疫应答。在这个特定的实施方案中，本发明提供了用于人类或动物尤其是对抗微生物、病毒或癌的疫苗或免疫疗法。尤其可以包括对Epstein-Barr病毒、HIV病毒、乙型肝炎病毒(EP185 573)、假狂犬病病毒、合胞体形成病毒或其它病毒具有特异性的抗原肽或肿瘤特异性抗原肽(EP259 212)。
优选，核酸还可以包括在目标细胞或器官中允许表达感兴趣的治疗性基因和/或表达编码抗原肽的基因的序列。其可以包括这样一种序列，当这些序列能够在感染细胞中起作用时，这些序列天然负责所考虑基因的表达。还可以包括不同来源的序列(决定其它蛋白质或者甚至是合成蛋白质的表达)。尤其还可以包括真核或病毒基因的启动子序列。例如，可以包括衍生自期望感染的细胞基因组的启动子序列。或者，可以包括衍生自病毒基因组的启动子序列。对此，可以列举的是例如E1A、MLP、CMV和RSV基因等的启动子。此外，通过添加激活序列或调节序列等，可以修饰这些表达序列。还可以包括诱导型或阻抑型启动子。
而且，核酸还可以包括尤其是感兴趣治疗性基因的上游、引导靶细胞分泌路径中合成的治疗性产物的信使序列。该信使序列可以是治疗性产物的天然信使序列，但也可以是任何其它功能性信使序列，或是人工信使序列。核酸还可以包括将合成的治疗性产物定向到特定细胞区室的信使序列。
根据本发明的优选方案，更准确地说，酸敏感化合物选自下列通式化合物：
Figure A0181520000191
其中：·  g是0或1的整数·  G表示选自氢原子、具有1-6个碳原子的饱和或不饱和的直链或支链烷基取代基或芳基，并且·  G1和G2表示：(a)其中一个为选自多胺类基团的亲水取代基，另一个为选自单链或双链烷基或甾类衍生物的疏水取代基，或者(b)其中一个为含有10-24个碳原子并任选含有一个或多个不饱和部分的疏水直链烷基，另一个为下列通式所示的基团：其中i是1-4的整数，j是9-23的整数，并且亲水取代基选自多胺类基团，或者(c)其中一个为选自聚亚烷基二醇的亲水取代基，另一个为选自聚亚烷基亚胺的取代基，或者(d)其中一个为选自聚亚烷基二醇的亲水取代基，另一个为疏水取代基，其选自单链或双链烷基、甾类衍生物、或选自单链或双链烷基或甾类衍生物和具有1-20个单体单元的聚亚烷基二醇分子之间的共价共轭物，或者(e)其中一个为选自聚亚烷基二醇的亲水取代基，另一个为治疗性分子。
更优选，本发明的酸敏感化合物选自下列通式化合物：
Figure A0181520000201
其中：·  g是0或1的整数·  G表示氢原子、具有1-6个碳原子的饱和或不饱和的直链或支链烷基取代基或表示苯基，并且·  G1和G2表示：(a)其中一个为选自多胺类基团的亲水取代基，另一个为选自单链或双链烷基或甾类衍生物的疏水取代基，或者(d)其中一个为选自聚亚烷基二醇的亲水取代基，另一个为选自单链或双链烷基或甾类衍生物的疏水取代基。
通式(I)所示的新的酸敏感化合物可以药理上可接受的无毒盐形式提供。所述无毒盐包括无机酸(盐酸、硫酸、氢溴酸、磷酸或硝酸)盐或有机酸(乙酸、丙酸、琥珀酸、马来酸、羟基马来酸、苯甲酸、富马酸、甲磺酸或草酸)盐。
有关含环状原酸酯基团的分子合成的文献中报道的许多方法(例如，可以参照评论性杂志Synthesis，Robert H.DeWolfe，1974，pp.153-172中给出的实施例)都可以用来制备本发明酸敏感化合物。根据另一个可以预见的方法，通过例如将式G1OH醇与下列通式原酸酯反应，可以制得通式(I)酸敏感化合物。
Figure A0181520000211
其中G、g、G1和G2定义同通式(I)，Z表示含有1-4个碳原子的直链或支链烷基。
在有溶剂或无溶剂条件下，上述取代作用可以在酸催化剂存在下进行和/或在50-150℃下热激活化。如果选择在溶剂存在下进行操作，那么溶剂选自常规有机化学溶剂，如有机氯化溶剂、芳族溶剂或醚类。当使用催化剂时，催化剂可以是无机或有机酸、路易斯酸或布朗斯台德酸。例如，催化剂可以选自盐酸、硫酸、对甲苯磺酸、樟脑磺酸、对甲苯磺酸吡啶鎓或氯化镁。如果反应过程中产生的醇ZOH比醇G1OH更易挥发，那么，蒸馏醇ZOH对上述取代作用是有利的。可以在大气压或减压条件下加热进行连续蒸馏。
原料醇G1OH可以是市售的，也可以采用本领域技术人员已知的任何方法合成得到，例如，通过水合相应的烯烃，或者，通过水解相应的卤代衍生物，或通过还原相应的含羰基衍生物。
根据本发明的另一方案，基团Z可以已经为基团G1，此时，通式(III)所示的原酸酯与醇G1OH之间的反应步骤不是必需的。
通式(III)化合物可以通过通式(IV)的三烷基原酸酯，
Figure A0181520000212
其中Z和G定义同上，Z1和Z2可以相同或不同，表示含有1-4碳原子的直链或支链烷基，作用于通式(V)的二醇获得。
Figure A0181520000221
其中g和G2定义同上。
该反应可以根据常规方法进行，以原酸酯形式保护二醇，例如，根据T.W.Greene和P.G.M.Wuts in“Protective Groups in OrganicSynthesis”(2ndEd.，Wiley-Interscience，pp.135-6)中指出的方法。
反应步骤通常在酸催化剂存在下于常规有机溶剂中进行(例如有机氯化溶剂，芳族溶剂或醚类等)。催化剂可选自无机或有机酸、路易斯酸或布朗斯台德酸。例如，可利用盐酸、硫酸、对甲苯磺酸、樟脑磺酸、对甲苯磺酸吡啶鎓或氯化镁。
通式(IV)的三烷基原酸酯可以是市售的，或可依本领域已知的常规方法合成，例如从相应的酯，或通过由其它市售的三烷基原酸酯的烷氧基取代。
通式(V)表示的二醇可以是市售的，也可以通过市售二醇与G2之间的反应获得，或者，将G2直接官能化为二醇以得到通式(V)的二醇。根据本领域技术人员公知的方法，该官能化反应的要点在于，例如，将相应的烯烃氧化，或者，将相应的环氧化物开环。
当G1和G2中的一个表示多胺类基团时，其可以为市售产品，或者，采用本领域技术人员已知的常规方法获得，例如，采用现有技术(例如，WO96/17823、WO97/18185、WO98/54130或WO99/51581)描述的方法或其类似方法。
当G1和G2中的一个表示选自单链或双链烷基的疏水取代基时，后者可以市售获得，或者，采用本领域技术人员已知的常规方法获得。例如，当取代基包括具有长碳链的二烷基氨基取代基时，其可以通过将相应的伯胺烷基化(卤代烷基的单取代作用)或烷基化还原(由醛)或缩合/还原(由酸形成酰胺官能团，然后进行还原)制得。
当G1和G2中的一个表示选自甾类衍生物或疏水树状聚合物的疏水取代基时，其优选采用市售产品。
当G1和G2中的一个表示选自聚亚烷基二醇或单或多糖的疏水取代基时，后者可以市售获得，或者，通过本领域技术人员已知的常规方法，尤其是通过聚合反应获得。在这种情况下，或者，当该取代基与导向成分共价连接时，可以在该取代基与所述导向成分结合之前或之后，采用本领域技术人员已知的常规方法合成本发明上述酸敏感化合物。
当G1和G2中的一个表示选自聚亚烷基亚胺的取代基时，后者可以市售获得，或者根据本领域技术人员已知的常规方法或现有技术(例如，WO96/02655)描述的方法获得。
上文指出的制备方法仅仅是为了便于说明而给出的方法，当然也可以采用任何其它的等效制备方法。例如，以不带有基团G2但在适当位置上带有任选被保护的官能团(例如被保护的胺)的通式(V)二醇为原料的反应可以通过进行一个附加的结合基团G2的最终步骤来完成(例如，将胺脱保护，然后与式G2COOH的酸缩合)。
本发明的另一个方面涉及含有至少一个上文定义的通式(I)酸敏感化合物的组合物。根据本发明的另一实施方案，所述组合物含有至少一个生物活性物质和通式(I)酸敏感化合物，其中G1和G2具有(a)、(b)、(c)或(d)中给出的定义。
本发明的组合物还可以含有一种或多种能与复合物结合的辅剂，所述复合物由本发明酸敏感化合物和生物活性物质形成。因此，在另一实施方案中，本发明涉及含有至少一种生物活性物质、式(I)酸敏感化合物(其中G1和G2具有(a)、(b)、(c)或(d)中给出的定义)和一种或多种辅剂的组合物。当生物活性物质是要被转染的核酸时，这类辅剂(如脂质、肽或蛋白质)的存在能够有利地增加化合物的转染能力。
看来，本发明的组合物可以含有一种或多种中性脂质作为辅剂。实际上已证实了，中性脂质的加入可以改善核脂质颗粒的形成(此时，生物活性物质是核酸)，并通过去稳定颗粒膜促进颗粒向细胞中渗透。
更优选，所述中性脂质是带有两个脂肪链的脂质。在特别有利的实施方案中，采用生理条件下的天然或合成、两性离子脂质或不带离子电荷的脂质。它们尤其可选自二油酰基磷脂酰基乙醇胺(DOPE)、油酰基棕榈酰基磷脂酰基乙醇胺(POPE)、二硬脂酰基磷脂酰基乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰基乙醇胺、dimirystoyl磷脂酰基乙醇胺及其N-甲基化1-3次衍生物、磷脂酰甘油、二酰甘油、糖基二酰甘油、糖脂(尤其是例如半乳糖脑苷脂)、鞘脂(尤其是例如鞘髓磷脂)或脱唾液酸神经节苷脂(尤其是例如脱唾液酸GM1和GM2)。
上述各种脂质可以采用本领域技术人员公知的常规技术合成得到或从器官(如脑)或卵中提取。尤其是，天然脂质的提取可以通过有机溶剂进行(参见Lehninger，Biochemistry)。
优选，当生物活性物质是核酸时，以mol/mol计，对于每1当量核酸，本发明组合物含有0.01-20当量辅剂，优选含0.5-5当量辅剂。
根据位于环状原酸酯任一侧的取代基G1和G2的不同，本发明酸敏感化合物可以具有不同的用途。
当通式(I)中的取代基G1和G2具有(a)、(b)或(c)中给出的定义时，本发明酸敏感化合物能够直接与生物活性物质形成共轭物(例如包括脂质体、复合物或纳米颗粒)，所述生物活性物质然后可以释放到酸性高于生理正常酸度的组织或细胞区室中。这些酸敏感化合物特别优选用于核酸的转染。
当通式(I)中的取代基G1和G2具有(d)中给出的定义时，本发明酸敏感化合物构成非离子表面活性剂，其可以稳定包封生物活性物质的颗粒，并在体内呈极弱酸性或酸性的部位，尤其在pH为酸性并且pH在大约4-7的部位降解来释放生物活性物质。
此外，已知多糖或聚亚烷基二醇取代基，尤其是聚乙二醇(PEG)能够授予颗粒一种称之为隐形剂(“furtiveness”)的东西，使颗粒与之相连，通过抑制血清蛋白的非特异性吸附，进而通过小噬细胞识别所述颗粒(参见例如Torchilin等人，Biochim.Biophys.Acta1994，1195，pp.11-20，或者，Papahadjopoulos等人，PNAS 1991，88，pp.11460-4)。因此，从安全的观点看，本发明含有PEG分子的酸敏感化合物具有优点，并且，它的另一优点是能够减少干扰其它蛋白质的危险。在体内酸性部位，存在于本发明化合物中的原酸酯降解使得PEG分子与颗粒剩余部分分离，进而使生物活性物质再次“可被利用”(事实上，隐形剂“消失”)。因此，可以实现对酸性组织的选择性传递。
最后，当通式(I)中的取代基G1和G2具有(e)或(f)中给出的定义时，本发明酸敏感化合物与治疗性分子形成共价共轭物，从而使治疗性分子载体化，然后将治疗性分子释放到身体的酸性部位。这些共轭物与Kratz等人描述的共价共轭物同类，但是，在治疗性分子和"载体”部分之间具有新的酸敏感键，与迄今使用的pH-敏感键相比，本发明的酸敏感键具有敏感度可调的优点。
因此，本发明还涉及上文定义的通式(I)酸敏感化合物用于制备治疗疾病用药物的用途。此时，所需治疗的疾病决定了对生物活性物质的选择。
根据一个特别有利的实施方案，当生物活性物质是核酸时，其中G1和G2具有(a)、(b)或(c)给出的定义的通式(I)酸敏感化合物可用于制备药物，所述药物用于核酸的体外、离体或体内转染，尤其是转染至初级细胞或确立株系中。其可以包括例如呈分化的或多能形式的下列细胞(前体)：纤维细胞、肌细胞、神经细胞(神经元、蛛形细胞、神经胶质细胞)、肝细胞、造血细胞系(淋巴细胞、CD34、树状细胞等)或上皮细胞。
最后，根据本发明的另一实施方案，其中G1和G2具有(e)或(f)给出的定义的通式(I)酸敏感化合物可用作药物。
在上文中，本发明酸敏感化合物在pH较生理正常酸度更偏酸性的组织或细胞区室中发生降解。但是，根据本发明的另一实施方案，通过本领域技术人员已知的全身或局部治疗，可以在身体靶区域中带来或增加酸性。举例说明如下(但不限于此)：将酸性物质注射到待治疗部位或静脉注射能导致肿瘤组织特异性酸化的葡萄糖(T.Volk等人，Br.J.Cancer；1993，68(3)，492-500)。因此，本发明酸敏感化合物还可以用于原先不具有酸性但采用本领域技术人员已知的治疗方法使其呈现酸性的身体部位中。
对于上文指出的本发明酸敏感化合物的所有用途，含有
一其中G1和G2具有(e)或(f)给出的定义的通式(I)酸敏感化合物，或
一其中G1和G2具有(a)、(b)、(c)或(d)给出的定义的通式(I)酸敏感化合物和生物活性物质的本发明的组合物可以配成制剂用于例如局部、经皮、经口、直肠、阴道、肠胃外、鼻内、静脉内、肌内、皮下、眼内、经眼、气管内或腹膜内给药。本发明组合物含有用于注射制剂(尤其是用于直接注射到目标器官中)或用于局部给药(至皮肤和/或粘膜)的赋型剂。其可以包括尤其是等渗、无菌溶液或无菌水或生理盐水的干燥，尤其是冻干组合物(视情况而定)，以制备注射溶液。注射用生物活性物质的剂量以及给药次数可根据不同参数进行调节，特别是根据所采用的给药方式、有关病状、生物活性物质为核酸时待表达的链或所需治疗时间进行调节。尤其是关于给药方式，可以包括直接注射到组织，例如在肿瘤水平上，或循环途径中，或处理培养细胞，然后再植入体内或再注射或移植。本发明中的相关组织是例如肌肉、皮肤、脑、肺、肝、脾、骨髓、胸腺、心脏、淋巴、血液、骨、软骨、胰腺、肾、膀胱、胃、肠、睾丸、卵巢、直肠、神经系统、眼、腺或结缔组织。
除了上述方案之外，本发明还包括由下文实施例和附图呈现出来的其它特征和优点，并且下文的实施例和附图仅用于说明本发明，而不限制本发明范围。特别是，申请人提出了各种不限制本发明的操作规程和可用于制备通式(I)化合物的反应中间体。当然，由这些规程和/或中间产物吸取灵感而开发出类似的方法以获得本发明的其它通式(I)化合物是在本领域技术人员的能力范围内。
附图说明
附图1：由DNA和对照阳离子脂质或酸敏感化合物A(顺式或反式)形成复合物，采用3个不同的比例：0.4或1.7或6.0nmol阳离子脂质或酸敏感化合物/μgDNA，在pH5，荧光强度随时间的变化。
附图2：由DNA和化合物A(顺式或反式)或对照阳离子脂质形成的不同加载比例的复合物体内转染至Hela细胞中的效力，有或没有血清。
y-轴表示荧虫素酶的表达水平(pg/孔/μg蛋白质)。x-轴表示化合物A(顺式或反式)或对照阳离子脂质/DNA加载比例。
附图3：对照阳离子脂质/DNA核脂质颗粒大小(nm)随化合物C或化合物D或Brij700或化合物D的非酸敏感类似物的用量(相对于DNA的质量，重量/重量)的变化。小的颗粒尺寸表明核脂质颗粒是稳定的。相反，很大的颗粒尺寸表明核脂质颗粒去稳定，并随后趋于聚集。
附图4：pH＝5，在不同比例下(重量/重量)，对照阳离子脂质/DNA/化合物或类似物D核脂质颗粒的大小(nm)随时间的变化。小的核脂质颗粒尺寸表明它们是稳定的。相反，很大的颗粒尺寸表明核脂质颗粒去稳定，并随后趋于聚集。
附图5：在不同pH值(pH4、pH5、pH6和pH7.4)，对照阳离子脂质/DNA/化合物C或化合物E核脂质颗粒的大小(nm)随时间的变化。化合物C或化合物E/DNA的比例设定为1(nmol/μg蛋白质)。
附图6：质粒pXL3031的图解表示。
附图7：化合物D对由阳离子脂质/DOPE/DNA(5/5/1)复合物介导的体内基因转移活性的剂量/应答曲线。化合物“类似物D”用作对照。数值是平均值(线)和带有皮下M109肿瘤的4 Balb/c小鼠的个体值(点)。
实施例
普通试剂和催化剂，如三乙胺、三氟乙酸、三氟乙酸酐、溴乙酸三级丁酯、丁内酯、3-氨基丙烷-1，2-二醇、丝氨醇、2-氨基丙烷-1，3-二醇、原甲酸三甲酯、原乙酸三甲酯、对甲苯磺酸、对甲苯磺酸吡啶鎓或苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)鏻(BOP)、六氟磷酸酯，可以市售获得。
用氯化钠饱和水溶液、碳酸氢钠饱和水溶液和浓度为0.5mol/l的硫酸氢钾浓溶液进行洗涤。
亲水聚合物(不同大小的聚乙二醇)由市售获得。多胺类亲水取代基也由市售获得，或者，可以采用本领域技术人员已知的常规方法，尤其是采用下列实施例所指出的方法合成得到。疏水取代基(单链或双链二烷基胺、脂肪醇等)由市售获得，或根据本领域技术人员已知的常规方法合成得到。例如，如下列实施例所述，单链或双链二烷基胺可以由伯胺和相应的卤代烷基衍生物合成。
在Bruker 300，400和600MHz波谱仪上记录质子核磁共振波谱(1HNMR)。用ppm(百万分之一)表示化学位移并且用惯用缩写表示多重峰。
使用的质粒为Gene Therapy(1999)6，pp，1482-1488中描述的pXL3031，其含有编码巨细胞病毒CMV E/P启动子控制下的荧虫素酶的luc基因。该质粒如附图6所示。其大小为3671bp。将使用的质粒溶液在水中稀释至1.262 g/l用于注射。实施例1：2，2，2-三氟-N-(2-甲氧基-[1，3]二氧戊环-4-基甲基)乙酰胺(″原1″)的合成
2，2，2-三氟-N-(2-甲氧基-[1，3]二氧戊环-4-基甲基)乙酰胺(″原1″)具有下列结构式：
Figure A0181520000281
原1
它可以由3-氨基丙烷-1，2-二醇经两步合成得到：1)制备N-(2，3-二羟基丙基)-2，2，2-三氟乙酰胺
在带有磁力棒的圆底烧瓶中，将15g 3-氨基丙烷-1，2-二醇(164.6mmol)溶解在100ml四氢呋喃中。然后在冰浴上将反应混合物冷却至0℃，逐渐加入21.5ml三氟乙酸乙酯(181.1mmol)。在室温下搅拌反应混合物2小时。然后将反应粗产物蒸发至干。得到29g纯的无色油状物(收率：95％)，该产物无需进一步提纯直接使用。2)制备2，2，2-三氟-N-(2-甲氧基-[1，3]二氧戊环-4-基甲基)乙酰胺(″原1″)
将上一步获得的29g N-(2，3-二羟基丙基)-2，2，2-三氟乙酰胺(155mmol)溶解在增补了75ml原甲酸三甲酯(685mmol)的75ml二氯甲烷中。然后加入300mg对甲苯磺酸(1.7mmol)，并在室温下搅拌反应混合物2小时。
然后，将粗产物稀释在500ml二氯甲烷中，用200ml饱和碳酸氢钠洗涤3次，再用200ml饱和氯化钠洗涤3次。在硫酸镁上干燥有机相，过滤并浓缩至于。得到30g无需进一步提纯的纯油状物(收率：85％)。1HNMR(300MHz，CDC13，δd ppm)。测得比例为50/50的两个非对映异构体的混合物。*3.33和3.37(2s：3H合计)；3.35-3.80(mts：3H)；4.10-4.25(mt：1H)；4.50(mt：1H)；5.73和5.78(2s：1H合计)；6.66和7.55(2个未分辨复合物：1H合计)实施例2：2，2，2-三氟-N-(2-甲氧基-2-甲基-[1，3]二噁烷-5-基)乙酰胺(″原2″)的合成
2，2，2-三氟-N-(2-甲氧基-2-甲基-[1，3]二噁烷-5-基)乙酰胺(″原2″)具有下列结构式：原2
它可以由2-氨基丙烷-1，3-二醇经两步合成得到：1)  制备2，2，2-三氟-N-(2-羟基-1-羟基甲基乙基)乙酰胺
将4g 2-氨基丙烷-1，3-二醇(43.9mmol)补加在20ml四氢呋喃中。然后在冰浴上将反应混合物冷却至0℃，逐渐加入5.8ml三氟乙酸乙酯(181.1mmol)。在室温下搅拌反应溶液2小时。
然后将反应粗产物蒸发至干，在二氯甲烷中吸收3次，以便充分蒸发四氢呋喃。得到8.1g纯的白色粉末(收率：99％)，该产物无需进一步提纯直接用于下一步。2)  制备2，2，2-三氟-N-(2-甲氧基-2-甲基-[1，3]二噁烷-5-基)乙酰胺(″原2″)
将上一步获得的7.9g 2，2，2-三氟-N-(2-羟基-1-羟基甲基乙基)乙酰胺(42.2mmol)溶解在增补了16.1ml原乙酸三甲酯(126.7mmol)的30ml二氯甲烷中。然后加入73mg对甲苯磺酸(0.42mmol)，并在室温下搅拌反应混合物3小时。
然后，用150ml二氯甲烷稀释反应粗产物，用50ml饱和碳酸氢钠溶液洗涤3次，再用50ml饱和氯化钠溶液洗涤3次。在硫酸镁上干燥有机相，过滤并浓缩至干。得到9.9g无需进一步提纯的纯的白色固体(收率：96％)。1H NMR(300MHz，CDC13，δd ppm)。测得比例大约为75/25的两个非对映异构体的混合物。*1.49和1.50(2s：3H合计)；3.34-3.35(2s：3H合计)；3.66和3.82(分别为dmt，J＝12Hz和dd，J＝11和8Hz：2H合计)；3.90-4.00和4.20-4.35(2mts：1H合计)；3.97和4.33(分别为dd，J＝11和5Hz和dmt，J＝12Hz：2H合计)；6.38和7.04(2个宽的未分辩复合物：1H合计)。实施例3：合成顺式或反式化合物4-{4-[(2-{3-[4-(3-氨基-丙基氨基)丁基氨基]丙基氨基}乙酰基氨基)甲基]-[1，3]二氧戊环-2-基氧基}-N，N-二十八烷基丁酰胺四乙酸酯
该实施例描述了合成下式两个不同非对映异构体顺式和反式酸敏感化合物A的路线：化合物Aa一合成顺式和反式4-(4-氨基甲基-[ l，3l二氧戊环-2-基氧基)-N，N-二十八烷基丁酰胺(脂质部分-O-原1-NH2 )
该合成分3个阶段进行：官能化二十八烷基胺为醇，接到基团“原1”上，然后去调其保护基团。1)制备4-羟基-N，N-二十八烷基丁酰胺
在4.6g三氯化铝(34mmol)中增补25ml氯仿，在恒温槽上冷却混合物至大约10℃，滴加在15ml氯仿中的6.4ml三乙胺(46mmol)，并使反应混合物回到室温。使用滴液漏斗，向混合物中逐渐加入6g与在110ml氯仿中的1ml丁内酯(13.8mmol)混合的二十八烷基胺。
在室温下磁力搅拌2小时后，反应不再发生变化。然后加入75ml水，反应混合物搅拌30分钟。在赛力特硅藻土上过滤粗产物并用氯仿洗涤。沉出分离滤液，用50ml饱和氯化钠溶液洗涤有机相3次。在硫酸镁上干燥氯仿溶液，过滤并浓缩。通过硅胶色层分离得到4.9g白色粉末(收率：70％)。2)制备顺式和反式N，N-二十八烷基-4-{4-[2，2，2-三氟乙酰胺基)甲 基]-[1，3]二氧戊环-2-基氧基}-丁酰胺
将上一步制得的2.8g 4-羟基-N，N-二十八烷基丁酰胺(4.6mmol)与2.6g 2，2，2-三氟-N-(2-甲氧基)-[1，3]二氧戊环-4-基甲基}乙酰胺(原1，11.5mmol)和90mg氯化镁(0.92mmol)混合。在80℃无溶剂加热2小时。
然后将反应粗产物溶解在150ml环己烷中，并用30ml饱和碳酸氢钠溶液洗涤3次，然后用30ml饱和氯化钠溶液洗涤3次。在硫酸镁上干燥有机相，过滤并浓缩。用硅胶色谱进行提纯。从而分离出两个预期的顺式和反式非对映异构体白色粉末1.2g和1.1g(收率：62％)。顺式化合物的1H NMR(300MHz，CDCl3，δppm)：0.89(t，J＝7Hz：6H)；1.15至1.40(mt：60H)；1.52(mt：4H)；1.94(mt：2H)；2.39(t，J＝7Hz：2H)；3.20(宽峰t，J＝8Hz：2H)；3.29(mt：2H)；3.61(t，J＝5Hz：2H)；3.66(mt：2H)；3.79(dd，J＝8和7Hz：1H)；4.11(t，J＝8Hz：1H)；4.50(mt：1H)；5.82(s：1H)；8.13(未分辨复合物：1H)。反式化合物的1H NMR(300 MHz，CDCl3，δ ppm)：0.89(t，J＝7Hz：6H)；1.15至1.40(mt：60H)；1.52(mt：4H)；1.95(mt：2H)；2.38(t，J＝7Hz：2H)；3.21(宽峰t，J＝8Hz：2H)；3.29(宽峰t，J＝8Hz：2H)；3.44(mt，1H)；3.55至3.75(mt：1H)；3.60(t，J＝6Hz：2H)；3.69(dd，J＝8.5和5Hz：1H)；4.19(dd，J＝8.5和7Hz：1H)；4.50(mt：1H)；5.87(s，1H)；6.70(未分辩的复合物：1H)。3)制备顺式和反式4-(4-氨基甲基-[1，3]二氧戊环-2-基氧基)-N，N-二十八烷基丁酰胺
将上一步获得的1.1g N，N-二十八烷基-4-{4-[(2，2，2-三氟乙酰基氨基)甲基]-[1，3]二氧戊环-2-基氧基}丁酰胺(1.37mmol，顺式或反式)溶解在10ml四氢呋喃中并加入10ml 4％的氢氧化钠，同时剧烈搅拌。在室温下，静置反应过夜。
然后将四氢呋喃浓缩，用150ml乙醚萃取产物3次。在氯化钙上干燥有机相，过滤并蒸发。分离得到840mg目标产物(收率：86％)，并直接用于下一步骤。b-合成(三氟乙酰基-{3-[三氟乙酰基(4-{三氟乙酰基-[3-(2，2，2-三氟乙酰基氨基)-丙基]氨基}丁基)氨基]丙基}氨基)乙酸(多胺亲水部分-COOH)
分两步进行合成：保护精胺的四个胺，然后用保护的溴乙酸取代其中一个伯胺。1)合成2，2，2-三氟-N-[3-(2，2，2-三氟乙酰基氨基)丙基]-N-(4-{三氟乙酰基-[3-(2，2，2-三氟乙酰基氨基)丙基]氨基}-丁基)乙酰胺
将8g精胺(39.5mmol)溶解在75ml二氯甲烷中。加入33ml三乙胺(237mmol)，然后在冰浴上冷却反应混合物至0℃。使用滴液漏斗，用1小时滴加稀释在100ml二氯甲烷中的41.5g三氟乙酸酐。然后使反应混合物回到室温，并搅拌过夜。
将75ml 5％碳酸氢钠溶液加入反应混合物，室温搅拌溶液15分钟。用150ml二氯甲烷萃取水相3次。合并有机相并用100ml 0.5M硫酸氢钾浓溶液洗涤3次，然后用100ml饱和氯化钠溶液洗涤3次。在硫酸镁上干燥有机相，过滤并浓缩至干。分离出无需进一步提纯的纯的黄色粉末22.5g。(收率：97％)。2)制备(三氟乙酰基-{3-[三氟乙酰基-(4-{三氟乙酰基-[3-(2，2，2-三氟乙酰基氨基)-丙基]氨基}丁基)氨基]丙基}氨基)乙酸
在1g氢化钠(60％，在油中，即25.6mmol)中补加60无水二甲基甲酰胺。在氩气流下，将反应混合物在水浴中冷却，然后滴加上文得到的溶解在40ml无水二甲基甲酰胺中的10g 2，2，2-三氟-N-[3-(2，2，2-三氟乙酰基氨基)-丙基]-N-(4-{三氟乙酰基-[3-(2，2，2-三氟-乙酰基氨基)丙基]氨基}丁基)乙酰胺(17mmol)。将反应混合物在室温静置1小时，然后在冰浴上再次冷却并加入3.66g溴乙酸叔丁酯(18.7mmol)。反应混合物在室温搅拌过夜。
然后加入500ml乙酸乙酯，并用100ml饱和碳酸氢钠溶液洗涤3次，用饱和氯化钠溶液洗涤3次。在硫酸镁上干燥有机相，过滤并浓缩至干。以叔丁酯的形式，分离出含有不纯目标产物的黄色油状物。
将反应粗产物稀释在50ml二氯甲烷中，加入50ml三氟乙酸。室温下搅拌溶液3小时。然后将反应混合物蒸发至干并稀释在50ml二氯甲烷中。然后用150ml饱和碳酸氢钠溶液萃取产物3次。得到的水相用30ml二氯甲烷洗涤3次，然后通过加入浓盐酸进行酸化。用300ml二氯甲烷萃取产物3次。在硫酸镁上干燥有机相，过滤并浓缩至干。在硅胶色谱上继续进行提纯(洗脱液：二氯甲烷/甲醇8/2)。回收得到3.5g黄色粉末(两步总收率：32％)。1H NMR(400MHz，(CD3)2S0 d6，373K，δdppm)：1.62(mt：4H)；1.80-2.00(mt：4H)；3.28(mt：2H)；3.30-3.60(mt：10H)；4.01(s：2H)；9.1 5-9.35(未分辩的复合物：1H)。c-合成顺式和反式4-{4-[(2-{3-[4-(3-氨基丙基氨基)丁基氨基]丙基氨基)乙酰基氨基)-甲基]-[1，3，]二氧戊环-2-基氧基}-N，N-二十八烷基-丁酰胺四乙酸酯(酸敏感化合物A)
该合成用三步进行：将a和b中合成的两个分子缩合，然后多胺去保护，最后成盐。相同的操作规程用于制备顺式和反式化合物。1)合成顺式和反式N，N-二十八烷基-4-(4-[2-(三氟乙酰基-{3-[三氟乙酰基-(4-{三氟-乙酰基-[3-(2，2，2-三氟乙酰基氨基)丙基]氨基}-丁基)氨基]丙基}氨基)乙酰基氨基]甲基}-[1，3]-二氧戊环-2-基氧基)丁酰胺
在上文(步骤a)得到的800mg溶解在10ml二氯甲烷中的4-(4-氨基甲基-[1，3]二氧戊环-2-基氧基)-N，N-二十八烷基丁酰胺(1.13mmol，顺式或反式)中依次补加390μl三乙胺(2.8mmol)、上述步骤b中得到的800mg(三氟乙酰基-{3-[三氟乙酰基-(4-{三氟-乙酰基-[3-(2，2，2-三氟乙酰基氨基)丙基]氨基}-丁基)氨基]丙基}氨基)乙酸(1.24mmol)和600mgBOP。溶液在室温下搅拌2小时。
然后浓缩反应粗产物，吸收在150ml乙酸乙酯中，用40ml饱和碳酸氢钠溶液洗涤3次，并用40ml饱和氯化钠溶液洗涤3次。在硫酸镁上干燥后，过滤并蒸发，用硅胶色谱法提纯产物(洗脱液：乙酸乙酯)。分离出1.1g白色粉末(收率：73％)。2)制备顺式和反式4-{4-[(2-{3-[4-(3-氨基丙基氨基)丁基氨基]丙基氨基}乙酰基氨基)-甲基]-[1，3]二氧戊环-2-基氧基}-N，N-二十八烷基丁酰胺
将上文得到的290mg N，N-二十八烷基-4-(4-{[2-(三氟乙酰基-{3-[三氟乙酰基-(4-{三氟-乙酰基-[3-(2，2，2-三氟乙酰基氨基)丙基]氨基}-丁基)氨基]丙基}氨基)乙酰基氨基]甲基}[1，3]-二氧戊环-2-基氧基)丁酰胺(0.22mmol，顺式或反式)溶解在3ml四氢呋喃并在剧烈搅拌条件下加入3ml 4％氢氧化钠。反应在室温下静置过夜。
然后浓缩溶剂，将粗产物吸收在二氯甲烷/甲醇的1/1混合物中。用硅胶色谱法(二氯甲烷/甲醇/氨，45/45/10)提纯该粗溶液。浓缩产物，加入水后进行冻干。得到180mg白色冻干产物(收率：87％)。3)制备顺式和反式非对映异构体4-{4-[(2-{3-[4-(3-氨基丙基氨基)丁基氨基]丙基氨基}乙酰基氨基]甲基}-[1，3]-二氧戊环-2-基氧基)-N，N-二十八烷基丁酰胺(化合物A)
在离子交换树脂上，将上一步得到的游离碱形式的产物定量成盐：将其溶解在水/乙醇混合物中并在含有大大过量乙酸酯树脂(BIQ-RAD；AG1-X2树脂)的柱中洗脱。
顺式化合物的1H NMR(400MHz，CDCl3，δdppm)：0.89(t，J＝7Hz：6H)；1.20-1.40(mt：60H)；1.52(mt：4H)；1.65-1.90(mt：8H)；1.93(mt：2H)；1.97(s：3H)；2.37(t，J＝7Hz：2H)；2.73(mt：4H)；2.81(t，J＝6.5Hz：2H)；2.89(mt：4H)；2.95(t，J＝6.5Hz：2H)；3.15-3.30(mt：4H)；3.32(AB，J＝17Hz：2H)；3.45(dt，J＝14和6.5Hz：1H)；3.55-3.65(mt：1H)；3.61(裂分峰t，J＝7和2Hz：2H)；3.74(t，J＝8Hz：1H)；4.06(t，J＝8Hz：1H)；4.31(mt：1H)；5.79(5：1H)，7.81(t，J＝5.5Hz：1H)。
反式化合物的1H NMR(400MHz，CDCl3，δdppm)：0.88(t，J＝7Hz：6H)；1.05-1.45(mt：60H)；1.51(mt：4H)；1.65-1.90(mt：8H)；1.92(mt：2H)；1.97(5：3H)；2.37(t，J＝7Hz：2H)；2.73(mt：4H)；2.80(t，J＝6Hz：2H)；2.88(mt：4H)；2.96(t，J＝6Hz：2H)；3.15-3.55(mt：8H)；3.57(宽t，J＝6Hz：2H)；3.69(dd，J＝7.5和5.5Hz：1H)；4.11(t，J＝7.5Hz：1H)；4.43(mt：1H)；5.85(s，1H)；7.73(宽t，J＝5.5Hz：1H)。实施例 4.合成4-{4-[(2-{3-[双(3-氨基丙基)氨基]丙基氨基)乙酰基氨基)甲基]-[1，3]二氧戊环-2-基氧基}-N，N-二十四烷基丁酰胺四氯氢化物
该实施例描述了以顺式和反式两个非对映异构体的等摩尔混合物的形式合成具有下式的酸敏感化合物B的路线。
                 化合物Ba-合成4-(4-氨基甲基-[1，3]二氧戊环-2-基氧基)-N，N-二十四烷基丁酰胺(脂质部分-O-原1-NH2 )
该合成分四步进行：合成二十四烷基胺，然后将其官能化为醇，并接到基团“原1”上，然后去掉其保护基团。1)二十四烷基胺盐酸盐
在74g溴代十四烷(267.1mmOl)中增补400ml乙醇和57g十四烷基胺(267.1mmol)。然后加入70.8g悬浮中的碳酸钠(667mmol)，将反应混合物加热回流过夜。将反应混合物蒸发至干，吸收在1.51二氯甲烷中，用200ml水洗涤3次，然后用400ml饱和氯化钠溶液洗涤一次。在氯化钙上干燥有机相并浓缩。
将热的粗产物溶解在600ml异丙醇(增补了在异丙醇中的300ml5N盐酸)中进行成盐。将得到的透明溶液冷却，使目标产物结晶出来。过滤并用异丙醇洗涤后，得到48.4g絮凝状白色粉末(收率：41％)。2)制备4-羟基-N，N-二十四烷基丁酰胺
在22.4g三氯化铝(168.1mmol)中增补75ml二氯甲烷，在冰水浴中冷却至10℃。滴加在100ml氯仿中的39ml三乙胺(280.1mmol)，然后使反应混合物回到室温。在机械搅拌条件下，向混合物中逐渐加入与350ml氯仿中的5.2ml丁内酯(67.2mmol)混合的25g二十四烷基胺盐酸盐(56mmol)。在室温下2小时后，反应不再发生变化。
然后加入200ml水并搅拌反应混合物30分钟。在赛力特硅藻土上过滤粗产物，并用氯仿洗涤。沉出分离滤液，用150ml饱和氯化钠溶液洗涤有机相3次。在硫酸镁上干燥氯仿溶液，过滤并浓缩。经硅胶色谱法(乙酸乙酯/环己烷1/1)提纯后得到21.2g白色粉末，收率76％。3)制备N，N-二十四烷基-4-{4-[(2，2，2-三氟乙酰氨基)甲基]-[1，3]二氧戊环-2-基氧基}丁酰胺
将上一步得到的3.5g 4-羟基-N，N-二十四烷基丁酰胺(7.1mmol)与1.8g 2，2，2-三氟-N-(2-甲氧基-[1，3]二氧戊环-4-基甲基)乙酰胺(原1，7.8mmol)和18mg对甲苯磺酸吡啶鎓(PPTS，0.071mmol)。在80℃无溶剂加热反应3小时。
将反应粗产物溶解在200ml庚烷中，用50ml饱和碳酸氢钠溶液洗涤3次，用50ml乙腈洗涤3次，然后浓缩至干。
在硅胶上提纯一小份粗产物以确定中间体，其余的粗产物直接用于下一步反应。用硅胶色谱法(环己烷/乙酸乙酯7/3v/v)分离出几毫克油状物。4)制备4-(4-氨基甲基[1，3]二氧戊环-2-基氧基)-N，N-二十四烷基丁酰胺
将上一步得到的粗产物溶解在20ml增补了20ml 4％氢氧化钠的四氢呋喃中。室温下剧烈搅拌，将反应混合物静置过夜。
然后，浓缩四氢呋喃，用200ml乙醚萃取产物3次。在氯化钙上干燥有机相，过滤并蒸发。用硅胶色谱法(二氯甲烷/甲醇9/1v/v)分离出1.6g无色油状物(两步总收率：38％)。1H NMR(300MHz，CDCl3，δdppm)：观察到比例为50/50的两个非对映异构体混合物。*0.89(t，J＝7Hz：6H)；1.15-1.45(mt：44H)；1.52(mt：4H)；1.58(未分辨的复合物：2H)；1.95(五重峰，J＝6.5Hz：2H)；2.39(t，J＝6.5Hz2H)；2.75-3.00(mt：2H)；2.31(mt：2R)；3.29(mt：2H)；3.60(mt：2H)；3.71和3.80(分别为dd，J＝7.5 Hz和6Hz和t，J＝7.5Hz：1H合计)；4.06和4.14(2t，J＝7.5Hz：1H合计)；4.21和4.33(2mts：1H合计)；5.82和5.85(2s：1H合计) b-合成三氟乙酸盐形式的[(3-{双[3-(2，2，2-三氟乙酰基-氨基)丙基]氨基}丙基)三氟乙酰基氨基]乙酸(多胺亲水部分-COOH型)
以3-氨基丙醇和3，3′-亚胺基双丙基胺为原料，分6步进行上述合成。1)制备2，22-三氟-N-{3-[3-(2，2，2-三氟乙酰基氨基)丙基氨基]丙基}乙酰胺
在氩气流下，将35g 3，3′-亚胺基双丙基胺(266.7mmol)溶解在150ml四氢呋喃中。在冰浴上冷却反应混合物至0℃，并使用滴液漏斗非常缓慢地滴加65ml三氟乙酸乙酯(546.8mmol)。在滴加结束时(3小时后)，使反应混合物回到室温，在氩气下继续搅拌数小时。
然后在滤纸上过滤反应混合物。浓缩滤液至干，在二氯甲烷中吸收数次，在滑动叶板旋转真空泵产生的真空条件下，在40℃烘箱中进行最后的干燥16小时。分离出85.3g无需进一步提纯的白色粉末(收率：99％)。2)制备(3-羟基丙基氨基)乙酸叔丁酯
将196ml 3-氨基丙醇(2.56mol)稀释在250ml二氯甲烷中，在冰浴上冷却反应至0℃。保持反应混合物在0℃，滴加20g溶解在200ml二氯甲烷中的溴代乙酸叔丁酯(102.5mmol)，在滴加结束时(2小时后)，使反应混合物在室温下静置3小时。
用150ml饱和碳酸氢钠溶液洗涤粗产物3次，然后用150ml饱和氯化钠溶液洗涤3次。在氯化钙上干燥有机相，过滤并浓缩。分离出17.8g无色油状物(收率：92％)。3)制备[(3-羟基丙基)-三氟乙酰基氨基]乙酸叔丁酯
将17.65g(3-羟基丙基-氨基)乙酸叔丁酯(93.3mmol)溶解在100ml二氯甲烷中，在冰浴上冷却反应至0℃。加入26ml三乙胺(186.6mmol)，然后，使用滴液漏斗，滴加21.5g三氟乙酸酐(102.6mmol)。在滴加结束时，使反应混合物在室温下磁力搅拌过夜。
然后溶液用50ml饱和碳酸氢钠溶液洗涤3次，用50ml 0.5M的硫酸氢钾溶液洗涤3次，用饱和氯化钠溶液洗涤3次。在硫酸镁上干燥有机相，过滤并浓缩，分离出24.5g浅黄色油状物(收率：92％)。4)制备[(3-溴代丙基)三氟乙酰基氨基]乙酸叔丁酯
将10g[(3-羟基丙基)-三氟乙酰基氨基]乙酸叔丁酯(35mmol)溶解在150ml四氢呋喃中。加入12.4g三苯基膦(47.3mmol)。反应混合物恒温在15-20℃。使用滴液漏斗，滴加15.1g溶解在60ml乙腈中的四溴化碳(45.6mmol)，反应在室温下搅拌4小时。
反应混合物浓缩至干，吸收在乙酸乙酯中，并在滤纸上过滤。滤液浓缩至干，吸收在环己烷中，在烧结材料No.3上过滤。再次浓缩滤液，用硅胶色谱法(环己烷/乙酸乙酯8/2 V/V)提纯，分离出10.4g浅黄色油状物(收率：85％)。5)制备[(3-{双[3-(2，2，2-三氟乙酰基氨基)丙基]氨基}丙基)三氟乙酰基氨基]乙酸叔丁酯
将26g[(3-溴代丙基)三氟-乙酰基氨基]乙酸叔丁酯(74.7mmol)和24.1g 2，2，2-三氟-N-{3-[3-(2，2，2-三氟乙酰基氨基)丙基氨基]丙基}乙酰胺(74.7mmol)溶解在130ml乙腈中。然后加入30g悬浮中的碳酸钠(224mmol)，将反应加热回流6小时。
然后在滤纸上过滤反应混合物并浓缩至干。然后用硅胶色谱法(环己烷/乙酸乙酯8/2 V/V)提纯粗产物，分离出16.6g浅黄色油状物(收率：38％)。6)制备三氟乙酸盐[(3-{双[3-(2，2，2-三氟乙酰基氨基)丙基]氨基}-丙基)三氟乙酰基氨基]乙酸的三氟乙酸盐
在15.8g[(3-{双[3-(2，2，2-三氟乙酰基氨基)丙基]氨基}丙基)三氟乙酰基氨基]乙酸叔丁酯(28.76mmol)中依次增补50ml二氯甲烷和50ml三氟乙酸。混合物在室温下搅拌数小时。然后反应混合物浓缩至干。分离出18.7g浅黄色蜜状物(收率：100％)。1H NMR(300 MHz，CDCl3，δdppm)：在室温下观测到旋转异构体的混合物。*1.80-2.10(mt：6H)；3.12(mt：6H)；3.29(mt：4H)；3.50(mt：2H)；4.1和4.29(分别为宽峰s和mt：2H合计)；9.50-9.75(mt：2H)c-合成4-{4-[(2-{3-[双(3-氨基丙基)氨基]-丙基氨基}乙酰基氨基)甲 基]-[ 1，3]二氧戊环-2-基氧基}-N，N-二十四丁酰胺四盐酸盐( 化合物B)
该合成分3步进行：将在上述a和b部分获得的两个分子缩合，然后多胺脱保护并成盐。1)制备4-[4-({2-[(3-{双[3-(2，2，2-三氟-乙酰基氨基)丙基]氨基}丙基)三氟乙酰基氨基]-乙酰基氨基}甲基)-[1，3]二氧戊环-2-基氧基]-N，N-二十四烷基丁酰胺
将1.9ml三乙胺(13.8mmol)、2g[(3-{双[3-(2，2，2-三氟乙酰基氨基)丙基]氨基}-丙基)三氟乙酰基氨基]乙酸(三氟乙酸盐，3.04mmol)和1.8g BOP(4.14mmol)依次加入到溶解在30ml二氯甲烷中的1.65g 4-(4-氨基甲基-[1，3]二氧戊环-2-基氧基)-N，N-二十四烷基丁酰胺(2.76mmol)中。溶液在室温下搅拌1小时。
然后将粗产物浓缩至干，吸收在200ml乙酸乙酯中，用40ml饱和氯化钠溶液洗涤，然后用40ml饱和碳酸氢钠溶液洗涤3次，用40ml饱和氯化钠溶液洗涤3次。用硅胶色谱法(洗脱液：乙酸乙酯)提纯产物，分离出2.2g浅黄色蜜状物(收率：72％)。2)制备4-{4-[(2-{3-[双(3-氨基丙基)-氨基]丙基氨基}乙酰基氨基)甲 基]-[1，3]二氧戊环-2-基氧基}-N，N-二十四烷基丁酰胺
将2.1g 4-[4-({2-[(3-{双[3-(2，2，2-三氟乙酰基氨基)丙基]氨基}丙基)三氟乙酰基氨基]乙酰基氨基}甲基)-[1，3]二氧戊环-2-基氧基]-N，N-二十四烷基丁酰胺(1.88mmol)溶解在30ml四氢呋喃中，剧烈搅拌下加入30ml 4％的氢氧化钠。反应在室温下静置过夜。
然后浓缩溶剂并将粗产物吸收在二氯甲烷/甲醇的1/1混合物中。用硅胶色谱法(二氯甲烷/甲醇/氨，45/45/10，V/V/V)提纯粗溶液，浓缩产物，然后在加入水后进行冻干。得到1.3g白色冻干产物(收率：84％)。3)制备4-{4-[(2-{3-[双(3-氨基丙基)氨基]丙基氨基}乙酰基氨基)甲 基]-[ 1，3]二氧戊环-2-基氧基}-N，N-二十四烷基丁酰胺四盐酸盐(化合物 B)
将上一步得到的游离碱形式的产物在离子交换树脂上定量成盐：将其溶解在水中，在含有大大过量的氯化树脂(FLUKA；DOWEX 21K)的柱中进行洗脱。通过1H NMR证实所得到的白色冻干产物的结构。1H NMR(300MHz，(CD3)2SO d6，δdppm)：观测到比例为50/50的两个非对映异构体混合物。*0.89(t，J＝7Hz：6H)；1.15-1.40(mt：44H)；1.40-1.60(mt：4H)；1.72(mt：8H)；2.31(mt：2H)；2.40-2.55(mt：6H)；2.70-2.90(mt：6H)；3.15-3.75-4.00至4.40(2系列mt：13H合计)；5.83和5.86(2s：1H合计)实施例5：合成PEG化的脂质C和D
该实施例描述了合成PEG化的脂质十八烷醇-原1-PEG5000-OMe和胆固醇-原1-PEG5000-OMe的路线，所述十八烷醇-原1-PEG5000-OMe和胆固醇-原1-PEG5000-Ome的不同之处仅在于它们的脂质部分：十八烷醇用于化合物C，胆固醇用于化合物D。这两个酸敏感化合物具有下列通式：
Figure A0181520000411
化合物C化合物Da-合成C-(2-十八烷基氧基-[1，3]二氧戊环-4-基)甲基胺和C-{2- [17-(1，5-二甲基己基)-10，13-二甲基-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十 四氢-1H-环戊[a]菲-3-基氧基]-[1，3]二氧戊环-4-基}甲基胺(脂质部分-O-原 1-NH2)
以化合物“原1”为原料，该合成分2步进行：用脂肪醇(胆固醇和十八烷醇)取代环外甲基，然后将胺脱保护。1)制备2，2，2-三氟-N-(2-十八烷基氧基-[1，3]二氧戊环-4-基甲基)乙酰胺
将3g 2，2，2-三氟-N-(2-甲氧基[1，3]二氧戊环-4-基甲基)乙酰胺(原1，13.09mmol)与3.54g十八烷醇(13.09mmol)混合。混合物在80℃熔化，加入32mg对甲苯磺酸吡啶鎓(0.13mmol)后静置2小时。然后将反应粗产物溶解在环己烷中，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，然后用饱和氯化钠溶液洗涤，在硫酸镁上干燥，并浓缩至干。该粗产物直接用于下一步反应。1′)制备N-{2-[17-（1，5-二甲基己基)-10，13-二甲基-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基氧基]-[1，3]二氧戊环-4-基甲基}-2，2，2-三氟乙酰胺
该反应与上文描述的相同，该反应还可以在无催化剂条件下进行。2)制备C-(2-十八烷氧基-[l，3]二氧戊环-4-基)甲基胺
将6.12g上一步骤1的反应粗产物(13.09mmol)溶解在20ml四氢呋喃中。反应混合物在冰浴上冷却，加入30ml 4％氢氧化钠。室温下搅拌反应混合物直至试剂完全消失(经4小时)。
然后，浓缩部分溶剂，用200ml乙醚萃取3次。在氯化钙上干燥有机相，过滤并蒸发。用硅胶色谱法(二氯甲烷/甲醇9/1，V/V)提纯反应粗产物。回收2.6g白色粉末(两个连续步骤1和2的收率：53％)。1H NMR(300 MHz，CDCl3，δdppm)。观测到比例大约为50/50的两个非对映异构体的混合物。*0.89(t，J＝7Hz：3H)；1.20-1.45和1.58(2mt：32H合计)；2.75-3.00(mt：2H)；3.53(mt：2H)；3.65-3.85(mt：1H)；4.00-4.40(mt：2H)；5.81和5.84(2s：1H合计)。2′)制备C-{2-[17-(1，5-二甲基己基)-10，13-二甲基-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十八氢-1H-环戊[a]菲-3-基础基]-[1，3]二氧戊环-4-基}甲基胺
反应步骤与步骤2)相同。回收得到1.4g白色粉末(两个连续步骤1′和2″的总收率：22％)。1H NMR(400MHz，CDCl3，δdppm).测定比例为50/50的两个非对映异构体混合物。*0.69(s：3H)；0.85-1.75-1.86和2.00(mts：26H合计)；0.88(mt：6H)；0.93(d，J＝7Hz：3H)；1.01(s：3H)；2.33(mt：2H)；2.75-3.00(mts：2H)；3.50(mt：1H)；3.71-3.85-4.05和4.16(4mts：2H合计)；4.20和4.35(2mts：1H合计)；5.36(mt：1H)；5.93和5.96(2s：1H合计)b-合成甲氧基聚乙二醇5000的酸(亲水部分MeO-PEG5000-COOH)
需要一个单独的步骤：氧化市售的甲氧基聚乙二醇的末端羟基。
将20g MeO-PEG5000-OH(4mmol)溶解在100ml等体积水/乙腈混合物中。依次加入312mg 2，2，6，6-四甲基哌啶基氧基(2mmol)和6.4g[双(乙酰氧基)碘代]苯(20mmol)。在室温下搅拌反应混合物16小时。
将反应混合物蒸发至干，吸收在40ml二氯甲烷/乙醇(1/1；V/V)混合物中，然后加入500ml乙醚进行沉淀。过滤并用乙醚洗涤，分离出19g白色粉末(收率：95％)。1H NMR(300MHz，CDCl3 δdppm)：3.39(s：3H)；3.40-3.95(mts：404H)；4.15(s：2H)c-合成甲氧基-(聚乙二醇5000)-(N-(2-十八烷氧基-[1，3]二氧戊环-4-基甲基)酰胺(化合物C)和甲氧基-(聚乙二醇5000)-N-{2-[17-(1，5-二甲基己基)-10，13-二甲基-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十四氢-1H- 环戊[a]-菲-3-基氧基]-[1，3]二氧戊环-4-基甲基}酰胺(化合物D) 化合物C：
将上一步获得的1.2g MeO-PEG5000-COOH溶解在5ml二氯甲烷中。加入188μl三乙胺(1.34mmol)，然后加入100mg C-(十八烷氧基-[1，3]二氧戊环-4-基)甲基胺(0.27mmol)。然后加入143mg BOP(0.32mmol，1.2eq)。在室温下搅拌反应混合物1小时。
通过加入乙醚(60ml)使反应混合物沉淀，离心，用乙醚洗涤，并注入到制备高效液相色谱(HPLC)中。分离出最纯馏分，得到415mg白色冻干产物(收率：32％)。1H NMR(300MHz，CDCl3，δdppm)：观测到比例为50/50的两个非对映异构体混合物。*0.90(t，J＝7Hz：3H)；1.20-1.40和1.50-1.75(mts：32H)；3.39(s：3H)；3.40-3.95(mts：448H)；4.02和4.03(2s：2H合计)；4.00-4.25(mts：3H合计)；5.80和5.84(2s：1H合计)化合物D：
合成步骤与制备化合物C的方法相同。分离出最纯的馏分，得到395g白色冻干产物(收率：30％)。1H NMR(400MHz，CDCl3，δdppm)：观测到比例为50/50的两个非对映异构体混合物。*0.68(s：3H)；0.85-1.75-1.85和2.00(mts 26H合计)；0.87(mt：6H)；0.92(d，J＝7 Hz：3H)；1.00(5：3H)；2.33(mt：2H)；3.39(5：3H)；3.40-3.90(mts：448H)；4.00-4.20(mts：1H合计)；4.01和4.04(2s：2H合计)；4.28和4.46(2 mts：1H合计)；5.35(mt：1H)；5.90和5.95(2s：1H合计)实施例6：合成PEG化的脂质E
该实施例描述了合成具有下式的PEG氧基化脂质十八烷醇-原2-PEG5000-OMe的路线：
Figure A0181520000441
化合物Ea-合成2-甲基-2-十八烷氧基-[1，3]二噁烷-5-基胺(疏水脂质部分-O-原 2-NH2)
以上文描述合成的物质“原2”为原料，分两步进行该合成：用十八烷醇取代环外甲氧基，然后进行胺脱保护。1)制备2，2，2-三氟-N-(2-甲基-2-十八烷氧基-[1，3]二噁烷-5-基)乙酰胺
将3g 2，2，2-三氟-N-(2-甲氧基-2-甲基-[1，3]二噁烷-5-基)乙酰胺(12.34mmol)与3g十八烷醇(11.1mmol)混合。混合物在80℃熔化并静置2小时以蒸发出所有的醇交换过程中产生的甲醇。
将熔化的反应混合物倾入50ml乙腈中，使产生沉淀。通过从乙腈中重结晶提纯目标产物。分离出2.85g白色粉末(重结晶后收率：53％)。2)制备2-甲基-2-十八烷氧基-[1，3]二噁烷-5-基胺
将上一步的1g三氟乙酰胺衍生物(2.08mmol)溶解在10ml四氢呋喃中，向其中加入10ml 4％氢氧化钠。混合物在室温下剧烈搅拌直至试剂完全消失(经4小时)。
然后，浓缩部分溶剂，用100ml乙醚萃取3次。在氯化钙上干燥有机相，过滤并蒸发。得到无需进一步提纯的810mg白色粉末(收率：100％)。1H NMR(400MHz，CDCl3，δdppm)：0.89(t，J＝7Hz：3H)；1.20-1.50(mt：30H)；1.49(s：3H)；1.62(mt：2H)；1.67(宽5：2H)；2.71(mt：1H)；3.46(t，J＝7Hz：2H)；3.54(宽d，J＝10Hz：2H)；4.30(dd，J＝10和1.5Hz：2H)。b-合成甲氧基(聚乙二醇5000)-N-(2-甲基-2-十八烷氧基)-[ 1，3]二噁烷 -5-基)酰胺(化合物E)
最后一步是将脂质胺与PEG的酸(其合成方法描述在实施例5中)缩合。
将1.15g MeO-PEG5000-COOH(0.23mmol)溶解在5ml二氯甲烷中。加入18μl三乙胺(1.30mmol)，然后加入100mg 2-甲基-2-十八烷氧基-[1，3]二噁烷-5-基胺(0.26mmol)。加入172mg BOP(0.39mmol)，反应混合物在室温下静置小时。
加入乙醚(60ml)沉淀反应混合物，离心，用乙醚洗涤，然后注入制备HPLC中。分离出最纯馏分，得到420mg白色冻干产物(收率：34％)。1H NMR(400MHz，CDCl3，δdppm)；0.89(t，J＝7Hz：3H)；1.20-1.50(mt：30H)；1.48(s：3H)；1.55-1.75(mt：2H)；3.39(s：3H)；3.40-3.90(mt：448H)；3.89(宽d，J＝8.5Hz：1H)；4.05(s：2H)；4.30(宽d，J＝12Hz：2H)；7.57(d，J＝8.5Hz：1H)。实施例7：用顺式和反式酸敏感化合物A紧密结合DNA的研究
上文制得的顺式和反式酸敏感化合物A具有类似于通常用于DNA非病毒转染的阳离子脂质的结构，尤其是，在它们的结构中含有环状原酸酯官能团，从而使它们具有酸敏感性。
因此，该实施例的目的是为了表明顺式和反式酸敏感化合物A具有将待转染DNA特异性紧密结合到阳离子脂质上的能力，同时具有在酸性介质中发生降解进而释放紧密结合的DNA的能力。通过用溴化乙锭(EtBr)进行荧光测试，能够很容易地证明上述能力：没有荧光表明没有游离DNA存在，意味着DNA被紧密结合。
在下文中，使用实施例3中制备的顺式和反式酸敏感化合物A，用使用WO97/18185中描述的下式非酸敏感类似物作为对照。H2N-(CH2)3-NH-(CH2)4-NH-(CH2)3-NH-CH2-CO-Gly-N[(CH2)17-CH3]2该非酸敏感类似物在本文中称为“对照阳离子脂质”。
将等体积的不同滴度脂质溶液与DNA溶液混合，使DNA与递增量的对照阳离子脂质或顺式或反式酸敏感化合物A接触。在150mM的氯化钠溶液中，制得浓度为10μl/ml的800μl DNA复合物样品，其具有递增量的对照阳离子脂质或顺式或反式酸敏感化合物A。
在时间t＝0，向上述样品中加入200μl pH为5并且浓度为0.1mol/l的缓冲液，将样品存储在37℃烘箱中。使用FluoroMax-2(JobinYvon-Spex)，用溴化乙锭(EtBr)，随时间变化测定荧光(在20℃测定)，激发和发射波长分别为260nmh 590nm。激发和发射的狭缝宽度设定为5nm。按1g/mlDNA/阳离子脂质或DNA/酸敏感化合物溶液(0.01mgDNA/ml)的量加入3μl溴化乙锭后，记录荧光值。
结果列于表1。在pH5，当用于紧密结合DNA的顺式或反式酸敏感化合物A或对照阳离子脂质的量太低(0.4nmol脂质/μgDNA)并因此DNA未被完全紧密结合时，随时间的变化，未测得明显的荧光变化。另一方面，相对于能确保完全紧密结合DNA的较大量(1.7nmol脂质/μg DNA和6.0nmol脂质/μgDNA)(非酸敏感)对照阳离子脂质，观测到顺式和反式酸敏感化合物A具有不同的性能。确实，正如荧光增强所证实，顺式和反式酸敏感化合物A随时间释放DNA，而非酸敏感的对照阳离子脂质则并非如此。此外，观测到DNA的释放发生在加入酸(pH5，37℃)数小时后。
根据酸敏感化合物的用量，在DNA的释放动力学中，观测到一种变化：酸敏感化合物A的用量越少，则DNA的释放越快。
上述研究表明了顺式和反式酸敏感化合物A的显著特性：它们能够紧密结合DNA与之形成复合物，并且它们在酸性介质中降解导致与DNA形成的复合物分解，从而释放DNA。因此，这些酸敏感化合物尤其可用于DNA非病毒转染至细胞中。实施例8：关于顺式和反式酸敏感化合物A的体内转染能力的研究
该实施例说明了顺式和反式酸敏感化合物A的体内转染能力(与前一实施例描述的酸敏感化合物A的非酸敏感类似物(对照阳离子脂质)相比)。
该研究在4个不同加载比例下进行：1.0、4.0、6.0或10.0nmol脂质/μgDNA。在上述各条件下进行试验，使用和不使用胎牛血清(″+或-血清″)。细胞的培养：在MEM(″极限必需培养基″)类培养基存在下，加入2mML-谷氨酰胺、50单位/ml青霉素和50单位/ml链霉素，培养取自人类宫颈上皮癌的海拉细胞(美国典型培养物保藏中心(ATCC)Rockville，MD，美国)。培养基和添加剂从Gibco/BRL life Technologies(Gaithersburg，MD，美国)购得。细胞在37℃的烧瓶中培养，并且培养器中有5％二氧化碳。转染：在转染的前一天，将海拉细胞转移至24孔板中，每个孔中的细胞数为30,000-50,000。24小时后，这些稀释表现大约80％汇合。
为了转染，将细胞洗涤2次并在37℃用500μl培养基培养，使用(10％FCS v/v)或不使用血清。
将含有0.5μg质粒DNA的50μl复合物加入到各个孔中(在加入孔中之前至少30分钟制备复合物)。在37℃，2小时后，在没有血清的板中增补10％(v/v)FCS(胎牛血清”)。
在37℃，在5％二氧化碳下，将所有的板放置36小时。荧虫素酶活性的测定：简而言之，用500μl PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤转染的细胞2次，然后用250μl试剂(Promega细胞培养溶胞剂，来自Luciferase Assay System试剂盒)裂解。
用Wallac Victor2发光计(1420 Multilabel couter)，测定在4℃离心(12,000xg)5分钟的10μl等份溶胞产物上清液。
在荧虫素、辅酶A和ATP存在下，发射光10秒，以2000个处理的细胞为基准，分析并表达荧虫素酶活性。用相对光照单位(″RLU″：″相对光照单位″)表达荧虫素酶活性，并用样品中的蛋白质浓度进行正态化，使用Pierce BCA试剂盒(Rockford，IL，USA)获得所述样品。
列于图2的结果显示了3个试验化合物(顺式和反式酸敏感化合物A和对照阳离子脂质)的高转染活性。在3个化合物之间没有测得明显的差别。在没有血清时，在所有情况下的转染水平都高(105-107RLU/μg蛋白质)，并且转染能力随酸敏感化合物或对照阳离子脂质的用量增加。在所有情况下，血清的存在抑制了转染。
因此，该实施例表明，与其非酸敏感类似物(对照阳离子脂质)相比，顺式和反式酸敏感化合物A保持了转染能力。更一般地说，在已知的用于非病毒转染的阳离子脂质类分子中引入酸敏感环状原酸酯官能团不会破坏这些化合物有效转染DNA的能力。实施例 9：酸敏感化合物C和D作为非离子表面活性剂用于DNA/阳离子脂质转染复合物的胶体稳定
该实施例说明了，相对于DNA/阳离子脂质转染颗粒，本发明(d)中定义的酸敏感PEG氧基化脂质能用作非离子表面活性剂，起到胶体稳定作用。
在该实施例中，使用的阳离子脂质已在实施例7和8中使用，并在WO97/18185中有所描述，且结构如下：H2N-(CH2)3-NH-(CH2)4-NH-(CH2)3-NH-CH2-CO-Gly-N[(CH2)17-CH3]2(对照阳离子脂质)。
实施例5中制备的化合物C和D用作酸敏感PEG化脂质。作为对照，使用BRIJ 700(SIGMA)和下式的PEG化脂质：
Figure A0181520000491
                       类似物D它们分别是化合物C和D的非酸敏感类似物，并且已知用作非离子表面活性剂(参见例如WO98/34648)。两个对照物在水中使用，浓度为10g/l。
将含有对照阳离子脂质和一种PEG化脂质(化合物C或化合物D或Brij 700或类似物D)的溶液与DNA溶液等体积混合，由在75mM氯化钠溶液中的10μg/ml DNA制备1ml核脂质复合物样品(DNA/对照阳离子脂质)。所有这些样品的对照阳离子脂质/DNA比为1.5(nmol脂质/μg DNA)，并含有递增量的PEG氧基化脂质(以聚合物/DNA重量/重量比表示)。
在混合后测定所得到的颗粒大小，从而可以研究酸敏感PEG化脂质(化合物C或D)的量或非酸敏感PEG化脂质(Brij 700或类似物D)的量对对照阳离子脂质/DNA复合物的稳定作用的影响。用CoulterN4Plus仪，使用装满800μl含有0.01mg DNA/ml的不同溶液的塑料透明小容器(4个透明侧面)，测定水动力学直径，检测是在90°以单一方式进行。
结果列于附图3中，附图3描述了对照阳离子脂质/DNA颗粒大小随化合物C或D或Brij700或类似物D的用量的变化。
可以看出，当用量最低时，酸敏感PEG化脂质以及它们的稳定对照物能够形成小尺寸(小于100nm)对照阳离子脂质/DNA颗粒，而在没有酸敏感或非酸敏感PEG化脂质时或在非酸敏感PEG化脂质的量太低时，这些同样的对照阳离子脂质/DNA颗粒自动聚集(尺寸大于1μm)。
因此，该实施例表明，化合物C和D，更一般地说，本发明(d)中定义的具有通式(I)的酸敏感PEG化脂质，能够用作非离子表面活性剂，并且它们的胶体稳定能力与通常用于核脂质颗粒的胶体稳定的稳定非离子表面活性剂(亦即是非酸敏感的，如Brij 700)不相上下。实施例10：化合物C和D之pH值对DNA/阳离子载体复合物的胶体 稳定性的影响
该实施例说明了本发明(d)中定义的具有通式(I)的酸敏感PEG化脂质(用作非离子表面活性剂用于稳定DNA/阳离子脂质核脂质复合物)能够在酸性pH下降解并进而释放出所述的核脂质复合物。
该实施例中利用的显著特性是：当PEG化脂质被不带有脂质部分的PEG代替时，胶体稳定作用将不存在。确实，在非缓冲介质中，在阳离子载体和酸敏感PEG化脂质存在下配制DNA导致小颗粒产生(参见实施例9)。相反，仅使用PEG(即，不与脂质部分偶联)，相同的研究表明，不存在任何稳定作用。
该实施例中使用的酸敏感PEG化脂质是实施例5中制备的化合物D及其非酸敏感类似物(在上述实施例和下文中，所述非酸敏感类似物被称为“类似物D”)。
将含有对照阳离子脂质和化合物D或非酸敏感类似物D的溶液与DNA溶液等体积混合，由在75mM氯化钠溶液中的10μg/ml DNA制备1ml核脂质复合物样品(DNA/对照阳离子脂质)。所有这些样品的对照阳离子脂质/DNA比为1.5(nmol脂质/μgDNA)，并含有递增量的PEG化脂质(以聚合物/DNA重量/重量比表示)。
将pH＝5的100μl乙酸/乙酸钠缓冲液(0.1mol/l)加入这些样品中，这些样品在通风烘箱中恒温在37℃。随时间的变化测定颗粒大小。
所得结果如图4所示，其表明核脂质颗粒随时间变化，并且也随酸敏感或非酸敏感PEG氧基化脂质/DNA比变化(测定了3个重量/重量比：0.5、0.75或1)。
就类似物D而言(非酸敏感PEG化脂质)，pH对颗粒的胶体稳定作用没有影响：与所用的类似物D/DNA比无关，形成的颗粒尺寸小，大约为100nm。当t＝0时，对于化合物D，与化合物D/DNA比无关，测得相同的稳定性。
另一方面，在酸性pH下(pH5)，当化合物D用作非离子表面活性剂时，测得核脂质颗粒的大小随时间而增加。化合物D/DNA比越低，则核脂质颗粒大小增加的速度越快。因此，在低比例(0.5)下，4小时后，颗粒全部形成聚集体，而当化合物D用量大大过量时(比例为1)，根本没有或只有很少的颗粒形成聚集体。
因此，可以推论，化合物D对pH值敏感。事实上，核脂质颗粒大小随时间而增加表明了当使用酸性介质时，酸敏感PEG氧基化脂质(化合物D)发生降解(即，在化合物的酸敏感部分“未接枝”脂质部分)。
此外，通过增加酸敏感PEG化脂质/DNA比，聚集所需的时间也增加，这往往表明，酸敏感PEG化脂质的用量越高，则在越过临界点发生核脂质颗粒聚集之前，待降解的酸敏感PEG化脂质的量越多。因此，可以通过调节酸敏感胶体稳定剂的量，设定在给定pH下释放活性组分所需的时间。 实施例11：用阳离子脂质/中性共-脂质/化合物D混合物配制的DNA的体内转染
该实施例说明了诸如化合物D的非离子表面活性剂对用基于阳离子脂质的脂质体配制的DNA转移效力的影响。
1)   制备脂质体
将下式阳离子脂质
Figure A0181520000521
和中性脂质DOPE(由Avanti极性脂质得到，Birmingham，AL)按原样溶解在氯仿中，然后以等摩尔量混合。
将适量化合物D溶解在氯仿中，并加入上述混合物中。化合物D的用量以脂质总量的mol％表示。
在氩气流下蒸发有机溶剂，以便在试管底部形成脂质薄膜。真空干燥该薄膜至少1小时，然后，在4℃，用pH7.4的20mM HEPES缓冲液和5％葡萄糖进行再水合2小时。得到的脂质悬浮物在50℃加热30分钟，然后进行超声处理5分钟，以形成大约100nm脂质体均相悬浮物。
使用的DNA为含有受控于CMV启动子的CAT基因的质粒DNA。所用的质粒DNA具有下列标准：内毒素水平低于20U/mg，超螺旋DNA的量大于90％，混杂的大肠杆菌DNA少于5％，混杂的RNA少于5％并且混杂的蛋白质少于1％。
2)   制备DNA/脂质复合物
在快速和剧烈搅拌条件下，将等体积脂质体悬浮物(适当浓度)快速加入DNA溶液中。总的说来，1μg DNA与5nmol阳离子脂质形成复合物。形成的复合物具有大约100-240nm直径。
3)   体内给药
在所有试验中，使用大约6周大的雌性Balb/C小鼠。用106 M109细胞，在每个小鼠的右胁腹进行皮下注射。当肿瘤大小达到大约300mm3时，通过静脉注射使小鼠接受200μl DNA/脂质复合物。注射24小时后，摘取组织并存储于-70℃下备用。
4)  CAT分析
使用″FastPrep Cell Disrupter FP120″仪器(Bio 101/Savant)，将组织匀化。然后，以1000转数/分钟，将样品离心5分钟。用标准CATELISA方法(Roche，IN)，测定表达的CAT转基因的量。
5)   结果
分析了化合物D对DNA/阳离子脂质/DOPE(5/5/1)复合物的基因转移活性的剂量/反应曲线。化合物“类似物D”用作反面对照。同预料的一样，最高基因转移发生在肺中。可以看出，使用化合物“类似物D”以剂量-相依方式抑制了肺和肿瘤中的转染活性。增加化合物D的量，肺中的转染活性也被抑制。另一方面，在肿瘤中，基因转移似乎没有受到影响。上述结果与下述设想是一致的：在外渗后，肿瘤的酸性环境将导致PEG部分与颗粒其余部分分开。
因此，附图7所示的结果表明，相对于肺，化合物D能使基因对肿瘤的特异转移活性增加至40倍。实施例12：研究不同pH下酸敏感化合物的稳定性
该实施例说明了本发明酸敏感化合物具有酸敏感性，并且其酸敏感性可以根据存在的原酸酯环(5-或6-员环)特性进行调节。
为此，对于能够包括不同敏感度范围的各种酸敏感PEG化脂质，测定核脂质复合物(与实施例9和10中使用的核脂质复合物相同)大小随pH和时间的变化。以不变的对照阳离子脂质/DNA和酸敏感PEG化脂质/DNA，进行上述分析。
制备1ml DNA/对照阳离子脂质/酸敏感PEG化脂质复合物，使得
-对照阳离子脂质/DNA为1.5nmol/μg，
-酸敏感PEG氧基化脂质/DNA为0.5或1，和
-DNA浓度为20μg/ml(在75mM氯化钠溶液中)。
30分钟后，将500μl 0.05mol/l缓冲溶液和500μl 150mM氯化钠溶液加入在通风烘箱中恒温于37℃的样品中。这样，形成了酸性pH，测定颗粒大小随时间的变化。
样品的最终浓度为10μgDNA/ml(在75mM氯化钠溶液中)。使用的缓冲液为pH4、pH5和pH6的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液和pH7.4的Hepes/氢氧化钠缓冲液。
所得结果如附图5所示，其表明，对于上述实施例中制备的酸敏感化合物C和E，核脂质颗粒大小随pH和时间而变化，化合物C和E的不同之处仅在于所使用的原酸酯环(5-或6-员环)的特性不同。
对于这两个化合物，当pH为酸性时，测得核脂质颗粒大小随时间而增加，这表明，它们发生了降解。另一方面，当pH为7.4时，没有观测到核脂质颗粒大小随时间而增加。此外，pH越低，则核脂质颗粒的聚集越快。
最后，观测到两个试验化合物C和E之间的动力学差别很大：在pH6时，在使用化合物E的情况下，酸化大约1小时后，核脂质颗粒开始聚集，而使用化合物C时，能够稳定至少4小时。
这些结果表明了酸敏感化合物C和E的几个显著特性，更一般地讲，表明了本发明的一类酸敏感化合物的显著特性：
-在酸性pH值，它们具有高敏感度，在所有情况下，可以看出，pH越低，则它们去稳定越快，
-在生理pH(pH7.4)下，它们都比较稳定，并且
-根据所用的原酸酯基团(5-或6-员环)的特性，它们的降解动力学差别很大。

Claims (27)

1.酸敏感化合物及其盐，其特征在于这些化合物含有环状原酸酯和至少一个选自聚亚烷基二醇、单或多糖、亲水治疗性分子或多胺类基团的亲水取代基。
2.根据权利要求1的酸敏感化合物，其特征在于它们具有下列通式：其中：·  g是可以为0、1、2、3或4的整数，·  G表示氢原子、含有1-6个碳原子的饱和或不饱和的直链或支链烷基或表示芳基，·  G1和G2表示：(a)其中一个为选自多胺类基团的亲水取代基，另一个为选自单链或双链烷基、甾类衍生物或疏水树状聚合物的疏水取代基，或者(b)其中一个为含有10-24个碳原子并任选含有一个或多个不饱和部分的疏水直链烷基，另一个为下列通式所示的基团：其中i是1-4的整数，j是9-23的整数，并且亲水取代基选自多胺类基团，或者(c)其中一个为选自聚亚烷基二醇或者单或多糖的亲水取代基，另一个为选自聚亚烷基亚胺的取代基，或者(d)其中一个为选自聚亚烷基二醇或者单或多糖的亲水取代基，另一个为疏水取代基，其选自单链或双链烷基、甾类衍生物、疏水树状聚合物或选自单链或双链烷基、甾类衍生物或疏水树状聚合物和具有1-20个单体单元的聚亚烷基二醇分子之间的共价共轭物，或者(e)其中一个为选自聚亚烷基二醇或者单或多糖的亲水取代基，另一个为治疗性分子，或者(f)其中一个为具有亲水特性的治疗性分子，另一个为选自单链或双链烷基、甾类衍生物或疏水树状聚合物的疏水取代基。
3.权利要求2的酸敏感化合物，其特征在于G选自氢、甲基、乙基或苯基。
4.权利要求2的酸敏感化合物，其特征在于单链或双链烷基由一个或两个具有10-24个碳原子并任选含有一个或多个不饱和部分的直链烷基构成。
5.权利要求2的酸敏感化合物，其特征在于甾类衍生物选自甾醇、甾类或甾类激素。
6.权利要求2的酸敏感化合物，其特征在于疏水树状聚合物是聚(苄基醚)。
7.权利要求2的酸敏感化合物，其特征在于聚亚烷基二醇选自平均分子量为102-105道尔顿的聚亚烷基二醇。
8.权利要求7的酸敏感化合物，其特征在于聚亚烷基二醇选自平均分子量为102-105道尔顿的聚乙二醇。
9.权利要求2的酸敏感化合物，其特征在于单或多糖选自吡喃糖、呋喃糖、葡聚糖、α-直链淀粉、支链淀粉、果聚糖、甘露聚糖、木聚糖和阿拉伯聚糖。
10.权利要求2的酸敏感化合物，其特征在于聚亚烷基二醇或单或多糖与导向成分共价连接。
11.权利要求10的酸敏感化合物，其特征在于导向成分选自糖、肽、蛋白质、寡核苷酸、脂质、神经递质、激素、维生素或其衍生物。
12.权利要求10的酸敏感化合物，其特征在于聚亚烷基亚胺选自含有下列通式所示的单体单元的聚合物：
Figure A0181520000041
其中R可以是氢原子或下式基团，并且n是2-10的整数，p和q是整数，并且p+q之和能满足聚合物平均分子量为100-107Da，当然，不同单元-NR-(CH2)n-之间的n值可以不同。
13.权利要求2的酸敏感化合物，其特征在于各个取代基G1和G2通过“间隔”分子间接连接到环状原酸酯上。
14.权利要求13的酸敏感化合物，其特征在于所述“间隔”分子选自烷基(1-6个碳原子)、羰基、酯、醚、酰胺、氨基甲酸酯或硫代氨基甲酸酯键、甘油、脲、硫脲或这些基团中一些基团的组合。
15.权利要求2的酸敏感化合物，其特征在于治疗性分子选自肽、寡肽、蛋白质、抗原及其抗体、酶及其抑制剂、激素、抗生素、镇痛药、支气管扩张药、抗菌剂、抗高血压药、心血管剂、作用于中心神经系统的试剂、抗组胺药、抗抑郁药、安定药、抗惊厥剂、抗炎物、兴奋剂、止吐剂、利尿剂、镇痉剂、抗局部缺血剂、限制细胞死亡的试剂或抗癌剂。
16.一种组合物，其特征在于它们含有权利要求1-15中定义的至少一种酸敏感化合物。
17.一种组合物，其特征在于它们含有至少一种生物活性物质和权利要求2定义的酸敏感化合物，化合物中G1和G2具有(a)、(b)、(c)或(d)中给出的定义。
18.权利要求17的组合物，其特征在于所述生物活性物质是权利要求15定义治疗性分子或是核酸。
19.权利要求16或17的组合物，其特征在于它们还含有一种或多种辅剂。
20.权利要求19的组合物，其特征在于所述辅剂是一种或多种中性脂质。
21.权利要求20的组合物，其特征在于所述辅剂选自天然或合成、两性离子脂质或生理条件下不带离子电荷的脂质。
22.权利要求21的组合物，其特征在于所述辅剂选自二油酰基磷脂酰基乙醇胺(DOPE)、油酰基棕榈酰基磷脂酰基乙醇胺(POPE)、二硬脂酰基磷脂酰基乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰基乙醇胺、dimirystoyl磷脂酰基乙醇胺及其N-甲基化1-3次衍生物、磷脂酰甘油、二酰甘油、糖基二酰甘油、脑苷脂(尤其是例如半乳糖脑苷脂)、鞘脂(尤其是例如鞘髓磷脂)或脱唾液酸神经节苷脂(尤其是例如脱唾液酸GM1和GM2)。
23.权利要求16-22中任一项的组合物，其特征在于所述组合物还含有用于注射制剂的药学上可接受的载体。
24.权利要求16-22中任一项的组合物，其特征在于所述组合物还含有用于向皮肤和/或粘膜投药的药学上可接受的载体。
25.权利要求1一15中任一项定义的酸敏感化合物用于制备治疗疾病用药物的用途。
26.权利要求2定义的酸敏感化合物用于制备用于核酸转染的药物的用途，其中，酸敏感化合物中的G1和G2具有(a)、(b)、(c)或(d)给出的定义
27.权利要求2定义的酸敏感化合物用作药物，其中，酸敏感化合物中的G1和G2具有(e)或(f)给出的定义。
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