CN1863559A - 化合物 - Google Patents
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- A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
Abstract
本发明提供了一种治疗剂用递送运载体，包括改性脂质和治疗剂；其中改性脂质包括脂质和递送、导向或稳定化结构部分(DTS结构部分)；其中，脂质通过连接体与DTS结构部分连接，所述连接体在生物学流体中稳定，在规定的条件下不稳定；其中DTS结构部分在脂质和治疗剂形成复合体后与脂质连接。
Description
本发明涉及一种化合物以及一种递送运载体。此外，本发明涉及化合物和递送运载体的制备过程以及化合物和递送运载体在治疗和药物递送中的应用，其中所述治疗尤其是指基因疗法(特别是基因转移)。
基因疗法的一个方面涉及将外来核酸(诸如DNA)导入细胞中，这样，其已表达的蛋白便可执行所需的治疗性功能。
此类治疗的例子包括插入TK、TSG或ILG基因以治疗癌症；插入CFTR基因以治疗囊性纤维化；插入NGF、TH或LDL基因以治疗神经变性疾病和心血管疾病；插入IL-1拮抗剂基因以治疗类风湿性关节炎；插入HIV抗原和TK基因以治疗AIDS和CMV感染；插入抗原和细胞因子以产生疫苗的作用；插入β-球蛋白以治疗血红蛋白病，诸如地中海贫血症。
许多现行的基因疗法研究使用的是腺病毒基因载体(诸如Ad3或Ad5)或其它的基因载体。然而，由于这些应用伴随着严重的问题，因此激励了人们发展危险性较小的、非病毒性的基因传递方法。
具有巨大潜力的非病毒性传递系统涉及到阳离子型脂质体的使用。鉴于此，采用阳离子型脂质体(通常由中性磷脂和阳离子型脂质组成)将DNA、mRNA、反义寡核苷酸、蛋白和药物传递到细胞中。许多阳离子型脂质体都是商业可得的，且目前也合成了许多新型的阳离子型脂质。这些脂质体的效果都用体内和体外的效果进行了说明。
在制备阳离子型脂质体中有用的一种细胞转染剂是N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲铵氯化物，也称作“DOTMA”。
最常用的一种阳离子脂质体系由中性磷脂二油酰磷脂酰乙醇胺(常称为“DOPE”)以及阳离子型脂质3β-[(N，N-二甲氨基乙烷)氨基甲酰]胆固醇(常称作“DC-Chol”)组成。
在人类基因疗法中，尽管发现了已知阳离子型脂质体的功效，但还需要优化阳离子型脂质体的基因转移的效果。随着人类基因组计划的完成，如同基因疗法所述，使用基因用于治疗有期望成为一种革命性的医学方法。在本文中，尽管其效果仍不如病毒学方法，非病毒型传递仍逐渐被科学界认为是对于人类应用而言最安全的选择。
在过去的十年中，对于复合大分子构造，对该领域展开了大量的研究，包括各种现有技术的多种元素(病毒蛋白或肽类、脂质体、聚合物、导向策略以及隐秘(stealth)性质)。
WO01/48233教导了一种以三联体为基础的体系，该三联体由病毒核心肽Mu、质粒DNA以及阳离子型脂质体(LMD)组成。该技术在体外获得了很好的成功且在体内也获得了具有潜力的结果。但是，对于所有现行的非病毒型工艺而言，为了达到体内治疗性水平，还需要更多的发展。
WO01/48233和WO02/48380教导了一种以改性脂质为基础的体系，该改性脂质带有一碳水化物基团。人们发现此种改性脂质稳定且毒性较低。
为了该目标，制剂的粒子在生物学流体(血清、肺内粘液)中必须是稳定的，同时保持着有效的转染能力。
这一要求是所有现有技术的主要障碍之一。现有稳定的制剂的转染能力很弱，而大多数现有的有效转染性试剂则由于其不稳定性而在应用范围上受到很大的限制。
给药后(对于全身应用则在血液中；对于肺部局部给药则在粘液中)，带电荷的复合体暴露在盐和生物大分子之下，从而导致很强的胶体聚集，以及导致生物活性元素(调理素)吸附在其表面之上。所述基因载体经历强烈的变化，可包括沉淀、导致巨噬细胞清除颗粒的蛋白结合、导致其破裂的表面干扰。
为了制备用于体内外细胞专一导向的药物和基因递送体系，需要作出计划以制备具有足够活性以展现治疗效果的生物流体稳定的递送体系。因此，对于有效的药物/基因递送运载体，在稳定性和活性之间必须找到一个平衡点。
在文献中记载的一些方法使用了对酸不稳定的脂质，这些脂质被认为在内体内经胞吞作用而被裂解，从而可帮助药物或DNA或pDNA释放到细胞溶胶中。
对酸不稳定的或还原敏感的脂质用以促进药物/pDNA的释放——教导了以下策略步骤以将对酸不稳定的(酯类、乙烯基醚类)或还原敏感的-连接体(二硫化物)导入到脂质体/脂质体-DNA复合体(lipoplex)中以帮助药物或基因从酸性腔室诸如内体中释放出来。
原酸酯：根据Nantz等人(1)所述，含有原酸酯的脂质在pH 4.5、38℃环境下暴露一段时间(未指明)导致完全水解。然而，pH 4.5是溶酶条件，而作者声称的含有该新脂质的脂质体制剂导致潜在的内体逃逸不能被证明，原因是内体腔室中的pH的范围所致(开始的内体为6，后来的内体为5)。
Diplasmenyl脂质：根据Thompson等人(2，3)所述，含乙烯基醚的脂质有效地水解成脂肪酸醛和甘油磷酸胆碱，当＞20％的脂质水解后可增加脂质体的渗透性。该体系对于典型的药物递送很有意义。然而，没有给出任何基因递送的数据，而只是说正在进行之中。
二硫键：根据Hughes等人，在还原环境下例如内体和细胞溶胶中，向脂质中引入二硫键，该脂质可选择性地使pDNA/脂质体络合物不稳定。脂质，1，2-二油基-sn-甘油-3-琥珀酰-2-羟乙基-二硫化物鸟氨酸(DOGSDSO)与DOPE联合应用(4)，与曾经报道的脂质的非二硫化物类似物相比较，效果增强了至多50倍(5)。类似的，制备胆固醇基-半-二硫-二羟乙酰基-三(氨基乙基)-胺(CHDTAEA)，并与DOPE联合应用作为中性辅助脂质(6)。与DC-Chol脂质体比较，其转染效率增加并且细胞毒性有所下降。Scherman等人已描述，还原敏感性脂多胺(lipopolyamines)(RSLs)作为一种新的非病毒基因传送递送系统，具有改良的转基因表达，用于调整pDNA的释放(7)。这些化合物在脂质主链的不同位置引入二硫桥，形成微团，将pDNA压缩为直径约为100nm的小微粒。据报道，他们对于还原条件和血清敏感。
含二硫键的PEG脂质：根据Huang等人，一种新的可分的聚乙二醇偶联物mPEG-DTB-DSPE，其在还原环境中暴露时可再生天然磷脂DSPE(8)。在pH7.2，37℃，在1mM的Cys存在的条件下，DOPE制剂：mPEG-DTB-DSPE(100∶3，m/m)在30分种内释放出俘获的荧光团。
后包覆(post-coating)(结合)产生隐秘脂质体-大多数现行生产隐秘脂质体或脂质体-DNA复合体的方案使用聚乙二醇连接的脂质，该脂质预温育进入递送运载体(附图1A和1B)。只是在近期，Wagner(9)和Xu(10)报道了后包覆策略，其中利用确立的巯基化学或酰胺键化学与脂质体/脂质体-DNA复合体的表面形成共价的不可水解的键。
本发明解决了现有技术所存在的问题。
本发明的一个方面是提供一种治疗剂用递送运载体，其包括改性脂质和治疗剂；其中改性脂质包括脂质和递送、导向或稳定化结构部分(DTS结构部分)；其中脂质通过在生物学流体中稳定且在限定的条件下不稳定的连接体与DTS结构部分连接起来；其中，DTS结构部分在脂质与治疗剂形成复合体后与脂质连接。
本发明的一个方面是提供一种用于治疗剂用递送运载体的制备方法，所述治疗剂用递送运载体包括改性脂质和治疗剂，这种方法包括如下几步：(a)形成包含连接体结构部分的脂质和治疗剂的复合体；(b)通过连接体结构部分将脂质和递送、导向或稳定化结构部分(DTS结构部分)连接起来，其中在DTS结构部分和脂质之间的连接在生物学流体中稳定且在限定的条件下不稳定。
本发明的一个方面是提供一种如下式所示的改性脂质：
其中A和B之一是脂质，另一个是递送、导向或稳定化结构部分(DTS结构部分)；其中X和Y独立地是任选的连接体基团；其中R1是H或烃基；其中R2是孤电子对或R4；其中R4是合适的取代基；其中R3和R5独立地选自H或烃基；其中Q选自O，S，NH。
本发明的一个方面是提供一种如下式所示的改性脂质：
其中A和B之一是脂质，另一个是递送、导向或稳定化结构部分(DTS结构部分)；其中X和Y独立地是任选的连接体基团；其中R1是H，O-或烃基；其中R2是孤电子对或R4，其中R4是合适的取代基。
本发明的一个方面是提供一种如下式所示的改性脂质：
其中A和B之一是脂质，另一个是递送、导向或稳定化结构部分(DTS结构部分)；其中X和Y独立地是任选的连接体基团。
本发明的另一个方面是提供一种本发明化合物或递送运载体或一种根据本发明方法制备的用于治疗目的的化合物。
本发明的另一个方面是提供一种本发明化合物或递送运载体或一种根据本发明方法制备的化合物或递送运载体在生产用于治疗遗传性障碍或状况或疾病的药物中的应用。
本发明的另一个方面是提供一种由本发明化合物或递送运载体或由根据本发明方法制备的化合物或递送运载体形成的脂质体/脂质体-DNA复合体。
本发明的另一个方面是提供一种制备脂质体/脂质体-DNA复合体的方法，包括由本发明化合物或递送运载体或根据本发明方法制备的化合物或递送运载体形成该脂质体/脂质体-DNA复合体。
本发明的另一个方面是提供一种本发明脂质体/脂质体-DNA复合体或一种根据本发明方法制备的用于治疗目的的脂质体/脂质体-DNA复合体。
本发明的另一个方面是提供本发明脂质体/脂质体-DNA复合体或根据本发明方法制备的脂质体/脂质体-DNA复合体在生产用于治疗遗传性障碍或状况或疾病的药物中的应用。
本发明的另一个方面是提供核苷酸序列或药物活性剂与任一种或多种如下物质的组合：本发明化合物或递送运载体、根据本发明方法制备的化合物或递送运载体、本发明脂质体/脂质体-DNA复合体或根据本发明方法制备的脂质体/脂质体-DNA复合体。
本发明的另一个方面是提供一种用于治疗目的的本发明组合。
本发明的另一个方面是提供一种本发明组合在生产用于治疗遗传性障碍或状况或疾病的药物中的应用。
本发明的另一个方面是提供一种药物组合物，包括本发明化合物或递送运载体或根据本发明方法制备的化合物或递送运载体，其中所述化合物或递送运载体和药物混合以及任选地和药学上可接受的稀释剂、载体或赋型剂混合。
本发明的另一个方面是提供一种药物组合物，包括本发明脂质体/脂质体-DNA复合体或根据本发明方法制备的脂质体/脂质体-DNA复合体，其中所述脂质体/脂质体-DNA复合体和药物混合以及任选地和药学上可接受的稀释剂、载体或赋型剂混合。
本发明其他一些方面在所附权利要求书中定义。
我们已发现提供特别的含治疗剂如核苷酸或其他药物活性剂如“小分子”的递送运载体是有益的。包括脂质和DTS结构部分的递送运载体，其中它们之间的连接体在细胞外生物学流体中是稳定的且在细胞内生物学流体中和/或在限定的条件中是不稳定的，这种递送运载体的提供具有如下作用：
*在不危害核心载体(core vector)完整性情况下，对药物和基因递送体系的表面保护和/或功能化(导向性)。
*DTS结构部分诸如导向结构部分暂时或持久性传入到药物或基因递送运载体。可通过选择在脂质或DTS结构部分上不同的基团来控制DTS结构部分的持久性。
*提供带有DTS+靶分子的药物/基因递送运载体自组装的单罐反应(one pot reaction)。该自组装包括有单一装配，也可包括由单罐中的分阶段反应提供的分阶段组装。任何一方面都可通过简单的对过量非反应试剂的透析而避免过度的纯化过程。
*DTS结构部分和脂质的连接强度可通过在特定pH条件中的水解反应控制。
现有技术中后包覆的单罐方法主要基于氨氧基(aminoxy)和醛、酮反应形成-C＝N-(与Schiff-碱相似的)共价键的选择性和高反应性。重要的是，这种反应可以在碱或酸性pH的含水环境中进行。此外，当暴露于含水条件中时反应基团没有象NHS-活化的羧基和其他酯的情况出现部分分解。因此，反应物质例如醛/酮和氨氧基或硫醇和醇的稳定性允许在没有由于水解/降解引起的反应物质损失情况下对表面反应的总体控制。换言之，应用配体(后结合(post-conjugated)物质)和联结体(ligate)(在脂质体/脂质体-DNA复合体/微团表面上的反应性物质)的化学计量法很容易地控制后包覆化合物(配体)的数量，此外，醛和酮反应性的差别导致结合的配体和联结体可调的稳定性。醛比酮具有更好的反应性，因此能够比酮类似物形成更快，更稳定的加合物。结果为，可优选使用醛用于形成更稳定的加合物，而酮则应用于形成较不稳定的结合。然而，必须强调的是，根据取代基的属性，醛和酮都表现出与包含氨氧基的化合物不同的稳定性。因此，醛和酮均可应用于形成暂时和持久性的连接。
我们已经取得稳定化结构部分诸如聚乙二醇分子(PEG)的后偶联(post-coupling)，其中对脂质体-DNA复合体使用化学选择性对酸不稳定并且稳定偶联策略。引起对血清诱导的脂质体-DNA复合体降解和沉淀的抗性显著提高，和在生物学相关环境下稳定化结构部分的可调性释放。需要的脂质体-DNA复合体的稳定化程度取决于应用的稳定化结构部分的摩尔比率。我们还发现使用导向结构部分诸如叶酸基(folate)与PEG稳定化脂质体-DNA复合体后偶联，可实现导向能力并提高转染效率。这种工艺可允许经透析来简单纯化。
稳定化结构部分诸如PEG结构部分的酸不稳定性，可在稳定化结构部分和脂质体-DNA复合体之间形成Schiff-碱时取得，例如在PEG和胺或酰肼单元之间。酸抗性可通过稳定化结构部分和脂质体-DNA复合体的氨氧基单元反应取得。尤其有益的稳定化单元是二醛-PEG，其可用于通过与一个醛形成Schiff-碱稳定脂质体-DNA复合体。通过加入一含氨氧基的导向配体，第二个醛可用于导向。
优选方式
在一个优选方式中，在与细胞表面接触或在细胞内，所述连接是不稳定的。
在一个优选方式中，在限定的pH条件中，所述连接是不稳定的。本领域技术人员能够设计合适的连接体以使其在所要求的pH条件中不稳定。所要求的pH条件特别是指那些与存在递送运载体或脂质的条件有显著区别的pH条件。
在一个优选方式中，在pH为5-6.5，特别是5.3-6.2，或5-6，或5.5-6.5的条件下，所述连接是不稳定的。其他合适pH值是本领域技术人员可推断得出的。例如，在肿瘤细胞中已发现的pH值下，所述连接可能不稳定，所述pH值为6.5-7.0；在胃肠道内已发现的pH值下，所述连接可能不稳定，例如在胃中，其pH值一般为1.5-2.5。
在一个优选方式中，在还原条件下所述连接是不稳定的。
本领域技术人员应理解，能够获得任何合适的如下连接体，其在生物学流体中是稳定的，且在限定的条件中是不稳定的。优选的连接体如下所述。
在一个优选方式中，为如下式所示的改性脂质：
其中A和B之一是脂质，另一个是递送、导向或稳定化结构部分(DTS结构部分)；其中X和Y独立地是任选的连接体基团；其中X和Y独立地是任选的连接体基团；其中R1是H或烃基；其中R2是是孤电子对或R4；其中R4是合适的取代基；其中R3和R5独立地选自H或烃基；其中Q选自O、S、NH。
术语“烃基”此处是指至少包括C和H的基团，或者任选包括一个或多个其他合适的取代基。所述合适的取代基的例子包括卤素、烷氧基、硝基、烷基、环状基团等等。除了取代基可以是环状基团之外，多个取代基结合起来也可能形成环状基团。如果烃基包含了不止一个C原子，这些C原子没有必要依次连接。例如，至少两个C原子可以通过合适的元素或基团连接起来。因此，烃基可以包括杂原子。合适的杂原子对于本领域技术人员而言是显而易见的，例如，硫、氮或氧。非限定性的烃基例子是酰基。
典型的烃基是碳氢化合物基团。在这里，术语“碳氢化合物”是指任意一种烷基，烯基，炔基，这些基团可能是直链，支链或环状，或芳香基团。术语碳氢化合物也包括那些可任选取代的基团。如果碳氢化合物是具有一个或多个取代基的支链结构，该一个取代基可能在碳氢化合物的主链或支链其中之一上，又或，该多个取代基可能同时在碳氢基团的主链和在支链上。
在一个优选方式中，为如下式所示的改性脂质：
其中A和B之一是脂质，另一个是递送、导向或稳定化结构部分(DTS结构部分)；其中X和Y独立地是任选的连接体基团；其中R1是H，O-或烃基；其中R2是孤电子对或R4，其中R4是合适的取代基。
在一个优选方式中，为如下式所示的改性脂质：
其中A和B之一是脂质，另一个是递送、导向或稳定化结构部分(DTS结构部分)；其中X和Y独立地是任选的连接体基团；其中R1是H，O-或烃基；其中R2是孤电子对或R4，其中R4是合适的取代基；其中R3和R5独立地选自H或烃基；其中Q是合适的取代基。
优选的，R2是R4。R4可选自任何合适的取代基。合适的取代基包括吸电子基团，例如卤化烃，特别是氟化烃；硝基酚，特别是对硝基苯酚。
优选的，Q选自OH、SH、伯胺、仲胺、叔胺和烃基。
在一个优选方式中，为如下式所示的改性脂质：
其中A和B之一是脂质，另一个是递送、导向或稳定化结构部分(DTS结构部分)；其中X和Y独立地是任选的连接体基团。
在一个优选方式中，A是DTS结构部分，B是脂质。本领域技术人员应理解，A可能是脂质，B可能是DTS结构部分。
任选的连接体Y
在一个优选方式中，任选的连接体Y是存在的。
在一个方式中，Y可选自O，S，NH和烃基。
在一个优选方式中，Y是O(氧)。在这种情况下，本发明改性脂质的化学式为：
在另一方式中，Y是烃基。
优选的，Y可选自-[CnHn-2]a-[NH]b-[CZ]c-[NH]d-[CZ]e-NH-，其中，a、b、c、d和e独立地选自0-10；其中n为5-10；其中，Z为O或S。
优选的，a、b、c、d和e独立地选自0-5，更优选为0-3，或0、1或2。
在更优选的方式中，
●a为0或1；和/或
●b为0或1；和/或
●c为0或1；和/或
●d为0，1或2；和/或
●e为0或1。
在更优选的方式中，Z为O。
在更优选的方式中，n为5。
在一种方式中，Y是寡聚或多聚的基团，例如PEG。
在一种方式中，Y选自-NH-、-NH-CO-NH-、-NH-CS-NH-、-NH-CO-NH-NH-CO-NH-、-CO-NH-、和-C5H3-NH-。
在一种方式中，Y选自：
-NH-(CH2)2-NH-C(O)-CH(CH2OH)-，
-NH-(CH2)2-NH-C(O)-CH(CH2SH)-，
-NH-(CH2)2-NH-C(O)-CH2O-，
-NH-(CH2)2-NH-(CH2)3-NH-C(O)-CH(CH2OH)-，
-NH-(CH2)2-NH-(CH2)3-NH-C(O)-CH(CH2SH)-，
-NH-(CH2)2-NH-(CH2)3-NH-C(O)-CH2O-，
-NH-CH2-C(O)-NH-，
-NH-。
在一个优选方式中，连接体X含有多胺基团或经由多胺基团连接在脂质上。
可以确认多胺基团是有益的。因为其提高了DNA的键合能力和合成的脂质体/脂质体-DNA复合体的基因转移效率。
在一个实施方案中，多胺基团优选是非天然存在的多胺。可以确认，多胺的头基是有益的，因为增加的氨基官能度提高了脂质体/脂质体-DNA复合体的总体正电性。此外，多胺已知能够强力地结合并稳定DNA。此外，多胺在细胞中天然存在，因此能够相信能将毒性问题减少到最低。
在另一个实施方案中，优选本发明多胺基团的两个或更多胺基团以一个或多个下述基团分隔开，该基团未在自然界发现其分隔天然存在的多胺化合物的胺基团(即，优选本发明多胺基团有非天然的间隔基)。
优选多胺基团含有至少两个被亚乙基(-CH2CH2-)相互分隔开(彼此间隔开)的多胺基团胺。
优选多胺基团的每一个胺通过亚乙基(-CH2CH2-)相互分隔开(彼此间隔开)。
适合的多胺典型的例子包括亚精胺、精胺、caldopentamine、norspermidine和norspermine。优选的多胺是亚精胺或精胺，因为这些多胺已知能够与单链或双链DNA相互作用。可供选择的优选多胺是caldopentamine。
任选的连接体X
在一个优选方式中，任选的连接体X是存在的。
在一种方式中，任选的连接体X是不存在的。
在一个优选方式中，X是烃基。
在一种方式中，如果X是存在的，则为烃基。它可以是如下碳氢化合物基团，选自任选取代的烷基、烯基和炔基。它可以是如下碳氢化合物基团，选自任选取代的含有1-10个碳原子的烷基、烯基和炔基。
R1
如上所述，DTS结构部分的持久性可受控于脂质或DTS结构部分上R1基团的选择(在本发明方法或组合物中——选择醛或酮)。
在一个优选方式中，R1选自H和烃基。
在一个优选方式中，R1选自H和碳氢化合物基团。
在一个优选方式中，R1选自H和含有1-10个碳原子的碳氢化合物基团。
在一个优选方式中，R1选自H、含有1-10个碳原子的烷基和含有1-10个碳原子的芳基。
在一个优选方式中，R1选自H、含有1-5个碳原子的烷基(如甲基和乙基)和含有6个碳原子的芳基。
在一个优选方式中，R1为H。
R2
优选的，R2为R4。R4可选自任何合适的取代基。合适的取代基包括吸电子基团如卤化烃，特别是氟化烃；硝基酚，特别是对硝基苯酚。
在一种方式中，R4选自H和任选取代的烷基、烯基和炔基。R4可选自H和任选取代的含有1-10个碳原子的烷基、烯基和炔基。
在一种方式中，R4是H。
在一种方式中，R2是H。
C＝N
C＝N键可为对酸不稳定的或耐酸的。
在一个优选方式中，C＝N键为对酸不稳定的。
在一种方式中，C＝N键是耐酸的。
DTS结构部分
递送、导向或稳定化结构部分(DTS结构部分)用于增强脂质的生物学作用，例如可提高它的稳定性、溶解性、生物利用度和/或对于特定生物材料的亲合力(导向作用)。
在一个优选方式中，DTS结构部分是递送和/或稳定化结构部分。
在一个优选方式中，DTS结构部分是递送和/或稳定化聚合物。
优选的，DTS结构部分选自单或双官能的聚(乙二醇)(“PEG”)，聚(乙烯醇)(“PVA”)；其他聚(氧化烯)例如聚(丙二醇)(“PPG”)；和聚(氧乙基化多元醇)(poly(oxyethylated polyols))例如聚(氧乙基化甘油)、聚(氧乙基化山梨醇)和聚(氧乙基化葡萄糖)及类似物。
如US-A-2001/0021763背景部分教导，所述聚合物可以是均聚物、无规或嵌段二元聚合物和三元聚合物，基于上述聚合物单体，其可以是直链或支链的，或者取代或未取代的，类似于mPEG和其他带帽的只有一个用于与连接体连接的活性位点的单官能PEG。
合适的附加聚合物包括聚(恶唑啉)，聚(丙烯酰基吗啉)(“PAcM”)和聚(乙烯基吡咯烷酮)(“PVP”)。PVP和聚(恶唑啉)是本领域熟知的聚合物，其制备方法和在合成mPEG中的应用对于本领域技术人员是显而易见的。PAcM以及它的合成和应用在US-A-5,629,384和US-A-5,631,322中公开。
本发明中可能使用的合适的导向结构部分包括抗体，例如人源化的单克隆抗体(Her_neu)和单链人抗体片段(如Fv)；配体例如叶酸基结构部分、碳水化合物表位(GM3、氨基乳糖，维生素，生长因子，肽，例如RGD和腱生蛋白，和蛋白质例如运铁蛋白(transferin)和白蛋白。
本发明中可能使用的合适的递送结构部分包括膜活性肽和蛋白质，例如毒素和TAT。
在本发明的一个优选方式中，DTS结构部分包含进一步的连接体基团，它能够与进一步的结构部分诸如DTS结构部分连接。因此，DTS可以被进一步改性为包含一附加的DTS结构部分以改变化合物的官能度。例如第一DTS结构部分可以稳定脂质所形成的脂质体/脂质体-DNA复合体。当脂质体/脂质体-DNA复合体形成以后，可以引入另一DTS，其可用于将脂质体/脂质体-DNA复合体导向特定生物学目标。
进一步的连接体可选自马来酰亚胺(maleimeido)基团、卤化碳、醛和酮。进一步的连接体优选为酮。
进一步的连接体可初始连接于第一DTS结构部分来提供，所述DTS结构部分含有至少两个能够形成连接的基团。这两个基团中一个可用于使第一DTS结构部分和脂质连接，另一个基团可用于使第二DTS结构部分与初始DTS/脂质复合体连接。优选的，第一DTS结构部分是稳定化结构部分。此种方式下，系统在进一步改性前被稳定化。优选的，第二DTS结构部分是导向结构部分。
脂质
在一个优选方式中，脂质是或包括胆固醇基团或甘油/神经酰胺主链。任何脂质类似结构或多胺都是合适的。
优选的，所述胆固醇基团是胆固醇。
优选的，所述胆固醇基团通过氨基甲酰键与X或Y连接。
所述胆固醇基团可以是胆固醇或其衍生物。胆固醇衍生物例如包括取代衍生物，其中一个或多个环CH2或CH基团和/或一个或多个直链CH2或CH基团被恰当地取代。替代性地或附加地，一个或多个所述环基团和/或一个或多个直链基团可以是不饱和的。
在一个优选的实施方案中，所述胆固醇基团是胆固醇。胆固醇因为其能够稳定所形成的脂质体双层而被认为是有益的。
优选的，所述胆固醇基团通过氨基甲酰键连接于所述任选的连接体。氨基甲酰键因为所形成的脂质体/脂质体-DNA复合体具有低或极低的细胞毒性而被认为是有益的。
在特别优选的方式中，脂质是-C(＝O)-O-Chol。在更优选的方式中，B是脂质-C(＝O)-O-Chol。
进一步的方式
可以通过任何方法制备如下式所示的本发明改性脂质：
我们发现由氨氧基化合物和醛或酮制备是特别有利的。
本发明另一方式提供了制备如下式所示的改性脂质的方法：
所述方法包括使(i)如下式所示的化合物：
与(ii)如下式所示的化合物反应：
其中A和B之一是脂质，另一个是递送、导向或稳定化结构部分(DTS结构部分)；其中X和Y独立地是任选的连接体基团；其中R1是H、O-或烃基；其中R2是孤电子对，H，烃基。
本发明另一个方式提供了一种组合物，其包括(i)如下式所示的化合物：
(ii)如下式所示的化合物：
其中A和B之一是脂质，另一个是递送、导向或稳定化结构部分(DTS结构部分)；其中X和Y独立地是任选的连接体基团；其中R1和R2独立地是H或烃基。
优选的，R2是H或烃基。
在一优选方式中，R2是H。
优选的，本发明方法是在含水介质中或在完全水性介质中进行。
本发明进一步提供了根据在此限定的本发明方法制备的化合物，根据在此限定的本发明方法得到的化合物，和/或能够根据在此限定的本发明方法得到的化合物。
优选的，该化合物与核苷酸序列混合或缔合。
该核苷酸序列可以是一个可用于治疗例如基因治疗的表达系统的部分或全部。
在一个优选方式中，本发明化合物与缩合多肽/核酸复合体混合以提供一种非病毒核酸递送载体。优选的，缩合多肽/核酸复合体包括本申请人的共同未决申请WO01/48233所揭示的化合物。优选的，多肽或其衍生物能够缩合核酸复合体。优选的，核酸复合体对于多肽或其衍生物是异源的。
优选的，化合物与药物活性剂混合或缔合。所述药物活性剂可选自PNA、ODN、RNA、DNA、肽、蛋白质和药物例如抗癌药阿霉素。
优选的，阳离子脂质体/脂质体-DNA复合体由本发明化合物和中性磷脂例如DOTMA或DOPE形成。优选的，所述中性磷脂是DOPE。
本发明将参照附图作进一步举例性的详细说明：
附图1A显示导向结构部分预插入到后加载(post-loading)脂质体中。
附图1B显示导向结构部分后插入(post-inserting)到脂质体中。
附图1C显示单罐偶联含水环境中的间隔基、导向化合物到预加载药物/基因载体系统中。
附图2显示在PEG-双-CHO存在下，在OptiMEM中的LMD(B198)稳定性试验。
附图3显示在OptiMEM中的LMD(B198/DOPE)(40∶60)稳定性试验。
附图4显示在PEG-双-CHO存在下，在OptiMEM中的LMD(B198/氨氧基脂质1)(30∶10)的稳定性。
附图5显示在OptiMEM中的LMD(B198/氨氧基脂1/DOPE)(30∶10∶60)稳定性试验。
附图6显示图表。
附图7显示图表。
附图8显示图表。
附图9显示图表。
附图10显示图表。
附图11显示图表。
附图12显示在血清中温育后，用不同PEGs改性的LD DOPE∶脂质B198∶胆固醇{45∶30∶25，m/m/m)的大小测量。
附图13显示在血清中温育后，用不同PEGs改性的LD(DOPE：脂质B198)∶脂质23(45∶30∶25，m/m/m)使用PCS测量的大小情况。
附图14显示加入血清后在pH 5.3条件下温育3小时后，用不同PEGs改性的LDDOPE∶脂质B198∶脂质23(45∶30∶25，摩尔比)的大小测量。
附图15显示在血清中温育后，用不同摩尔百分比PEGs改性的LD DOPE∶脂质B198∶氨氧基-脂质-1(45∶30∶25，m/m/m)的大小测量。
附图16显示加入血清后在pH 5.3条件下温育3小时后，用不同摩尔百分比PEGs改性的LD DOPE∶脂质198∶脂质-氨氧基1(45∶30∶25，摩尔比)的大小测量
附图17显示在Panc-1细胞中，不同摩尔百分比PEG2000-二醛改性的各种LDs的转染。
附图18显示由DOPE∶脂质B198∶脂质-氨氧基脂质1(45∶30∶25，摩尔比)脂质体(比例pDNA∶脂质＝1∶12)(0.1mg/ml(pDNA))组成的LD，用1和10摩尔百分比的不同PEGs改性，并在OVCAR-1细胞上转染。
附图19显示由DOPE∶脂质B198∶脂质23(45∶30∶25，m/m/m)脂质体(比例pDNA∶脂质＝1∶13)(0.1mg/ml(pDNA))组成的LD，用1和10摩尔百分比的不同PEGs改性，并在OVCAR-1细胞上转染。0对应无PEG的情况。
附图20显示在血清中温育后，用不同摩尔百分比PEGs改性的LD DOPE∶脂质B198∶脂质23(45∶30∶25，m/m/m)的大小测量。
附图21显示在血清中温育后，用不同摩尔百分比PEGs改性的LD DOPE∶脂质198∶氨氧基-脂质-1(45∶30∶25，m/m/m)的大小测量。
附图22显示由DOPE∶脂质B198∶脂质23(45∶30∶25，m/m/m)脂质体(比例pDNA∶脂质＝1∶14)(0.1mg/ml(pDNA))组成的LD进行导向试验，并在OVCAR-1细胞上转染。
附图23显示由DOPE∶脂质B198∶脂质-氨氧基脂质1(45∶30∶25，m/m/m)脂质体(比例pDNA∶脂质＝1∶12)(0.1mg/ml(pDNA))组成的LD，进行导向试验，并在OVCAR-1细胞上转染。
附图24a显示在血清中温育后，用不同摩尔百分比PEG2000-二醛改性的LD DOPE∶脂质16(45∶30∶25，m/m/m)的浊度测量。
附图24b显示在血清中温育后，用不同摩尔百分比PEG2000-二醛改性的LD DOPE∶脂质14(45∶30∶25，m/m/m)的浊度测量。
附图25图1和3显示由脂质体制剂LIPIDB198/DOPE/氨氧基脂质1(30∶60∶10，m/m/m)组成的制剂II转染后的切片表面的小神经胶质细胞。它表明脂质体-DNA复合体经噬菌作用被捕获。图2表明制剂II转染后的海马CA1区的锥形神经元。图4表明制剂III转染后的锥形神经元层(低放大率)。
附图26显示LMDa-e样品在10、20和30μg/动物pDNA鼻内给药的体内功效。质粒NGVL-1(7.5kbβ-gal)。A，μ/B198/DOPE；Bμ/B198/DOPE/氨氧基脂质1；C，μ/B198/DOPE/氨氧基脂质1+5％PEG2000-二醛；D，C18-μ/B198/DOPE/氨氧基脂质1；E，C18-μ/B198/DOPE/氨氧基脂质1+5％PEG2000-二醛。
本发明将结合实施例作进一步详细的说明。
实施例
合成过程
概述用Brucker AM 500，Brucker DRX400，Brucker DRX300或者Jeol GX-270Q光谱仪记录1H核磁共振光谱，使用剩余的同位素溶剂(CDCl3，δH＝7.26ppm)作为内标。用Micromass AutoSpecQ质谱仪(Brucker)或者MALDI(Brucker)质谱仪记录质谱，高效液相色谱(分析性和半制备性)使用Hitachi(Merck)系统进行。
缩写：DIEA，二异丙基乙胺；DMF，二甲基甲酰胺；DCM，二氯甲烷；EDC，1-乙基-3-(3′-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐；EDT，1，2-乙二硫醇；HBTU，O-苯并三唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐；HATU，O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐；MTBE，甲基叔丁醚；OpF，五氟苯酚；PCS，光子相关光谱；TFA，三氟乙酸；
导向化合物
概述 制备导向配体，包含叶酸基单元，该叶酸基单元经叶酸基的γ位羧基与固相上氨基酸的游离氨基形成共价结合，从而在肽和叶酸之间形成酰胺键。几乎所有的癌细胞系都过表达叶酸基受体(folate receptor)。应用双重策略：(a)叶酸基配体通过C端半胱氨酸残基的巯基后偶联到聚乙二醇单元的马来酰亚胺基团上，例如OpF-acon-PEG-mal或CHO-PEGmal和(b)，(c)通过氨氧基后偶联到二醛的第二游离醛基上，所述二醛已经后偶联到脂质体-DNA复合体上，见附图1B和1C。
叶酸-(Gly)3-(Arg)3-(Gly)3-Cys-OH
Fmoc-Cys(Trt)-Wang树脂(0.53mmol/g加载量，200mg)在DMF中浸涨16个小时，用DMF充分洗涤。使用在DMF中的哌啶(20％)(2×5mins)获得Fmoc解封，接着用DMF充分洗涤。对于每一个偶联步骤，使用3当量氨基酸，5当量DIEA和3当量HBTU。每一步偶联进行30分钟，接着在3当量DIEA条件下，使用DMF中醋酸酐(10％)进行加帽(capping)。使用3ml由TFA(10ml)，水(0.5ml)，EDT(0.25ml)，苯硫基甲烷(0.5ml)和苯酚(0.75g)组成的溶液处理3小时将肽裂解。加入MTBE(20ml)得到肽沉淀，然后以3000rpm离心20分钟。去除上清液，将得到的黄色肽溶解在3ml水中。HPLC分析(Hitachi，C18柱，梯度洗脱0-40％乙腈，40分钟，流速1ml/min)给出两个主峰，吸收λmax＝289nm。MALDI分析粗肽在m/z＝1355处给出一个主离子峰，与[M+]相应。在Gilson半制备性HPLC系统中用LaChrom C18半制备性柱纯化粗肽，流速设为7ml/min，检测波长为λ＝214nm。游离硫醇的存在可经阳性硫醇测试证实(Ellmann测试，也称作DTNB测试：将40mg 5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲)酸溶解在0.1M NaH2PO3缓冲液(pH＝8)中。在1mL此种溶液中加入20微升肽(10mg/mL)，立即变为黄色，其原因在于游离的硫醇)。MALDI m/z＝1355.84[M+]。HPLC分析(C18，0-40％乙腈，40mins，流速1ml/min，tr＝15min，单峰。
叶酸-Ser-Thr-Asp-Arg-Asp-Arg-Asp-Arg-CONH(CH2)3-NH-CH2-ONH2
概述 该导向配体被合成以偶联在LD或LMD系统表面的二醛-PEG2000的第二游离醛基上，作为附图1所述后偶联策略的一部分。
实验过程 DCM(50mL)中Boc-NHCO-CH2-COOH(0.5g，2.6mmol)，HBTU(1037mg，1.05当量)，DMAP(960mg，3当量)和Fmoc-NH-(CH2)3-NH3Cl(770mg，1当量)的悬浮液搅拌16小时，得到澄清溶液。碱性化合物使用柠檬酸(7％，3×100mL)萃取，用硫酸镁干燥有机相，蒸发所有溶剂。1H NMR σ(ppm)8.4(s，1H，NH-CO)，8.1(s，1H，NH-Fmoc)7.8(d，2H，7.4Hz，Fmoc)，7.6(d，2H，7.4Hz，Fmoc)，7.4(d×d，2H，7.2Hz，7.2Hz)，7.32(d×d×d，2H，4Hz，7.4Hz，1.1Hz)，5.6(m，1H，NH-氨氧基)，4.25(d，1H，Fmoc)，4.2(s，2H，CH2-氨氧基)，4.1(m，1H，Fmoc)，1.55(m，6H，CH2CH2CH2)，1.3(s，9H，Boc)。用TFA/水(80％)解封Boc基团1.5h。产物特征的确认通过质谱进行(ESI)，m/z＝410[M+K]+。HPLC(C18)，0-100％CH3CN，40min)，tR＝27.52min。
SPPS. 加入Fmoc-NH(CH2)3-NHCO-CH2-ONH2(320mg，1.15mmol)和DMAP(320mg，3.7当量)之前，Chlorotrytylresin树脂(0.5g，1.4mmol/g)在DCM中浸涨，振摇3小时。树脂的精确加载量根据UV(300nm)确定，消光系数ε(Fmoc)＝7800M-1cm-1。加载量确定为0.128mmol。接下来偶联Fmoc-氨基酸，在DMF(10mL)中混合3当量氨基酸，5当量HBTU和5当量DIEA，偶联时间为1小时。在DMF(20％)中使用哌啶进行Fmoc解封。加入EDC(125mg，1当量)和NHS(73mg，1当量)和DIEA(220L，10当量)之前，在DMF(30mL)中溶解叶酸(283mg)，偶联2小时。使用TFA(4.9mL/0.125mL水/0.125mL三异丙基硅烷)由树脂上裂解。黑色溶液在MTBE中沉淀，产生黄色水溶性沉淀物。MALDI m/z 1457.89[M+].。冻干并用Hitachi半制备性HPLC C18(0-100％CH3CN，40min)纯化粗产物，tR18.6min。
聚乙二醇衍生物
概述 新的聚乙二醇衍生物合成具有双重目的：(i)引入化学选择性结构部分，其可选择性的与氨氧基脂质1和26(d)的氨氧基基团反应以使PEG衍生物偶联到脂质体-DNA复合体的表面；(ii)聚乙二醇衍生物包含对酸不稳定的连接体(顺式-乌头酸)，可在酸性pH条件(可触发能力)下裂解(e)和(f)。第二个目的将完全增强脂质和PEG结构部分之间的可触发的(triggerable)(对酸不稳定的)键12。
CHO-PEG
3400
-mal
NHS-PEG-mal(100mg，0.029mmol)和1-氨基-2-二甲氧基乙烷(3当量，9.1mg，10μL)在DCM中搅拌1小时，然后加入HATU(1当量，11mg)，继续搅拌16小时。蒸干全部DCM，加入2ml水。冻干，得到白色粉末，将其溶解于0.6ml水中，加入2.4ml TFA搅拌1小时。反应混合物在液氮中冷干。油状残留物用CDCl3提取，得到乳液，将该乳液冻干。加入CDCl3(2mL)得到澄清溶液。取0.8mL此溶液用于1H核磁共振：在9ppm(醛)处有明显振动，表明还存在过量的起始物质。缓慢向氯仿混合溶液中加入MTBE，产生白色沉淀，离心(3000rpm/5分钟)，去除上清液，向残渣中加入水，冷干。22mg白色粉末溶解于0.8mL CDCl3中，做1H核磁共振分析：σ(ppm)12(0.5H，COOH)，9.6(s，1H，CHO)，9(0.1H，CHO起始物质)，7.3(CHCl3)，6.7(s，1H，mal)，6.6(s，0.1H，mal)，6.5(s，1H，mal)，3.5(s，150H，CH2CH2O-PEG)，2.9(s，宽峰，4-6H，CH2CH2-mal)，1.1(s，3-5H，-CO-CH2-CH2CH2-O-)。1H核磁共振表明得到目标产物，纯度约为80％，其他则是游离的羧酸化合物。为了去除剩余的微量TFA和起始物质，将产物冷干两次，产生不溶于水的尼龙状白色聚合物。这有可能是醛在中性/碱性条件下发生了聚合。
OpF-acon-PEG
3400
-mal
向100mg NHS-PEG3400-mal(Shearwaters，USA)溶解于390mL DCM的溶液中，在30分钟时间内滴加溶解于10mL DCM的390μL 1，2-二氨基乙烷，并室温搅拌1小时。加入20mg HBTU(Advanced Chem Tech，UK)以促使反应完成，并室温搅拌16小时。蒸干所有DCM，向剩余物中加入2mL水和5mL乙腈，澄清溶液在液氮中冷冻，并冷干，得到易溶于水的白色粉末。产物再次冷干，然后溶于2mL DMF。加入25μL DIEA和顺式-乌头酸酐(6当量，27mg)(Sigma，UK)，反应搅拌16小时。后处理(Work-up)：加入20mL水，用乙醚(3×50mL)萃取。将水层与有机层分离，并冷干。产物样品使用分析性HPLC分析(C4，O-100CH3CN，无TFA)：存在三个峰tR＝26min，30mins(主峰)和33mins。分离30分钟时产生的峰并用MALDI分析：m/z＝3922[M+]；3922±44×n(±10＞n＝聚乙二醇的不均匀性)。在4mL DMF中溶解75mg(约0.0145mmol)顺式-acon-PEG3400-mal，加入五氟苯酚(5当量，14mg)，HATU(PE生物系统，UK；5当量，28mg)和DIEA(15当量，38μL)，室温搅拌16小时。后处理：加入20mL水，用乙醚(2×25mL)，乙酸乙酯/乙醚(1∶1；1×50mL)萃取。水相冷干得到红色/棕色粉末。加入2mL二氯甲烷溶解化合物，然后滴加MTBE产生红色/棕色沉淀。离心(3000rpm/5min)收集沉淀物，加水并冷干得到红色/棕色粉末。22mg粉末溶于CDCl3并用1H核磁共振分析：σ(ppm)8.5(s，2H，CONH)，7.4(s，CHCl3)，6.5(s，1H，acon-CH＝C)，6.4(s，宽峰，mal-H)，5.8(s，宽峰，mal-H′)，4(s，150H，CH2CH2O-PEG)，3.5(s，2H，CH2CH2-NH)，3.2(2H，s，2H，CH2CH2-NH)，1.3(s，宽峰，4H，CH2CH2-mal)。由于全部可电离基团的封闭，ESI和MALDI检测不到任何物质。HPLC分析(C4，0-100CH3CN，无TFA)，tR＝21-34min(PEG典型的宽峰)。
双-OpF-acon-PEG
6000
在2mL DCM中溶解NH2-PEG6000-NH2(100mg，0.0167mmol)，加入顺式-乌头酸酐(10当量，26mg)，搅拌2小时生成黄色溶液，4小时后转变为红色。蒸干所有的溶剂，加入10mL水，用乙醚(3×20mL)萃取多余的顺式-乌头酸酐，水相冷干得到黄色/红色粉末。HPLC表明反应没有进行完全。在2mL DMF中溶解粉末，加入DIEA(35μL)和顺式-乌头酸酐(26mg)，将反应混合物加热至50℃/3h。如前所述进行后处理。将红色/棕色粉末溶解于2mL DMF，加入EDC(12.7mg，4当量)和OpF(12.2mg，4当量)，室温搅拌16小时。后处理：加入10mL水用乙醚(3×20mL)萃取。冷冻水相，并冷干得到白色粉末，将其溶解于2mL DCM中，加入MTBE产生红色/棕色沉淀，离心(3000rpm，5分钟)。去除上清液，残留物中加入2mL水，冷干。红色/棕色粉末溶解于2mL DCM中，加入MTBE产生红色/棕色沉淀，离心(3000rpm，5分钟)，去除上清液，残留物中加入2mL水，冷干得到红色/棕色粉末。
胆固醇衍生物
可触发脂质的合成
合成概要合成各种以胆固醇为基础的阳离子或中性脂质，它们适于与聚乙二醇衍生物后偶联。四种脂质作为进一步改性的常规起始部分：第一个，(2-氨基乙基)氨基甲酸胆固醇酯(
01)，第二个，4-氮杂-(叔丁氧基羰基)-N6(胆固醇氧基羰基氨基)己胺(8)。
01和
8每一个均进一步改性为各自包括丝氨酸(
13，
14)和半胱氨酸(
15，16)的脂质。脂质
01改性为中性氨氧基脂质
19，而脂质
8则进一步改性为带电的氨氧基脂质
26。第三个重要的脂质，氨基乙酰基-胆固醇基-脂质20，被改性为酰肼脂质
23。最后，第四个起始脂质，氨基甲酸胆固醇酯改性为腙脂质
24。概述见表1。
表1
合成过程用五氧化磷蒸馏干燥的CH2Cl2，其他溶剂根据需要以预先干燥的形式购买。在背面镀有铝膜的预涂覆Merck-Kieselgel 60F254上使用薄层色谱法(Tlc)，使用紫外线、碘、酸性钼酸铵(IV)、酸性香草醛乙醇溶液或其他适当的试剂显色。以常规溶剂在Merck-Kieselgel 60(230-400目)上使用闪式柱色谱，使用紫外线(254nm)，碘，酸性钼酸盐(IV)，酸性香草醛乙醇溶液，锰酸钾水溶液(VIII)，丙酮中适当的4，4′-双(二甲基氨基)苯甲基二聚水分子或碘进行目测观察。使用NaCl片在Jasco FT/IR 620上记录红外光谱，使用VG-7070B或JEOL SX-102仪器记录质谱(阳离子电喷雾)。使用BrukerDRX300，DRX400或Jeol GX-270Q仪器利用剩余的同位素溶剂作为内标记录1H &13C核磁共振谱。
(2-氨基乙基)氨基甲酸胆固醇酯(01)
在1，2-乙二胺(180ml)中溶解氯甲酸胆固醇酯(7.5g，0.0167mol)，混合物搅拌15小时。使用水淬灭反应，二氯甲烷萃取。MgSO4干燥有机相，在真空下除去溶剂。闪式柱色谱纯化残留物，得到纯的标题化合物01(5.5g，0.0116，73％)。
2-(胆固醇氧基羰基)氨基乙醇(2)
在35ml DCM中溶解乙醇胺(15ml，0.246mol，2.2当量)，冰浴冷却至0℃。滴加氯甲酸胆固醇酯(50g，0.112mol，1当量)在300mlDCM中形成的溶液，滴加时间为1小时，期间产生白色沉淀。反应升至室温，继续搅拌18小时。过滤沉淀，用饱和NaHCO3(2×75ml)，水(2×75ml)洗溶液，MgSO4干燥，减压去除溶剂，得到2-(胆固醇氧基羰基)氨基乙醇2(44g，87％)。δH(300MHz)5.39(1H，m，H-6)，5.02(1H，m，N-H)，4.52(1H，m，H-3)，3.74(2H，t，J 5.5Hz，H-2′)，3.35(2H，t，J 5Hz，H-1′)，2.38-2.25(2H，m，H-4)，2.08-1.72(5H，m，H-2，H-7，H-8)，1.64-1.05(21H，m，H-1，H-9，H-11，H-12，H-14，H-15，H-16，H-17，H-20，H-22，H-23，H-24，H-25)，1.02(3H，s，H-19)，0.93(3Hd，J 6.5Hz，H-21)，0.89(6H，dd，J 1Hz 6.5Hz，H-26，H-27)，0.69(3H，s，H-18)。m/z(FAB+)469(M+Na)+，474(M+H)+，369(Chol)+。
甲磺酸2-[(胆固醇氧基羰基)氨基]乙酯(3)
向0℃，2-[(胆固醇氧基羰基)氨基]乙醇2(0.45g，0.96mmol，1.0当量)和三乙胺(0.4ml，2.88mmol，3.0当量)溶于DCM(10ml)形成的溶液中，滴加甲磺酰基氯溶液(0.19ml，2.40mmol，2.5当量)。反应升至室温，搅拌30分钟。在已指示反应完全后，加入冰淬灭反应。反应混合物倒入15ml饱和NH4Cl溶液中，用乙醚(3×10ml)，盐水(1×10ml)处理，Na2SO4干燥。减压除去溶剂得到白色固体，色谱(乙醚)纯化得到甲磺酸2-[(胆固醇氧基羰基)氨基]乙酯3(0.48g，90％)。δH(300MHz)5.39(1H，d，J 5Hz，H-6)，5.00(1H，m，N-H)，4.52(1H，m，H-3)，4.32(2H，t，J 5Hz，H-2′)，3.55(2H，m，H-1′)，3.06(3H，s，OMs)，2.36-2.29(2H，m，H-4)，2.04-1.81(5H，m，H-2，H-7，H-8)，1.64-1.05(21H，m，H-1，H-9，H-11，H-12，H-14，H-15，H-16，H-17，H-20，H-22，H-23，H-24，H-25)，1.02(3H，s，H-19)，0.93(3H d，J 6.5Hz，H-21)，0.89-0.87(6H，dd，J 1Hz 6.5Hz，H-26，H-27)，0.69(3H，s，H-18)。m/z(FAB+)574(M+Na)+，552(M+H)+，369(Chol)+。
4-氮杂-N6(胆固醇氧基羰基氨基)己醇(4)
圆底烧瓶中加入甲磺酸2-[(胆固醇氧基羰基)氨基]乙基酯3(15.6g，0.029mol，1.0当量)和3-氨基-丁-1-醇(150ml，7.5mmol，10当量)。一旦薄层色谱检测反应完全(大约3天)，加入DCM(100ml)和K2CO3(6g)搅拌30分钟。悬浮液通过Celite薄层，用DCM、乙醇和10％NEt3/EtOH充分洗涤。减压下移除溶剂，得到黄色油状物质。将得到的黄色油状物质再次溶解于10ml DCM，并用水(3×3ml)，盐水(3ml)洗涤，Na2SO4干燥。真空条件下移除溶剂，色谱纯化得到4-氮杂-N6(胆固醇氧基羰基氨基)己醇4(12.45g，81％)。δH(300MHz和270MHz)5.38(1H，m，H-6)，4.48(1H，m，H-3)，3.77(2H，t，J 5Hz，H-5′)，3.26(2H，m，H-1′)，2.91(2H，t，J 6Hz，H-2′)，2.82(2H，t，J 6Hz，H-3′)，2.30-2.23(2H，m，H-4)，2.00-1.76(5H，m，H-2，H-7，H-8)，1.74-1.00(23H，m，H-4′，H-1，H-9，H-11，H-12，H-14，H-15，H-16，H-17，H-20，H-22，H-23，H-24，H-25)，0.99(3H，s，H-19)，0.92-0.90(3H d，J 6Hz，H-21)，0.87-0.85(6H，dd，J 1Hz 6Hz，H-26，H-27)，0.68(3H，s，H-18)。m/z(FAB+)543(M+Na)+，531(M+H)+，369(Chol)+145，105，91(C7H7)+，81(C6H9)+，55。
4-氮杂-(叔丁氧基羰基)-N6(胆固醇氧基羰基氨基)己醇(5)
在4-氮杂-N6(胆固醇氧基羰基氨基)己醇4(3g，5.64mmol，1当量)和二碳酸二叔丁酯(di-tert-butyl-dicarbonate)(1.26g，5.64mmol，1.0当量)溶于DCM(18ml)形成的溶液中，加入NEt3(0.9ml，6.18mmol，1.1当量)，薄层色谱检测反应溶液。反应完全后，将反应混合物倒入饱和NH4Cl水溶液中(15ml)，DCM(2×40ml)萃取。合并有机相，水洗(3×40ml)，Na2SO4干燥。真空条件下移除溶剂，得到4-氮杂-(叔丁氧基羰基)-N6(胆固醇氧基羰基氨基)己醇5(3.19g，90％)。δH(270MHz)5.36(1H，m，H-6)，4.48(1H，m，H-3)，3.53(2H，t，J 5Hz，H-5′)，3.40-3.25(6H，m，H-1′，H-2′，H-3′)，2.30(2H，m，H-4)，2.00-1.70(5H，m，H-2，H-7，H-8)，1.05(9H，s，Boc Hs 3×CH3)，1.60-1.00(23H，m，H-4′，H-1，H-9，H-11，H-12，H-14，H-15，H-16，H-17，H-20，H-22，H-23，H-24，H-25)，0.98(3H，s，H-19)，0.93-0.90(3H d，J 6Hz，H-21)，0.88-0.86(6H，dd，J 1Hz 6Hz，H-26，H-27)，0.65(3H，s，H-18)。m/z(FAB+)643(M+Na)+，531(M-boc)，369(Chol)+，163，145，109，91(C7H7)+，81(C6H9)+，57。
甲磺酸4-氮杂-(叔丁氧基羰基)-N6(胆固醇氧基羰基氨基)己酯(6)
此制备过程同甲磺酸2-[(胆固醇氧基羰基)氨基]乙酯(2)，以0.0114mol经色谱(乙醚)纯化得到甲磺酸4-氮杂-(叔丁氧基羰基)-N6(胆固醇氧基羰基氨基)己酯6(0.73g，0.87％)。δH(300MHz)5.38(1H，m，H-6)，4.49(1H，m，H-3)，4.41(2H，t，J 6Hz，H-5′)，4.29(2H，t，J 5Hz，H-2′)，3.55(2H，m，H-1′)，3.55-3.35(2H，m，H-3′)，3.16(3H，s，OMs CH3)，2.35(2H，m，H-4)，2.12-1.70(5H，m，H-2，H-7，H-8)，1.38(9H，s，Boc Hs3×CH3)，1.67-1.00(23H，m，H-4′，H-1，H-9，H-11，H-12，H-14，H-15，H-16，H-17，H-20，H-22，H-23，H-24，H-25)，0.96(3H，s，H-19)，0.93-0.91(3H d，J 6Hz，H-21)，0.88-0.86(6H，dd，J 1Hz 6Hz，H-26，H-27)，0.69(3H，s，H-18)。m/z(FAB+)609(M-Boc)，369(Chol)+，145，121，105，95(C7H11)+，81(C6H9)+，69，55。
4-氮杂-(叔丁氧基羰基)-N6(胆固醇氧基羰基氨基)己叠氮(7)
甲磺酸4-氮杂-(叔丁氧基羰基)-N6(胆固醇氧基羰基氨基)己酯(7.0g，9.88mmol，1当量)，叠氮化钠(3.2g，0.049mol，5当量)和碘化钠(1.56g，9.88mmol，1.0当量)于氮气条件下加入圆底烧瓶中。搅拌加入无水DMF(50ml)，安装回流冷凝器，在80℃加热5.5小时。薄层色谱检测反应进行完全后，将烧瓶冷却至室温，减压移除DMF，残留物再次溶解于EtOAc。用碳酸氢钠(2×50ml)，水(2×10ml)，盐水(50ml)洗涤，干燥(Na2SO4)。减压移除溶剂，色谱(汽油1∶乙醚1)纯化得到4-氮杂-(叔丁氧基羰基)-N6(胆固醇氧基羰基氨基)己胺7(5.7g，88％)。δH(300MHz)5.38(1H，m，H-6)，4.85(1H，m，N-H)，4.53-4.50(1H，m，H-3)，3.38-3.28(8H，m，H-5′，H-3′，H-2′，H-1′)，2.36-2.25(2H，m，H-4)，1.90-1.78(5H，m，H-2，H-7，H-8)，1.48(9H，s，Boc Hs3×CH3)，1.63-1.05(23H，m，H-4′，H-1，H-9，H-11，H-12，H-14，H-15，H-16，H-17，H-20，H-22，H-23，H-24，H-25)，1.01(3H，s，H-19)，0.93-0.91(3H d，J 6Hz，H-21)，0.88-0.86(6H，dd，J 1Hz 6Hz，H-26，H-27)，0.68(3H，s，H-18)。m/z(FAB+)656(M+H)+，556(M-Boc)，369(Chol)+，145，121，105，95(C7H11)+，81(C6H9)+，57。
4-氮杂-(叔丁氧基羰基)-N6(胆固醇氧基羰基氨基)-己胺(8)
向4-氮杂-(叔丁氧基羰基)-N6(胆固醇氧基羰基氨基)己胺7(2.0g，3.05mmol，1当量)溶解于22ml THF得到的溶液中，搅拌下加入溶于3.5ml THF的三甲基膦(3.51mmol，1.15当量)溶液。薄层色谱检测反应进行完全后，加入3.5ml水和3.5ml氨水，继续搅拌1小时。真空条件下移除溶剂，色谱(ultra/2)纯化得到白色固体4-氮杂-(叔丁氧基羰基)-N6(胆固醇氧基羰基氨基)-己胺8(1.44g，76％)。δH(270MHz，CHCl3)5.36(1H，m，H-6)，4.46-4.44(1H，m，H-3)，3.31-3.22(6H，m，H-3′，H-2′，H-1′)，2.67(2H，t，J 6Hz，H-5′)，2.29(2H，m，H-4)，2.05-1.79(5H，m，H-2，H-7，H-8)，1.45(9H，s，Boc Hs 3×CH3)，1.78-1.05(23H，m，H-4′，H-1，H-9，H-11，H-12，H-14，H-15，H-16，H-17，H-20，H-22，H-23，H-24，H-25)，0.98(3H，s，H-19)，0.91-0.88(3H d，J 6Hz，H-21)，0.86-0.83(6H，dd，J 1Hz 6Hz，H-26，H-27)，0.66(3H，s，H-18)。m/z(FAB+)630(M+H)+，530(M-Boc)，369(Chol)+，145，121，109，95(C7H11)+，81(C6H9)+，61，57。
保护的丝氨酸衍生物(9)
无水二氯甲烷中的N-α-Boc-O-叔丁基-L-丝氨酸(74mg，0.281mmol)连续经DMAP(40mg，0.324mmol)，HBTU(128mg，0.337mmol)和胺01(100mg，0.216mmol)处理，混合物于室温条件下在氮气气氛下搅拌15小时，反应经水淬灭，用二氯甲烷萃取，MgSO4干燥。真空浓缩经干燥的萃取液，得到的残渣经闪式柱色谱纯化，得到纯的9(0.149mmol，69％)。δH(270MHz，CHCl3)6.7(1H，br s)，5.3(2H，m)，5.0(1H，brs)，4.4(1H，m)，4.1(1H，m)，3.7(1H，m)，3.2-3.4(5h，m)，2.29(2H，m)，2.05-1.79(5H，m)，1.45(9H，s，Boc)，1.15(9H，s)，1.78-1.05(23H，m)，0.98(3H，s)，0.91-0.88(3H d，J 6Hz)，0.86-0.83(6H，dd，J 1Hz 6Hz)，0.66(3H，s)。m/z(ESI)717(M+H)+，369(Chol)。
保护的半胱氨酸衍生物(10)
无水二氯甲烷中的N-α-Boc-S-三苯甲基-L-半胱氨酸(319mg，0.689mmol)连续经DMAP(195mg，1.6mmol)，HBTU(311mg，0.82mmol)和胺01(250mg，0.53mmol)处理，混合物于室温条件下在氮气气氛下搅拌15小时，反应经水淬灭，用二氯甲烷萃取。经干燥(MgSO4)的萃取液真空浓缩，得到的残渣经闪式柱色谱纯化得到纯的10(0.517mmol，98％)。δH(270MHz，CHCl3)7.2-7，5(15H，m)，6.3(1H，br s)，5.3(1H，m)，5.0(1H，br s)，4.8(1H，br s)，4.4(1H，m)，3.7(1H，m)，3.2-3.4(4H，m)，2.7(1H，m)，2.5(1H，m)，2.29(2H，m)，2.05-1.79(5H，m)，1.45(9H，s，Boc)，1.15(9H，s)，1.78-1.05(23H，m)，0.98(3H，s)，0.91-0.88(3H d，J 6Hz)，0.86-0.83(6H，dd，J 1Hz 6Hz)，0.66(3H，s)。m/z(ESI)940.5(M+Na)+，369(Chol)。
保护的丝氨酸衍生物(11)
无水二氯甲烷中的N-α-Boc-O-叔丁基-L-丝氨酸(41mg，0.155mmol)连续经DMAP(66mg，0.54mmol)，HBTU(0.180mmol)和胺8(75mg，0.119mmol)处理，混合物于室温条件下在氮气气氛下搅拌15小时，反应经水淬灭，用二氯甲烷萃取。经干燥(MgSO4)的萃取液真空浓缩，得到的残渣经闪式柱色谱纯化得到纯的11(0.090mmol，76％)。δH(270MHz，CHCl3)6.5(1H，br s)，5.2-5.5(2H，m)，5.15(1H，br s)，4.8(1H，m)，4.4(1H，m)，4.1(1H，m)，3.7(1H，m)，3.2-3.4(9H，m)，2.29(2H，m)，2.05-1.79(5H，m)，1.45(9H，s，Boc)，1.43(9H，s，Boc)，1.15(9H，s)，1.78-1.05(23H，m)，0.98(3H，s)，0.91-0.88(3H d，J 6Hz)，0.86-0.83(6H，dd，J 1Hz 6Hz)，0.66(3H，s)。m/z(ESI)874(M+H)+，369(Chol)。
半胱氨酸衍生物(12)
无水二氯甲烷中的N-α-Boc-S-三苯甲基-L-半胱氨酸(359mg，0.77mmol)连续经DMAP(220mg，1.8mmol)，HBTU(352mg，0.93mmol)和胺8(270mg，0.43mmol)处理，混合物于室温条件下在氮气气氛下搅拌15小时，反应经水淬灭，用二氯甲烷萃取。经干燥(MgSO4)的萃取液真空浓缩，得到的残渣经闪式柱色谱纯化得到纯的12(0.393mmol，91％)。δH(270MHz，CHCl3)7.2-7，5(15H，m)，6.3(1H，br s)，5.3(1H，m)，5.0(1H，br s)，4.8(1H，br s)，4.4(1H，m)，3.7(1H，m)，3.2-3.4(8H，m)，2.7(1H，m)，2.5(1H，m)，2.29(2H，m)，2.05-1.79(5H，m)，1.45(9H，s，Boc)，1.15(9H，s)，1.78-1.05(23H，m)，0.98(3H，s)，0.91-0.88(3H d，J 6Hz)，0.86-0.83(6H，dd，J 1Hz 6Hz)，0.66(3H，s)。m/z(ESI)1097.5(M+Na)+，369(Chol)。
(2-氨基乙基)氨基甲酸胆固醇酯的丝氨酸衍生物(13)
化合物9(100mg，0.14mmol)溶解于三氟乙酸(18ml)，二氯甲烷(5ml)和三异丙基硅烷(2ml)的混合液中，得到的溶液在室温下搅拌2小时。真空条件下浓缩溶液，得到的残留物经闪式柱色谱纯化，得到纯的13(0.11mmol，79％)。δH(270MHz，CHCl3)7.8(1H，br s)，5.3(1H，m)，5.0(1H，br s)，4.4(1H，m)，3.85(1H，m)，3.65(1H，m)，3.2-3.4(5H，m)，2.29(5H，m)，2.05-1.79(7H，m)，1.78-1.05(23H，m)，0.98(3H，s)，0.91-0.88(3H s，J 6Hz)，0.66(3H，s)。m/z(ESI)560.2(M+H)+，369(Chol)。
(2-氨基乙基)氨基甲酸胆固醇酯的半胱氨酸衍生物(14)
化合物10(420mg，0.457mmol)溶解于三氟乙酸(18ml)，二氯甲烷(5ml)和三异丙基硅烷(2ml)的混合液中，所得溶液在室温下搅拌2小时。真空条件下浓缩溶液，得到的残留物经闪式柱色谱纯化，得到纯的14(0.224mmol，49％)。δH(270MHz，CHCl3)7.7(1H，br s)，5.3(1H，m)，5.0(1H，br s)，4.4(1H，m)，4.1(1H，m)，3.6(1H，m)，3.2-3.4(4H，m)，2.93(1H，m)，2.87(1H，m)，2.29(4H，m)，2.05-1.79(5H，m)，1.78-1.05(23H，m)，0.98(3H，s)，0.91-0.88(3H d，J 6Hz)，0.86-0.83(6H，dd，J 1Hz 6Hz)，0.66(3H，s)。m/z(ESI)616.3(M+K)+，369(Chol)。
(2-氨基乙基)氨基甲酸胆固醇酯的丝氨酸衍生物(15)
化合物11(70mg，0.08mmol)溶解于三氟乙酸(18ml)，二氯甲烷(5ml)和三异丙基硅烷(2ml)的混合液中，所得溶液在室温下搅拌2小时。真空条件下浓缩溶液，得到的残留物经闪式柱色谱纯化，得到纯的15(0.046mmol，58％)。δH(270MHz，CHCl3)8.3(1H，br s)，5.3(1H，m)，5.0(1H，br s)，4.4(1H，m)，3.9(1H，m)，3.8(1H，m)，3.6(1H，m)，3.2-3.4(8H，m)，2.29(5H，m)，2.05-1.79(7H，m)，1.78-1.05(23H，m)，0.98(3H，s)，0.91-0.88(3H d，J 6Hz)，0.86-0.83(6H，dd，J 1Hz 6Hz)，0.66(3H，s)。m/z(ESI)617(M+H)+，369(Chol)。
(2-氨基乙基)氨基甲酸胆固醇酯的半胱氨酸衍生物(16)
化合物12(390mg，0.363mmol)溶解于三氟乙酸(18ml)，二氯甲烷(5ml)和三异丙基硅烷(2ml)的混合液中，所得溶液在室温下搅拌2小时。真空条件下浓缩溶液，得到的残留物经闪式柱色谱纯化，得到纯的16(0.243mmol，67％)。δH(270MHz，CHCl3)8.0(1H，br s)，5.3(1H，m)，5.0(1H，br s)，4.4(1H，m)，3.6(1H，m)，3.2-3.4(8H，m)，2.96(1H，m)，2.89(1H，m)，2.29(5H，m)，2.05-1.79(7H，m)，1.78-1.05(23H，m)，0.98(3H，s)，0.91-0.88(3H d，J 6Hz)，0.86-0.83(6H，dd，J 1Hz 6Hz)，0.66(3H，s)。m/z(ESI)633.3(M+H)+，369(Chol)。
Boc化中性氨氧基脂质(18)
无水二氯甲烷中的化合物17(145mg，0.758mmol)连续经DMAP(292mg，2.39mmol)，HBTU(373mg，0.987mmol)和胺01(272mg，0.576mmol)处理，混合物于室温下在氮气气氛下搅拌15小时，反应经7％柠檬酸水溶液淬灭，用二氯甲烷萃取。经干燥(MgSO4)的萃取液真空浓缩，得到的残渣经闪式柱色谱纯化，得到纯的18(302mg，81％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)8.56(s，1H，BocNHOCH2)，8.2(br，CH2CONHCH2)，5.5(m，1H，Chol C6)，5.4(m，1H，Chol-O(CO)NH)，4.5(m，1H，Chol C-3)，4.3(s，2H，(CO)CH2ONH2)，3.4(m，2H，O(CO)NHCH2CH2)，3.3(m，2H，O(CO)NHCH2CH2)，2.32(m，2H，Chol C-24)，1.46(s，3H，Boc)，0.94-2.10(Chol C-1，2，4，7，8，9，11，12，14，15，16，17，20，22，23，25)，1.0(s，3H，Chol C-19)，0.89(d，3H，J＝6.4，Chol C-21)，0.83，0.82(2×d，6H，J＝6.5和2.0Hz)，0.68(s，3H，Chol C-18)；3C NMR(100MHz，CDCl3)169.6(NH(CO)CH2ONH2)，157.9(Boc)，156.6(OCONH)，139.7(C-5)，122.4(C-6)，82.8(Boc)，76.2((CO)CH2ONH2)，74.4(C-3)，56.6(C-14)，56.0(C-17)，49.9(C-9)，42.2(C-13)，40.6(C-4)，39.4-40.6(C-12，C-4，O(CO)NHCH2CH2重叠)，38.4(C-24)，36.9(C-1)，36.4(C-10)，36.1(C-22)，35.7(C-20)，31.80(C-8)，321.79(C-7)，28.1(C-16和Boc重叠)，28.0(C-2)，27.9(C-25)，24.2(C-15)，23.7(C-23)，22.7(C-26)，22.5(C-27)，20.9(C-11)，19.2(C-19)，18.6(C-21)和11.8(C-18)。ESI-MS 646[M+H]+；HRMS：C37H64N3O6计算值：646.479512；实测值：646.479874。
中性氨氧基脂质(19)
化合物18(86mg，0.067mmol)加入2-丙醇(3ml)，经二氧六环(3ml)中4M HCl处理，混合物室温搅拌4小时。真空条件下移除溶剂，残留物溶解于最小量2-丙醇∶二氧六环1∶5溶液中，产物19用醚沉淀，为白色固体(28mg，84％)；1H NMR(400MHz，d4-MeOD)5.35(m，1H，Chol C6)，4.8(m，1H，Chol-O(CO)NH)，4.5(s，2H，(CO)CH2ONH2)，4.4(m，1H，Chol C-3)，3.3(m，2H，O(CO)NHCH2CH2)，3.1(m，2H，O(CO)NHCH2CH2)，2.32(m，2H，CholC-24)，0.94-2.10(Chol C-1，2，4，7，8，9，11，12，14，15，16，17，20，22，23，25)，1.0(s，3H，Chol C-19)，0.89(d，3H，J＝6.4，Chol C-21)，0.83，0.82(2×d，6H，J＝6.5和2.0Hz)，0.68(s，3H，Chol C-18)；3C NMR(100MHz，CDCl3)171.4(NH(CO)CH2ONH2)，158.3(OCONH)，140.55(C-5)，123.2(C-6)，75.4((CO)CH2ONH2)71.9(C-3)，57.5(C-14)，57.0(C-17)，51.0(C-9)，43.0(C-13)，40.2(C-4)，40.0-40.6(C-12，C-4)，O(CO)NHCH2CH2重叠)，39.2(C-24)，37.8(C-1)，37.3(C-10)，36.9(C-22)，36.6(C-20)，32.7(C-8)，32.6(C-7)，28.9(C-16)，28.8(C-2)，28.7(C-25)，24.9(C-15)，24.5(C-23)，23.2(C-26)，22.9(C-27)，21.8(C-11)，19.7(C-19)，19.2(C-21)和12.3(C-18)。ESI-MS 546[M+H]+。
胆固醇基甘氨酸(20)
向0℃氯甲酸胆固醇酯(1g，2.23mmol)的二氧六环(35ml)溶液中，加入NEt3(424μl，2.23mmol)和甘氨酸(170mg，2.23mmol)的水(15ml)溶液，混合物室温搅拌过夜。反应经7％柠檬酸水溶液淬灭，用二氯甲烷萃取，干燥萃取液，真空浓缩，得到的残留物经层析纯化得到白色固体化合物20(680mg，63％)；1H NMR(400MHz，CDCl3)5.35(m，1H，Chol C6)，5.15(m，1H，Chol-O(CO)NH)，4.5(s，2H，(CO)CH2ONH2)，4.5(m，1H，Chol C-3)，3.95(m，2H，O(CO)NHCH2)，2.32(m，2H，Chol C-24)，0.94-2.10(Chol C-1，2，4，7，8，9，11，12，14，15，16，17，20，22，23，25)，1.0(s，3H，Chol C-19)，0.89(d，3H，J＝6.4，Chol C-21)，0.83，0.82(2×d，6H，J＝6.5和2.0Hz)，0.68(s，3H，Chol C-18)；3CNMR(100MHz，CDCl3)159.3(OCONH)，142.4(C-5)，125.4(C-6)，75.4((CO)CH2ONH2)，71.9(C-3)，57.5(C-14)，57.0(C-17)，51.0(C-9)，43.0(C-13)，40.0-40.6(C-12，C-4)39.2(C-24)，37.8(C-1)，37.3(C-10)，36.9(C-22)，36.6(C-20)，32.7(C-8)，32.6(C-7)，28.9(C-16)，28.8(C-2)，28.7(C-25)，24.9(C-15)，24.5(C-23)，23.2(C-26)，22.9(C-27)，21.8(C-11)，19.7(C-19)，19.2(C-21)，和12.3(C-18)。MS-FAB+：510[M+Na]+。
Boc化胆固醇基-甘氨酸-酰肼(22)
无水二氯甲烷中的化合物21(33mg，0.246mmol)连续经DMAP(73mg，0.6mmol)，HBTU(109mg，0.287mmol)和20(100mg，0.205mmol)处理，混合物于室温条件下在氮气气氛下搅拌15小时，反应经7％柠檬酸水溶液淬灭，用二氯甲烷萃取。经干燥(MgSO4)的萃取液真空浓缩，得到的残渣经闪式柱色谱纯化，得到纯的22(103mg，83％)；1H NMR(400MHz，CDCl3)8.6br s，1H，BocNH2NH2CO)，6.9(br，CH2CONH2NH2Boc)，5.8(m，1H，Chol-O(CO)NH)，5.4(m，1H，CholC6)，4.5(m，1H，Chol C-3)，3.9(s，2H，(CO)CH2NH(CO)O)，2.32(m，2H，Chol C-24)，1.46(s，3H，Boc)，0.94-2.10(CholC-1，2，4，7，8，9，11，12，14，15，16，17，20，22，23，25)，1.0(s，3H，Chol C-19)，0.89(d，3H，J＝6.4，Chol C-21)，0.83，0.82(2×d，6H，J＝6.5和2.0Hz)，0.68(s，3H，Chol C-18)；3C NMR(100MHz，CDCl3)169.7(BocNH2NH2CO)，156.7(Boc)，155.6(OCONH)，139.6(C-5)，122.6(C-6)，82.0(Boc)，74.9(C-3)，56.6(C-14)，56.2(C-17)，49.9(C-9)，42.9(Gly CH2)，42.3(C-13)，39.7(C-4)，39.4-6(C-12)，38.4(C-24)，36.9(C-1)，36.5(C-10)，36.2(C-22)，35.8(C-20)，31.80(C-8)，31.79(C-7)，28.2(C-16和Boc重叠)，28.1(C-2)，27.9(C-25)，24.2(C-15)，23.9(C-23)，22.8(C-26)，22.5(C-27)，21.0(C-11)，19.3(C-19)，18.7(C-21)和11.8(C-18)。ESI-MS 502[M+H]+，542[M+K]+；HRMS：C35H59N3O5Na计算值：624.435242；实测值：624.436356。
胆固醇基-甘氨酸-酰肼(23)
化合物22(40mg，0.067mmol)加入2-丙醇(1ml)，经二氧六环(1ml)中4M HCl处理，混合物室温搅拌30分钟。真空条件下移除溶剂，残留物溶解于最小量2-丙醇∶二氧六环1∶5溶液中，产物23用己烷沉淀，为白色固体(28mg，84％)；1H NMR(400MHz，d4-MeOD)7.8(br，CH2CONH2NH2)，5.5(m，1H，Chol C6)，4.6(m，1H，Chol C-3)，4.0(s，2H，(CO)CH2NH(CO)O)，2.32(m，2H，Chol C-24)，1.46(s，3H，Boc)，0.94-2.10(Chol C-1，2，4，7，8，9，11，12，14，15，16，17，20，22，23，25)，1.0(s，3H，Chol C-19)，0.89(d，3H，J＝6.4，Chol C-21)，0.83，0.82(2×d，6H，J＝6.5和2.0Hz)，0.68(s，3H，Chol C-18)；13C NMR(100MHz，d4-MeOD)169.7(NH2NH2CO)，156.6(OCONH)，140.3(C-5)，123.2(C-6)，75.9(C-3)，57.4(C-14)，56.8(C-17)，50.8(C-9)，48.4(gly CH2)，42.9(C-13)，40.4(C-4)，40.1(C-12)，39.0(C-24)，37.6(C-1)，37.2(C-10)，36.8(C-22)，36.5(C-20)，32.5(C-8)，32.4(C-7)，28.8(C-16)，28.7(C-2)，28.6(C-25)，24.8(C-15)，24.4(C-23)，23.1(C-26)，22.9(C-27)，21.7(C-11)，19.7(C-19)，19.0(C-21)和12.2(C-18)。ESI-MS：541.7[M+K]+。
胆固醇基-氨基甲酸-酰肼(24)
向0℃氯甲酸胆固醇酯(1.0g，2.23mmol)的二氯甲烷(90ml)溶液中，加入肼水合物(1g，20mmol)，反应缓慢升至室温，搅拌过夜。反应经7％柠檬酸水溶液淬灭，用二氯甲烷萃取。经干燥(MgSO4)的萃取液真空浓缩，得到的残留物用二氯甲烷/己烷结晶，得到白色固体化合物24(0.75g，76％)；1H NMR(400MHz，CDCl3)5.4(m，1H，Chol C6)，4.55(m，1H，Chol C-3)，4.7-3.3(O(CO)NHNH2)，2.32(m，2H，Chol C-24)，1.46(s，3H，Boc)，0.94-2.10(CholC-1，2，4，7，8，9，11，12，14，15，16，17，20，22，23，25)，1.0(s，3H，Chol C-19)，0.89(d，3H，J＝6.4，Chol C-21)，0.83，0.82(2×d，6H，J＝6.5和2.0Hz)，0.68(s，3H，CholC-18)；13C NMR(100MHz，CDCl3)158.3(OCONH)，139.5(C-5)，122.7(C-6)，75.2(C-3)，56.6(C-14)，56.1(C-17)，49.9(C-9)，42.2(C-13)，39.7(C-4)，39.4(C-12)，38.4(C-24)，36.9(C-1)，36.5(C-10)，36.1(C-22)，35.7(C-20)，31.8(C-8)，31.77(C-7)，28.2(C-25)，28.0(C-16)，27.9(C-2)，24.2(C-15)，23.8(C-23)，22.8(C-26)，22.5(C-27)，21.0(C-11)，19.2(C-19)，18.6(C-21)和11.8(C-18)。ESI-MS：484.63[M+K]+。
(Boc)氨氧基脂质(25)
N-羟基琥珀酰亚胺(0.36g，3.13mmol，1当量)，17(0.6g，3.13mmol，1当量)，和N，N′-二环己基碳二亚胺(0.68g，3.13mmol，1当量)溶解于EtOAc(90mL)中，混合物室温搅拌过夜。经Celite垫过滤混合物，去除生成的白色沉淀二环己基脲(用60ml EtOAc清洗)，加入10mL THF中的8(1.97g，3.13mmol，1当量)溶液。加入6ml三乙胺使多相反应过程中保持pH值为8。所得混合物室温搅拌过夜。反应完成后，将混合物过滤，减压条件下移除溶剂，闪式柱色谱(CH2Cl2/MeOH/NH392∶7∶1)纯化得到白色固体25。产量(2.3g，90％)；1H NMR(270MHz，CDCl3)：δ＝5.33-5.35(m，1H，H6′)，4.4-4.52(m，1H，H3′)，4.3(s，2H，H90，3.2-3.42(m，8H，H1，H2，H4，H6)，2.23-2.35(m，2H，H4′)，1.7-2.1(m，7H，H2′，H7′，H8′，H5)，1.44-1.46(m，18H，2Boc)，1-1.73(m，21H，H1′，H9′，H11′，H12′，H14′-H17′，H22′-H25′)，0.98(3H，s，H-19′)，0.85(d，J＝6.5Hz，3H，H21′)，0.83(d，J＝6.5Hz，6H，H26′&H27′)和0.65(s，3H，H18′)；MS(FAB+)：m/z＝803[M+H]+，703[M-Boc]+，647，603[M-2Boc]+，369，279，255，235，204，145，95，69。
带电氨氧基脂质(1)
0℃，在25(1.1g，1.36mmol，1当量)的CH2Cl2(10ml)中，加入TFA(2mL，20.4mmol，15当量)。溶液室温下搅拌5小时，反应完成后，将甲苯加入来自反应混合物的共沸TFA中。真空条件下移除溶剂，经色谱(CH2Cl2/MeOH/NH3 92∶7∶1至75∶22∶3)纯化得到白色固体1(709mg，产率：86％)；IR(CHCl3)：vmax＝3306，2948，2850，2246，1698，1647，1541，1467，1253，1133；1H NMR(270MHz，CDCl3)：δ＝5.26-5.4(m，1H，H6′)，4.4-4.52(m，1H，H3′)，4.12(s，2H，H9)，3.34-3.41(m，2H，H2)，3.15-3.3(m，2H，H4)，2.6-2.74(m，4H，H1&H6)，2.14-2.39(m，2H，H4′)，1.62-2.1(m，7H，H2′，H7′，H8′，H5)，1.02-1.6(m，21H，H1′，H9′，H11′，H12′，H14′-H17′，H22′-H25′)，0.96(3H，s，H-19′)，0.86(d，J＝6.5Hz，3H，H21′)，0.83(d，J＝6.5Hz，6H，H26′&H27′)和0.66(s，3H，H18′)；MS(FAB+)：m/z＝603[M+H]+，369[Chol]+，160，137，109，95，81，69，55。
含氨氧基脂质1的脂质体和脂质体-DNA复合体的稳定性
(A)对于不含氨氧基脂质1的LMD系统的研究
LMD由DOPE∶脂质B198(60∶40，摩尔比)脂质体组成，标准配方比例为12∶0.6∶1，对该LMD进行稳定性分析。在HEPES 4mM(pH 7)中，使用不同量的PEG2000-二醛温育LMD 16小时。随后，样品加入OptiMEM中，在20分钟的时间内，使用PCS测量各自的大小(附图2)。能够清楚地观察到增加PEG2000-二醛的量对于稳定化的影响。这种稳定化暗示Schiff-碱的形成，因此通过在脂质体-DNA复合体(DOPE，脂质B198)表面暴露的胺和来自PEG的醛之间形成C＝N共价键可以稳定颗粒。为了排除聚乙二醇非特异地吸附到LMD表面，使用分别包含巯基，一个或两个胺官能度的PEG衍生物进行对照试验(附图3)。结果清楚表明含有醛的PEG和氨氧基官能度存在特异的相互作用，然而其他官能化PEG衍生物显示出非常弱的非特异性作用。为了证实意料中的Schiff-碱的形成，我们使用其中以氨氧基-脂质1代替10％脂质B198的LMD系统。
生化产品和化学品：
二油酰磷脂酰基乙醇胺(DOPE)买自Avanti Lipid(Alabaster，AL，USA)，质粒nis-pCMVβ半乳糖苷酶由Bayou Biolabs(Harahan，LA，USA)生产。脂质-B198有由我们实验室合成，Mu-肽在Wang树脂上采用标准Fmoc基Merrifield固相肽化学合成。
合成：
脂质体的制备：
脂质体制备如下，二氯甲烷中的足量脂质混合物在100ml圆底烧瓶中干燥成薄层，将该薄层在真空条件下进一步干燥2小时。脂质膜在4mM Hepes(pH 7)中水合，得到5mg/ml脂质的最终浓缩物。简短的超声处理后，在氮气下使用挤压机(Lipex Biomembranes)使悬浮液通过两个堆叠聚碳酸酯滤器(0.1μm孔，Osmonids)挤出10次，制备小的单层泡囊。挤出的脂质体的脂质浓度通过Steward分析确定。
制备MD和LMD和LD
LD(脂质∶DNA)和LMD(脂质∶Mu∶DNA)复合体∶DNA储备液(典型地，为1.2mg/ml)制剂加入到0.6重量比的Mu在蒸馏水中的涡旋混合稀释溶液中，得到0.2mg/ml的DNA最终浓缩物。然后，MD溶液在涡旋下缓慢加入至脂质体，重量比DNA∶脂质为1∶12。最后加入在4mM Hepes中稀释的蔗糖，以在4mM Hepes，6％蔗糖中的所需DNA浓度，得到LMD制剂。将0.2mg/ml的DNA溶液在涡旋下缓慢加入至脂质体中，重量比DNA∶脂质为1∶12。最后加入在HEPES 4mM(pH7)中稀释的蔗糖，以在HEPES 4mM(pH 7)，6％蔗糖中的所需DNA浓度，得到LD制剂。
包含脂质体B198∶DOPE(50∶50)的LMD系统的稳定性研究
LMD由DOPE∶脂质B198(60∶40，摩尔比)脂质体组成，在0.15mg/ml(DNA浓缩物)水平在OptiMEM进行稳定性分析。LMD用不同量的PEG2000-二醛培养16小时/4℃在HEPES 4mM(pH 7)中，最终浓度调节至0.1mg/ml。随后，样品加入OptiMEM，使用光子相关分光仪(N4plus，Coulter)通过动态光散射技术测量各自的大小。使用的参数：20℃，0.0890cP(粘度)，反射指数1.33，角度90°，632.8nm(波长)。观察到增加PEG2000-二醛的数量对稳定化的明显影响。
该稳定化暗示了Schiff-碱的形成，因此通过在脂质体-DNA复合体(DOPE，脂质B198)表面暴露的胺和来自PEG的醛之间形成C＝N共价键可以稳定颗粒。为了排除聚乙二醇非特异地吸附到LMD表面，使用分别包含巯基、一个或两个胺官能度的PEG衍生物进行对照试验(附图3)。结果清楚表明含有醛的PEG和胺官能度存在特异的相互作用，然而其他官能化PEG衍生物显示出非常弱的非特异性作用。
LMD由DOPE∶脂质B198(50∶50，摩尔比)脂质体组成，在0.15mg/ml(DNA浓缩物)水平在血清中进行稳定性分析。LMD用不同量的PEG2000-二醛培养16小时/4℃在HEPES 4mM(pH 7)中，最终浓度调节至0.1mg/ml。随后，60μl不同组成的LMD与240μl血清混合，混合物在轻微摇动下在37℃下培养。以血清作为空白对照，用Ultrospec 4000分光光度计(Phamarcia Biotech Ltd，Cambridge，England)记录不同时间在600nm处的吸光度。没有观察到增加PEG2000-二醛的量有重要的稳定化作用(附图7)。LD由DOPE∶脂质B198∶胆固醇(45∶30∶25，摩尔比)脂质体组成，在0.1mg/ml(DNA浓度)水平在血清中进行分析。LD用不同摩尔百分比(相对于总的脂质摩尔含量)的PEG2000-二醛，OpF-acon-PEG3400-mal，NHS-PEG3000-mal培养16小时/4℃在HEPES 4mM(pH 7)中，最终浓度调节至0.09mg/ml。随后，16.6μl不同组成的LD和50μl的血清混合，混合物在37℃下温育。在不同时间采样5μl LD用光子相关分光仪(样品在HEPES(4mM pH)中稀释用于测量)测量产生的粒子的大小。(附图12)
由此说明，在脂质体-DNA复合体(DOPE，B198)暴露的胺和PEG-二醛之间形成的Schiff-碱在血清中并不是非常稳定。该PEG的作用对于不稳定制剂如LMD(B198∶DOPE)(附图7)是很弱的，对于更加稳定的制剂如LD(DOPE，B198，胆固醇)则更加明显。
附图12说明对pH值敏感的Opf-acon-PEG-Mal积极地偶联到脂质体-DNA复合体的胺上，并且有很强的稳定化作用。
包含丝氨酸脂质13的脂质体的研究
DOPE∶丝氨酸脂质13(50∶50)脂质体用于形成LMD载体，脂质体∶mu∶pDNA比例为12∶0.6∶1，确定存在不同量的PEG2000-二醛时的稳定性。复合体在HEPES 4mM(pH 7)中平衡16小时，之后在OptiMEM中加入样品。PEG存在的量和LMD的关系以及复合体的稳定性可以确定。没有加PEG的LMDs的尺寸快速增大，然而加入20％PEG(质量比，大约相当于脂质体的6％摩尔)的LMDs在尺寸的增长上比较缓慢(附图8)。脂质和PEG2000-二醛之间共价键的特定形成的证据来自于与硫醇化PEG的对比。只有包含醛的PEG产生稳定的LMDs，而其他PEG不显示出稳定化。而且，这些实验暗示了在聚乙二醇和以丝氨酸胆固醇为基础的化合物表面胺基之间存在的类似Schiff-碱的共价键的形成。
LMD由DOPE∶丝氨酸脂质13(50∶50)脂质体组成，标准配方比例为12∶0.6∶1，对此LMD在血清中进行稳定性分析。LMDs在HEPES4mM(pH 7)中与不同量的PEG2000-二醛温育20小时。随后，60μl100μg/ml不同组成的LMD与240μl血清混合，混合物在轻微摇动下在37℃下温育。以单独的血清作为空白对照，记录不同时间在600nm处的吸光度。观察到增加PEG2000-二醛的量有显著的稳定性作用(附图9)。
这说明，LMD的丝氨酸暴露表面和PEG-醛之间形成的Schiff-碱对于降低由血清引致的聚集是足够稳定的。
转染实验：
在OptiMEM和血清(90％)中的Panc-1细胞转染方案
概述 培养的Panc-1或OVCAR-1细胞在48-孔培养板中以每孔2E5细胞接种，在37℃和5％CO2下，在DMEM中生长至大约70％汇合。这些细胞在PBS中洗涤，然后将转染介质加给每一个孔(0.250ml血清或OptiMem)。0.5μg LMD(DNA)加至每一个孔，时间为1小时。接着细胞用PBS清洗3次，在标准培养基(NGM)中生长24小时。从培养板上刮下细胞，使用Roche诊断学化学发光报告基因分析试剂盒来分析β-半乳糖表达。
结果 转染结果证明，随增加PEG-二醛的量，观察到活性下降。这与PEG和LMD的共价偶联(Schiff-碱形成)是一致的，其进一步被由未影响转染水平的PEG-SH对照所强调。转染的减少可归因于PEG连至LMD表面所导致的载体细胞摄取的减少，这因此屏蔽了正电荷，或通过PEG细胞内抑制作用进行。
结论
醛/酮官能化PEG与(a)胺或(b)含丝氨酸的脂质(如丝氨酸脂质13)的表面反应被实现。生成的键非常不稳定(a)或更加稳定(b)。在两种情况中，在缩合反应过程中产生的唯一副产物是水。因此，这种方法展示了一种非常有效且一流的方式用以稳定药物或基因递送体系，它们保持了它们的部分转染活性(附图10和11)并显示了强的稳定性。预期这种概念对于平衡药物/基因递送载体的稳定化和功能是理想的。而且，这种概念允许带双官能隐秘化合物的药物/基因递送载体和含巯基导向配体的容易的单罐反应。
后偶联、血清稳定化、触发性和体外转染
综述
概论 表1中所例举的每一个可触发脂质都以优化的比例(见附图)作为除IPIDB198和DOPE外的第三脂质配制成脂质体。脂质体通过100nm膜(10x)挤出，由PCS测量大小。缓慢加入在HEPES(4mM)中的pDNA稀释溶液产生LD(脂质体+pDNA)，最终浓度0.1mg pDNA/mL。如果不立即用于转染，将LDs于4℃下在6％蔗糖中储存。发现有三个制剂特别有趣，分别是脂质B198/DOPE/胆固醇(45∶30∶25)，脂质B198/DOPE/脂质23和脂质B198/DOPE/氨氧基脂质1。
脂质B198/DOPE/胆固醇
血清稳定性
LDs由0.1mg/ml(pDNA)的DOPE∶脂质B198∶胆固醇(45∶30∶25，摩尔比)脂质体组成，加入血清分析。LDs用不同摩尔百分比(相对于总的脂质摩尔含量)的PEG2000-二醛，OpF-acon-PEG3400-mal，NHS-PEG3400-mal于HEPES 4mM(pH 7)中培养16小时，温度为4℃。最终浓度调节为0.09mg/ml。随后，不同组成的16.6μl LD与50μl血清混合，混合物在37℃条件下温育。在不同时间点抽取5μl LD利用PCS测定产生粒子的大小(HEPES 4mM pH7稀释每一个样品以用于测量)。
结论
结果说明脂质体-DNA复合体(DOPE，脂质B198)暴露的胺和PEG-二醛之间形成的Schiff-碱在血清中不是很稳定。PEG的作用对于不稳定的制剂如LMD(脂质B198/DOPE)(附图7)是很弱的，对于更加稳定的制剂如LD(DOPE/脂质B198/胆固醇)(附图12)则更加明显。
附图12表明对pH敏感的OpF-acon-PEG-mal积极地偶联到脂质体-DNA复合体的胺上，并且有很强的稳定化作用。
脂质B198/DOPE/脂质
23
血清稳定性
LDs由0.1mg/ml(pDNA)的DOPE∶脂质B198∶脂质23(45∶30∶25，m/m/m)脂质体组成，暴露至血清后进行分析。LDs用不同摩尔百分比(相对于总的脂质摩尔含量)的PEG2000-二醛，OpF-acon-PEG3400-mal，PEG6000-SH于HEPES 4mM(pH 7)中培养16小时，温度为4℃。最终浓度调节为0.09mg/ml。随后，不同组成的16.6μl LD与50μl血清混合，混合物在37℃条件下温育。在不同时间点抽取5μl LD，利用PCS测产生粒子的大小(HEPES 4mM pH7稀释每一个样品以用于测量)。
pH释放
LDs由0.1mg/ml(pDNA)的DOPE∶脂质B198∶脂质23(45∶30∶25，摩尔比)脂质体组成，在pH 5.3下在血清中进行稳定性分析。LDs用不同摩尔百分比(相对于总的脂质摩尔含量)的PEG2000-二醛或OpF-acon-PEG3400-mal于HEPES 4mM(pH 7)中温育16小时，温度为4℃。最终浓度调节为0.09mg/ml。在血清稳定性试验(同之前的相似)之前，LDs在pH5.3(HCl调节)条件下温育3小时。
转染
LDs由0.1mg/ml(DNA浓度)的DOPE∶脂质B198∶脂质23(45∶30∶25，摩尔比)脂质体组成，将该LDs根据所述转染方案在OVCAR-1细胞上进行转染。
导向性
LDs由0.1mg/ml(pDNA)的DOPE∶脂质B198∶脂质23(45∶30∶25，摩尔比)脂质体(比例pDNA∶脂质＝1∶14)组成，进行导向试验。首先，OpF-acon-PEG3400-mal溶液在pH 8下在叶酸-半胱氨酸肽溶液中温育1小时，得到OpF-acon-PEG3400-cys-叶酸(OpF-acon-PEG3400-cys-folate)，随后加入到LD溶液(1或10摩尔％，相对于总的脂质摩尔含量)。同样的方法处理OpF-acon-PEG3400-mal溶液但是不加入导向肽以产生对照LDs。
混合物在HEPES 4mM(pH 7)中温育16小时，温度为4℃，对同一缓冲剂透析(MCO＝10000)24小时，得到40μg/ml的导向的LD溶液。随后，不同组成的37.5μl LD与50μl的血清混合，混合物在37℃条件中温育。在不同时间点抽取8μl LD利用PCS测产生粒子的大小(HEPES 4mM pH7稀释每一个样品以用于测量)。
这些LD根据所述转染方案在OVCAR-1细胞上进行转染。
结论
附图13证明了包含中性酰肼脂质23的LD的高度稳定性。这表明脂质体-DNA复合体的酰肼和PEG2000-二醛之间形成的羧基腙加合物在血清中高度稳定。使用PEG6000-SH的对照试验清楚证明了上述作用是由于醛官能团形成了血清稳定的加合物。
附图13表明对pH敏感的OpF-acon-PEG3400-mal对于肼脂质23具有强偶联性，导致高度耐血清的脂质体-DNA复合体制剂。
附图14证明，在试验条件下偶联acon-PEG3400-mal的LD(包含脂质23)和未改性LD不会被pH温育影响(相似结果见附图13)。pH敏感的腙加合物受到pH(5.3)强烈的影响，导致产生较附图13稳定性较差的颗粒。
附图19证明包含酰肼脂质23的稳定LD甚至能够在含95％的介质情况下转染。增加PEG的量观察到转染有所降低，这与PEG与LD产生共价偶联是一致的。这可归因于PEG附着或PEG细胞内抑制作用导致的载体被细胞摄取的降低。
附图20证明了OpF-acon-PEG3400-mal和OpF-acon-PEG3400-cys-叶酸与LD的有效偶联。用10摩尔％OpF-acon-PEG3400-mal或10摩尔％OpF-acon-PEG3400-cys-叶酸改性时，LD具有高度稳定性。
附图22证明了后改性LD系统的潜在导向能力。
当足够的导向结构部分与脂质体-DNA复合体(10摩尔％)偶联，能够观察到因OVCAR-1细胞系的叶酸基受体的导向性导致的明显的升高(10％血清中为3倍，95％血清中为6倍)。95％血清中的10％OpF-acon-PEG3400-cys-叶酸LD的转染水平与同样情况下与未改性粒子是相当的。
总结所有的结果表明酰肼脂质23与PEG-二醛的醛偶联，产生对pH敏感但是耐血清的结合体。含有顺式乌头酸键的PEG在实验条件下没有产生pH释放，但预期在更加具有挑战性的体外/体内条件中对于pH敏感13-15。
体外转染结果证明产生的粒子能够在非常有挑战性的条件如95％血清中进行转染。这种粒子的稳定性(和其pH释放潜能结合)以及它的转染能力对于系统性应用是理想的。
可使用叶酸基受体导向所产生的脂质体-DNA复合体。这种粒子具有高度稳定性并且比没有导向结构部分的粒子具有更高的转染效率。
L1PIDB198/DOPE/氨氧基脂质1
血清稳定性
LDs由0.1mg/ml(pDNA)的DOPE∶脂质B198∶氨氧基脂质1(45∶30∶25，摩尔比)脂质体组成，暴露至血清后进行分析。LDs用不同摩尔百分比(相对于总的脂质摩尔含量)的PEG2000-二醛，OpF-acon-PEG3400-mal，PEG6000SH于HEPES 4mM(pH 7)中温育16小时，温度为4℃。最终浓度调节为0.09mg/ml。随后，不同组成的16.6μl LD与50μl血清混合，混合物在37℃条件下温育。在不同时间点抽取5μlLD，利用PCS测产生粒子的大小(HEPES 4mM pH7稀释每一个样品以用于测量)。
pH释放
LDs由0.1mg/ml(DNA浓度)的DOPE∶脂质B198∶氨氧基脂质1(45∶30∶25，摩尔比)脂质体组成，将该LDs暴露于pH 5.3后在血清中进行稳定性分析。LDs用不同摩尔百分比(相对于总的脂质摩尔含量)的PEG2000-二醛或OpF-acon-PEG3400-mal于HEPES 4mM(pH7)中温育16小时，温度为4℃。最终浓度调节为0.09mg/ml。在血清稳定性试验(同之前的相似)之前，LDs在pH5.3(HCl调节)下温育3小时。
转染
LDs由0.1mg/ml(pDNA)的DOPE∶脂质B198∶氨氧基脂质1(45∶30∶25，摩尔比)脂质体组成，根据所述转染方案在OVCAR-1细胞上进行转染。
导向性
LDs由0.1mg/ml(DNA浓度)的DOPE∶脂质B198∶氨氧基脂质1(45∶30∶25，m/m/m)脂质体(比例pDNA∶脂质＝1∶12，w/w)组成，进行导向试验。首先，OpF-acon-PEG3400-mal溶液在pH 8下在叶酸-半胱氨酸肽溶液中温育1小时，得到OpF-acon-PEG3400-cys-叶酸，随后将其加入到LD溶液(1或10摩尔％，相对于总的脂质摩尔含量)。同样的方法处理OpF-acon-PEG3400-mal溶液但是不加入导向肽，产生对照LDs。
混合物在HEPES 4mM(pH 7)中培养16小时，温度为4℃，对同一缓冲剂透析24小时，得到40μg/ml的导向的LD溶液。
随后，不同组成的37.5μl LD与50μl的血清混合，混合物在37℃下温育。在不同时间点抽取8μl LD，利用PCS测产生粒子的大小(HEPES 4mM pH7稀释每一个样品以用于测量)。
这些LD根据所述转染方案在OVCAR-1细胞上进行转染。
结论
附图15表明脂质体-DNA复合体的氨氧基脂质1和PEG2000-二醛之间的结合在血清中是高度稳定的。使用PEG6000-SH的对照试验没有产生任何这样的作用。
附图15表明对pH敏感的OpF-acon-PEG3400-mal和脂质体-DNA复合体的氨氧基脂质1强偶联，产生非常强的稳定化作用。
附图16证明在实验条件下acon-PEG3400-mal和PEG2000-二醛偶联的LDs以及未改性LD不受pH温育影响(相似结果见附图15)。
附图18证明了包含氨氧基脂质1(由脂质B198∶DOPE组成的LD在95％血清中几乎不能转染)的LD在95％血清中的优越性。观察到随着PEG量的增加，转染有所减少，这与PEG和LD共价偶联是一致的。这可归因于PEG附着或PEG细胞内抑制作用导致的载体被细胞摄取的降低。
附图21证明了OpF-acon-PEG3400-mal和OpF-acon-PEG3400-cys-叶酸与LD有效偶联。用10摩尔％OpF-acon-PEG3400-mal或10摩尔％OpF-acon-PEG3400-cys-叶酸改性时，LD具有更高的稳定性。
附图23证明了后改性LD系统的潜在导向能力。
当足够的导向结构部分与脂质体-DNA复合体(10摩尔％)偶联，能够观察到OVCAR-1细胞系的叶酸基受体的导向性导致的明显的升高(10％血清中为3.6倍，95％血清中为7.2倍)。
摘要所有的结果表明氨氧基脂质1与PEG2000-二醛的醛偶联，没有产生对pH敏感的结合。含有顺式-乌头酸键的PEG在实验条件下没有证明pH释放，但预期在更加具有挑战性的体外/体内条件中对于pH敏感16。体外转染结果证明产生的粒子能够在非常有挑战性的条件如95％血清中进行转染。产生的脂质体-DNA复合体可利用叶酸基受体进行导向。这种粒子在95％血清中更加稳定，并且比没有导向结构部分的粒子具有更加高的转染效率。
包含脂质14，16，24的脂质体制剂的研究
血清稳定性
LDs由0.13mg/ml(pDNA)的DOPE∶脂质B198∶脂质14；DOPE∶脂质B198∶脂质16；(45∶30∶25，摩尔比)脂质体组成，加入血清进行分析。LDs用不同摩尔百分比(相对于总的脂质摩尔含量)的PEG2000-二醛于HEPES 4mM(pH 7)中温育16小时，温度为4℃。最终浓度调节为0.1mg/ml。随后，不同组成的60μl LD与240μl血清混合，混合物在37℃条件下温育。记录不同时间在600nm的吸收度(浊度(turbidity))。
转染
LD由DOPE∶脂质B198∶脂质14；DOPE∶脂质B198∶脂质16；DOPE∶脂质B198∶脂质24，DOPE∶脂质B198∶脂质B198，DOPE∶脂质B198∶胆固醇和DOPE∶脂质B198∶氨氧基脂质1(45∶30∶25摩尔比)组成，经不同摩尔百分比的PEG2000-二醛改性。这些LDs根据所述转染方案在Panc-1细胞上进行转染。
结论
附图24a表明包含脂质14的脂质体-DNA复合体暴露的半胱氨酸和PEG-二醛之间形成的结合在血清中不稳定。二醛PEG对于这种内在不稳定的制剂的作用很弱，只有在PEG比例高时(25摩尔％)作用才明显。
附图24b表明包含脂质16的脂质体-DNA复合体暴露的半胱氨酸和PEG-二醛之间形成的结合在血清中稳定。PEG的作用是明显的。
附图17证明观察到随着PEG量的增加，转染(在含10％的介质的情况下)有所减少，这与PEG和LDs的共价偶联是一致的。这可归因于PEG附着或PEG细胞内抑制作用导致的载体被细胞摄取的降低。
摘要所有的结果表明包含半胱氨酸的脂质16和14偶联至PEG2000-二醛的醛上。产生的复合体在血清中更加稳定，并且当与高摩尔百分比的PEGs偶联时，在包含10％血清的介质中对Panc-1表现出低转染水平。包含脂质24的LDs能够在生长介质中转染。
生物学评价II：体外转染研究
概述
海马切片根据如下详细叙述从Wistar大鼠制备。使用三种不同类型的脂质体-DNA复合体温育，其区别在于所含脂质体组成不同。制剂I：脂质B198/DOPE(50∶50，m/m)的脂质体-DNA复合体；制剂II：LIPIDB198/DOPE/氨氧基脂质1(30∶60∶10，m/m/m)的脂质体-DNA复合体；制剂III：L1PIDB198/DOPE/氨氧基脂质1(30∶60∶10，m/m/m)的脂质体-DNA复合体用二醛2000(10％)温育。
海马切片的制备
利用27-21天龄Wistar大鼠(WAG/GSto，Moscow，Russia)进行研究，快速断头处死后，鼠脑立即转移至一个Petri皿，其中含4℃冷冻溶液，溶液组成如下：120mM NaCl，5mM KCl，26mM NaHCO3，2mM MgCl2和20mM葡萄糖(溶液1)，不加入钙盐以减少可能的神经损害。溶液不断使用95％O2/5％CO2气体混合物充氧保持pH＝7.4。海马切片(300-400μm厚)用一个叶片刀沿小泡纤维切割下来，以保持兴奋性连接的薄层结构。在预温育期间，切片完全浸泡在细胞外溶液中：135mM NaCl，5mM KCl，26mM NaHCO3，1.5mM CaCl2，1.5mM MgCl2，20mM葡萄糖(溶液2)(pH＝7.4，95％O2/5％CO2鼓泡)，温度为30-31℃。试验在细胞外溶液中进行，溶液组成如下：150mM NaCl，5mMKCl，20mM HEPES，2mM CaCl2，1mM MgCl2，10mM葡萄糖(溶液3)(pH＝7.4，不充氧)。使用脂质体-DNA复合体温育期间，切片保存1小时：
第1种情况：在溶液2中，预先充氧，不要在加载过程中充氧。温育后，充氧条件下，切片在溶液2中保存8小时。
第2种情况：在溶液3(氨基酸和血清)中，不充氧。不要从细胞外溶液中移除脂质体-DNA复合体。37℃下，切片在CO2温育器中保存超过24小时。
结果
附图25 1和3显示了利用制剂II转染后的切片表面的小神经胶质细胞，制剂II由脂质体制剂脂质B198/DOPE/氨氧基脂质1(30∶60∶10，m/m/m)组成。它表明脂质体-DNA复合体经吞噬作用被捕获。2显示了利用制剂II转染后的海马CA1区的锥形神经元。4显示了利用制剂III转染后的一层锥形神经元(低放大率)。
结论
后包覆的样品III显示了平均值120-140μm的显著组织侵入(内吞)，如用荧光显微镜所探测到的，在所研究表面下面显示了广布的弱荧光。样品1和2当暴露于表面时被吞噬。
生物学评价III：体内转染研究
概述
使用200μl氯胺酮∶盐酸甲苯噻嗪(2∶1 v/v)麻醉MF-1雌性小鼠(35g)，使用鼻内装置给药一系列不同的脂质体-DNA复合体构建体：每只动物10μg，20μg或30μg pDNA，30μl PBS总体积。所有的脂质体-DNA复合体样品在HEPES，4mM(pH 7)中制备，pDNA浓度为0.1mg/mL，最终浓度为10％蔗糖，pDNA共100μg。每一个样品在4℃下和二醛2000温育72小时，然后用真空旋转蒸发仪浓缩至最终pDNA浓度为1.0mg/mL(即，最终体积为100μL)。为了较好的制剂控制，pDNA组分与腺病毒核肽mu或C18-mu预缩合。
样品
标准LMD(a)
·缩合物质：μ，0.6质量当量
·质粒：pNGVL-1(β-半乳糖苷酶，7.5kb)，1当量
·脂质体：B198/DOPE，12质量当量
LMD(AO)(b)
·缩合物质：μ，0.6质量当量
·质粒：pNGVL-1(β-半乳糖苷酶，7.5kb)，1当量
·脂质体：B198/DOPE/氨氧基脂质1(30∶60∶10，m/m/m)，12质量当量
LMD(AO/PEG-醛)(c)
·缩合物质：μ，0.6质量当量
·质粒：pNGVL-1(β-半乳糖苷酶，7.5kb)，1当量
·脂质体：B198/DOPE/A01(30∶60∶10，m/m/m)，12质量当量
·5％PEG2000-二醛
LMD18(AO)(d)
·缩合物质：C18-μ，0.6质量当量
·质粒：pNGVL-1(β-半乳糖苷酶，7.5kb)，1当量
·脂质体：B198/DOPE/A01(30∶60∶10，m/m/m)，12质量当量
LMD18(AO/PEG-醛)(e)
·缩合物质：C18-μ，0.6质量当量
·质粒：pNGVL-1(β-半乳糖苷酶，7.5kb)，1当量
·脂质体：B198/DOPE/A01(30∶60∶10，m/m/m)，12质量当量
步骤
使用200μl氯胺酮∶盐酸甲苯噻嗪(2∶1 v/v)麻醉MF-1雌性小鼠(35g)，使用鼻内装置给药LMD构建体：每只动物10μg，20μg或30μg，30μl PBS总体积。48小时后处死动物，切除气管和肺。在1m细胞溶解缓冲液中均化组织，使用商业可获得的分析试剂盒(Boehringer Mannheim)通过ELISA确定β-gal表达。β-gal水平标准化为每一个样品的蛋白质含量，其可使用bicinconinic acid(BCA)蛋白质分析系统(Pierce)确定。
图26鼻内给药LMDa-e样品在10，20和30μg/动物的pDNA水平的体内功效。质粒NGVL-1(7.5kbβ-gal)。A，μ/B198/DOPE；B，μ/B198/DOPE/A01；C，μ/B198/DOPE/A01+5％PEG2000-二醛；D，C18-μ/B198/DOPE/A01；E，C18-μ/B198/DOPE/A01+5％PEG2000-二醛
结果和结论
二醛后包覆的脂质体-DNA复合体(c)在30μg pDNA/动物剂量水平，转染效率为阳性腺病毒对照的大约10％。其他样品的转染效率不可测。
上文所提到的所有的出版物在这里引入作为参考。本发明方法和系统的各种改进和改变对于本领域技术人员而言在不离开本发明界限和宗旨的范围内都是显而易见的。虽然本发明描述了特定的优选的实施例，但要求保护的范围并不限于这些实施例。事实上，对于生物学、化学或其他相关领域的技术人员而言显而易见的用于实施本发明的所述方式的各种改变都包含在权利要求的范围内。
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Claims (61)
1.一种治疗剂用递送运载体，包含改性脂质和治疗剂；
其中改性脂质包含脂质和递送、导向或稳定化结构部分(DTS结构部分)；
其中脂质通过连接体与DTS结构部分连接，所述连接体在细胞外生物学流体中稳定且在细胞内生物学流体和/或限定的条件下不稳定；和
其中DTS结构部分在脂质和治疗剂形成复合体后与脂质连接。
2.一种治疗剂用递送运载体的制备方法，所述治疗剂用递送运载体包含改性脂质和治疗剂，所述方法包括以下步骤：(a)形成包括连接体结构部分的脂质和治疗剂的复合体；(b)通过连接体结构部分将递送、导向或稳定化结构部分(DTS结构部分)与所述脂质连接，其中DTS结构部分和脂质之间的连接在生物学流体中稳定且在限定的条件下不稳定。
3.根据权利要求1或2的发明，其中在与细胞表面接触或在细胞内时，所述连接不稳定。
4.根据权利要求1或2的发明，其中在限定的pH条件下，所述连接不稳定。
5.根据权利要求4的发明，其中在pH 5.0-6.5，所述连接不稳定。
6.根据权利要求1或2的发明，其中在还原条件下或在细胞内生物学流体中，所述连接不稳定。
7.根据在前任一项权利要求的发明，其中改性脂质如下式所示：
其中A和B之一是脂质，另一个是递送、导向或稳定化结构部分(DTS结构部分)；其中X和Y独立地是任选的连接体基团。
8.根据权利要求1-6任一项的发明，其中改性脂质如下式所示：
其中A和B之一是脂质，另一个是递送、导向或稳定化结构部分(DTS结构部分)；
其中X和Y独立地是任选的连接体基团；
其中R1是H或烃基；
其中R2是孤电子对或R4；其中R4是合适的取代基；
其中R3和R5独立地选自H和烃基；和
其中Q选自O，S，NH。
9.根据权利要求1-6任一项的发明，其中改性脂质如下式所示：
其中A和B之一是脂质，另一个是递送、导向或稳定化结构部分(DTS结构部分)；
其中X和Y独立地是任选的连接体基团；
其中R1是H，O-或烃基；和
其中R2是孤电子对或R4，其中R4是合适的取代基。
10.根据权利要求9的发明，其中改性脂质如下式所示：
其中A和B之一是脂质，另一个是递送、导向或稳定化结构部分(DTS结构部分)；其中X和Y独立地是任选的连接体基团；和
其中R1是H，O-或烃基；
其中R2是孤电子对或R4，其中R4是合适的取代基；
其中R3和R5独立地选自H和烃基；和
其中Q是合适的取代基。
11.根据权利要求8或10的发明，其中Q选自OH，SH，伯胺，仲胺，叔胺和烃基。
12.根据权利要求8-11任一项的发明，其中R1是H。
13.根据权利要求8-12任一项的发明，其中C＝N键是对酸不稳定的或耐酸的。
14.根据权利要求13的发明，其中C＝N键是对酸不稳定的。
15.根据权利要求13的发明，其中C＝N键是耐酸的。
16.根据权利要求7-15任一项的发明，其中Y是存在的。
17.根据权利要求7-16任一项的发明，其中Y是O。
18.根据权利要求7-16任一项的发明，其中Y是烃基。
19.根据权利要求18的发明，其中Y选自-[CnHn-2]a-[NH]b-[CZ]c-[NH]d-[CZ]e-NH-，其中a，b，c，d和e独立地选自0-10；其中n为5-10；和
其中Z为O或S。
20.根据权利要求19的发明，其中a为0或1。
21.根据权利要求19或20的发明，其中b为0或1。
22.根据权利要求19、20或21的发明，其中c为0或1。
23.根据权利要求19-22任一项的发明，其中d为0、1或2。
24.根据权利要求19-23任一项的发明，其中e为0或1。
25.根据权利要求19-24任一项的发明，其中Z为0。
26.根据权利要求19-25任一项的发明，其中n为5。
27.根据权利要求7-16任一项的发明，其中Y选自-NH-、-NH-CO-NH-、-NH-CS-NH-、-NH-CO-NH-NH-CO-NH-、-CO-NH-、和-C5H3-NH-、-NH-(CH2)2-NH-C(O)-CH(CH2OH)-、-NH-(CH2)2-NH-C(O)-CH(CH2SH)-、-NH-(CH2)2-NH-C(O)-CH2O-、-NH-(CH2)2-NH-(CH2)3-NH-C(O)-CH(CH2OH)-、-NH-(CH2)2-NH-(CH2)3-NH-C(O)-CH(CH2SH)-、-NH-(CH2)2-NH-(CH2)3-NH-C(O)-CH2O-和-NH-CH2-C(O)-NH-。
28.根据权利要求27的发明，其中Y选自-NH-(CH2)2-NH-C(O)-CH(CH2OH)-、-NH-(CH2)2-NH-C(O)-CH(CH2SH)-、-NH-(CH2)2-NH-C(O)-CH2O-、-NH-(CH2)2-NH-(CH2)3-NH-C(O)-CH(CH2OH)-、-NH-(CH2)2-NH-(CH2)3-NH-C(O)-CH(CH2SH)-、-NH-(CH2)2-NH-(CH2)3-NH-C(O)-CH2O-、-NH-CH2-C(O)-NH-和-NH-。
29.根据权利要求7-28任一项的发明，其中X是存在的。
30.根据权利要求7-29任一项的发明，其中X是烃基。
31.根据权利要求7-30任一项的发明，其中A是DTS结构部分，B是脂质。
32.根据在前权利要求任一项的发明，其中DTS结构部分是递送和/或稳定化结构部分。
33.根据在前权利要求任一项的发明，其中DTS结构部分是递送和/或稳定化聚合物。
34.根据在前权利要求任一项的发明，其中DTS结构部分选自单或双官能的聚(乙二醇)(“PEG”)，聚(乙烯醇)(“PVA”)；其他聚(氧化烯)例如聚(丙二醇)(“PPG”)；和聚(氧乙基化多元醇)例如聚(氧乙基化甘油)，聚(氧乙基化山梨醇)，和聚(氧乙基化葡萄糖)及类似物。
35.根据在前权利要求任一项的发明，其中DTS结构部分包含另外的连接体基团，该连接体基团能够与另外的DTS结构部分连接。
36.根据权利要求35的发明，其中DTS结构部分包含另外的连接体基团，该连接体基团能够与导向结构部分连接。
37.根据在前权利要求任一项的发明，其中脂质是或包括胆固醇基团。
38.根据权利要求37的发明，其中所述胆固醇基团是胆固醇。
39.根据权利要求37或38的发明，其中所述胆固醇基团通过氨基甲酰键或醚键与X连接。
40.根据权利要求7-39任一项的发明，其中脂质通过多胺基团与X连接。
41.根据权利要求40的发明，其中所述多胺基团不是天然存在的多胺。
42.根据权利要求40或41的发明，其中多胺基团包含被亚乙基(-CH2CH2-)基团彼此间隔开的至少两个胺。
43.根据权利要求42的发明，其中多胺是亚精胺、精胺或caldopentamine的任一种。
44.一种改性脂质，如下式所示：
其中，A和B之一是脂质，另一个是递送、导向或稳定化结构部分(DTS结构部分)；
其中X和Y独立地是任选的连接体基团；
其中R1是H或烃基；
其中R2是是孤电子对或R4；其中R4是合适的取代基；
其中R3和R5独立地选自H或烃基；和
其中Q选自OH，SH，NH。
45.一种改性脂质，如下式所示：
其中A和B之一是脂质，另一个是递送、导向或稳定化结构部分(DTS结构部分)；
其中X和Y独立地是任选的连接体基团；
其中R1是H、O-或烃基；和
其中R2是孤电子对或R4，其中R4是合适的取代基。
46.一种改性脂质，如下式所示：
其中A和B之一是脂质，另一个是递送、导向或稳定化结构部分(DTS结构部分)；其中X和Y独立地是任选的连接体基团。
47.根据权利要求44、45或46的改性脂质，其特征在于权利要求10-43任一项的特征。
48.根据权利要求44-47任一项的化合物，该化合物与核苷酸序列或药物活性剂混合或缔合。
49.根据权利要求1-43任一项的递送运载体或根据权利要求44-47任一项的化合物，用于治疗。
50.根据权利要求1-43任一项的递送运载体或根据权利要求44-47任一项的化合物在制造治疗遗传性障碍或状况或疾病的药物中的用途。
51.由根据权利要求44-47任一项的化合物生成的脂质体/脂质体-DNA复合体。
52.一种制备脂质体/脂质体-DNA复合体的方法，包括由根据权利要求44-47任一项的化合物形成脂质体/脂质体-DNA复合体。
53.根据权利要求51的脂质体/脂质体-DNA复合体，用于治疗。
54.根据权利要求51的脂质体/脂质体-DNA复合体或根据权利要求52的方法制备的脂质体/脂质体-DNA复合体在制造治疗遗传性障碍或状况或疾病的药物中的用途。
55.核苷酸序列与任一种或多种如下物质的组合：根据权利要求1-43任一项的递送运载体，根据权利要求44-47任一项的化合物，根据权利要求51的脂质体/脂质体-DNA复合体或根据权利要求52的方法制备的脂质体/脂质体-DNA复合体。
56.根据权利要求55的组合，用于治疗。
57.根据权利要求55的组合在制造治疗遗传性障碍或状况或疾病的药物中的用途。
58.一种药物组合物，包含根据权利要求1-43任一项的递送运载体或根据权利要求44-47任一项的化合物，其中所述递送运载体及所述化合物和药物混合以及任选地和药学上可接受的稀释剂、载体或赋型剂混合。
59.一种药物组合物，包含根据权利要求51的脂质体/脂质体-DNA复合体或根据权利要求52的方法制备的脂质体/脂质体-DNA复合体，其中所述脂质体/脂质体-DNA复合体和药物混合以及任选地和药学上可接受的稀释剂、载体或赋型剂混合。
60.一种递送运载体、化合物、阳离子脂质体/脂质体-DNA复合体或组合物，其基本上如说明书所述并可参照任一附图。
61.一种方法，其基本上如说明书所述并可参照任一附图。
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