CN1263730C - 用于胞内释放药理活性化合物的用作阳离子脂质的l－肉碱或烷酰基l－肉碱的酯 - Google Patents
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Abstract
公开了L-肉碱和烷酰基L-肉碱的酯，它们可以作为阳离子脂质用于细胞内释放药理学的活性化合物。也公开了具有式(I)结构的L-肉碱和烷酰基L-肉碱的新酯，其中R基团的定义如说明书所述。
Description
本发明涉及一类新的L-肉碱和酰基L-肉碱的酯以及它们作为适于帮助药理活性化合物的胞内释放、促进它们的跨膜转运或促进它们与特定细胞膜位点(受体)的相互作用的阳离子脂质的用途。
本发明还涉及作为上述新化合物用于相同目的的L-肉碱和酰基L-肉碱的其他已知酯。
术语“胞内释放”在本文中的意思是指用天然来源或经过修饰赋予了治疗活性的多核苷酸或质粒进行细胞转染(基因释放)，或者将药物或免疫原性肽掺入到细胞中。
许多药理活性物质，诸如象多肽和蛋白质或药物一般需要穿透到细胞中通过以亚细胞或分子水平影响细胞功能而发挥它们的作用。对于这些分子来说，细胞膜构成了选择性不透屏障。细胞膜事实上履行保护功能，阻止可能的毒性物质进入，但也阻止了具有治疗活性的化合物通过。细胞膜的复合组成包括磷脂、糖脂和蛋白质；其功能受到细胞浆组分如Ca++及其他离子、ATP、微丝、微管、酶和与Ca++键合的蛋白质的影响。不同的细胞类型显示的选择性和它们之间的选择性是由于细胞的结构和细胞浆组分之间的相互作用和对外界信号的反应造成的。通过将复合物中的物质与再现天然来源的膜脂质组分的脂质制剂结合可以克服细胞膜的屏障效应。这些脂质可以与膜融合并释放与其结合的物质使之进入细胞。这些脂质复合物不仅能通过与膜融合的方式促进细胞内的转移，也能降低细胞膜与欲穿透细胞膜进入细胞的分子之间的电荷排斥力。两性脂质，如膜磷脂，在水性系统中形成脂质小襄或脂质体。
脂质体是一种小囊，其中水性体积被一或多层由脂质分子-通常为磷脂-组成的膜完全包裹。磷脂有一个亲水的头和一对碳链(疏水性的尾)，它是生物膜的主要组分。在水溶液中，疏水性的尾自动排斥水，而此时亲水性头与介质相互作用，自然形成有不同直径的小囊的群体。脂质体一般是两性离子，中性或阴离子。这些小囊可以作为药物、小分子、蛋白质、核苷酸和质粒的载体。
近年来，已广泛使用阳离子脂质体向细胞中转移遗传物质，它是一类由合成脂质制备的带正电荷的小囊。DNA的阴性电荷可以与阳离子脂质体相互作用，形成稳定的DNA-脂质体复合物。此技术的简单性和通用性使脂质体成为一种在人的基因疗法中输送基因的重要的载体。现在，用于基因疗法和NIH重组顾问委员会(NIHRecombinant Advisory Committee)批准的多数载体包括病毒的和合成的系统。
病毒感染包括一系列复杂的机制以能够感染特定的细胞并携带DNA进入细胞核。基因疗法使用病毒载体的原理基于用对疗效编码的基因替换病毒基因，而不消除病毒颗粒感染细胞的能力。病毒疗法受到免疫、细胞病变和基因重组等病毒因素(viral elements)的限制。
非常希望在病毒疗法中使用阳离子脂质。这些载体与生物来源的相比具有非常大的潜力，因为它们更安全、低毒并能够结合大体积的基因。然而，与生物载体相比，它们的细胞内基因转录产率较低。
需牢记的是，这种转染体系的应用是在研究的初级阶段。阳离子脂质在DNA-脂质复合物的形成、细胞与复合物的相互作用、与细胞膜的融合、在细胞内释放DNA和转录等过程中起非常重要的作用。
脂质体的体内(in-vivo)应用有重要的例子。病毒疗法的第一个临床试验是通过引入一个含有人脂质体复合的HLA-B7基因表达载体用于治疗黑素瘤。另一个重要的应用涉及脂质体复合的表达载体SV40C-FTR通过经肺途径或鼻腔喷雾给药治疗肺泡纤维变性。其他包括在癌症的基因疗法中使用脂质体的临床试验正在进展中。
在阳离子脂质的结构中通常鉴别四个构成因素：带正电的阳离子头，间隔区，锚状脂质(the anchor lipid)和连接键。
阳离子头导致阳离子脂质体和DNA之间、DNA-脂质体复合物和细胞膜及细胞的其他组分之间的相互作用。它含有一个或多个可以被取代的阳离子基团(决定于电荷数目)。
间隔区是分子中分隔阳离子头和疏水性尾的部分，并且它确保阳离子头与DNA磷脂的阴离子电荷之间的最佳的接触。
锚状脂质是分子的非极性烃部分，并决定双脂质层的物理性质，如其刚性和与膜脂质的交换速率。
″连接键″表示烃链和分子的其他部分之间的键。此键决定了阳离子脂质的化学稳定性和生物降解能力。
近年来脂质体在化妆品领域的应用稳定增长。脂质体在此领域的成功是由于皮肤对这些化合物是非常耐受的。它们既作为活性成分的载体，也作为促进活性成分吸收的化合物。
在制备和使用脂质体方面的科技和专利参考文献是非常丰富的，然而仅有少量的参考文献记载了肉碱衍生物在基因释放中的应用，对于药物的传递，没有涉及制备即使极少地相似于本发明的化合物的已知技术的文献可供利用。
专利申请EP 0 279 887记载了肉碱载体的应用，如磷脂酰基肉碱，可选地与其他磷脂和脂质(胆固醇、磷脂酰基胆碱、磷脂酰基丝氨酸)组成混合物，制备脂质体。
在关于制备脂质体的例子中，与普萘洛尔结合制备了磷脂酰基肉碱脂质体，普萘洛尔是一种已知具有抗高血压、抗心绞痛和抗心律失常活性的药物。此处使用肉碱衍生物是基于肉碱显著的心肌向性。此向性使脂质体能避免被肝代谢而不能到达所需的靶部位。
磷脂酰基肉碱的存在也使脂质体能够口服，因为它能对抗肠内的脂酶。
在《医药化学杂志》1998，6月18日；41(13)：2207-15记载了一些用于基因释放的L-肉碱的酯，但并未记载或提示它们作为药物释放的有用药剂。
WO96/39193记载了新的靶药物制剂，其目的在于通过肉碱-酰基肉碱移位酶系统进入线粒体，但未提示它们是制备脂质体的有用药剂。
EP 559 625 B1记载了一些有选择性的胃肠道肌松弛活性的L-肉碱和酰基L-肉碱的酯。
近年来分子生物学家已鉴定了一些导致人类遗传疾病的染色体水平的缺损。
现代医学的一个重要方面涉及用基因疗法方案治疗由遗传基因导致的疾病。
如已提及的，阳离子脂质体广泛用于在细胞内传递药物活性化合物，促进跨膜输送或促进其与特定的细胞膜位点(受体)的相互作用。
这些载体与源于生物的载体相比具有非常大的潜力，因为它们更安全、低毒并且也能结合大体积的基因。然而，与生物载体相比，它们的细胞内基因转录产率较低。
此外，由常规的阳离子脂质介导的基因转移需要质粒DNA和阳离子脂质保持分离，恰在基因转移之前使其混合。
使多核苷酸复合物稳定的尝试迄今为止是失败的，未能产生令人鼓舞的结果；实际上，它们仅在短的时间内保持稳定。
在基因疗法或基因释放和药物释放领域，已认识到非常需要稳定、可再生的位点-特异性系统，它在一个适当的时间周期后也具有活性。
已发现在促进细胞内的药理学活性化合物在细胞内传送方面具有强大活性的一类阳离子脂质含有新的L-肉碱和酰基L-肉碱的酯。
这些新化合物是稳定和高选择性的，因为它们在到达靶器官时具有位点特异性。
此特性使它们能特别有效地将活性物质直接传递到活性物质可以发挥其药理学活性的部位。
此处记载的本发明的化合物是有通式(I)的化合物：
其中：
n是1-3的整数；
R是氢或直链或分支的、有2-6个碳原子的烷酰基；
R1和R2，可以相同或不同，代表有3-20个碳原子的饱和或不饱和直链酰基；并且
X-是药学可接受的酸的阴离子。
R的例子是乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基和异戊酰基。
R1和R2的例子是己酰基、十一烷酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基或油酰基。
本发明优选的化合物如：
-L-肉碱溴化物与2-羟基乙酰基-1，3-二棕榈酰基甘油的酯(ST770)；
-乙酰基L-肉碱溴化物与2-羟基乙酰基-1，3-二棕榈酰基甘油的酯(ST 771)；
-丙酰基L-肉碱溴化物与2-羟基乙酰基-1，3-二棕榈酰基甘油的酯(ST 772)；
-异丁酰基L-肉碱溴化物与2-羟基乙酰基-1，3二棕榈酰基甘油的酯(ST 773)；
-异戊酰基L-肉碱溴化物与2-羟基乙酰基-1，3-二棕榈酰基甘油的酯(ST 774)；
-L-肉碱溴化物与1，3-二己酰基-2-羟基十六烷基甘油的酯(ST 810)；
-乙酰基L-肉碱溴化物与1，3-二己酰基-2-羟基乙酰基甘油的酯(ST 809)；
-丙酰基L-肉碱溴化物与1，3-二己酰基-2-羟基乙酰基甘油的酯(ST 808)。
药理学上可以接受的酸的阴离子是指任何不导致不需要的毒性或副作用升高的酸的阴离子。
这些酸是药理学家和药学领域的技术人员熟知的。
这些阴离子的例子不仅限于以下列出的种类：氯；溴；碘；门冬氨酸根；酸式门冬氨酸根；柠檬酸根；酸式柠檬酸根；酒石酸根；酸式酒石酸根；磷酸根；酸式磷酸根；延胡索酸根；酸式延胡索酸根；甘油磷酸根；葡萄糖磷酸根；乳酸根；顺丁烯二酸根；酸式顺丁烯二酸根；粘酸根；乳清酸根；草酸根；酸式草酸根；硫酸根；酸式硫酸根；三氯醋酸根；三氟醋酸根；甲磺酸根；双羟萘酸根和酸式双羟萘酸根。
以脂质体形式存在的式(I)化合物，作为在基因疗法中传递天然来源的或经修饰的质粒或核苷酸的药剂，或为作为疫苗的肽或蛋白质编码，或用于下列药物的基因释放，例如，抗癌剂，抗病毒剂，抗细菌剂，抗真菌剂，抗原生动物剂，用于治疗心血管系统疾病的药物，免疫原性肽和其他用于治疗的药物。
通过本领域普通技术人员熟知的常规技术制备含有式(I)化合物的脂质体；见A1len T.M.Drugs 56，747-56(1998)的例子。也可以用脂质体技术实践中熟知的其他组分制备本发明的脂质体。在本发明的一个实施例中，脂质体可以含有助性脂质，此术语在本领域是可以理解的。助性脂质例如胆固醇，1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰基胆碱或二油酰磷脂酰基胆碱。
本发明的脂质体适于以组合物形式存在。在属于传递药理学活性化合物的实施方案中，组合物理解为药剂学上的种类，可选地含有药学上可接受的载体和/或赋型剂。
脂质体形式的式(I)化合物，也可以用于制备化妆品组合物，脂质体本身可以作为化妆品活性剂，也可以用于输送化妆品活性物质，如水合剂、营养素、面部清洁剂、抗皱剂、抗蜂窝炎剂和抗拉伸纹剂(anti-stretch-mark agents)。
含有式(I)化合物的脂质体可以通过口服、肠道外、肌内、静脉注射、皮下、经皮给药，或以鼻或口喷雾剂的形式给药。
本发明也涉及另外具有通式(II)的阳离子脂质，它们已知用于不同的用途(见上述EP 559 625)。
根据本发明，式(II)化合物是L-肉碱的酯，用于制备在药物释放方面具有潜在活性的脂质体，它与上述式(I)化合物相比，在到达靶器官方面表现出稳定性和选择性的特点。同样有益的性质适用于化妆品。
这些化合物具有通式(II)：
其中：
R3是饱和或不饱和，直线或分支，有4-26个碳原子的酰基链；
R4是饱和或不饱和，直线或分支，有4-26个碳原子的烷基链；并且
X-是药理学可接受的酸的阴离子。
R3优选的例子是壬酰基、十二烷酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰基或油酰基。
R4优选的例子是壬烷基、十一烷基、十四烷基、十六烷基或油基。
本发明记载的特定的式(II)化合物的例子是：
-棕榈酰基L-肉碱氯化物十一烷基酯(ST 983)；
-硬脂酰基L-肉碱氯化物十一烷基酯(ST 1055)；
-硬脂酰基L-肉碱氯化物十四烷基酯(ST 1351)；
-棕榈酰基L-肉碱氯化物十四烷基酯(ST 1379)；
-肉豆蔻酰基L-肉碱氯化物十四烷基酯(ST 1380)；
-棕榈酰L-肉碱溴化物十六烷基酯(ST 1390)；
-油基(oleyl)L-肉碱氯化物油基酯(ST 1392)。
上述《医药化学杂志》1998年6月18日；41(13)：2207-15记载了一些式(II)化合物，即ST 1380、ST1390和ST 1392，作为制备用于细胞转染的具有治疗活性的脂质体的有用药剂，但未记载作为制备用于输送药物的脂质体的有用药剂。
制药领域具有一般经验的技术人员清楚地知道在制备脂质体-药物复合物方面面临的困难；实际上，不能预测一个用于传递基因的脂质体是否能用于传递药物，这需要克服许多困难以得到能与药物复合并将其优先释放到需要发挥治疗作用的器官的脂质体。
脂质体形式的式(II)化合物，是有用的药物释放剂，可以输送药物如抗癌剂、抗血管生成剂、抗病毒剂、抗细菌剂、抗真菌剂、抗原生动物剂，或用于治疗心血管疾病的药物，或免疫原性肽，和其他用于治疗的药物。
脂质体形式的式(II)化合物，也可以用于制备化妆品组合物，脂质体本身可以作为化妆品活性剂，也可以用于输送化妆品活性物质，如水合剂、营养素、面部清洁剂、抗皱剂、抗蜂窝炎剂和抗拉伸纹剂(anti-stretch-mark agents)。
在含有式(II)化合物的脂质体中，所述的脂质体可选地含有助性脂质。
含有式(II)化合物的脂质体可以通过口服、肠道外、肌内、静脉内、皮下、透皮给药，或以鼻或口喷雾剂的形式给药。
本发明也涉及另外具有通式(III)的阳离子脂质，它们已知用于不同的用途(见上述EP 559 625)。
根据本发明，式(III)化合物是L-肉碱的酯，用于制备在促进药物释放方面具有潜在活性的脂质体，它与上述式(I)化合物相比，在到达靶器官方面表现出稳定性和选择性的特点。
这些化合物具有通式(III)：
其中：
R5是饱和或不饱和，直线或分支，有4-26个碳原子的酰基链；
R6是饱和或不饱和，直线或分支，有4-26个碳原子的烷基链；
X-是药理学可接受的酸的阴离子，
具有如下限制条件：
当R5是硬脂酰基时，R6不是硬脂基，
当R5是油酰基时，R6不是硬脂基，
当R5是棕榈酰基时，R6不是棕榈基，
当R5是肉豆蔻酰基时，R6不是肉豆蔻基，
当R5是月桂酰基时，R6不是月桂基，
当R5是油酰基时，R6不是油基。
《医药化学杂志》1988，41，2207-2215公开了仅用于基因释放的放弃保护的脂质体形式的化合物。
R5优选的例子是壬酰基、十二烷酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰基或油酰基。
R6优选的例子是壬烷基、十一烷基、十四烷基、十六烷基或油基。
本发明式(III)化合物的优选的例子是：
-棕榈酰基L-肉碱氯化物十一烷基酯(ST 983)；
-硬脂酰基L-肉碱氯化物十一烷基酯(ST 1055)；
-硬脂酰基L-肉碱氯化物十四烷基酯(ST 1351)；
-棕榈酰基L-肉碱氯化物十四烷基酯(ST 1379)。
式(III)化合物作为在基因疗法中传递天然来源的或经修饰的质粒或核苷酸的药剂，或为作为疫苗的肽或蛋白质编码。
式(III)化合物可以通过口服、肠道外、肌内、静脉内、皮下、透皮给药，或以鼻或口喷雾剂的形式给药。
在以下反应简图中表示了制备本发明式(I)化合物的过程，它表示此简图用于所有通式(I)化合物。由于所有必需的试剂都是市售的或已公开在文献中，并且反应条件通常适用于本发明任何变化的全部范围，如果在常识范围内可以正常地满足需求，技术人员可以容易地得到R、R1和R2代表的所有的基团。
参考以上反应流程1，以下说明本申请的式(I)化合物的制备方法。
例1
丙酰基L-肉碱溴化物与2-羟基乙酰基-1，3-二棕榈酰
基甘油的酯(ST 772)
a)制备1，3-二羟基丙-2-酮1，3-二棕榈酸酯(1)
在0℃(外部温度)在无水氮气流中将二羟基丙酮(7g；0.078mol)溶解在300mL无水氯仿中。
向得到的溶液中滴加棕榈酰氯(44g；0.16mol)和无水吡啶(15mL)。
将温度已上升至环境温度的所得混合物搅拌24小时。
按以下顺序萃取混合物：用0.5％盐酸的水溶液300mL、5％碳酸氢钠的水溶液300mL，最后用300mL水。
用无水硫酸钠使分离出的有机相脱水，用纤维素滤器过滤并浓缩至干，得到粗产物(1)。
从500mL乙醇中结晶得到纯品。
得到30.4g产品(1)。
产率：73％
熔点＝80-81℃
H1NMR(CDCl3)：0.9(6H，t，CH3CH2-)；1.3(48H，m，(CH2)n＝24)；1.55(4H，m，-OCOCH2CH2-)；2.4(4H，t，-OCOCH2-)；4.7(4H，s，-OCCH2-).
b)制备1，2，3-三羟基丙烷-1，3-二棕榈酸酯(2)
将水(7.5mL)缓慢加到产品(1)(5g，9mmol)中，搅拌使之溶解在四氢呋喃(125mL)和甲苯(25mL)中。
将所得的白色乳状悬浮液的温度调至5℃(外部温度)，分次加入硼氢化钠(500mg；13mmol)。在5℃将悬浮液保持搅拌30分钟。
然后缓慢加入冰醋酸直至不再有剩余的硼氢化钠分解产生泡沫，最终得到一种溶液。
向溶液中加入氯仿(100mL)，形成两相系统。
分离底层含有CHCI3的有机相，按以下顺序萃取：用水(25mL)，碳酸氢钠(10％水溶液25mL)和水(25mL)。
用硫酸钠使含有(2)的有机相脱水，过滤并浓缩至干，得到一种蜡状产物。
用丙酮使蜡状产物结晶得到产品(2)。
得到4.8g产品(2)。
产率：94％。
熔点＝71-72℃
H1NMR(CDCl3)：0.9(6H，t，CH3CH2-)；1.3(48H，m，(CH2)n＝24)；1.55(4H，m，-OCOCH2CH2-)；2.4(4H，t，-OCOCH2-)；4.2(5H，m，-CHCH2O-).
c)制备1，3-二棕榈酰-2-溴乙酰基甘油(3)
在0℃和搅拌的条件下将产品(2)(2.5g；4.4mmol)溶解在无水氯仿(50mL)中(外部温度)。
向得到的溶液中缓慢加入吡啶(0.42ml)并滴加3ml含有溴代乙酰氯(0.43mL；5.2mmol)的氯仿溶液。
将反应混合物在0℃保持30分钟(外部温度)，并在环境温度下保持30分钟。
然后按以下顺序处理反应混合物：盐酸的1％水溶液(约50mL)，碳酸氢钠的5％水溶液(约50mL)和水。
用丙酮结晶纯化产物(3)，然后使反应混合物脱水(用硫酸钠)并浓缩至干。
得到2.5g产品。
产率：89％。
熔点＝46-47℃
H1NMR(CDCl3)：0.9(6H，t，CH3CH2-)；1.3(48H，m，(CH2)n＝24)；1.55(4H，m，-OCOCH2CH2-)；2.4(4H，t，-OCOCH2-)；3.9(2H，s，-OCH2COO-)4.2-4.4(5H，m，-CHCH2O-)；5.25(1H，m，CHCH2O-).。
d)
制备L-丙酰基肉碱溴化物与2-羟乙酰-1，3-二棕榈酰甘油的酯 (4)
将预先在40℃真空干燥的L-丙酰基肉碱内盐(0.95g，4.4mmol)悬浮在无水二甲基甲酰胺中(约20mL)。
将产物(3)(3g，4.7mmol)分次小部分加入悬浮液中。将悬浮液缓慢加热到38℃并保持此条件直至得到一种溶液。
10分钟后，使溶液达到0℃，保持30分钟。得到一种沉淀，过滤，用乙酸乙酯洗涤并溶解在氯仿(100mL)中。将所得乳状溶液(30mL)通过硅藻土过滤并浓缩。向后一溶液中加入己烷(100mL)，将得到的产品(4)的沉淀物过滤并在35℃真空干燥。
得到3.19g标题化合物。
产率：80％。
熔点＝127-128℃
[α]25 D＝-3.9(C＝1％氯仿)
C47H88BrNO10的元素分析
| C％ | H％ | N％ | Br％ | |
| 计算值 | 62.23 | 9.78 | 1.54 | 8.81 |
| 实测值 | 62.73 | 10.15 | 0.79 | 8.77 |
H1 NMR(CDCl3)：0.9-0.95(6H，t，CH3CH2CH2-)；1.1-1.2(3H，t，CH3CH2CO)；1.2-1.4(24H，m，CH2n＝24)；1.5-1.6(4H，m，-OCCH2CH2-)；2.3-2.4(4H，t，-OCCH2CH2-)；2.4-2.45(4H，d.d.，-CHCH2O-)；2.95(2H，d，-CH2COOCH2COO-)；3.5(9H，s，N(CH3)3)；4.2(4H，m，-CH2OCOCH2-)；4.35(2H，m，-CH2N-)；4，65(2H，d，d，-OCH2CO-)；5.25(1H，m，-OCH2CHCH2O-)；5.75(1H，m，-CHCH2N-).
例2-7
按与上述实施例相同的方法制备下述化合物：
-L-肉碱溴化物与2-羟基乙酰基-1，3-二棕榈酰基甘油的酯(ST770)；
-乙酰基L-肉碱溴化物与2-羟基乙酰基-1，3-二棕榈酰基甘油的酯(ST 771)；
-异丁酰基L-肉碱溴化物与2-羟基乙酰基-1，3二棕榈酰基甘油的酯(ST 773)；
-异戊酰基L-肉碱溴化物与2-羟基乙酰基-1，3-二棕榈酰基甘油的酯(ST 774)；
-L-肉碱溴化物与1，3-二己酰基-2-羟基乙酰基甘油的酯(ST810)；
-乙酰基L-肉碱溴化物与1，3-二己酰基-2-羟基乙酰基甘油的酯(ST 809)；
-丙酰基L-肉碱溴化物与1，3-二己酰基-2-羟基乙酰基甘油的酯(ST 808)；
此处记载的本发明的一个优选的实施方案包括制备有抗癌药物的脂质体，尤其是作为喜树碱的载体的脂质体，如WO 97/31003记载的。在一个进一步优选的实施方案中，本发明提供了具有通式(IV)的传递喜树碱的脂质体：
其中：R7是-C(R11)＝N-O(n)R10基团，其中R10是氢，或是直链或分支的C1-C5烷基或C1-C5烯基基团，或一个C3-C10环烷基基团，或一个直链或分支的(C3-C10)环烷基(C1-C5)烷基基团，或一个C6-C14芳基，或一个直链或分支的(C6-C14)芳基-C1-C5)烷基基团，或杂环或直链或分支的杂环-(C1-C5)烷基基团，所述的杂环基团含有至少一个选自氮原子和/或氧和/或硫的杂原子，氮原子可选地被(C1-C5)烷基基团取代；所述的烷基、烯基、环烷基、芳基、芳基-烷基、杂环或杂环-烷基基团可选地被其它基团取代，这些基团选自：卤素、羟基、C1-C5烷基、C1-C5烷氧基、苯基、氰基、硝基、-NR12R13，其中R12和R13可以相同或不同，它们可以是氢、直链或分支的(C1-C5)烷基、-COOH基团或其药学上可接受的一种酯；或-CONR14R15基团，其中R14和R15，可以相同或不同，是氢、直链或分支的(C1-C5)烷基；或
R10是C6-C10芳酰基，可选地被一或多个下述基团取代：卤素，羟基，直链或分支的C1-C5烷基，直链或分支的C1-C5烷氧基，苯基，氰基，硝基，-NR16R17，其中R16和R17，可以相同或不同，是氢，直链或分支的C1-C5烷基；
R10是聚氨基烷基残基；或
R10是葡萄糖残基；
n是0或1；
R11是氢，直链或分支的C1-C5烷基，直链或分支的C1-C5烯基，C3-C10环烷基，直链或分支的(C3-C10)环烷基-(C1-C5)烷基，C6-C14芳基，直链或分支的(C6-C14)芳基-(C1-C5)烷基；
R8和R9，可以相同或不同，是氢、羟基、直链或分支的C1-C5烷氧基；
它们的N1-氧化物，单一异构体，特别是-C(R11)＝N-O(n)R10基团的顺反异构体，其可能的旋光对映体，非对映异构体和相关的混合物，它们的药学可接受的盐及其活性代谢物。
1999年3月9日申请的欧洲专利申请99830124.6记载了式(IV)化合物。
至于式(IV)化合物，其中n是1，R10的定义如上，芳酰基除外，可以从喜树碱7-醛(式IVa，R11氢)或喜树碱7-酮(式IVa，R11不是氢)制备这些化合物。
其中R7是-C(R11)＝O基团，R11的定义如式(IV)，R8和R9的定义如式(IV)。式(IVa)化合物与式(Va)化合物R10O-NH2反应，其中R10如上所述，产生式(I)化合物，其中R7是-C(R11)＝N-O-R10基团，R10的定义如式(IV)，芳酰基除外。
可以用本领域技术人员已知的常规方法进行此反应，此过程包括肟的正常生成。优选地，喜树碱7-醛或7-酮与羟胺的比例应在1∶3-3∶1的范围内。也可以使用相关的羟胺盐。在有碱存在的条件下进行此反应，如无机碱，例如碳酸钾，或一种有机碱，如三乙胺或或二氮杂双环壬烷，使用极性溶剂，优选甲醇或乙醇，在从室温至溶剂沸点温度范围内的温度进行反应，可选地有脱水剂存在，如钠或镁的硫酸盐，分子筛。如果需要，也可以在有催化剂如Lewis酸的条件下进行此反应。
或者，可以从喜树碱7-醛的肟(按Sawada等在《化学与药学通报》39，2574(1991)记载的方法得到)，或喜树碱7-酮的肟，或从相应的7-酰基喜树碱，通过与一个R10-X卤化物反应制备上述化合物，其中X优选碘，在极性溶剂如四氢呋喃或乙醇中，和在有碱如氢化钠或碳酸钾存在的条件下进行此反应。
至于式(IV)化合物，其中n是1，R10是芳酰基，定义如式(IV)中所述，可以从喜树碱7-肟制备这些化合物，在以上段落记载了其制备方法，用R10-COCl酰基氯化物，在极性溶剂中，在有碱存在的条件下，优选吡啶，或直接在吡啶中进行反应，方法如Cho等在《有机化学杂志》62，2230(1997)所记载。
至于式(IV)化合物，其中n是0，并且R10的定义如上，芳酰基除外，可以从喜树碱7-醛(式IVa，R11氢)或喜树碱7-酮(式IVa，R11不是氢)制备此化合物。
其中R7是-C(R11)＝O基团，R11如式(IV)的定义，R8和R9的定义如式(IV)中所定义。式(IVa)化合物与式(Vb)化合物R10-NH2反应，其中R10的定义如上，产生式(IV)化合物，其中R7是-C(R11)＝N-R10基团，R10的定义如式(IV)中所定义，芳酰基除外。可以用药学领域技术人员已知的常规方法进行此反应，此过程包括正常形成亚胺。优选地，喜树碱7-醛或7-酮与亚胺的摩尔比应在1∶3-3∶1的范围。也可以使用相关的胺盐。在有碱存在的条件下进行此反应，如一种无机碱，例如碳酸钾，或一种有机碱，如三乙胺或二氮杂双环壬烷，使用极性溶剂，优选甲醇或乙醇，在从室温至溶剂沸点温度范围内的温度进行反应，可选地有脱水剂存在，如钠或镁的硫酸盐，分子筛。如果需要，也可以在有催化剂如Lewis酸的条件下进行此反应，如Moretti和Torre在《合成》，1970，141，或Kobayashi等在《Synlett》1977，115记载的。
欧洲专利申请EP 0056692和上述Sawada等在《化学与药学通报》39，2574(1991)发表的文章记载了喜树碱7-醛和喜树碱7-肟。
按已知的异芳香氮氧化法制备式(IV)化合物的N1氧化物，优选用醋酸或三氟醋酸和过氧化氢进行氧化，或通过与有机过氧化酸反应而进行(A.A1bini和S.Pietra，《杂环N-氧化物》，CRC，1991).
关于R10的不同的意义，在不同的式V试剂中有所不同，这些试剂可以由市售得到，或可以按文献记载的方法制备，本领域的专家可以借助这些文献，补充他们所拥有的此领域的知识。
用文献记载的常规方法可以得到药学上可接受的盐，这不需要进一步的描述。
例8
7-苄氧基亚氨甲基喜树碱(CPT 172)
500mg(1.33mmol)7-甲酰基喜树碱溶解在100ml乙醇中。加入15ml吡啶和638mg(4mmol)O-苄基羟胺盐酸盐。将溶液回流5小时。真空蒸发溶剂，在硅胶上用快速色谱法(flashchromatography)纯化得到的残余物，洗脱剂为己烷与乙酸乙酯4∶6的混合物。
产率：65％
熔点：200-205℃。
得到的产品含有顺式和反式异构体比例为8∶2的混合物(异构体A：Rf 0.32；异构体B，Rf 0.19，使用Merck 60 F254硅胶；洗脱剂：己烷∶乙酸乙酯为3∶7)。
HPLC：用安装四元泵(quaternary pump)的仪器进行此分析(HP1050)，使用Rheodyne注射器(20μl回路)和二极管阵列检测器(HP 1050)，使用HPLC-Chem Station程序进行驱动。在200-600nm范围内得到光谱，并在360和400nm记录色谱。
使用有RP18预柱的C18反向色谱柱(Rainin C18；25×0.4cm，Varian)。线性洗脱梯度进行分析，从乙腈∶水＝30∶70开始在20分钟内达到乙腈100％，流速为1ml/分钟。保留时间为：异构体B 12.51分钟，异构体A为14.48分钟。
1H-NMR(300MHz；DMSO-d6)：δ：0.88(t，H3-18A+H3-18B)，1.878m，(H2-19A+H2-19B)，5.18(s，H2-5B)，5.21(8s，H2-Ph B)，5.30(H2-Ph A)，5.40(s，H2-5A)，5.45(s，H2-17A+H2-17B)，6.53(s，-OH A+-OH B)，7.3-7.6(m，Ar A+ Ar B+H-14A+H-14B)，7.75(m，H-11A+H-11B)，7.85-7-95(m，H-10A+H-10B)，7.98(dd，H-12B)，8.18-8.27(m，H-12A+H9-B)，8.45(s，CH＝N B)，8.59(dd，H-9A)，9.38(s，CH＝N A).Mass m/z 481(M+100)374(30)330(70)300(30)273(20)243(20)91(34).
例9
7-丁氧基亚氨基甲基喜树碱(CPT 184)
将400mg(1.06mmol)7-甲酰基喜树碱溶解在80ml乙醇中。加入12ml砒啶和400mg(3.18mmol)0-t-丁基羟胺盐酸盐。溶液回流4小时。真空蒸发溶剂，在硅胶上用快速色谱法(flashchromatography)纯化得到的残余物，洗脱剂为己烷与乙酸乙酯4∶6的混合物。
得到322mg(0.72mmol)黄色固体。
产率：68％
熔点：250℃。
得到的产品含有顺式和反式异构体比例为约8∶2的混合物(异构体A：Rf 0.31；异构体B，Rf 0.24，Merck 60 F254硅胶；洗脱剂：己烷∶乙酸乙酯为3∶7)。
HPLC：用安装四元泵的仪器进行此分析(HP 1050)，使用Rheodyne注射器(20μl回路)和二极管阵列检测器(HP 1050)，使用HPLC-Chem Station程序进行驱动。在200-600nm范围内得到光谱，并在360和400nm记录色谱。
使用有RP18预柱的C18反向色谱柱(Rainin C18；25×0.4cm，Varian)。线性洗脱梯度进行分析，从乙腈∶水＝30∶70开始在20分钟内达到乙腈100％，流速为1ml/分钟。保留时间为：异构体B 12.92分钟，异构体A为14.61分钟。
1H-NMR(300MHz；DMSO-d6)：δ：0.88(t，H3-18A+H3-18B)，1.30(s，t-but.B)，1.47(s，t-but.A)，1.87(m，H2-19A+H2-19B)，5.18(s，H2-5B)，5.37(H2-5A)，5.42(s，H2-17A+H2-17B)，6.54(s，-OH A+-OH B)，7.35(s H-14A)，7.36(s，H-14B)7.69-7.83(m，H-11A+H-11B)，7.85-7.98(m，H-10A+H-10B)，8.07(dd，H-9B)，8.16-8.27(m，H-9A+H-12B)8.40(s，CH B)，8.62(dd，H-12A)，9.31(s，CH A).Mass m/z 448(M+28)391(40)374(100)362(40)330(34)57(17).
制备脂质体
本发明的化合物可以用来制备多层脂质体(MLV)和单层脂质体(SUV)，可以是干粉状或水溶液中的悬浮物。
用本发明的化合物，如例1-7所制备的，按以下方法制备脂质体。将适宜量的化合物溶解在氯仿中；在旋转蒸发器中将溶液真空浓缩至干，直至得到一层脂质膜。在高真空度下干燥脂质膜直至除去最后的残余溶剂，然后将脂质膜溶解在叔丁醇或水中。将溶液冷冻干燥，得到一种柔软的干燥粉末。
用适宜量的水溶液将粉末水化，得到所用化合物的脂质体，然后与多核苷酸或所需的药物复合。
另一种制备脂质体的方法包括将一个脂质膜吸附在一个适宜的惰性载体如山梨醇、甘露醇或其他药学可接受的碳水化物上，此脂质膜中包含一种溶解在溶剂中的本发明的化合物。将此混合物真空干燥，得到一种固体，在使用之前它可以方便而快速地水化。
干燥粉末形式的制剂呈现长期稳定性方面的改善，并且易于使用。
另外，可以按以下步骤用本发明的化合物制备干粉状的与DNA或所需药物复合的脂质体。将本发明的化合物溶解在叔丁醇或水中；将得到的溶液与DNA或所需药物混合，将混合物冷冻干燥，得到一种柔软的干燥粉末状的复合物，我们将其定义为前脂质体-DNA或前脂质体-药物。
可以用得到的粉末(前脂质体)制备通过气雾剂形式给药的药物组合物，或当其与水或适宜的缓冲溶液重组时，可以经胃肠外或口服给药。
也可以用上述方法通过将脂质膜吸附在惰性载体如山梨醇、甘露醇或其他碳水化物上，得到固体形式的与DNA或药物复合的脂质体。
测试脂质体的形成
按以下步骤，使用水溶性染料，用比色法测定脂质体的形成。得到一种水溶性染料偶氮胂III的水溶液(m.w.＝776.37；2.3mg/mL)。
用此溶液替代水以水化用上述方法得到的脂质膜。
用水将一份含有包裹染料的脂质体的悬浮液稀释100倍。
使用2mL此脂质体悬浮液在660nm得到第一光学密度读数；与定义为空白的相同的样品进行比较得到读数。将200μl CaCl2溶液(15mg/mL；100mM)加入第一样品中，在660nm以空白为背景测定光密度，向其中加入200μl水。将所得的吸收值作为读数2。向样品中加入100μl三硝基甲苯X-100(5％v/v；0.26％终浓度)溶液，向空白中加入200μl水；在660nm得到的对应于光密度值的读数定义为读数3。用以下公式计算被包裹的染料的百分数：
被包裹染料的百分数提供了一个脂质体形成的测定尺度，其平均值为40％；用激光散射法检测脂质体的体积，得到阳性结果。
制备脂质体的实施例
制备以下形式的棕榈酰基L-肉碱氯化物十一烷基酯(ST 983)
a)冷冻干燥粉末
在100mL烧瓶中将65mg，0.11mmol棕榈酰基L-肉碱氯化物十一烷基酯溶解在20mL氯仿中。
蒸发溶液直至得到脂质膜，将其真空干燥3小时。将得到的产物溶解在叔丁醇中，用液氮将此溶液快速冷却至-70℃并冷冻干燥24小时。得到海绵状柔软白色固体。
b)吸附的粉末
将143mg，0.231mmol棕榈酰基L-肉碱氯化物十一烷基酯溶解在10mL氯仿中。将得到的溶液以小部分分次倒入含有750mg山梨醇的100mL烧瓶中。加完各部分氯仿溶液后，快速蒸发氯仿。
将得到的固体真空干燥3小时。
得到893mg白色固体产物。
使用前，用适当体积的水将产物快速水化得到一等渗的溶液。
c)MLV悬浮液
在一100ML烧瓶中，将65mg，0.11mmol棕榈酰基L-肉碱氯化物十一烷基酯溶解在20mL氯仿中。
将得到的溶液蒸发直至得到脂质膜，将其真空干燥3小时。
在30℃用10mL水将脂质膜水化3小时，得到MLV悬浮液。
将MLV悬浮液适当稀释，与多核苷酸或药物复合，进行生物测定。
e)SUV悬浮液
在100mL烧瓶中，将65mg，0.11mmol棕榈酰基L-肉碱氯化物十一烷基酯溶解在20mL氯仿中。
将得到的溶液蒸发直至得到一脂质膜，将其真空干燥3小时。
在30℃，用10mL水将得到的脂质膜水化3小时，得到MLV悬浮液。
用孔径为200nm的聚碳酸酯滤器将MLV悬浮液过滤10次。将如此得到的单层脂质体悬浮液与多核苷酸或药物复合并进行生物测定。
f)测定脂质体的物理稳定性
用周期为30天的比浊法测定脂质体悬浮液的物理稳定性。
每间隔一定时间，在600nm测定每个将被测试的悬浮液的吸收度。被测制剂在0时测得的平均吸收值保持不变。
在考察期间内被考察的分子呈现一致的值。
可以通过将本发明的化合物与助性脂质如胆固醇、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰基胆碱(POPC)或二油基磷脂酰基胆碱(DOPE)结合制备MLV和SUV脂质体悬浮液。
化合物与助性脂质结合以得到具有更稳定膜的脂质体。以下在记载脂质体制备的部分，给出了一个制备例，其中本发明的化合物与助性脂质如胆固醇或POPC结合。
制备传递药物的脂质体的实施例
例10
制备紫杉醇-ST 983 MLV脂质体(1∶40)
将20mg，0.0234mmol紫杉醇和556mg，0.9417mmol ST 983溶解在20mL氯仿中。
浓缩溶液直至在烧瓶表面得到一个脂质膜。
用真空泵消除最后残留的氯仿，将20mL叔丁醇加入脂质膜中，将得到的溶液分成19份，立即用液氮将其在-70℃冷冻24小时。每份固体含有紫杉醇(1.05mg)和ST 983(29.2mg)。
为得到最终的脂质体悬浮液，在使用时将冷冻干燥产物用水(450μL)或其他盐溶液水合，搅拌10分钟，静置30分钟以完成膨胀(水合)过程。
得到了MLV脂质体。
测定制剂的物理稳定性
用比浊法测定脂质体悬浮液的物理稳定性，使用在800nm测定的TDC(Time Drive Curve时间驱动曲线)记录，温度为20℃，测定时间为20小时。
记录了用于指示制剂稳定性的恒定浊度趋向，它未显示沉淀现象。
测定制剂中紫杉醇的化学稳定性
用HPLC法测定紫杉醇的化学稳定性。
色谱条件如下：
色谱柱：μBondapack C-18
洗脱剂：乙腈∶水70∶30
检测器UV-VIS：227nm
流速：1mL/分钟
保留时间：4.5分钟
针对标准品，测得的紫杉醇的浓度为2.13mg/mL。
被包裹的紫杉醇的浓度为98％。
例11
制备紫杉醇-ST 983 SUV脂质体
将20mg，0.0234mmol紫杉醇和556mg，0.9417mmol ST 983溶解在20mL氯仿中。
浓缩溶液直至在烧瓶表面得到一个脂质膜。
用真空泵消除最后残留的氯仿，将20mL叔丁醇加入脂质膜中，将得到的溶液分成19份，立即用液氮将其在-70℃冷冻24小时。每份固体含有紫杉醇(1.05mg)和ST 983(29.2mg)。
为得到最终的SUV脂质体悬浮液，在0℃将已用PBS溶液(1mL)水合的冷冻干燥产物声处理20分钟。
在400nm滤器上过滤，除去声处理仪的探针释放的痕量的钛。
测定制剂的物理稳定性。
用比浊法测定脂质体悬浮液的物理稳定性，使用在800nm测定的TDC(Time Drive Curve时间驱动曲线)记录，温度为20℃，测定时间为20小时。
记录了用于指示制剂稳定性的恒定浊度趋向，它未显示沉淀现象。
测定制剂中紫杉醇的化学稳定性
用HPLC法测定紫杉醇的化学稳定性。
色谱条件如下：
色谱柱：μBondapack C-18
Eluent：乙腈∶水70∶30
检测器UV-VIS：227nm
流速：1mL/分钟
保留时间：4.5分钟
对SUV脂质体悬浮液的HPLC分析产生与在同样条件下相应的MLV脂质体悬浮液相同的结果，被包裹的紫杉醇的百分率为98％.
24小时后重复进行HPLC分析，除紫杉醇峰外，没有新峰出现，显示了活性成分的稳定性。
例12
制备紫杉醇-ST 983-胆固醇脂质体(1∶15)
制备这些类型的脂质体以得到具有稳定膜的复合物。
将6mg，0.0101mmol紫杉醇，62.2mg，0.105mmol ST 983和40mg胆固醇溶解在10mL氯仿中。
浓缩所得溶液直至在烧瓶表面得到一个脂质膜。
用高效真空泵消除最后残留的氯仿后，将6.3mL叔丁醇加入脂质膜中，将得到的溶液分成5份，立即用液氮将其在-70℃冷冻24小时。每份固体含有紫杉醇(1.2mg)和ST 983(12.44mg)和胆固醇(8mg)。
为得到最终的脂质体悬浮液，在使用时将冷冻干燥产物用水(1000μL)或其他盐溶液水合，搅拌10分钟并静置30分钟以完成膨胀(水合)过程。
得到MLV脂质体。
测定制剂的物理稳定性
用比浊法测定脂质体悬浮液的物理稳定性，使用在800nm测定的TDC(Time Drive Curve时间驱动曲线)记录，温度为20℃，测定时间为6小时。
记录了用于指示制剂稳定性的恒定浊度趋向，它未显示沉淀现象。
例13
制备紫杉醇-ST 772 SUV脂质体(1∶70)
将20mg，0.0234mmol紫杉醇和1485mg，1.638mmol ST 772溶解在20mL氯仿中。
浓缩溶液直至在烧瓶表面得到一个脂质膜。
用高效真空泵消除最后残留的氯仿后，将20mL叔丁醇加入脂质膜中。为得到澄清的溶液，必须将其加热到60℃。立即用液氮将其在-70℃冷冻，并冷冻干燥24小时。
为得到最终的SUV脂质体悬浮液，将已用PBS溶液(20mL)水合的冷冻干燥产物在0℃声处理20分钟。
在400nm滤器上过滤，除去声处理仪的探针释放的痕量的钛。测定制剂的物理稳定性。
用比浊法测定制剂的物理稳定性，使用在800nm测定的TDC(Time Drive Curve时间驱动曲线)记录，温度为20℃，测定时间为6小时。
记录了用于指示制剂稳定性的恒定浊度趋向，它未显示沉淀现象。
例14
制备CPT 83-ST 983 MLV脂质体(1∶40)
将6.3mg，0.0168mmol CPT 83(7-腈喜树碱，记载于WO97/31003)和400mg，0.667mmol ST 983溶解在20mL氯仿中。
浓缩溶液直至在烧瓶表面得到一个脂质膜。
用真空泵消除最后残留的氯仿后，将26mL叔丁醇加入脂质膜中，将得到的溶液细分成12份，立即用液氮将其在-70℃冷冻，并冷冻干燥24小时。每份固体含有CPT 83(0.525mg)和ST 983(33.33mg)。
为得到最终的脂质体悬浮液，在使用时将冷冻干燥产品用水(1000μL)或其它盐溶液水合，并搅拌10分钟。
得到MLV脂质体。
测定制剂的物理稳定性。
用比浊法测定制剂的物理稳定性，使用在800nm测定的TDC(Time Drive Curve时间驱动曲线)记录，温度为20℃，测定时间为20小时。
记录了用于指示制剂稳定性的恒定浊度趋向，它未显示沉淀现象。
测定制剂中CPT 83的化学稳定性
用HPLC法测定CPT 83的化学稳定性。
色谱条件如下：
色谱柱：Supelcosil LC-ABZ
洗脱剂：磷酸盐缓冲液20mM∶甲醇40∶60，pH＝7.3
检测器UV-VIS：360nm
流速：1mL/分钟
保留时间：4.033分钟
针对标准品测得的CPT 83浓度为0.502mg/mL。
被包裹的CPT 83百分率为99％。
例15
制备CPT 83-ST 983 SUV脂质体(1∶40)
将6.3mg，0.0168mmol CPT 83和400mg，0.667mmol ST 983溶解在20mL氯仿中。
浓缩溶液直至在烧瓶表面得到一个脂质膜。
用高效真空泵消除最后残留的氯仿后，将26mL叔丁醇加入脂质膜中，将得到的溶液细分成12份，立即用液氮将其在-70冷冻，并冷冻干燥24小时。每份固体含有CPT 83(0.525mg)和ST 983(33.33mg)。
为得到最终的SUV脂质体悬浮液，将冷冻干燥产品用水(1000μL)水合，并在0℃声处理40分钟。
在400nm滤器上过滤，除去声处理仪的探针释放的痕量的钛。测定制剂中CPT 83的化学稳定性
用HPLC法测定CPT 83的化学稳定性。
色谱条件如下：
色谱柱：Supelcosil LC-ABZ
洗脱剂：磷酸盐缓冲液20mM∶甲醇40∶60，pH＝7.3
检测器UV-VIS：360nm
流速：1mL/分钟
保留时间：4.033分钟
针对标准品测得的CPT 83浓度为0.3mg/mL。
被包裹的CPT 83的百分率为59％。
在24小时后重复进行HPLC分析，除CPT 83峰外未显示新的峰，表明了化合物的稳定性。
测定制剂的物理稳定性
用比浊法测定制剂的物理稳定性，使用在600nm测定的TDC(Time Drive Curve时间驱动曲线)记录，温度为20℃，测定时间为20小时。
记录了用于指示制剂稳定性的恒定浊度趋向，它未显示沉淀现象。
例16
制备CPT 184-ST 983 MLV脂质体(1∶40)
将7.29mg，0.0168mmol CPT 184和400mg，0.677mmol ST 983溶解在20mL氯仿中。
浓缩溶液直至在烧瓶表面得到一个脂质膜。
用真空泵消除最后残留的氯仿后，将26mL叔丁醇加入脂质膜中，将得到的溶液细分成12份，立即用液氮将其在-70℃冷冻，并冷冻干燥24小时。每份固体含有CPT 184(0.607mg)和ST 983(33.33mg)。
为得到最终的脂质体悬浮液，将冷冻干燥产品用水(1000μL)或其它盐溶液水合，并搅拌10分钟。
得到MLV脂质体。
测定制剂的物理稳定性
用比浊法测定制剂的物理稳定性，使用在600nm测定的TDC(Time Drive Curve时间驱动曲线)记录，温度为20℃，测定时间为20小时。
记录了用于指示制剂稳定性的恒定浊度趋向，它未显示沉淀现象。
测定制剂中CPT 184的化学稳定性
用HPLC法测定CPT 184的化学稳定性。
色谱条件如下：
色谱柱：Supelcosil LC-ABZ
洗脱剂：磷酸盐缓冲液20mM∶甲醇40∶60，pH＝7.3
检测器UV-VIS：360nm
流速：1mL/分钟
保留时间：25.5分钟
针对标准品，测得CPT 184浓度为0.600mg/mL。
包裹的CPT 184百分率为99％。
例17
制备CPT 184-ST 983 SUV脂质体(1∶40)
将7.29mg，0.0168mmol CPT 184和400mg，0.667mmol ST983溶解在20mL氯仿中。
浓缩溶液直至在烧瓶表面得到一个脂质膜。
用高效真空泵消除最后残留的氯仿后，将26mL叔丁醇加入脂质膜中，将得到的溶液细分成12份，立即用液氮将其在-70℃冷冻，并冷冻干燥24小时。每份固体含有CPT 184(0.607mg)和ST 983(33.33mg)。
为得到最终的SUV脂质体悬浮液，将冷冻干燥产品用水(1000μL)水合，并在0℃声处理40分钟。
在400nm滤器上过滤，除去声处理仪的探针释放的痕量的钛。
测定制剂中CPT 184的化学稳定性
用HPLC法测定CPT 184的化学稳定性。
色谱条件如下：
色谱柱：Supelcosil LC-ABZ
洗脱剂：磷酸盐缓冲液20mM∶甲醇40∶60，pH＝7.3
检测器UV-VIS：360nm
流速：1mL/分钟
保留时间：25.5分钟
针对标准品测得的CPT184浓度为0.36mg/mL。
被包裹的CPT 184的百分率为70％。
在24小时后重复进行HPLC分析，除CPT 184峰外未显示新的峰，表明了活性成分的稳定性。
测定制剂的物理稳定性
用比浊法测定制剂的物理稳定性，使用在600nm测定的TDC(Time Drive Curve时间驱动曲线)记录，温度为20℃，测定时间为20小时。
记录了用于指示制剂稳定性的恒定浊度趋向，它未显示沉淀现象。
在以下实施例中，使用助性脂质和/或低温防护剂制备脂质体。
例18
制备CPT 184-ST 983脂质体
在2L烧瓶中，向20mg CPT 184和600mg ST 983中加入100ml甲基氯仿，并稍加热直至完全溶解。在旋转蒸发器中浓缩得到的溶液直至在烧瓶表面得到一个脂质膜，并在高效真空泵中干燥2小时。用乳糖溶液(6g/300ml水)在45℃将脂质膜水合，在一个旋转蒸发器中搅拌2小时。然后将悬浮液声处理2小时，每个周期持续半小时。随后将产品通过200nm滤器过滤并冷冻干燥。
测定制剂中CPT 184的化学稳定性
用HPLC法确定CPT 184的化学稳定性。
产品在实验的24小时内稳定。
测定制剂的物理稳定性
用比浊法测定制剂的物理稳定性。在24小时的测定过程中，产品稳定。颗粒体积也是稳定的(平均值为100nm)。
例19
制备CPT 184-ST 983脂质体
按以下步骤制备1ml脂质体(POPC-1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰基胆碱5mM；ST 983 1.25mM；CPT 1840.25和海藻糖150mM)：
0.11mg，0.25μmol CPT 184溶解在250μL乙酸乙酯中，3.79mg，4.89μmol POPC溶解在100μL乙醇中，0.74mg，1.25μmol ST983溶解在100μL乙醇中。将此三溶液混合在一起并旋转蒸发。在室温及80mbar的条件下用旋转蒸发仪将溶剂蒸发除去。在暗处将脂质膜干燥2小时。将脂质膜悬浮在1ml的150mM D(+)海藻糖二水合物溶液中(Fluka，HPLC99％)，通过0.22nm滤器灭菌，并旋转2分钟。使悬浮液通过200nm聚碳酸酯滤器21次。将过滤后的脂质体悬浮液在液氮中冷冻，并冷冻干燥2夜。得到白色固体。
例20
制备CPT 184-ST 983脂质体
使用例19的方法，不同的是使用500mM海藻糖。
ST 983脂质体-抗癌剂复合物的抗癌活性
如下所述，ST 983脂质体主要蓄积在肺部。此部位特异性使其在鼠科模型肺癌发生方面的应用具有优势。
此例中使用的抗癌剂是紫杉醇。
为诱发体内肿瘤，未麻醉的Balb/c小鼠在右后爪的股四头肌处接受注射0.1ml RPMI-1640(Sigma)，其中有3×105细胞的鼠肺癌M109。
植入肿瘤10天后，用磷酸盐-缓冲盐溶液(PBS，SIGMA，P-4417)稀释脂质体-紫杉醇复合物并以2.5mg/mL ST 983和75μg/mL紫杉醇的浓度静脉注射。
紫杉醇(paclitaxel INDENA)作为空白，20mg/mL的浓度溶解在cremophor载体EL(BASF)中并在+4℃避光储存另外24小时。使用时，用磷酸盐-缓冲盐溶液(PBS，SIGMA)稀释并用和ST 983脂质体输送的紫杉醇相同的体积和浓度静脉注射。
按1∶1的比例用乙醇稀释制备cremophor。
从接种肿瘤后的第10天开始连续给药7天。持续观察动物直至接种后第17天，并脱颈椎处死动物，取出肺测定转移瘤的数目。在5ml Bouin’s溶液中将肺培养10天进行染色，以测定转移瘤的数目，Bouin’s溶液中含有71％苦味酸饱和溶液、4.8％冰醋酸(Merck)，和24％的10％甲醛(Fluka)。
在Bouin’s溶液中培养结束时，对转移瘤计数。
与未经处理的对照小鼠比较，由cremophor输送的紫杉醇未显示降低肺转移瘤数目的效果，虽然后者小于未经处理的对照鼠，然而与ST 983脂质体复合的紫杉醇显示出降低肺转移瘤数目和体积的显著效果。
用针对未配对数据的Mann-Whitney无参数试验法对肺移植瘤数目进行数据统计学分析。
所得结果示于以下表1。
表1
在BALB/c小鼠体内接种肿瘤M109和用紫杉醇及紫杉醇/脂质体ST983处理后第17天的肺转移瘤
分组 转移瘤 转移瘤
平均值±s.d 体积
对照 21±12 M
紫杉醇 22±9 S
紫杉醇-ST983 10±2 S
M＝平均值(1-2mm直径)
S＝小(＜1mm直径)
体外细胞毒性试验
在96孔平板上测定对HeLa和M109细胞的毒性。铺平板后，用所测定的分子对细胞再处理48小时。然后用PBS洗涤细胞，并将其置于正常的生长条件下48小时。除去生长介质后，在冰上用16％TCA培养细胞，在水中洗涤3次，用硫氰酸胺(sulforhodamine)B(SRB)在1％醋酸中的溶液处理细胞30分钟，在单纯的1％醋酸中洗涤细胞3次，在pH 10.5的TRIS 10mM中培养20分钟，最后在540nm读取读数。
测定CPT 83的细胞毒性
进行CPT 83细胞毒性的体外测定以评价与脂质体复合的抗癌剂的细胞毒性，作为对有效活性的初步预测。
使用上述硫氰酸胺B试验评价在体外在M109细胞中脂质体输送CPT 83的能力。
另外，也评价了溶解在二甲亚砜(DMSO)中的CPT 83的细胞毒性，以与和ST 983脂质体复合的相同分子的毒性进行比较。
在细胞毒性测定中使用脂质体-CPT 83复合物，其浓度示于以下表2.1，2.2和3.3，它是SUV和MLV构型。所用的摩尔比为脂质体∶CPT 83＝40∶1。
SUV和MLV构型的ST 983-CPT 83复合物的细胞毒性平均值示于表2.1，2.2和2.3，它提示ST 983脂质体能以非常近似于DMSO的方式输送CPT 83，并显示同样数量等级的细胞毒性。
表2.1
ST 983 SUV-CPT 83的细胞毒性(SRB)
浓度单位为μM
| ctr | 1.3 | 0.13 | 0.013 | 00013 | |
| 平均s.d. | 0.9110.7450.8840.8330.8540.7930.7920.9010.8391250.060645 | 0.2940.1980.2040.250.2540.2310.1930.2480.3524440.034513 | 0.7050.5250.8010.7480.7780.7390.6020.690.6353330.092925 | 0.9080.8210.9060.8560.8670.8020.8270.9040.7671110.042054 | 0.9110.830.910.8530.8730.8030.8290.890.76670.040149 |
表中的值指在540nm的光密度读数。
表2.2
ST 983MLV-CPT 83的细胞毒性(SRB)
浓度单位为μM
| Ctr | 1.3 | 0.13 | 0.013 | 0.0013 | |
| 平均s.d. | 0.8950.820.8960.8470.8630.7940.8290.8930.8546250.038682 | 0.0380.0380.0410.0410.0410.0430.0390.0410.040250.001753 | 0.040.0460.0490.0420.0530.0410.0440.0440.0448750.004357 | 0.0950.1090.1280.1050.1110.0730.080.0640.0956250.021738 | 0.0880.1240.1270.1150.1070.0950.0850.0650.100750.021359 |
表中的值指在540nm的光密度读数。
表2.3
DMSO-CPT 83的细胞毒性(SRB)
浓度单位为μM
| ctr | 13 | 1.3 | 0.13 | 0.013 | 0.0013 | |
| 平均s.d. | 0.8980.7740.8570.7870.8080.7450.7750.8640.81350.053519 | 0.2810.2670.30.2860.2850.2880.3120.3180.2921250.016848 | 0.330.3020.2850.2870.3180.3170.3280.3050.3090.017205 | 0.4060.4070.570.3830.4740.4670.4290.4210.4446250.059269 | 0.80.8040.8630.8360.8510.790.8060.810.820.026506 | 0.8090.8160.8860.8410.8630.7950.8310.8780.8398750.033237 |
表中的值指在540nm的光密度读数。
ST 983脂质体-CPT 184复合物的生物活性
测定例18脂质体(以下命名为脂质体A)和例20脂质体(以下命名为脂质体B)的生物活性。
对健康小鼠的毒性
按q4d×4(每日4次，给药4天)的方案，以1.2mg/kg的剂量口服、静脉注射脂质体A和B，与游离的CPT 184相比较。两种脂质体对体重、肺、脾和肾没有显著影响。静脉注射脂质体B，口服脂质体A，与游离的CPT 184相似，对胸腺产生影响。静脉注射脂质体A仅有小的影响。24小时后两种脂质体未使血液学参数显示显著的变化。，按qd5的方案静脉注射脂质A显示与游离的CPT 184相似的毒性。
脂质体的肺向性
脂质体A和B显示主要在肺水平聚集。静脉注射1.2mg/kg剂量的脂质体。将溶解在DMSO中的游离CPT184以1.2mg/kg的剂量口服给药。在最后一次给药后24小时处死动物，即健康小鼠。从动物体取出肺在液氮中冷冻。当融化后，将组织汇集并在0.1％醋酸/乙腈溶液中1∶5均质化。将匀浆分成3份，2份加入CPT 184测定回收率。在16,000g将3份样品离心5分钟。
收集上清液并用二氯甲烷提取。用speedvac将有机相干燥，残余物再次溶解在乙腈中以在50μL中含有相当于一只动物的量，在HPLC上加样。在Waters Symmetry C18 3.5μm(4.6×7.5mm)上进行HPLC。使用在370nm激发和510nm发射的Merck荧光计作为检测器。洗脱剂是水/乙腈60∶40，等度洗脱。样品体积为50μL。CPT 184的回收率约为70％。脂质体A和B的CPT 184聚集水平高于DMSO中游离的CPT 184，如图3所示。
基因传递
制备脂质体-DNA复合物
将脂质体和质粒DNA分别适当稀释在PBS中。然后将DNA加到脂质体中，将脂质体DNA复合物在约4℃保持约30min以促进形成稳定的脂质体-DNA相互作用体。
在体外试验中，使用1，2-二油酰基氧-3-三甲基-铵丙烷(DOTAP)作为参考的阳离子脂质；每2×105HeLa细胞使用2.5μg质粒DNA，脂质体浓度为9μM。
在体内试验中，使用DOTAP和[2，3(二油酰基)丙基]三甲基铵(DOTMA)作为参考的阳离子脂质。
结果中的摩尔比定义为每毫克NDA中各阳离子脂质的nmol浓度。
在体内转染试验中，每只动物使用25μg质粒DNA。
在这些试验中使用的质粒pCMVluc含有受巨细胞病毒(CMV)启动子转录控制的虫萤光素酶基因cDNA。
萤光素酶活性的定量测定
用Boehringer Mannheim kit(cat no.1669 893)方法测定细胞和组织内蛋白质萤光素酶活性。
在PBS中洗涤细胞3次，然后从平板中移出，在溶胞缓冲液(lysis buffer)(100mM磷酸钾pH 7.8.1mM二硫苏糖醇-DTT)中散布成一层，然后进行3次连续的冷冻融化循环。在1.5mLEppendorf试管中离心后，上清液在提取蛋白质后5小时内进行发光试验。用在562nm的发光计测定发射出的光。在液氮中首次冷冻后细细研磨得到粉末。将组织再次悬浮在溶胞缓冲液中，在冰中培养10-15分钟。
然后将样品在2ml Eppendorf试管中离心，测定上清液的荧光素酶活性。
斑点印迹分析
按Sanbrook，Fritsch和Maniatis在Molecular Cloning(分子克隆)1989记载的碱性溶胞过程提取细胞DNA。
使用Biorad斑点印迹装置将从细胞中提取得到的5μg DNA预吸附在尼龙滤器(Boehringer)上。在65℃将这些滤器与含有0.5M焦磷酸钠(NaPi)，1mM EDTA，7％SDS的溶液预杂交4小时。用质粒pCMVluc DNA作模板和随机接触过抗原的Amersham Kit制备32P(α)标记的探针。
使用1×106CPM/ml在42℃将滤器在同样的预杂交缓冲液中杂交12小时。然后在65℃，在含有40mM NaPi，1％SDS的缓冲液中将滤器洗涤3次，每次10分钟。借助磷光剂成像进行放射自显影分析，使用由β射线活化的磷光屏(phosphor screens)，借助与图像分析程序结合的光电倍增管系统读数和测量。使用IP-LabGel图像分析程序在斑点印迹上进行的光密度法。
质粒DNA转染试验
在体内和体外进行了一些质粒DNA转染试验。
使用DOTAP和DOTMA作为参考阳离子脂质，Abkenet等在《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)1993，90，6518充分表征和记载了其转染效率。在体内试验中，分析了阳离子脂质与质粒DNA各种不同的摩尔比，以测定各阳离子脂质的活性和各自对于基因转移最有效的浓度。用pCMVluc质粒中含有的荧光素酶基因转运体评价了各种脂质体体内和体外的转染能力，即以用于快速定量的相对发光单位(RLU)(以上已叙述)表述的其活性。
如上所述，作为一种选择，通过对从预吸收在硝酸纤维素滤器上(斑点印迹)的转染细胞中提取并与32P-标记的质粒DNA标记物杂交DNA样品进行光密度分析(磷光剂成像)，评价了一些阳离子脂质体的转染效率。
体内转染试验
体内转染效率对ST 983脂质体：DNA摩尔比的依赖性
在此试验中，评价了肝、肺和心的转染效率对ST 983脂质体：质粒DNA摩尔比的依赖性。对以下与每μg DNA对应的纳摩尔(nmol)脂质体的比例∶12∶1，24∶1，36∶1和48∶1进行了测定。
小鼠每组6只，体重约为20g，用分散在200μl PBS中的上述数量的脂质体-DNA复合物对其静脉注射，在并在给予复合物24小时后处死。
从肺、心和肝组织中提取的荧光素酶活性显示了在所测定的所有摩尔比的情况下，荧光素酶主要在肺分布。实际上，从三种组织中提取得到的荧光素酶约99％分布在肺中。已证明最优的脂质体：DNA摩尔比为12∶1。所得结果示于下表3。
表3
作为ST 983：DNA摩尔比(μg DNA)的函数的
ST 983体内转染效率
| 脂质体 | 平均RLU/mg蛋白质±s.d. | ST 983：DNA | ||
| 肝 | 肺 | 心脏 | 摩尔比 | |
| ST 983对照DOTMA | 2589±1401310±3851035±3471571±156396±551352±226 | 8818442±4495292257856±280480301107±21503112747±5655458±453828742±161332 | 28875±25937091±2498351±4775251±489755±553363±123 | 12∶124∶136∶148∶112∶1 |
体内转染效率对SRT 983脂质体制剂之间的差异的依赖性
将表示为相对发光单位(RLU)的荧光素酶活性值，报告于表4，所测试的虫荧光素酶是从接受静脉注射不同的ST 983脂质体制剂的Balb/c小鼠的肺提取得到的，脂质体制剂中脂质体∶DNA的摩尔比例为12∶1。
所得数据，除证明ST 983脂质体能够在体内转运质粒DNAI，其效率高于和/或类似于DOTMA外，也显示了在不同ST 983制剂之间的一定程度的变异性。这可能是由于一些物理化学特性如脂质体囊的体积、或与不同的ST 983制剂的单层(SUV)或多层结构相关的囊的有关性质造成的。实际上，R.I.Mahato等在《人类基因疗法》9.1998：2083已充分说明了以上列出的物理化学参数，它们是达到最佳体内和体外转染效率的决定因素。
表4
ST 983的体内转染效率
(不同的制剂)
| 脂质体 | 平均RLU/mg蛋白质±s.d. | ST 983∶DNA |
| ST 983/#72ST 983/#73ST 983/#4对照DOTMA | 肺3118235±1847267285835±8270671022117±604021523±983410125±189520 | 摩尔比12∶112∶112∶112∶1 |
体内转染效率对ST 983-DNA脂质体复合物预培养时间的依赖性
表5列出了从接受静脉注射ST983脂质体的小鼠的肝、肺、心提取得到的相对发光单位，此脂质体在给药前与质粒DNA预培养30分钟或3小时。用与DNA预培养3小时的ST 983处理的动物与用预培养30分钟的相同脂质体处理的动物相比，在肺和心的荧光素酶活性方面显示增长到5倍。
此结果提示稳定的脂质体-DNA复合物的形成具有时间依赖性，并且在测定体内转染效率方面具有关键的作用。
表5
ST 983的体内转染效率作为脂质体/DNA预培养时间的函数
| 脂质体 | 时间 | 平均RLU/mg蛋白质±s.d. | T 983∶DNA | ||
| 肝 | 肺 | 心 | 摩尔比 | ||
| ST983ST 983 | 30分钟3h | 3526±2602497±682 | 874882±659174225656±211731 | 8118±26337100±1853 | 12∶112∶1 |
ST 772脂质体在HeLa细胞内的质粒DNA转染
图1和2显示ST 772脂质体在HeLa细胞中的质粒DNA转染效率。为此目的，从ST 272转染的细胞中提取DNA进行了光密度分析，用DOTAP作为对照阳离子脂质。斑点分析的结果显示质粒DNA的数量与由DOTAP得到的结果在相同数量级。
Claims (28)
1.式(I)化合物
其中
n是1-3的整数；
R是氢或直链或分支的有2-6个碳原子的烷酰基；
R1和R2，可以相同或不同，代表有3-20个碳原子的饱和或不饱和直链酰基；并且
X-是药理学可接受的酸的阴离子。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中R选自由以下基团组成的组：乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基和异戊酰基。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中R1和R2选自由己酰基、十一烷酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基或油酰基构成的组。
4.根据权利要求1所述的化合物，其中X-选自由以下基团构成的组：氯、溴、碘、门冬氨酸根、酸式门冬氨酸根、柠檬酸根、酸式柠檬酸根、酒石酸根、酸式酒石酸根、磷酸根、酸式磷酸根、延胡索酸根、酸式延胡索酸根、甘油磷酸根、葡萄糖磷酸根、乳酸根、顺丁烯二酸根、酸式顺丁烯二酸根、粘酸根、乳清酸根、草酸根、酸式草酸根、硫酸根、酸式硫酸根、三氯醋酸根、三氟醋酸根、甲磺酸根、双羟萘酸根和酸式双羟萘酸根。
5.根据权利要求1所述的化合物，它选自由以下物质构成的组：
-L-肉碱溴化物与2-羟基乙酰基-1，3-二棕榈酰基甘油的酯；
-乙酰基L-肉碱溴化物与2-羟基乙酰基-1，3-二棕榈酰基甘油的酯；
-丙酰基L-肉碱溴化物与2-羟基乙酰基-1，3-二棕榈酰基甘油的酯；
-异丁酰基L-肉碱溴化物与2-羟基乙酰基-1，3二棕榈酰基甘油的酯；
-异戊酰基L-肉碱溴化物与2-羟基乙酰基-1，3-二棕榈酰基甘油的酯；
-L-肉碱溴化物与1，3-二己酰基-2-羟基乙酰基甘油的酯；
-乙酰基L-肉碱溴化物与1，3-二己酰基-2-羟基乙酰基甘油的酯；
-丙酰基L-肉碱溴化物与1，3-二己酰基-2-羟基乙酰基甘油的酯。
6.根据权利要求1-5中的任一权利要求所述的化合物在制备脂质体方面的用途。
7.含有权利要求1-5中的任一权利要求所述的化合物的脂质体。
8.根据权利要求7所述的脂质体，它还含有辅助性脂质。
9.根据权利要求8所述的脂质体，其中所述的辅助性脂质选自胆固醇、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱或二油基磷脂酰胆碱。
10.根据权利要求7-9中任一权利要求所述的脂质体在制备用于输送药理学活性化合物的组合物中的用途。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述的药理学活性化合物是天然来源或经过修饰的质粒或多核苷酸。
12.根据权利要求11所述的用途，其中的质粒或多核苷酸用于基因疗法。
13.根据权利要求11所述的用途，其中的质粒或多核苷酸为作为疫苗的肽或蛋白质编码。
14.根据权利要求10所述的用途，其中的活性化合物是药物。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述的药物选自包括以下物质的组：抗癌剂、抗血管生成剂、抗病毒剂、抗细菌剂、抗真菌剂、抗原生动物剂、具有心血管系统活性的化合物，或免疫原性肽。
16.根据权利要求15所述的用途，其中所述的药物是抗癌剂或抗血管生成剂。
17.根据权利要求16所述的用途，其中所述的抗癌剂选自紫杉醇或喜树碱衍生物。
18.根据权利要求17所述的用途，其中所述的喜树碱的衍生物选自由以下物质组成的组：
-7-腈喜树碱；
-7-苄氧基亚氨甲基喜树碱，和
-7-丁氧基亚氨基甲基喜树碱。
19.根据权利要求7-9的脂质体在制备化妆品组合物方面的用途。
20.含有根据权利要求7、8或9所述的脂质体的药物组合物。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述的脂质体含有具有药理学活性的化合物。
22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述的活性化合物是天然来源或经修饰的质粒或多核苷酸。
23.根据权利要求22所述的组合物，其中所述的质粒或多核苷酸用于基因疗法。
24.根据权利要求22所述的组合物，其中的质粒或多核苷酸为用作疫苗的肽或蛋白质编码。
25.含有根据权利要求7-9中任一权利要求所述的脂质体的化妆品组合物。
26.根据权利要求25所述的组合物，其中所述的脂质体含有具有化妆品活性的物质。
27.根据权利要求21所述的组合物，其中所述的化合物选自抗癌剂、抗血管生成剂、抗病毒剂、抗细菌剂、抗真菌剂、抗原生动物剂，具有心血管系统活性的化合物，或免疫原性肽。
28.根据权利要求20-27所述的组合物，它可以通过口服、肠道外、肌内、静脉注射、皮下、透皮给药，或以鼻或口喷雾剂的形式给药。
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