NO327742B1

NO327742B1 - Estere av L-karnitin eller alkanoyl L-karnitiner, anvendelse derav for fremstilling av liposomer, de oppnadde liposomer samt anvendelse derav samt farmasoytiske og kosmetiske sammensetninger

Info

Publication number: NO327742B1
Application number: NO20014985A
Authority: NO
Inventors: Claudio Pisano; Mari Ornella Tinti; Mose Santaniello; Luciana Critelli; Giovanni Salvatori
Original assignee: Sigma Tau Ind Farmaceuti
Priority date: 1999-04-13
Filing date: 2001-10-12
Publication date: 2009-09-14
Also published as: BG109876A; AU2004224958A1; PT1426044E; NO20014985D0; EP1183228A2; PL211710B1; HK1092732A1; EA200101076A1; DK1426044T3; DE60025961D1; ATE317257T1; US20050079209A1; IL145765A; ME00113B; IS8719A; DE60025961T2; JP2011042657A; AU2004224958B2; HUP0201446A3; CA2370143A1

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en klasse nye estere av L-karnitin og acyl L-karnitiner og deres anvendelse som kationiske lipider egnet for å favorisere den intracellulære avleveringen av farmakologisk aktive forbindelser, lette deres transmembrantransport, eller for å fremme deres interaksjon med spesifikke cellemembranseter (reseptorer). Oppfinnelsen vedrører videre anvendelse av forbindelsene for fremstilling av liposomer, de oppnådde liposomene samt anvendelse derav og videre farmasøytiske og kosmetiske sammensetninger.

Oppfinnelsen beskrevet heri angår også kjente estere av L-karnitin og acyl L-karnitiner, anvendbare for samme formål som de ovenfor nevnte nye forbindelsene.

Hva som menes her med begrepet "intracellulær avlevering" er cellulær transfeksjon med polynukleotider eller plasmider av naturlig opprinnelse eller modifisert, utstyrt med terapeutisk aktivitet (genavlevering) eller introduksjon av legemidler eller immunogeniske peptider inn i cellene.

Mange av de farmakologisk aktive substansene, slik som for eksempel polypeptider og proteiner eller legemidler generelt trenger å penetrere inn i cellene for å fremvise deres effekter ved å influere cellefunksjonene ved undercellulært eller molekylært nivå. For disse molekylene utgjør cellemembranen en selektivt impermeabel barriere. Cellemembranen gir i virkeligheten en beskyttende funksjon, som hindrer at potentielt toksiske substanser kommer inn, men også passering av forbindelser med terapeutisk aktivitet. Den komplekse sammensetningen av cellemembranen inkluderer fosfolipider, glykolipider og proteiner; hvor dens funksjon blir influert av cytoplasmatiske komponenter slike som Ca""" og andre ioner, ATP, mikrofilamenter, mikrotubuler, enzymer og proteiner som binder Ca<4-1>". Interaksjonen mellom de strukturelle og cytoplasmatiske komponentene til cellene og responsen til eksterne signaler er ansvarlig for selektiviteten vist ved og blant de forskjellige typer celler. Barriereeffekten til membranene kan overvinnes ved å kombinere substanser i kompleks med lipidformuleringer som reproduserer sammensetningen til naturlig forekommende membranlipider. Disse lipidene er i stand til å sammensmelte med membranene og å frigi substansene kombinert med dem til cellene. Lipidkompleksene er i stand ikke bare til å lette intracellulær overføring ved hjelp av fusjon med membranene, men kan også redusere ladningsfrastøtingen mellom membranen og molekylet som skal penetrere inn i cellen. Amfipatiske lipider, slik som membranfosfolipider, danner lipidvesikler eller liposomer i de vandige systemene.

Liposomer er vesikler hvori et vandig volum er fullstendig innesperret av en eller flere membraner bestående av lipidmolekyler, vanligvis fosfolipider. Fosfolipider, som består av et hydrofilt hode og et par av karbonkjeder (hydrofob hale), er hovedkomponentene til biologiske membraner. I vandig løsning autoassosierer de hydrofobe halene og ekskluderer vann, mens de hydrofile hodene reagerer innbyrdes med mediet og danner spontant populasjoner av vesikler med forskjellige diametre. Lipidene er generelt zwitterioniske, nøytrale eller anioniske. Disse vesiklene kan anvendes som bærere for legemidler, små molekyler, proteiner, nukleotider og plasmider.

I det siste har kationiske liposomer, en klasse av positivt ladede vesikler fremstilt fra syntetiske lipider, blitt omfattende anvendt for overføring av genetisk materiale til cellene. Den negative ladningen til DNA kan reagere innbyrdes med de positive ladningene til de kationiske lipidene, som danner et stabilt DNA-liposomkompleks. Enkeltheten og mangfoldigheten til denne teknologien har gjort liposomer til en viktig vehikel for avlevering av gener for genterapi i humane subjekter. Pr. i dag inkluderer de fleste av vektorene som anvendes for genterapi, og som er godkjent av NIH Recombinant Advisory Committee, virale og syntetiske systemer.

Viral infeksjon omfatter en serie komplekse mekanismer for å være i stand til å angripe en spesifikk celle og bære DNAet inn i kjernen. Årsaken til anvendelsen av virale vektorer ved genterapi er basert på muligheten til å erstatte viralgenene med gener som koder for en terapeutisk funksjon uten å eliminere evnen av den virale partikkelen til å infisere cellen. Begrensningene ved viral terapi har å gjøre med de virale elementene som kan være immunogene, cytopatiske og rekombinogene.

Det er store forventninger til anvendelsen av kationiske lipider for genterapi. Disse vektorene fremviser stort potentiale sammenlignet med de av biologisk opprinnelse, siden de er langt sikrere, mindre toksiske og også er i stand til å inkorporere gener med stor størrelse. Sammenlignet med biologisk-type vektorer har de imidlertid en lav intracellulær gentransskripsjonsytelse. Det bør imidlertid huskes at anvendelsen av slike transfeksjonssystemer er i en begynnende forskningsfase. Kationiske lipider spiller en viktig rolle ved dannelse av DNA-lipidkomplekset, i cellekompleks-interaksjon, i fusjon med membranen, i DNA-frigivelse inne i cellen og i transkripsjon.

Det er viktige eksempler på in-vivo applikasjoner av kationiske liposomer. Det første kliniske forsøket på genterapi ble utført ved å introdusere en ekspresjonsvektor som inneholdt det humane liposomkomplekset HLA-B7 genet for behandling av melanomi. En annen viktig applikasjon angår behandling av pulmonær cystisk fibrose ved hjelp av administrasjon via den pulmonære ruten eller som en nasalspray av den liposom-komplekserte ekspresjonsvektoren SV-40C-FTR. Andre kliniske forsøk som omfatter anvendelsen av liposomer ved behandling av kreft er for tiden under utvikling.

Fire oppbyggende elementer er generelt identifisert i strukturen til kationiske lipider: det positivt ladede kationiske hodet, spaceren, ankerlipidet og "linker"-bindingen.

Det kationiske hodet er ansvarlig for interaksjonene mellom de kationiske liposomene og DNA, mellom DNA-liposomkomplekset og cellemembranen og de andre komponentene til cellen. Den består av mono- eller polykationiske grupper (avhengig av antall ladninger) som kan være variabelt substituert.

Spaceren er den delen av molekylet som separerer det kationiske hodet fra den hydrofobe halen og er involvert i å sikre en optimal kontakt mellom det kationiske hodet og de negative ladningene til DNA-fosfatene.

Ankerlipidet er den ikke-polare hydrokarbondelen til molekylet og bestemmer de fysikalske egenskapene til dobbeltlipidlaget, slik som dets stivhet og utbyttingshastigheten med membranlipidene.

Hva som er ment med "linker-bindingen" er bindingen mellom hydrokarbonkj edene og resten av molekylet. Denne bindingen bestemmer den kjemiske stabiliteten og bionedbrytbarheten til de kationiske lipidene.

I de senere år har anvendelsen av liposomer økt stadig innenfor den kosmetiske sektoren. Vellykketheten av liposomer på dette feltet skyldes det faktum at disse forbindelsene er svært godt tolerert av huden. De anvendes både som vehikler for aktive ingredienser og som forbindelser som favoriserer adsorpsjonen av sistnevnte.

I forsknings- og patentlitteraturen er det fyldig referanser til fremstillingen og anvendelsen av liposomer; det er imidlertid svært fa referanser som beskriver anvendelsen av karnitinderivater anvendbare for genavlevering, mens for legemiddelavlevering er ingen dokumenter tilgjengelige som angår kjente teknikker for fremstilling av forbindelser som fjernt ligner de ifølge oppfinnelsen beskrevet heri. Patentsøknad EP 0 279 887 beskriver anvendelsen av et derivat av karnitin, dvs. fosfatidylkarnitin, eventuelt i blandinger med andre fosfolipider og lipider (kolesterol, fosfatidylkolin, fosfatidylserin), for fremstilling av liposomer.

I eksempelet som er angitt som angår fremstillingen av liposomer blir liposomer av fosfatidylkarnitin fremstilt som inkorporerer propranolol, et legemiddel kjent for å være aktivt som et antihypertensivt, anti-angina og anti-arytmisk middel. Karnitinderivåtet anvendes her på grunn av den uttalte myokardiske tropismen til karnitin. Denne tropismen gjør det mulig å unngå at liposomene blir metabolisert av leveren, i stedet for å nå det ønskede målsetet.

Tilstedeværelsen av fosfatidylkarnitin gjør det også mulig å administrere liposomene oralt, siden de er resistente for intestinale lipaser.

IJ. Med. Chem. 1998 18. juni; 41(13):2207-15 er et antall estere av L-karnitin anvendelig for genavlevering beskrevet, men de er ikke beskrevet eller foreslått som anvendelige midler for legemiddelavlevering.

WO 96/39193 beskriver nye målrettede legemidler som er målrettet for å komme inn i mitokondria via karnitin-acylkarnitin-traslokasesystemet, men foreslår ikke at de er anvendelige midler for fremstilling av liposomer.

EP 559 625 Bl beskriver et antall estere av L-karnitin og acyl L-karnitiner som har selektiv gastrointestinalkanal muskel-relakserende aktivitet.

I de senere år har molekylbiologer identifisert et antall defekter på kromosomalt plan som forårsaker arvelige sykdommer hos humane subjekter.

En viktig sektor innenfor moderne medisin angår behandlingen av disse arvelige genetisk-baserte sykdommene ved hjelp av anvendelse av genterapiprotokoller.

Som allerede nevnt, blir kationiske liposomer inngående anvendt for intracellulær levering av farmakologisk aktive forbindelser, som letter transmembrantransport eller fremmer deres interaksjon med spesifikke cellemembranseter (reseptorer).

Disse vektorene har stort potentiale sammenlignet med de med biologisk opprinnelse, siden de er langt sikrere, mindre toksiske og også er i stand til å inkorporere gener med stor størrelse. Sammenlignet med biologisk-type vektorer har de imidlertid en lav intracellulær gentranskripsjonsytelse.

Videre krever genoverføring formidlet ved vanlige kationiske lipider at plasmid DNA og kationiske lipider holdes separat og at deres blanding utføres umiddelbart før genoverføring.

Forsøk på å stabilisere disse polynukleotide kompleksene har så langt mislykkes i å gi oppløftende resultater; i virkeligheten er de stabile kun i en kort tidsperiode.

Innenfor feltet genterapi eller genavlevering og legemiddelavlevering er det derfor et sterkt behov for stabile, reproduserbare setespesifikke systemer som også er aktive etter en passende tidsperiode.

Det er nå blitt funnet at en klasse kationiske lipider er svært aktive i å fremme den intracellulære avleveringen av farmakologisk aktive forbindelser som innbefatter de nye estrene av L-karnitin og acyl L-karnitiner.

Disse nye forbindelsene er stabile og svært selektive fordi de er setespesifikke i å nå målorganet.

Denne karakteristikken gjør dem særlig anvendelige for transport av aktive forbindelser direkte til setet hvor de kan utøve sin farmakologiske aktivitet.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen beskrevet heri er forbindelser med den generelle formel (I):

hvor:

n er et heltall fra 1 til 3;

R er hydrogen eller alkanoyl, rett eller forgrenet, med 2-6 karbonatomer;

Ri og R2, som kan være like eller forskjellige, representerer en mettet eller umettet rett acylkjede, med 3-20 karbonatomer; og

X" er anionet til en farmakologisk akseptabel syre.

Eksempler på R er acetyl, propionyl, butyryl, valeryl og isovaleryl.

Eksempler på Ri og R2 er heksanoyl, undekanoyl, myristoyl, palmitoyl eller oleoyl.

Foretrukne eksempler av forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse er:

- ester av L-karnitinbromid med 2-hydroksyacetyl-l,3-dipalmitoylglycerol (ST 770); - ester av acetyl L-karnitinbromid med 2-hydroksyacetyl-l,3-dipalmitoylglycerol (ST 771); - ester av propionyl L-karnitinbromid med 2-hydroksyacetyl-l,3-dipalmitoylglycerol (ST 772); - ester av isobutyryl L-karnitinbromid med 2-hydroksyacetyl-l,3-dipalmitoylglycerol (ST 773); - ester av isovaleryl L-karnitinbromid med 2-hydroksyacetyl-l,3-dipalmitoylglycerol (ST 774); - ester av L-karnitinbromid med l,3-diheksanoyl-2-hydroksyacetylglycerol (ST 810); - ester av acetyl L-karnitinbromid med l,3-diheksanoyl-2-hydroksyacetylglycerol (ST 809); - ester av propionyl L-karnitinbromid med l,3-diheksanoyl-2-hydroksyacetylglycerol (ST 808).

Hva som forstås med et anion av en farmakologisk akseptabel syre er et hvilket som helst anion av en syre som ikke gir opphav til uønskede toksiske effekter eller bivirkninger.

Disse syrene er godt kjente for farmasøyter og eksperter innen farmasøytisk teknologi.

Eksempler på disse anionene er: klorid; bromid; jodid; aspartat; syreaspartat; citrat; syrecitrat; tartrat; syretartrat; fosfat; syrefosfat; fumarat; syrefumarat; glycerofosfat; glukosefosfat; laktat; maleat; syremaleat; mukat; orotat; oksalat; syreoksalat; sulfat; syresulfat; trikloracetat; trifluoracetat; metansulfonat; pamoat og syrepamoat.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre anvendelse av en forbindelse som omtalt ovenfor for fremstilling av liposomer.

Videre angår oppfinnelsen et liposom, kjennetegnet ved at det innbefatter en forbindelse som omtalt ovenfor.

Oppfinnelsen vedrører videre anvendelse av et liposom for fremstilling av en sammensetning anvendelig for transport av farmakologisk aktive forbindelser.

Videre vedrører oppfinnelsen anvendelse av et liposom som omtalt ovenfor for fremstilling av et kosmetisk preparat.

Oppfinnelsen vedrører videre en farmasøytisk sammensetning, kjennetegnet ved at de innbefatter et liposom som omtalt ovenfor.

Endelig vedrører oppfinnelsen en kosmetisk sammensetning, kjennetegnet ved at den innbefatter et liposom som omtalt ovenfor.

Forbindelser med formel (I), i form av liposomer, er midler både anvendelige for avlevering av naturlig forekommende eller modifiserte plasmider eller nukleotider anvendelige i genterapi, eller som koder for et peptid eller protein anvendelig som en vaksine, og for generell avlevering av legemidler, slik som for eksempel antikreftmidler, antivirale midler, antibakterielle midler, antifungale midler, antiprotozoanmidler, legemidler anvendelige for behandling av kardiovaskulære systemsykdommer, eller immunogene peptider og andre legemidler anvendelige i terapi.

Liposomene som inneholder forbindelsen med formel (I) fremstilles ved hjelp av vanlige teknikker, godt kjente for fagmannen; se for eksempel Allen T.M. Drugs 56, 747-56 (1998). Liposomene ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles også ved anvendelse av andre komponenter godt kjent innenfor liposomteknologi. Ifølge en utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen kan liposomene inneholde hjelperlipider, et begrep som er godt forstått innenfor teknikkens stand. Eksempler på hjelperlipider er kolesterol, l-palmitoyl-2-oleoylfosfatidylkolin eller dioleylfosfatidylkolin.

Liposomene ifølge foreliggende oppfinnelse foreligger fordelaktig som sammensetninger. I en utførelsesform som angår avlevering av farmasøytisk aktive forbindelser er sammensetningene å forstå som farmasøytiske sammensetninger, som eventuelt innbefatter farmasøytisk akseptable vehikler og/eller eksipienter.

Forbindelser med formel (I), i form av liposomer, kan også anvendes ved fremstilling av kosmetiske sammensetninger, som både innbefatter liposomet i og for seg som kosmetisk aktivt middel og for avlevering av substanser med kosmetisk aktivitet, slik som for eksempel hydratiseirngsmidler, næringsstoffer, substanser for ansiktsrensing, anti-rynkemidler, anti-cellulære midler og anti-strekkmerkemidler.

Liposomer som innbefatter forbindelsene med formel (I) kan administreres oralt eller parenteralt, intravenøst, intramuskulært, subkutant, transdermalt eller i form av nasal-eller munnsprayer.

Fremgangsmåten for fremstilling av forbindelser med formel (I) ifølge foreliggende oppfinnelse er presentert i følgende reaksjonsdiagram, og det er ment at dette diagrammet gjelder for hele den generelle formelen (I). Fagmannen kan enkelt finne ut alle gruppene ment med R, Ri og R2, siden alle de nødvendige reagensene er kommersielt tilgjengelige eller beskrevet i litteraturen og reaksjonsbetingelsene er generelt anvendbare for hele omfanget av oppfinnelsen slik at eventuell modifikasjon, hvis nødvendig, normalt oppnås innenfor den generelle kunnskapen innenfor området. Med referanse til reaksjonsdiagrammet 1 ovenfor, er fremstillingen av forbindelser med formel (I) ifølge foreliggende oppfinnelse illustrert nedenfor.

EKSEMPEL 1

Fremstilling av esteren av propionyl L-karnitinbromid med 2-hydroksyacetyl 1,3 dipalmitoylglycerol (ST 772)

a) Fremstilling av l,3-dihydroksypropan-2-on 1,3-dipalmitat (1)

Dihydroksyaceton (7 g; 0,078 mol) løses i 300 ml vannfri kloroform ved 0°C (ekstern

temperatur) under vannfri nitrogenstrøm.

Til løsningen oppnådd på denne måten blir palmitoylklorid (44; 0,16 mol) og vannfri pyridin (15 ml) tilsatt dråpevis.

Den resulterende blandingen, hvis temperatur er bragt til omgivelsestemperatur, holdes under røring i 24 timer.

Blandingen blir deretter ekstrahert i følgende rekkefølge: med 300 ml av en vandig løsning av 0,5% saltsyre, 300 ml av en vandig løsning av 5% natriumbikarbonat og til slutt 300 ml vann.

Den separerte organiske fasen blir dehydrert over vannfritt natriumsulfat, filtrert på et cellulosefilter og konsentrert til tørrhet hvilket gir det urene produktet (1).

Rent produkt (1) oppnås ved krystallisering fra 500 ml etylalkohol.

30,4 g produkt (1) oppnås.

Utbytte: 73%

Smeltepunkt = 80-81°C

H^MR (CDC13): 0,9 (6H, t, CH3CH2.); 1,3 (48H, m, (CH2)n=24); 1,55 (4H, m,

-OCOCH2CFJ2-); 2,4 (4H, t, -OCOCHO: 4,7 (4H, s, -OCCHO.

b) Fremstilling av l,2,3-trihydroksypropan-l,3-dipalmitat (2)

Vann (7,5 ml) tilsettes sakte til produktet (1) (5 g, 9 mmol), løst i tetrahydrofuran (125

ml) og toluen (25 ml) under røring.

Temperaturen til den melkaktig hvite suspensjonen som oppnås bringes til 5°C (ekstern temperatur) og natriumborhydrid (500 mg; 13 mmol) tilsettes i små porsjoner. Suspensjonen holdes under røring i 30 minutter ved 5°C.

Iseddiksyre tilsettes forsiktig til brusingen produsert av dekomponeringen av overskudd natriumborhydrid stilner og til slutt oppnås en løsning.

Kloroform (100 ml) tilsettes til løsningen, og det oppnås et to-fasesystem.

Den lavere organiske fasen som består av CHCI3 separeres, ekstraheres i følgende rekkefølge: med vann (25 ml), natriumbikarbonat (25 ml av 10% vandig løsning) og vann (25 ml).

Den organiske løsningen som inneholder (2) dehydreres over natriumsulfat, filtreres og konsentreres til tørrhet, og det oppnås et voksaktig produkt.

Produkt (2) oppnås ved acetonkrystallisasjon av det voksaktige urene produktet.

4,8 g av produktet (2) oppnås.

Utbytte: 94%

Smeltepunkt = 71-72°C

H'NMR (CDCI3): 0,9 (6H, t, CH3CH2-); 1,3 (48H, m, (CH2)n=24); 1,55 (4H, m,

-OCOCH9CHO: 2,4 (4H, t, -OCOCHO: 4,2 (4H, m, - CHCFbCM.

c) Fremstilling av l,3-dipalmitoyl-2-bromacetylglycerol (3)

Produkt (2) (2,5 g; 4,4 mmol) ble solubilisert i vannfri kloroform (50 ml) under røring

og ved 0°C (ekstern temperatur).

Til løsningen således oppnådd ble det sakte tilsatt pyridin (0,42 ml) og dråpvis 3 ml av en kloroformløsning som inneholdt bromacetylklorid (0,43 ml; 5,2 mmol).

Reaksjonsblandingen holdes i 30 minutter ved 0°C (ekstern temperatur) og i 30 minutter ved omgivelsestemperatur.

Reaksjonsblandingen blir deretter behandlet i følgende rekkefølge med: en vandig løsning av 1% saltsyre (ca. 50 ml), en vandig løsning av 5% natriumbikarbonat (ca. 50 ml) og vann.

Produkt (3) ble renset ved acetonkrystallisasjon, etter dehydrering av reaksjonsblandingen (med natriumsulfat) og deretter konsentrert til tørrhet.

2,5 g av produkt (3) ble oppnådd.

Utbytte: 89%

Smeltepunkt = 46-47°C

H<*>NMR (CDC13): 0,9 (6H, t, CH3CH2-); 1,3 (48H, m, (CH2)n=24); 1,55 (4H, m, -OCOCH2CH2..); 2,4 (4H, t, -OCOCHO: 3,9 (2H, s, -O CH?COO-) 4,2-4,4 (5H, m,

-CHCH2O-); 5,25 (1H, m, CHCH2O-).

d) Fremstilling av esteren L-propionylkarnitinbromid med 2-hydroksyacetyl-l,3-dipalmitoylglycerol (4) L-propionylkarnitin indre salt (0,95 g, 4,4 mmol) på forhånd vakuumtørket ved 40°C ble suspendert i vannfritt dimetylformamid (ca. 20 ml).

Produkt (3) (3, g, 4,7 mmol) ble tilsatt til suspensjonen i små porsjoner. Suspensjonen ble varmet forsiktig til 38°C og holdt ved disse betingelsene til en løsning var oppnådd.

Etter 10 minutter ble løsningen brakt til 0°C i 30 minutter. Et presipitat ble oppnådd, som ble filtrert og vasket med etyleter og løst i kloroform (100 ml). Den opalescerende løsningen som ble oppnådd (30 ml) ble filtrert på celitt og konsentrert. Til denne sistnevnte løsningen ble det tilsatt heksan (100 ml), og presipitatet av produktet (4) som ble oppnådd ble filtrert og vakuumtørket ved 35°C.

3,19 g av tittelforbindelsen ble oppnådd.

Utbytte: 80%.

Smeltepunkt = 127-128°C

[a]<25>D = -3,9 (C = 1% kloroform)

Elementanalyse av C47H88BrNOio

H'NMR (CDC13): 0,9-0,95 (6H, t, CH3CH2CH2-); 1,1-1,2 (3H, t, CH3CH2CO); 1,2-1,4 (24H, m, CH2n=24); 1,5-1,6 (4H, m, -OCCH2CH2-); 2,3-2,4 (4H, t, -OCCrL.CHO: 2,4-2,45 (4H, d.d., -CH CH2CM: 2,95 (2H, d, -CH2COOCH2COO-); 3,5 (9H, s, N (CH3)3); 4,2 (4H, m, -CH20COCH2-), 4,35 (2H, m, - CH9NO: 4,65 (2H, d.d.-OCH2CO-): 5,25 (1H, m, -CH2CHCH2O-); 5,75 (1H, m, -CHCH2N-).

EKSEMPLER 2-7

Følgende forbindelser ble fremstilt på samme måte som i det foregående eksempelet: - ester av L-karnitinbromid med 2-hydroksyacetyl-l,3-dipalmitoylglycerol (ST 770); - ester av acetyl L-karnitinbromid med 2-hydroksyacetyl-l,3-dipalmitoylglycerol (ST 771); - ester av propionyl L-karnitinbromid med 2-hydroksyacetyl-l,3-dipalmitoylglycerol (ST 772); - ester av isobutyryl L-karnitinbromid med 2-hydroksyacetyl-l,3-dipalmitoylglycerol (ST 773); - ester av isovaleryl L-karnitinbromid med 2-hydroksyacetyl-l,3-dipalmitoylglycerol (ST 774); - ester av L-karnitinbromid med l,3-diheksanoyl-2-hydroksyacetylglycerol (ST 810); - ester av acetyl L-karnitinbromid med l,3-diheksanoyl-2-hydroksyacetylglycerol (ST 809); - ester av propionyl L-karnitinbromid med l,3-diheksanoyl-2-hydroksyacetylglycerol (ST 808).

En foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse består i anvendelsen av liposomer med antikreftlegemidler, og særlig liposomer som tjener som vehikler for kamfoteciner, for eksempel de som er beskrevet i WO 97/31003. Oppfinnelsen lam anvendes med liposomer for avlevering av kamptoteciner med den generelle formelen

(IV):

hvor: R7 er en -C(Rn)=N-0(n)Rio-gruppe, hvori Rio er hydrogen eller en C1-C5 alkyl

eller C1-C5 alkenylgruppe, rett eller forgrenet, eller en C3-C10 cykloalkylgruppe, eller en rett eller forgrenet (C3-C10) cykloalkyl-(Ci-Cs) alkylgruppe, eller en C6-C14 aryl, eller en rett eller forgrenet (C6-C14) aryl-Ci-Cs) alkylgruppe, eller en heterocyklisk eller rett eller forgrenet heterocyklisk -(C1-C5) alkylgruppe, idet nevnte heterocykliske gruppe

inneholder minst et heteroatom utvalgt fra atomer av nitrogen, eventuelt substituert med en (C1-C5) alkylgruppe, og/eller oksygen og/eller svovel; hvor nevnte alkyl, alkenyl, cykloalkyl, aryl, aryl-alkyl, heterocykliske eller heterocyklo-alkylgrupper eventuelt er substituert med andre grupper utvalgt fra: halogen, hydroksy, C1-C5 alkyl, C1-C5 alkoksy, fenyl, cyano, nitro, -NR12R13, hvor R12 og Ri3, som kan være like eller forskjellige, er hydrogen, rett eller forgrenet (C1-C5) alkyl, -COOH-gruppen eller en av den farmasøytisk akseptable estere; eller-CONR^Ris-gruppe, hvor R14 og R15, som kan være like eller forskjellige, er hydrogen, rett eller forgrenet (C1-C5) alkyl; eller

Rio er en C6-C10 aroylrest, eventuelt substituert med en eller flere grupper utvalgt fra: halogen, hydroksy, rett eller forgrenet C1-C5 alkyl, rett eller forgrenet C1-C5 alkoksy, fenyl, cyano, nitro, -NR16R17, hvor Ri6 og R17, som kan være like eller forskjellige, er hydrogen, rett eller forgrenet C1-C5 alkyl;

Rio er en polyaminoalkylrest; eller

Rio er en glykosylrest;

n er tallet 0 eller 1;

Rn er hydrogen, rett eller forgrenet C1-C5 alkyl, rett eller forgrenet C1-C5 alkenyl, C3-C10 cykloalkyl, rett eller forgrenet (C3-C10) cykloalkyl-(Ci-C5) alkyl, C6-C14 aryl, rett eller forgrenet (C6-C14) aryl-(Ci-C5) alkyl;

Rs og R9, som kan være like eller forskjellige, er hydrogen, hydroksyl, rett eller forgrenet C1-C5 alkoksy;

deres Ni-oksider, enkeltisomerer, særlig syn- og anti-isomerene av -C(Ri i)=N-0(„)Rio gruppen, deres mulige enantiomerer, diastereoisomerer og relaterte blandinger, deres farmasøytisk akseptable salter og deres aktive metabolitter.

Forbindelser med formel (IV) er beskrevet i europeisk søknad nr. 99830124.6, inngitt 9. mars 1999.

Med hensyn til forbindelsene med formel (IV) hvori n er 1 og Rio er som definert ovenfor, unntatt for aroyl, kan disse forbindelsene fremstilles med utgangspunkt i kamptotecin 7-aldehyd (formel IVa, Rn hydrogen) eller kamptotecin 7-keto (formel rVa, Ri 1 forskjellig fra hydrogen).

hvor R7 er -C(Ri i)=0-gruppen, og Rn er som definert i formel (IV), Rg og R9 er som definert i formel (IV). Formel (IVa)-forbindelsen omsettes med formel (Va)-forbindelsen R10O-NH2, hvor Rio er som ovenfor, for å gi forbindelser med formel (I), hvori R7 er -C(R[ i)=N-0-Rio-gruppen, hvor Rio er som definert i formel (IV), unntatt for aroyl.

Reaksjonen kan utføres med vanlige fremgangsmåter kjente for eksperter innenfor feltet, hvor fremgangsmåten består av normal dannelse av oksimer. Foretrukket er det molare forholdet mellom kamptotecin 7-aldehyd eller 7-keto og hydroksylamin i området 1:3 til 3:1. De relevante hydroksylaminsaltene kan også anvendes. Reaksjonen utføres under nærvær av en base, for eksempel, en uorganisk base slik som kaliumkarbonat, eller en organisk base, slik som trietylamin eller diazabicyklononan, ved anvendelse av polare løsemidler, foretrukket metanol eller etanol, og ved utførelse av reaksjonen ved en temperatur som varierer fra omgivelsestemperatur til kokepunkttemperaturen for løsemidlet, eventuelt under nærvær av dehydreringsmidler, for eksempel natrium eller magnesiumsulfat, og molekylsikter. Hvis påkrevet, kan reaksjonen også utføres under nærvær av en katalysator, for eksempel en Lewis-syre.

Alternativt kan forbindelsene nevnt ovenfor fremstilles fra oksimet av kamptotecin 7-aldehyd (oppnådd som beskrevet i Sawada et al. Chem. Pharm. Bull. 39,2574 (1991)), eller 7-keton eller fra det korresponderende 7-acylkamptotecinet ved reaksjon med et R10-X halid, hvor X foretrukket er jod, i et polart løsemiddel, for eksempel tetrahydrofuran eller alkoholer, og under nærvær av en base, for eksempel natriumhydrid eller kaliumkarbonat.

Angående forbindelsene med formel (IV) hvori n er 1 og Rio er aroyl, som definert i formel (IV), kan disse forbindelsene fremstilles med utgangspunkt i kamptotecin 7-oksim, hvor fremstillingen av denne er beskrevet i tidligere avsnitt, med R10-COCI-acylklorider, i polare løsemidler, og under nærvær av en base, foretrukket pyridin, eller direkte i pyridin, som beskrevet av Cho et al. J. Org. Chem. 62, 2230 (1997).

Angående forbindelsene med formel (IV) hvori n er 0 og Rio er som definert ovenfor, unntatt for aroyl, kan forbindelsene fremstilles med utgangspunkt i kamptotecin 7-aldehyd (formel IVa, Ri 1 hydrogen) eller kamptotecin 7-keto (formel IVa, Ri 1 forskjellig fra hydrogen).

hvor R7 er -C(Ri i)=0-gruppen, og Ri i er som definert i formel (IV), R§ og R9 er som definert i formel (IV). Formel (IVa)-forbindelsen omsettes med formel (Vb)-forbindelsen R10-NH2, hvor Rio er som definert ovenfor, hvilket gir forbindelser med formel (IV), hvor R7 er-C(Rn)=N-Rio-gruppen, R)0 er som definert i formel (IV), unntatt for aroyl. Reaksjonen kan utføres med vanlige fremgangsmåter kjente for eksperter innenfor farmasøytisk teknologi, hvor fremgangsmåten består i normal dannelse av iminer. Foretrukket er det molare forholdet mellom kamptotecin 7-aldehyd eller 7-keto og iminet i området 1:3 til 3:1. De relevante aminsaltene kan også anvendes. Reaksjonen utføres under nærvær av en base, for eksempel en uorganisk base slik som kaliumkarbonat, eller en organisk base, slik som trietylamin eller diazabicyklononan, ved anvendelse av polare løsemidler, foretrukket metanol eller etanol, og reaksjonen blir utført ved en temperatur i området fra omgivelsestemperatur til kokepunkttemperaturen for løsemidlet, eventuelt under nærvær av dehydreringsmidler, for eksempel natrium-eller magnesiumsulfat, og molekylsikter. Hvis påkrevet, kan reaksjonen også utføres under nærvær av en katalysator, for eksempel en Lewis-syre, som beskrevet, for eksempel av Moretti og Torre, Synthesis, 1970,141; eller av Kobayashi et al., Synlett, 1977, 115).

Kamptotecin 7-aldehyd og kamptotecin 7-oksim er beskrevet i europeisk patentsøknad EP 0056692 og i den ovenfor siterte artikkelen til Sawada et al., Chem. Pharm. Bull. 39, 2574(1991).

Ni-oksidene til forbindelsene med formel (IV) fremstilles ifølge kjente heteroaromatiske nitrogenoksydasjonsfremgangsmåter, foretrukket ved oksidenng med eddiksyre eller trifluoreddiksyre og hydrogenperoksid, eller ved reaksjon med organiske peroksysyrer (A. Albini og S. Pietra, Heterocyclic N-oxides, CRC, 1991).

Angående den varierende signifikansen av Rio, tilstede i de forskjellige formel V-reagensene, er disse reagensene kommersielt tilgjengelige eller kan fremstilles ifølge fremgangsmåter kjente i litteraturen, som fagmannen kan anvende med kjennskap til det aktuelle området.

Farmasøytisk akseptable salter oppnås ved vanlige fremgangsmåter beskrevet i litteraturen, og som ikke krever ytterligere beskrivelse.

EKSEMPEL 8

7-benzyloksyiminometylkamptotecin (CPT 172)

500 mg (1,33 mmol) av 7-formylkamptotecin løses i 100 ml etanol. 15 ml pyridin og

638 mg (4 mmol) O-benzylhydroksylaminhydroklorid tilsettes. Løsningen reflukseres i 5 timer. Løsemidlet vakuumfordampes og residuet oppnådd på denne måten renses ved flash-kromatografi på silikagel ved anvendelse av 4:6 blanding av heksan/etylacetat som eluent.

Utbytte: 65%

Smeltepunkt: 200-205°C dek.

Produktet som ble oppnådd består av en ca. 8:2 blanding av de to syn- og anti-isomerene (isomer A: Rf 0,32; isomer B, Rf 0,19, på Merck 60 F254 silikagel; eluent: heksametylacetat 3:7).

HPLC: analysene ble utført på et apparat utstyrt med en kvaternær pumpe (HP 1050) med en Rheodyne-injektor (20 ul loop) og en diodetabelldetektor (HP 1050) kjørt med HPLC-ChemStation-program. Spektra-akvisisjon ble gjort fra 200 til 600 nm og kromatogrammene ble avlest ved 360 og 400 nm.

En Cl8 omvendt-fasekolonne (Rainin Cl8; 25x0,4 cm, Varian) ble anvendt med en RP18 prekolonne. Analysen ble utført med en lineær elueringsgradient som startet fra acetonitril:vann 30:70 til acetonitril 100% i 20 minutter med en strømningshastighet på 1 ml/min. Retensjonstidene var 12,52 for isomer B og 14,48 min. for isomer A.

'H-NMR (300 MHz; DMSO-d6): 8: 0,88 (t, H3-18A+H3-18B), 1,87 (m, (H2-19A+H2-19B), 5,18 (s, H2-5B), 5,21 (8s, H2-Ph B), 5,30 (H2-Ph A), 5,40 (s, H2-5A), 5,45 (s, H2-17A+H2-17B), 6,53 (s, -OH A+-OH B), 7,3-7,6 (m, Ar A+ Ar B+H-14A+ H-14B), 7,75 (m, H-11A+H-11B), 7,85-7,95 (m, H-10A+H-10B), 7,98 (dd, H-12B), 8,18-8,27 (m, H-12A+H9-B), 8,45 (s, CH=N B), 8,59 (dd, H-9A), 9,38 (s, CH=N A).

Masse m/z 481 (M<+> 100) 374 (30) 330 (70) 300 (30) 273 (20) 243 (20) 91 (34).

EKSEMPEL 9

7-butoksyiminometylkamptotecin (CPT 184)

400 mg (1,06 mmol) av 7-formylkamptotecin løses i 80 ml etanol. 12 ml pyridin og 400 mg (3,18 mmol) O-t-butylhydroksylaminhydroklorid tilsettes. Løsningen reflukseres i 4 timer. Løsemidlet blir vakuumfordampet og residuet oppnådd på denne måten blir renset ved flash-kromatografi på silikagel ved anvendelse av 4:6 blanding av heksan/etylacetat som eluent.

322 mg (0,72 mmol) av gult fast stoff oppnås.

Utbytte: 68%

Smeltepunkt: 250°C dek.

Det oppnådde produktet består av en ca. 8:2 blanding av de to syn- og anti-isomerene (isomer A: Rf 0,31; isomer B, Rf 0,24, på Merck 60 F254 silikagel; eluent: heksametylacetat 3:7).

HPLC: analysene ble utført på et apparat utstyrt med en kvaternær pumpe (HP 1050) med en Rheodyne-injektor (20 ul loop) og en diodetabelldetektor (HP 1050) kjørt med HPLC-ChemStation-programmet. Spektra-akvisisjon ble gjort fra 200 til 600 nm og kromatogrammene ble avlest ved 360 og 400 nm.

En Cl8 omvendt-fasekolonne (Rainin Cl8; 25x0,4 cm, Varian) ble anvendt med en RP18 prekolonne. Analysen ble utført med en lineær elueringsgradient som startet fra acetonitril:vann 30:70 til acetonitril 100% i løpet av 20 minutter med en strømningshastighet på 1 ml/min. Retensjonstidene var: 12,92 for isomer B og 14,61 min. for isomer A.

'H-NMR (300 MHz; DMSO-d6): 8: 0,88 (t, H3-18A+H3-18B), 1,30 (s, t-but.B), 1,47 (s, t-but.A), 1,87 (m, (H2-19A+H2-19B), 5,18 (s, H2-5B), 5,37 (H2-5 A), 5,42 (s, H2-17A+H2-17B), 6,54 (s, -OH A+-OH B), 7,35 (s, H-14A), 7,36 (s, H-14B), 7,69-7,83 (m, H-11A+H-11B), 7,85-7,98 (m, H-10A+H-10B), 8,07 (dd, H-9B), 8,16-8,27 (m, H-9A+H-12B), 840 (s, CH B), 8,62 (dd, H-12A), 9,31 (s, CH A).

Masse m/z 448 (M+ 28) 391 (40) 374 (100) 362 (40) 330 (34) 57 (17).

FREMSTILLING AV LIPOSOMER

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan anvendes for å fremstille multilamellære liposomer (MLV) og unilamellære liposomer (SUV), begge i form av tørre pulvere og som suspensjoner i vandige løsninger.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen, fremstilt som beskrevet i eksemplene 1-7, anvendes for å fremstille liposomene ifølge følgende prosedyre. En egnet mengde av forbindelsen løses i kloroform; løsningen vakuumkonsentreres til tørrhet på en rotasjonsfordamper til en lipidfilm oppnås. Lipidfilmen tørkes under høyvakuum til siste gjenværende spor av løsemiddel er blitt eliminert og blir deretter løst i tert-butylalkohol eller med vann.

Løsningen oppnådd på denne måten lyofiliseres og det oppnås et mykt, tørt pulver.

Pulverene hydratiseres med en egnet mengde vandig løsning, som gir liposomet til forbindelsen som anvendes, som deretter komplekseres med polynukleotidet eller med det ønskede legemidlet.

En annen fremgangsmåte for fremstilling av liposomer består av å absorbere en lipidfilm, som består av en forbindelse ifølge oppfinnelsen i et løsemiddel, på et egnet inert støttemateriale slik som sorbitol, mannitol eller andre farmakologisk akseptable karbohydrater. Blandingen vakuumtørkes og gir et fast stoff som enkelt og svært raskt blir hydratisert før anvendelse.

Preparatene i form av tørre pulvere gir fordelen av å være stabile i lange perioder, og er enkle å anvende.

Videre kan forbindelsene ifølge oppfinnelsen anvendes for å fremstille liposomer kompleksert med DNA eller med ønsket legemiddel, i form av tørre pulvere, ifølge følgende fremgangsmåte. Forbindelsen ifølge oppfinnelsen løses i tert-butylalkohol eller med vann; løsningen oppnådd på denne måten blandes med DNA eller ønsket legemiddel og blandingen lyofiliseres og gir komplekset som kan defineres som proliposom-DNA eller proliposom-legemiddel, i form av et mykt, tørt pulver.

Pulveret således oppnådd (proliposomer) kan anvendes for fremstilling av farmasøytiske sammensetninger som kan administreres via aerosol, eller som alternativt, når de rekonstitusjoneres med vann, eller med en egnet bufferløsning, kan administreres parenteralt eller oralt.

Liposomene kompleksert med DNA eller med legemidler, i fast form, kan også oppnås ved fremgangsmåten med å adsorbere lipidfilmen på et inert støttemateriale slik som sorbitol, mannitol eller andre karbohydrater ved hjelp av fremgangsmåten beskrevet ovenfor.

TESTING AV LIPOSOMDANNELSE

Liposomdannelsen ble testet ved hjelp av en kolorimetrisk metode, ved anvendelse av et vannløselig fargestoff, ifølge følgende fremgangsmåte. En vandig løsning av det vannløselige fargestoffet Arsenazo III ble oppnådd (molekylvekt = 776,37; 2,3 mg/ml).

Denne løsningen ble anvendt i stedet for vann for å hydratisere lipidfilmene som kommer fra den ovenfor nevnte fremstillingen.

En porsjon av suspensjonen som inneholder liposomet som innkapsler fargestoffet ble fortynnet 100 ganger med vann.

To ml av liposomsuspensjonen ble anvendt for å oppnå den første optiske

tetthetsavlesningen ved 660 nm; hvor avlesningen ble oppnådd i relasjon til en lik prøve definert som en blindprøve. 200 ul av en CaC^-løsning (15 mg/ml; 100 mm) ble tilsatt til den første prøven, og den optiske tettheten ble målt ved 660 nm mot blindprøven, til hvilken 200 ul vann ble tilsatt. Absorbansverdien som ble oppnådd ble indikert som avlesning 2. Det ble fortsatt ved å tilsette til prøven 100 ul av en løsning av Triton X-100 (5% v/v; 0,26% sluttkonsentrasjon) og til blindprøven 200 ul vann; den optiske

tetthetsavlesningen ved 660 nm ga den optiske tetthetsverdien definert som avlesning 3. For å beregne prosentandel innkapslet fargestoff, ble følgende formel anvendt:

Prosentandelen innkapslet fargestoff gir et mål på liposomdannelsen og er gjennomsnittlig ca. 40%: liposomstørrelsesundersøkelsen ble utført ved anvendelse av laserlysspredning med et positivt utbytte.

EKSEMPLER PÅ FREMSTILLING AV LIPOSOMER

Fremstilling av liposomer av palmitoyl L-karnitinkloridundecylester (ST 983) i form av:

a) Lyofilserte pulvere

65 mg, 0,11 mmol palmitoyl L-karnitinkloridundecylester ble løst i 20 ml kloroform, i

en 100 ml kolbe.

Løsningen ble fordampet til en lipidfilm ble oppnådd som ble vakuumtørket i 3 timer. Det således oppnådde produktet ble løst i tert-butylalkohol og denne løsningen ble raskt avkjølt til -70°C med flytende nitrogen og lyofilisert i 24 timer.

Et svampaktig mykt hvitt faststoff ble oppnådd.

b) Adsorberte pulvere

143 mg, 0,231 mmol palmitoyl L-karnitinkloridundecylester ble løst i 10 ml kloroform.

Løsningen således oppnådd ble helt i små porsjoner over i en 100 ml kolbe som inneholdt 750 mg sorbitol. Ved slutten av tilsetningen av de forskjellige porsjonene kloroformløsning, ble kloroformen raskt fordampet.

Det faste stoffet således oppnådd ble vakuumtørket i 3 timer.

893 mg av et hvitt fast produkt ble oppnådd.

Før anvendelse ble produktet hydratisert raskt med et egnet volum vann for å oppnå en isoton løsning.

c) MLV-suspensjoner

65 mg, 0,11 mmol palmitoyl L-karnitinkloirdundecylester ble løst i 20 ml kloroform, i

en 100 ml kolbe.

Løsningen således oppnådd ble fordampet til en lipidfilm ble oppnådd som deretter ble vakuumtørket i 3 timer.

Lipidfilmen ble hydratisert med 10 ml vann, ved 30°C, i 3 timer hvilket ga en MLV-suspensjon. MLV-suspensjonen, passende fortynnet, ble kompleksert med et polynukleotid eller med et legemiddel og anvendt for biologiske undersøkelser.

d) SUV-suspensjoner

en 100 ml kolbe.

Lipidfilmen ble hydratisert med 10 ml vann ved 30°C i 3 timer, hvilket ga en MLV-suspensjon. MLV-suspensjonen ble ekstrudert 10 ganger gjennom et polykarbonatfilter med en porestørrelse på 200 nm. Den unilamellære liposomsuspensjonen således oppnådd ble kompleksert med et polynukleotid eller et legemiddel og anvendt for biologiske undersøkelser.

e) Testing av fysisk stabilitet av liposomer

Den fysiske stabiliteten av liposomsuspensjonen ble testet ved hjelp av turbidimetri i en

periode på 30 dager.

En absorbansmåling ved 600 nm i et visst tidsintervall ble utført for hver suspensjon som skulle testes. Den midlere absorbansverdien målt ved tid 0 holdt seg konstant for alle de testede formuleringene.

Molekylene ga samsvarende verdier i tidsperiodene som ble undersøkt.

ML V- og SUV-liposomsuspensjonene kan fremstilles ved å kombinere forbindelsene ifølge oppfinnelsen med hjelperlipider slike som kolesterol, l-palmitoyl-2-oleoyl fosfatidylkolin (POPC) eller dioleylfosfatidylkolin (DOPE).

Forbindelsene kombineres med hjelperlipider for å oppnå liposomer med stablermembraner. Nedenfor, i kapittelet som beskriver fremstilling av liposomer, er et eksempel på en fremstilling gitt, hvori en forbindelse ifølge oppfinnelsen kombineres med et hjelperlipid slik som kolesterol eller POPC.

EKSEMPLER PÅ FREMSTILLING AV LIPOSOMER FOR LEGEMIDDELAVLEVERING

EKSEMPEL 10

Fremstilling av taksol-ST 983 MLV-liposomer (1:40)

20 mg, 0,0234 mmol taksol og 556 mg, 0,9417 mmol ST 983 ble løst i 20 ml kloroform.

Løsningen ble konsentrert til en lipidfilm ble oppnådd på overflaten av glasskolben.

Etter eliminering av de siste spor av kloroform ved hjelp av en vakuumpumpe, ble 20 ml tert-butylalkohol tilsatt til lipidfilmen og løsningen således oppnådd ble underoppdelt i 19 fraksjoner som umiddelbart ble frosset til -70°C med flytende nitrogen og lyofilisert i 24 timer. Hver fraksjon av faststoff inneholdt taksol (1,05 mg) og ST 983 (29,2 mg).

For å oppnå den endelige liposomsuspensjonen, ble det lyofiliserte produktet hydratisert ved anvendelse med vann (450 ul) eller annen saltvannsløsning, rørt i 10 minutter og etterlatt stående i 30 minutter for å muliggjøre fullstendig utførelse av svelle (hydratiserings)-prosessen.

MLV-liposomer ble oppnådd.

Testing av fysisk stabilitet ved fremstillingen

Den fysikalske stabiliteten til preparatet ble testet ved hjelp av turbidimetri med avlesning av en TDC ('Time Drive Curve") ved 800 nm, ved 20°C, i 20 timer.

En konstant turbiditetstrend som er indikativ for stabilitet av preparatet ble avlest uten noe presipitasjonsfenomen.

Testing av kjemisk stabilitet av taksol ved fremstillingen

Den kjemiske stabiliteten til taksol ble testet med HPLC.

De kromatografiske betingelsene var som følger:

Kolonne: uBondapack C-18

Eluent: acetonitril:vann 70:30

Detektor UV-VIS: 227 nm

Strømningshastighet: 1 ml/min.

Retensjonstid: 4,5 min.

Taksolkonsentrasjonen, bestemt mot en standard, var 2,13 mg/ml.

Prosent innkapslet taksol var 98%.

EKSEMPEL 11

Fremstilling av taksol-ST 983 SUV-liposomer

Etter eliminering av siste spor av kloroform med en høyvakuumpumpe, ble 20 ml tert-butylalkohol tilsatt til lipidfilmen og løsningen således oppnådd ble underoppdelt i 19 fraksjoner som umiddelbart ble frosset til -70°C med flytende nitrogen og lyofilisert i 24 timer. Hver fraksjon faststoff inneholdt taksol (1,05 mg) og ST 983 (29,2 mg).

For å oppnå den endelige SUV-liposomsuspensjonen ble det lyofiliserte produktet, hydratisert med en PBS-løsning (1 ml), lydbehandlet i 20 minutter ved 0°C.

Filtrering ble deretter utført på et 400 nm filter for å eliminere spor av titan frigitt ved lydbehandlingsproben.

Testing av fysisk stabilitet av sammensetningen

Den fysiske stabiliteten til sammensetningen ble testet ved hjelp av turbidimetri med avlesning på en TDC ('Time Drive Curve") ved 800 nm, ved 20°C, i 20 timer.

En konstant turbiditetstrend, indikativ for stabilitet til preparatet, ble avlest uten noe presipitasjonsfenomen.

Testing av kjemisk stabilitet av taksol ved fremstillingen

Den kjemiske stabiliteten til taksol ble testet med HPLC.

De kromatografiske betingelsene var som følger:

Kolonne: uBondapack C-18

Eluent: acetonitril:vann 70:30

Detektor UV-VIS: 227 nm

Strømningshastighet: 1 ml/min.

Retensjonstid: 4,5 min.

HPLC-analyse av SUV-liposomsuspensjonen ga samme resultater som den korresponderende MLV-liposomsuspensjonen, og i dette tilfellet var også prosentandelen innkapslet taksol 98%.

HPLC-analyse gjentatt etter 24 timer avdekket ingen nye topper andre enn taksolgroppen som indikerer stabilitet for den aktive ingrediensen.

EKSEMPEL 12

Fremstilling av taksol-ST 983-kolesterolliposomer (1:15)

Disse typene liposomer ble fremstilt for å oppnå komplekser med stablermembraner.

6 mg, 0,0101 mmol taksol, 62,2 mg, 0,105 mmol ST 983 og 40 mg kolesterol ble løst i

10 ml kloroform.

Den således oppnådde løsningen ble konsentrert til en lipidfilm ble oppnådd på overflaten av glasskolben.

Etter eliminering av de siste sporene av kloroform med en høyvakuumpumpe, ble 6,3 ml tert-butylalkohol tilsatt til lipidfilmen og løsningen således oppnådd ble underoppdelt i 5 fraksjoner som umiddelbart ble frosset til -70°C med flytende nitrogen og lyofilisert i 24 timer. Hver fraksjon faststoff inneholdt taksol (1,2 mg), ST 983 (12,44 mg) og kolesterol (8 mg).

For å oppnå den endelige liposomsuspensjonen, ble det lyofiliserte produktet hydratisert ved anvendelse med vann (1000 ul) eller andre saltvannsløsninger, rørt i 10 minutter og etterlatt stående i 30 minutter for å muliggjøre fullstendig svelle (hydratiserings)-prosess.

MLV-liposomer ble oppnådd.

Testing av fysisk stabilitet av sammensetningen

Den fysiske stabiliteten til preparatet ble testet ved hjelp av turbidimetri med avlesning på en TDC ("Time Drive Curve") ved 800 nm, ved 20°C, i 6 timer.

En konstant turbiditetstrend som er indikativ for stabiliteten til preparatet, ble avlest uten noe presipiteringsfenomen.

EKSEMPEL 13

Fremstilling av taksol-ST 772 SUV-liposomer (1:70)

20 mg, 0,0234 mmol taksol og 1485 mg, 1,638 mmol ST 772 ble løst i 20 ml kloroform.

Etter eliminering av de siste sporene av kloroform med en høyvakuumpumpe, ble 20 ml tert-butylalkohol tilsatt til lipidfilmen. For å oppnå en klar løsning ble den varmet til 60°C. Løsningen ble umiddelbart frosset til -70°C med flytende nitrogen og lyofilisert i 24 timer.

For å oppnå den endelige SUV-liposomsuspensjonen ble det lyofiliserte produktet, hydratisert med en PBS-løsning (20 ml), lydbehandlet i 20 minutter ved 0°C.

Filtrering ble deretter utført på et 400 nm filter for å eliminere spor av titan frigjort av lydbehandlingsproben.

Testing av fysisk stabilitet av sammensetningen

EKSEMPEL 14

Fremstilling av CPT 83-ST 983 MLV-liposomer (1:40)

6,3 mg, 0,0168 mmol CPT 83 (7-karbonitirlkampotecin, beskrevet i WO 97/31003) og 400 mg, 0,667 mmol ST 983 ble løst i 20 ml kloroform.

Etter eliminering av de siste sporene av kloroform ved hjelp av en vakuumpumpe, ble 26 ml tert-butylalkohol tilsatt til lipidfilmen, og løsningen således oppnådd ble underoppdelt i 12 fraksjoner som umiddelbart ble nedfrosset til -70°C med flytende nitrogen og lyofilisert i 24 timer. Hver fraksjon fast stoff inneholdt CPT 83 (0,525 mg) og ST 983 (33,33 mg).

For å oppnå den endelige liposomsuspensjonen ble det lyofiliserte produktet hydratisert ved anvendelse med vann (1000 ul) eller annen saltvannsløsning og rørt i 10 minutter.

MLV-liposomer ble oppnådd.

Testing av fysisk stabilitet av sammensetningen

Den fysiske stabiliteten til preparatet ble testet ved hjelp av turbidimetri med avlesning på en TDC ("Time Drive Curve") ved 800 nm, ved 20°C, i 20 timer.

Testing av kjemisk stabilitet av CPT 83 ved fremstillingen

Den kjemiske stabiliteten til CPT 83 ble testet med HPLC.

De kromatografiske betingelsene var som følger:

Kolonne: Supelcosil LC-ABZ

Eluent: fosfatbuffer 20 mnrmetanol 40:60, pH = 7,3

Detektor UV-VIS: 360 nm

Strømningshastighet: 1 ml/min.

Retensjonstid: 4,033 min.

CTP 83-konsentrasjon, bestemt mot en standard, var 0,502 mg/ml.

Prosent innkapslet CPT 83 var 99%.

EKSEMPEL 15

Fremstilling av CPT 83-ST 983 SUV-liposomer (1:40)

6,3 mg, 0,0168 mmol CPT 83 og 400 mg, 0,667 mmol ST 983 ble løst i 20 ml kloroform.

Etter eliminering av de siste sporene av kloroform ved hjelp av en høyvakuumpumpe, ble 26 ml tert-butylalkohol tilsatt til lipidfilmen, og løsningen således oppnådd ble underoppdelt i 12 fraksjoner som umiddelbart ble frosset til -70°C med flytende nitrogen og lyofilisert i 24 timer. Hver fraksjon fast stoff inneholdt CPT 83 (0,525 mg) og ST 983 (33,33 mg).

For å oppnå den endelige SUV-liposomsuspensjonen ble det lyofiliserte produktet, hydratisert ved anvendelse med vann (1000 ul), lydbehandlet i 40 minutter ved 0°C.

Filtrering ble utført på et 400 nm filter for å eliminere spor av titan frigitt av den lydbehandlede proben.

Testing av kjemisk stabilitet av CPT 83 i sammensetningen

Den kjemiske stabiliteten til CPT 83 ble testet ved HPLC.

De kromatografiske betingelsene var som følger:

Kolonne: Supelcosil LC-ABZ

Eluent: fosfatbuffer 20 mm:metanol 40:60, pH = 7,3

Detektor UV-VIS: 360 nm

Strømningshastighet: 1 ml/min.

Retensjonstid: 4,033 min.

CTP 83-konsentrasjon, bestemt mot en standard, var 0,3 mg/ml.

Prosent innkapslet CPT 83 var 59%.

HPLC-analyse gjentatt etter 24 timer avdekket ingen nye topper forskjellig fra CPT 83-toppen, som indikerer stabiliteten til forbindelsen.

Testing av fysisk stabilitet av sammensetningen

Den fysiske stabiliteten til preparatet ble testet ved hjelp av turbidimetri med avlesning på en TDC ("Time Drive Curve") ved 600 nm, ved 20°C, i 20 timer.

EKSEMPEL 16

Fremstilling av CPT 184-ST 983 MLV-liposomer (1:40)

7,29 mg, 0,0168 mmol CPT 184 og 400 mg, 0,667 mmol ST 983 ble løst i 20 ml kloroform.

Etter eliminering av de siste sporene av kloroform ved hjelp av en vakuumpumpe, ble 26 ml tert-butylalkohol tilsatt til lipidfilmen, og løsningen således oppnådd ble underoppdelt i 12 fraksjoner som umiddelbart ble frosset ned til -70°C med flytende nitrogen og lyofilisert i 24 timer. Hver fraksjon fast stoff inneholdt CPT 184 (0,607 mg) og ST 983 (33,33 mg).

MLV-liposomer ble oppnådd.

Testing av fysisk stabilitet av sammensetningen

Den fysiske stabiliteten til preparatet ble testet ved hjelp av turbidimetri med avlesning av en TDC ("Time Drive Curve") ved 600 nm, ved 20°C, i 20 timer.

En konstant turbiditetstrend som indikerer stabiliteten til preparatet, ble avlest, uten noe presipiteringsfenomen.

Testing av kjemisk stabilitet til CPT 184 i sammensetningen

Den kjemiske stabiliteten til CPT 184 ble testet ved HPLC.

De kromatografiske betingelsene var som følger:

Kolonne: Supelcosil LC-ABZ

Eluent: fosfatbuffer 20 mm:metanol 40:60, pH = 7,3

Detektor UV-VIS: 360 nm

Strømningshastighet: 1 ml/min.

Retensjonstid: 25,5 min.

CTP 184-konsentrasjon, bestemt mot en standard, var 0,600 mg/ml.

Prosent innkapslet CPT 184 var 99%.

EKSEMPEL 17

Fremstilling av CPT 184-ST 983 SUV-liposomer (1:40)

Etter eliminering av de siste sporene av kloroform ved hjelp av en høyvakuumpumpe, ble 26 ml tert-butylalkohol tilsatt til lipidfilmen, og løsningen således oppnådd ble underoppdelt i 12 fraksjoner som umiddelbart ble frosset ned til -70°C med flytende nitrogen og lyofilisert i 24 timer. Hver fraksjon fast stoff inneholdt CPT 184 (0,607 mg) og ST 983 (33,33 mg).

For å oppnå den endelige SUV-liposomsuspensjonen ble det lyofiliserte produktet hydratisert med vann (1000 ul), lydbehandlet i 40 minutter ved 0°C.

Testing av kjemisk stabilitet av CPT 184 i sammensetningen

Den kjemiske stabiliteten til CPT 184 ble testet ved HPLC.

De kromatografiske betingelsene var som følger:

Kolonne: Supelcosil LC-ABZ

Eluent: fosfatbuffer 20 mm:metanol 40:60, pH = 7,3

Detektor UV-VIS: 360 nm

Strømningshastighet: 1 ml/min.

Retensjonstid: 25,5 min.

CTP 184-konsentrasjon, bestemt mot en standard, var 0,36 mg/ml.

Prosent innkapslet CPT 184 var 70%.

HPLC-analyse gjentatt etter 24 timer avdekket ingen nye topper forskjellig fra CPT 184-toppen, hvilket indikerer stabilitet til den aktive ingrediensen.

Testing av fysisk stabilitet av sammensetningen

I de følgende eksempler ble liposomer fremstilt ved anvendelse av hjelperlipider og/eller kryobeskyttende midler.

EKSEMPEL 18

Fremstilling av CPT 184-ST 983 liposomer

I en 21 kolbe ble 100 ml metylkloroform tilsatt til 20 mg CPT 184 og 600 mg ST 983 og blandingen ble forsiktig varmet til fullstendig oppløsning. Løsningen som ble oppnådd ble konsentrert på en rotavapor til en lipidfilm ble oppnådd, som ble ytterligere tørket i to timer på en høyvakuumpumpe. Lipidfilmen ble hydratisert med en laktoseløsning (6 g/300 ml vann) ved 45°C og holdt under røring i rotavaporen i 2 timer. Suspensjonen ble deretter lydbehandlet i 2 timer, hvor hver cykel tok en halv time. Deretter ble produktet filtrert gjennom et 200 nm filter og lyofilisert.

Testing av kjemisk stabilitet av CPT 184 i sammensetningen

Den kjemiske stabiliteten til CPT 184 ble fastslått ved HPLC. Produktet var stabilt i løpet av 24 timer med testing.

Testing av fysisk stabilitet av sammensetningen

Den fysiske stabiliteten til preparatet ble testet ved hjelp av turbidimetri. Produktet var stabilt gjennom 24-timers testen. Partikkelstørrelsen var også stabil (middelverdi på 100 nm).

EKSEMPEL 19

Fremstilling av CPT 184-ST 983 liposomer

For 1 ml liposomal formulering (POPC - l-palmitoyl-2-oleoyl fosfatidylkolin 5 mm; ST 983 1,25 mm; CPT 184 0,25 og trehalose 150 mm), ble den følgende fremgangsmåte anvendt: 0,11 mg, 0,25 umol CPT 184 ble løst i 250 ul etylacetat, 3,79 mg, 4,89 umol POPC ble løst i 100 ml etanol og 0,74 mg, 1,25 umol ST 983 ble løst i 100 |al etanol. De tre løsningene ble blandet sammen og virvlet. Løsningene ble fordampet med en rotavapor ved romtemperatur, 80 mbar. Lipidfilmen ble tørket i to timer i mørket. Lipidfilmen ble suspendert i 1 ml av en 150 mm D(+)-trehalosedihydrat (Fluka, HPLC 99%) løsning, sterilisert gjennom et 0,22 mm filter og virvlet i to minutter. Suspensjonen ble ekstrudert 21 ganger gjennom 200 nm polykarbonatfilter. Den ekstruderte liposomsuspensjonen ble frosset i flytende nitrogen og lyofilisert i 2 netter. Et hvitt fast stoff ble oppnådd.

EKSEMPEL 20

Fremstilling av CPT 184-ST 983 liposomer

Samme fremgangsmåte som i eksempel 19 ble anvendt unntatt at trehalose 500 mm ble anvendt.

Antikreftaktivitet til ST 983 liposom-antikreftmiddelkompleks

Som det fremgår nedenfor, viser ST 983 liposomet fremherskende akkumulering i lungene. Denne karakteristikken av setespesifisitet favoriserer dets anvendelse i en murinmodell av pulmonar karsinogenese.

Antikreftmidlet anvendt i dette eksperimentet var taksol.

For å indusere tumoren in-vivo, mottok ikke-anestesibehandlede Balb/c mus injeksjoner av 3xl0<5> celler murin pulmonar karsinom M109 i 0,1 ml RPMI-1640 (Sigma) i quadriceps femoris til den høyre bakpoten.

Ti dager etter implantering av tumoren ble liposom-taksolkomplekset fortynnet med fosfatbufret saltvannsløsning (PBS, SIGMA, P-4417) og injisert intravenøst ved en konsentrasjon på 2,5 mg/ml av ST 983 og 75 ug/ml taksol.

Taksol (paclitaxel INDENA) anvendt som en kontroll ble løst i kremoforvehikel EL (BASF) ved en konsentrasjon på 20 mg/ml og lagret ved +4°C i de neste 24 timene, beskyttet mot lyset. Ved anvendelsen ble løsningen fortynnet med fosfatbufret saltvannsløsning (PBS, SIGMA) og injisert intravenøst i samme volum og konsentrasjonsbetingelser som beskrevet for taksol transportert av ST 983 liposomet.

Kremoforen ble fremstilt ved å fortynne 1:1 med etylalkohol.

Administrasjoner ble gitt i syv etterfølgende dager som startet fra dag 10 etter inokulering av tumoren. Dyrene ble holdt under observasjon opp til dag 17 post-inokulasjon og avlivet ved cervical dislokasjon, og deres lunger ble fjernet for bestemmelse av antallet metastaser. Beising av lungene for å dektere metastaser ble gjort ved å inkubere lungene i 10 dager i 5 ml Bouins løsning, som består av 71% mettet pikrinsyreløsning, 4,8% iseddiksyre (Merck) og 24% 10% formaldehyd (Fluka). Ved slutten av inkuberingsperioden i Bouins løsning ble antallet metastaser talt.

Sammenlignet med ubehandlede kontrollmus viste kremofortransportert taksol ingen redusert effekt på antallet lungemetastaser, selv om sistnevnte var mindre enn de til ubehandlede kontroller, mens taksol kompleksert med ST 983 liposom viste en signifikant reduksjon både i antall og størrelse lungemetastaser.

Statistisk analyse av dataene for antallet lungemetastaser ble gjort ved anvendelse av Mann-Whitney ikke-parametriske tester for uparede data.

Resultatene som ble oppnådd er presentert i tabell 1 nedenfor.

In-vitro cytotoksitetstester

Toksisitetsundersøkelsene ble gjort på HeLa og Ml09 celler i 96-brønns plater. Etter avsetning på platene, ble cellene behandlet med molekylene som ble testet i de neste 48 timene. Cellene ble deretter vasket med PBS og utsatt for normale vekstbetingelser i 48 timer. Etter fjerning av vekstmediet ble cellene inkubert på is med 16% TC A, vasket 3 ganger i H2O, behandlet i 30 minutter med sulforhodamin B (SRB) i 1% eddiksyre, vasket 3 ganger i 1% eddiksyre alene, inkubert i 20 minutter i TRIS 10 mm pH 10,5 og til slutt ble avlesninger gjort ved 540 nm.

Cytotoksisitetstester med CPT 83

In-vitro cytotoksisitetstester med CPT 83 ble utført for å evaluere cytotoksisiteten til antikreftmidlet kompleksert med liposomet, som en forhåndsindikasjon på effektiv aktivitet.

For å evaluere evnen liposomet har til å transportere CPT 83 in-vitro i Ml 09 celler, ble sulforhodamin B testen beskrevet ovenfor anvendt.

I tillegg ble cytotoksisiteten til CPT 83 løst i dimetylsulfoksid (DMSO) også evaluert sammenlignet med den for samme molekyl kompleksert med ST 983 liposomet.

Liposom-CPT 83 komplekset ble anvendt i cytotoksisitetsundersøkelsene ved konsentrasjonene indikert i tabellene 2.1, 2.2 og 2.3 nedenfor både i SUV- og MLV-konfigurasjoner. Liposom:CPT 83 molart forhold som ble anvendt var 40:1.

Midlere cytotoksisitetsverdier for ST 983-CPT 83 kompleksene i både i SUV- og MLV-konfigurasjonene gitt i tabellene 2.1, 2.2 og 2.3 nedenfor, indikerer at ST 983 liposomet er i stand til å transportere CPT 83 langt på samme måte som DMSO, som presenterer cytotoksisitetsnivåer i samme størrelsesorden.

Verdiene gitt i tabellen refererer til optiske tetthetsavlesninger ved 540 nm.

Biologisk aktivitet til ST 983 liposom-CPT 184 kompleks

Den biologiske aktiviteten til liposomene i eksempel 18 (under navngitt liposom A) og i eksempel 20 (under navngitt liposom B) ble testet.

Toksisitet i friske mus

Liposomene A og B ble gitt oralt, intravenøst, sammenlignet med fritt CPT 184, ved en dose på 1,2 mg/kg ifølge q4dx4-skjemaet. De to liposomene hadde ikke signifikante effekter på vekten av kroppen, lungen, milten og nyrene. Liposom B, intravenøst, og liposom A, oralt som ble gitt påvirket tymusvekten tilsvarende fritt CPT 184. Intravenøst liposom A hadde kun minimal effekt. Hematologiske parametre viste ingen signifikante variasjoner etter 24 timer, med begge liposomene. Liposom A, gitt intravenøst ifølge qd5-skjemaet viste en toksisitet sammenlignbar med fritt CPT 184.

Lungetropisme av liposomer

Liposomer A og B viste fremherskende akkumulering i lungen. Liposomene ble gitt i.v. 1,2 mg/kg. Fritt CPT 184 ble gitt oralt 1,2 mg/kg i DMSO. Dyrene, friske mus, ble avlivet 24 timer etter siste administrasjon. Lungene ble skåret ut og frosset i flytende nitrogen. Idet de tinte, ble organene samlet og homogenisert i en 0,1% eddiksyre/acetonitril 1:5-løsning. Homogenater ble oppdelt i tre porsjoner, hvor to av dem ble tilsatt CPT 184 for utvinningsberegning. De tre prøvene ble sentrifugert ved 16.000 g i 5 minutter. Supernatanter ble samlet og ekstrahert med diklormetan. Den organiske fasen ble tørket med en speedvac og residuet ble løst i acetonitril for å få mengden som korresponderer til et dyr i 50 ul for anvendelse ved HPLC. HPLC ble kjørt på en Waters Symmetry Cl8 3,5 um (4,6 x 7,5 mm). Et Merck-fluorimeter var detektoren ved 370 nm eksitasjon og 510 nm emisjon. Eluenten var vann/acetonitril 60:40, isokratisk. Prøvevolumet var 50 ul. CPT 184 utvunnet var ca. 70%. Både liposomer A og B hadde et akkumuleirngsnivå for CPT 184 høyere enn fritt CPT 184 i DMSO, som vist i fig. 3.

GENAVLEVERING

Fremstilling av liposom-DNA kompleks

Liposom og plasmid DNA ble hensiktsmessig fortynnet separat i PBS. DNA ble deretter tilsatt til liposomet og liposom-DNA komplekset ble stående i ca. 30 minutter ved 4°C for å lette dannelsen av en stabil liposom-DNA interaksjon.

I in-vitro eksperimentene ble l,2-dioleoyloksy-3-tirmetylammoniumpropan (DOTAP) anvendt som et referansekationisk lipid; 2,5 ug plasmid DNA ble anvendt pr. 2x10<5 >HeLa celler og liposomkonsentrasjonen var 9 uM.

I in-vivo eksperimentene ble både DOTAP og [2,3-(dioleoyl)propyl]trimetylammonium (DOTMA) anvendt som referansekationiske lipider.

Molarforholdene definert i resultatene refererer til nmol konsentrasjoner av de respektive kationiske lipider pr. mg DNA.

I in-vivo transfeksjonseksperimentene ble 25 ug plasmid DNA pr. dyr anvendt.

Plasmid pCMVluc anvendt i disse eksperimentene inneholdt cDNA til luciferansegenet under transkripsjonal kontroll av cytomegalovirus (CMV) promotoren.

Kvantitativ bestemmelse av lucifereaseaktivitet

Proteinluciferaseaktivitet i celler og vev ble bestemt ved anvendelse av Boehringer Mannheim-kit (kat. nr. 1669 893).

Cellene ble vasket 3 ganger i PBS og deretter fjernet fra platen med en skrape i lyseringsbuffer (100 mm kaliumfosfat, pH 7,8,1 mm ditiotreitol - DTT) og gjort til gjenstand for tre etterfølgende cykler med nedfrysing og tining. Etter sentrifugering i 1,5 ml Eppendorf-rør ble supernatanten anvendt for luminescenstest ikke mer enn 5 timer etter ekstraksjon av proteinene. Luminescensemisjonsmålingene ble gjort ved anvendelse av et luminometer ved 562 nm. Etter en første nedfrysing i flytende N2 fulgt av fin knusing for å oppnå et pulver, ble vevene resuspendert i lyseringsbuffer og inkubert i 10-15 minutter på is.

Prøvene ble deretter sentrifugert i 2 ml Eppendorf-rør og supernatanten ble testet for luciferaseakti vitet.

Dot-blot analyse

Cellulær DNA ble ekstrahert ifølge alkalilyseringsfremgangsmåten beskrevet av Sanbrook. Fritsch og Maniatis i Molecular Cloning, 1989. 5 ug av DNA ekstrahert fra cellene ble preabsorbert på nylonfilteret (Boehringer) ved anvendelse av Biorad dob-blot-apparat. Filtrene ble deretter prehybridisert i 4 timer ved 65°C med en løsning som inneholdt 0,5 M natriumpyrofosfat (NaPi), 1 mm EDTA, 7% SDS. Proben merket med P(alfa) ble fremstilt ved anvendelse av plasmid pCMVluc NDA som et templat og det randomiserte primede Amersham Kit. Filteret ble hybridisert i samme prehybridiseringsbuffer i 12 timer ved 42°C ved anvendelse av lxlO<6> CPM/ml. Filteret ble deretter gjort til gjenstand for 3 10-minutters vaskinger ved 65°C i en buffer som inneholdt 40 mm NaPi, 1% SDS. Autoradiogramanalysen ble utført ved hjelp av en fosforavbilder som anvender fosforrastere aktivert ved beta-stråling som avleses og kvantifiseres ved hjelp av et fotomultiplikatorsystem sammen med et bildeanalyseprogram. Densitometri utført på dot-blot ble gjort ved anvendelse av et IP-LabGel bildeanalyseprogram.

Plasmid DNA-transfeksjonstester

Et antall plasmid DNA-transfeksjonstester ble utført både in-vitro og in-vivo.

Både DOT AP og DOTMA ble anvendt som referansekationlipider, hvor transfeksjonskapasiteten av disse har blitt rikelig karakterisert og beskrevet av Abkenet et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 1993, 90, 6518.1 in-vivo eksperimentene ble forskjellige molare forhold mellom kationiske lipider og plasmid DNA analysert for å bestemme aktiviteten til de kationiske lipidene og de respektive mest effektive konsentrasjonene for genoverføring. Transfeksjonskapabiliteten til de forskjellige liposomene ble evaluert både in-vitro og in-vivo ved anvendelse av luciferasegentranssportør som inneholdt pCMVluc-plasmidet hvor aktiviteten til denne gitt som relative luminescensenheter (RLU) (beskrevet tidligere) ble gjort for enkel kvantifisering.

Som et alternativ ble transfeksjonseffektiviteten til et antall kationiske liposomer evaluert ved hjelp av densitometrisk analyse (fosforavbildning) av prøver av DNA ekstrahert fra transfekterte celler preabsorbert på nitrocelluosefiltre (dot-blot) og hybridisert med P-merkede plasmid DNA-markører, som beskrevet tidligere.

In-vivo transfeksjonstester

Avhengighet av in-vivo transfeksjonseffektivitet på ST 983 liposom:DNA molart forhold

I dette eksperimentet ble avhengigheten av lever, lunge og

hjertetransfeksjonseffektivitet på ST 983 liposom:plasmid DNA molart forhold evaluert. Følgende nmol forhold av liposom pr. ug DNA ble testet: 12:1, 24:1, 36:1 og 48:1.

Grupper av 6 Balb/c mus som veide ca. 20 g ble behandlet intravenøst med de ovenfor nevnte mengdene av liposom-DNA kompleks i 200 ul volumer av PBS og ble avlivet 24 timer etter administrasjon av komplekset.

Luciferaseaktiviteten ekstrahert fra lungen, hjertet og levervevet avdekket en fremtredende lungefordeling av luciferase ved alle molarforholdene analysert. I virkeligheten ble ca. 99% av den totale luciferase ekstrahert fra de tre vevene lokalisert i lungene. Liposom:DNA molarforholdet på 12:1 viste seg å være det beste. Resultatene oppnådd er presentert i tabell 3 nedenfor.

Avhengighet av in-vivo transfeksjonseffektivitet på forskjeller mellom SRT 983 liposompreparater

Luciferaseaktivitetsverdier, som relative luminescensenheter (RLU), ekstrahert fra lungene til Balb/c mus behandlet intravenøst med forskjellige ST 983 liposompreparater ved et liposom:DNA molart forhold på 12:1, er rapportert i tabell 4.

De oppnådde dataene viser, i tillegg til å demonstrere at ST 983 liposomet er i stand til å transportere plasmid DNAI in vivo, med effektivitetsratinger høyere enn og/eller sammenlignbare med de for DOTMA, også en variasjon blant de forskjellige ST 983 preparatene. Dette kan være på grunn av et antall fysiokjemiske karakteristikker slike som størrelsen til de liposomale vesiklene, eller de relative andelene av vesikler i relasjon til den unilamellære (SUV) eller multilamellære strukturen til de forskjellige T 983 preparatene. Når det gjelder fakta, har de fysiokjemiske parametrene listet ovenfor blitt inngående beskrevet som avgjørende for å oppnå optimal in-vivo og in-vitro transfeksjonseffektivitet av R.I. Mahato et al., Human Gene Therapy 9,1998:2083.

Avhengighet av in-vivo transfeksjonseffektivitet på ST 983-DNA liposomkompleks preinkubasjonstid

Tabell 5 presenterer relative luminescensenheter ekstrahert fra leveren, lungen og hjertet til mus behandlet intravenøst med ST 983 liposom forhåndsinkubert med plasmid DNA i 30 minutter eller i 3 timer før administrasjon. Dyrene behandlet med ST 983 preinkubert i 3 timer med DNA viser en ca. 5-dobbelt økning i luciferaseaktivitet i lungen og hjertet sammenlignet med de som behandles med samme liposom preinkubert i 30 minutter. Dette resultatet viser at dannelsen av et stabilt liposom-DNA kompleks er et tidsavhengig fenomen og spiller en kritisk rolle som en avgjørende faktor i in-vivo transfeksj onseffekti vitet.

Plasmid DNA-transfeksjon i HeLa celler med ST 772 liposom

Fig. 1 og 2 viser plasmid DNA-transfeksjonseffektivitet til ST 772 liposom i HeLa celler. For dette formålet ble densitometrisk analyse av DNA ekstrahert fra cellene transfektert med ST 272 og med DOT AP som referansekationlipidet utført. Resultatene av denne blot-analysen viser mengder plasmid DNA i samme størrelsesorden som de som de som oppnås med DOT AP.

Claims

1. Forbindelser, karakterisert ved formel (I) hvor: ner et heltall fra 1 til 3; R er hydrogen eller alkanoyl, rett eller forgrenet, med 2-6 karbonatomer; Ri og R2, som kan være like eller forskjellige, representerer en mettet eller umettet rett acylkjede, med 3-20 karbonatomer; og X" er anionet til en farmakologisk akseptabel syre.

2. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at R er utvalgt fra gruppen som består av acetyl, propionyl, butyryl, valeryl og isovaleryl.

3. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at Ri og R2 er utvalgt fra gruppen som består av heksanoyl, undekanoyl, myristoyl, palmitoyl eller oleoyl.

4. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at X" er utvalgt fra gruppen som består av klorid; bromid; jodid; aspartat; syreaspartat; citrat; syrecitrat; tartrat; syretartrat; fosfat; syrefosfat; fumarat; syrefumarat; glycerofosfat; glukosefosfat; laktat; maleat; syremaleat; mukat; orotat; oksalat; syreoksalat; sulfat; syresulfat; trikloracetat; trifluoracetat; metansulfonat; pamoat og syrepamoat.

5. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at den er utvalgt fra gruppen som består av: - ester av L-karnitinbromid med 2-hydroksyacetyl-l,3-dipalmitoylglycerol; - ester av acetyl L-karnitinbromid med 2-hydroksyacetyl-l,3-dipalmitoylglycerol; - ester av propionyl L-karnitinbromid med 2-hydroksyacetyl-l,3-dipalmitoylglycerol; - ester av isobutyryl L-karnitinbromid med 2-hydroksyacetyl-l,3-dipalmitoylglycerol; - ester av isovaleryl L-karnitinbromid med 2-hydroksyacetyl-l,3-dipalmitoylglycerol; - ester av L-karnitinbromid med l,3-diheksanoyl-2-hydroksyacetylglycerol; - ester av acetyl L-karnitinbromid med l,3-diheksanoyl-2-hydroksyacetylglycerol; - ester av propionyl L-karnitinbromid med l,3-diheksanoyl-2-hydroksyacetylglycerol.

6. Anvendelse av en forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5 for fremstilling av liposomer.

7. Liposom, karakterisert ved at det innbefatter en forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5.

8. Liposom ifølge krav 7, karakterisert ved at det ytterligere inneholder hjelperlipider.

9. Liposom ifølge krav 8, karakterisert ved at nevnte hjelperlipid er utvalgt fra gruppen som består av kolesterol, l-palmitoyl-2-oleoyl-fosfatidylkolin eller dioleylfosfatidylkolin.

10. Anvendelse av et liposom ifølge et hvilket som helst av kravene 7-9, for fremstilling av en sammensetning anvendelig for transport av farmakologisk aktive forbindelser.

11. Anvendelse ifølge krav 10, hvor den farmakologisk aktive forbindelsen er et naturlig forekommende eller modifisert plasmid eller polynukleotid.

12. Anvendelse ifølge krav 11, hvor plasmidet eller polynukleotidet er anvendbart i genterapi.

13. Anvendelse ifølge krav 11, hvor plasmidet eller polynukleotidet koder for et peptid eller protein anvendelig som en vaksine.

14. Anvendelse ifølge krav 10, hvor den aktive forbindelsen er et legemiddel.

15. Anvendelse ifølge krav 14, hvor nevnte legemiddel er utvalgt fra gruppen som består antikreft, antiangiogeniske, antivirale, antibakterielle, antifungale, antiprotozoane midler, forbindelser aktive på det kardiovaskulære systemet eller immunogene peptider.

16. Anvendelse ifølge krav 15, hvori nevnte legemiddel er et anticancer- eller antiangiogenisk middel.

17. Anvendelse ifølge krav 16, hvor nevnte anticancermiddel er utvalgt fra gruppen som består av taksol eller et kamptotecinderivat.

18. Anvendelse ifølge krav 17, hvor nevnte derivat av kamptotecin er utvalgt fra gruppen som består av - 7-karbonitrilkamptotecin; - 7-benzyloksyiminometylkamptotecin, og - 7-butoksyiminometylkamptotecin.

19. Anvendelse av et liposom ifølge krav 7-9 for fremstilling av en kosmetisk sammensetning.

20. Farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at den innbefatter et liposom ifølge kravene 7, 8 eller 9.

21. Sammensetning ifølge krav 20, karakterisert ved at nevnte liposom inneholder en farmakologisk aktiv forbindelse.

22. Sammensetning ifølge krav 21, karakterisert ved at den aktive forbindelsen er et naturlig forekommende eller modifisert plasmid eller polynukleotid.

23. Sammensetning ifølge krav 22, karakterisert ved at plasmidet eller polynukleotidet er anvendelig i genterapi.

24. Sammensetning ifølge krav 22, karakterisert ved at plasmidet eller polynukleotidet koder for et peptid eller protein anvendelig som en vaksine.

25. Sammensetning ifølge krav 21, karakterisert ved at nevnte forbindelse er utvalgt fra gruppen som består antikreft, antiangiogeniske, antivirale, antibakterielle, antifungale, antiprotozoane midler, forbindelser aktive på det kardiovaskulære systemet eller immunogene peptider.

26. Sammensetning ifølge krav 20-25, karakterisert ved at den kan administreres oralt, parenteralt, intravenøst, intramuskulært, subkutant, transdermalt eller i form av en nasal- eller munnspray.

27. Kosmetisk sammensetning, karakterisert ved at den innbefatter et liposom ifølge et hvilket som helst av kravene 7-9.

28. Sammensetning ifølge krav 27, karakterisert ved at nevnte liposom inneholder en substans med kosmetisk aktivitet.