DE60017388T2 - Ester des l-carnitin oder alkanoyl l-carnitin zur verwendung als kationische lipide für die intrazelluläre verabreichung therapeutischer stoffe - Google Patents

Ester des l-carnitin oder alkanoyl l-carnitin zur verwendung als kationische lipide für die intrazelluläre verabreichung therapeutischer stoffe Download PDF

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Description

  • Die hierin beschriebene Erfindung betrifft eine Klasse von neuen Estern von L-Carnitin und Acyl-L-carnitinen und deren Verwendung als kationische Lipide, die zur Favorisierung der intrazellulären Freisetzung von pharmakologisch aktiven Verbindungen, wodurch deren Transmembrantransport erleichtert wird, oder zur Förderung ihrer Wechselwirkung mit spezifischen Zellmembranstellen (Rezeptoren) geeignet sind.
  • Die hierin beschriebene Erfindung betrifft ebenfalls weitere bekannte Ester von L-Carnitin und Acyl-L-carnitinen, die für die gleichen Zwecke wie die oben erwähnten neuen Verbindungen nützlich sind.
  • Mit dem Ausdruck "intrazelluläre Freisetzung" ist die zelluläre Transfizierung mit Polynukleotiden oder Plasmiden natürlichen Ursprungs oder mit Modifizierung, die eine therapeutische Aktivität (Gen-Freisetzung) aufweisen, oder die Einführung von Arzneimitteln oder immunogenen Peptiden in Zellen gemeint.
  • Viele der pharmakologisch aktiven Substanzen wie beispielsweise Polypeptide und Proteine oder Arzneimittel im allgemeinen müssen in Zellen eindringen, um ihre Wirkungen auszuüben, indem Zellfunktionen beim subzellulären oder molekularen Niveau beeinflußt werden. Für diese Moleküle macht die Zellmembran eine selektiv impermeable Sperre aus. Die Zellmembran übt tatsächlich eine Schutzfunktion aus, wodurch der Eintritt von möglicherweise toxischen Substanzen, aber ebenfalls die Passage von Verbindungen mit therapeutischer Aktivität verhindert wird. Die komplexe Zusammensetzung der Zellmembran umfaßt Phospholipide, Glycolipide und Proteine; deren Funktion wird durch cytoplasmatische Komponenten wie Ca++ und andere Ionen, ATP, Mikrofilamente, Mikrotubuli, Enzyme und Proteine, die Ca++ binden, beeinflußt. Die Wechselwirkung zwischen den strukturellen und cytoplasmatischen Komponenten der Zellen und die Antwort auf externe Signale sind für die Selektivität verantwortlich, die von den verschiedenen unterschiedlichen Zelltypen und unter diesen gezeigt wird. Die Schutzwirkung der Membranen kann durch Kombinieren von Substanzen in Komplexen mit Lipid-Formulierungen überwunden werden, die die Zusammensetzung von natürlich auftretenden Membranlipiden reproduzieren. Diese Lipide sind in der Lage mit den Membranen zu verschmelzen und die Substanzen freizusetzen, die mit diesen in den Zellen kombiniert sind. Die Lipid-Komplexe sind nicht nur in der Lage, den intrazellulären Transfer mit Hilfe der Fusion mit den Membranen zu erleichtert, sondern können ebenfalls die Ladungsabstoßung zwischen der Membran und dem Molekül, das in die Zelle penetrieren muß, vermindern. Amphiphatische Lipide wie Membranphospholipide bilden Lipidbläschen oder Liposomen in den wäßrigen Systemen.
  • Liposomen sind Bläschen, in denen ein wäßriges Volumen vollständig durch eine oder mehrere Membranen eingeschlossen ist, die sich aus Lipidmolekülen, üblicherweise Phospholipiden zusammensetzen. Phospholipide, die aus einem hydrophilen Kopf und einem Paar von Kohlenstoffketten (hydrophober Schwanz) bestehen, sind die Hauptkomponenten von biologischen Membranen. In einer wäßrigen Lösung erfolgt eine Autoassoziierung der hydrophoben Schwänze, zum Ausschluß von Wasser, während die hydrophilen Köpfe mit dem Medium wechselwirken, unter spontaner Bildung von Populationen von Bläschen mit unterschiedlichen Durchmessern. Die Lipide sind im allgemeinen zwitterionisch, neutral oder anionisch. Diese Bläschen können als Träger für Arzneimittel, kleine Moleküle, Proteine, Nukleotide und Plasmide verwendet werden.
  • In den letzten Jahren wurden die kationischen Liposomen, eine Klasse von positiv geladenen Bläschen, hergestellt aus synthetischen Lipiden, intensiv für den Transfer von genetischem Material in Zellen verwendet. Die negative Ladung von DNA kann mit den positiven Ladungen der kationischen Lipide wechselwirken, unter Bildung eines stabilen DNA-Liposom-Komplexes. Die Einfachheit und Vielseitigkeit dieser Technologie haben die Liposome zu einem wichtigen Träger für die Freisetzung von Genen für die Gentherapie bei Menschen gemacht. Gegenwärtig umfassen die meisten Vektoren, die für die Gentherapie verwendet werden und von dem NIH-Recombinant Advisory Committee akzeptiert werden, virale und synthetische Systeme.
  • Eine Virusinfektion beinhaltet eine Serie von komplexen Mechanismen, um in der Lage zu sein, eine spezifische Zelle zu attackieren und die DNA in den Kern zu tragen. Die Rationale für die Verwendung von Virusvektoren für die Gentherapie basiert auf der Möglichkeit des Ersatzes der viralen Gene durch Gene, die eine therapeutische Funktion codieren, ohne die Fähigkeit des Viruspartikels zum Infizieren der Zellen zu eliminieren. Die Beschränkungen der Virustherapie haben mit solchen viralen Elementen zu tun, die immunogen, cytopathisch und rekombinogen sein können.
  • Große Hoffnungen gibt es bezüglich der Verwendung von kationischen Lipiden für die Gentherapie. Diese Vektoren weisen ein großen Potential im Vergleich zu solchen biologischen Ursprungs auf, weil sie viel sicherer, weniger toxisch und ebenfalls in der Lage sind, Gene mit großer Größe einzufügen. Im Vergleich zu den Vektoren vom biologischen Typ haben sie jedoch eine geringe intrazelluläre Gen-Transkriptionsausbeute. Es sollte jedoch berücksichtigt werden, daß sich die Verwendung solcher Transfektionssysteme in der Anfangsstufe der Forschung befindet. Kationische Lipide spielen eine sehr wichtige Rolle bei der Bildung des DNA-Lipid-Komplexes, bei der Zell-Komplex-Wechselwirkung, bei der Fusion mit der Membran, bei der DNA-Freisetzung im Inneren der Zelle und bei der Transkription.
  • Es gibt wichtige Beispiele der in vivo-Anwendungen von kationischen Liposomen. Der erste klinische Versuch bei der Gentherapie wurde durch Einführen eines Expressionsvektors durchgeführt, umfassend das menschliche Liposom-komplexierte HLA-B7-Gen für die Behandlung von Melanomen. Eine andere wichtige Anwendung betrifft die Behandlung von pulmonarer cystischer Fibrose mit Hilfe der Verabreichung über die pulmonare Route oder als Nasenspray des Liposom-komplexierten Expressionsvektors SV-40C-FTR. Andere klinische Versuche, die die Verwendung von Liposomen bei der Gentherapie für Krebs beinhalten, laufen zur Zeit.
  • Vier Bestandteilselemente werden im allgemeinen bei der Struktur von kationischen Lipiden identifiziert: der positiv geladene kationische Kopf, der Abstandshalter, das Ankerlipid und die Linkerbindung.
  • Der kationische Kopf ist für die Wechselwirkungen zwischen kationischen Liposomen und DNA, zwischen dem DNA-Liposom-Komplex und der Zellmembran und den anderen Komponenten der Zellen verantwortlich. Er besteht aus mono- oder polykationischen Gruppen (in Abhängigkeit von der Anzahl der Ladungen), die variabel substituiert sein können.
  • Der Abstandshalter ist der Teil des Moleküls, der den kationischen Kopf von dem hydrophoben Schwanz trennt, und ist bei der Sicherstellung eines optimalen Kontaktes zwischen dem kationischen Kopf und den negativen Ladungen der DNA-Phosphate involviert.
  • Das Ankerlipid ist der nicht-polare Kohlenwasserstoffteil des Moleküls und bestimmt die physikalischen Eigenschaften der Doppellipidschicht wie die Steifheit davon und die Rate des Austausches mit Membranlipiden.
  • Mit in "Linkerbindung" ist die Bindung zwischen den Kohlenwasserstoffketten und dem Rest des Moleküls gemeint. Diese Bindung bestimmt die chemische Stabilität und Bioabbaubarkeit der kationischen Lipide.
  • In den letzten Jahren hat sich die Verwendung von Liposomen ständig auf dem kosmetischen Sektor erhöht. Der Erfolg von Liposomen auf diesem Gebiet liegt in der Tatsache, daß diese Verbindungen von der Haut sehr gut toleriert werden. Sie werden als Träger für aktive Bestandteile ebenso wie als Verbindungen verwendet, die die Absorption der zuletzt genannten favorisieren.
  • Die wissenschaftliche und Patentliteratur beinhaltet viele Referenzen bezüglich der Herstellung und Verwendung von Liposomen; es gibt jedoch sehr wenige Literaturstellen, die die Verwendung von Carnitin-Derivaten beschreiben, die für die Gen-Freisetzung nützlich sind, während für die Arzneimittelfreisetzung keine Dokumente erhältlich sind, die sich mit bekannten Techniken für die Herstellung von Verbindungen befassen, die entfernt jenen gemäß der hierin beschriebenen Erfindung ähnlich sind.
  • Die Patentanmeldung EP 0 279 887 beschreibt die Verwendung eines Derivates von Carnitin, d.h. Phosphatidylcarnitin, wahlweise in Mischungen mit anderen Phospholipiden und Lipiden (Cholesterin, Phosphatidylcholin, Phosphatidylserin) zur Herstellung von Liposomen.
  • Bei dem angegebenen Beispiel in bezug auf die Herstellung von Liposomen werden Liposome von Phosphatidylcarnitin erzeugt, die Propanolol einfügen, ein Arzneimittel, von dem bekannt ist, daß es als blutdrucksenkendes, Antiangina- und Antiarrhythmiemittel wirkt. Das Carnitin-Derivat wird hier aufgrund des ausgesprochenen Myokardtropismus von Carnitin verwendet. Dieser Tropismus ermöglicht es zu verhindern, daß die Liposomen durch die Leber metabolisiert werden und nicht die gewünschte Zielstelle erreichen.
  • Das Vorhandensein von Phosphatidylcarnitin ermöglicht ebenfalls, die Liposomen oral zu verabreichen, weil sie gegenüber intestinalen Lipasen resistent sind.
  • In J. Med. Chem. 1998, 18. Juni; 41(13):2207-15 wird eine Anzahl von Estern von L-Carnitin, die für die Gen-Freisetzung nützlich sind, beschrieben, aber es wird nicht beschrieben oder vorgeschlagen, daß diese als Mittel für die Arzneimittelfreisetzung nützlich sind.
  • WO 96/39193 beschreibt neue Zielarzneimittel, die für den Eintritt in die Mitochondrien über das Carnitin-Acylcarnitin-Translokasesystem beabsichtigt sind, aber legt nicht nahe, daß diese ein nützliches Mittel für die Herstellung von Liposomen sind.
  • EP 559 625 B1 beschreibt eine Anzahl von Estern von L-Carnitin und Acyl-L-carnitinen, die eine selektive Gastrointestinaltrakt-muskelrelaxierende Wirkung aufweisen.
  • In den letzten Jahren haben Molekularbiologen zahlreiche Mängel beim chromosomalen Niveau identifiziert, die Erbkrankheiten in menschlichen Subjekten verursachen.
  • Ein wichtiger Sektor der modernen Medizin betrifft die Behandlung dieser Erkrankungen auf erbgenetischer Basis mit Hilfe der Verwendung von Gen-Therapieprotokollen.
  • Wie bereits erwähnt, werden kationische Liposomen extensiv für die intrazelluläre Freisetzung von pharmakologisch aktiven Verbindungen verwendet, wodurch der Transmembrantransport erleichtert oder deren Wechselwirkung mit den spezifischen Zellmembranstellen (Rezeptoren) gefördert wird.
  • Diese Vektoren haben ein großes Potential im Vergleich zu solchen biologischen Ursprungs, weil sie viel sicherer, weniger toxisch und ebenfalls in der Lage sind, Gene mit großer Größe einzufügen. Im Vergleich zu Vektoren vom biologischen Typ haben sie jedoch eine geringe intrazelluläre Gen-Transkriptionsausbeute.
  • Weiterhin erfordert der Gentransfer, der durch konventionelle kationische Lipide mediiert wird, daß Plasmid-DNA und kationische Lipide getrennt gehalten werden und daß deren Mischung unmittelbar vor dem Gen-Transfer bewirkt wird.
  • Versuche zur Stabilisierung dieser Polynukleotid-Komplexe haben bisher keine unterstützenden Ergebnisse ergeben; tatsächlich bleiben sie nur für eine kurze Zeitperiode stabil.
  • Auf dem Gebiet der Gentherapie oder Gen-Freisetzung und Arzneimittelfreisetzung gibt es daher ein deutliche Bedürfnis für stabile, reproduzierbare, stellenspezifische Systeme, die ebenfalls nach einer geeigneten Zeitperiode aktiv sind.
  • Es wurde nun festgestellt, daß eine Klasse von kationischen Lipiden, die bei der Förderung der intrazellulären Freisetzung von pharmakologisch aktiven Verbindungen sehr aktiv sind, die neuen Ester von L-Carnitin und Acyl-L-carnitinen umfassen.
  • Diese neuen Verbindungen sind stabil und sehr selektiv, weil sie stellenspezifisch bei dem Erreichen des Zielorgans sind.
  • Dieses Charakteristikum macht diese insbesondere für den Transport von aktiven Verbindungen direkt an die Stelle nützlich, wo sie ihre pharmakologische Aktivität entfalten können.
  • Die Verbindungen gemäß der hierin beschriebenen Erfindung sind Verbindungen mit der allgemeinen Formel (I):
    Figure 00060001
    worin:
    n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist;
    R Wasserstoff oder geradkettiges oder verzweigtes Alkanoyl mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen ist;
    R1 und R2, die gleich oder verschieden sein können, eine gesättigte oder ungesättigte, geradkettige Acylkette mit 3 bis 20 Kohlenstoffatomen sind; und
    x– das Anion einer pharmakologisch akzeptablen Säure ist.
  • Beispiele von R sind Acetyl, Propionyl, Butyryl, Vaerlyl und Isovaleryl.
  • Beispiele von R1 und R2 sind Hexanoyl, Undecanoyl, Myristoyl, Plamitoyl oder Oleoyl.
  • Bevorzugte Beispiele von Verbindungen gemäß der Erfindung sind:
    • – Ester von L-Carnitinbromid mit 2-Hydroxyacetyl-1,3-dipalmitoylglycerin (ST 770);
    • – Ester von Acetyl-L-carnitinbromid mit 2-Hydroxyacetyl-1,3-dipalmitoylglycerin (ST 771);
    • – Ester von Propionyl-L-carnitinbromid mit 2-Hydroxyacetyl-1,3-dipalmitoylglycerin (ST 772);
    • – Ester von Isobutyryl-L-carnitinbromid mit 2-Hydroxyacetyl-1,3-dipalmitoylglycerin (ST 773);
    • – Ester von Isovaleryl-L-carnitinbromid mit 2-Hydroxyacetyl-1,3-dipalmitoylglycerin (ST 774);
    • – Ester von L-Carnitinbromid mit 1,3-Dihexanoyl-2-hydroxycetylglycerin (ST 180);
    • – Ester von Acetyl-L-carnitinbromid mit 1,3-Dihexanoyl-2-hydroxyacetylglycerin (ST 809);
    • – Ester von Propionyl-L-carnitinbromid mit 1,3-Dihexanoyl-2-hydroxyacetylglycerin (ST 808).
  • Mit einem Anion einer pharmakologisch akzeptablen Säure ist irgendein Anion einer Säure gemeint, das keine unerwünschten toxischen oder Nebenwirkungen ergibt.
  • Diese Säuren sind dem Pharmakologen und Experten auf dem Gebiet der pharmazeutischen Technologie gutbekannt.
  • Beispiele dieser Anionen sind, obwohl sie nicht ausschließlich sind: Chlorid; Bromid; Iodid; Aspartat; saures Aspartat; Citrat; saures Citrat; Tartrat; saures Tartrat; Phosphat; saures Phosphat; Fumarat; saures Fumarat; Glycerophosphat; Glucosephosphat; Lactat; Maleat; saures Maleat; Mucat; Orotat; Oxalat; saures Oxalat; Sulfat; saures Sulfat; Trichloracetat; Trifluoracetat; Methansulfonat; Pamoat und saures Pamoat.
  • Verbindungen der Formel (I) in der Form von Liposomen sind Mittel, die sowohl für die Freisetzung von natürlich auftretenden oder modifizierten Plasmiden oder Nukleotiden, die in der Gentherapie nützlich sind, oder die ein Peptid oder Protein codieren, das als Impfstoff nützlich ist, als auch für die allgemeine Freisetzung von Arzneimitteln nützlich sind, wie z.B. Antikrebsmittel, Antivirusmittel, antibakterielle Mittel, Antipilzmittel, Antiprotozoane, Arzneimittel, die für die Therapie von kardiovaskulären Systemerkrankungen nützlich sind, oder immunogene Peptide und andere Arzneimittel, die bei der Therapie nützlich sind.
  • Die Liposomen, umfassend die Verbindung der Formel (I) werden durch konventionelle Techniken hergestellt, die der Person mit Fachwissen gut bekannt sind; siehe beispielsweise Allen T.M., Drugs 56, 747–56 (1998). Die Liposome gemäß dieser Erfindung können auch hergestellt werden, indem andere Komponenten verwendet werden, die in der Praxis der Liposomtechnologie gutbekannt sind. In einem Ausführungsbeispiel dieser Erfindung können die Liposomen Helferlipide enthalten, ein Ausdruck, der bei diesem Stand der Technik gutbekannt ist. Beispiele von Helferlipiden sind Cholesterin, 1-Palmitoyl-2-oleoylphosphatidylcholin oder Dioleylphosphatdicylcholin.
  • Die erfindungsgemäßen Liposomen werden geeignet als Zusammensetzungen präsentiert. In dem Ausführungsbeispiel, das die Freisetzung von pharmakologisch aktiven Verbindungen betrifft, werden die Zusammensetzungen als pharmazeutische verstanden, wahlweise umfassend pharmazeutisch akzeptable Träger und/oder Exzipienten.
  • Verbindungen der Formel (I) in der Form von Liposomen können ebenfalls bei der Herstellung von kosmetischen Zusammensetzungen, die sowohl das Liposom per se als auch ein kosmetisch aktives Mittel umfassen, und für die Freisetzung von Substanzen mit kosmetischer Aktivität verwendet werden, wie beispielsweise Hydratisierungsmittel, Nährstoffe, Substanzen für die Gesichtsreinigung, Antifaltenmittel, Anticellulitismittel und Mittel gegen Schwangerschaftsstreifen.
  • Liposomen, umfassend die Verbindungen der Formel (I), können oral oder parenteral, intravenös, intramuskulär, subkutan, transdermal oder in der Form eines Nasen- oder Mundsprays verwendet werden.
  • Die Vorgehensweise zur Herstellung der Verbindungen der Formel (I) gemäß dieser Erfindung wird durch das folgende Reaktionsdiagramm dargestellt, wobei beabsichtigt ist, daß dieses Diagramm für die gesamte allgemeine Formel (I) gilt. Der Fachmann kann leicht alle Gruppen für R, R1 und R2 erhalten, weil alle notwendigen Reagenzien kommerziell erhältlich oder in der Literatur offenbart sind, und die Reaktionsbedingungen im allgemeinen für den gesamten Umfang dieser Erfindung anwendbar sind, wobei gegebenenfalls jegliche Modifizierung normalerweise innerhalb des Fachwissens liegt.
  • Figure 00090001
  • Unter Bezugnahme auf das obige Reaktionsdiagramm 1 wird die Herstellung der Verbindungen der Formel (I) gemäß dieser Erfindung unten erläutert.
  • Beispiel 1
  • Herstellung des Esters von Propionyl-L-carnitinbromid mit 2-Hydroxyacetyl-1,6-dipalmitoylglycerin (ST 772)
  • a) Herstellung von 1,3-Dihydroxypropan-2-on-1,3-dipalmitat (1)
  • Dihydroxyaceton (7 g; 0,078 mol) wurde in 300 ml wasserfreiem Chloroform bei 0°C (externe Temperatur) unter wasserfreiem Stickstofffluß aufgelöst.
  • Zu der somit erhaltenen Lösung wurden Palmitoylchlorid (44 g, 0,16 mol) und wasserfreies Pyridin (15 ml) tropfenweise gegeben.
  • Die resultierende Mischung, deren Temperatur auf Umgebungstemperatur gebracht wurde, wurde 24 Stunden unter Rühren gehalten.
  • Die Mischung wurde dann auf folgende Weise extrahiert: mit 300 ml einer wäßrigen Lösung einer 0,5%igen Salzsäure, 300 ml einer wäßrigen Lösung aus 5%igem Natriumbicarbonat und schließlich mit 300 ml Wasser.
  • Die getrennte organische Phase wurde auf wasserfreiem Natriumsulfat dehydratisiert, auf einem Cellulose-Filter filtriert und zur Trockene konzentriert, unter Erhalt des rohen Produktes (1).
  • Das reine Produkt (1) wurde durch Kristallisierung von 500 ml Ethylalkohol erhalten. 30,4 g Produkt (1) wurden erhalten.
    Ausbeute: 73 %,
    Schmelzpunkt: 80–81°C,
    1H-NMR (CDCl3): 0,9 (6H, CH 3CH2-); 1,3 (48H, m, (CH2)n=24); 1,55 (4H, m, -OCOCH2 CH 2); 2,4 (4H, t, -OCOCH 2-); 4,7 (4H, s, -OCCH 2-).
  • b) Herstellung von 1,2,3-Trihydroxypropan-1,3-dipalmitat (2)
  • Wasser (7,5 ml) wurde langsam zum Produkt (1) (5 g, 9 mmol) gegeben, in Tetrahydrofuran (125 ml) und Toluol (25 ml) unter Rühren aufgelöst.
  • Die Temperatur der erhaltenen milchigweißen Suspension wurde auf 5°C (externe Temperatur) gebracht und Natriumborhydrid (500 mg, 13 mmol) wurde in kleinen Portionen zugegeben. Die Suspension wurde 30 Minuten bei 5°C unter Rühren gehalten.
  • Eisessig wurde dann langsam zugegeben, bis die Schaumbildung, erzeugt durch die Zersetzung des überschüssigen Natriumborhydrides, aufhörte, unter Erhalt einer Lösung.
  • Chloroform (100 ml) wurde dann zu der Lösung gegeben, unter Bildung eines zweiphasischen Systems.
  • Die untere organische Phase, bestehend aus CHCl3, wurde getrennt, wobei in der folgenden Reihenfolge extrahiert wurde: mit Wasser (25 ml), Natriumbicarbonat (25 ml einer 10%igen wäßrigen Lösung) und Wasser (25 ml).
  • Die organische Lösung, die (2) umfaßte, wurde auf Natriumsulfat dehydratisiert, filtriert und zur Trockene konzentriert, unter Erhalt eines wachsartigen Produktes.
  • Das Produkt (2) wurde durch Acetonkristallisierung des wachsartigen rohen Produktes erhalten. 4,8 g des Produktes (2) wurden erhalten.
    Ausbeute: 94 %,
    Schmelzpunkt: 71–72°C,
    1H-NMR (CDCl3): 0,9 (6H, t, CH 3CH2-); 1,3 (48H, m, (CH2)n=24); 1,55 (4H, m, -OCOCH2 CH 2-); 2,4 (4H, t, -OCOCH 2-); 4,2 (5H, m, -CHCH 2O-).
  • c) Herstellung von 1,3-Dipalmitoyl-2-bromacetylglycerin (3)
  • Das Produkt (2) (2,5 g, 4,4 mmol) wurde in wasserfreiem Chloroform (50 ml) unter Rühren und bei 0°C (externe Temperatur) aufgelöst.
  • Zu der somit erhaltenen Lösung wurde langsam Pyridin (0,42 ml) und tropfenweise 3 ml einer Chloroform-Lösung mit Bromacetylchlorid (0,43 ml, 5,2 mmol) gegeben.
  • Die Reaktionsmischung wurde 30 Minuten bei 0°C (externe Temperatur) und 30 Minuten bei Umgebungstemperatur gehalten.
  • Die Reaktionsmischung wurde dann in der folgenden Reihenfolge behandelt mit: einer wäßrigen Lösung aus 1%iger Salzsäure (ungefähr 50 ml), einer wäßrigen Lösung aus 5%igem Natriumbicarbonat (ungefähr 50 ml) und Wasser.
  • Das Produkt (3) wurde durch Aceton-Kristallisierung nach Dehydratisierung der Reaktionsmischung (mit Natriumsulfat) und Konzentration zur Trockene gereinigt. 2,5 g des Produktes (3) wurden erhalten.
    Ausbeute: 89 %,
    Schmelzpunkt: 46–47°C,
    1H-NMR (CDCl3): 0,9 (6H, t, CH 3CH2-); 1,3 (48H, m, (CH2)n=24); 1,55 (4H, m, -OCOCH2 CH 2-); 2,4 (4H, t, -OCOCH 2-); 3,9 (2H, s, -OCH 2COO-), 4,2 – 4,4 (5H, m, -CHCH 2O-); 5,25 (1H, m, CHCH2O-).
  • d) Herstellung des Esters von L-Propionylcarnitinbromid mit 2-Hydroxyacetyl-1,3-dipalmitoylglycerin (4)
  • Das innere L-Propionylcarnitinsalz (0,95 g, 4,4 mmol), das zuvor bei 40°C vakuumgetrocknet war, wurde in wasserfreiem Dimethylformamid (ungefähr 20 ml) suspendiert.
  • Das Produkt (3) (3 g, 4,7 mol) wurde zu der Suspension in kleinen Portionen gegeben. Die Suspension wurde langsam auf 38°C erwärmt und unter diesen Bedingungen gehalten, bis eine Lösung erhalten wurde.
  • Nach 10 Minuten wurde die Lösung für 30 Minuten auf 0°C gebracht. Ein Präzipitat wurde erhalten, das filtriert und mit Ethylether gewaschen und in Chloroform (100 ml) aufgelöst wurde. Die erhaltene schillernde Lösung (30 ml) wurde auf Celite filtriert und konzentriert. Zu dieser zuletzt genannten Lösung wurde Hexan (100 ml) gegeben und das erhaltene Präzipitat des Produktes (4) wurde filtriert und bei 35°C im Vakuum getrocknet. 3,19 g der Zielverbindung wurden erhalten.
    Ausbeute: 80 %,
    Schmelzpunkt 127–128°C,
    [α]25D = –3,9 (C = 1 % Chloroform),
    Elementaranalyse von C47H88BrNO10
    Figure 00120001
    1H-NMR (CDCl3): 0,9 – 0,95 (6H, t, CH 3CH2CH2-), 1,1 – 1,2 (3H, t, CH 3CH2CO); 1,2 – 1,4 (2H, m, CH2n=24); 1,5 – 1,6 (4H, m, -OCCH2 CH 2); 2,3 – 2,4 (4H, t, -OCCH 2CH2-); 2,4 – 2,45 (4H, d.d., -CHCH 2O-); 2,95 (2H, d, -CH 2COOCH2COO-); 3,5 (9H, s, N(CH3)3); 4,2 (4H, m, -CH 2COOCH2-); 4,35 (2H, m, -CH 2N-); 4,65 (2H, d, d, -OCH 2CO-); 5,25 1H, m, -OCH2 CHCH2O-); 5,75 (1H, m, -CHCH2N-).
  • Beispiele 2 bis 7
  • Die folgenden Verbindungen wurden auf gleiche Weise wie bei dem vorgenannten Beispiel hergestellt.
    • – Ester von L-Carnitinbromid mit 2-Hydroxyacetyl-1,3-dipalmitoylglycerin (ST 770);
    • – Ester von Acetyl-L-carnitinbromid mit 2-Hydroxyacetyl-1,3-dipalmitoylglycerin (ST 771);
    • – Ester von Isobutyryl-L-carnitinbromid mit 2-Hydroxyacetyl-1,3-dipalmitoylglycerin (ST 773);
    • – Ester von Isovaleryl-L-carnitinbromid mit 2-Hydroxyacetyl-1,3-dipalmitoylglycerin (ST 774);
    • – Ester von L-Carnitinbromid mit 1,3-Dihexanoyl-2-hydroxycetylglycerin (ST 810);
    • – Ester von Acetyl-L-carnitinbromid mit 1,3-Dihexanoyl-2-hydroxyacetylglycerin (ST 809);
    • – Ester von Propionyl-L-carnitinbromid mit 1,3-Dihexanoyl-2-hydroxyacetylglycerin (ST 808);
  • Ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel der hierin beschriebenen Erfindung besteht in der Herstellung von Liposomen mit Antikrebs- arzneimitteln und insbesondere Liposomen, die als Vehikel für Camptothecine wirken, wie z.B. solche, die in WO 97/31003 offenbart sind. Gemäß einem mehr bevorzugten Ausführungsbeispiel gibt die hierin beschriebene Erfindung Liposome zur Freisetzung von Camptothecinen mit der allgemeinen Formel (IV) an:
    Figure 00130001
    worin R1 eine -C(R11)=N-O(n)R10-Gruppe, worin R10 bedeutet: Wasserstoff oder eine C1-5-Alkyl- oder C1-5-Alkenyl-Gruppe, geradkettig oder verzweigt, oder eine C3-10-Cycloalkyl-Gruppe oder eine geradkettige oder verzweigte (C3-10)-Cycloalkyl-(C1-5)-alkyl-Gruppe oder C6-14-Aryl oder eine geradkettige oder verzweigte (C6-14)-Aryl-(C1-5)-alkyl-Gruppe oder eine heterocyclische oder geradkettige oder verzweigte Heterocyclus-(C1-5)-alkyl-Gruppe, wobei die heterocyclische Gruppe zumindest ein Heteroatom umfaßt, ausgewählt aus Atomen von Stickstoff, wahlweise substituiert durch eine (C1-5)-Alkyl-Gruppe, und/oder Sauerstoff und/oder Schwefel, wobei die Alkyl-, Alkenyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, Arylalkyl-, heterocyclische oder Heterocyclo-Alkyl-Gruppe wahlweise durch anderen Gruppen substituiert ist, ausgewählt aus Halogen, Hydroxy, C1-5-Alkyl, C1-5-Alkoxy, Phenyl, Cyano, Nitro, -NR12R13, worin R12 und R13, die gleich oder verschieden sein können, Wasserstoff, geradkettiges oder verzweigtes (C1-5)-Alkyl, -COOH-Gruppe oder einer der pharmakologisch akzeptablen Ester davon; oder die -CONR14R15-Gruppe ist, worin R14 und R15, die gleich oder verschieden sein können, Wasserstoff, geradkettiges oder verzweigtes (C1-5)-Alkyl sind; oder
    R10 ein C6-10-Aroyl-Rest ist, wahlweise substituiert durch eine oder mehrere Gruppen, ausgewählt aus: Halogen, Hydroxy, geradkettiges oder verzweigtes C1-5-Alkyl, geradkettiges oder verzweigtes C1-5-Alkoxy, Phenyl, Cyano, Nitro, -NR16R17, worin R16 und R17, die gleich oder verschieden sein können, Wasserstoff, geradkettiges oder verzweigtes C1-5-Alkyl sind;
    R10 ein Polyaminoalkyl-Rest ist oder
    R10 ein Glycosyl-Rest ist;
    n die Zahl 0 oder 1 ist;
    R11 Wasserstoff, geradkettiges oder verzweigtes C1-5-Alkyl, geradkettiges oder verzweigtes C1-5-Alkenyl, C3-10-Cycloalkyl, geradkettiges oder verzweigtes (C3-10)-Cycloalkyl-(C1-5)-alkyl, C6-14-Aryl, geradkettiges oder verzweigtes (C6-14)-Aryl-(C1-5)-alkyl ist;
    R8 und R9, die gleich oder verschieden sein können, Wasserstoff, Hydroxyl, geradkettiges oder verzweigtes C1-5-Alkoxy sind;
    deren N1-Oxide, einfachen Isomere, insbesondere die syn- und anti-Isomeren der -C(R11)=N-O(n)R10-Gruppe, deren möglichen Enantiomeren, Diastereoisomeren und verwandten Mischungen, deren pharmazeutisch akzeptablen Salze und deren aktive Metaboliten.
  • Verbindungen der Formel (IV) sind in der europäischen Patentanmeldung 99830124.6, angemeldet am 9. März 1999, beschrieben.
  • Verbindungen (IV), worin n 1 und R10 wie oben definiert ist, mit der Ausnahme von Aroyl, können ausgehend von Camptothecin-7-aldehyd (Formel IVa, R11 = Wasserstoff) oder Camptothecin-7-keto (Formel IVa, R11 hat eine andere Bedeutung als Wasserstoff) hergestellt werden.
    Figure 00140001
    worin R7 die -C(R11)=O-Gruppe ist und R11 wie in der Formel (IV) definiert ist, R8 und R9 wie in der Formel (IV) definiert sind. Die Verbindung der Formel (IVa) wird mit der Verbindung der Formel (Va) R10O-NH2, worin R10 wie oben definiert ist, reagiert, unter Erhalt von Verbindungen der Formel (2), worin R7 die -C(R11)=N-O-R10-Gruppe ist, R10 wie in der Formel (IV) definiert ist, mit Ausnahme von Aroyl.
  • Die Reaktion kann durch konventionelle Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, durchgeführt werden, wobei das Verfahren aus der üblichen Bildung von Oximen besteht. Bevorzugt ist das molare Verhältnis von Camptothecin-7-aldehyd oder -7-keton zu Hydroxylamin in dem Bereich von 1:3 bis 3:1. Die relevanten Hydroxylaminsalze können ebenfalls verwendet werden. Die Reaktion wird in der Gegenwart einer Base, beispielsweise einer anorganischen Base wie Kaliumcarbonat oder einer organischen Base wie Triethylamin oder Diazabicyclononan unter Verwendung von polaren Lösungsmitteln, bevorzugt Methanol oder Ethanol und durch Durchführen der Reaktion bei einer Temperatur im Bereich von Umgebungstemperatur bis zum Siedepunkt des Lösungsmittels, wahlweise in der Gegenwart von Dehydratisierungsmitteln, z.B. Natrium- oder Magnesiumsulfat, Molekularsieben, durchgeführt. Falls erforderlich kann die Reaktion ebenfalls in der Gegenwart eines Katalysators, z.B. einer Lewis-Säure durchgeführt werden.
  • Alternativ können die oben erwähnten Verbindungen von dem Oxim von Camptothecin-7-aldehyd (erhalten wie in Sawada et al., Chem. Pharm. Bull 39, 2574 (1991) beschrieben) oder -7-keton oder von dem entsprechenden 7-Acylcamptothecin durch Reaktion mit einem R10-X-Halogenid, worin X bevorzugt Iod ist, in einem polaren Lösungsmittel, z.B. Tetrahydrofuran oder Alkoholen und in der Gegenwart einer Base, z.B. Natriumhydrid oder Kaliumcarbonat durchgeführt werden.
  • Die Verbindungen der Formel (IV), worin n 1 und R10 Aroyl ist, wie in der Formel (IV) definiert, können ausgehend von Camptothecin-7-oxim, dessen Herstellung im vorhergehenden Abschnitt beschrieben worden ist, mit R10-COCl-Acylchloriden in polaren Lösungsmitteln und in der Gegenwart einer Base, bevorzugt Pyridin oder direkt in Pyridin wie von Cho et al., J. Org. Chem. 62, 2230 (1997) beschrieben, hergestellt werden.
  • Die Verbindungen der Formel (IV), worin n O und R10 wie oben definiert ist, mit der Ausnahme von Aroyl, können ausgehend von Camptothecin-7-aldehyd (Formel IVa, R11 = Wasserstoff) oder Camptothecin-7-keton (Formel IVa, R11 hat eine andere Bedeutung als Wasserstoff) hergestellt werden.
    Figure 00150001
    worin R7 die -C(R11)=O-Gruppe ist und R11 wie in der Formel (IV) definiert ist und R8 und R9 wie in der Formel (IV) definiert sind. Die Verbindung der Formel (IVa) wird mit der Verbindung der Formel (Vb) R10-NH2, worin R10 wie oben definiert ist, reagiert, unter Erhalt von Verbindungen der Formel (IV), worin R7 die -C(R11)=N-R10-Gruppe ist, R10 wie in Formel (IV) definiert ist, mit Ausnahme von Aroyl. Die Reaktion kann mit konventionellen Verfahren, die dem Experten auf dem Gebiet der pharmazeutischen Technologie bekannt sind, durchgeführt werden, wobei das Verfahren aus der üblichen Bildung von Iminen besteht. Bevorzugt sollte das molare Verhältnis von Camptothecin-7-aldehyd oder -7-keton zu dem Imin in dem Bereich von 1:3 bis 3:1 liegen. Die relevanten Aminsalze können ebenfalls verwendet werden. Die Reaktion wird in der Gegenwart einer Base, z.B. einer anorganischen Base wie Kaliumcarbonat oder einer organischen Base wie Triethylamin und Diazabicyclononan unter Verwendung von polaren Lösungsmitteln, bevorzugt Methanol oder Ethanol und durch Durchführung der Reaktion bei einer Temperatur im Bereich von Umgebungstemperatur bis zur Siedepunkttemperatur des Lösungsmittels, wahlweise in der Gegenwart von Dehydratisierungsmitteln, beispielsweise Natrium- oder Magnesiumsulfat, Molekularsieben durchgeführt. Falls erforderlich, kann die Reaktion ebenfalls in der Gegenwart eines Katalysators, beispielsweise einer Lewis-Säure, durchgeführt werden, wie beispielsweise von Moretti und Torre, (Synthesis, 1970, 141); oder Kobanashi et al., (Synlett, 1977, 115) beschrieben ist.
  • Camptothecin-7-aldehyd und Camptothecin-7-oxim sind in der europäischen Patentanmeldung EP 0056692 und in dem oben genannten Artikel von Sawada et al., Chem. Pharm. Bull. 39, 2574 (1991) beschrieben.
  • Die N1-Oxide der Verbindungen der Formel (IV) werden entsprechend bekannten heteroaromatischen Stickstoff-Oxidationsverfahren, bevorzugt durch Oxidation mit Essigsäure oder Trifluoressigsäure und Wasserstoffperoxid oder durch Reaktion mit organischen Peroxysäuren (A. Albini und S. Pietra, Heterocyclic N-oxides, CTC, 1991) hergestellt.
  • Im Hinblick auf die variierende Bedeutung von R10, das in den unterschiedlichen Reagenzien der Formel (V) vorhanden ist, sind diese kommerziell erhältlich oder können entsprechend Verfahren hergestellt werden, die aus der Literatur bekannt sind, auf die der Experte auf diesem Gebiet zusätzlich zu dem eigenen Wissen zurückgreifen kann.
  • Pharmazeutisch akzeptable Salze werden durch konventionelle Verfahren, die in der Literatur beschrieben sind und keine weitere Beschreibung erfordern, erhalten.
  • Beispiel 8
  • 7-Benzyloxyiminomethylcamptothecin (CPT 172)
  • 500 mg (1,33 mmol) 7-Formylcamptothecin werden in 100 ml Ethanol aufgelöst. 15 ml Pyridin und 638 mg (4 mmol) O-Benzylhydroxylaminhydrochlorid werden zugegeben. Die Lösung wird 5 Stunden unter Rückfluß gehalten. Das Lösungsmittel wird im Vakuum verdampft und der somit erhaltene Rest durch Flash-Chromatographie aus Silicagel unter Verwendung einer 4:6-Mischung aus Hexan/Ethylacetat als Eluent gereinigt.
    Ausbeute: 65 %,
    Schmelzpunkt: 205–205°C, Zersetzung.
  • Das erhaltene Produkt besteht aus einer ungefähren 8:2-Mischung der beiden syn- und anti-Isomeren (Isomer A: Rf 0,32, Isomer B: Rf 0,19, auf Merck 60 F254-Silicagel, Eluent: Hexan:Ethylacetat 3:7).
  • HPLC: Die Analysen wurden auf einer Anlage durchgeführt, die mit einer quaternären Pumpe (HP 1050) mit einem Rheodyne-Injektor (20 μl-Schleife) und einem Dioden-Anordnungsdetektor (HP 1050) ausgerüstet war, der durch das HPLC-ChemStation-Programm läuft. Die Spektrumaufnahme erfolgte von 200 bis 600 nm und die Chromatogramme wurden bei 360 bis 400 nm aufgezeichnet.
  • Eine C18-Umkehrphasensäule (Rainin C18, 25 × 0,4 cm, Varian) wurde mit einer RP18 Vorsäule verwendet. Die Analyse wurde mit einem linearen Elutionsgradienten, ausgehend von Acetonitril:Wasser 30:70 zu Acetonitril 100 % innerhalb von 20 min mit einer Fließrate von 1 ml/min durchgeführt. Die Retentionszeiten waren 12,51 min für das Isomer B und 14,48 min für das Isomer A.
    1H-NMR (300 MHZ; DMSO-d6) δ: 0,88 (t, H3-18A+H3-18B), 1,87 8m (H2-19A+H2-19B), 5,18 (s, H2-5B), 5,21 (8s, H2-Ph B), 5,30 (H2-Ph A), 5,40 (s, H2-5A), 5,45 (s, H2-17A+H2-17B), 6,53 s, -OH A+-OH B), 7,3 – 7,6 (m, Ar A+Ar B+H-14A+H-14B), 7,75 (m, H-11A+H-11B), 7,85 – 7,95 (m, H-10A+H-10B), 7,98 (dd, H-12B), 8,18 – 8,27 (m, H-12A+H9-B), 8,45 (s, CH=N B), 8,59 (dd, H-9A), 9,38 (s, CH=N A).
    Mass m/z 481 (M+ 100) 374 (30), 330 (70), 300 (30), 273 (20), 243 (20), 91 (34).
  • Beispiel 9
  • 7-Butoxyiminomethylcamptothecin (CPT 184)
  • 400 mg (1,06 mmol) 7-Formylcamptothecin werden in 80 ml Ethanol aufgelöst. 12 ml Pyridin und 400 mg (3,18 mmol) O-t-Butylhydroxylaminhydrochlorid werden zugegeben. Die Lösung wird 4 Stunden unter Rückfluß gehalten. Das Lösungsmittel wird im Vakuum verdampft und der somit erhaltene Rest durch Flash-Chromatographie auf Silicagel unter Verwendung einer 4:6-Mischung aus Hexan/Ethylacetat als Eluent gereinigt. 322 mg (0,72 mmol) eines gelben Feststoffes werden erhalten.
    Ausbeute: 68 %,
    Schmelzpunkt: 250°C, Zersetzung.
  • Das erhaltene Produkt besteht aus einer ungefähren 8:2-Mischung der beiden syn- und anti-Isomeren (Isomer A: Rf 0,31, Isomer B: Rf 0,24, auf Merck 60 F254-Silicagel, Eluent: Hexan:Ethylacetat 3:7).
  • HPLC: Die Analysen wurden auf einer Anlage durchgeführt, die mit einer quaternären Pumpe (HP 1050) mit einem Rheodyne-Injektor (20 μl-Schleife) und einem Dioden-Anordnungsdetektor (HP 1050) ausgerüstet war, der durch das HPLC-ChemStation-Programm läuft. Die Spektrumaufnahme erfolgte von 200 bis 600 nm und die Chromatogramme wurden bei 360 bis 400 nm aufgezeichnet.
  • Eine C18-Umkehrphasensäule (Rainin C18, 25 × 0,4 cm, Varian) wurde mit einer RP18 Vorsäule verwendet. Die Analyse wurde mit einem linearen Elutionsgradienten, ausgehend von Acetonitril:Wasser 30:70 zu Acetonitril 100 % innerhalb von 20 min mit einer Fließrate von 1 ml/min durchgeführt. Die Retentionszeiten waren 12,92 min für das Isomer B und 14,61 min für das Isomer A.
    1H-NMR (300 MHZ; DMSO-d6) δ: 0,88 (t, H3-18A+H3-18B), 1,30 (s, t-But.B), 1,47 (s, t-But.A), 1,87 (m, H2-19A+H2-19B), 5,18 (s, H2-5 B), 5,37 (H2-5 A), 5,42 (s, H2-17A+H2-17B), 6,54 (s, -OH A+-OH B), 7,35 (s, H-14A), 7,36 (s, H-14B), 7,69 – 7,83 (m, H-11A+H-11B), 7,85 – 7,98 (m, H-10A+H-10B), 8,07 (dd, H-9B), 8,16 – 8,27 (m, H-9A+H-12B), 8,40 (s, CH B), 8,62 (dd, H-12A), 9,31 (s, CH A).
    Mass m/z 448 (M+ 28) 391 (40), 374 (100), 362 (40), 330 (34), 57 (17).
  • Herstellung der Liposomen
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen können zur Herstellung von multilamellaren Liposomen (MLV) und unilamellaren Liposomen (SUV) sowohl in der Form von trockenen Pulvern als auch in der Form von Suspensionen in wäßrigen Lösungen verwendet werden.
  • Die in den Beispielen 1 bis 7 hergestellten Verbindungen gemäß dieser Erfindung werden zur Herstellung der Liposomen entsprechend der folgenden Vorgehensweise verwendet. Eine geeignete Menge der Verbindung wird in Chloroform aufgelöst; die Lösung wird im Vakuum in einem Rotationsverdampfer zur Trockene konzentriert, bis ein Lipidfilm erhalten wird. Der Lipidfilm wird im hohen Vakuum getrocknet, bis die letzten verbleibenden Spuren des Lösungsmittels eliminiert sind, und wird dann in tert-Butyl alkohol oder mit Wasser aufgelöst. Die somit erhaltene Lösung wird lyophilisiert, unter Erhalt eines weichen trockenen Pulvers.
  • Die Pulver werden mit einer geeigneten Menge einer wäßrigen Lösung hydratisiert, unter Erhalt des Liposoms der verwendeten Verbindung, das dann mit dem Polynukleotid oder mit dem gewünschten Arzneimittel komplexiert wird.
  • Ein anderes Verfahren zur Herstellung der Liposomen besteht aus der Adsorption eines Lipidfilmes, bestehend aus einer Verbindung gemäß dieser Erfindung, in einem Lösungsmittel, auf einem geeigneten inerten Träger wie Sorbit, Mannit oder anderen pharmakologisch akzeptablen Carbohydraten. Die Mischung wird vakuumgetrocknet, unter Erhalt eines Feststoffes, der leicht und sehr schnell vor der Verwendung hydratisiert werden kann.
  • Präparate in der Form von trockenen Pulvern weisen die Vorteile auf, daß sie lange Zeit stabil und leicht zu verwenden sind.
  • Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung von Liposomen, die mit DNA oder dem gewünschten Arzneimittel komplexiert sind, in der Form von trockenen Pulvern entsprechend dem folgenden Vorgang verwendet werden. Die erfindungsgemäße Verbindung wird in tert-Butylalkohol oder mit Wasser aufgelöst; die somit erhaltene Lösung wird mit DNA oder dem gewünschten Arzneimittel vermischt und die Mischung wird lyophilisiert, unter Erhalt des Komplexes, den wir als Proliposom-DNA oder Proliposom-Arzneimittel definieren können, in der Form eines weichen trockenen Pulvers.
  • Die somit erhaltenen Pulver (Proliposomen) können für die Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden, die über Aerosol oder alternativ bei Rekonstitution mit Wasser oder einer geeigneten Pufferlösung parenteral oder oral verabreicht werden können.
  • Mit DNA oder mit Arzneimitteln komplexierte Liposomen können in fester Form ebenfalls durch das Adsorptionsverfahren des Lipidfilmes auf einem inerten Träger wie Sorbit, Mannit oder anderen Kohlenhydraten durch das oben erwähnte Verfahren erhalten werden.
  • Test der Liposombildung
  • Die Liposombildung wurde mit Hilfe eines kolorimetrischen Verfahrens unter Verwendung eines wasserlöslichen Farbstoffes entsprechend der folgenden Vorgehensweise untersucht. Eine wäßrige Lösung aus dem wasserlöslichen Farbstoff Arsenazo III wurde erhalten (Molekulargewicht 776,37; 2,3 mg/ml).
  • Diese Lösung wurde anstelle von Wasser zum Hydratisieren der Lipidfilme, die von dem erwähnten Präparat stammen, verwendet.
  • Ein Aliquot der Suspension mit dem Liposom, das den Farbstoff einkapselt, wurde 100-fach mit Wasser verdünnt.
  • 2 ml der Liposom-Suspension wurden verwendet, unter Erhalt der ersten Ablesung der optischen Dichte bei 660 nm; die Ablesung wurde in bezug auf eine gleiche Probe, die als Blanko definiert wurde, erhalten. 200 μl einer CaCl2-Lösung (15 mg/ml; 100 mM) wurden zu der ersten Probe gegeben und die optische Dichte wurde bei 660 nm gegenüber der Blanko-Probe gemessen, zu der 200 μl Wasser gegeben wurden. Der erhaltene Absorbanswert wurde als Ablesung 2 bezeichnet. Wir fügten dann zu der Probe 100 μl einer Lösung aus Triton X-100 (5 % V/V; 0,26%ige Endkonzentration) und 200 μl Wasser zu der Blankoprobe zu; die Ablesung der optischen Dichte bei 660 nm ergab den Wert der optischen Dichte, der als Ablesung 3 definiert wurde. Zum Berechnen des Prozentsatzes des eingekapselten Farbstoffes wurde die folgende Formel verwendet:
  • Figure 00200001
  • Der Prozentsatz des eingekapselten Farbstoffes ergibt eine Maßnahme der Liposombildung und ist im Durchschnitt etwa 40 %: die Liposomengrößenüberprüfung wurde unter Verwendung der Laserlichtstreuung mit einem positiven Outcome durchgeführt.
  • Beispiele zur Herstellung von Liposomen
  • Beispiel 8
  • Herstellung von Taxol-ST 772 SUV-Liposomen (1:70)
  • 20 mg 0,0234 mmol Taxol und 1485 mg, 1,638 mmol ST772 wurden in 20 ml Chloroform aufgelöst.
  • Die Lösung wurde konzentriert, bis ein Lipidfilm auf der Oberfläche des Glaskolbens erhalten wurde.
  • Nach Eliminierung der letzten Spuren von Chloroform mit einer Hoch-Vakuumpumpe wurden 20 ml tert-Butylalkohol zu dem Lipidfilm gegeben. Für den Erhalt einer klaren Lösung mußte sie auf 60°C erwärmt werden. Die Lösung wurde unmittelbar bei –70°C mit flüssigem Stickstoff gefroren und 24 Stunden lyophilisiert.
  • Für den Erhalt der endgültigen SUV-Liposomen-Suspension wurden das lyophilisierte Produkt, hydratisiert mit einer PBS-Lösung (20 ml), 20 Minuten bei 0°C mit Schall behandelt.
  • Die Filtration wurde dann auf einem 400 nm-Filter zum Eliminieren von Spuren von Titan, das durch die Schallsonde freigesetzt wurde, durchgeführt.
  • Untersuchung der physikalischen Stabilität des Präparates
  • Die physikalische Stabilität des Präparates wurde durch Trübheitsmessung unter Aufzeichnung einer TDC (Zeitantriebskurve) bei 800 nm bei 20°C 6 Stunden untersucht.
  • Ein konstanter Trübheitstrend, der eine Stabilität des Präparates anzeigt, wurde aufgezeichnet, ohne irgendwelche Ausfällungsphänomene.
  • Gen-Freisetzung
  • Herstellung des Liposom-DNA-Komplexes
  • Liposom und Plasmid-DNA wurden geeignet getrennt in PBS verdünnt. Die DNA wurde dann zu dem Liposom gegeben und der Liposom-DNA-Komplex wurde für etwa 30 min bei 4°C gelassen, zur Erleichterung der Bildung einer stabilen Liposom-DNA-Wechselwirkung.
  • Bei den in vitro-Experimenten wurde 1,2-Dioleoyloxy-3-trimethylammoniumpropan (DOTAP) als kationisches Referenzlipid verwendet; 2,5 μg Plasmid-DNA wurden pro 2 × 105 HeLa-Zellen verwendet, und die Liposom-Konzentration war 9 μM.
  • Bei den in vivo-Experimenten wurden sowohl DOTAP als auch [2,3-(Dieoleoyl)propyl]trimethylammonium (DOTMA) als kationische Referenzlipide verwendet.
  • Die in den Ergebnissen definierten molaren Verhältnisse betreffen nmol-Konzentrationen in den jeweiligen kationischen Lipiden pro mg DNA.
  • Bei den in vivo-Transfektionsexperimenten wurden 25 μg Plasmid-DNA pro Tier verwendet.
  • Das Plasmid pCMVluc, das bei diesen Experimenten verwendet wurde, enthielt die cDNA des Luciferase-Gens unter der transkriptionalen Kontrolle des Cytomegalovirus (CMV)-Förderers.
  • Quantitative Bestimmung der Luciferase-Aktivität
  • Die Proteinluciferase-Aktivität in den Zellen und Geweben wurde unter Verwendung des Boehringer Mannheim-Kits (Kat. Nr. 1669 893) bestimmt.
  • Die Zellen wurden 3-mal in PBS gewaschen und dann von der Platte mit einem Kratzer in Lysepuffer (100 mM Kaliumphosphat, pH 7,8, 1 mM Dithiothreitol-DTT) entfernt und drei aufeinanderfolgenden Zyklen von Gefrieren und Auftauen unterworfen. Nach Zentrifugation in 1,5 ml Eppendorf-Röhren wurde der Überstand für den Lumineszenz-Test nicht mehr als 5 Stunden nach der Extraktion der Proteine verwendet. Die Lumineszenzemissionsmessungen erfolgten unter Verwendung eines Luminometers bei 562 nm. Nach einem ersten Gefrieren in flüssigem N2, mit anschließendem feinem Zerstoßen unter Erhalt eines Pulvers wurden die Gewebe in Lysepuffer resuspendiert und 10 bis 15 min in Eis inkubiert.
  • Die Proben wurden dann in 2 ml Eppendorf-Röhren zentrifugiert und der Überstand bezüglich der Luciferase-Aktivität untersucht.
  • Dot-Blot-Analyse
  • Dot-Blot-Analyse wurde entsprechend dem alkalischen Lysevorgang extrahiert, beschrieben von Sanbrook, Fritsch und Maniatis in Molecular Cloning 1989.
  • 5 μg der DNA, extrahiert von den Zellen, wurden auf Nylonfiltern (Boehringer) unter Verwendung der Biorad-Dot-Blot-Auftragung präabsorbiert. Die Filter wurden dann 4 Stunden bei 65°C mit einer Lösung, umfassend 0,5 M Natriumpyrophosphat (NaPi), 1 mM EDTA, 7 % SDS, prähybridisiert. Die mit 32P(alpha) markierte Probe wurde unter Verwendung von Plasmid-pCMVluc-DNA als Templat und dem zufällig geprimten Asmersham-Kit hergestellt. Der Filter wurde in dem gleichen Prähybridisierungspuffer 12 Stunden bei 42°C hybridisiert, wobei 1 × 106 CPM/ml verwendet wurden. Der Filter wurde dann 3 10-Minuten-Waschungen bei 65°C in einem Puffer mit 40 mM NaPi, 1 % SDS unterworfen. Die autoradiographische Analyse wurde mit Hilfe eines Phosphor-Bildgebers durchgeführt, der Phosphor-Screens verwendet, die durch beta-Strahlung aktiviert sind, was mit Hilfe eines Photomultiplier-Systems in Verbindung mit einem Bildanalyseprogramm gelesen und quantifiziert wird. Die Densitometrie, durchgeführt auf dem Dot Blot, erfolgte unter Verwendung eines IP-LabGel-Bildanalyseprogramms.
  • Plasmid-DNA-Transfektion-Tests
  • Eine Anzahl von Plasmid-DNA-Transfektions-Tests wurde sowohl in vitro als auch in vivo durchgeführt.
  • Sowohl DOTAP als auch DOTMA wurden als kationische Referenzlipide verwendet, deren Transfektionskapazität reichlich charakterisiert und von Abkenet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90, 6518 beschrieben ist. Bei den in vivo Experimenten wurden verschiedene molare Verhältnisse von kationischen Lipiden zu Plasmid-DNA für die Zwecke der Bestimmung der Aktivität der kationischen Lipide und der jeweiligen effizientesten Konzentrationen für den Gen-Transfer analysiert. Die Transfektionsfähigkeit der verschiedenen Liposome wurden sowohl in vitro als auch in vivo unter Verwendung des Luciferase-Gentransporters, enthalten in dem pCMVluc-Plasmid, ausgewertet, dessen Aktivität, ausgedrückt als relative Lumineszenzeinheiten (RLU) (zuvor beschrieben) für die leichte Quantifizierung erzeugt war.
  • Als Alternative wurde die Transfektionseffizienz einer Anzahl von kationischen Liposomen mit Hilfe der densitrometrischen Analyse (Phosphorbildgeber) von Proben von DNA, extrahiert von transfizierten Zellen, präabsorbiert auf Nitrocellulose-Filtern (Dot-Blot) und mit 31P-markierten Plasmid-DNA-Markern hybridisiert, wie zuvor beschrieben ausgewertet.
  • In vivo-Transfektionstests
  • Abhängigkeit der in vivo-Transfektionseffizienz auf ST 983-Liposom: DNA-molares Verhältnis
  • Bei diesem Experiment wurde die Abhängigkeit von Leber-, Lungen- und Herztransfektionseffizienz von ST 983 Liposom:Plasmid-DNA-molares Verhältnis ausgewertet. Die folgenden nmol-Verhältnisse von Liposom pro μg DNA wurden getestet: 12:1, 24:1, 36:1 und 48:1.
  • Gruppen von 6 Balb/c-Mäusen mit einem Gewicht von ungefähr 20 g wurde intravenös mit den oben erwähnten Mengen des Liposom-DNA-Komplexes in 200 μl Volumen PBS intravenös behandelt und 24 Stunden nach der Verabreichung des Komplexes getötet.
  • Die Luciferase-Aktivität, extrahiert von dem Lungen-, Herz- und Lebergewebe ergab eine hauptsächlich pulmonale Verteilung von Luciferase bei allen untersuchten molaren Verhältnissen. Tatsächlich waren ungefähr 99 % der Gesamtluciferase, extrahiert von den drei Geweben, in den Lungen lokalisiert. Das molare Liposom:DNA-Verhältnis von 12:1 erwies sich als das beste.
  • Plasmid-DNA-Transfektion in HeLa-Zellen mit ST 722 Liposom
  • Die 1 und 2 zeigen die Plasmid-DNA-Transfektionseffizienz des ST 772 Liposoms in HeLa-Zellen. Für diesen Zweck wurde eine densitrometrische Analyse der DNA, extrahiert von den Zellen, transfiziert mit ST 272 und mit DOTAP als kationisches Referenzlipid durchgeführt. Die Ergebnisse der Blot-Analyse ergab Mengen von Plasmid-DNA in der gleichen Größenordnung, wie es für DOTAP erhalten wurde.

Claims (28)

  1. Verbindungen der Formel (I):
    Figure 00240001
    worin: n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist; R Wasserstoff oder geradkettiges oder verzweigtes Alkanoyl mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen ist; R1 und R2, die gleich oder verschieden sein können, eine gesättigte oder ungesättigte, geradkettige Acylkette mit 3 bis 20 Kohlenstoffatomen sind; und X– das Anion einer pharmakologisch akzeptablen Säure ist.
  2. Verbindung nach Anspruch 1, worin R ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Acetyl, Propionyl, Butyryl, Valeryl und Isovaleryl.
  3. Verbindung nach Anspruch 1, worin R1 und R2 ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Hexanoyl, Undecanoyl, Myristoyl, Palmitoyl oder Oleoyl.
  4. Verbindung nach Anspruch 1, worin X– ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Chlorid; Bromid; Iodid; Aspartat; saurem Aspartat; Citrat; saurem Citrat; Tartrat; saurem Tartrat; Phosphat; saurem Phosphat; Fumarat; saurem Fumarat; Glycerophosphat; Glucosephosphat; Lactat; Maleat; saurem Maleat; Mucat; Orotat; Oxalat; saurem Oxalat; Sulfat; saurem Sulfat; Trichloracetat; Trifluoracetat; Methansulfonat; Pamoat und saurem Pamoat.
  5. Verbindung nach Anspruch 1, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus – Ester von L-Carnitinbromid mit 2-Hydroxyacetyl-1,3-dipalmitoylglycerin; – Ester von Acetyl-L-carnitinbromid mit 2-Hydroxyacetyl-1,3-dipalmitoylglycerin; – Ester von Propionyl-L-carnitinbromid mit 2-Hydroxyacetyl-1,3-dipalmitoylglycerin; – Ester von Isobutyryl-L-carnitinbromid mit 2-Hydroxyacetyl-1,3-dipalmitoylglycerin; – Ester von Isovaleryl-L-carnitinbromid mit 2-Hydroxyacetyl-1,3-dipalmitoylglycerin; – Ester von L-Carnitinbromid mit 1,3-Dihexanoyl-2-hydroxycetylglycerin; – Ester von Acetyl-L-carnitinbromid mit 1,3-Dihexanoyl-2-hydroxyacetylglycerin; – Ester von Propionyl-L-carnitinbromid mit 1,3-Dihexanoyl-2-hydroxyacetylglycerin;
  6. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Erzeugung von Liposomen.
  7. Liposom, umfassend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
  8. Liposom nach Anspruch 7, weiterhin umfassend Helferlipide.
  9. Liposom nach Anspruch 8, worin das Helferlipid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cholesterin, 1-Palmitoyl-2-oleoylphosphatidylcholin oder Dioleylphosphatidylcholin.
  10. Verwendung eines Liposoms nach einem der Ansprüche 7 bis 9 zur Herstellung einer Zusammensetzung, die für den Transport von pharmakologisch aktiven Verbindungen nützlich ist.
  11. Verwendung nach Anspruch 10, worin die pharmakologisch aktive Verbindung ein natürlich auftretendes oder modifiziertes Plasmid oder Polynukleotid ist.
  12. Verwendung nach Anspruch 11, worin das Plasmid oder Polynukleotid bei der Gentherapie nützlich ist.
  13. Verwendung nach Anspruch 11, worin das Plasmid oder Polynukleotid ein Peptid oder Protein codiert, das als Impfstoff nützlich ist.
  14. Verwendung nach Anspruch 10, worin die aktive Verbindung ein Arzneimittel ist.
  15. Verwendung nach Anspruch 14, worin das Arzneimittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antikrebs-, antiangiogenen, Antivirus-, antibakteriellen, Antifungus-, Antiprotozoan-Mitteln, Verbindungen, die für das kardiovaskuläre System aktiv sind, oder immunogenen Peptiden.
  16. Verwendung nach Anspruch 15, worin das Arzneimittel ein Antikrebs- oder antiangiogenes Mittel ist.
  17. Verwendung nach Anspruch 16, worin das Antikrebsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Taxol oder Camptothecinderivat.
  18. Verwendung nach Anspruch 17, worin das Derivat von Camptothecin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus – 7-Carbonitrilcamptothecin; – 7-Benzyloxyiminomethylcamptothecin und – 7-Butoxyiminomethylcamptothecin.
  19. Verwendung eines Liposoms nach den Ansprüchen 7 bis 9 zur Erzeugung einer kosmetischen Zusammensetzung.
  20. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Liposom nach den Ansprüchen 7, 8 oder 9.
  21. Zusammensetzung nach Anspruch 20, worin das Liposom eine pharmakologisch aktive Verbindung umfasst.
  22. Zusammensetzung nach Anspruch 21, worin die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antikrebs-, antiangiogenen, Antivirus-, antibakteriellen, Antifungus-, Antiprotozoan-Mitteln, Verbindungen, die für das kardiovaskuläre System aktiv sind, oder immunogenen Peptiden.
  23. Zusammensetzung nach Anspruch 21, worin die aktive Verbindung ein natürlich auftretendes oder modifiziertes Plasmid oder Polynukleotid ist.
  24. Zusammensetzung nach Anspruch 22, worin das Plasmid oder Polynukleotid bei der Gentherapie nützlich ist.
  25. Zusammensetzung nach Anspruch 22, worin das Plasmid oder Polynukleotid ein Peptid oder Protein codiert, das als Impfstoff nützlich ist.
  26. Kosmetikzusammensetzung, umfassend ein Liposom nach einem der Ansprüche 7 bis 9.
  27. Zusammensetzung nach Anspruch 26, worin das Liposom eine Substanz mit kosmetischer Aktivität umfasst.
  28. Zusammensetzung nach den Ansprüchen 20 bis 27, die oral, parenteral, intravenös, intramuskulär, subkutan, transdermal oder in Form eines Nasal- oder Mundsprays verabreicht werden kann.
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