ES2234591T3 - Esteres de l-carnitina o alcanoil l-carnitinas utiles como lipidos cationicos para la administracion intracelular de compuestos farmacologicamente activos. - Google Patents

Esteres de l-carnitina o alcanoil l-carnitinas utiles como lipidos cationicos para la administracion intracelular de compuestos farmacologicamente activos.

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ES2234591T3 ES00922852T ES00922852T ES2234591T3 ES 2234591 T3 ES2234591 T3 ES 2234591T3 ES 00922852 T ES00922852 T ES 00922852T ES 00922852 T ES00922852 T ES 00922852T ES 2234591 T3 ES2234591 T3 ES 2234591T3
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Abstract

Constituidos de fórmula (I) en la que: n es un número entero entre 1 y 3; R es hidrógeno o alcanoílo, lineal o ramificado, con 2-6 átomos de carbono; R1 y R2, que pueden ser iguales o diferentes, representan una cadena acílica lineal saturada o insaturada, con 3-20 átomos de carbono; y X- es el anión de un ácido farmacológicamente aceptable.

Description

Ésteres de L-carnitina o alcanoil L-carnitinas útiles como lípidos catiónicos para la administración intracelular de compuestos farmacológicamente activos.
La invención descrita en el presente documento se refiere a una clase de nuevos ésteres de L-carnitina y acil
L-carnitinas y su uso como lípidos catiónicos adecuados para favorecer la administración intracelular de constituidos farmacológicamente activos, facilitando su transporte transmembrana, o para promover su interacción con sitios de la membrana celular específicos (receptores).
La invención descrita en el presente documento también se refiere a ésteres de L-carnitina y acil L-carnitinas más conocidos, útiles para los mismos propósitos que los nuevos constituidos anteriormente mencionados.
Lo que se quiere decir aquí mediante el término "administración intracelular" es la transfección celular con polinucleótidos o plásmidos de origen natural o modificado, dotados de actividad terapéutica (administración génica) o la introducción de fármacos o péptidos inmunogénicos en las células.
Muchas de las sustancias farmacológicamente activas, tales como, por ejemplo, polipéptidos y proteínas o fármacos en general necesitan penetrar en las células para ejercer sus efectos influyendo en las funciones celulares a nivel molecular o subcelular. Para estas moléculas la membrana celular constituye una barrera selectivamente impermeable. La membrana celular, de hecho, desempeña una función protectora, impidiendo la entrada de sustancias potencialmente tóxicas, pero también el paso de constituidos con actividad terapéutica. La compleja composición de la membrana celular incluye fosfolípidos, glicolípidos y proteínas; su función está influida por los componentes citoplasmáticos tales como Ca^{++} y otros iones, ATP, microfilamentos, microtúbulos, enzimas y proteínas que unen Ca^{++}. La interacción entre los componentes citoplasmáticos y estructurales de las células y la respuesta a señales externas son responsables de la selectividad mostrada por y entre los diversos tipos celulares diferentes. El efecto barrera de las membranas se puede superar combinando sustancias en complejos con formulaciones lípidas que reproducen la composición de los lípidos de membrana de origen natural. Estos lípidos son capaces de fusionarse con las membranas y de liberar las sustancias combinadas con ellos en las células. Los complejos lipídicos son capaces no sólo de facilitar la transferencia intracelular por medio de su fusión con las membranas, sino que también disminuyen la repulsión de cargas entre la membrana y la molécula que tiene que penetrar en la célula. Los lípidos anfipáticos, tales como los fosfolípidos de membrana, forman vesículas lipídicas o liposomas en sistemas acuosos.
Los liposomas son vesículas en las cuales un volumen acuoso está completamente encerrado mediante una o más membranas compuestas de moléculas de lípidos, normalmente fosfolípidos. Los fosfolípidos, que consisten en una cabeza hidrófila y un par de cadenas de carbono (cola hidrófoba), son los componentes principales de las membranas biológicas. En disolución acuosa las colas hidrófobas se autoasocian para expulsar el agua, mientras que las cabezas hidrófilas interaccionan con el medio, formando espontáneamente poblaciones de vesículas de diámetros variables. Los lípidos generalmente son bipolares, neutros o aniónicos. Estas vesículas se pueden usar como vehículos de fármacos, moléculas pequeñas, proteínas, nucleótidos y plásmidos.
En los últimos años, los liposomas catiónicos, una clase de vesículas cargadas positivamente preparadas a partir de lípidos sintéticos, se han usado ampliamente para la transferencia de material genético a las células. La carga negativa del ADN puede interactuar con las cargas positivas de los lípidos catiónicos, formando un complejo ADN-liposoma estable. La simplicidad y versatilidad de esta tecnología ha hecho de los liposomas un vehículo importante para la administración de genes para terapia génica en pacientes humanos. Actualmente, la mayoría de los vectores usados para terapia génica y aprobados por el NIH Recombinant Advisory Committee incluye sistemas sintéticos y víricos.
La infección vírica implica una serie de mecanismos complejos para poder atacar una célula específica y transportar el ADN al núcleo. El fundamento del uso de vectores víricos para terapia génica se basa en la posibilidad de reemplazar los genes víricos por genes que codifican una función terapéutica, sin eliminar la capacidad de la partícula vírica de infectar las células. Las limitaciones de la terapia vírica tienen que ver con aquellos elementos víricos que pueden ser inmunogénicos, citopáticos y recombinogénicos.
Están puestas grandes esperanzas en el uso de lípidos catiónicos para terapia génica. Estos vectores poseen un gran potencial comparados con aquellos de origen biológico, ya que son mucho más seguros, menos tóxicos y también son capaces incorporar genes de gran tamaño. Comparados con vectores de tipo biológico, no obstante, tienen un bajo rendimiento de trascripción génica intracelular. Se debería tener en cuenta, no obstante, que el uso de dichos sistemas de transfección está en una etapa inicial de investigación. Los lípidos catiónicos desempeñan un papel muy importante en la formación de los complejos ADN-lípido, en la interacción de complejo-célula, en la fusión con la membrana, en la liberación del ADN dentro de la célula y en la trascripción.
Hay ejemplos importantes de aplicaciones in vivo de liposomas catiónicos. El primer ensayo clínico en terapia génica se llevó a cabo introduciendo un vector de expresión que contenía el gen HLA-B7 complejado a liposomas humanos para el tratamiento del melanoma. Otra aplicación importante se refiere al tratamiento de la fibrosis cística pulmonar por medio de la administración a través de la vía pulmonar o como pulverizador nasal del vector de expresión SV-40C-FTR complejado a liposomas. Actualmente están en marcha otros ensayos clínicos que implican el uso de liposomas en terapia génica para cáncer.
Generalmente se identifican cuatro elementos constituyentes en la estructura de los lípidos catiónicos: la cabeza catiónica cargada positivamente, el espaciador, el lípido de anclaje y el enlace de unión.
La cabeza catiónica es responsable de las interacciones entre los liposomas catiónicos y el ADN, entre el complejo ADN-liposoma y la membrana celular y los otros componentes de la célula. Consiste en grupos mono- o policatiónicos (dependiendo del número de cargas) que pueden estar sustituidos de manera variable.
El espaciador es la parte de la molécula que separa la cabeza catiónica de la cola hidrófoba y está implicado en asegurar el contacto óptimo entre la cabeza catiónica y las cargas negativas de los fosfatos del ADN.
El lípido de anclaje es la parte hidrocarbonada no polar de la molécula y determina las propiedades físicas de la doble capa lipídica, tales como su rigidez y su velocidad de intercambio con los lípidos de la membrana.
Lo que se quiere decir mediante "enlace de unión" es el enlace entre las cadenas hidrocarbonadas y el resto de la molécula. Este enlace determina la estabilidad química y biodegradabilidad de los lípidos catiónicos.
En los últimos años el uso de liposomas se ha incrementado de manera constante en el sector de los cosméticos. El éxito de los liposomas en este campo se debe al hecho de que estos constituidos son muy bien tolerados por la piel. Se usan como vehículos para componentes activos y como constituidos que favorecen la absorción de estos últimos.
La bibliografía de patentes y científica es abundante en referencias a la preparación y uso de liposomas; hay, sin embargo, muy pocas referencias que describan el uso de derivados de la carnitina útiles para la administración génica, mientras que para la administración de fármacos no hay documentos disponibles que se ocupen de técnicas conocidas para la preparación de constituidos que se asemejen remotamente a aquellos de acuerdo con la invención aquí des-
crita.
La solicitud de patente EP 0 279 887 describe el uso de un derivado de la carnitina, es decir, fosfatidil carnitina, opcionalmente en mezclas con otros fosfolípidos y lípidos (colesterol, fosfatidil colina, fosfatidil serina), para la preparación de liposomas.
En el ejemplo proporcionado en relación a la preparación de liposomas, los liposomas de fosfatidil carnitina se producen con propanolol incorporado, un fármaco conocido por ser activo como agente antihipertensivo, anti-angínico y antiarrítmico. El derivado carnitina se usa aquí a causa del pronunciado tropismo miocardial de la carnitina. Este tropismo hace posible evitar que los liposomas sean metabolizados por el hígado, más que alcanzar el sitio diana deseado.
La presencia de fosfatidil carnitina también hace posible administrar los liposomas oralmente, ya que son resistentes a las lipasas intestinales.
En J. Med. Chem. 18 de junio de 1998; 41(13): 2207-2215, se describen una serie de ésteres de L-carnitina útiles para la administración génica, pero no se describen o se proponen como agentes útiles para la administración de fármacos.
El documento WO 96/39193 describe nuevos agentes farmacológicos dirigidos que están dirigidos para entrar en la mitocondria a través del sistema carnitina-acilcarnitina traslocasa, pero no se sugiere de ellos que sean agentes útiles para la preparación de liposomas.
El documento EP 559 625 B1 describe una serie de ésteres de L-carnitina y acil L-carnitinas dotadas de actividad relajante muscular selectiva del tracto gastrointestinal.
En los últimos años los biólogos moleculares han identificado numerosos defectos a nivel cromosómico que provocan enfermedades hereditarias en pacientes humanos.
Un sector importante de la medicina moderna está involucrado en el tratamiento de estas enfermedades hereditarias con base genética mediante el uso de protocolos de terapia génica.
Como ya se ha mencionado, los liposomas catiónicos se usan ampliamente para la administración intracelular de constituidos farmacológicamente activos, facilitando el transporte transmembrana o promoviendo su interacción con sitios de la membrana celular específicos (receptores).
Estos vectores poseen un gran potencial comparados con aquellos de origen biológico, ya que son mucho más seguros, menos tóxicos y también son capaces incorporar genes de gran tamaño. Comparados con vectores de tipo biológico, no obstante, tienen un bajo rendimiento de trascripción génica intracelular.
Además, la transferencia génica mediada por lípidos catiónicos convencionales requiere que el plásmido de ADN y los lípidos catiónicos se mantengan separados, y que su mezcla se lleve a cabo inmediatamente antes de la transferencia génica.
Los intentos para estabilizar estos complejos polinucleótidos hasta ahora han fracasado a la hora de dar resultados alentadores; de hecho, permanecen estables solamente durante un corto período.
En el campo de la terapia génica o administración génica y administración de fármacos, hay por tanto una necesidad claramente percibida de sistemas específicos de sitio reproducibles y estables que también sean activos después de un periodo de tiempo adecuado.
Ahora se ha encontrado que una clase de lípidos catiónicos poderosamente activos en la promoción de la administración intracelular de constituidos farmacológicamente activos comprende los nuevos ésteres de L-carnitina y acil L-carnitinas.
Estos nuevos constituidos son estables y altamente selectivos debido a que son específicos de sitio a la hora de alcanzar el órgano diana.
Esta característica los hace particularmente útiles para el transporte de constituidos activos directamente al sitio en el que pueden ejercer su actividad farmacológica.
Los constituidos de acuerdo con la invención aquí descrita son constituidos con fórmula general (I):
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en la que:
n es un número entero entre 1 y 3;
R es hidrógeno o alcanoílo, lineal o ramificado, con 2-6 átomos de carbono;
R_{1} y R_{2}, que pueden ser iguales o diferentes, representan una cadena acílica lineal saturada o insaturada, con 3-20 átomos de carbono; y
X^{-} es el anión de un ácido farmacológicamente aceptable.
Ejemplos de R son acetilo, propionilo, butirilo, valerilo e isovalerilo.
Ejemplos de R_{1} y R_{2} son hexanoílo, undecanoílo, miristoílo, palmitoílo u oleoílo.
Ejemplos preferidos de constituidos de acuerdo con la invención son:
-
éster de bromuro de L-carnitina con 2-hidroxiacetil-1,3-dipalmitoil glicerol (ST 770);
-
éster de bromuro de acetil L-carnitina con 2-hidroxiacetil-1,3-dipalmitoil glicerol (ST 771);
-
éster de bromuro de propionil L-carnitina con 2-hidroxiacetil-1,3-dipalmitoil glicerol (ST 772);
-
éster de bromuro de isobutiril L-carnitina con 2-hidroxiacetil-1,3-dipalmitoil glicerol (ST 773);
-
éster de bromuro de isovaleril L-carnitina con 2-hidroxiacetil-1,3-dipalmitoil glicerol (ST 774);
-
éster de bromuro de L-carnitina con 1,3-dihexanoil-2-hidroxiacetil glicerol (ST 810);
-
éster de bromuro de acetil L-carnitina con 1,3-dihexanoil-2-hidroxiacetil glicerol (ST 809);
-
éster de bromuro de propionil L-carnitina con 1,3-dihexanoil-2-hidroxiacetil glicerol (ST 808).
Lo que se quiere decir por un anión de un ácido farmacológicamente aceptable es cualquier anión de un ácido que no incremente los efectos secundarios o tóxicos no deseados.
Estos ácidos son muy conocidos por farmacólogos y por expertos en tecnología farmacéutica.
Ejemplos de estos aniones, aunque no listados de manera exhaustiva, son: cloruro; bromuro; yoduro; aspartato; aspartato ácido; citrato; citrato ácido; tartrato; tartrato ácido; fosfato; fosfato ácido; fumarato, fumarato ácido; glicerofosfato; glucosa fosfato; lactato; maleato; maleato ácido; mucato; orotato; oxalato; oxalato ácido; sulfato; sulfato ácido; tricloroacetato; trifluoroacetato; metano sulfonato; pamoato y pamoato ácido.
Los constituidos de fórmula (I), en forma de liposomas, son agentes útiles tanto para la administración de plásmidos o nucleótidos de origen natural o modificados útiles en terapia génica, o que codifican para un péptido o proteína útil como una vacuna, y para la administración general de fármacos, tales como, por ejemplo, fármacos anticancerígenos, agentes antivíricos, agentes antibacterianos, antifúngicos, antiprotozoicos, fármacos útiles para la terapia de enfermedades del sistema cardiovascular, o péptidos inmunogénicos y otros fármacos útiles en terapia.
Los liposomas que contienen el constituido de fórmula (I) se preparan por medio de técnicas convencionales, muy conocidas para la persona que tenga conocimientos ordinarios en la técnica; véase por ejemplo Allen T. M., Drugs 56, 747-756 (1998). Los liposomas de acuerdo con la presente invención también se pueden preparar usando otros componentes muy conocidos en la práctica de la tecnología con liposomas. En una forma de realización de la presente invención, los liposomas pueden contener lípidos adyuvantes, un término que es bien comprendido en esta técnica. Ejemplos de lípidos adyuvantes son el colesterol, 1-palmitoil-2-oleoil fosfatidil colina o dioleoil fosfatidil colina.
Los liposomas de acuerdo con la presente invención se presentan de manera adecuada en forma de composiciones. En la forma de realización perteneciente a la administración de constituidos farmacológicamente activos, las composiciones se entiende que son farmacéuticas, que opcionalmente comprenden vehículos y/o excipientes farmacéuticamente aceptables.
Los constituidos de fórmula (I), en forma de liposomas, también pueden ser útiles en la preparación de composiciones cosméticas, que comprenden el liposoma per se como agente activo cosmético y para la administración de sustancias con actividad cosmética, tales como, por ejemplo, agentes hidratantes, nutrientes, sustancias para la limpieza facial, agentes antiarrugas, agentes anticelulíticos y agentes antiestrías.
Los liposomas que comprenden los constituidos de fórmula (I) se pueden administrar transdérmica, subcutánea, intramuscular, intravenosa parenteral u oralmente, o en forma de pulverizadores nasales o bucales.
El procedimiento para la preparación de los constituidos de fórmula (I) de acuerdo con la invención está representado en el siguiente diagrama de reacción, pretendiéndose que este diagrama se aplique a toda la fórmula general (I). El experto podrá obtener fácilmente todos los grupos representados por R, R_{1} y R_{2}, ya que todos los reactivos necesarios están disponibles comercialmente o descritos en la bibliografía y las condiciones de reacción son aplicables de manera general a todo el alcance de la presente invención, llevándose a cabo normalmente cualquier modificación si fuese necesaria dentro de los conocimientos generales comunes.
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Con referencia al diagrama de reacción 1 anterior, la preparación de los constituidos de fórmula (I) de acuerdo con la invención se ilustra aquí a continuación.
Ejemplo 1 Preparación del éster de bromuro de propionil L-carnitina con 2-hidroxiacetil-1,3-dipalmitoil glicerol (ST 772) a) Preparación de 1,3-dipalmitato de 1,3-dihidroxipropan-2-ona (1)
Se disolvió dihidroxiacetona (7 g, 0,078 mol) en 300 ml de cloroformo anhidro a 0ºC (temperatura externa) en flujo de nitrógeno anhidro.
A la disolución así obtenida se añadió gota a gota cloruro de palmitoílo (44 g, 0,16 mol) y piridina anhidra (15 ml).
La mezcla resultante, cuya temperatura se elevó hasta temperatura ambiente, se mantuvo en agitación durante 24 horas.
A continuación la mezcla se extrajo en el orden siguiente: con 300 ml de una disolución acuosa de ácido clorhídrico al 0,5%, 300 ml de una disolución acuosa de bicarbonato sódico al 5% y finalmente con 300 ml de agua.
La fase orgánica separada se deshidrató sobre sulfato sódico anhidro, se filtró en un filtro de celulosa y se concentró hasta sequedad, obteniendo el producto en bruto (1).
El producto puro (1) se obtuvo por cristalización en 500 ml de alcohol etílico.
Se obtuvieron 30,4 g del producto (1).
Rendimiento: 73%
P.f. = 80-81ºC
RMN ^{1}H (CDCl_{3}): 0,9 (6H, t, CH_{\underline{3}}CH_{2}-); 1,3 (48H, m, (CH_{2})_{n=24}); 1,55 (4H, m, -OCOCH_{2}CH_{\underline{2}}-); 2,4 (4H, t, -OCOCH_{\underline{2}}-); 4,7 (4H, s, -OCCH_{\underline{2}}-).
b) Preparación de 1,3-dipalmitato de 1,2,3-trihidroxipropano (2)
Se añadió agua (7,5 ml) al producto (1) (5 g, 9 mmol) lentamente, y se disolvió en tetrahidrofurano (125 ml) y tolueno (25 ml) con agitación.
La temperatura de la suspensión blanca lechosa obtenida se llevó hasta 5ºC (temperatura externa) y se añadió en pequeñas fracciones borohidruro sódico (500 mg; 13 mmol). La suspensión se mantuvo en agitación durante 30 minutos a 5ºC.
A continuación se añadió lentamente ácido acético glacial hasta que se produjo efervescencia por la descomposición del borohidruro sódico cesado en exceso, obteniendo finalmente una disolución.
Se añadió cloroformo (100 ml) a la disolución, obteniéndose la formación de un sistema bifásico.
La fase orgánica inferior que consistía en CHCl_{3} se separó, extrayéndose en el orden siguiente: con agua (25 ml), bicarbonato sódico (25 ml de disolución acuosa al 10%) y agua (25 ml).
La disolución orgánica que contenía (2) se deshidrató sobre sulfato sódico, se filtró y se concentró hasta sequedad, obteniéndose un producto ceroso.
El producto (2) se obtuvo por cristalización en acetona del producto en bruto ceroso.
Se obtuvieron 4,8 g del producto (2).
Rendimiento: 94%.
P.f. = 71-72ºC
RMN ^{1}H (CDCl_{3}): 0,9 (6H, t, CH_{\underline{3}}CH_{2}-); 1,3 (48H, m, (CH_{2})_{n=24}); 1,55 (4H, m, -OCOCH_{2}CH_{\underline{2}}-); 2,4 (4H, t, -OCOCH_{\underline{2}}-); 4,2 (5H, m, -CHCH_{\underline{2}}O-).
c) Preparación de 1,3-dipalmitoil-2-bromoacetil glicerol (3)
El producto (2) (2,5 g; 4,4 mmol) se solubilizó en cloroformo anhidro (50 ml) en agitación y a 0ºC (temperatura externa).
A la disolución así obtenida se añadió piridina lentamente (0,42 ml) y 3 ml de una disolución de cloroformo que contenía cloruro de bromoacetilo (0,43 ml; 5,2 mmol) gota a gota.
La mezcla de reacción se mantuvo durante 30 minutos a 0ºC (temperatura externa) y durante 30 minutos a temperatura ambiente.
A continuación la mezcla de reacción se trató en el orden siguiente con: una disolución acuosa de ácido clorhídrico al 1% (50 ml aproximadamente), una disolución acuosa de bicarbonato sódico al 5% (50 ml aproximadamente) y agua.
El producto (3) se purificó por cristalización en acetona, después de deshidratar la mezcla de reacción (con sulfato sódico) y concentrar hasta sequedad.
Se obtuvieron 2,5 g del producto (3).
Rendimiento: 89%.
P.f. = 46-47ºC
RMN ^{1}H (CDCl_{3}): 0,9 (6H, t, CH_{\underline{3}}CH_{2}-); 1,3 (48H, m, (CH_{2})_{n=24}); 1,55 (4H, m, -OCOCH_{2}CH_{\underline{2}}-); 2,4 (4H, t, -OCOCH_{\underline{2}}-); 3,9 (2H, s, -OCH_{\underline{2}}COO-); 4,2-4,4 (5H, m, -CHCH_{\underline{2}}O-); 5,25 (1H, m, -CHCH_{2}O-).
d) Preparación del éster de bromuro de L-propionil carnitina con 2-hidroxiacetil-1,3-dipalmitoilglicerol (4)
La sal interna de L-propionil carnitina (0,95 g, 4,4 mmol) secada previamente sobre vacío a 40ºC se suspendió en dimetilformamida anhidra (20 ml aproximadamente).
El producto (3) (3 g, 4,7 mmol) se añadió a la suspensión en fracciones pequeñas. La suspensión se calentó lentamente hasta 38ºC y se mantuvo en estas condiciones hasta que se obtuvo una disolución.
Después de 10 minutos la disolución se llevó a 0ºC durante 30 minutos. Se obtuvo un precipitado, que se filtró y se lavó con etil éter y se disolvió en cloroformo (100 ml). La disolución opalescente obtenida (30 ml) se filtró sobre Celite y se concentró. A esta última disolución se añadió hexano (100 ml), y el precipitado del producto (4) obtenido se filtró y se secó sobre vacío a 35ºC.
Se obtuvieron 3,19 g del constituido del título.
Rendimiento: 80%.
P.f. = 127-128ºC
[\alpha]^{25}_{D} = -3,9 (C = cloroformo al 1%)
Análisis elemental de C_{47}H_{88}BrNO_{10}
C% H% N% Br%
Calculado 62,23 9,78 1,54 8,81
Hallado 62,73 10,15 0,79 8,77
RMN ^{1}H (CDCl_{3}): 0,9-0,95 (6H, t, CH_{\underline{3}}CH_{2}CH_{2}-); 1,1-1,2 (3H, t, CH_{3}CH_{2}CO); 1,2-1,4 (24H, m, (CH_{2})_{n=24}); 1,5-1,6 (4H, m, -OCCH_{2}CH_{\underline{2}}-); 2,3-2,4 (4H, t, -OCCH_{\underline{2}}CH_{2}-); 2,4-2,45 (4H, dd, -CHCH_{\underline{2}}O-); 2,95 (2H, d, -CH_{\underline{2}}COOCH_{2}
COO-); 3,5 (9H, s, N (CH_{3})_{3}); 4,2 (4H, m, -CH_{\underline{2}}OCOCH_{2}-); 4,35 (2H, m, -CH_{\underline{2}}N-); 4,65 (2H, dd, -OCH_{\underline{2}}CO-); 5,25 (1H, m, -OCH_{2}CHCH_{2}O-); 5,75 (1H, m, -CHCH_{2}N-).
Ejemplos 2-7
Los siguientes constituidos se prepararon de la misma manera que en el ejemplo precedente:
-
éster de bromuro de L-carnitina con 2-hidroxiacetil-1,3-dipalmitoil glicerol (ST 770);
-
éster de bromuro de acetil L-carnitina con 2-hidroxiacetil-1,3-dipalmitoil glicerol (ST 771);
-
éster de bromuro de isobutiril L-carnitina con 2-hidroxiacetil-1,3-dipalmitoil glicerol (ST 773);
-
éster de bromuro de isovaleril L-carnitina con 2-hidroxiacetil-1,3-dipalmitoil glicerol (ST 774);
-
éster de bromuro de L-carnitina con 1,3-dihexanoil-2-hidroxiacetil glicerol (ST 810);
-
éster de bromuro de acetil L-carnitina con 1,3-dihexanoil-2-hidroxiacetil glicerol (ST 809);
-
éster de bromuro de propionil L-carnitina con 1,3-dihexanoil-2-hidroxiacetil glicerol (ST 808).
Una forma de realización preferida de la invención aquí descrita consiste en la preparación de liposomas con fármacos anticancerígenos, y particularmente liposomas que actúan como vehículos para camptotecinas, por ejemplo aquellos descritos en el documento WO 97/31003. En una forma de realización más preferida, la invención aquí descrita proporciona liposomas para la administración de camptotecinas de fórmula general (IV):
6
en la que: R_{7} es un grupo -C(R_{11})=N-O_{(n)}R_{10}, en la que R_{10} es hidrógeno o un grupo alquilo C_{1-}C_{5} o alquenilo C_{1-}C_{5}, lineal o ramificado, o un grupo cicloalquilo C_{3-}C_{10}, o un grupo cicloalquil (C_{3-}C_{10}) alquilo (C_{1-}C_{5}) lineal o ramificado, o un arilo C_{6-}C_{14}, o un grupo aril (C_{6-}C_{14}) alquilo (C_{1-}C_{5}) lineal o ramificado, o un heterociclo o un grupo heterociclo-alquilo (C_{1-}C_{5}) lineal o ramificado, dicho grupo heterociclo que contiene al menos un heteroátomo seleccionado entre átomos de nitrógeno, opcionalmente sustituido por un grupo alquilo (C_{1-}C_{5}), y/u oxígeno y/o azufre; dichos grupos alquilo, alquenilo, cicloalquilo, arilo, aril-alquilo, heterociclo y heterociclo-alquilo estando opcionalmente sustituidos con otros grupos seleccionados entre: halógeno, hidroxilo, alquilo C_{1-}C_{5}, alcoxilo C_{1-}C_{5}, fenilo, ciano, nitro, -NR_{12}R_{13}, en la que R_{12} y R_{13}, que pueden ser iguales o diferentes, son hidrógeno, alquilo (C_{1-}C_{5}) lineal o ramificado, el grupo -COOH o uno de sus ésteres farmacéuticamente aceptables; o el grupo -CONR_{14}R_{15}, en la que R_{14} y R_{15}, que pueden ser iguales o diferentes, son hidrógeno, alquilo (C_{1-}C_{5}) lineal o ramificado; o
R_{10} es un residuo aroílo C_{6}-C_{10}, opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados entre: halógeno, hidroxilo, alquilo C_{1-}C_{5} lineal o ramificado, alcoxilo C_{1-}C_{5} lineal o ramificado, fenilo, ciano, nitro, -NR_{16}R_{17}, en la que R_{16} y R_{17}, que pueden ser iguales o diferentes, son hidrógeno, alquilo C_{1-}C_{5} lineal o ramificado;
R_{10} es un residuo poliaminoalquilo; o
R_{10} es un residuo glicosilo;
n es el número 0 ó 1;
R_{11} es hidrógeno, alquilo C_{1-}C_{5} lineal o ramificado, alquenilo C_{1-}C_{5} lineal o ramificado, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, cicloalquil (C_{3}-C_{10}) alquilo (C_{1-}C_{5}) lineal o ramificado, arilo C_{6}-C_{14}, aril (C_{6}-C_{14}) alquilo (C_{1-}C_{5}) lineal o ramificado;
R_{8} y R_{9}, que pueden ser iguales o diferentes, son hidrógeno, hidroxilo, alcoxilo C_{1-}C_{5} lineal o ramificado;
sus N_{1}-óxidos, isómeros únicos, particularmente los isómeros syn y anti del grupo -C(R_{11})=N-O_{(n)}R_{10}, sus posibles enantiómeros, diasteroisómeros y mezclas relacionadas, sus sales farmacéuticamente aceptables y sus metabolitos activos.
Los constituidos de fórmula (IV) se describen en la solicitud de patente europea Nº 99830124.6, presentada el 9 de marzo de 1999.
En lo que respecta a los constituidos de fórmula (IV) en la que n es 1 y R_{10} es como se define anteriormente, con la excepción del aroílo, estos constituidos se pueden preparar a partir de 7-aldehído camptotecina (fórmula IVa, R_{11} hidrógeno) o 7-ceto camptotecina (fórmula IVa, R_{11} distinto de hidrógeno).
7
en la que R_{7} es el grupo -C(R_{11})=O, y R_{11} es como se define en la fórmula (IV), R_{8} y R_{9} es como se define en la fórmula (IV). El constituido de fórmula (IVa) se hace reaccionar con el constituido de fórmula (Va) R_{10}O-NH_{2}, en la que R_{10} es como anteriormente, para dar constituidos de fórmula (I), en la que R_{7} es el grupo -C(R_{11})=N-O-R_{10}, R_{10} se define como en la fórmula (IV), excepto por el aroílo.
La reacción se puede llevar a cabo con procedimientos convencionales conocidos por expertos en la materia, el procedimiento consiste en la formación normal de oximas. Preferentemente, la relación molar de 7-aldehído o 7-ceto camptotecina a hidroxilamina debería estar en el intervalo de 1:3 a 3:1. También se pueden usar las sales de hidroxilamina pertinentes. La reacción se lleva a cabo en presencia de una base, por ejemplo, una base inorgánica tal como carbonato potásico, o una base orgánica, tal como trietilamina o diazabiciclononano, usando disolventes polares, preferentemente metanol o etanol, y llevando a cabo la reacción a un intervalo de temperaturas entre temperatura ambiente y la temperatura del punto de ebullición del disolvente, opcionalmente en presencia de agentes deshidratantes, por ejemplo sulfato de sodio o de magnesio, tamices moleculares. Si fuese necesario, la reacción también se puede llevar a cabo en presencia de un catalizador, por ejemplo un ácido de Lewis.
Alternativamente, los constituidos anteriormente mencionados se pueden preparar a partir de la oxima del 7-aldehído camptotecina (obtenido como se describe en Sawada y colaboradores, Chem. Phar. Bull. 39, 2574 (1991)), o la 7-cetona o a partir de la 7-acilcamptotecina correspondiente por reacción con un haluro R_{10}-X, en la que X preferentemente es yodo, en un disolvente polar, por ejemplo tetrahidrofurano o alcoholes, y en presencia de una base, por ejemplo, hidruro sódico o carbonato potásico.
En lo que respecta a los constituidos de fórmula (IV) en la que n es 1 y R_{10} es aroílo, como se define en la fórmula (IV), estos constituidos se pueden preparar a partir de la 7-oxima camptotecina, cuya preparación se describe en el párrafo anterior, con cloruros de acilo R_{10}-COCl, en disolventes polares, y en presencia de una base, preferentemente piridina, o directamente en piridina, como se describe por Cho y colaboradores, J. Org. Chem. 62, 2230 (1997).
En lo que respecta a los constituidos de fórmula (IV) en la que n es 0 y R_{10} es como se define anteriormente, con la excepción del aroílo, los constituidos se pueden preparar a partir de la 7-aldehído camptotecina (fórmula IVa, R_{11} hidrógeno) o 7-ceto camptotecina (fórmula IVa, R_{11} distinto de hidrógeno).
8
en la que R_{7} es el grupo -C(R_{11})=O, y R_{11} es como se define en la fórmula (IV), R_{8} y R_{9} son como se define en la fórmula (IV). El constituido de fórmula (IVa) se hace reaccionar con el constituido de fórmula (Vb) R_{10}-NH_{2}, en la que R_{10} es como se define anteriormente, para dar constituidos de fórmula (IV), en la que R_{7} es el grupo -C(R_{11})=N-O-R_{10}, R_{10} se define como en la fórmula (IV), excepto por el aroílo. La reacción se puede llevar a cabo con procedimientos convencionales conocidos por expertos en tecnología farmacéutica, el procedimiento consiste en la formación normal de iminas. Preferentemente, la relación molar de 7-aldehído o 7-ceto camptotecina a imina debería estar en el intervalo de 1:3 a 3:1. También se pueden usar las sales de amina pertinentes. La reacción se lleva a cabo en presencia de una base, por ejemplo, una base inorgánica tal como carbonato potásico, o una base orgánica, tal como trietilamina o diazabiciclononano, usando disolventes polares, preferentemente metanol o etanol, y llevando a cabo la reacción a un intervalo de temperaturas entre temperatura ambiente y la temperatura del punto de ebullición del disolvente, opcionalmente en presencia de agentes deshidratantes, por ejemplo sulfato de sodio o de magnesio, tamices moleculares. Si fuese necesario, la reacción también se puede llevar a cabo en presencia de un catalizador, por ejemplo un ácido de Lewis como se describe, por ejemplo, por Moretti y Torre, Synthesis, 1970, 141; o por Kobayashi y colaboradores, Synlett, 1977, 115).
La 7-aldehído camptotecina y la 7-oxima camptotecina se describen en la solicitud de patente europea EP 0056692 y en el artículo anteriormente citado de Sawada y colaboradores, Chem. Pharm. Bull. 39, 2574 (1991).
Los N_{1}-óxidos de los constituidos de fórmula (IV) se preparan de acuerdo con procedimientos de oxidación de nitrógenos heteroaromáticos conocidos, preferentemente por oxidación con ácido acético o trifluoroacético y peróxido de hidrógeno, o por reacción con peroxiácidos orgánicos (A. Albini y S. Pietra, Heterocyclic N-oxides, CRC, 1991).
En lo que respecta a la importancia variable de R_{10}, presente en los diferentes reactivos de fórmula V, estos reactivos están disponibles comercialmente, o se pueden preparar de acuerdo con procedimientos comunes a los de la bibliografía, a los cuales puede recurrir un experto en el sector, como suplemento para su propio conocimiento de la materia.
Las sales farmacéuticamente aceptables se obtienen con procedimientos convencionales descritos en la bibliografía, y que no necesitan de una descripción más profunda.
Ejemplo 8 7-benciloxiiminometilcamptotecina (CPT 172)
Se disolvieron 500 mg (1,33 mmol) de 7-formilcamptotecina en 100 ml de etanol. Se añadieron 15 ml de piridina y 638 mg (4 mmol) de clorhidrato de O-bencilhidroxilamina. La disolución se calentó a reflujo durante 5 horas. El disolvente se evaporó sobre vacío y el residuo así obtenido se purificó por cromatografía súbita en gel de sílice usando una mezcla 4:6 de hexano/acetato de etilo como eluyente.
Rendimiento: 65%
P.f. = 200-205ºC dec.
El producto obtenido consiste en una mezcla 8:2 aproximadamente de los dos isómeros syn y anti (isómero A: Rf 0,32; isómero B, Rf 0,19, en gel de sílice Merck 60 F254; eluyente: hexano:acetato de etilo 3:7).
HPLC: los análisis se llevaron a cabo en un aparato equipado con una bomba cuaternaria (HP 1050) con un inyector Rheodyne (bucle de 20 \mul) y un detector diodo-array (HP 1050) corrido por el programa de HPLC ChemStation. La obtención del espectro se hizo entre los 200 y los 600 nm y los cromatogramas se tomaron a 360 y 400 nm.
Se usó una columna de fase inversa C18 (Rainin C18, 25 x 0,4 cm, Varian) con una columna previa RP18. El análisis se llevó a cabo con un gradiente de elución lineal, comenzando con acetonitrilo:agua 30:70 a acetonitrilo al 100% en 20 minutos, con una velocidad de flujo de 1 ml/min. Los tiempos de retención fueron: 12,51 min para el isómero B y 14,48 min para el isómero A.
RMN ^{1}H (300 MHz; DMSO-d_{6}):\delta 0,88 (t, H_{3}-18A+H_{3}-18B), 1,87 8m, (H_{2}-19A+H_{2}-19B), 5,18 (s, H_{2}-5B), 5,21 (8s, H_{2}-Ph B), 5,30 (H_{2}-Ph A), 5,40 (s, H_{2}-5A), 5,45 (s, H_{2}-17A+H_{2}- 17B), 6,53 (s, -OH A+-OH B), 7,3-7,6 (m, Ar A+ Ar B+H-14A+H-14B), 7,75 (m, H-11A+H-11B), 7,85-7,95 (m, H-10A+H-10B), 7,98 (dd, H-12B), 8,18-8,27 (m, H-12A+H-9B), 8,45 (s, CH=N B), 8,59 (dd, H-9A), 9,38 (s, CH=N A).
Masas m/z 481 (M^{+} 100) 374 (30) 330 (70) 300 (30) 273 (20) 243 (20) 91 (34).
Ejemplo 9 7-butoxiiminometilcamptotecina (CPT 184)
Se disolvieron 400 mg (1,06 mmol) de 7-formilcamptotecina en 80 ml de etanol. Se añadieron 12 ml de piridina y 400 mg (3,18 mmol) de clorhidrato de O-t-butilhidroxilamina. La disolución se calentó a reflujo durante 4 horas. El disolvente se evaporó sobre vacío y el residuo así obtenido se purificó por cromatografía súbita en gel de sílice usando una mezcla 4:6 de hexano/acetato de etilo como eluyente.
Se obtuvieron 322 mg (0,72 mmol) de sólido amarillo.
Rendimiento: 68%
P.f. = 250ºC dec.
El producto obtenido consiste en una mezcla 8:2 aproximadamente de los dos isómeros syn y anti (isómero A: Rf 0,31; isómero B, Rf 0,24, en gel de sílice Merck 60 F254; eluyente: hexano:acetato de etilo 3:7).
HPLC: los análisis se llevaron a cabo en un aparato equipado con una bomba cuaternaria (HP 1050) con un inyector Rheodyne (bucle de 20 \mul) y un detector diodo-array (HP 1050) corrido por el programa de HPLC ChemStation. La obtención del espectro se hizo entre los 200 y los 600 nm y los cromatogramas se tomaron a 360 y 400 nm.
Se usó una columna de fase inversa C18 (Rainin C18, 25 x 0,4 cm, Varian) con una columna previa RP18. El análisis se llevó a cabo con un gradiente de elución lineal, comenzando con acetonitrilo:agua 30:70 a acetonitrilo al 100% en 20 minutos, con una velocidad de flujo de 1 ml/min. Los tiempos de retención fueron: 12,92 min para el isómero B y 14,61 min para el isómero A.
RMN ^{1}H (300 MHz; DMSO-d_{6}):\delta 0,88 (t, H_{3}-18A+H_{3}-18B), 1,30 (s, t-but.B), 1,47 (s, t-but.A), 1,87 (m, H_{2}-19A+H_{2}-19B), 5,18 (s, H_{2}-5B), 5,37 (H_{2}-5A), 5,42 (s, H_{2}-17A+H_{2}-17B), 6,54 (s, -OH A+-OH B), 7,35 (s, H-14A), 7,36 (s, H-14A), 7,69-7,83 (m, H-11A+H-11B), 7,85-7,98 (m, H-10A+H-10B), 8,07 (dd, H-9B), 8,16-8,27 (m, H-9A+H-12B), 8,40 (s, CH B), 8,62 (dd, H-12A), 9,31 (s, CH A).
Masas m/z 448 (M^{+} 28) 391 (40) 374 (100) 362 (40) 330 (34) 57 (17).
Preparación de liposomas
Los constituidos de acuerdo con la invención se pueden usar para preparar liposomas multilamelares (MLV) y liposomas unilamelares (SUV), ambos en forma de polvos secos y en forma de suspensiones en disoluciones
acuosas.
Los constituidos de acuerdo con la invención, preparados como se describe en los ejemplos 1-7, se usan para preparar los liposomas de acuerdo con el siguiente procedimiento. Se disuelve una cantidad adecuada del constituido en cloroformo; la disolución se concentra sobre vacío hasta sequedad en un evaporador rotatorio hasta que se obtiene una película de lípidos. La película de lípidos se seca sobre alto vacío hasta que las últimas trazas de disolvente remanente hayan sido eliminadas y a continuación se disuelve en alcohol tert-butílico o con agua. La disolución así obtenida se liofiliza, obteniendo un polvo suave y seco.
Los polvos se hidratan con una cantidad adecuada de disolución acuosa, obteniendo el liposoma del constituido usado, que a continuación se compleja con el polinucleótido o con el fármaco deseado.
Otro procedimiento de preparación de liposomas consiste en la adsorción de una película de lípidos, que consiste en un constituido de acuerdo con la invención en un disolvente, o en un soporte inerte adecuado tal como sorbitol, manitol u otros carbohidratos farmacológicamente aceptables. La mezcla se seca sobre vacío, obteniendo un sólido que se puede hidratar fácil y muy rápidamente antes de su uso.
Las preparaciones en forma de polvos secos presentan la ventaja de ser estables durante largos periodos, y son fáciles de usar.
Además, los constituidos de acuerdo con la invención se pueden usar para preparar liposomas complejados con ADN o con el fármaco deseado, en forma de polvos secos, de acuerdo con el siguiente procedimiento. El constituido de acuerdo con la invención se disuelve en alcohol tert-butílico o con agua; la disolución así obtenida se mezcla con el ADN o el fármaco deseado y la mezcla se liofiliza, obteniendo el complejo que podemos definir como proliposoma-ADN o proliposoma-fármaco, en forma de un polvo suave y seco.
Los polvos así obtenidos (proliposomas) se pueden usar para la preparación de composiciones farmacéuticas que se pueden administrar mediante aerosoles, o que, alternativamente, cuando se reconstituyen con agua, o con una disolución tampón adecuada, se pueden administrar parenteral u oralmente.
Los liposomas complejados con ADN o con fármacos, en forma sólida, también se pueden obtener con el procedimiento de adsorción de la película de lípidos sobre un soporte inerte tal como sorbitol, manitol u otros carbohidratos por medio del procedimiento descrito anteriormente.
Prueba de la formación de liposomas
La formación de liposomas se probó por medio de un procedimiento colorimétrico, usando un colorante soluble en agua, de acuerdo con el siguiente procedimiento. Se obtuvo una disolución acuosa del colorante soluble en agua Arsenazo III (P.m. = 776,37; 2,3 mg/ml).
Esta disolución se usó para hidratar las películas de lípidos procedentes de la preparación anteriormente mencionada en lugar del agua.
Se diluyó 100 veces con agua una alícuota de la suspensión que contenía el liposoma que encapsulaba el colorante.
Se usaron 2 ml de la suspensión de liposomas para obtener la primera lectura de densidad óptica a 660 nm; la lectura se obtuvo en relación a una mezcla igual definida como blanco. Se añadieron 200 \mul de una disolución de CaCl_{2} (15 mg/ml; 100 mM) a la primera muestra, y se midió la densidad óptica a 660 nm frente al blanco, al cual se añadieron 200 \mul de agua. El valor de absorbancia obtenido se indicó como lectura 2. Proseguimos añadiendo 100 \mul de una disolución de Triton X-100 (5% v/v; concentración final del 0,26%) a la muestra y 200 \mul de agua al blanco; la densidad óptica leída a 660 nm proporcionó el valor de la densidad óptica definida como lectura 3. Para calcular el porcentaje de colorante encapsulado, se usó la siguiente fórmula:
% de colorante encapsulado = [Lectura 3 - Lectura 2] \times 100/ Lectura 3
El porcentaje de colorante encapsulado proporciona una medida de la formación de liposomas y en promedio es del 40% aproximadamente: la medida del tamaño de los liposomas se realizó usando un Laser Light Scattering con un resultado positivo.
Ejemplos de preparación de liposomas Ejemplo 8 Preparación de taxol-liposomas SUV ST 772 (1:70)
Se disolvieron 20 mg (0,0234 mmol) de taxol y 1485 mg (1,638 mmol) de ST 772 en 20 ml de cloroformo.
La disolución se concentró hasta que se obtuvo una película de lípidos sobre la superficie del matraz de cristal.
Después de la eliminación de las últimas trazas de cloroformo con una bomba de alto vacío, se añadieron 20 ml de alcohol tert-butílico a la película de lípidos. Para obtener una disolución clara, se tuvo que calentar hasta 60ºC. La disolución se congeló inmediatamente a -70ºC con nitrógeno líquido y se liofilizó durante 24 horas.
Para obtener la suspensión de liposomas SUV final el producto liofilizado, hidratado con una disolución de PBS (20 ml), se sonicó durante 20 minutos a 0ºC.
A continuación se llevó a cabo la filtración sobre un filtro de 400 nm para eliminar las trazas de titanio liberado por la sonda del sonicador.
Prueba de estabilidad física de la preparación
La estabilidad física de la preparación se probó por medio de turbidimetría con el registro de una TDC (Time Drive Curve) a 800 nm, a 20ºC, durante 6 horas.
Se registró una tendencia de turbidez constante, indicativa de la estabilidad de la preparación, sin fenómenos de precipitación.
Se obtuvieron liposomas MLV.
Administración génica Preparación del complejo liposoma-ADN
El liposoma y el plásmido de ADN se diluyeron adecuadamente de manera separada en PBS. A continuación se añadió el ADN al liposoma y el complejo liposoma-ADN se dejó durante 30 minutos aproximadamente a 4ºC para facilitar la formación de una interacción liposoma-ADN estable.
En los experimentos in vitro, se usó 1,2-dioleoíloxi-3-trimetil-amonio propano (DOTAP) como lípido catiónico de referencia; se usaron 2,5 \mug de plásmido de ADN por 2 x 10^{5} células HeLa, la concentración de liposomas era
9 \muM.
En los experimentos in vivo, se usaron ambos DOTAP y [2,3-(dioleoil)propil]trimetilamonio (DOTMA) como lípidos catiónicos de referencia.
Las relaciones molares definidas en los resultados se refieren a concentraciones nmol de los respectivos lípidos catiónicos por mg de ADN.
En los experimentos de transfección in vivo, se usaron 25 \mug de plásmido de ADN por animal.
El plásmido pCMVluc usado en estos experimentos contenía el ADNc del gen de la luciferasa bajo el control transcripcional del promotor de citomegalovirus (CMV).
Determinación cuantitativa de actividad de la luciferasa
La actividad de la proteína luciferasa se determinó en células y tejidos usando el kit Boehringer Mannheim (cat Nº 1669 893).
Las células se lavaron tres veces en PBS y a continuación se retiraron de la placa con un raspador en tampón de lisis (fosfato potásico 100 mM, pH 7,8; ditiotreitol - DTT 1 mM) y se sometieron a tres ciclos consecutivos de congelación y descongelación. Después de centrifugar en tubos Eppendorf de 1,5 ml, el sobrenadante se usó para la prueba de luminiscencia no más de 5 horas después de la extracción de las proteínas. Las medidas de emisión de luminiscencia se hicieron usando un luminómetro a 562 nm. Después de congelar primero en N_{2} líquido seguido de molienda fina para obtener un polvo, los tejidos se resuspendieron en tampón de lisis y se incubaron durante 10-15 min en
hielo.
A continuación las muestras se centrifugaron en tubos Eppendorf de 2 ml y el sobrenadante se probó para su actividad luciferasa.
Análisis bidimensional
El ADN celular se extrajo de acuerdo con el procedimiento de lisis alcalina descrito por Sanbrook, Fritsch and Maniatis en Molecular Cloning, 1989.
5 \mug del ADN extraído de las células se preabsorbió sobre filtros de nylon (Boehringer) usando el aparato bidimensional de Biorad. A continuación los filtros se prehibridaron durante 4 horas a 65ºC con una disolución que contenía fosfato sódico 0,5 M (NaPi), EDTA 1 mM, SDS al 7%. La sonda marcada con ^{32}P(alfa) se preparó usando el plásmido de ADN pCMVluc como plantilla y el kit Amersham cebado aleatoriamente. El filtro se hibridó en el mismo tampón de prehibridación durante 12 horas a 42ºC usando 1 x 10^{6} CPM/ml. A continuación el filtro se sometió a 3 lavados de 10 minutos a 65ºC en tampón que contenía NaPi 40 mM, SDS al 1%. El análisis autorradiográfico se llevó a cabo con la ayuda de una cámara de fósforo que usa pantallas de fósforo activadas por \beta-activación que se leen y se cuantifican por medio de un sistema fotomultiplicador junto con un programa de análisis de imágenes. La densitometría realizada en la bidimensional se hizo usando un programa de análisis de imágenes IP-LabGel.
Pruebas de transfección del plásmido de ADN
Se llevaron a cabo una serie de pruebas de transfección de plásmidos de ADN tanto in vitro como in vivo.
Se usó cualquiera de los dos DOTAP y DOTMA como lípidos catiónicos de referencia, cuya capacidad de transfección ha sido ampliamente caracterizada y descrita por Abkenet y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU. 1993, 90, 6518. En los experimentos in vivo, se analizaron varias relaciones molares diferentes de lípidos catiónicos a plásmidos de ADN con el propósito de determinar la actividad de los lípidos catiónicos y las respectivas concentraciones más eficaces para la transfección génica. La capacidad de transfección de los diversos liposomas se evaluó tanto in vitro como in vivo usando el transportador del gen de la luciferasa contenido en el plásmido pCMVluc, cuya actividad, en términos de unidades de luminiscencia relativas (RLU) (descritas previamente) contribuye a una cuantificación fácil.
Como alternativa, se evaluó la eficacia de la transfección de una serie de liposomas catiónicos por medio de análisis densitométrico (cámara de fósforo) de muestras de ADN extraído de células transfectadas preabsorbidas sobre filtros de nitrocelulosa (bidimensional) e hibridadas con marcadores de plásmidos de ADN ^{32}P marcados, como se describe previamente.
Pruebas de transfección in vivo Dependencia de la eficacia de la transfección in vivo sobre la relación molar liposoma ST 983:ADN
En este experimento, se evaluó la dependencia de la eficacia de la transfección de hígado, pulmón y corazón sobre la relación molar liposoma ST 983:ADN. Se probaron las siguientes relaciones nm de liposoma por \mug de ADN: 12:1, 24:1, 36:1 y 48:1.
Grupos de 6 ratones Balb/c que pesaban 20 g aproximadamente se trataron intravenosamente con las cantidades anteriormente mencionadas de complejo liposoma-ADN en volúmenes de 200 \mul de PBS y se sacrificaron 24 horas después de la administración del complejo.
La actividad luciferasa extraída del tejido de pulmón, corazón e hígado reveló una distribución de la luciferasa predominantemente pulmonar a todas las relaciones molares analizadas. De hecho, aproximadamente el 99% de la luciferasa total extraída de los tres tejidos estaba localizada en los pulmones. La relación molar liposoma:ADN de 12:1 demostró ser la mejor.
Transfección de plásmidos de ADN en células HeLa con liposomas ST 772
Las figuras 1 y 2 muestran la eficacia de la transfección del plásmido de ADN del liposoma ST 772 en células HeLa. Para este propósito, se llevó a cabo el análisis densitométrico del ADN extraído de las células transfectadas con ST 272 y con DOTAP como lípido catiónico de referencia. Los resultados del análisis de transferencia revelan cantidades de plásmido de ADN del mismo orden de magnitud que las obtenidas con DOTAP.

Claims (28)

1. Constituidos de fórmula (I)
9
en la que:
n es un número entero entre 1 y 3;
R es hidrógeno o alcanoílo, lineal o ramificado, con 2-6 átomos de carbono;
R_{1} y R_{2}, que pueden ser iguales o diferentes, representan una cadena acílica lineal saturada o insaturada, con 3-20 átomos de carbono; y
X^{-} es el anión de un ácido farmacológicamente aceptable.
2. Constituido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que R se selecciona del grupo constituido por acetilo, propionilo, butirilo, valerilo e isovalerilo.
3. Constituido de acuerdo con la reivindicación 1 en el que R_{1} y R_{2} se seleccionan del grupo constituido por hexanoílo, undecanoílo, miristoílo, palmitoílo u oleoílo.
4. Constituido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que X^{-} se selecciona del grupo constituido por cloruro; bromuro; yoduro; aspartato; aspartato ácido; citrato; citrato ácido; tartrato; tartrato ácido; fosfato; fosfato ácido; fumarato, fumarato ácido; glicerofosfato; glucosa fosfato; lactato; maleato; maleato ácido; mucato; orotato; oxalato; oxalato ácido; sulfato; sulfato ácido; tricloroacetato; trifluoroacetato; metano sulfonato; pamoato y pamoato ácido.
5. Constituido de acuerdo con la reivindicación 1, seleccionado del grupo constituido por:
-
éster de bromuro de L-carnitina con 2-hidroxiacetil-1,3-dipalmitoil glicerol;
-
éster de bromuro de acetil L-carnitina con 2-hidroxiacetil-1,3-dipalmitoil glicerol;
-
éster de bromuro de propionil L-carnitina con 2-hidroxiacetil-1,3- dipalmitoil glicerol;
-
éster de bromuro de isobutiril L-carnitina con 2-hidroxiacetil-1,3-dipalmitoil glicerol;
-
éster de bromuro de isovaleril L-carnitina con 2-hidroxiacetil-1,3-dipalmitoil glicerol;
-
éster de bromuro de L-carnitina con 1,3-dihexanoil-2-hidroxiacetil glicerol;
-
éster de bromuro de acetil L-carnitina con 1,3-dihexanoil-2-hidroxiacetil glicerol;
-
éster de bromuro de propionil L-carnitina con 1,3-dihexanoil-2-hidroxiacetil glicerol.
6. Uso de un constituido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para la preparación de liposomas.
7. Liposomas que comprenden un constituido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
8. Liposomas de acuerdo con la reivindicación 7, que además contienen lípidos adyuvantes.
9. Liposomas de acuerdo con la reivindicación 8, en los cuales dicho lípido adyuvante se selecciona del grupo constituido por colesterol, 1-palmitoil-2-oleoil fosfatidil colina o dioleoil fosfatidil colina.
10. Uso de un liposoma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7-9, para la preparación de una composición útil para el transporte de constituidos farmacológicamente activos.
11. Uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el constituido farmacológicamente activo es un plásmido o polinucleótido de origen natural o modificado.
12. Uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el plásmido o polinucleótido es útil en terapia génica.
13. Uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el plásmido o polinucleótido codifica para un péptido o proteína útil como una vacuna.
14. Uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el constituido activo es un fármaco.
15. Uso de acuerdo con la reivindicación 14, en el que dicho fármaco se selecciona del grupo constituido por agentes anticancerígenos, antiangiogénicos, antivíricos, antibacterianos, antifúngicos, antiprotozoicos, constituidos activos sobre el sistema cardiovascular, o péptidos inmunogénicos.
16. Uso de acuerdo con la reivindicación 15, en el que dicho fármaco es un agente anticancerígeno o antiangiogénico.
17. Uso de acuerdo con la reivindicación 16, en el que dicho agente anticancerígeno se selecciona del grupo constituido por taxol o un derivado camptotecina.
18. Uso de acuerdo con la reivindicación 17, en el que dicho derivado de la camptotecina se selecciona del grupo constituido por
-
7-carbonitrilocamptotecina
-
7-benciloxiiminometilcamptotecina, y
-
7-butoxiiminometilcamptotecina.
19. Uso de acuerdo con las reivindicaciones 7-9 para la preparación de una composición cosmética.
20. Composición farmacéutica que comprende un liposoma de acuerdo con las reivindicaciones 7, 8 ó 9.
21. Composición de acuerdo con la reivindicación 20, en la cual dicho liposoma contiene un constituido farmacológicamente activo.
22. Composición de acuerdo con la reivindicación 21, en la cual dicho constituido se selecciona del grupo constituido por agentes anticancerígenos, antiangiogénicos, antivíricos, antibacterianos, antifúngicos, antiprotozoicos, constituidos activos sobre el sistema cardiovascular, o péptidos inmunogénicos.
23. Composición de acuerdo con la reivindicación 21, en la cual el constituido activo es un plásmido o polinucleótido de origen natural o modificado.
24. Composición de acuerdo con la reivindicación 22, en la cual el plásmido o polinucleótido es útil en terapia génica.
25. Composición de acuerdo con la reivindicación 22, en la cual el plásmido o polinucleótido codifica para un péptido o proteína útil como una vacuna.
26. Composición cosmética que comprende un liposoma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones
7-9.
27. Composición de acuerdo con la reivindicación 26, en la cual dicho liposoma contiene una sustancia con actividad cosmética.
28. Composición de acuerdo con las reivindicaciones 20-27, que se puede administrar transdérmica, subcutánea, intramuscular, intravenosa parenteral u oralmente, o en forma de pulverizadores nasales o bucales.
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