SK287253B6 - Estery L-karnitínu alebo alkanoyl-L-karnitínov - Google Patents

Estery L-karnitínu alebo alkanoyl-L-karnitínov Download PDF

Info

Publication number
SK287253B6
SK287253B6 SK1431-2001A SK14312001A SK287253B6 SK 287253 B6 SK287253 B6 SK 287253B6 SK 14312001 A SK14312001 A SK 14312001A SK 287253 B6 SK287253 B6 SK 287253B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
liposome
hydrogen
composition
liposomes
group
Prior art date
Application number
SK1431-2001A
Other languages
English (en)
Other versions
SK14312001A3 (sk
Inventor
Claudio Pisano
Maria Ornella Tinti
Mose Santaniello
Luciana Critelli
Giovanni Salvatori
Original Assignee
Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A. filed Critical Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A.
Publication of SK14312001A3 publication Critical patent/SK14312001A3/sk
Publication of SK287253B6 publication Critical patent/SK287253B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C229/02—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C229/04—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C229/22—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated the carbon skeleton being further substituted by oxygen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C229/02—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/22—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin
    • A61K31/225—Polycarboxylic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/02—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by special physical form
    • A61K8/14—Liposomes; Vesicles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/40—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing nitrogen
    • A61K8/44—Aminocarboxylic acids or derivatives thereof, e.g. aminocarboxylic acids containing sulfur; Salts; Esters or N-acylated derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1277—Processes for preparing; Proliposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

Opísané estery L-karnitínu a alkanoyl-L-karnitínov vzorca (I), v ktorom n je celé číslo od 1 do 3, R je vodík alebo alkanoyl, priamy alebo rozvetvený, s 2 až 6 atómami uhlíka, R1 a R2, ktoré sú to isté alebo rôzne, predstavujú nasýtený alebo nenasýtený priamy acylový reťazec s 3 až 20 atómami uhlíka, a X- je anión farmakologicky prijateľnej kyseliny, sa môžu použiť ako katiónové lipidy na vnútrobunkové dodávanie farmakologicky účinných zlúčenín.

Description

Vynález sa týka triedy nových esterov L-karnitínu a acyl-L-karnitínov a ich použitia ako katiónových lipidov vhodných na zlepšenie vnútrobunkového dodávania farmakologicky účinných zlúčenín, uľahčenie ich transmembránového prenosu alebo na zvýšenie ich interakcie so špecifickými miestami v bunkovej membráne (receptormi).
Vynález sa tiež týka ďalších známych esterov L-kamitínu a acyl-L-kamitínov vhodných na to isté použitie ako uvedené nové zlúčeniny.
Doterajší stav techniky
Termín „vnútrobunkové dodávanie“ predstavuje vnútrobunkovú transfekciu s polynukleotidmi alebo plazmidmi prírodného pôvodu alebo modifikovanými, vybavenými s terapeutickou účinnosťou (génové dodávanie) alebo zavádzanie liečiv alebo imunogénnych peptidov do buniek.
Veľa farmakologicky účinných látok, ako napríklad polypeptidy a proteíny alebo liečivá, vo všeobecnosti potrebujú preniknúť do buniek na vykonávanie ich účinkov ovplyvnením bunkových funkcii na subbunkovej alebo molekulovej úrovni. Pre tieto molekuly bunková membrána predstavuje selektívne nepriepustnú bariéru. Bunková membrána naozaj vykonáva ochrannú funkciu, ktorá bráni vstupu potenciálne toxických látok, ale tiež prechodu zlúčenín s terapeutickým účinkom. Úplné zloženie bunkovej membrány zahŕňa fosfolipidy, glykolipidy a proteíny, ich funkcia je ovplyvňovaná cytoplazmatíckými zložkami, ako je Ca2+ a iné ióny, ATP, mikrofibrilami, mikrotubulami, enzýmami a proteínmi, ktoré viažu Ca2+. Interakcia medzi štruktúrnymi a cytoplazmatíckými zložkami buniek a odpoveď na vonkajšie signály sú zodpovedné za selektívnosť preukazovanú mnohými rôznymi typmi buniek a medzi nimi. Bariérový účinok membrán sa môže prekonať kombináciou látok v komplexoch s lipidovými formuláciami, ktoré reprodukujú zloženie prírodné sa vyskytujúcich membránových lipidov. Tieto lipidy sú schopné fúzie s membránami a uvoľňovať látky s nimi skombinované do buniek. Lipidové komplexy sú schopné nielen uľahčovať vnútrobunkový prenos prostredníctvom fúzie s membránami, ale tiež môžu zmenšiť nábojové odpudzovanie medzi membránou a molekulou, ktorá má preniknúť do bunky. Amfipatické lipidy, napríklad membránové fosfolipidy, tvoria lipidové vezikuly alebo lipozómy vo vodných systémoch.
Lipozómy sú vezikuly, v ktorých je objem vody úplne uzatvorený jednou alebo viacerými membránami zloženými z molekúl lipidov, zvyčajne fosfolipidov. Fosfolipidy, ktoré pozostávajú z hydrofilnej hlavy a páru uhľovodíkových reťazcov (hydrofóbny chvost), sú hlavnými zložkami biologických membrán. Vo vodnom roztoku hydrofóbne chvosty autoasociatívne vylučujú vodu, zatiaľ čo hydrofilné hlavy interagujú s prostredím, pričom sa spontánne vytvárajú populácie vezikúl s rôznymi priemermi. Lipidy sú vo všeobecnosti amfotéme, neutrálne alebo aniónové. Tieto vezikuly sa môžu použiť ako nosiče liečiv, malých molekúl, proteínov, nukleotidov a plazmidov.
V posledných rokoch sa veľmi používali katiónové lipozómy ako trieda pozitívne nabitých vezikúl pripravených zo syntetických lipidov na prenos genetického materiálu do buniek. Negatívny náboj DNA môže interagovať s pozitívnymi nábojmi katiónových lipidov, čím sa vytvorí stabilný komplex DNA-lipozóm. Jednoduchosť a všestrannosť tejto technológie robí lipozómy významným prostriedkom na dodávanie génov v génovej terapii u ľudských subjektov. V súčasnosti väčšina vektorov používaných v génovej terapii a odsúhlasených NIH Recombínant Advísory Committee zahŕňa vírusové a syntetické systémy.
Vírusové infekcie obsahujú série komplexných mechanizmov na schopnosť zasiahnuť špecifickú bunku a preniesť DNA do jadra. Dôvodom na použitie vírusových vektorov v génovej terapii je založený na možnosti nahradenia vírusových génov s génmi, ktoré kódujú terapeutickú funkciu bez zníženia schopnosti vírusových častíc infikovať bunky. Obmedzenia vírusovej terapie predstavujú také vírusové prvky, ktoré môžu byť imunogénne, cytopatické a rekombinogénne.
Veľké nádeje sa vkladajú do použitia katiónových lipidov v génovej terapii. Tieto vektory majú veľký potenciál v porovnaní s tými, ktoré sú biologického pôvodu, pretože sú oveľa bezpečnejšie, menej toxické a sú tiež schopné zaviesť gény s veľkými rozmermi. Ale v porovnaní s vektormi biologického typu majú nízky výťažok vnútrobunkovej transkripcie. Použitie takých transfekčných systémov je v počiatočnom štádiu výskumu. Katiónové lipidy hrajú veľmi významnú úlohu v tvorbe DNA-lipidového komplexu, interakcii bunka-komplex, fúzii s membránou, pri uvoľňovaní DNA vo vnútri bunky a v transkripcii.
Ďalej sú uvedené významné príklady v in vivo aplikáciách katiónových lipozómov. Prvý klinický pokus s génovou terapiou sa uskutočnil zavedením expresného vektora s obsahom ľudského génu HLA-B7 v komplexe s lipozómom na liečbu melanómu. Iná významná aplikácia sa týka liečenia pľúcnej cystickej fibrózy prostredníctvom podávania expresného vektora SV-40C-FTR v komplexe s lipozómom cez pľúcnu cestu alebo ako nosný sprej. Iné klinické pokusy zahŕňajúce použitie lipozómov v génovej terapii na rakovinu sú v súčasnosti vo vývoji.
SK 287253 Β6
V štruktúre katiónových lipidov sú vo všeobecnosti identifikované štyri základné prvky: pozitívne nabitá katiónová hlava, oddeľovač, kotva lipidu a spojovacia väzba.
Katiónová hlava je zodpovedná za interakcie medzi katiónovými lipozómami a DNA, medzi komplexom DNA-lipozóm a bunkovou membránou a inými zložkami v bunke. Pozostáva z mono- alebo polykatiónových skupín (v závislosti od množstva nábojov), ktoré môžu byť ľubovoľne substituované.
Oddeľovač je časť molekuly, ktorá oddeľuje katiónovú hlavu od hydrofóbneho chvosta, a má za úlohu zabezpečiť optimálny kontakt medzi katiónovou hlavou a negatívnymi nábojmi fosforečnanových skupín DNA.
Kotva lipidu je nepoláma uhľovodíková časť molekuly a určuje fyzikálne vlastnosti dvojitej lipidovej vrstvy, ako je jej tuhosť a rýchlosť výmeny s membránovými lipidmi.
„Spojovacou väzbou“ sa myslí väzba medzi uhľovodíkovými reťazcami a zvyškom molekuly. Táto väzba určuje chemickú stabilitu a biodegradovateľnosť katiónových lipidov.
V posledných rokoch použitie lipozómov prudko vzrástlo v kozmetickej oblasti. Úspech lipozómov v tomto poli je vďaka skutočnosti, že tieto zlúčeniny sú veľmi dobre tolerované kožou. Používajú sa ako nosiče účinných látok a ako zlúčeniny uľahčujúce ich absorpciu.
Vedecká a patentová literatúra je bohatá na odkazy týkajúcich sa prípravy a použitia lipozómov, ale je tu veľmi málo odkazov opisujúcich použitie derivátov kamitínu vhodných na dodávanie génov, zatiaľ čo sa týka dodávania liekov, nie sú dostupné žiadne dokumenty so známymi technikami na prípravu zlúčenín vzdialene sa podobajúcich na tie, ktoré sú tu opísané podľa vynálezu.
Patentová prihláška EP 0 279 887 opisuje použitie derivátu kamitínu, t. j. fosfatidylkamitínu, prípadne v zmesiach s inými fosfolipidmi a lipidmi (cholesterol, fosfatidylcholín, fosfatidylserín), na prípravu lipozómov.
V uvedenom príklade, ktorý sa týka prípravy lipozómov, sa lipozómy fosfatidylkamitínu pripravujú zavedením propranololu, známeho liečiva účinného ako činidla proti vysokému tlaku, antiantigózneho a antiarytmického. Derivát kamitínu sa tu používa kvôli zreteľnému myokardiálnemu tropizmu kamitínu. Tento tropizmus spôsobuje to, že sa lipozómy nemetabolizujú v pečeni skôr ako dosiahnu želané cieľové miesto.
Prítomnosť fosfatidylkamitínu tiež umožňuje podávať lipozómy orálne, pretože sú odolné proti črevným lipázam.
V J. Med. Chem. 1998, 18. jún, 41(13):2207-15 je opísané množstvo esterov L-kamitínu, ktoré sú vhodné na dodávanie génov, ale nie sú opísané alebo navrhnuté ako vhodné činidlá na dodávanie liekov.
EP 559 625 BI opisuje množstvo esterov L-karnitínu a acyl-L-kamitínov so selektívnou účinnosťou na relaxáciu svalov gastrointestinálneho traktu.
V posledných rokoch molekuloví biológovia identifikovali veľa defektov na chromozomálnej úrovni, ktoré zapríčiňujú dedičné ochorenia u ľudských objektov.
Významná oblasť modernej medicíny sa týka liečenia týchto dedičných genetických ochorení prostredníctvom postupov génovej terapie.
Ako už bolo uvedené, katiónové lipozómy sa extenzívne využívajú na vnútrobunkový prenos farmakologicky účinných zlúčenín, na uľahčenie transmembránového prenosu alebo na podporu ich interakcie so Špecifickými miestami bunkovej membrány (receptory).
Tieto vektory majú veľký potenciál v porovnaní s tými, ktoré majú biologický pôvod, pretože sú oveľa bezpečnejšie, menej toxické a sú tiež schopné zavádzať gény s veľkými rozmermi. V porovnaní s vektormi biologického typu, však poskytujú nízky vnútrobunkový transkripčný výťažok.
Navyše génový prenos sprostredkovaný bežnými katiónovými lipidmi vyžaduje, aby sa plazmidová DNA a katiónové lipidy udržiavali oddelene a aby sa ich zmiešavame uskutočnilo bezprostredne pred génovým prenosom.
Pokusy stabilizovať tieto polynukleotidové komplexy boli až dosiaľ neúspešné, pričom sa získali iba neuspokojivé výsledky, skutočne tieto komplexy zostávajú stabilné iba počas krátkeho obdobia.
V oblasti génovej terapie alebo génového dodávania alebo dodávania liekov je preto silná potreba získať stabilné, reprodukovateľné miestne špecifické systémy, ktoré sú tiež účinné po vhodnom časovom období.
Podstata vy nálezu
Teraz sa zistilo, že trieda katiónových lipidov, ktoré sú veľmi účinné pri podpore vnútrobunkového dodávania farmakologicky účinných zlúčenín, obsahuje nové estery L-kamitínu a acyl-L-kamitínov.
Tieto nové zlúčeniny sú stabilné a vysoko selektívne, pretože sú miestne špecifické pri dosahovaní cieľového orgánu.
Táto charakteristika ich robí užitočnými najmä na prenos aktívnych látok priamo na miesto, kde sa môže prejaviť ich farmakologická účinnosť.
Tu opísané zlúčeniny podľa vynálezu, sú zlúčeniny všeobecného vzorca (I):
n je celé číslo od 1 do 3,
R je vodík alebo alkanoyl, priamy alebo rozvetvený, s 2 až 6 atómami uhlíka,
R1 a R2, ktoré môžu tie isté alebo rôzne, predstavujú nasýtený alebo nenasýtený priamy acylový reťazec s 3 až 20 atómami uhlíka, a
X’je anión farmakologicky prijateľnej kyseliny.
Príkladmi R sú acetyl, propionyl, butyryl, valeryl a izovaleryl.
Príkladmi R1 a R2 sú hexanoyl, undekanoyl, myristoyl, palmitoyl alebo oleoyl.
Výhodnými príkladmi zlúčenín podľa vynálezu sú:
ester L-kamitínbromidu s 2-hydroxyacetyl-l,3-dipalmitoylgly-cerolom (ST 770), ester acetyl-L-kamitínbromidu s 2-hydroxyacetyl-l,3-dipal-mitoylglycerolom(ST 771), ester propionyl-L-karnitínbromidu s 2-hydroxyacetyl-l,3-di-palmitoylglycerolom (ST 772), ester izobutyryl-L-kamitínbromidu s 2-hydroxyacetyl-l,3-di-palmitoylglycerolom (ST 773), ester izovaleryl-L-kamitinbromidu s 2-hydroxyacetyl-l,3-di-palmitoylglycerolom(ST 774), ester L-kamitínbromidu s l,3-dihexanoyl-2-hydroxyacetyl-glycerolom (ST 810), ester acetyl-L-karnitínbromidu s l,3-dihexanoyl-2-hydroxyace-tylglycerolom(ST 809), ester propionyl-L-kamitmbromidu s l,3-dihexanoyl-2-hydroxy-acetylglycerolom (ST 808).
Anión farmaceutický prijateľnej kyseliny je hocijaký anión kyseliny, ktorý nespôsobuje neželané toxické alebo vedľajšie účinky.
Tieto kyseliny sú dobre známe farmakológom a odborníkom vo farmaceutickej technológii.
Príklady takých aniónov, hoci nie sú nimi obmedzené, sú: chlorid, bromid, jodid, aspartát, hydrogenaspartát, citrát, hydrogencitrát, vínan, hydrogenvínan, fosforečnan, hydrogenfosforečnan, fumarát, hydrogenfumarát, glycerofosforečnan, glukózfosforečnan, mliečnan, maleát, hydrogénmaleát, galaktarát, orotát, šťaveľan, hydrogenšťaveľan, síran, hydrogensíran, trichlóracetát, trifluóracetát, metánsulfonát, pamoát a hydrogenpamoát.
Zlúčeniny vzorca (I) vo forme lipozómov sú činidlá vhodné na dodávame prirodzene sa vyskytujúcich alebo modifikovaných plazmidov alebo nukleotidov užitočných v génovej terapii alebo takých, ktoré kódujú peptid alebo proteín vhodný ako vakcína a na všeobecné dodávanie liečiv, napríklad protirakovinových liečiv, protivírusových, protibakteriálnych, fungicídnych, antiprotozoálnych činidiel, liečiv vhodných na liečenie ochorení kardiovaskulárneho systému alebo imunogénnych peptidov alebo iných liečiv vhodných na liečenie.
Lipozómy s obsahom zlúčeniny vzorca (I) sa pripravujú bežnými technikami, ktoré sú dobre známe odborníkovi, pozri napr. Alien T.M. Drugs 56, 747-56 (1998). Lipozómy podľa predloženého vynálezu sa môžu tiež pripraviť s použitím iných zložiek, ktoré sú dobre známe v praxi lipozómovej technológie. V jednom uskutočnení tohto vynálezu lipozómy obsahujú helperové lipidy, pričom tento názov je veľmi dobre známy v tomto odbore. Príklady helperových lipidov sú cholesterol, l-palmitoyl-2-oleoylfosfatidylcholm alebo dioleylfosfatidylcholín.
Lipozómy podľa predloženého vynálezu sú výhodne prítomné v prostriedkoch. V uskutočnení, ktoré sa týka dodávania farmakologicky účinných zlúčenín, sa ako prostriedky rozumejú farmaceutické prostriedky, výhodne s obsahom farmaceutický účinných vehikúl a/alebo excipientov.
Zlúčeniny vzorca (I) vo forme lipozómov tiež môžu byť vhodné na prípravu kozmetických prostriedkov, ktoré obsahujú lipozómy samotné ako kozmeticky aktívne činidlo, ako aj na dodávanie látok s kozmetickou účinnosťou, napríklad hydratačné činidlá, živiny, látky na čistenie pleti, protivráskové činidlá, činidlá proti celulitíde a činidlá proti ochabovaniu.
Lipozómy obsahujúce zlúčeniny vzorca (I) sa môžu podávať orálne alebo parenterálne, intravenózne, intramuskulárne, subkutánne, transdermálne alebo vo forme nosových alebo ústnych sprejov.
Tu opísaný vynález sa tiež týka ďalších katiónových lipidov všeobecného vzorca (II), ktoré sú už známe v inom použití (uvedený EP 559 625).
Spôsob prípravy zlúčenín vzorca (I) podľa vynálezu je znázornený v nasledujúcej reakčnej schéme, pričom táto schéma predstavuje celý všeobecný vzorec (I). Odborník môže ľahko získať všetky skupiny, ktoré znamenajú R, R1 a R2, pretože všetky potrebné reakčné činidlá sú komerčne dostupné alebo opísané v literatúre a reakčné podmienky sú vo všeobecnosti aplikovateľné na celý rozsah predloženého vynálezu a hocijaká modifikácia sa môže dosiahnuť v rámci všeobecných bežných poznatkov.
Vzhľadom na uvedenú reakčnú schému 1, príprava zlúčenín vzorca (I) podľa vynálezu je uvedená neskôr.
(l)a) ch2oh
C=o + 2-C1CO—(CH2)i4CH3 ch2oh
CH2OCO(CH3)14CH3 * c=o
I
CH2OCO(CH2)14CH3
CH2OCO(CH2)14CH3
C=O + NaBEL
I
CH2OCO(CH2)14CH3 (2) b)
CH2OCO(CH2)14CH3 * CH—OH
I
CH2OCO(CH2)14CH3 (3) c)
CH2OCO(CH2)14CH3
CH—OH + C10CCH2Br
CH2OCO(CH2)14CH3
CH2OCO(CH2}14CH3
CH—OCOCH2Br
CH2OCO(CH2)14CH3 (4) d)
CH2OCO(CH2)14CH3
CH—OCOCH2Br CH2OCO(CH2)14CH3
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obrázky 1 a 2 ukazujú transfekčnú účinnosť plazmidovej DNA lipozómu ST 772 v HeĽa bunkách. Uskutočnila sa denzitometrická analýza DNA extrahovanej z buniek transfektovaných s ST 272 a s DOTAP ako referenčným katiónovým lipidom. Výsledky blotovej analýzy odhalili množstvá plazmidovej DNA toho istého poriadku ako sa získalo s DOTAP.
Obrázok 3 zobrazuje, že obidva lipozómy A a B poskytli akumulovanú hladinu pre CPT 184 vyššiu ako pre voľný CPT 184 v DMSO.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Príprava esteru propionyl-L-karnitínbromidu s 2-hydroxyacetyl-l,3-dipalmitoylglycerolom (ST 772)
a) Príprava l,3-dihydroxypropan-2-ónu-l,3-dipalmitátu (1)
Dihydroxyacetón (7 g, 0,0078 mol) sa rozpustil v 300 ml bezvodého chloroformu pri 0 °C (vonkajšia teplota) pod prietokom bezvodého dusíka.
K takto získanému roztoku sa po kvapkách pridal palmitoylchlorid (44 g, 0,16 mol) a bezvodý pyridín (15 ml).
Výsledná zmes, ktorej teplota sa upravila na izbovú teplotu, sa miešala počas 24 hodín.
Zmes sa potom extrahovala v nasledujúcom poradí: s 300 ml vodného roztoku 0,5 % kyseliny chlorovodíkovej, 300 ml vodného roztoku 5 % hydrogenuhličitanu sodného a nakoniec s 300 ml vody.
Oddelená organická fáza sa vysušila nad bezvodým síranom sodným, filtrovala na celulózovom filtri a koncentrovala sa do sucha za získania surového produktu (1).
Čistý produkt (1) sa získal kryštalizáciou z 500 ml etylalkoholu.
Získalo sa 30,4 g produktu (1).
Výťažok: 73 %
Teplota tavenia = 80-81 °C
H'NMR (CDCIj): 0,9 (6H, t, CH,CH,-):. 1,3 (48H, m, (CH2)n=24), 1,55 (4H, m, -OCOCH,CH,). 2,4 (4H, t, -OCOCH,-), 4,7 (4H, s, -OCCH,).
b) Príprava l,2,3-trihydroxypropán-l,3-dipalmitátu (2)
K produktu (1) (5 g, 9 mmol), ktorý sa rozpustil v tetrahydrofútráne (125 ml), sa pomaly za miešania pridala voda (7,5 ml) a toluén (25 ml).
Teplota mliečnobielej suspenzie sa upravila na 5 °C (vonkajšia teplota) a pomaly sa pridával v malých množstvách bóran sodný (500 mg, 13 mmol). Suspenzia sa udržiavala za miešania počas 30 minút pri 5 °C.
Potom sa po kvapkách pridala ľadová kyselina octová, pokiaľ sa nezastavilo šumenie vzniknuté rozkladom nadbytku bóranu sodného za získania konečného roztoku.
Chloroform (100 ml) sa pridal k roztoku za získania dvojfázového systému.
Spodná organická fáza obsahujúca CHC13 sa oddelila a extrahovala v nasledujúcom poradí: s vodou (25 ml), hydrogenuhličitanom sodným (25 ml 10 % vodného roztoku) a vodou (25 ml).
Organický roztok obsahujúci produkt (2) sa sušil nad síranom sodným, filtroval a koncentroval do sucha za získania voskového produktu.
Produkt (2) sa získal kryštalizáciou voskového produktu.
Získalo sa 4,8 g produktu (2).
Výťažok: 94 %.
Teplota tavenia = 71 - 72 °C
H'NMR (CDClj): 0,9 (6H, t, CH,CH,-):, 1,3 (48H, m, (CH,)n=24), 1,55 (4H, m, -OCOCH,CH,). 2,4 (4H, t, -OCOCH,-). 4,2 (5H, m, -CHCH,O).
c) Príprava l,3-dipalmitoyl-2-brómacetylglycerolu (3)
Produkt (2) (2,5 g, 4,4 mmol) sa za miešanie rozpustil v bezvodom chloroforme (50 ml) pri teplote 0 °C (vonkajšia teplota).
K takto získanému roztoku sa pomaly pridával pyridín (0,42 ml) a po kvapkách 3 ml chloroformového roztoku s obsahom brómacetylchloridu (0,43 ml, 5,2 mmol).
Reakčná zmes sa udržiavala 30 minút pri 0 °C (vonkajšia teplota) a 30 minút pri izbovej teplote.
Reakčná zmes sa potom spracovala v nasledujúcom poradí: vodným roztokom 1 % kyseliny chlorovodíkovej (približne 50 ml), vodným roztokom 5 % hydrogenuhličitanu sodného (približne 50 ml) a vodou.
Produkt (3) sa čistil kryštalizáciou z acetónu, po vysušení reakčnej zmesi do sucha (so síranom sodným) a koncentroval do sucha.
Získalo sa 2,5 g produktu.
Výťažok: 89 %.
Teplota tavenia 46 - 47 °C
H'NMR (CDC13): 0,9 (6H, t, CH,CH,-):. 1,3 (48H, m, (CH2)„.24), 1,55 (4H, m, -OCOCH,CH,-). 2,4 (4H, t, -OCOCH,). 3,9 (2H, s, -OCH,COO-), 4,2-4,4 (5H, m, -CHCH,O-), 5,25 (1H, m, CHCH2O-).
d) Príprava esteru L-propionylkamitínbromidu s 2-hydroxyace-tyl-l,3-dipalmitoylglycerolom (4)
Vnútorná soľ L-propionylkamitínu (0,95 g, 4,4 mmol) predtým vákuovo vysušená sa pri 40 °C suspendovala v bezvodom dimetylformamide (približne 20 ml).
Produkt (3) (3 g, 4,7 mmol) sa v malých dávkach pridal k suspenzii. Suspenzia sa pomaly zohrievala na 38 °C a udržiavala v týchto podmienkach až kým sa nezískal roztok.
Po 10 minútach sa roztok na 30 minút ochladil na 0 °C. Získala sa zrazenina, ktorá sa filtrovala a premyla s etyléterom a rozpustila sa v chloroforme (100 ml). Získaný opalescentný roztok (30 ml) sa filtroval nad ce litom a koncentroval. K tomuto poslednému roztoku sa pridal hexán (100 ml) a získaný produkt (4) v podobe zrazeniny sa filtroval a vákuovo sušil pri 35 °C
Získalo sa 3,19 g titra zlúčeniny.
Výťažok: 80 %.
Teplota tavenia = 127 - 128 stC
[a] d = - 3,9 (C = 1 % chloroform)
Elementárna analýza C4; TfgsBrNOto
C% % % r%
Vypočítané 62,23 9,78 1,54 8,81
Nájdené 62,73 10,15 0,79 8,77
H'NMR (CDC13): 0,9-0,95 (6H, t, CH3CH,CH,-):. 1,1-1,2 (3H, t, CH3CH2CO), 1,2-1,4 (24H, M, CH2n=24), 1,5-1,6 (4H, m, -OCCH, CH?-), 2,3-2,4 (4H, t, -OCCH,CH,-). 2,4-2,45 (4H, d. d, CHCH,O-), 2,95 (2H, d, -CH,COOCH,COO-). 3,5 (9H, s, N (CH3)3), 4,2 (4H, m, -CH,OCOCH?-). 4,35 (2H, M, -CH,N-). 4,65 (2H, d, d, -OCH,CO-). 5,25 (1H, m, -OCH,CHCH,O-). 5,75 (1H, m, -CHCH2N-).
Príklady 2 až 7
Nasledujúce zlúčeniny sa pripravili takým istým spôsobom, ako je v predchádzajúcom príklade:
- ester L-karnitínbromidu s 2-hydroxyacetyl-l,3-dipalmitoylgly-cerolom (ST 770),
- ester acetyl-L-kamitínbromidu s 2-hydroxyacetyl-1,3-dipalmi-toylglycerolom (ST 771),
- ester izobutyryl-L-kamitínbromidu s 2-hydroxyacetyl-1,3-di-palmitoylglycerolom (ST 773),
- ester izovarelyl L-kamitínbromidu s 2-hydroxyacetyl-1,3-di-palmitoylglycerolom (ST 774),
- ester L-kamitinbromidu s l,3-dihexanoyl-2-hydroxyacetyl-glycerolom (ST 810),
- ester acetyl-L-kamitínbromidu s 1,3-dihexanoyl-2-hydroxyace-tylglycerolom (ST 809),
- ester propionyl-L-karnitínbromidu s l,3-dihexanoyl-2-hydroxy-acetylglycerolom(ST 808).
Jedno výhodné uskutočnenie podľa vynálezu pozostáva z prípravy lipozómov s protirakovinovými liečivami a najmä lipozómov, ktoré pôsobia ako vehikulá kamptotecinov, napríklad takých, ako sú opísané vo WO 97/31003. Vo výhodnejšom uskutočnení tu opísaný vynález poskytuje lipozómy na dodávanie kamptotecínov všeobecného vzorca (IV):
kde
R7 je skupina -C/R'^N-O^R10, v ktorej R10 je vodík alebo C] až C5 alkylová alebo Ci až C5 alkenylová skupina, priama alebo rozvetvená, alebo C3 až C10 cykloalkylová skupina, alebo priama alebo rozvetvená C3 až C10 cykloalkyl-Ci až C5 alkylová skupina, alebo C6 až C14 arylová skupina, alebo priama alebo rozvetvená C6 až C14 aryl-Ci až C5 alkylová skupina alebo heterocyklická alebo priama alebo rozvetvená heterocyklická-C! až C5 alkylová skupina, pričom heterocyklická skupina obsahuje aspoň jeden heteroatóm vybraný z atómov dusíka, prípadne substituovaného s C! až C5 alkylovou skupinou, a /alebo kyslíka a/alebo síry, pričom alkylové, alkenylové, cykloalkylové, arylové, arylalkylová, heterocyklické alebo heterocykloalkylové skupiny sú prípadne substituované s inými skupinami vybranými z halogénu, hydroxyskupiny, C[ až C5 alkylovej skupiny, C] až C5 alkoxyskupín, fenylu, kyanoskupiny, nitroskupiny, -NR12R13, kde R12 a R13 môžu byť to isté alebo rôzne a sú vodík, priama alebo rozvetvená Ci až C5 alkylskupina, skupina -COOH alebo jeden z jej farmaceutický prijateľných esterov, alebo skupina -CONR14R15, kde R14 a R15 môžu byť to isté alebo rôzne a sú vodík, priania alebo rozvetvená C] až C5 alkylskupina, alebo
R'°jeC6ažC 10 aroylový zvyšok prípadne substituovaný s jednou alebo viacerými skupinami vybranými z halogénu, hydroxyskupiny, priamej alebo rozvetvenej C[ až C5 alkylskupiny, priamej alebo rozvetvenej Ci až C5 alkoxylskupiny, fenylu, kyanoskupiny, nitroskupiny, -NR1SR17, kde R16 a R17 môžu byť to isté alebo rôzne a sú vodík, priama alebo rozvetvená Q až C5 alkylskupina,
R10je polyaminoalkylový zvyšok, alebo
R,oje glykozylový zvyšok, n je číslo 0 alebo 1,
R11 je vodík, priama alebo rozvetvená Ci až C5 alkylskupina, priama alebo rozvetvená Ci až C5 alkenylová skupina, C3 až Ci0 cykloalkylová skupina, priama alebo rozvetvená C3 až C|0 cykloalkyl-C, až C5 alkylová skupina, C6 až C14 arylová skupina, priama alebo rozvetvená C6 až C14 aryl-C! až C5 alkylová skupina,
R8 a R9 môžu byť to isté alebo rôzne a sú vodík, hydroxylová skupina, priama alebo rozvetvená C, až C5 alkoxylskupina, ich Ni-oxidy, jednotlivé izoméry, najmä syn- a antiizoméry -C(R”)=N-O(n)R10 skupina, ich možné enantioméry, diastereoméry a príbuzné zmesi, ich farmaceutický prijateľné soli a ich aktívne metabolity.
Zlúčeniny vzorca (IV) sú opísané v európskej prihláške vynálezu č. 99830124.6, podanej 9. marca 1999.
Zlúčeniny vzorca (IV), v ktorej n je 1 a R10, je ako je definované, s výnimkou aroylu, sa môžu pripraviť vychádzajúc z kamptotecín-7-aldehydu (vzorec (IVa), R11 je vodík) alebo kamptotecínu-7-ketónu (vzorec (IVa), R11 je iný ako vodík)
kde
R7 je -C(Rh)=O skupina a Rnje, ako je definované vo vzorci (IV), R8a R9sú, ako je definované vo vzorci (IV). Zlúčenina vzorca (IVa) reaguje so zlúčeninou vzorca (Va) R10O-NH2, kde R10 je, ako je uvedené, za získania zlúčenín vzorca (I), v ktorom R7 je -C(R1I)=N-O-R10 skupina, R10 je, ako je definované vo vzorci (IV) okrem aroylu.
Reakcia sa uskutočňuje bežnými metódami, ktoré sú známe odborníkom v tejto oblasti, spôsob spočíva v normálnej tvorbe oxímov. Výhodne je molový pomer kamptotecín-7-aldehydu alebo kamptotecínu-7-ketónu k hydroxylamínu v rozsahu od 1 : 3 do 3 : 1. Môžu sa tiež použiť príslušné hydroxylamínové soli. Reakcia sa uskutočňuje v prítomnosti zásady, napríklad anorganickej zásady, ako je uhličitan draselný, alebo organickej zásady, ako je trietylamín alebo diazabicyklononán, s použitím polárnych rozpúšťadiel, výhodne metanolu alebo etanolu, a pri teplote v rozsahu od teploty okolia k teplote varu rozpúšťadla, prípadne v prítomnosti sušiaceho činidla, napr. síranu sodného alebo horečnatého, molekulových sít. Ak je to potrebné, môže sa reakcia uskutočňovať v prítomnosti katalyzátora, napr. Lewisovej kyseliny.
Alternatívne sa môžu uvedené zlúčeniny pripraviť z oxímu kamptotecín-7-aldehydu (získaného podľa toho, ako je opísané v Sawada a kol. Chem. Pharm. Bull. 39, 2574 (1991)) alebo 7-ketónu alebo zo zodpovedajúceho 7-acylkamptotecínu reakciou s R10-X halogenidom, kde X je výhodne jód, v polárnom rozpúšťadle, napr. tetrahydrofuráne alebo alkoholoch, a v prítomnosti zásady, napr. hydridu sodného alebo uhličitanu draselného.
Zlúčeniny vzorca (IV), v ktorých n je 1 a R10 je aroyl, ako je definované vo vzorci (IV), sa môžu pripraviť vychádzajúc z kamptotecín-7-oxímu, ktorých príprava bola opísaná v predchádzajúcom odseku, s R10-COC1-acylchloridmi, v polárnych rozpúšťadlách a v prítomnosti zásady, prednostne pyridínu, alebo priamo v pyridíne, ako opísal Cho a kol. J. Org. Chem. 62, 2230 (1997).
Zlúčeniny vzorca (IV), v ktorých n je 0 a R10 je, ako je definované, s výnimkou aroylu, sa môžu pripraviť vychádzajúc z kamptotecín-7-aldehydu (vzorca (IVa), R11 je vodík) alebo kamptotecín-7-ketónu (vzorca (IVa), R11 je iné ako vodík)
SK 287253 Β6
kde
R7 je skupina -C(Rn)=O a R11 je, ako je definované vo vzorci (IV), R8 a R9 sú, ako je definované vo vzorci (IV). Zlúčenina vzorca (IVa) reaguje so zlúčeninou vzorca (Vb) R10-NH2, kde R10 je, ako je definované skôr, za získania zlúčenín vzorca (IV), v ktorom R7 je -C(R”)=N-O-R10 skupina, R10 je definované vo vzorci (IV) okrem aroylu. Reakcia sa uskutočňuje bežnými metódami, ktoré sú známe odborníkom v oblasti farmaceutickej technológie, pričom spôsob spočíva v normálnej tvorbe imínov. Výhodne je mólový pomer kamptotecín-7-aldehydu alebo kamptotecín-7-ketónu k imínu v rozsahu od 1 : 3 do 3 : 1. Môžu sa tiež použiť príslušné amínové soli. Reakcia sa uskutočňuje v prítomnosti zásady, napríklad anorganickej zásady, ako je uhličitan draselný, alebo organickej zásady, ako je trietylamín alebo diazabicyklononán, s použitím polárnych rozpúšťadiel, výhodne metanolu alebo etanolu, a pri teplote v rozsahu od teploty okolia k teplote varu rozpúšťadla, prípadne v prítomnosti sušiaceho činidla, napr. síranu sodného alebo horečnatého, molekulových sít. Ak je to potrebné, môže sa reakcia uskutočňovať v prítomnosti katalyzátora, napr. Lewisovej kyseliny, ako je napríklad opísané Morettim a Torrem, v Synthesis, 1970, 141, alebo Kobayashim a kol., Synlett, 1977, 115.
Kamptotecín-7-aldehyd a kamptotecín-7-xím sú opísané v európskej patentovej prihláške EP 0056692 a v citovanom článku Sawada a kol., Chem. Pharm. Bull. 39, 2574 (1991).
Nroxidy zlúčenín vzorca (IV) sa pripravujú podľa známych metód oxidácie heteToatómového dusíka, výhodne oxidáciou s kyselinou octovou alebo fluóroctovou a peroxidom vodíka alebo reakciou s organickými peroxykyselinami (A. Albíni a S. Pietra, Heterocyklické N-oxidy, CRC, 1991).
Rôzne reakčné činidlá vzorca (V) s meniacim sa významom R10 sú komerčne dostupné alebo sa môžu pripraviť podľa metód známych v literatúre, ktoré môže uskutočniť odborník v odbore ako doplnok k svojim vlastným skúsenostiam.
Farmaceutický prijateľné soli sa získajú bežnými metódami opísanými v literatúre, ktoré nevyžadujú žiadny ďalší opis.
Príklad S
7-Benzyloxyiminometylkamptotecín (CPT 172)
500 mg (1,33 mmol) 7-formylkamptotecinu sa rozpustilo v 100 ml etanolu. Pridalo sa 15 ml pyridínu a 638 mg (4 mmol) O-benzylhydroxylamín hydrochloridu. Roztok sa 5 hodín refluxoval. Rozpúšťadlo sa vo vákuu odparilo a takto získaný produkt sa čistil okamihovou chromatografiou na silikagéli s použitím zmesi hexán/etylacetát 4 : 6 ako eluantu.
Výťažok: 65 %
Teplota tavenia: 200 - 205 °C (dek.)
Takto získaný produkt pozostával približne zo zmesi 8 : 2 dvoch syn- a antiizomérov (izomér A: Rf 0,32, izomér B, Rf 0,19, na silikagéli Merck 60 F254, eluant; hexán : etylacetát 3 : 7).
HPLC: analýzy sa uskutočnili v prístroji vybavenom s kvartémou pumpou (HP 1050) s dávkovacom Rheodyne (20 μΐ slučka) a maticovo-diódovým detektorom (HP 1050) riadeným prostredníctvom programu HPLC-ChemStation. Spektrálne merania sa uskutočnili v rozsahu od 200 do 600 nm a chromagramy sa zaznamenali pri 360 a 400 nm.
Použila sa kolóna C18 s reverznou fázou (Rainin C18, 25x0,4 cm, Varian) s predkolónou RP18. Analýza sa uskutočnila s lineárnym elučným gradientom s počiatkom od acetonitril: voda 30:70 k 100 % acetonitrilu v 20 minúte s rýchlosťou toku 1 ml/min. Retenčné časy boli: 12,51 min. pre izomér B a 14,48 min pre izomér A.
'H-NMR (300 MHz, DMSO-dQ: [ľ: 0,88 (t, H3-18A+H3-18B), 1,87 8m, (H2-19A+H2-19B), 5,18 (s,H2-5B), 5,21 (8s, H2-Ph B), 5,30 (H2Ph A), 5,40 (s, H2-5A), 5,45 (s, H2-17A+H2-17B), 6,53 (s, -OH A+-OH B), 7,3-7,6 (m, Ar A+Ar B+H-14A+1H-14B), 7,75 (m, H-11A+H-11B), 7,85-7,95 (m, H-10A+H-10B), 7,98 (dd, H-12B), 8,18-8,27 (m, H-12A+H9-B), 8,45 (s, CH=N B), 8,59 (DD,H-9A), 9,38 (s, CH=N A).
Hmotnostná analýza m/z 481 (M‘100) 374 (30) 330 (70) 300 (30) 273 (20) 243 (20) 91 (34).
Príklad 9
7-Butoxyiminometylkamptotecín (CPT 184)
400 mg (1,06 mmol) 7-formylkamptotecínu sa rozpustilo v 80 ml etanolu. Pridalo sa 12 ml pyridínu a 400 mg (3,18 mmol) O-Abutylhydroxylamín hydrochloridu. Roztok sa 4 hodiny refluxoval. Rozpúšťadlo sa vo vákuu odparilo a takto získaný produkt sa čistil okamihovou chromatografiou na silikagéli s použitím zmesi hexán/etylacetát 4 : 6 ako eluantu.
Získalo sa 322 mg (0,72 mmol) žltej tuhej látky.
Výťažok: 68 %
Teplota tavenia: 250 °C (dek.)
Takto získaný produkt pozostával približne zo zmesi 8 : 2 dvoch syn- a antiizomérov (izomér A: Rf 0,31, izomér B, Rf 0,24, na silikagéli Merck 60 F254, eluent: hexán : etylacetát 3 : 7).
HPLC: analýzy sa uskutočnili v prístroji vybavenom s kvartémou pumpou (HP 1050) s dávkovačom Rheodyne (20 μΐ slučka) a maticovo-diódovým detektorom (HP 1050) riadeným prostredníctvom programu HPLC-ChemStation. Spektrálne merania sa uskutočnili v rozsahu od 200 do 600 nm a chromagramy sa zaznamenali pri 360 a 400 nm.
Použila sa kolóna C18 s reverznou fázou (Rainin C18, 25x0,4 cm, Varian) s predkolónou RP18. Analýza sa uskutočnila s lineárnym elučným gradientom s počiatkom od acetonitril: voda 30 : 70 k 100 % acetonitrilu v 20 minúte s rýchlosťou toku 1 ml/min. Retenčné časy boli: 12,92 min. pre izomér B a 14,61 min. pre izomér A.
'H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ: 0,88 (t, H3-18A+H3-18B), 1,30 (s, t-but. B), 1,47 (s, t-but. A), 1,87 (m, H2-19A+H2-19B), 5,18 (s,H2-5 B), 5,37 (H2-5 A), 5,42 (s, H2-17A+H2-17B), 6,54 (s, -OH A + -OH B), 7,35 (s H-14A), 7,36 (s, H-14B), 7,69-7,83 (m, H-11A+H-11B), 7,85-7,98 (m, H-10A+H-10B), 8,07 (dd, H-9B), 8,16-8,27 (m, H-9A+H-12B), 8,40 (s, CH B), 8,62 (dd, H-12A), 9,31 (s, CH A).
Hmotnostná analýza m/z 448 (M+28) 391 (40) 374 (100) 362 (40) 330 (34) 57 (17).
Príprava lipozómov
Zlúčeniny podľa vynálezu sa môžu použiť pri príprave multilamelámych lipozómov (MLV) a jednolamelámych lipozómov (SUV), vo forme suchých práškov a ako suspenzie vo vodných roztokoch.
Zlúčeniny podľa vynálezu pripravené, ako je opísané v príkladoch 1 až 7, sa používajú na prípravu lipozómov podľa nasledovného postupu. Vhodné množstvo zlúčeniny sa rozpustí v chloroforme, roztok sa vo vákuu koncentruje do sucha v rotačnej odparke až kým sa nezíska lipidový film. Lipidový film sa suší pod vysokým vákuom do sucha, až pokiaľ sa neodstránia posledné zostávajúce stopy rozpúšťadla a potom sa rozpustí v terc-butylalkohole alebo vo vode. Takto získaný roztok sa lyofilizuje za získania jemného, suchého prášku.
Prášok sa hydratuje s vhodným množstvom vodného roztoku za získania lipozómu použitej zlúčeniny, ktorá potom vytvorí komplex s polynukleotidom alebo so želaným liečivom.
Iný spôsob prípravy lipozómov spočíva v adsorpcii lipidového filmu, ktorý pozostáva zo zlúčeniny podľa vynálezu v roztoku, na vhodnom inertnom povrchu, ako je sorbitol, manitol alebo iné farmakologicky prijateľné uhľovodíky. Zmes sa vo vákuu suší, za získania tuhej látky, ktorá sa môže ľahlo a veľmi rýchlo hydratovať pred použitím.
Prípravky vo forme suchých práškov majú výhodnú stabilitu počas dlhého času a sú ľahko použiteľné.
Navyše zlúčeniny podľa vynálezu sa môžu použiť na prípravu lipozómov komplexne viazaných s DNA alebo so želaným liečivom vo forme suchých práškov podľa nasledovného postupu. Zlúčenina podľa vynálezu sa rozpustí v íerc-butylalkohole alebo vo vode, takto získaný roztok sa zmieša s DNA alebo želaným liečivom a zmes sa lyofilizuje za získania komplexu, ktorý sa môže definovať ako prolipozóm-DNA alebo prolipozóm-liečivo vo forme jemného suchého prášku.
Takto získané prášky (prolipozómy) sa môžu použiť na prípravu farmaceutických prostriedkov, ktoré sa môžu podávať prostredníctvom aerosólu, alebo ktoré sa môžu alternatívne po rekonštitúcii s vodou alebo s vhodným tlmivým roztokom podávať parenterálne alebo orálne.
Komplexy lipozómov s DNA alebo s liečivami v tuhej forme sa tiež môžu získať postupom adsorpcie lipidového filmu na inertnom povrchu, ako je sorbitol, manitol alebo iné uhľovodíky prostredníctvom postupu opísaného skôr.
Testovanie tvorby lipozómov
Tvorba lipozómu sa testovala pomocou kolorimetrie s použitím farbiva rozpustného vo vode podľa nasledujúceho postupu. Získal sa vodný roztok vo vode rozpustného farbiva Arsenazo III (mol. hmotnosť = 776,37, 2,3 mg/ml).
Tento roztok sa použil namiesto vody na hydratáciu lipidových filmov pochádzajúcich z uvedenej prípravy.
Podiel zo suspenzie obsahujúcej lipozóm, ktorý opuzdruje farbivo, sa 100-násobne zriedil vodou.
Použili sa 2 ml lipozómovej suspenzie za získania prvej optickej hustoty odčítanej pri 660 nm, odčítanie sa získalo vzhľadom na ekvivalentnú vzorku definovanú ako čistú. 200 μΐ roztoku CaCl2 (15 mg/ml, 100 mM) sa pridalo k prvej vzorke a optická hustota sa merala pri 600 nm oproti čistej vzorke, ku ktorej sa pridalo 200 μΐ vody. Získaná hodnota absorbancie sa označila ako hodnota 2. K vzorke sa pridalo 100 μΐ roztoku Triton X-100 (5 % o/o, 0,26 % výslednej koncentrácie) a k čistému roztoku sa pridalo 200 μΐ vody, optická hustota odčítaná pri 660 nm sa definovala ako hodnota 3. Na vypočítanie percenta zapuzdreného farbiva sa použil nasledujúci vzorec:
Odčítanie 3 - Odčítanie 2 % zapuzdreného farbiva =-----------------------------------x 100
Odčítanie 3
Percento zapuzdreného farbiva poskytuje mieru tvorby lipozómu a v priemere je približne 40 %: kontrola veľkosti lipozómu sa uskutočnila s použitím rozptylu laserového svetla s pozitívnym výsledkom.
Príklady prípravy lipozómov
Príprava lipozómov undecylesteru palmitoyl-L-kamitínchloridu (ST 983) vo forme:
a) lyofilizovaných práškov mg, 0,11 mol undecylester palmitoyl-L-kamitínchloridu sa rozpustilo v 20 ml chloroformu v 100 ml banke.
Roztok sa odparil pokiaľ sa nezískal lipidový film, ktorý sa pod vákuom sušil počas 3 hodín. Takto získaný produkt sa rozpustil v íerc-butylalkohole a prudko sa ochladil na -70 °C s kvapalným dusíkom a lyofilizoval sa počas 2 hodín.
Získala sa biela kyprá pórovitá tuhá látka.
b) adsorbovaných práškov
143 mg, 0,231 mmol undecylester palmitoyl-L-kamitínchloridu sa rozpustilo v 10 ml chloroformu. Takto získaný roztok sa v malých množstvách nalieval do 100 ml banky s obsahom 750 mg sorbitolu. Na konci dodávania rôznych množstiev chloroformového roztoku sa chloroform rýchlo odparil.
Takto získaná tuhá látka sa sušila počas 3 hodín vo vákuu.
Získalo sa 893 mg bielej tuhej látky.
Pred použitím sa produkt rýchlo hydratoval s vhodným objemom vody za získania izotonického roztoku.
c) suspenzie viaclamelárnych lipozómov (MLV) mg, 0,11 mmol undecylester palmitoyl L-kamitínchloridu sa rozpustilo v 20 ml chloroformu v 100 ml banke.
Takto získaný roztok sa odparoval, až pokiaľ sa nezískal lipidový film, ktorý sa potom vo vákuu 3 hodiny sušil.
Lipidový film sa hydratoval s 10 ml vody, pri 30 °C, počas 3 hodín za získania MLV suspenzie.
MLV suspenzia, vhodne zriedená, sa uvádzala do komplexu s polynukleotidom a s liečivom a použila sa v biologických pokusoch.
e) suspenzie jednolamelámych lipozómov (SUV) mg, 0,11 mmol undecylester palmitoyl-L-kamitínchloridu sa rozpustilo v 20 ml chloroformu v 100 ml banke.
Takto získaný roztok sa odparoval, až pokiaľ sa nezískal lipidový film, ktorý sa potom vo vákuu 3 hodiny sušil.
Lipidový film sa hydratoval s 10 ml vody, pri 30 °C, počas 3 hodín za získania MLV suspenzie.
MLV suspenzia sa 10 krát pretláčala cez polykarbonátový filter s veľkosťou pórov 200 nm. Takto získaná jednolameláma lipozómová suspenzia sa uvádzala do komplexu s polynukleotidom a s liečivom a použila sa v biologických pokusoch.
f) Testovanie fyzikálnej stability lipozómov
Fyzikálna stabilita lipozómovej suspenzie sa testovala prostredníctvom turbidimetrie počas 30 dní.
Meranie absorbancie pri 600 nm počas istého časového intervalu sa uskutočnilo s každou testovanou suspenziou. Priemerná hodnota absorbancie meraná v čase 0 zostávala konštantná pre všetky testované formulácie.
Molekuly predstavovali prijateľné hodnoty v rámci určených časových úsekov.
LV a SUV lipozómové suspenzie sa môžu pripraviť kombináciou zlúčenín podľa vynálezu s helperovými lipidmi, ako je cholesterol, l-pahnitoyl-2-oleoylfosfatidylcholín (POPC) alebo dioleylfosfatidylcholín (DOPE).
Zlúčeniny sa kombinovali s helperovými lipidmi na účely získania lipizómov so stabilnými membránami. V uvedenej časti opisujúcej prípravu lipozómov je príklad, v ktorom sa zlúčenina podľa vynálezu kombinuje s helperovým lipidom, ako je cholesterol alebo POPC.
Príklady prípravy lipozómov na dodávanie liečiv
Príklad 10
Príprava MLV lipozómov taxol-ST 983 (1 : 40) mg, 0,0234 mmol taxolu a 556 mg, 0,9417 mmol ST 983 sa rozpustilo v 20 ml chloroformu.
Roztok sa koncentroval, pokiaľ sa nezískal lipidový film na povrchu sklenej banky.
Po odstránení posledných stôp chloroformu pomocou vákuovej pumpy sa k lipidovému filmu pridalo 20 ml ŕerc-butylalkoholu a takto získaný roztok sa rozdelil do 19 frakcií, ktoré sa bezprostredne ochladili na -70 °C s kvapalným dusíkom a lyofilizovali počas 24 hodín. Každá frakcia tuhej látky obsahovala taxol (1,05 mg) a ST 983 (29,2 mg).
Na získanie konečnej lipozómovej suspenzie sa lyofilizovaný produkt hydratoval vodou (450 μΐ) v čase použitia alebo inými slanými roztokmi, miešal počas 10 minút a nechal odpočívať počas 30 minút na umožnenie dokončenia napúčacieho (hydratačného) procesu.
Získali sa MLV lipozómy.
Testovanie fyzikálnej stability prípravku
Fyzikálna stabilita prípravku sa testovala prostredníctvom turbidimetrie so zaznamenávaním TDC (Tíme Drive Curve, časovo závislej krivky) pri 800 nm, 20 °C počas 20 hodín.
Zaznamenal sa konštantný trend turbidity, ktorý indikoval stabilitu bez javu zrážania.
Testovanie chemickej stability taxolu v prípravku
Chemická stabilita taxolu sa testovala HPLC.
Chromatografícké podmienky boli nasledujúce:
Kolóna: mikroBondapackC-18
Eluent: acetonitriLvoda 70 : 30 Detektor UV-VIS: 227 nm Rýchlosť toku: 1 ml/min. Retenčný čas: 4,5 min.
Koncentrácia taxolu stanovená proti štandardu bola 2,13 mg/ml.
Percento zapuzdreného taxolu bolo 98 %.
Príkladll
Príprava SUV lipozómov taxol-ST 983 mg, 0,0234 mmol taxolu a 556 mg, 0,9417 mmol ST 983 sa rozpustilo v 20 ml chloroformu.
Roztok sa koncentroval, pokiaľ sa nezískal lipidový film na povrchu sklenenej banky.
Po odstránení posledných stôp chloroformu pomocou vákuovej pumpy sa k lipidovému filmu pridalo 20 ml fcrc-butylalkoholu a takto získaný roztok sa rozdelil do 19 frakcií, ktoré sa bezprostredne ochladili na -70 °C s kvapalným dusíkom a lyofilizovali počas 24 hodín. Každá frakcia tuhej látky obsahovala taxol (1,05 mg) a ST 983 (29,2 mg).
Na získanie konečnej SUV lipozómovej suspenzie lyofilizovaného produktu hydratovaného s PBS roztokom (1 ml), sa pôsobilo ultrazvukom počas 20 minút pri 0 °C.
Potom sa uskutočnila filtrácia na 400 nm filtri na elimináciu stôp titánu, ktorý sa uvoľnil pôsobením ultrazvukovej sondy.
Testovanie fyzikálnej stability prípravku
Fyzikálna stabilita prípravku sa testovala prostredníctvom turbidimetrie so zaznamenávaním TDC (Tíme Drive Curve, časovo závislej krivky) pri 800 nm, 20 °C počas 20 hodín.
Zaznamenal sa konštantný trend turbidity, ktorý indikoval stabilitu bez javu zrážania.
Testovanie chemickej stability taxolu v prípravku
Chemická stabilita taxolu sa testovala HPLC.
Chromatografícké podmienky boli nasledujúce:
Kolóna: mikroBondapack C-18
Eluent: acetonitrikvoda 70 : 30
Detektor UV-V1S: 227 nm
Rýchlosť toku: 1 ml/min. Relenčný čas: 4,5 min.
HPLC analýza SUV lipozómovej suspenzie viedla k tým istým výsledkom, ako mala zodpovedajúca MLV lipozómová suspenzia a v tomto prípade bolo tiež zapuzdrených 98 % taxolu.
HPLC analýza zopakovaná po 24 hodinách nezistila nové piky iné ako taxolový pík, Čo indikovalo stabilitu účinných zložiek,
Príklad 12
Príprava cholesterolových lipozómov taxol-ST 983 (1:15)
Tieto typy lipozómov sa pripravili s cieľom získať komplexy so stabilnejšími membránami.
mg, 0,0101 mmol taxolu, 62,2 mg, 0,105 mmol ST 983 a 40 mg cholesterolu sa rozpustilo v 10 ml chloroformu.
Roztok sa koncentroval, pokiaľ sa nezískal lipidový film na povrchu sklenej banky.
Po odstránení posledných stôp chloroformu pomocou vysoko vákuovej pumpy sa k lipidovému filmu pridalo 6,3 ml Zerc-butylalkoholu a takto získaný roztok sa rozdelil do 5 frakcií, ktoré sa bezprostredne ochladili na -70 °C s kvapalným dusíkom a lyofilizovali počas 24 hodín. Každá frakcia tuhej látky obsahovala taxol (1,2 mg), ST 983 (12,44 mg) a cholesterol (8 mg).
Na získanie konečnej lipozómovej suspenzie sa lyofilizovaný produkt hydratoval vodou (100 μΐ) v čase použitia alebo inými slanými roztokmi, miešal sa počas 10 minút a nechal odpočívať počas 30 minút na umožnenie dokončenia napúčacieho (hydratačného) procesu.
Získali sa MLV lipozómy.
Testovanie fyzikálnej stability prípravku
Fyzikálna stabilita prípravku sa testovala prostredníctvom turbidimetrie so zaznamenávaním TDC (Time Drive Curve, časovo závislej krivky) pri 800 nm, 20 °C počas 20 hodín.
Zaznamenal sa konštantný trend turbidity, ktorý indikoval stabilitu bez javu zrážania.
Príklad 13
Príprava SUV lipozómov taxol-ST 772 (1:70) mg, 0,0234 mmol taxolu a 1485 mg, 1,638 mmol ST 772 sa rozpustilo v 20 ml chloroformu.
Roztok sa koncentroval, pokiaľ sa nezískal lipidový film na povrchu sklenej banky.
Po odstránení posledných stôp chloroformu pomocou vysoko vákuovej pumpy sa k lipidovému filmu pridalo 20 ml tórc-butylalkoholu. Na získanie čistého roztoku sa musel zohriať na 60 °C. Roztok sa bezprostredne ochladil na -70 °C s kvapalným dusíkom a lyofilizoval počas 24 hodín.
Na získanie konečnej SUV lipozómovej suspenzie lyofilizovaného produktu, hydratovaného s PBS roztokom (20 ml), sa na neho pôsobilo ultrazvukom počas 20 minút pri 0 °C.
Potom sa uskutočnila filtrácia na 400 nm filtri na elimináciu stôp titánu, ktorý sa uvoľnil pôsobením ultrazvukovej sondy.
Testovanie fyzikálnej stability prípravku
Fyzikálna stabilita prípravku sa testovala prostredníctvom turbidimetrie so zaznamenávaním TDC (Time Drive Curve, časovo závislej krivky) pri 800 nm, 20 °C počas 6 hodín.
Zaznamenal sa konštantný trend turbidity, ktorý indikoval stabilitu bez javu zrážania.
Príklad 14
Príprava MLV lipozómov CPT 83-ST 983 (1:40)
6,3 mg, 0,0168 mmol CPT 83 (7-karbonitrilkamptotecín, opísaný vo WO 97/31003) a 400 mg, 0,667 mmol ST 983 sa rozpustilo v 20 ml chloroformu.
Roztok sa koncentroval, pokiaľ sa nezískal lipidový film na povrchu sklenej banky.
Po odstránení posledných stôp chloroformu pomocou vákuovej pumpy sa k lipidovému filmu pridalo 26 ml te/obutylalkoholu a takto získaný roztok sa rozdelil do 12 frakcií, ktoré sa bezprostredne ochladili na -70 °C s kvapalným dusíkom a lyofilizovali počas 24 hodín. Každá frakcia tuhej látky obsahovala CPT 83 (0,525 mg), ST 983 (33,33 mg).
Na získanie konečnej lipozómovej suspenzie sa lyofilizovaný produkt hydratoval vodou (1000 μΐ) v čase použitia alebo inými slanými roztokmi a miešal sa počas 10 minút.
Získali sa MLV lipozómy.
Testovanie fyzikálnej stability prípravku
Fyzikálna stabilita prípravku sa testovala prostredníctvom turbidimetrie so zaznamenávaním TDC (Tíme Drive Curve, časovo závislej krivky) pri 800 nm, 20 °C počas 20 hodín.
Zaznamenal sa konštantný trend turbidity, ktorý indikoval stabilitu bez javu zrážania.
Testovanie chemickej stability CPT 83 v prípravku
Chemická stabilita CPT 83 sa testovala HPLC.
Chromatografické podmienky boli nasledujúce:
Kolóna: Supelcosil LC-ABZ
Eluent: 20 mM tlmivý fosforečnanový roztok metanol 40 : 60, pH = 7,3
Detektor UV-VIS: 360 nm
Rýchlosť toku: 1 ml/min.
Retenčný čas: 4,033 min.
Koncentrácia CPT 83, stanovená proti štandardu, bola 0,502 mg/ml.
Percento zapuzdreného CPT 83 bolo 99 %.
Príklad 15
Príprava SUV lipozómovCPT 83-ST (1:40)
6,3 mg, 0,0168 mmol CPT 83 a 400 mg, 0,667 mmol ST 983 sa rozpustilo v 20 ml chloroformu.
Roztok sa koncentroval, pokiaľ sa nezískal lipidový film na povrchu sklenej banky.
Po odstránení posledných stôp chloroformu s pomocou vysoko vákuovej pumpy sa k lipidovému filmu pridalo 26 ml terc-butylalkoholu a takto získaný roztok sa rozdelil do 12 frakcií, ktoré sa bezprostredne ochladili na -70 °C s kvapalným dusíkom a lyofilizovali počas 24 hodín. Každá frakcia tuhej látky obsahovala CPT 83 (0,525 mg) a ST 983 (33,33 mg).
Na získanie konečnej SUV lipozómovej suspenzie lyofilizovaného produktu, hydratovaného s vodou (1000 μΐ), sa neho pôsobilo ultrazvukom počas 40 minút pri 0 °C.
Potom sa uskutočnila filtrácia na 400 nm filtri na elimináciu stôp titánu, ktorý sa uvoľnil pôsobením ultrazvukovej sondy.
Testovanie chemickej stability CPT 83 v prípravku Chemická stabilita CPT 83 sa testovala HPLC.
Chromatografické podmienky boli nasledujúce:
Kolóna: Supelcosil LC-ABZ
Eluent: 20 mM fosforečnanový tlmivý roztok : metanol 40 : 60, pH = 7,3
Detektor UV-VIS: 360 nm
Rýchlosť toku: 1 ml/min.
Retenčný čas: 4,033 min.
Koncentrácia CPT 83, stanovená proti štandardu, bola 0,3 mg/ml.
Percento zapuzdreného CPT 83 bolo 59 %.
HPLC analýza zopakovaná po 24 hodinách nezistila nové piky iné ako CPT 83 pík, čo indikovalo stabilitu aktívnych zložiek.
Testovanie fyzikálnej stability prípravku
Fyzikálna stabilita prípravku sa testovala prostredníctvom turbidimetrie so zaznamenávaním TDC (Tíme Drive Curve, časovo závislej krivky) pri 600 nm, 20 °C počas 20 hodín.
Zaznamenal sa konštantný trend turbidity, ktorý indikoval stabilitu bez javu zrážania.
Príklad 16
Príprava MLV lipozómov CPT 184-ST 983 (1:40)
7,29, 0,0168 CPT 184 a 400 mg, 0,677 mmol ST 983 sa rozpustilo v 20 ml chloroformu.
Roztok sa koncentroval pokiaľ, sa nezískal lipidový film na povrchu sklenej banky.
Po odstránení posledných stôp chloroformu pomocou vákuovej pumpy sa k lipidovému filmu pridalo 26 ml terc-butylalkoholu a takto získaný roztok sa rozdelil do 12 frakcií, ktoré sa bezprostredne ochladili na -70 °C s kvapalným dusíkom a lyofilizovali počas 24 hodín. Každá frakcia tuhej látky obsahovala CPT 184 (0,607 mg) a ST 983 (33,33 mg).
Na získanie konečnej lipozómovej suspenzie sa lyofilizovaný produkt hydratoval vodou (1000 μΐ) v čase použitia alebo inými slanými roztokmi a miešal sa počas 10 minút.
Získali sa MLV lipozómy.
Testovanie fyzikálnej stability prípravku
Fyzikálna stabilita prípravku sa testovala prostredníctvom turbidimetrie so zaznamenávaním TDC (Tíme Drive Curve, časovo závislej krivky) pri 600 nm, 20 °C počas 20 hodín.
Zaznamenal sa konštantný trend turbidity, ktorý indikoval stabilitu bez javu zrážania.
Testovanie chemickej stability CPT 184 prípravku
Chemická stabilita CPT 184 sa testovala HPLC.
Chromatografické podmienky boli nasledujúce:
Kolóna: Supelcosil LC-ABZ
Eluent: 20 mM fosforečnanový tlmivý roztok metanol 40 : 60, pH = 7,3
Detektor U V-VIS: 360 nm
Rýchlosť toku: 1 ml/min.
Retenčný čas: 25,5 min.
Koncentrácia CPT 184, stanovená proti štandardu, bola 600 mg/ml.
Percento zapuzdreného CPT 184 bolo 99 %.
Príklad 17
Príprava SUV lipozómov CPT 184-ST 983 (1:40)
7,29 mg, 0,0168 mmol CPT 184 a 400 mg, 0,667 mmol ST 983 sa rozpustilo v 20 ml chloroformu. Roztok sa koncentroval pokiaľ, sa nezískal lipidový film na povrchu sklenej banky.
Po odstránení posledných stôp chloroformu pomocou vysoko vákuovej pumpy sa k lipidovému filmu pridalo 26 ml terc-butylalkoholu a takto získaný roztok sa rozdelil do 12 frakcií, ktoré sa bezprostredne ochladili na -70 °C s kvapalným dusíkom a lyofilizovali počas 24 hodín. Každá frakcia tuhej látky obsahovala CPT 184 (0,607 mg) a ST 983 (33,33 mg).
Na získanie konečnej SUV lipozómovej suspenzie lyofilizovaného produktu, hydratovaného s vodou (1000 μΐ), sa pôsobilo ultrazvukom počas 40 minút pri 0 °C.
Potom sa uskutočnila filtrácia na 400 nm filtri na elimináciu stôp titánu, ktorý sa uvoľnil pôsobením ultrazvukovej sondy.
Testovanie chemickej stability CPT 184 v prípravku
Chemická stabilita CPT 184 sa testovala HPLC.
Chromatografické podmienky boli nasledujúce:
Kolóna: Supelcosil LC-ABZ
Eluent: 20 mM fosforečnanový tlmivý roztok : metanol 40 : 60, pH = 7,3
Detektor UV-VIS: 360 nm
Rýchlosť toku: 1 ml/min.
Retenčný čas: 25,5 min.
Koncentrácia CPT 184, stanovená proti štandardu, bola 0,36 mg/ml.
Percento zapuzdreného CPT 184 bolo 70 %.
HPLC analýza zopakovaná po 24 hodinách nezistila nové piky iné ako CPT 184 pík, čo indikovalo stabilitu aktívnych zložiek.
Testovanie fyzikálnej stability prípravku
Fyzikálna stabilita prípravku sa testovala prostredníctvom turbidimetrie so zaznamenávaním TDC (Tíme Drive Curve, časovo závislej krivky) pri 600 nm, 20 °C počas 20 hodín.
Zaznamenal sa konštantný trend turbidity, ktorý indikoval stabilitu bez javu zrážania.
V nasledujúcich príkladoch sa lipozómy pripravili s použitím heleprových lipidov a/alebo kryoochranných činidiel.
Príklad 18
Príprava lipozómov CPT 184-ST 983
Do 2 1 banky sa k 20 mg CPT 184 a 600 mg ST 983 pridalo 100 ml metylchloroformu a zmes sa mierne zohrievala do úplného rozpustenia. Získaný roztok sa koncentroval a rotačné odparoval, pokiaľ sa nezískal lipidový film, ktorý sa ďalej sušil počas dvoch hodín s vysokovákuovou vývevou. Lipidový film sa hydratoval s roztokom laktózy (6 g/300 ml vody) pri 45 °C a v rotačnej odparke sa miešal počas okolo dvoch hodín. Na suspenziu sa potom pôsobilo ultrazvukom počas 2 hodín, každý cyklus trval hodinu a pol. Následne sa produkt filtroval cez 200 nm filter a lyofilizoval.
Testovanie chemickej stability CPT 184 v prípravku
Chemická stabilita CPT 184 sa stanovila pomocou HPLC. Produkt zostal stabilný počas 24 hodín testovania.
Testovanie fyzikálnej stability prípravku
Fyzikálna stabilita prípravku sa testovala prostredníctvom turbidimetrie. Produkt bol stabilný počas 24 hodín testu. Veľkosť častíc tiež bola stabilná (priemerná hodnota 100 nm).
Príklad 19
Príprava lipozómov CPT 184-ST 983
Na prípravu 1 ml lipozómového prostriedku (5 mM POPC-l-palmitoyl-2-oleoylfosfatidylcholínu, 1,25 mM ST 983, 0,25 mM CPT 184 a 150 mM trehalózy) sa použil nasledovný postup:
0,11 mg, 0,25 pmol CPT 184 sa rozpustilo v 250 μΐ etylacetátu, 3,79 mg, 4,89 μιηοΐ POPC sa rozpustilo v 100 μΐ etanolu a 0,74 mg, 1,25 μπιοί ST 983 sa rozpustilo v 100 μΐ etanolu. Tri roztoky sa zmiešali spolu a rozvírili sa. Rozpúšťadlá sa odparili v rotačnej odparke pri izbovej teplote za tlaku 80 mbar. Lipidový film sa sušil počas 2 hodín v tme. Potom sa suspendoval v 1 ml roztoku 150 mM D(+)-trehaloza dihydrátu (Fluka, HPLC 99 %), sterilizoval cez 0,22 nm filter a počas 2 minút sa víril. Suspenzia sa 21-krát pretláčala cez 200 nm polykarbonátové filtre. Pretlačená lipozómová suspenzia sa zmrazila v kvapalnom dusíku a lyofilizovala počas 2 nocí. Získala sa biela tuhá látka.
Príklad 20
Príprava lipozómov CPT 184-ST 983
Použil sa ten istý postup ako v príklade 19 okrem použitej 500 mM trehalózy.
Protirakovinová účinnosť komplexu ST 983 lipozóm - protirakovinové činidlo
Ako bude ukázané, ST 983 lipozóm vykázal výraznú akumuláciu na pulmonárnej úrovni. Táto črta miestnej špecificity má výhodu pri jeho použití v myšom modeli rakoviny pľúc.
Ako protirakovinové činidlo sa použil taxol.
Na zavedenia nádoru in vivo dostali neanestetizované myši Balb/c injekcie 3x10’buniek myšieho pľúcneho karcinómu M109 v 0,1 ml RPMI-1640 (Sigma) do quadriceps fémoris v pravej zadnej labke.
Desiaty deň po implantácii nádoru sa komplex lipozóm-taxol zriedil s fyziologickým roztokom tlmeným s fosforečnanom (PBS, SIGMA, P-4417) a intravenózne sa vstrekoval v koncentrácii 2,5 mg/ml ST 983 a 75 pg/ml taxolu.
Taxol (paklitaxel INDENA) použitý ako kontrola sa zriedil v kremoforovom vehikule EL (BASF) pri koncentrácii 20 mg/ml a uskladňoval sa pri 4 °C počas nasledujúcich 24 hodín, chránený pred svetlom. V čase použitia sa zriedil s fyziologickým roztokom tlmeným s fosforečnanom (PBS, SIGMA) a intravenózne sa vstrekol v tom istom objeme a koncentračných podmienkach, ako bolo opísané pre taxol transportovaný ST 983 lipozómom.
Kremofor sa pripravil zriedením etanolom 1:1.
Podania sa podávali počas 7 po sebe idúcich dní s počiatkom od 10 dňa po inokulácii nádoru. Zvieratá sa sledovali 17 dní po inokulácii a po usmrtení sa odstránili ich pľúca na určenie množstva metastáz. Zaľarbenie pľúc na zistenie metastáz sa uskutočnilo inkubáciou pľúc počas 10 dní v Bouínovom roztoku, ktorý pozostával zo 71 % nasýteného roztoku kyseliny pikrovej, 4,8 % ľadovej kyseliny octovej (Merck) a 24 % 10 % formaldehydu (Fluka). Na konci inkubačnej doby sa spočítali metastázy v Bouinovom roztoku.
V porovnaní s neošetrenými kontrolnými myšami, kremoforom transportovaný taxol neukázal žiaden účinok zníženia počtu pľúcnych metastáz, ale boli menšie ako v neošetrených kontrolách, zatiaľ čo taxol v komplexe s ST 983 lipozómom ukázal výrazné zníženie množstva, ako aj veľkosti pľúcnych metastáz.
Štatistická analýza počtu pľúcnych metastáz sa uskutočnila s použitím s Mamm-Whitney neparametrovými testami pre nepárne údaje.
Získané výsledky sú prítomné v tabuľke 1.
Tabuľka 1
Pľúcne metastázy na 17. deň po inokulácii nádoru M109 u myší BALB/c po ošetrení s taxolom a komplexom taxol/lipozóm ST983.
Skupina Metastázy Metastázy
Priemer ± s. d. veľkosť
Kontroly 21±12 M
Taxol 22±9 S
Taxol-ST983 10±2 S
M = stredná (priemer 1-2 mm) S = malá (priemer < 1 mm) s. d. = štandardná odchýlka
In vitro testy na cytotoxicitu
Toxicitné testy sa uskutočnili na Hela bunkách M109 v 96 jamkových platniach. V ten istý deň po nanesení na platne sa bunky ošetrili s testovanými molekulami počas nasledujúcich 48 hodín. Bunky sa potom premyli s PBS a nechali v normálnych rastových podmienkach počas 48 hodín. Po odstránení rastového média sa bunky inkubovali na ľade so 16 % TCA, 3-krát premyli s vodou, spracovali počas 30 minút so sulforodamínom B (SRB) v 1 % kyseline octovej, 3-krát sa premyli s 1 % kyselinou octovou samotnou, inkubovali počas 20 minút v TRIS 10 mM s pH 10,5 a nakoniec sa uskutočnili odčítali pri 540 nm.
Testy na cytotoxicitu s CPT 83
In vitro testy na cytotoxicitu s CPT 83 sa previedli kvôli vyjadreniu cytotoxicity protirakovinového činidla v komplexe s lipozómom ako predbežná indikácia účinnosti.
Na vyjadrenie schopnosti lipozómu transportovať CPT 83 in vitro v M109 bunkách sa použil opísaný sulforodamínový B test.
Navyše cytotoxicita CPT 83 rozpusteného v dimetylsulfoxide (DMSO) sa tiež vyjadrila ako porovnanie s cytotoxicitou vyjadrenou pre tú istú molekulu v komplexe s lipozómom ST 983.
Komplex s lipozóm CPT 83 sa použil v cytotoxicitných pokusoch pri koncentráciách uvedených v tabuľkách 2.1, 2.2 a 3.3 uvedených pre usporiadania SUV aj ML V. Použitý molový pomer lipozóm : CPT 83 bol 40 : 1.
Priemerné hodnoty cytotoxicity komplexov ST 983-CPT 83 v obidvoch usporiadaniach daných v tabuľkách 2.1, 2.2 a 2.3 indikujú, že ST 983 lipozóm je schopný prenosu CPT 83 tým istým spôsobom ako DMSO, pričom sa zistili hladiny cytotoxicity toho istého poriadku.
Tabuľka 2.1
Cytotoxicita (SRB) ST 983 SUV-CPT 83
Koncentrácie v μΜ
ctr L3 0,13 0,013 0,0013
0,911 0,294 0,705 0,908 0,911
0,745 0,198 0,525 0,821 0,83
0,884 0,204 0,801 0,906 0,91
0,833 0,25 0,748 0,856 0,853
0,854 0,254 0,778 0,867 0,873
0,793 0,231 0,739 0,802 0,803
0,792 0,193 0,602 0,827 0,829
0,901 0,248 0,69 0,904 0,89
Priemer 0,839125 0,352444 0,635333 0,767111 0,7667
s. d. 0,060645 0,034513 0,092925 0,042054 0,040149
s. d. = štandardná odchýlka
Hodnoty dané v tabuľke zodpovedajú odčítaniam optickej hustoty pri 540 nm.
Tabuľka 2.2
Cytotoxicita (SRB) ST 983 MLV-CPT 83 Koncentrácie v μΜ
ctr L3 0J3 0.013 0,0013
0,895 0,038 0,04 0,095 0,088
0,82 0,038 0,046 0,109 0,124
0,896 0,041 0,049 0,128 0,127
0,847 0,041 0,042 0,105 0,115
0,863 0,041 0,053 0,111 0,107
0,794 0,043 0,041 0,073 0,095
0,829 0,039 0,044 0,08 0,085
0,893 0,041 0,044 0,064 0,065
Priemer 0,854625 0,04025 0,044875 0,095625 0,10075
s. d. 0,038682 0,001753 0,004357 0,021738 0,021359
s. d. = štandardná odchýlka
Hodnoty dané v tabuľke zodpovedajú odčítaniam optickej hustoty pri 540 nm.
Tabuľka 2.3
Cytotoxicita (SRB) ST 983 DMSO-CPT 83 Koncentrácie v μΜ
ctr 13 13 0,13 0,013 0.0013
0,898 0,281 0,33 0,406 0,8 0,809
0,774 0,267 0,302 0,407 0,804 0,816
0,857 0,3 0,285 0,57 0,863 0,886
0,787 0,286 0,287 0,383 0,836 0,841
0,808 0,285 0,318 0,474 0,851 0,863
0,745 0,288 0,317 0,467 0,79 0,795
• 0,775 0,312 0,328 0,429 0,806 0,831
0,864 0,318 0,305 0,421 0,81 0,878
Priemer 0,8135 0,292125 0,309 0,444625 0,82 0,839875
s. d. 0,053519 0,016848 0,017205 0,059269 0,026506 0,033237
s. d. = štandardná odchýlka
Hodnoty dané v tabuľke zodpovedajú odčítaniam optickej hustoty pri 540 nm.
Biologická aktivita komplexu lipozóm ST 983-CPT 184
Testovala sa biologická aktivita lipozómov z príkladu 18 (pomenovaný ako lipozóm A) a príkladu 20 (nižšie pomenovaný ako lipozóm B).
Toxicita u zdravých myší
Lipozómy A a B sa podávali orálne, intravenózne, v porovnaní s voľným CPT 184, v dávke 1,2 mg/kg podľa schémy q4x4. Dva lipozómy nemali významné účinky na telesnú hmotnosť, pľúca, slezinu a obličky. Lipozóm B podávaný intravenózne a lipozóm A podávaný orálne, výrazne ovplyvnili hmotnosť týmusu podobne ako voľný CPT 184. Intravenózny lipozóm A mal iba minimálny účinok. Krvné parametre neukázali výrazné zmeny po 24 hodinách pri obidvoch lipozómoch. Lipozóm A podaný intravenózne podľa schémy qd5 ukázal toxicitu porovnateľnú s voľným CPT.
Pľúcny tropizmus lipozómov
Lipozómy A a B ukázali prednostnú akumuláciu na pľúcnej úrovni. Lipozómy sa podávali intravenózne v dávkach 1,2 mg/kg. Voľný CPT 184 sa podával orálne v dávkach 1,2 mg/kg v DMSO. Zvieratá, zdravé myši, sa usmrtili po 24 hodinách po poslednom podaní. Pľúca sa vybrali z tela a zamrazili v kvapalnom dusíku. Po roztopení sa orgány opláchli a homogenizovali v 0,1 % kyseline octovej/acetonitrile v pomere 1:5. Homogenáty sa rozdelili na tri podiely, ku dvom z nich sa pridal CPT 184 na opakovanie výpočtu. Tri vzorky sa odstred’ovali pri 16 000 g počas 5 minút. Sumatanty sa zozbierali a extraktovali s dichlórmetánom. Organická fáza sa sušila s rýchlou vývevou a zvyšok sa znovu rozpustil v acetonitrile na získanie množstva zodpovedajúcemu dávke 50 μΐ pre jedno zviera na vstreknutie do HPLC. HPLC sa uskutočnila v prístroji Waters Symmetry C18 3,5 pm (4,6x7,5mm). Fluorimeter od Merck mal detektor pri excitácii 370 nm a 510 nm pre emisiu. Eluent bol voda/acetonitril 60 : 40, izokraticky. Objem vzorky bol 50 pl. Výťažok CPT 184 bol okolo 70 %. Obidva lipozómy A aj B poskytli akumulačnú hladinu pre CPT vyššiu ako voľný CPT v DMSO, ako je uvedené na obr. 3.
Dodávanie génov
Príprava komplexu lipozóm-DNA
Lipozóm a plazmidová DNA sa oddelene vhodne zriedili v PBS. DNA sa potom pridala k lipozómu a t komplex lipozóm-DNA sa potom ponechal počas približne 30 min pri 4 °C na uľahčenie tvorby stabilných interakcií medzi DNA a lipozómom.
V in vitro experimentoch sa použil l,2-dioleoyloxy-3-trimetylamóniumpropán (DOTAP) sa použil ako referenčný katiónový lipid, na 2xl0s HeLa buniek sa použilo 2,5 pg plazmidovej DNA a koncentrácia lipozómu bola 9 μΜ.
V referenčných in vivo experimentoch sa použili DOTAP a [2,3-dioleoyl)propyl]trimetylamónium (DOTMA) ako referenčné katiónové lipidy.
Mólové pomery sú definované ako výsledky, ktoré zodpovedajú koncetráciám v nmol príslušných katiónových lipidov na mg DNA.
V in vivo transfekčných experimentoch sa použilo 25 pg plazmidovej DNA na zviera.
Plazmid pCMVluc použitý v týchto experimentoch obsahoval cDNA luciferázového génu pod transkripčnou kontrolou cytomegalovírusového (CMV) promótora.
SK 287253 Β6
Kvantitatívne stanovenie luciferázovej aktivity
Aktivita luciferázového proteínu v bunkách a tkanivách sa stanovila s použitím súpravy Boehringer Mannheim(kat. č. 1669 893).
Bunky sa trikrát premyli v PBS a potom sa odstránili z platne pomocou škrabky v lýzovom tlmivom roztoku (100 mM fosforečnanu draselného s pH 7,8, 1 mM ditiotreitol - DTT) a podrobili sa trom po sebe idúcim testom zmrazovania a tavenia. Po odstreďovaní v 1,5 ml Eppendorfových trubiciach, sa použil supematant v luminiscenčnom teste nie viac ako 5 hodín po extrakcii proteínov. Merania luminiscenčnej emisie sa uskutočnili s použitím luminometra pri 562 nm. Po prvom zmrazení v kvapalnom N2, po ktorom nasledovalo jemné mletie za získania prášku, sa tkanivá znovu suspendovali v lýzovom tlmivom roztoku a inkubovali počas 10 až 15 minút na ľade.
Vzorky sa potom odstreďovali v 2 ml Eppendorfových trubiciach a supematant sa testoval na luciferázovú aktivitu.
Bodová blotová analýza
Bunková DNA sa extrahovala podľa postupu alkalickej lýzy opísanej Sanbrook-om, Fritsch-om a Maniatis-om v Molekulovom klonovaní, 1989.
pg DNA extrahovanej z buniek s predabsorbovalo na nylonových filtroch (Boehringer) s použitím Biorad bodového blotového prípravku. Filtre sa potom prehybridizovali počas 4 hodín pri 65 °C s roztokom s obsahom 0,5 M pyrofosfátu sodného (NaPi), 1 mM EDTA, 7 % SDS. Pripravila sa sonda 32P(i) s použitím plazmidovej pCMVluc DNA ako templátu a náhodne nanášanou súpravou Amersham. Filter sa hybridizoval tým istým predhybridizačným tlmivým roztokom počas 12 hodín pri 42 °C s použitím lxlO6 CPM/ml. Filter sa potom podrobil trom 10 minútovým premývaniam pri 65 °C v tlmivom roztoku obsahujúcom 40 mM NaPi, 1 % SDS. Autorádiografická analýza sa uskutočnila pomocou fosforového zobrazovača, ktorý využíva fosforové clony aktivované beta-žiarením, ktoré sa čítajú a kvantifikujú prostredníctvom multinásobičového systému v spojení so zobrazovacím analytickým programom. Denzitometria uskutočňovaná na bodovom blote sa vykonala s použitím IP-LabGel zobrazovacieho analytického programu.
Transfekčné testy plazmidovej DNA
Uskutočnilo sa veľa transfekčných testov s plazmidovou DNA in vitro aj in vivo.
DOTAP aj DOTMA sa použili ako referenčné katiónové lipidy, ktorých transfekčná kapacita bola úplne charakterizovaná a opísaná Abkenetom a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90, 6518. V in vivo experimentoch sa analyzovali rôzne mólové pomery katiónových lipidov k plazmidovej DNA kvôli stanoveniu aktivity katiónových lipidov a príslušných najúčinnejších koncentrácií na génový prenos. Transfekčná schopnosť rôznych lipozómov sa vyjadrila in vivo ako aj in vitro s použitím prenášača génu luciferázy obsiahnutej pCMVluc plazmide, ktorého aktivita sa stanovila s pomocou relatívnych luminiscenčných jednotiek (RLU, relative luminiscence units) kvôli jednoduchej kvantifikácii.
Ako alternatíva sa vyjadrila transfekčná účinnosť množstva katiónových lipozómov prostredníctvom denzitometrickej analýzy (fosforový zobrazovač) vzoriek DNA extrahovaných z transfektovaných buniek predabsorbovaných na nitrocelulózových filtroch ( bodový blot) a hybridizovaných s 32P značenými markermi plazmidovej DNA, ako bolo predtým opísané.
In vivo transfekčné testy
Závislosť in vivo transfekčnej účinnosti od mólového pomeru lipozóm ST 983 : DNA
V tomto experimente sa vyjadrila závislosť transfekčnej účinnosti pečene, pľúc a srdca od mólového pomeru lipozómu ST 983 : plazmidovej DNA. Testovali sa nasledujúce pomery v nmol lipozómu na pg DNA: 12 : 1,36 : 1 a48 : 1.
Skupiny po 6 myši Balb/c s hmotnosťou približne 20 g sa intravenózne ošetrili s uvedenými množstvami komplexu lipozóm-DNA v 200 μΐ objemoch PBS a po 24 hodinách po podaní komplexu sa usmrtili.
Luciferázová aktivita z tkanív pľúc, srdca a pečene sa hlavne prejavila v distribúcii luciferázy v pľúcach pri všetkých analyzovaných mólových pomeroch. Skutočne 99 % celkovej luciferázy extrahovanej z troch tkanív bolo zistených v pľúcach. Zistilo sa, že mólový pomer lipozóm : DNA 12 : 1 je najlepší. Získané výsledky sú uvedené v tabuľke 3.
Tabuľka 3
In vivo transfekčná účinnosť ST 983 ako funkcia mólového pomeru ST 983 : DNA (pg DNA)
Lipozóm Pečeň Priemer RLU/mg proteínu ± s. d. Pľúca Srdce ST 983 :DNA mólový pomer
ST 983 2589±140 8818442 + 449529 28875 ± 2593 12:1
1310 + 385 2257856 + 280480 7091 ± 249 24 : 1
Lipozóm Pečeň Priemer RLU/mg proteínu ± s. d. Pľúca Srdce ST 983 :DNA mólový pomer
1035 ±347 301107 ±21503 8351 ±477 36: 1
1571±156 112747 ±5655 5251 ±489 48 : 1
Kontrola 396 ±55 458 ±45 755 ± 55
DOTMA 1352 ±226 3828742± 161332 3363±123 12:1
s. d. = štandardná odchýlka
Závislosť in vivo transfekčnej účinnosti od rozdielov v prípravkoch lipozómu SRT 983
Hodnoty luciferázovej aktivity, ako relatívne luminiscenčné jednotky (RLU) odvodené z pľúc myší Balb/c intravenózne ošetrených s rôznymi prípravkami lipozómu ST 983 v mólovom pomere lipozóm : DNA 12:1, sú uvedené v tabuľke 4.
Získané údaje navyše k ukážke toho, že lipozóm ST 983 je schopný prenášať plazmidovú DNA in vivo s účinnosťou vyššou ako a/alebo porovnateľnou s účinnosťou DOTMA, tiež znázorňujú rozdiely medzi rôznymi prípravkami ST 983. Toto je zapríčinené množstvom fyzikálnochemických charakteristík ako napríklad veľkosťou vezikúl lipozómov alebo relatívnych veľkostí vezikúl vo vzťahu k jednolamelámej alebo multilamelámej štruktúre rôznych prípravkov ST 983. Fyzikálnochemické parametre uvedené skôr boli podrobne opísané ako určujúce vlastnosti pri dosahovaní optimálnej in vivo a in vitro transfekčnej účinnosti autormi R.I. Mahatom-m a kol., Human Gene Therapy 9. 1998: 2083.
Tabuľka 4
In vivo transfekčná účinnosť ST 983 (rôzne prípravky)
ST 983 : DNA Mólový pomer : 1 : 1 : 1 : 1
Lipozóm Priemer RLU/mg proteínu ± s. d. Pľúca
ST 983/V72 3118235±184726
ST 983/#73 7285835 ± 827067
ST 983/#74 1022117 ±60402
Kontrola 1523 ± 98
DOTMA 3410125± 189520
= štandardná odchýlka
Závislosť in vivo transfekčnej účinnosti od predinkubačného času komplexu lipozóm ST 983-DNA
Tabuľka 5 predstavuje relatívne luminiscenčné jednotky odvodené z pečene, pľúc a srdca myší intravenózne ošetrených s lipozómom ST 983 predinkubovaným s plazmidovou DNA počas 30 minút alebo počas 3 hodín pred podaním. Zvieratá ošetrené s ST 983 predinkubovaným počas 3 hodín s DNA vykázali približne 5-násobný nárast aktivity luciferázy v pľúcach a srdci v porovnaní s myšami ošetrenými s tým istým lipozómom inkubovaným počas 30 minút.
Z tohto výsledku vyplýva, že tvorba stabilného komplexu lipozóm-DNA je jav, ktorý závisí od času a hrá kritickú úlohu ako určujúci fakt in vivo transfekčnej účinnosti.
Tabuľka 5
Účinnosť in vivo transfekcie ST 983 ako funkcia predinkubačného času lipozóm/DNA
Lipozóm Čas Priemer RLU/mg proteínu ± s. d. T983:DNA
Pečeň Pľúca Srdce Mólový pomer
ST 983 30 min 3526 ±260 874882 ± 65917 8118 ±263 12 : 1
ST983 3h 2497 ± 682 4225656 ±211731 37100 ±1853 12 : 1
s. d. = štandardná odchýlka
Transfekcia plazmidovej DNA v HeLa bunkách s lipozómom ST 772
Obrázky 1 a 2 ukazujú transfekčnú účinnosť plazmidovej DNA lipozómu ST 772 v HeLa bunkách. Kvôli tomuto dôvodu sa vykonala denzitometrická analýza DNA extrahovanej z buniek transfektovaných s ST 772 a s DOTAP ako refenčného katiónového lipidu. Výsledky blotovej analýzy vyjadrujú množstvá plazmidovej DNA toho istého poriadku ako sa získalo s DOTAP.
30 min 4 hod % 4 hod
DNA 1990,567 19424,67 0 0
772MLV 79 1858214 13123082 67 71
772MLV 80 2219863 15360769 80 83
DOTAP 24/9/98 2271950 1847457 100 100
DOTAP 29/9/98 2535507 17090549 91 93
PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (28)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Zlúčeniny všeobecného vzorca (I) v ktorom n je celé číslo od 1 do 3,
    R je vodík alebo alkanoyl, priamy alebo rozvetvený, s 2 až 6 atómami uhlíka,
    R1 a R“, ktoré sú to isté alebo rôzne, predstavujú nasýtený alebo nenasýtený priamy acylový reťazec s 3 až 20 atómami uhlíka, a
    X je anión farmakologicky prijateľnej kyseliny.
  2. 2. Zlúčenina podľa nároku 1, v ktorej R je vybrané zo skupiny pozostávajúcej z acetylu, propionylu, butyrylu, valerylu a izovalerylu.
  3. 3. Zlúčenina podľa nároku 1, v ktorej sú R1 a R2 vybrané zo skupiny pozostávajúcej z hexanoylu, undekanoylu, myristoylu, palmitoylu alebo oleoylu.
  4. 4. Zlúčenina podľa nároku 1, v ktorej X je vybrané zo skupiny pozostávajúcej z chloridu, bromidu, jodidu, aspartátu, hydrogenaspartátu, citrátu, hydrogencitrátu, vinami, hydrogenvínanu, fosforečnanu, hydrogenfosforečnanu, fumarátu, hydrogenfumarátu, glycerofosforečnanu, glukózfosforečnanu, mliečnanu, maleátu, hydrogenmaleátu, galaktarátu, orotátu, šťaveľanu, hydrogenšťaveľanu, síranu, hydrogensíranu, trichlóracetátu, trifluóracetátu, metánsulfonátu, pamoátu a hydrogenpamoátu.
  5. 5. Zlúčenina podľa nároku 1 vybraná zo skupiny obsahujúcej:
    - ester L-kamitínbromidu s 2-hydroxyacetyl-l,3-dipalmitoyl-glycerolom,
    - ester acetyl-L-kamitínbromidu s 2-hydroxyacetyl-l,3-di-palmitoylglycerolom,
    - ester propionyl-L-kamitínbromidu s 2-hydroxyacetyl-l,3-dipalmitoylglycerolom,
    - ester izobutyryl-L-kamitínbromidu s 2-hydroxyacetyl-l,3-dipalmitoylglycerolom,
    - ester izovarelyl-L-kamitínbromidu s 2-hydroxyacetyl-l,3-dipalmitoylglyceroloni,
    - ester L-kamitinbromidu s l,3-dihexanoyl-2-hydroxyace-tylglycerolom
    - ester acetyl-L-kamitínbromidu s l,3-dihexanoyl-2-hydroxy-acetylglycerolom
    - ester propionyl-L-kamitínbromidu s l,3-dihexanol-2-hydro-xyacetylglyceroIom.
  6. 6. Použitie zlúčeniny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5 na prípravu lipozómov.
  7. 7. Lipozóm obsahujúci zlúčeninu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5.
  8. 8. Lipozóm podľa nároku 7, ktorý ďalej obsahuje helperové lipidy.
  9. 9. Lipozóm podľa nároku 8, v ktorom je helperový lipid vybraný zo skupiny pozostávajúcej z cholesterolu, l-palmitoyl-2-oleoylfosfatidylcholínu alebo dioleylfbsfatidylcholinu.
  10. 10. Použitie lipozómu podľa ktoréhokoľvek nároku 7 až 9 na prípravu prostriedku vhodného na prenos farmakologicky účinných zlúčenín.
  11. 11. Použitie podľa nároku 10, v ktorom farmaceutický účinnou zlúčeninou je prírodné sa vyskytujúci sa alebo modifikovaný plazmid alebo polynukleotid.
  12. 12. Použitie podľa nároku 11, v ktorom plazmid alebo polynukleotid je vhodný na génovú terapiu.
  13. 13. Použitie podľa nároku 11, v ktorom plazmid alebo polynukleotid kódujú peptid alebo proteín vhodný ako vakcína.
  14. 14. Použitie podľa nároku 10, v ktorom účinnou zlúčeninou je liečivo.
  15. 15. Použitie podľa nároku 14, v ktorom je liečivo vybrané zo skupiny pozostávajúcej z protirakovinových, protiangiogénnych, protivírusových, protibakteriálnych, fungicídnych, antiprotozoálnych činidiel, zlúčenín účinných na kardiovaskulárny systém alebo imunogénnych peptidov.
  16. 16. Použitie podľa nároku 15, v ktorom liečivom je protirakovinové alebo protiangiogénne činidlo.
  17. 17. Použitie podľa nároku 16, v ktorom protirakovinové činidlo je vybrané zo skupiny pozostávajúcej z taxolu alebo kamptotecínového derivátu.
  18. 18. Použitie podľa nároku 17, v ktorom je derivát kamptotecinu vybraný zo skupiny pozostávajúcej z:
    - 7-karbonitrilkamptotecínu,
    - 7-benzyloxyiminometylkamptotecínu a
    - 7-butoxyiminometylkamptotecínu.
  19. 19. Použitie lipozómu podľa nárokov 7 až 9 na prípravu kozmetického prostriedku.
  20. 20. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje lipozóm podľa nárokov 7, 8 alebo 9.
  21. 21. Prostriedok podľa nároku 20, vyznačujúci sa tým, že lipozóm obsahuje farmaceutický prijateľnú zlúčeninu.
  22. 22. Prostriedok podľa nároku 21, vyznačujúci sa tým, že účinnou látkou je prirodzene sa vyskytujúci alebo modifikovaný plazmid alebo polynukleotid.
  23. 23. Prostriedok podľa nároku 22, vyznačujúci sa tým, že plazmid alebo polynukleotid je vhodný na génovú terapiu.
  24. 24. Prostriedok podľa nároku 22, vyznačujúci sa tým, že plazmid alebo polynukleotid kóduje peptid alebo proteín vhodný ako vakcína.
  25. 25. Prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje lipozóm podľa niektorého z nárokov 7 až 9.
  26. 26. Prostriedok podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že tento lipozóm obsahuje látku s kozmetickou aktivitou.
  27. 27. Prostriedok podľa nároku 21, v y z n a č u j ú c i sa tým, že zlúčenina je vybraná zo skupiny pozostávajúcej z protirakovinových, protiangiogénnych, protivírusových, protibakteriálnych, fungicídnych, antiprotozoálnych činidiel, zlúčenín účinných na kardiovaskulárny systém alebo imunogénnych peptidov.
  28. 28. Prostriedok podľa nárokov 20 až 27, v y z n a č u j ú c i sa tým, že sa podáva orálne, parenterálne, intravenózne, intramuskuláme, subkutánne, transdermálne alebo vo forme nosného alebo ústneho spreja.
SK1431-2001A 1999-04-13 2000-04-11 Estery L-karnitínu alebo alkanoyl-L-karnitínov SK287253B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT1999RM000220A IT1306129B1 (it) 1999-04-13 1999-04-13 Esteri della l-carnitina o di alcanoil l-carnitine utilizzabili comelipidi cationici per l'immissione intracellulare di composti
PCT/IT2000/000137 WO2000061543A2 (en) 1999-04-13 2000-04-11 Esters of l-carnitine or alkanoyl l-carnitines

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK14312001A3 SK14312001A3 (sk) 2002-02-05
SK287253B6 true SK287253B6 (sk) 2010-04-07

Family

ID=11406659

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1431-2001A SK287253B6 (sk) 1999-04-13 2000-04-11 Estery L-karnitínu alebo alkanoyl-L-karnitínov
SK5094-2008A SK288246B6 (sk) 1999-04-13 2000-04-11 Použitie esterov L-karnitínu alebo alkanoyl-L-karnitínov ako katiónových lipidov na vnútrobunkové dodávanie farmakologicky účinných zlúčenín

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK5094-2008A SK288246B6 (sk) 1999-04-13 2000-04-11 Použitie esterov L-karnitínu alebo alkanoyl-L-karnitínov ako katiónových lipidov na vnútrobunkové dodávanie farmakologicky účinných zlúčenín

Country Status (34)

Country Link
US (4) US6797281B1 (sk)
EP (3) EP1435232A1 (sk)
JP (2) JP4703855B2 (sk)
KR (2) KR100798499B1 (sk)
CN (2) CN100402017C (sk)
AT (2) ATE317257T1 (sk)
AU (2) AU776301B2 (sk)
BG (3) BG65501B1 (sk)
BR (2) BRPI0017460B1 (sk)
CA (2) CA2650202C (sk)
CZ (1) CZ302628B6 (sk)
DE (2) DE60025961T2 (sk)
DK (2) DK1426044T3 (sk)
EA (2) EA004459B1 (sk)
EE (2) EE05719B1 (sk)
ES (2) ES2258688T3 (sk)
HK (2) HK1045145B (sk)
HR (1) HRP20010740B1 (sk)
HU (1) HU229366B1 (sk)
IL (4) IL145765A0 (sk)
IS (2) IS2476B (sk)
IT (1) IT1306129B1 (sk)
ME (2) ME00113B (sk)
MX (1) MXPA01010359A (sk)
NO (2) NO327742B1 (sk)
NZ (2) NZ528874A (sk)
PL (2) PL211710B1 (sk)
PT (2) PT1183228E (sk)
RS (3) RS20090448A (sk)
SI (2) SI1183228T1 (sk)
SK (2) SK287253B6 (sk)
TR (2) TR200202358T2 (sk)
WO (1) WO2000061543A2 (sk)
ZA (1) ZA200109291B (sk)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1246792B1 (en) * 2000-01-13 2014-08-13 Emisphere Technologies, Inc. Compounds and compositions for delivering active agents
DE10113446A1 (de) † 2001-03-19 2002-09-26 Schwarzkopf Gmbh Hans Haarbehandlungsmittel mit Betainen
DK2108362T3 (da) * 2002-06-26 2013-09-02 Medigene Ag Kationisk liposomal-fremstilling omfattende en taxan
EP2108362B1 (en) * 2002-06-26 2013-05-29 MediGene AG A cationic liposomal preparation comprising a taxane
ITRM20040288A1 (it) * 2004-06-11 2004-09-11 Sigma Tau Ind Farmaceuti Uso della 7-t-butossiimminometilcamptotecina per la preparazione di un medicamento per il trattamento delle neoplasie dell'utero.
GT200500310A (es) * 2004-11-19 2006-06-19 Compuestos organicos
US20080095834A1 (en) * 2005-03-02 2008-04-24 Volkmar Weissig Mitochondriotropic Phospholipid Vesicles
SA06270147B1 (ar) 2005-06-09 2009-12-22 نوفارتيس ايه جي عملية لتخليق 5-(مثيل–1h–إيميدازول–1-يل )–3-(ثلاثي فلـورو مثيل)–بنزامـين
CN101287448A (zh) * 2005-08-10 2008-10-15 诺瓦提斯公司 拓扑异构酶i的抑制剂7-叔丁氧基亚氨基甲基喜树碱的微粒组合物
WO2007017513A2 (en) * 2005-08-10 2007-02-15 Novartis Ag Formulations for 7-(t-butoxy)iminomethyl camptothecin
US20100178325A1 (en) * 2006-08-23 2010-07-15 Biodelivery Sciences International, Inc. Amphiphilic nucleotide cochleate compositions and methods of using the same
AU2008210511A1 (en) * 2007-02-01 2008-08-07 Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A. Pharmaceutical composition comprising a campothecin derivative
US20100104625A1 (en) * 2007-02-16 2010-04-29 Cornell University Biodegradable compositions and materials
US20100204432A1 (en) 2007-05-28 2010-08-12 Husam Younes Biodegradable elastomers prepared by the condensation of an organic di-, tri- or tetra-carboxylic acid and an organic diol
ES2569660T3 (es) 2007-06-08 2016-05-12 Mannkind Corporation Inhibidores de la IRE-1alfa
EP2706121A1 (en) 2008-03-13 2014-03-12 PerkinElmer Health Sciences, Inc. Enzymatic substrate building blocks for multiple detection systems
EP2532649B1 (en) * 2011-06-07 2015-04-08 Incella GmbH Amino lipids, their synthesis and uses thereof
WO2013032643A2 (en) * 2011-08-31 2013-03-07 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Lipids capable of conformational change and their use in formulations to deliver therapeutic agents to cells
CA2906839A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Perkinelmer Health Sciences, Inc. Compounds and methods relating to testing for lysosomal storage disorders
MX2018010586A (es) 2016-03-02 2019-03-28 Univ Texas Nanovacuna de activacion de "sting" para inmunoterapia.
EP3634942A4 (en) 2017-06-06 2021-03-10 Wayne State University PROCESSES AND COMPOSITIONS ASSOCIATED WITH MATERIALS DERIVED FROM CARNITINE
CN115177608B (zh) * 2022-07-26 2023-12-05 南方医科大学南方医院 长链酰基肉碱类化合物在制备预防和/或治疗肝癌的药物中的应用

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5008288A (en) * 1986-01-06 1991-04-16 Alfred Stracher Carnitine directed pharmaceutical agents
US4866040A (en) * 1986-01-06 1989-09-12 Alfred Stracher Aminocarnitine directed pharmaceutical agents
IT1230142B (it) * 1989-05-03 1991-10-14 Fidia Spa Derivati della carnitina, processo per la loro preparazione e impiego in terapia umana
DE69119074T2 (de) * 1990-06-15 1996-12-12 University Of North Carolina At Chapel Hill, Chapel Hill, N.C. Kovalente-ther lipidnukleosid-konjugate
IT1248321B (it) * 1991-05-15 1995-01-05 Sigma Tau Ind Farmaceuti Uso di esteri di acil l-carnitine con l'acido gamma-idrossibutirrico per produrre composizioni farmaceutiche per il trattamento di epatopatie
IT1258370B (it) * 1992-03-02 1996-02-26 Sigma Tau Ind Farmaceuti Esteri della l-carnitina e di acil l-carnitine dotati di attivita' miorilassante selettiva sull'apparato gastro-intestinale e composizioni farmaceutiche che li contengono.
US5972600A (en) * 1992-04-03 1999-10-26 The Regents Of The University Of California Separation of active complexes
IT1263013B (it) * 1992-10-20 1996-07-23 Avantgarde Spa Esteri della l-carnitina e di alcanoil l-carnitine con l'acido glicolico o suoi esteri e composizioni farmaceutiche contenenti tali per il trattamento di affezioni cutanee.
US5552156A (en) * 1992-10-23 1996-09-03 Ohio State University Liposomal and micellular stabilization of camptothecin drugs
US5512671A (en) * 1993-02-16 1996-04-30 Wake Forest University Ether lipid-nucleoside covalent conjugates
IT1261984B (it) * 1993-06-22 1996-06-11 Avantgarde Spa Uso di esteri della l-carnitina o di acil l- carnitine con idrossiacidi per produrre composizioni farmaceutiche per il trattamento di affezioni cutanee.
EP0706374B1 (en) * 1993-06-30 1997-12-10 Genentech, Inc. Method for preparing liposomes
IT1273987B (it) * 1994-09-29 1997-07-14 Sigma Tau Ind Farmaceuti Uso di esteri ftalidilidenici della carnitina e di alcanoil carnitine per il trattamento dello shock endotossico
US6008202A (en) * 1995-01-23 1999-12-28 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
US6316652B1 (en) * 1995-06-06 2001-11-13 Kosta Steliou Drug mitochondrial targeting agents
AU707734B2 (en) * 1995-06-07 1999-07-15 Regents Of The University Of California, The Stabilization of polynucleotide complexes
US5811406A (en) * 1995-06-07 1998-09-22 Regents Of The University Of California Dry powder formulations of polynucleotide complexes
IT1283955B1 (it) * 1996-03-20 1998-05-07 Sigma Tau Ind Farmaceuti Bis alcanoil esteri della carnitina ad attivita' antibatterica, antimicotica ed antiprotozoaria.
WO1998004720A1 (en) * 1996-07-26 1998-02-05 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Method and reagents for genetic immunization
US6056973A (en) * 1996-10-11 2000-05-02 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic liposome composition and method of preparation
US6071532A (en) * 1996-10-15 2000-06-06 Emory University Synthesis of glycophospholipid and peptide-phospholipid conjugates and uses thereof
IT1299172B1 (it) * 1998-05-06 2000-02-29 Sigma Tau Ind Farmaceuti Esteri perfluorurati di alcanoil l-carnitine utilizzabili quali lipidi cationici per l'immissione intracellulare di composti

Also Published As

Publication number Publication date
BG109876A (en) 2008-02-29
AU2004224958A1 (en) 2004-11-25
PT1426044E (pt) 2006-06-30
NO20014985D0 (no) 2001-10-12
EP1183228A2 (en) 2002-03-06
PL211710B1 (pl) 2012-06-29
HK1092732A1 (en) 2007-02-16
EA200101076A1 (ru) 2002-04-25
DK1426044T3 (da) 2006-06-12
DE60025961D1 (de) 2006-04-20
ATE317257T1 (de) 2006-02-15
US20050079209A1 (en) 2005-04-14
IL145765A (en) 2007-07-04
ME00113B (me) 2010-10-10
IS8719A (is) 2008-03-07
DE60025961T2 (de) 2006-08-17
JP2011042657A (ja) 2011-03-03
AU2004224958B2 (en) 2007-11-22
HUP0201446A3 (en) 2002-11-28
CA2370143A1 (en) 2000-10-19
US6797281B1 (en) 2004-09-28
DK1183228T3 (da) 2005-05-17
KR20060113799A (ko) 2006-11-02
NO20014985L (no) 2001-10-12
DE60017388D1 (de) 2005-02-17
HK1045145B (zh) 2006-01-27
HRP20010740A2 (en) 2002-10-31
NZ528874A (en) 2005-09-30
ITRM990220A1 (it) 2000-10-13
CZ20013617A3 (cs) 2002-02-13
CN100402017C (zh) 2008-07-16
EE201100028A (et) 2011-08-15
EP1426044B1 (en) 2006-02-08
US20070190128A1 (en) 2007-08-16
EP1183228B1 (en) 2005-01-12
JP5420507B2 (ja) 2014-02-19
TR200202358T2 (tr) 2002-12-23
NO20085413L (no) 2001-10-12
HRP20010740B1 (en) 2005-08-31
YU70201A (sh) 2004-07-15
EE05514B1 (et) 2012-02-15
ATE286873T1 (de) 2005-01-15
JP2002541238A (ja) 2002-12-03
SI1183228T1 (en) 2005-04-30
HK1045145A1 (en) 2002-11-15
EE200100518A (et) 2002-12-16
CA2370143C (en) 2011-06-21
CA2650202C (en) 2012-12-11
IS2476B (is) 2008-12-15
IS6095A (is) 2001-09-28
NZ515270A (en) 2004-02-27
PL351112A1 (en) 2003-03-24
BG105971A (en) 2002-08-30
HU229366B1 (en) 2013-11-28
AU776301B2 (en) 2004-09-02
ES2258688T3 (es) 2006-09-01
CZ302628B6 (cs) 2011-08-10
RS50911B (sr) 2010-08-31
NO327742B1 (no) 2009-09-14
ZA200109291B (en) 2002-08-16
IL175366A0 (en) 2006-09-05
CN1263730C (zh) 2006-07-12
PL204418B1 (pl) 2010-01-29
WO2000061543A2 (en) 2000-10-19
BR0009765B1 (pt) 2013-11-05
BG65501B1 (bg) 2008-10-31
KR100684378B1 (ko) 2007-02-20
KR100798499B1 (ko) 2008-01-28
NO336949B1 (no) 2015-11-30
US7585519B2 (en) 2009-09-08
CN1359370A (zh) 2002-07-17
HUP0201446A2 (en) 2002-08-28
US7629003B2 (en) 2009-12-08
ES2234591T3 (es) 2005-07-01
IL175366A (en) 2010-12-30
BRPI0017460B1 (pt) 2016-04-19
CA2650202A1 (en) 2000-10-19
TR200102941T2 (tr) 2002-05-21
EE05719B1 (et) 2014-08-15
BR0009765A (pt) 2002-01-02
PT1183228E (pt) 2005-04-29
IS2539B (is) 2009-09-15
KR20010113794A (ko) 2001-12-28
BG65312B1 (bg) 2008-01-31
SI1426044T1 (sl) 2006-04-30
CN1823731A (zh) 2006-08-30
EA006021B1 (ru) 2005-08-25
EP1435232A1 (en) 2004-07-07
IT1306129B1 (it) 2001-05-30
DE60017388T2 (de) 2006-03-30
SK288246B6 (sk) 2015-03-03
EA004459B1 (ru) 2004-04-29
AU4312300A (en) 2000-11-14
RS52682B (en) 2013-08-30
IL145765A0 (en) 2002-07-25
MXPA01010359A (es) 2002-05-06
US20040186175A1 (en) 2004-09-23
EP1426044A1 (en) 2004-06-09
IL185486A0 (en) 2008-01-06
WO2000061543A3 (en) 2001-01-11
JP4703855B2 (ja) 2011-06-15
RS20090448A (en) 2010-06-30
MEP24008A (en) 2010-06-10
SK14312001A3 (sk) 2002-02-05
EA200300745A1 (ru) 2003-12-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7585519B2 (en) Esters of L-carnitine or alkanoyl L-carnitines useful as cationic lipids for the intracellular delivery of pharmacologically active compounds
AU2007214359B2 (en) Esters of L-carnitine or alkanoyl L-carnitines useful as cationic lipids for the intracellular delivery of pharmacologically active compounds
WO2023024511A1 (zh) 新型阳离子脂质化合物(一)
KR20070023826A (ko) 미용 활성 화합물의 세포 내 전달을 위한 양이온성지질로서 유용한 ｌ-카르니틴 또는 알카노일 ｌ-카르니틴의에스테르함유 리포솜이

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees

Effective date: 20170411