MXPA01010359A - Esteres de l-carnitina o alcanoil l-carnitinas y su uso como lipidos cationicos apropiados para favorecer la entrega intracelular de compuestos farmacologicamente activos. - Google Patents
Esteres de l-carnitina o alcanoil l-carnitinas y su uso como lipidos cationicos apropiados para favorecer la entrega intracelular de compuestos farmacologicamente activos.Info
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Abstract
Se describen esteres de L-carnitina y alcanoil L- carnitinas que pueden usarse como lipidos cationicos para la entrega intracelular de compuestos farmacologicamente activos. Tambien se describen nuevos esteres de L-carnitina y alcanoil L-carnitinas de la formula (I) (ver formula) en donde los grupos R son como se define en la descripcion.
Description
ESTERES DE L-CARNITINA O ALCANOIL L-CARNITINAS Y SU USO COMO LIPIDOS CATIONICOS APROPIADOS PARA FAVORECER LA ENTREGA INTRACELULAR DE COMPUESTOS FAMACOLOGICAMENTE
ACTIVOS 5 Antecedentes de la Invención . La invención descrita en la presente se refiere a una clase de nuevos esteres de L-carnitina y acil L- carnitinas, y su uso como lípidos catiónicos apropiados
10 para favorecer la entrega intracelular de compuestos farmacológicamente activos, facilitar su transporte a través de las membranas, o para promover su interacción con sitios específicos de membrana de células (receptores) . 15 La invención descrita en la presente también se refiere a esteres conocidos de L-carnitina y acil L- carnitinas, útiles para los mismos propósitos que los nuevos compuestos arriba mencionados. Lo que se entiende aquí por el término * entrega
20 intracelular" es la transfección celular con polinucleótidos o plásmidos de origen natural o modificado, dotados con actividad terapéutica (entrega de genes) o la introducción de medicamentos o péptidos inmunogénicos en las células. 25 REF: 133372
*"*-'•"*- Muchas de las sustancias farmacológicamente activas, tales como, por ejemplo, polipéptidos y proteínas o medicamentos en general, necesitan penetrar en las células para ejercer sus efectos por las funciones de influencia de las células a un nivel subcelular o molecular. Para estas moléculas, la membrana de la célula constituye una barrera selectivamente impermeable. La membrana de la célula, de hecho, realiza una función protectora, evitando la entrada de sustancias potencialmente tóxicas, pero también el paso de compuestos con actividad terapéutica. La composición compleja de la membrana de la célula incluye fosfolípidos, glicolípidos y proteínas; su función está influenciada por componentes citoplásmicos tales como Ca++ y otros iones, ATP, microfilamentos, microtubos, enzimas y proteínas que ligan Ca++. La interacción entre los componentes estructurales y citoplásmicos de las células y la respuesta a las señales externas, son responsables de la selectividad mostrada por y entre los diferentes tipos de células. Este efecto de barrera de las membranas puede superarse combinando sustancias en complejos con formulaciones de lípidos que reproducen la composición de los lípidos de membrana que se presentan naturalmente. Estos lípidos son capaces de fundirse con las membranas y de liberar las sustancias combinadas con ellos en las células. Los complejos de lípidos son capaces no sólo de facilitar la transferencia intracelular por medio de fusión con las membranas, sino también de disminuir la repulsión de carga entre la membrana y la molécula que ha penetrado en la célula. Los lípidos anfipáticos, tales como los fosfolípidos de membrana, forman vesículas o liposomas de lípido en los sistemas acuosos. Las liposomas son vesículas en las cuales se encierra completamente un volumen acuoso por una o más membranas compuestas de moléculas de lipidos, usualmente fosfolípidos. Los fosfolípidos, que consisten de una cabeza hidrofílica y un par de cadenas de carbono (cola hidrofóbica) , son los principales componentes de las membranas biológicas. En una solución acuosa, las colas hidrofóbicas se auto-asocian 'para excluir el agua, mientras que las cabezas hidrofílicas interactúan con el medio, formando espontáneamente poblaciones de vesículas de diferentes diámetros. Los lípidos generalmente son zwitteriónicos, neutrales o aniónicos. Estas vesículas pueden usarse como portadores de medicamentos, moléculas pequeñas, proteínas, nucleótidos y plásmidos. Durante los años recientes, las liposomas catiónicos, una clase de vesículas positivamente cargadas preparadas a partir de lípidos sintéticos, se han usado ampliamente para la transferencia de material genético en las células. La carga negativa del ADN puede interactuar con las cargas positivas de los lípidos catiónicos, formando un complejo estable ADN-liposo a. La simplicidad y versatilidad de esta tecnología hace de las liposomas un vehículo importante para la entrega de genes para la terapia de genes en sujetos humanos. Actualmente, la mayoría de los vectores usados para la terapia de genes y aprobada por el NIH Recombinant Advisory Committee (Comité Revisor de NIH Recombinante) incluye sistemas virales' y sintéticos. La infección viral involucra una serie de mecanismos complejos con objeto de ser capaz de atacar una célula específica y llevar el ADN en el núcleo. El racional para el uso de vectores virales para la terapia de genes, se basa en la posibilidad de reemplazar los genes virales con genes que codifican para una función terapéutica, sin eliminar la capacidad de la partícula viral para infectar las células. Las limitaciones de la terapia viral tiene que ver con aquellos elementos virales que pueden ser inmunogénicos, citopáticos y recombinogénicos . Se tienen grandes esperanzas en el uso de lípidos catiónicos para la terapia de genes. Estos vectores poseen un gran potencial comparados con aquellos de origen biológico, ya que estos son mucho más seguros, menos tóxicos y también son capaces de incorporar genes de gran tamaño. Como se compara con los vectores de tipo biológico, sin embargo, estos tienen un bajo rendimiento de transcripción de genes intracelulares. Debe tenerse en cuenta sin embargo, que el uso de tales sistemas de transfección está en una etapa inicial de desarrollo. Los lípidos catiónicos juegan un papel muy importante en la formación del complejo ADN-lípido, en la interacción célula-complejo, en la fusión con la membrana, en la entrega del ADN dentro de la célula y en la transcripción. Estos son ejemplos importantes de aplicaciones in vi vo de liposomas catiónicas. El primer ensayo clínico en la terapia de genes, se condujo al introducir un vector de expresión que contiene el gen HLA-B7 en complejo con la liposoma humana, para el tratamiento del melanoma. Otra aplicación importante se refiere al tratamiento de fibrosis quística pulmonar por medio de la administración por la ruta pulmonar o como un atomizador nasal, del vector de expresión SV-40C-FTR en complejo con la liposoma. Otros ensayos clínicos, que involucran el uso de liposomas en la terapia de genes para el cáncer, están actualmente en progreso. Cuatro elementos constituyentes están generalmente identificados en la estructura de lípidos catiónicos: la cabeza catiónica cargada positivamente, el espaciador, el lípido ancla y el enlace ligador. La cabeza catiónica es la responsable de las interacciones entre las liposomas catiónicas y el ADN, entre el complejo ADN-liposoma y la membrana de célula y los otros componente de la célula. Esta consiste de grupos mono- o policatiónicos (dependiendo del número de cargas) que puede substituirse variablemente. El espaciador es la parte de la molécula que separa la cabeza catiónica de la cola hidrofóbica y está involucrado en asegurar el contacto óptimo entre la cabeza catiónica y las cargas negativas de los fosfatos de ADN. El lípido ancla es la parte hidrocarburo no polar de la molécula y determina las propiedades físicas de la capa de lípido doble, tales como su rigidez y su relación de intercambio con los lípidos de membrana. Por * enlace ligador" significa el ligado entre las cadenas de hidrocarburo y el resto de la molécula. Este enlace determina la estabilidad química y la biodegradabilidad de los lípidos catiónicos. En años recientes, el uso de liposomas se ha incrementado estadísticamente en el sector cosmético. El éxito de las liposomas en este campo se debe al hecho de que estos compuestos son muy bien tolerados por la piel.
Estos se usan tanto como vehículos para ingredientes activos y como compuestos que favorecen la absorción del último. La literatura científica y de patentes es rica en referencia a la preparación y el uso de liposomas; sin embargo, muy pocas referencias describen el uso de derivados de carnitina útiles para la entrega de genes, mientras que para la entrega del medicamento no están disponibles documentos con respecto a técnicas conocidas para la preparación de compuestos remotamente parecidos a aquellos descritos en la presente de conformidad con la invención. La solicitud de patente EP 0 279 887 describe el uso de un derivado de carnitina, esto es, fosfatidil carnitina, opcionalmente en mezclas con otros fosfolípidos y lípidos (colesterol, fosfatidil colina, fosfatidil serina), para la preparación de liposomas. En los ejemplos proporcionados con respecto a la preparación de liposomas, las liposomas de fosfatidil carnitina se producen incorporando propranolol, un medicamento conocido por ser activo como un agente antihipertensivo, anti-angina y anti-arritmia . El derivado de carnitina se usa aquí tomando en cuenta el tropismo miocardial pronunciado de la carnitina. Este tropismo hace posible evitar que las liposomas sean metabolizadas por el hígado, en vez de alcanzar el sitio objetivo deseado. La presencia de fosfatidil carnitina también hace posible administrar los liposomas oralmente, ya que estos son resistentes a las lipasas intestinales. En J. Med. Chem. 1998 Junio 18; 41 (13) : 2207-15, se describen un número de esteres de L-carnitina útiles para la entrega de genes, pero estos no se describen o proponen como agentes útiles para la entrega de medicamento. La WO 96/39193 describe agentes novedosos para ataque de medicamentos que se dirigen para entrar dentro de las microcondrias por medio del sistema traslocasa carnitina-acilcarnitina, pero no los sugieren como un agente útil para preparar liposomas. La EP 559 625 Bl describe un número de esteres de L-carnitina y acil L-carnitina dotados con una actividad selectiva relajante del músculo del tracto gastrointestinal . En años recientes, los biólogos moleculares han identificado numerosos defectos en el nivel cromosomal que causa enfermedades hereditarias en los sujetos humanos . Un importante sector de la medicina moderna concierne al tratamiento de estas enfermedades hereditarias basadas en la genética, por medio del uso de protocolos de terapia de genes. Como ya se ha mencionado, las liposomas catiónicas son usados ampliamente para la entrega intracelular de compuestos farmacológicamente activos, facilitando el transporte a través de las membranas o promueven su interacción con sitios específicos de membrana de células (receptores) . Estos vectores tienen un gran potencial comparados con aquellos de origen biológico, ya que estos son mucho más seguros, menos tóxicos y también son capaces de incorporar genes de gran tamaño. Comparados con los vectores de tipo biológico, estos tienen un bajo rendimiento de transcripción de genes intracelulares. Por otra parte, la transferencia de genes mediada por los lípidos catiónicos convencionales requiere que el plásmido ADN y los lípidos catiónicos se mantengan separados, y que la mezcla se efectúe inmediatamente antes de la transferencia de genes. Han fallado hasta ahora, los intentos para estabilizar estos complejos de polinucleótido para producir resultados alentadores; de hecho, quedan estables solamente por un periodo corto. En el campo de la terapia de genes o entrega de genes y entrega de medicamentos hay por lo tanto, una necesidad fuertemente percibida de sistemas de sitio específico, estables y reproducibles, que también sean activos después de un periodo apropiado de tiempo. Se ha encontrado ahora que una clase de los lípidos catiónicos poderosamente activos en la promoción de la entrega intracelular de compuestos farmacológicamente activos, comprende esteres nuevos de L-carnitina y acil L-carnitinas. Estos nuevos compuestos son estables y altamente selectivos debido a que son de sitio específico para alcanzar el órgano objetivo. Esta característica hace que sean particularmente útiles para el transporte de compuestos activos directamente al sitio donde pueden ejercer su actividad farmacológica. Descripción de la Invención. Los compuestos de conformidad con la invención descritos en la presente son compuestos de la fórmula general (I) :
íi) donde : n es un entero desde 1 hasta 3; R es hidrógeno o alcanoilo, recto o ramificado, con 2-6 átomos de carbono; Ri y R2, que pueden ser iguales o diferentes, representan una cadena acilo recta saturada o no saturada con 3-20 átomos de carbono; y X" es un anión de un ácido farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de R son acetilo, propionilo, butirilo, valerilo e isovalerilo. Los ejemplos de Ri y R2 son hexanoilo, undecanoilo, miristoilo, palmitoilo o aleoilo. Los compuestos preferidos de conformidad con la invención son: - Éster de bromuro de L-carnitina con 2-hidroxiacetil-1,3-dipalmitoilo glicerol (ST 770); Éster de bromuro de acetil L-carnitina con 2-hidroxiacetil-1, 3-dipalmitoil glicerol (ST 771); Éster de bromuro de propionil L-carnitina con 2-hidroxiacetil-1, 3-dipalmitoil glicerol (ST 772); Ester de bromuro de isobutiril L-carnitina con 2-hidroxiacetil-1, 3-dipalmitoil glicerol (ST 773); Éster de bromuro de isovaleril L-carnitina con 2-hidroxiacetil-1, 3-dipalmitoil glicerol (ST 774);
Éster de bromuro de L-carnitina con 1, 3-dihexanoil-2-hidroxiacetil glicerol (ST 810); Éster de bromuro de acetil L-carnitina con 1,3-dihexanoil-2-hidroxiacetil glicerol (ST 809) ; - Éster de bromuro de propionil L-carnitina con 1,3-dihexanoil-2-hidroxiacetil glicerol (ST 808) ; El significado de un anión de un ácido farmacéuticamente aceptable es cualquier anión de un ácido que no produzca efectos laterales o tóxicos indeseables. Estos ácidos son bien conocidos para los farmacologistas y para los expertos en tecnología farmacéutica. Los ejemplos de estos aniones, aunque no exclusivamente los que se enlistan son: cloro; bromo; yodo; aspartato; aspartato ácido; citrato; citrato ácido; tartrato; tartrato ácido; fosfato; fosfato ácido; fumarato; fumarato ácido; glicerofosfato; fosfato de glucosa; lactato; maleato; maleato ácido; mucato; oratato; oxalato; oxalato ácido; sulfato; sulfato ácido; tricloroacetato; trifluoroacetato; metano sulfonato; pamoato y pamoato ácido. Los compuestos de la fórmula (I), en forma de liposomas, son agentes útiles tanto para la entrega de plásmidos que ocurren naturalmente o modificados, como de nucleótidos útiles en la terapia de genes, o que codifican para un péptido o proteína útil como una vacuna, y para la entrega general del medicamentos, tales como, por ejemplo, medicamentos anticáncer, agentes antivirales, agentes antibacterianos, antihongos, antiprotozoarios, medicamentos útiles para la terapia de enfermedades del sistema cardiovascular, o péptidos inmunogénicos y otros medicamentos útiles en la terapia.
Las liposomas que contienen el compuesto de fórmula (I) se preparan por técnicas convencionales, bien conocidas para la persona que tiene habilidad ordinaria en el arte; ver por ejemplo Alien T.M. Drugs 56, 747-56 (1998). Las liposomas de conformidad con la presente invención, pueden prepararse también usando otros componentes bien conocidos en la práctica de la tecnología de las liposomas. En una modalidad de la presente invención, las liposomas pueden contener lípidos auxiliares, un término que es bien entendido en este arte. Los ejemplos de lípidos auxiliares son colesterol, l-palmitoil-2-oleoil fosfatidil colina o dioleil fosfatidil colina. Las liposomas de conformidad con la presente invención se presentan apropiadamente como composiciones. En la modalidad pertinente para entregar los compuestos farmacológicamente activos, las composiciones se entienden como farmacéuticas, opcionalmente comprendiendo vehículos y/o excipientes farmacéuticamente aceptables. Los compuestos de la fórmula (I), en la forma de liposomas, también pueden ser útiles en la preparación de composiciones cosméticas, ya sea comprendiendo la liposoma per se como agente activo cosmético y para la entrega de sustancias con actividad cosmética, tales como, por ejemplo, agentes hidratantes, nutrientes, substancias para la limpieza facial, agentes antiarrugas, agentes anticelulitis y agentes antimarca de estiramientos . Las liposomas comprenden los compuestos de fórmula (I) que pueden administrarse oralmente o parenteralmente, intravenosamente, intramuscularmente, subcutáneamente, transdermalmente, o en forma de atomizados nasales o para la boca. La invención descrita en la presente también se refiere a lípidos catiónicos adicionales con la fórmula general (II), ya conocidos para un uso diferente (EP 559 625 mencionada arriba) . De conformidad con la presente invención, los compuestos de la fórmula (II) son esteres de L-carnitina, útiles para la preparación de liposomas que poseen una actividad potente en la entrega de medicamentos y características presentes de estabilidad y selectividad para alcanzar el órgano objetivo comparable con aquellas de los compuestos de fórmula (I) arriba descritos. Las mismas propiedades ventajosas se aplican en el caso de los cosméticos. Estos compuestos tienen la fórmula general (II) :
(II) donde : R3 es una cadena acilo, recta o ramificada, saturada o no saturada, con 4-26 átomos de carbono; R4 es una cadena alquilo recta o ramificada, saturada o no saturada, con 4-26 átomos de carbono; X" es el anión de un ácido farmacológicamente aceptable. Los ejemplos preferidos de R3 son nonanoilo, dodecanoilo, miristoilo, palmitoilo, estearoilo u oleoilo. Los ejemplos preferidos de R4 son nonilo, undecilo, tetradecilo, hexadecilo u oleilo. Los ejemplos de compuestos específicos de la fórmula (II) , de conformidad con la invención descrita aquí, son:
Éster undecilo del cloruro de palmitoil L-carnitina (ST 983) ; Éster undecilo del cloruro de estearoil L-carnitina (ST 1055) ; - Éster tetradecilo del cloruro de estearoil L-carnitina (ST 1351) ; Éster tetradecilo del cloruro de palmitoil L-carnitina (ST 1379) ; Éster tetradecil del cloruro de miristoil L-carnitina (ST 1380); Éster hexadecil de bromuro de palmitoil L-carnitina (ST 1390) ; Éster oleil del cloruro de oleil L-carnitina (ST
1392) ; Se conocen diversos compuestos de la fórmula (II), especialmente ST 1380, ST 1390 y ST 1392, y se describen en la cita arriba notada J. Med. Chem. 1998 Jun 18; 41
(13) :2207-15, como agentes útiles para la preparación de liposomas para transfección celular dotadas con actividad terapéutica, pero que no son descritas como agentes útiles para la preparación de liposomas para la entrega de medicamentos. La persona habilidosa con experiencia promedio en el campo de formulaciones farmacéuticas, está bien consciente de las dificultades encontradas en la preparación de complejos liposomas-medicamentos, de hecho, es imposible establecer a priori si una liposoma que es útil para la entrega de genes puede utilizarse para entregar medicamento debido a los numerosos problemas que deben superarse para obtener una liposoma capaz de complementarse con un medicamento y la cual se entregará preferentemente en el órgano en donde tiene que ejercer su actividad curativa. Los compuestos de la fórmula (II), en forma de liposomas, son agentes útiles para la entrega de medicamentos, tales como, por ejemplo, anticáncer, antiangiogénicos, antivirales, antibacterianos, antihongos, agentes antiprotozoarios, como medicamentos útiles para la terapia de problemas cardiovasculares, o péptidos inmunogénicos, y otros medicamentos útiles en la terapia. Los compuestos de la fórmula (II), en forma de liposomas, también son útiles en la preparación de composiciones cosméticas como agentes cosméticos per se, o para la entrega de sustancias con actividad cosmética, tales como, por ejemplo, agentes hidratantes, nutrientes, agentes de limpieza facial, y agentes antiarrugas, anticelulitis y antimarcas de estiramiento.
Las liposomas pueden contener opcionalmente lípidos auxiliares como en el caso de las liposomas que comprenden los compuestos de fórmula (II). Las liposomas que comprenden compuestos de fórmula (II) pueden administrarse oralmente o parentalmente, intravenosamente, intramuscularmente, subcutáneamente, transdermalmente, o en forma de atomizados nasales o para la boca. La invención descrita en la presente, también se refiere a lípidos catiónicos en la fórmula general (III), ya conocidos para un uso diferente (EP 559 625 mencionado arriba) . De conformidad con la presente invención, los compuestos de la fórmula (III) son esteres de L-cartinina, útiles para la preparación de liposomas que poseen una actividad potente para promover la entrega del medicamento y características presentes de estabilidad y selectividad para alcanzar el órgano objetivo, comparable con aquellas de los compuestos de la fórmula (I) arriba descritos. Estos compuestos tienen la fórmula general (III) :
donde : Rs es una cadena acilo recta o ramificada, saturada o no saturada, con 4-26 átomos de carbono; R6 es una cadena alquilo recta o ramificada, saturada o no saturada, con 4-26 átomos de carbono; y X" es el anión de un ácido farmacológicamente aceptable; con la condición de que: cuando R5 es estearoilo, R no es estearilo, cuando R5 es oleoilo, Rß no es estearilo, cuando R5 es palmitoilo, R6 no es palmitilo, cuando R5 es miristoilo, R6 no es miristilo, cuando R5 es lauroilo, R6 no es laurilo, cuando R5 es oleoilo, R6 no es oleilo. Los compuestos no reivindicados en la forma de liposomas se describen en J. Med. Cehm. 1988, 41, 2207-2215 exclusivamente para la entrega de genes. Los ejemplos preferidos de R5 son nonanoilo, dodecanoilo, miristoilo, palmitoilo, estearoilo u oleoilo . Los ejemplos preferidos de R6 son nonilo, undecilo, tetradecilo, hexadecilo u oleilo.
Éster tetradecil de cloruro de estearoil L-carnitina (ST 1351) ; Éster tetradecil de cloruro de palmitoil L-carnitina (ST 1379) . Los compuestos de la fórmula (III) son agentes útiles para la entrega de plásmidos o nucleótidos que ocurren naturalmente o modificados útiles en la terapia de genes, o que codifican para un péptido o proteína útil como una vacuna. Los compuestos de la fórmula (III) pueden administrarse oralmente o parenteralmente, intravenosamente, intramuscularmente, subcutáneamente, transdermalmente, o en forma de atomizados nasales o para la boca. El procedimiento para la preparación de los compuestos de la fórmula (I) de conformidad con la invención, se presenta en el siguiente esquemas de reacción 1, intentando que este diagrama aplique para la fórmula general (I) completamente. La persona con habilidad, fácilmente puede obtener grupos mediados en R, i y 2/ ya que todos los reactivos necesarios están comercialmente disponibles o se describen en la literatura, y las condiciones de reacción generalmente son aplicables para todo el alcance de la presente invención; cualquier modificación, si es necesaria, se realiza normalmente dentro del conocimiento común general . ESQUEMA DE REACCIÓN 1
CH.OH CH.OCO(CH.)„CH, 1 ' C-0 ! C1CC-(CH.)„CH, i C-0 CH.OK CH.OCO(CH,)„CH,
CK.OCO(CH.),.CK, CK.OCO(CH.),,CH. i N»BK, C-0 i CH-OH (2) 6) ! CH.OCO(CH.)„CH, CH.OCOfCH.), CH.
Con referencia al esquema de reacción 1, la preparación de los componentes de la fórmula (I) de conformidad con la invención, se ilustra a continuación.
Con referencia al diagrama de reacción 1, la preparación de los componentes de la fórmula (I) de conformidad con la invención, se ilustra a continuación.
EJEMPLO 1 Preparación del éster propionilo del bromuro de L-carnitina con 2-hidroxi acetil 1,3 dipalmitoil glicerol (ST 772) a) preparación de 1, 3-dihidroxipropano-2-ona 1,3-dipalmitato (1) Se disuelve dihidroxiacetona (7g; 0.078 mol) en 300 mL de cloroformo anhidro a 0°C (temperatura externa) bajo un flujo de nitrógeno anhidro. A la solución de esta manera obtenida, se le agrega gota a gota cloruro de palmitoilo (44 g; 0.16 mol) y piridina anhidra (15 L) . La mezcla resultante, la temperatura de la cual se conduce a temperatura ambiente, se mantiene bajo agitación durante 24 horas. La mezcla se extrae en el siguiente orden: con 300 mL de una solución acuosa de ácido clorhídrico al 0.5%, 300 mL de una solución acuosa de bicarbonato de sodio al 5% y por último con 300 mL de agua.
Rendimiento: 73% p.f=80-81°C HXNMR (CDCI3) : 0.9 (6H, t, CH3CH2-) ; 1.3 (48H, m, (CH2)n=24); 1.55 (4H, m, -OCOCH2CH2-) ; 2.4 (4H, t, -OCOCH2-); 4.7 (4H, S, -OCCH2-). b) Preparación de 1, 2, 3-trihidroxipropano-l, 3-dipalmitato (2) Se agrega lentamente agua (7.5 mL) al producto (1) (5g, 9 mmol), disuelto en tetrahidofurano (125 mL) y tolueno (25 mL) bajo agitación. La temperatura de la suspensión blanca lechosa obtenida se conduce hasta 5°C (temperatura externa) y se agrega borohidruro de sodio (500 mg; 13 mmol) en pequeñas porciones. La suspensión se mantiene en agitación durante 30 minutos a 5°C. Se agrega después ácido acético glacial hasta que la efervescencia producida por la descomposición del exceso de borohidruro de sodio cesa, obteniendo finalmente una solución. Se agrega cloroformo (100 L) a la solución, obteniendo la formación de un sistema bifásico. La fase orgánica inferior consistente de CHCI3 se separó, se extrajo en el siguiente orden: con agua (25 de borohidruro de sodio cesa, obteniendo finalmente una solución. Se agrega cloroformo (100 mL) a la solución, obteniendo la formación de un sistema bifásico. La fase orgánica inferior consistente de CHC13 se separó, se extrajo en el siguiente orden: con agua (25 mL) , bicarbonato de sodio (25 mL de una solución acuosa al 10%) y agua (25 mL) . La solución orgánica conteniendo el (2), se deshidrató en sulfato de sodio, se filtró y se concentró hasta secarse, obteniendo un producto similar a la cera.
El producto (2) se obtuvo por cristalización en acetona del producto crudo similar a la cera. Se obtuvo 4.8 g del producto (2) . Rendimiento: 94%. p.f .=71-72°C H1NMR(CDC13) : 0.9 (6H, t, CH3CH2-); 1.3 (48H, m, (CH2)n=24) ;1.55 (4H, m, -OCOCH2CH2-) ; 2.4 (4H, t, -OCOCH2-) ; 4.2 (5H, , -CHCH20-) . c) Preparación de 1, 3-dipalmitoil-2-bromoacetil glicerol (3) El producto (2) (2.5 g; 4.4 mmol) se solubiliza en cloroformo anhidro (50 mL) bajo agitación y a 0°C (temperatura externa) .
A la solución de esta manera obtenida, se le agrega lentamente piridina (0.42 ml) y gota a gota 3 ml de una solución de cloroformo que contiene bromo-acetilcloruro (0.43 mL; 5.2 mmol) . La mezcla de reacción se mantiene durante 30 minutos a 0°C (temperatura externa) y durante 30 minutos a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se trató en el siguiente orden: con una solución acuosa de ácido clorhídrico al 1% (50 mL aproximadamente), con una solución acuosa de bicarbonato de sodio al 5% (50 L aproximadamente) y agua. El producto (3) se purificó por cristalización de acetona, después de deshidratar la mezcla de reacción (con sulfato de sodio) y se concentra hasta secar. Se obtienen 2.5 g del producto (3) . Rendimiento: 89%. p.f .=46-47°C HXNMR (CDC13) : 0.9 (6H, t, CH3CH2-); 1.3 (48H, m, (CH2)n=24); 1.55 (4H, m, -OCOCH2CH2-) ; 2.4 (4H, t, -OCOCH2-); 3.9 (2H, s,-OCH2COO-) 4.2-4.4 (5H, , -CHCH20-); 5.25 (1H, m, CHCH20-) .
d) Preparación del éster de bromuro de L propionil carnitina con 2-hidroxiacetil-l, 3-dipalmitoil glicerol (4) La sal interior de L-propionil carnitina (0.95 g, 4.4 mmol) secada previamente al vacío a 40°C, se suspendió en dimetilformamida anhidra (20 mL aproximadamente) . El producto (3) (3 g, 4.7 mmol), se agregó a la suspensión en pequeñas porciones. La suspensión se calentó lentamente hasta 38°C y se mantuvo en esas condiciones hasta que se obtuvo una solución. Después de 10 minutos, la solución se llevó hasta 0°C durante 30 minutos. Se obtuvo un precipitado, el cual se filtró y se lavó con éter de etilo y se disolvió en cloroformo (100 L) . La solución opalescente obtenida (30 mL) se filtró en celita y se concentró. A esta última solución se agregó hexano (100 L) , y el precipitado del producto (4) obtenido se filtró y se secó al vacío a 35°C. Se obtuvieron 3.19 g del compuesto del título. Rendimiento: 80% p.f .=127-128°C [a]25D=-3.9(C = cloroformo al 1%) Análisis elemental de C47H88BrNO?o C% H% N% Br% Calculado 62.23 9.78 1.57 8.81 Encontrado 62.73 10.15 0.79 8.77 XH RMN (CDC13) : 0.9-0.95 (6H, t, CH3CH2CH2-) ; 1.1-1.2 (3H, t, CH3CH2CO) ; 1.2-1.4 (24H, m, CH2n=24); 1.5-1.6 (4H, , -OCCH2CH2-); 2.3-2.4 (4H, t, -OCCH2CH2-); 2.4-2.45 (4H, d.d., -CHCH2O-); 2.95 (2H, d, -CH2COOCH2COO-) ; 3.5 (9H, s, N (CH3)3); 4.2 (4H, m, ^CHzOCOCH?-J ; 4.35 (2H, , -CH2N-); 4.65 (2H, d.d., -OCH2CO-); 5.25 (1H, m, -OCH2CHCH20-) ; 5.75 (1H, m, -CHCH2N) . EJEMPLOS 2-7. Los siguientes compuestos se prepararon de la misma manera como en el ejemplo precedente: éster de bromuro de L-carnitina con 2-hidroxiacetil- 1, 3-dipalmitoil glicerol (ST 770); - éster de bromuro de acetil L-carnitina con 2- hidroxiacetil-1, 3-dipalmitoil glicerol (ST 771); éster de bromuro de isobutiril L-carnitina con 2- hidroxiacetil-1, 3-dipalmitoil glicerol (ST 773) éster de bromuro de isovaleril L-carnitina con 2- hidroxiacetil-1, 3-dipalmitoil glicerol (ST 774); éster de bromuro de L-carnitina con 1, 3-dihexanoil- 2-hidroxiacetil glicerol (ST 810) ; éster de bromuro de acetil L-carnitina con 1,3- dihexanoil-2-hidroxiacetil glicerol (ST 809) .
(IV) donde: R7 es un grupo -C (Rn) =N-O(n)Ri0í en el cual Rio es hidrógeno o un grupo alquilo C1-C5 o alquenil C1-C5, recto o ramificado, o un grupo cicloalquilo C3-C10, o un grupo cicloalquilo C3-C?o_ alquilo C1-C5 recto o ramificado, o un grupo arilo C6-C?4, o un grupo alquilo C1-C5 arilo (C6-C4) alquilo recto o ramificado, o un grupo alquilo heterociclo- (C1-C5) recto o ramificado o heterocíclico, el grupo heterocíclico conteniendo al menos un heteroátomo seleccionado de los átomos de nitrógeno, opcionalmente substituido por un grupo alquilo
(C1-C5) t y/u oxígeno y/o azufre; Los grupos alquilo, alquenilo, cicloalquilo, arilo, aril-alquilo, heterocíclico o heterociclo-alquilo están opcionalmente substituidos con otros grupos seleccionados de: halógeno, hidroxi, alquilo C1-C5, alcoxi C1-C5, fenilo, ciano, nitro, -NR?2Ri3, donde R?2 y Ri3, que pueden ser el mismo o diferente, son hidrógeno, alquilo (C1-C5) recto o ramificado, el grupo -COOH o uno de sus esteres farmacéuticamente aceptables; o el grupo CONR14R15, donde Ri4 y Ri5, que pueden ser el mismo o diferente, son hidrógeno, alquilo (C1-C5) recto o ramificado; o Rio es un residuo aroilo C6-C?0, opcionalmente substituido por uno o más grupos seleccionados de: halógeno, hidroxi, alquilo C1-C5 recto o ramificado, alcoxi C1-C5 recto o ramificado, fenilo, ciano, nitro, -NR?6Ri , donde R?6 y R17, que pueden ser el mismo o diferente, son hidrógeno, alquilo C1-C5 recto o ramificado; Rio es un residuo poliaminoalquilo; o Rio es un residuo glicosilo; n es el número 0 o 1; R11 es hidrógeno, alquilo C1-C5 recto o ramificado, alquenilo C1-C5 recto o ramificado, cicloalquilo C3-C10, cicloalquilo (C3-C?o) -alquilo (C1-C5) recto o ramificado, arilo C6-C14, arilo (Cß-Cm) -alquilo (C1-C5) recto o ramificado; R8 y Rg, que pueden ser el mismo o diferente, son hidrógeno, hidroxi, alcoxi C1-C5 recto o ramificado; sus Ni-óxidos, isómeros simples, particularmente los isómeros syn y anti del grupo -C (Rn) sus posibles enantiómeros, diaestereoisómeros y mezclas Rii es hidrógeno, alquilo C1-C5 recto o ramificado, alquenilo C1-C5 recto o ramificado, cicloalquilo C3-C10, cicloalquilo (C3-C?o) recto o ramificado -alquilo (C1-C5) / arilo C6-C? , arilo (Ce-Cu) recto o ramificado -alquilo (C1-C5) ; R8 y R9, que pueden ser el mismo o diferente, son hidrógeno, hidroxi, alcoxi C1-C5 recto o ramificado; sus Ni-óxidos, isómeros simples, particularmente los isómeros syn y anti del grupo -C (Rn) sus posibles enantiómeros, diaestereoisómeros y mezclas relacionadas, sus sales farmacéuticamente aceptables y sus metabolitos activos. Los compuestos de la fórmula (IV) se describen en la solicitud de patente europea no. 99830124.6, presentada el 9 de marzo de 1999. Con respecto a los compuestos de la fórmula (IV) en los cuales n es 1 y Rio es como se define arriba, con excepción de aroilo, estos compuestos pueden prepararse partiendo de camptotecinas 7-aldehido (formula IVa, Rn hidrogeno) o camptotecina 7-ceto (formula IVa, u diferente a hidrógeno) .
(IVa) donde R7 es el grupo -C(Ru)=0, y Rn es como se define en la fórmula (IV), R8 y R9 son como se define en la fórmula (IV). El compuesto de la fórmula (IVa) se hace reaccionar con el compuesto de la fórmula (Va) , R?0O-NH2, donde Rio es como arriba, para producir compuestos de la fórmula (I), en los cuales R7 es el grupo -C (Rn) Rio se define como en la fórmula (IV), excepto para aroilo . La reacción puede llevarse a cabo con métodos convencionales conocidos por expertos en el campo, el proceso consiste en la formación normal de oximas. Preferiblemente, la relación molar de camptotecinas 7-aldehído o 7-ceto para hidroxilamina, deberá estar en el rango de 1:3 hasta 3:1. Las sales de hidroxilamina relevantes también pueden usarse. La reacción se lleva a cabo en presencia de una base, por ejemplo, una base inorgánica tal como carbonato de potasio, o una base orgánica tal como trietilamina o diazabiciclononano, usando solventes polares, preferiblemente metanol o etanol, y llevando a cabo la reacción a una temperatura en el rango desde temperatura ambiente hasta temperatura del punto de ebullición del solvente, opcionalmente en presencia de agentes deshidratantes, por ejemplo sulfato de sodio o magnesio, tamices moleculares. Si se requiere, la reacción también puede llevarse a cabo en presencia de un catalizador, por ejemplo un ácido Lewis. Alternativamente, los compuestos arriba mencionados pueden prepararse a partir de la oxima de camptotecina 7-aldehido (obtenida como se describe en Sawada y colaboradores, Chem. Pharm. Bull. 39, 2574 (1991)), o 7-cetona, o de la correspondiente 7-acilcamptotecina por la reacción con un haluro R?0-X, en donde X es preferiblemente yodo, en un solvente polar, por ejemplo tetrahidrofurano o alcoholes y en presencia de una base, por ejemplo hidruro de sodio o carbonato de potasio. Con respecto a los compuestos de fórmula (IV) en los cuales n es 1 y Ri0 es aroilo, como se define en la fórmula (IV), estos compuestos pueden prepararse partiendo de camptotecina 7-oxima, la preparación de la cual se describe en el párrafo previo, con cloruros de Rio-COCl acilo, en solventes polares, y en presencia de una base, preferiblemente piridina, o directamente en piridina, como se describe por Cho et al. J. Org. Chem. 62, 2230 (1997) . Con respecto a los compuestos de fórmula (IV) en los cuales n es 0 y Rio es como se define arriba, con la excepción de aroilo, los compuestos pueden prepararse partiendo de camptotecinas 7-aldehído (fórmula IVa, Rn hidrógeno) o camptotecina 7-ceto (fórmula IVa, Rp diferente a hidrógeno) .
donde R7 es el grupo -C(Rn)=0, y Rn es como se define en la fórmula (IV), R8 y Rg son como se define en la fórmula (IV). El compuesto de la fórmula (IVa) se hace reaccionar con el compuesto de Ja fórmula (Vb) R?0-NH2, en donde Rio es como se define arriba, para producir compuestos de fórmula (IV), en los cuales R7 es el grupo -C (Rn) =N-R?o, Rio es como se define en la fórmula (IV), excepto para aroilo. La reacción puede llevarse a cabo con métodos convencionales conocidos por expertos en la técnica farmacéutica, el proceso consiste en la formación normal de iminas. Preferiblemente, la relación molar de camptotecina 7-aldehído o 7-ceto para imina, deberá estar en el rango de 1:3 hasta 3:1. Las sales de amina relevantes también pueden usarse. La reacción se lleva a
,T cabo en presencia de una base, por ejemplo, una base orgánica tal como carbonato de potasio, o una base orgánica, tal como trietilamina o diazabiciclononano, usando solventes polares, preferiblemente metanol o etanol, y llevando a cabo la reacción a una temperatura en el rango desde temperatura ambiente hasta la temperatura del punto de ebullición del solvente, opcionalmente en presencia de agentes deshidratantes, por ejemplo sulfato de sodio o magnesio, tamices moleculares. Si se requiere, la reacción también puede conducirse en presencia de un catalizador, por ejemplo un ácido Lewis como se describe, por ejemplo, por Moretti and Torre, Síntesis, 1970, 141; o por Kobayashi y colaboradores, Synlett, 1977, 115) . La camptotecina 7-aldehído y camptotecina 7-oxima se describen en la solicitud de patente europea EP 0056692 y en el artículo arriba citado por Sawada y colaboradores, Chem. Pharm. Bull. 39, 2574 (1991). Los Ni-óxidos de los compuestos de la fórmula (IV) se preparan de conformidad con métodos de oxidación de nitrógeno heteroaromáticos conocidos, preferiblemente por la oxidación con ácido acético o trifluoroacético y peróxido de hidrógeno, o por reacción con peroxiácidos orgánicos (A- Albini and S. Pietra, Heterocyclic N-oxides, CRC, 1991) .
Con respecto a la importancia variable de Ro, presente en los reactivos diferentes de fórmula V, estos reactivos están comercialmente disponibles, o pueden prepararse de conformidad con métodos familiares de la literatura, que el experto en el sector puede resolver, como un suplemento de su propio conocimiento. Las sales farmacéuticamente aceptables se obtienen con métodos convencionales descritos en la literatura, y que no requiere una descripción adicional. EJEMPLO 8 7-benciloxiiminometilcamptotecina (CPT 172) Se disuelven 500 mg (1.33 mmol) de 7-formilcamptotecina en 100 ml de etanol. Se agrega 15 ml de piridina y 638 mg (4 mmol) de clorohidrato de 0-bencilhidroxilamina. La solución se va a reflujo durante 5 horas. El solvente se evapora al vacío y el residuo de esta manera obtenido se purifica por cromatografía instantánea en gel de sílice usando una mezcla 4:6 de hexano/etilo como el eluyente. Rendimiento: 65% p.f. : 200-205°C dec. El producto obtenido consiste de una mezcla aproximadamente de 8:2 de los dos isómeros syn y anti (isómero A: Rf 0.32; isómero B, Rf 0.19, en gel de sílice Merck 60 F254; eluyente: hexano: acetato de etilo 3:7).
HPLC: los análisis se llevaron a cabo en un aparato equipado con una bomba cuaternaria (HP 1050) con un inyector Rheodyna (20 µl de rizo) y un detector de diodo colocado (HP 1050) corrido por el programa HPLC-ChemStation. La adquisición del espectro se dio a partir de 200 hasta 600 nm y los cromatogramas se registraron a 360 y 400 nm. Se usó una columna de fase inversa C18 (Rainin C18; 25x0.4 cm, Varian) con una precolumna RP18. El análisis se llevó a cabo con un gradiente de elución lineal, partiendo de acetonitrilo: agua 30:70 hasta acetonitrilo al 100% durante 20 minutos, con una relación de flujo de 1 ml/minuto. Los tiempos de retención fueron: 12.51 minutos para el isómero B y 14.48 minutos para el isómero A. XH-NMR (300 MHz; DMS0-d6) : d: 0.88 (t, H3-18A+H3-18B) , 1.87 8m, (H2-19A+H2-19B) , 5.18 (s, H2-5B) , 5.21 (8s, H2-Ph B), 5.30 (H2-Ph A), 5.40 (s, H2-5A) , 5.45 (s, H2-17A+H2-17B), 6.53 (s, -OH A+-OH B) , 7.3-7.6 (m, Ar A+ Ar B+H-14A + H- 14B), 7.75 ( , H-11A+H- 11B), 7.85-7-95 (m, H-10A+H-10B), 7.98 (dd, H-12B) , 8.18-8.27 (m, H-12A+H9-B) , 8.45 (s, CH=N B) , 8.59 (dd, H-9A) , 9.38 (s, CH=N A) . Masa m/z 481 (M+ 100) 374 (30) 330 (70) 300 (30) 273 (20) 243 (20) 91 (34).
EJEMPLO 9 7-butoxiiminometilcamptotecina (CPT 184) Se disolvieron 400 mg (1.06 mmol) de 7- formilcamptotecina en 80 ml de etanol. Se agregaron 12 ml de piridina y 400 mg (3.18 mmol) de clorohidrato de O-t-butilhidroxilamina. La solución se fue a reflujo durante 4 horas. El solvente se evaporó al vacío y el residuo de esta manera obtenido se purificó por cromatografía instantánea en gel de sílice usando una mezcla 4:6 de hexano/acetato de etilo como el eluyente. Se obtienen 322 mg (0.72 mmol) de un sólido amarillo . Rendimiento: 68% p.f. : 250°C dec. El producto obtenido consiste de aproximadamente una mezcla 8:2 de los dos isómeros syn y anti (isómero A: Rf 0.31; isómero B, Rf 0.24, en gel de sílice Merck 60 F254; eluyente: hexano: acetato de etilo3:7). HPLC: Los análisis se llevaron a cabo en un aparato equipado con una bomba cuaternaria (HP 1050) con un inyector Rheodyne (20 µl en circuito) y un detector de diodo colocado (HP 1050) corrido por el programa HPLC-ChemStation. La adquisición de espectros se dio a partir de 200 hasta 600 nm y los cromatogramas se registraron a 360 y 400 nm.
Una columna de fase inversa C18 (Rainin C18; 25x 0.4 cm, Varian) se usó con una precolumna RP18. El análisis se llevó a cabo con un gradiente de elución lineal, partiendo de acetonitrilo: agua 30:70 hasta acetonitrilo 100% durante 20 minutos, con una relación de flujo de 1 ml/minuto. Los tiempos de retención fueron: 12.92 minutos para el isómero B y 14.61 minutos para el isómero A. ^-NMR (300 MHz; DMSO-d6) : d: 0.88 (t, H3-18A+H3-18B) , 1.30 (s, t-but. B), 1.47 (s, t-but.A), 1.87 (m, H2-19A+H2-19B), 5.18 (s, H2-5 B) , 5.37 (H2-5 A), 5.42 (s, H2-17A+H2-17B), 6.54 (s, -OH A+-OH B) , 7.35 (s H-14A) , 7.36 (s, H-14B) 7.69-7.83 (m, H-11A+H-11B) , 7.85-7.98 (m, H-10A+H-10B), 8.07 (dd, H-9B) , 8.16-8.27 ( , H-9A+H-12B) 8.40 (s, CH B), 8.62 (dd, H-12A), 9.31 (s, CH A). Masa m/z 448 (M+ 28) 391 (40) 374 (100) 362 (40) 330 (34) 57 (17) . PREPARACIÓN DE LIPOSOMAS Los compuestos de conformidad con la invención pueden usarse para preparar liposomas multilamelares (MLV) y liposomas unilamelares (SUV) , ambas en formas de polvos secos y como suspensiones en soluciones acuosas. Los compuestos de conformidad con la invención, preparados como se describe en los ejemplos 1-7, se usan para preparar las liposomas de conformidad con el siguiente procedimiento. Una cantidad apropiada del compuesto se disuelve en cloroformo; la solución se concentra al vacío hasta secarse en un evaporador rotatorio hasta que se obtiene una película de lípido. La película de lípido se seca bajo alto vacío hasta que el último rastro que queda de solvente sea eliminado y entonces se disuelve el alcohol tert-butílico o con agua. La solución de esta manera obtenida se liofiliza, obteniendo un polvo seco, suave. Los polvos se hidratan con una cantidad apropiada de solución acuosa, obteniendo la liposoma del compuesto usado, que se complementa entonces con el polinucleótido o con el medicamento deseado. Otro método de preparación de liposomas consiste en absorber una película de lípido, que consiste de un compuesto de conformidad con la invención en un solvente, en un soporte inerte apropiado tal como sorbitol, manitol u otros carbohidratos farmacológicamente aceptables. La mezcla se seca al vacío, obteniendo un sólido que puede hidratarse fácilmente y muy rápidamente antes de usarse. Las preparaciones en la forma de polvos secos presentan la ventaja de ser estables durante largos periodos y son fáciles de usar. Por otra parte, los compuestos de conformidad con la invención pueden usarse para preparar liposomas en complejo con ADN o con el medicamento deseado, en forma de polvos secos, de conformidad con el siguiente procedimiento. El compuesto de conformidad con la invención se disuelve en alcohol tert-butílico o con agua; La solución de esta manera obtenida se mezcla con ADN o el medicamento deseado, y la mezcla se liofiliza, obteniendo el complejo que puede definirse como proliposoma-ADN o proliposoma-medicamento, en forma de un polvo seco, suave. Los polvos de esta manera obtenidos (proliposomas) pueden usarse para la preparación de composiciones farmacéuticas que pueden administrarse por medio de aerosol, o que, alternativamente, cuando se reconstituyen con agua, o con una solución amortiguadora apropiada, pueden administrarse parenteralmente u oralmente. Las liposomas en complejo con ADN o con medicamento, en forma sólida, también pueden obtenerse con el método de adsorción de la película lípida en un soporte inerte tal como sorbitol, manitol, u otros carbohidratos por medio del método descrito arriba. Prueba de la formación de liposoma La formación de liposoma se prueba por medio de un método colorimétrico, usando un tinte soluble al agua, de conformidad con el siguiente procedimiento. Se obtiene una solución acuosa del tinte soluble en agua Arsenazo III (p.m. = 776.37; 2.3 mg/mL).
Esta solución se usa en lugar de agua para hidratar las películas lípidas producidas de la preparación arriba mencionada. Una alícuota de la suspensión que contiene la liposoma que encapsula el tinte, se diluye 100 veces con agua. Se usan dos mL de la suspensión de liposoma para obtener la primera densidad óptica leída a 660 nm; La lectura se obtiene en relación a una muestra igual definida como un blanco. Se agregan 200 µl de una solución de CaCl2 (15 mg/mL; 100 mM) a la primera muestra, y la densidad óptica se mide a 660 nm contra el blanco, al cual se le agregan 200 µl de agua. El valor de absorbancia obtenido se indica como la lectura 2. Se procede a agregar a la muestra 100 µl de una solución de
Tritón X-100 (5% v/v; 0.26% de concentración final) y al blanco 200 µl de agua; La densidad óptica leída a 600 nm proporciona el valor de densidad óptica definido como lectura 3. Para calcular el porcentaje de tinte encapsulado, se usa la siguiente fórmula: % de tinte encapsulado = lectura 3 - lectura 2 x 100 lectura 3 El porcentaje de tinte encapsulado proporciona una medida de la formación de liposomas y un promedio es aproximadamente de 40%: el registro de tamaño de liposoma se ejecuta usando un Láser Light Scattering con una salida positiva. EJEMPLOS DE PREPARACIÓN DE LIPOSOMAS Preparación de liposomas de éster undecilo de cloruro de palmitoil L-carnitina (ST 983) en la forma de: a) Polvos liofilizados Se disuelven 65 mg, 0.11 mmoles de éster undecil de cloruro de palmitoil L-carnitina en 20 mL de cloroformo, en un matraz de 100 mL. La solución se evapora hasta que se obtiene una película de lípidos que se seca al vacío durante 3 horas. El producto de esta manera obtenido se disuelve en alcohol tert-butílico y esta solución se enfría rápidamente hasta -70°C con nitrógeno liquido y se liofiliza durante 24 horas. Se obtiene un sólido blanco suave esponjoso. b) Polvos adsorbentes Se disuelven 143 mg, 0.231 mmol de éster undecilo del cloruro de palmitoil L-carnitina en 100 mL de cloroformo. La solución de esta manera obtenida se vacía en pequeñas porciones en un matraz de 100 mL que contiene 750 mg de sorbitol. Al final de la adición de las diferentes porciones de la solución de cloroformo, el cloroformo se evapora rápidamente.
El sólido de esta manera obtenido se seca al vacío durante 3 horas. Se obtienen 893 mg de un producto sólido blanco. Antes de usarse, el producto se hidrata rápidamente con un volumen apropiado de agua para obtener una solución isotónica. c) Suspensiones MLV. 65 mg, 0.11 mmol de éster undecilo del cloruro de palmitoil L-carnitina se disolvieron en 20 mL de cloroformo, en un matraz de 100 mL. La solución de esta manera obtenida se evaporó hasta que se obtuvo una película de lípido que después se secó al vacío durante 3 horas. La película de lípido se hidrató con 10 mL de agua, a 30°C, durante 3 horas, obteniendo una suspensión de MLV. La suspensión de MLV, apropiadamente diluida, se hizo en complejo con un polinucleótido o con un medicamento y se usó para ensayos biológicos. e) Suspensiones SUV. Se disolvieron 65 mg, 0.11 mmol de éster undecilo de cloruro de palmitoil L-carnitina en 20 mL de cloroformo, en un matraz de 100 mL.
La solución de esta manera obtenida, se evaporó hasta que se obtuvo una película de lípido que se secó entonces al vacío durante 3 horas. La película de lípido se hidrató con 10 mL de agua, a 30°C, durante 3 horas, obteniendo una suspensión MLV. La suspensión MLV se extruyó 10 veces a través de un filtro de policarbonato con un tamaño de poro de 200 nm, la suspensión de liposoma unilamelar de esta manera obtenida, se hizo en complejo con un polinucleótido o un medicamento y se usó para ensayos biológicos. f) Prueba de estabilidad físicas de liposomas. La estabilidad física de la suspensión de liposomas se probó por medio de turbidimetría durante un periodo de 30 días. Una medición de absorbancia a 600 nm durante un cierto intervalo de tiempo, se llevó a cabo para cada una de las suspensiones a probarse. El valor medio de absorbancia medido al tiempo 0 quedó constante para todas las formulaciones probadas. Las moléculas se considera que presentan los valores completos sobre los periodos de tiempo considerados. Las suspensiones de liposomas MLV y SUV, pueden prepararse combinando los compuestos de conformidad con la invención con lípidos auxiliares tales como
i .
colesterol, l-palmitoil-2-oleoil fosfatidil colina (POPC) o dioleil fosfatidil colina (DOPE) . Los compuestos se combinan con lípidos auxiliares para los propósitos de obtener liposomas con membranas más estables. A continuación, en la sección que describe la preparación de liposomas, se da un ejemplo de la preparación, en el cual un compuesto de conformidad con la invención se combina con un lípido auxiliar tal como colesterol o POPC. EJEMPLOS DE PREPARACIÓN DE LIPOSOMAS PARA LIBERCIÓN DE
MEDICAMENTO
EJEMPLO 10 Preparación de taxol-liposomas ST 983 MLV (1:40). Se disolvieron 20 mg, 0.0234 mmol de taxol y 556 mg, 0.9417 mmol de ST 983 en 20 L de cloroformo. La solución se concentró hasta que se obtuvo una película de lípido en la superficie del matraz de vidrio. Después de eliminar los últimos rastros de cloroformo con la ayuda de una bomba de vacío, se agregaron 20 L de alcohol tert-butílico a la película de lípido, y la solución de esta manera obtenida se sub-dividió en 19 fracciones que se congelaron inmediatamente a -70°C con nitrógeno líquido y se liofilizaron durante
24 horas. Cada una de las fracciones de sólido contenían taxol (1.05 mg) y ST 983 (29.2 mg) .
Para obtener la suspensión final de liposomas, el producto liofilizado se hidrató al momento del uso con agua (450 µL) u otras soluciones salinas, se agitó durante 10 minutos y se dejó el resto durante 30 minutos para permitir que completara el proceso de hinchado
(hidratación) . Se obtuvieron liposomas MLV. Prueba de estabilidad física de la preparación. La estabilidad física de la preparación se probó por medio de turbidimetría con el registro de un TDC (Curva de Manejo de Tiempoa) a 800 nm, a 20°C, durante 20 horas.
Se registró una tendencia de turbiedad constante, que indica la estabilidad de la preparación, sin fenómenos de precipitación. Prueba de estabilidad química del taxol en la preparación. La estabilidad química del taxol se probó por HPLC. Las condiciones cromatográficas fueron como siguen: Columna: µBondapack C-18 Eluyente: acetonitrilo : agua 70:30 Detector UV-VIS: 227 nm Relación de flujo; 1 mL/minuto Tiempo de retención; 4.5 minutos. La concentración de taxol, determinada contra un estándar, fue de 2.13 mg/mL.
El porcentaje de taxol encapsulado fue del 98%. EJEMPLO 11 Preparación de taxol-liposomas ST 983 SUV. Se disolvieron 20 mg, 0.0234 mmol de taxol y 556 mg, 0.9417 mmol de ST 983, en 20 mL de cloroformo. La solución se concentró hasta que se obtuvo una película de lípido en la superficie del matraz de vidrio.
Después de eliminar los últimos rastros de cloroformo con una bomba de alto vacío, se agregaron 20 L de alcohol tert-butílico a la película de lípido, y la solución de esta manera obtenida se sub-dividió en 19 fracciones que se congelaron inmediatamente a -70°C con nitrógeno líquido y se liofilizaron durante 24 horas. cada una de las fracciones del sólido contenía taxol (1.05 mg) y ST 983 (29.2 mg) . Para obtener la suspensión de liposoma SUV final, el producto liofilizado, hidratado con una solución PBS (1 mL) , se sónico durante 20 minutos a 0°C. Se realizó entonces la filtración en un filtro de 400 nm para eliminar los restos de titanio liberados por la sonda sonicadora. Prueba de estabilidad física de la preparación. La estabilidad física de la preparación se probó por medio de turbidimetría con el registro de un TDC (Curva de Manejo de Tiempo) a 800 nm, a 20°C, durante 20 horas.
Una tendencia de turbiedad constante, que indica la estabilidad de la preparación, se registró, sin un fenómeno de precipitación. Prueba de estabilidad química del taxol en la preparación. La estabilidad química del taxol se probó por HPLC.
Las condiciones cromatográficas fueron como sigue: Columna: µBondapack C-18 Eluyente: acetonitrilo: agua 70:30 Detector UV-VIS: 227 nm Relación de flujo; 1 mL/minuto Tiempo de retención; 4.5 minutos. El análisis HPLC de la suspensión de liposoma SUV proporciona los mismos resultados como la correspondiente suspensión de liposoma MLV, y en este caso, también, el porcentaje de taxol encapsulado fue del 98%. El análisis HPLC se repitió después de 24 horas, sin revelar nuevos picos diferentes al pico de taxol, indicando la estabilidad del ingrediente activo. EJEMPLO 12 Preparación de liposomas taxol-ST983-colesterol (1:15). Estos tipos de liposomas se prepararon con objeto de obtener complejos con membranas estables.
Se disuelven 6 mg, 0.0101 mmol de taxol, 62.2 mg, 0.105 mmol de ST 983 y 40 mg de colesterol, en 10 mL de cloroformo . La solución de esta manera obtenida, se concentró hasta que se obtiene una película de lípido en la superficie del matraz de vidrio. Después de eliminar los últimos rastros de cloroformo con una bomba de alto vacío, se agregó 6.3 mL de alcohol tert-butílico a la película de lípido, y la solución de esta manera obtenida se sub-dividió en 5 fracciones que se congelaron inmediatamente a -70°C con nitrógeno líquido y se liofilizó durante 24 horas. Cada una de las fracciones de sólido contenía taxol (1.2 mg) , ST 983 (12.44 mg) y colesterol (8 mg) . Para obtener la suspensión final de liposoma, el producto liofilizado se hidrató al momento del uso con agua (1000 µL) u otras soluciones salinas, se agitó durante 10 minutos y se dejó el resto durante 30 minutos para permitir que se completara el proceso de hinchado (hidratación) . Se obtuvieron liposomas MLV. Prueba de estabilidad física de la preparación. La estabilidad física de la preparación se probó por medio de turbidimetría con el registro de un TDC (Curva de Manejo de Tiempo ) a 800 nm, a 20°C, durante 6 horas.
Una tendencia de turbiedad constante, que indica la estabilidad de la preparación, se registró, sin un fenómeno de precipitación. EJEMPLO 13 Preparación de liposomas taxol-ST 772 SUV (1:70). Se disolvieron 20 mg, 0.0234 mmol de taxol y 1485 mg, 1.638 mmol de ST 772, en 20 mL de cloroformo. La solución se concentró hasta que se obtuvo una película de lípido en la superficie del matraz de vidrio. Después de eliminar los últimos rastros de cloroformo con una bomba de alto vacío, se agregó 20 mL de alcohol tert-butílico a la película de lípido. Para obtener una solución clara, esto se calentó hasta 60°C. la solución se congeló inmediatamente a -70°C con nitrógeno líquido y se liofilizó durante 24 horas. Para obtener la suspensión de liposoma SUV final, el producto liofilizado, hidratado con una solución de PBS (20 L) , se sónico durante 20 minutos a 0°C. Se realizó entonces la filtración en un filtro de 400 nm para eliminar los rastros de titanio liberado por la sonda sonicadora. Prueba de estabilidad física de la preparación. La estabilidad física de la preparación se probó por medio de turbidimetría con el registro de un TDC (Curva de Manejo de Tiempo ) a 800 nm, a 20°C, durante 6 horas.
Una tendencia de turbiedad constante, que indica la estabilidad de la preparación, se registró, sin un fenómeno de precipitación. EJEMPLO 14 Preparación de liposomas CPT 83-ST 983 MLV (1:40). Se disolvieron 6.3 mg, 0.0168 mmol de CPT 83 (7-carbonitrilo camptotecina, descrito en la WO 97/31003) y 400 mg, 0.667 mmol de ST 983, en 20 mL de cloroformo. La solución se concentró hasta que se obtuvo una película de lípido en la superficie del matraz de vidrio.
Después de eliminar los últimos rastros de cloroformo con la ayuda de una bomba de vacío, se agregó 26 mL de alcohol tert-butílico a la película de lípido y la solución de esta manera obtenida se sub-dividió en 12 fracciones que se congelaron inmediatamente a -70°C con nitrógeno líquido y se liofilizaron durante 24 horas, cada una de las fracciones de sólido contenía CPT 83 (0.525 mg) y ST 983 (33.33 mg) . Para obtener la suspensión final de liposoma, el producto liofilizado se hidrató al momento del uso con agua (1000 µL) u otras soluciones salinas, y se agitó durante 10 minutos. Se obtuvieron liposomas MLV. Prueba de estabilidad física de la preparación.
La estabilidad física de la preparación se probó por medio de turbidimetría con el registro de un TDC (Curva de Manejo de Tiempo) a 800 nm, a 20°C, durante 20 horas.
Una tendencia de turbiedad constante, que indica la estabilidad de la preparación, se registró, sin un fenómeno de precipitación. Prueba de estabilidad química del CPT 83 en la preparación. La estabilidad química del CPT 83 se probó por HPLC. Las condiciones cromatográficas fueron como sigue: Columna: Supelcosil LC-7?BZ Eluyente: solución amortiguadora de fosfato 20 mM:metanol
40:60, pH = 7.3 Detector UV-VIS: 360 nm Relación de flujo; 1 mL/minuto Tiempo de retención; 4.033 minutos. La concentración de CPT 83, determinada contra un estándar, fue de 0.502 mg/mL. El porcentaje de CPT 83 encapsulado fue del 99%. EJEMPLO 15 Preparación de liposomas CPT 83-ST 983 SUV (1:40). Se disolvieron 6.3 mg, 0.0168 mmol de CPT 83 y 400 mg, 0.667 mmol de ST 983, en 20 L de cloroformo. La solución se concentró hasta que se obtuvo una película de lípido en la superficie del matraz de vidrio.
Después de eliminar los últimos rastros de cloroformo con una bomba de alto vacío, se agregó 26 mL de alcohol tert-butílico a la película de lípido, y la solución de esta manera obtenida se sub-dividió en 12 fracciones que se congelaron inmediatamente a -70°C con nitrógeno líquido y se liofilizaron durante 24 horas, cada fracción de sólido contenía CPT 83 (0.525 mg) y ST 983 (33.33 mg) . Para obtener la suspensión de liposoma SUV final, el producto liofilizado, hidratado con agua (1000 µL) , se sónico durante 40 minutos a 0°C. La filtración se realizó entonces en un filtro de 400 nm para eliminar los rastros de titanio liberados por la sonda sonicadora. Prueba de estabilidad química del CPT 83 en la preparación. La estabilidad química del CPT 83 se probó por HPLC. Las condiciones cromatográficas fueron como sigue: Columna: Supelcosil LC-ABZ Eluyente: solución amortiguadora de fosfato 20 mM:metanol 40: 60, pH = 7.3 Detector UV-VIS: 360 nm Relación de flujo; 1 mL/minuto Tiempo de retención; 4.033 minutos.
La concentración de CPT 83, determinada contra un estándar, fue de 0.3 mg/mL. El porcentaje de CPT 83 encapsulado fue del 59%. El análisis HPLC se repitió después de 24 horas sin revelar nuevos picos diferentes al pico CPT 83, indicando la estabilidad del compuesto. Prueba de estabilidad física de la preparación. La estabilidad física de la preparación se probó por medio de turbidimetría con el registro de un TDC (Curva de Manejo de Tiempo ) a 600 nm, a 20°C, durante 20 horas.
Una tendencia de turbiedad constante, que indica la estabilidad de la preparación, se registró, sin un fenómeno de precipitación. EJEMPLO 16 Preparación de liposomas CPT 184-ST 983 MLV (1:40). Se disolvieron 7.29 mg, 0.0168 mmol de CPT 184 y 400 mg, 0.677 mmol de ST 983, en 20 L de cloroformo. La solución se concentró hasta que se obtuvo una película de lípido en la superficie del matraz de vidrio. Después de eliminar los últimos rastros de cloroformo con la ayuda de una bomba de vacío, se agregó 26 mL de alcohol tert-butílico a la película de lípido, y la solución de esta manera obtenida se sub-dividió en 12 fracciones que se congelaron inmediatamente a -70°C con nitrógeno líquido y se liofilizaron durante 24 horas.
cada fracción de sólido contenía CPT 184 (0.607 mg) y ST 983 (33.33) . Para obtener la suspensión de liposoma final, el producto liofilizado se hidrató al momento del uso con agua (1000 µL) u otras soluciones salinas, y se agitó durante 10 minutos. Se obtuvieron lipososomas MLV. Prueba de estabilidad física de la preparación. La estabilidad física de la preparación se probó por medio de turbidimetría con el registro de un TDC (Curva de Manejo de Tiempo ) a 600 nm, a 20°C, durante 20 horas. Una tendencia de turbiedad constante, que indica la estabilidad de la preparación, se registró, sin un fenómeno de precipitación. Prueba de estabilidad química del CPT 184 en la preparación. La estabilidad química del CPT 184 se probó por HPLC. Las condiciones cromatográficas fueron como sigue: Columna: Supelcosil LC-ABZ Eluyente: solución amortiguadora de fosfato 20 mM:metanol
40: 60, pH = 7.3 Detector UV-VIS: 360 nm Relación de flujo; 1 mL/minuto Tiempo de retención; 25.5 minutos.
La concentración de CPT 184, determinada contra un estándar, fue de 0.600 mg/mL. El porcentaje de CPT 184 encapsulado fue del 99%. EJEMPLO 17 Preparación de liposomas CPT 184-ST 983 (1:40). Se disolvieron 7.29 mg, 0.0168 mmol de CPT 184 y 400 mg, 0.667 mmol de ST 983, en 20 mL de cloroformo. La solución se concentró hasta que se obtuvo una película de lípido en la superficie del matraz de vidrio. Después de eliminar los últimos rastros de cloroformo con una bomba de alto vacío, se agregó 26 L de alcohol tert-butílico a la película de lípido, y la solución de esta manera obtenida se sub-dividió en 12 fracciones que se congelaron inmediatamente a -70°C con nitrógeno líquido y se liofilizaron durante 24 horas, cada fracción del sólido contenía CPT 184 (0.607 mg) y ST 983 (33.33 mg) . Para obtener la suspensión de liposoma SUV final, el producto liofilizado, hidratado con agua (1000 µL) , se sónico durante 40 minutos a 0°C. La filtración se realizó entonces en un filtro de 400 nm para eliminar los rastros de titanio liberados por la sonda sonicadora. Prueba de estabilidad química del CPT 184 en la preparación.
La estabilidad química del CPT 184 se probó por HPLC. Las condiciones cromatográficas fueron como sigue: Columna: Supelcosil LC-7?BZ Eluyente: solución amortiguadora de fosfato 20 mM:metanol 40: 60, pH = 7.3 Detector UV-VIS: 360 nm Relación de flujo; 1 mL/minuto Tiempo de retención; 25.5 minutos. La concentración de CPT 184, determinada contra un estándar, fue de 0.36 mg/mL. El porcentaje de CPT 184 encapsulado fue del 70%. El análisis HPLC se repitió después de 24 horas, sin revelar nuevos picos diferentes al pico CPT 184, indicando la estabilidad del ingrediente activo. Prueba de estabilidad física de la preparación. La estabilidad física de la preparación se probó por medio de turbidimetría con el registro de un TDC (Tiempo de Manejo de Curva) a 600 nm, a 20°C, durante 20 horas. Una tendencia de turbiedad constante, que indica la estabilidad de la preparación, se registró, sin un fenómeno de precipitación. En los siguientes ejemplos, las liposomas se preparan usando lípidos auxiliares y/o agentes crioprotectores .
EJEMPLO 18. Preparación de liposomas CPT 184-ST 983. En un matraz de 2 litros, se agregaron 100 ml de metilcloroformo a 20 mg de CPT 184 y 600 mg de ST 983, y la mezcla se entibia ligeramente hasta que se completa la disolución. La solución obtenida se concentra en un rotavapor hasta que se obtiene una película de lípido, que se seca adicionalmente durante dos horas en una bomba de alto vacío. La película de lípido se hidrata con una solución de lactosa (6 g/300 ml de agua) a 45°C y se deja bajo agitación en el rotavapor durante alrededor de 2 horas. La suspensión se sónica entonces durante 2 horas, cada uno de los ciclos son de media hora. Posteriormente, el producto se filtra a través de un filtro de 200 nm y se liofiliza. Prueba de estabilidad química del CPT 184 en la preparación . La estabilidad química del CPT 184 se comprueba por HPLC. El producto fue estable durante 24 horas de la prueba. Prueba de estabilidad física de la preparación. La estabilidad física de la preparación se prueba por medio de turbidimetría. El producto fue estable a través de las 24 horas de la prueba. El tamaño de partícula también fue estable (valor medio de 100 nm) .
EJEMPLO 19 Preparación de liposomas CPT 184-ST 983. Para 1 ml de formulación liposomal (POPC - 1-palmitoil-2-oleoil fosfatidil colina 5 mM; ST 983 1.25 mM; CPT 184 0.25 y trehalosa 150 mM) , se usó el siguiente procedimiento: Se disolvieron 0.11 mg, 0.25 µmoles de CPT 184 en
250 µL de acetato de etilo, 3.79 mg, se disolvieron 4.89 µmoles de POPC en 100 µL de etanol y se disolvieron 0.74 mg, 1.25 µmoles de ST 983 en 100 µL de etanol. Estas tres soluciones se mezclaron de manera conjunta y se formaron vórtices. Los solventes se evaporaron completamente con un rotavapor a temperatura ambiente, 80 mbar. La película de lípido se secó durante dos horas en la oscuridad. La película de lípido se suspendió en 1 ml de una solución de dihidrato de trehalosa (Fluka, HPLC 99%) , esterilizada a través de un filtro 0.22 nm y se formaron vórtices durante dos minutos. La suspensión se extruyó 21 veces a través de filtros de policarbonato de 200 nm. La suspensión de liposoma extruída se congeló en nitrógeno líquido y se liofilizó durante 2 noches. Se obtuvo un sólido blanco. EJEMPLO 20 Preparación de liposomas CPT 184-ST 983.
Se usó el mismo procedimiento del Ejemplo 19, excepto que se usó trehalosa 500 M. ACTIVIDAD ANTICANCER DEL COMPLEJO LIPOSOMA ST 983-AGENTE ANTICÁNCER. Como se observará a continuación, la liposoma ST 983 muestra una acumulación predominante en el nivel pulmonar. Esta característica de sitio específico favorece su uso en un modelo murino de carcinogénesis pulmonar. El agente anti-cáncer usado en este experimento fue taxol . Para inducir el tumor in vi vo, los ratones Balb/c no anestesiados recibieron inyecciones de 3xl05 células de carcinoma pulmonar de murina M109 en 0.1 ml de RPMI-1640 (Sigma) en los cuadríceps femorales de la pata posterior derecha. Diez días después de la implantación del tumor, el complejo de liposoma-taxol se diluyó con una solución salina amortiguadora de fosfato (PBS, SIGMA, P-4417) y se inyectó intravenosamente a una concentración de 2.5 mg/mL de ST 983 t 75 µg/mL de taxol. El taxol (paclitaxel INDENA) usado como un control se disolvió en el vehículo de cremofor EL (BASF) a una concentración de 20 mg/mL y se almacenó a +4°C durante las siguientes 24 horas, protegiendo contra la luz. Al momento del uso, se diluyó con una solución salina amortiguadora de fosfato (PBS, SIGMA) , y se inyectó intravenosamente en el mismo volumen y condiciones de concentración como se describe para el taxol transportado por la liposoma ST 983. El cremofor se prepara diluyendo 1:1 con alcohol de etilo . Las administraciones se dan durante siete días consecutivos iniciando del día 10 después de la inoculación del tumor. Los animales se mantienen bajo observación hasta el día 17 después de la inoculación y se sacrifican por dislocación cervical, y sus pulmones se remueven para la determinación del número de metástasis. El manchado de los pulmones para detectar la metástasis se da por incubación de los pulmones durante 10 días en 5 ml de solución Bouin, que consiste de 71% de solución de ácido pícrico saturado al 71%, ácido acético glacial al 7.8% (Merck), y 24% de formaldehído al 10% (Fluka). Al final del periodo de incubación en la solución Bouin, se contaron los números de metástasis. Como se compara con los ratones de control no tratados, el taxol transportado en cremofor no muestra reducción de efectos en el número de metástasis pulmonares, no obstante que el último fue más pequeño que aquellos de los controles no tratados, en tanto que el taxol en complejo con la liposoma ST 983 muestra una reducción importante tanto en el número como en el tamaño de las metástasis pulmonares. Los análisis estadísticos de los datos para el número de metástasis de pulmón se da usando las pruebas Mann-Whitney no paramétricas para datos impares. Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla 1 a continuación. TABLA 1. Metástasis de pulmón al día 17 después de la incolucación de tumor M109 en ratones BALB/c después del tratamiento con taxol y taxol/liposoma ST983.
Grupo Metástasis me dia Tamaño de ±s . d . metástasis Controles 21+12 M Taxol 22±9 S Taxol-ST983 10±2 S
M= medio (1-2 mm de diámetro) S = Pequeño (< 1 mm de diámetro) Pruebas de citotoxicidad in vitro. Los ensayos de toxicidad se dieron en células HeLA y
M109 en placas de 96 pozos. El día después de la colocación en placas, las células se trataron con las moléculas a probarse durante las próximas 48 horas. Las células se lavaron entonces con PBS y se quedaron en condiciones normales de crecimiento durante 48 horas. Después de remover el medio de crecimiento, las células se incubaron en hielo con TCA al 16%, se lavaron 3 veces en H20, se trataron durante 30 minutos con sulforhodamina B (SRB) en ácido acético al 1%, se lavaron 3 veces en ácido acético al 1% solamente, se incubaron durante 20 minutos en TRIS 10 mM pH 10.5 y, por último, las lecturas se tomaron a 540 nm. Pruebas de citotoxicidad con CPT 83. Las pruebas de citotoxicidad in vi tro con CPT 83 se condujeron con objeto de evaluar la citotoxicidad del agente anti-cáncer en complejo con la liposoma, como una indicación preliminar de actividad eficiente. Para evaluar la capacidad de la liposoma para transportar la CPT 83 in vi tro en células M109, se usó la prueba de sulforhodamina B descrita arriba. Además, la citotoxicidad de la CPT 83 disuelta en dimetiisulfóxido (DMSO) también se evaluó como se compara con la de la misma molécula en complejo con la liposoma ST 983. El complejo de liposoma-CPT 83 se usó en los ensayos de citotoxicidad en las concentraciones indicadas en las Tablas 2.1, 2.2 y 3.3 a continuación tanto en las configuraciones SUV como MLV. La relación molar liposoma: CPT 83 usada fue de 40:1. Los valores de citotoxicidad medios de los complejos ST 983-CPT 83 tanto en las configuraciones SUV como MLV dados en las Tablas 2.1, 2.2 y 2.3 a continuación, indican que la liposoma ST 983 es capaz de transportar la CPT 83 de mucho mejor manera que el DMSO, presentando niveles de citotoxicidad del mismo orden de magnitud. TABLA 2.1 Citotoxicidad (SRB) de ST983 SUV-CPT 83 Concentraciones en µM ctr 1.3 0.13 0.013 00013 0.911 0.294 0.705 0.908 0.911 0.745 0.198 0.525 0.821 0.83 0.884 0.204 0.801 0.906 0.91 0.833 0.25 0.748 0.856 0.853 0.854 0.254 0.778 0.867 0.873 0.793 0.231 0.739 0.802 0.803 0.792 0.193 0.602 0.827 0.829 0.901 0.248 0.69 0.904 0.89
Medio 0.839125 0.352444 0.635333 0.767111 0.7667 s.d. 0.060645 0.034513 0.092925 0.042054 0.040149
Los valores dados en la tabla se refieren a la densidad óptica leída a 540 nm.
TABLA 2 .2 Citotoxicidad (SRB) de ST983 MLV-CPT 83 Concentraciones en µM ctr 1.3 0.13 0.013 00013 0.895 0.038 0.04 0.095 0.088 0.82 0.038 0.046 0.109 0.124 0.896 0.041 0.049 0.128 0.127 0.847 0.041 0.042 0.105 0.115 0.863 0.041 0.053 0.111 0.107 0.794 0.043 0.041 0.073 0.095 0.829 0.039 0.044 0.08 0.085 0.893 0.041 0.044 0.064 0.065
Medio 0.854625 0.04025 0.044875 0.085625 0.10075 s.d. 00.038682 0.001753 0.004357 0.021738 0.021359
Los valores dados en la tabla se refieren a la densidad óptica leída a 540 nm.
I .
TABLA 2 .3 Citotoxicidad (SRB) de DMSO-CPT 83 Concentraciones en µM ctr 13 1.3 0.13 0.013 0.0013 0.898 0.281 0.33 0.406 0.8 0.809 0.774 0.267 0.302 0.407 0.804 0.816 0.857 0.3 0.285 0.57 0.863 0.886 0.787 0.286 0.287 0.383 0.836 0.841 0.808 0.285 0.318 0.474 0.851 0.863 0.745 0.288 0.317 0.467 0.79 0.795 0.775 0.312 0.328 0.429 0.806 0.831 0.864 0.318 0.305 0.421 0.81 0.878
Medio 0.8135 0.292125 0.309 0.444625 0.82 0.839875 s.d. 0.053519 0.016848 0.017205 0.059269 0.026506 0.033237
Los valores dados en la tabla se refieren a la densidad óptica leída a 540 nm. Actividad biológica del complejo liposoma ST 983-CPT 184. Se probó la actividad biológica de las liposomas del Ejemplo 18 (llamada a continuación liposoma A) y del Ejemplo 20 (llamada a continuación liposoma B) . Toxicidad en un ratón saludable. Se dieron las liposomas A y B oralmente, intravenosamente, en comparación con el CPT 184 libre, a la dosis de 1.2 mg/kg de conformidad con el esquema q4x4.
Las dos liposomas no tuvieron efectos importantes en el peso corporal, pulmones, bazo y ríñones. La liposoma B, intravenosamente, y la liposoma A, oralmente, afectan el peso del timo de manera similar al CPT 184 libre. La liposoma A intravenosa tuvo solamente un efecto mínimo. Los parámetros hematológicos no muestran variaciones importantes después de 24 horas, con ambas liposomas. La liposoma A, intravenosamente dada de conformidad con el esquema qd5, muestra una toxicidad comparable con la CPT 184 libre. Tropismo del pulmón de las liposomas. Las Liposomas A y B muestran una acumulación predominante al nivel pulmonar. Las liposomas se dan i.v. 1.2 mg/kg. La CPT 184 se dio oralmente 1.2 mg/kg en DMSO. Los animales, ratones saludables, se sacrificaron 24 horas después de la última administración. Los pulmones se extirparon de los cuerpos y se congelaron en nitrógeno líquido. Una vez descongelados, los órganos se agruparon y se homogenizaron en ácido acético al 0.1%/acetonitrilo 1:5. Los homogenizados se dividieron en tres alícuotas, dos de ellas se agregaron con CPT 184 para el cálculo de la recuperación. Las tres muestras se centrifugaron a 16,000 g durante 5 minutos. Los sobrenadantes se recolectaron y se extrajeron con diclorometano. La fase orgánica se secó con un speedvac y el residuo se volvió a disolver en acetonitrilo con objeto de tener la cantidad correspondiente para un animal en 50 µL para cargar en
HPLC. La HPLC se corrió en un Waters Symmetry C18 3.5 µm
(4.6x7.5 mm) . Un fluorímetro Merck fue el detector a 370 nm de excitación y a 510 nm de emisión. El eluyente fue agua/acetonitrilo 60:40, isocrático. El volumen de muestra fue de 50 µL. La CPT 184 recuperada fue de alrededor del 70%. 7?mbas liposomas A y B dieron un nivel de acumulación de CPT 184 mayor que la CPT 184 libre en DMSO, como se muestra en la Figura 3 Los ratones se sacrificaron 24 horas después del último tratamiento. Los valores representan las muestras de pulmón agrupadas con medios mas/menos se. ENTREGA DE GENES Preparación del complejo liposoma-ADN. La liposoma y el plásmido de ADN se diluyen apropiadamente de manera separada en PBS. El ADN se agrega entonces a la liposoma y el complejo liposoma-ADN se deja durante aproximadamente 30 minutos a 4°C para facilitar la formación de una interacción estable liposoma-ADN. En los experimentos in vi tro, se usa 1,2-dioleoiloxi-3-trimetilamonio propano (DOTAP) como un lípido catiónico de referencia; 2.5 µg de ADN de plásmido se usan por 2xl05 de células HeLa, y la concentración de liposoma fue de 9 µM.
En los experimentos in vi vo, tanto el DOTAP como el [2, 3- (dioleoil) propil] trimetilamonio (DOTMA) se usan como lípidos catiónicos de referencia. Las relaciones molares definidas en los resultados, se refieren a concentraciones nmol de los respectivos lípidos catiónicos por mg de ADN. En los experimentos de transfección in vi vo, se usan 25 µg de plásmido de ADN por animal. El plásmido pCMVluc usado en estos experimentos, contiene el cADN del gen de luciferasa bajo el control transcripcional del promotor de citomegalovirus (CMV) . Determinación cuantitativa de la actividad de luciferasa. La actividad de la proteína luciferasa en las células y tejidos, se determina usando el estuche Boehringer Mannheim (no. de catálogo 1669 893). Las células se lavan 3 veces en PBS y entonces se remueven de la placa con un raspador en solución amortiguadora de lisis (100 mM de fosfato de potasio, pH 7.8, 1 mM de ditiotreitol-DTT) y se expone a tres ciclos consecutivos de congelamiento y descongelamiento. Después de centrifugar en tubos Eppendorf de 1.5 mL, el sobrenadante se usó para la prueba de luminiscencia no más de 5 horas después de la extracción de las proteínas. Las mediciones de emisión de luminiscencia se dan usando
.-aC^Mfc un luminómetro a 562 nm. Después de un primer congelamiento en N2 líquido seguido por un molido fino para obtener un polvo, los tejidos se volvieron a suspender en solución amortiguadora de lisis y se incubaron durante 10-15 minutos en hielo. Las muestras se centrifugaron entonces en tubos Eppendorf de 2 ml y el sobrenadante se probó para actividad de luciferasa. Análisis de manchado de puntos. El ADN celular se extrajo de conformidad con el procedimiento de lisis alcalina descrito por Sanbrook, Fritsch y Maniatis en Molecular Cloning, 1989. Se pre-absorbieron 5 µg del ADN extraído de las células, en filtros de nilón (Boehringer) usando el aparato de manchado de punto Biorad. Los filtros se pre-hibridizaron entonces durante 4 horas a 65°C con una solución que contenía 0.5 M de pirofosfato de sodio (NaPi), 1 mM de EDTA, SDS al 7%. La sonda etiquetada con 32P(Alfa) se preparó usando el plásmido pCMVluc de ADN como una plantilla y el estuche Amersham de cebado aleatorio. El filtro se hibridizó en la misma solución amortiguadora de pre-hibridización durante 12 horas a 42 °C usando lxlO6 CPM/ l . El filtro se expuso entonces a 3 lavados de 10 minutos a 65°C en una solución amortiguadora que contenía 40 mM de NaPi, SDS al 1%. El análisis autoradiográfico se llevó a cabo con la ayuda de un generador de imágenes de fósforo que usó pantallas de fósforo activadas por radiación beta que se leen y cuantifican por medio de un sistema fotomultiplicador en conjunto con un programa de análisis de imágenes. La densito etría realizada en el manchado por puntos se dio usando un programa de análisis de imagen IP-LabGel. Pruebas de transfección de plásmidos de ADN. Se llevaron a cabo diversas pruebas de transfección de plásmidos de ADN tanto in vi tro como in vivo . Se usaron tanto DOTAP como DOTMA como lípidos catiónicos de referencia, la capacidad de transfección de los cuales se caracteriza y describe ampliamente por Abkenet y colaboradores, Proc. Nal. Acad. Sci. USA 1993, 90, 6518. En los experimentos in vi vo, se analizan varias relaciones molares diferentes de lípidos catiónicos para plásmidos de ADN, para los propósitos de determinar la actividad de los lípidos catiónicos y las concentraciones respectivas más eficientes para la transferencia de genes. La capacidad de transfección de las diferentes liposomas se evalúa tanto in vi tro como in vi vo usando el transportador del gen de luciferasa contenido en el plásmido pCMVluc, la actividad del cual, en términos de unidades de luminiscencia relativa (RLU) (descrita previamente) hace una cuantificación fácil.
Como una alternativa, la eficiencia de transfección de un número de liposomas catiónicas, se evalúa por medio de análisis densitométrico (generador de imágenes de fósforo) de muestras de ADN extraídas de células transfectadas en filtros de nitrocelulosa (manchado de punto) y se hibridizan con marcadores de plásmido de ADN etiquetados con 32P, como se describe previamente. Pruebas de transfección ip vivo Dependencia de la eficiencia de la transfección in vivo en la relación molar liposoma ST 983:ADN. En este experimento, se evalúa la dependencia de la eficiencia de transfección del hígado, pulmón y corazón en la relación molar liposoma ST 983 ¡plásmido de ADN. Se probaron las siguientes relaciones nmol de liposoma por µg de ADN: 12:1, 24:1, 36:1 y 48:1. Se trataron intravenosamente grupos de 6 ratones Balb/c pesando aproximadamente 20 g con las cantidades arriba mencionadas de complejo liposoma-ADN en volúmenes de 200 µl de PBS y se sacrificaron 24 horas después de la administración del complejo. La actividad de la luciferasa extraída de los tejidos del pulmón, corazón e hígado, revelaron una distribución predominantemente pulmonar de la luciferasa en todas las relaciones molares analizadas. De hecho, aproximadamente el 99% del total de luciferasa extraída de los tres tejidos se localiza en los pulmones. La relación molar liposoma: ADN de 12:1 es la mejor. Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla 3 a continuación. TABLA 3 Eficiencia de la transfección in vivo de ST 983 como un función de la relación molar ST 983:ADN (µg de ADN) Liposoma RLU/mg media de proteina ± s.d. ST 983:ADH hígado pulmón Corazón Relación molar
ST 983 2589 +/- 140 8818442 +/- 449529 28875 +/- 2593 12:1 1310 +/- 385 2257856 +/ - 280480 7091 +/- 249 24:1 1035 +/- 347 301107 +/ - 21503 8351 +/- 477 36:1 1571 + - 156 112747 +/- 5655 5251 +/- 489 48:1 Control 396 +/- 55 458 +/- 45 755 +/- 55 DOTMA 1352 +/- 226 3828742 +/ - 161332 3363 +/- 123 21:1
Dependencia de la eficiencia de transfección in vivo en las diferencias entre preparaciones de liposoma SRT 983.
Se reportan en la Tabla 4, los valores de la actividad de luciferasa, como unidades de luminiscencia relativa (RLU) , extraídos de los pulmones de ratones Balb/c tratados intravenosamente con diferentes preparaciones de liposomas ST 983 a una relación molar liposoma:ADN de 12:1.
Los datos obtenidos, además de demostrar que la liposoma ST 983 es capaz de transportar el plásmido de ADNI in vivo, con relaciones de eficiencia más altas que y/o comparables con aquellas de DOTMA, también muestran un grado de variabilidad entre las diferentes preparaciones de ST 983. Esto puede deberse a un número de características fisicoquímicas tales como el tamaño de las vesículas liposomales, o las proporciones relativas de las vesículas en relación con la estructura unilamelar (SUV) o multilamelar de las diferentes preparaciones ST 983. A decir verdad, los parámetros fisicoquímicos enlistados arriba se han descrito ampliamente como determinantes para realizar una eficiencia óptima de transfección in vi vo e in vi tro por R.I. Mahato y colaboradores, Human Gene Therapy 9. 1998: 2083. TABLA 4 Eficiencia de la transfección in vivo de ST 983 (diferentes preparaciones) Liposoma RLU/puj media de proteina ± s.d. ST 983:AJH Pulmón Relación molar
ST 983/#72 3118235 +/- 184726 12 : 1 ST 983/H73 7285835 +/- 827067 12 :1 ST 983/H4 1022117 +/- 60402 12 :1 Control 1523 +/- 98 DOTMA 3410125 +/- 189520 12 :1 Dependencia de la eficiencia de transfección in vivo en tiempo de pre-incubación del complejo liposoma ST 983-ADN. La Tabla 5 presenta las unidades de luminiscencia relativas extraídas del hígado, pulmón y corazón de ratones tratados intravenosamente con la liposoma ST 983, pre-incubada con plásmido de ADN durante 30 minutos o durante 3 horas antes de la administración. Los animales tratados con ST 983 pre-incubado durante 3 horas con ADN, muestran un incremento de aproximadamente 5 veces en la actividad de luciferasa en el pulmón y el corazón comparado con aquellos tratados con la misma liposoma pre-incubada durante 30 minutos. Estos resultados sugieren que la formación de un complejo estable liposoma-ADN es un fenómeno que depende del tiempo y juega un papel crítico como una determinante de la eficiencia de transfección in vi vo . TABLA 5 Eficiencia de la transfección in vivo de ST 983 como una función del tiempo de pre-incubación 1 i po s oma /ADN Lip o sexma Tiempo Media de proteina LU/mg ± s . d . T 983 :ADH Hígado Pulmón corazón Relación molar
ST 983 30 minutos 352 6 +/ - 874882 + 8118 +/ - 12 : 1 2 60 65917 2 63 3 horas 2497 +/ - 4225656 37100 +/ - 12 : 1
ST 983 682 +/ - 2 1173 1 1853 Transfección de plásmidos de ADN en células HeLa con liposoma ST 772. Las Figuras 1 y 2 muestran la eficiencia de la transfección del plásmido de ADN de la liposoma ST 772 en células HeLa. Para este propósito, se llevó a cabo un análisis densitométrico del ADN extraído de las células transfectadas con ST 272 y con DOTAP como el lípido catiónico de referencia. Los resultados del ensayo de manchado revelan cantidades de plásmido de ADN del mismo orden de magnitud como se obtiene con DOTAP. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la practica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.
Claims (4)
- Reivindicaciones . Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Compuestos de la fórmula (I) (i) caracterizados porque n es un entero desde 1 hasta 3; R es hidrógeno o alcanoilo, recto o ramificado, con
- 2-6 átomos de carbono; Ri y R2> que pueden ser iguales o diferentes, representan una cadena acilo recta saturada o no saturada con
- 3-20 átomos de carbono; y X" es un anión de un ácido farmacéuticamente aceptable . 2. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque R se selecciona del grupo que consiste de acetilo, propionilo, butirilo, valerilo e isovalerilo. 3. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque Ri y R2 se seleccionan del grupo que consiste de hexanoilo, undecanoilo, miristoilo, palmitoilo u oleilo. 4. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque X" se selecciona del grupo que consiste de cloro; bromo; yodo; aspartato; aspartato ácido; citrato; citrato ácido; tartrato; tartrato ácido; fosfato; fosfato ácido; fumarato; fumarato ácido; glicerofosfato; fosfato de glucosa; lactato; maleato; maleato ácido; mucato; oratato; oxalato; oxalato ácido; sulfato; sulfato ácido; tricloroacetato; trifluoroacetato; metano sulfonato; pamoato y pamoato ácido. 5. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de: éster de bromuro de L-carnitina con 2-hidroxiacetil-1, 3-dipalmitoil glicerol; - éster de bromuro de acetil L-carnitina con 2-hidroxiacetil-1, 3-dipalmitoil glicerol; éster de bromuro de propionil L-carnitina con 2-hidroxiacetil-1, 3-dipalmitoil glicerol; éster de bromuro de isobutiril L-carnitina con 2-hidroxiacetil-1, 3-dipalmitoil glicerol; éster de bromuro de isovaleril L-carnitina con 2-hidroxiacetil-1, 3-dipalmitoil glicerol; éster de bromuro de L-carnitina con 1, 3-dihexanoil-2-hidroxiacetil glicerol; - éster de bromuro de acetil L-carnitina con 1,3-dihexanoi1-2-hidroxiacetil glicerol; éster de bromuro de propionil L-carnitina con 1-3-dihexanoil-2-hidroxiacetil glicerol . 6. El uso de un compuesto de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-5, para la preparación de liposomas. 7. Una lipososma, caracterizada porque comprende un compuesto de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-5. 8. La liposoma de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque, además, contienen lípidos auxiliares. 9. La liposoma de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque el lípido auxiliar se selecciona del grupo que consiste de colesterol, 1-palmitoil-2-oleoil fosfatidil colina o dioleil fosfatidil colina. 10. El uso de una liposoma de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 7-9, para la L preparación de una composición útil para el transporte de compuestos farmacológicamente activos. 11. El uso de conformidad con la reivindicación 10, en el cual el compuesto farmacológicamente activo es un plásmido o un polinucleótido que se presenta naturalmente o modificado. 12. El uso de conformidad con la reivindicación 11, en el cual el plásmido o polinucleótido es útil en la terapia del gen. 13. El uso de conformidad con la reivindicación 11, en el cual el plásmido o polinucleótido codifica para un péptido o proteína útil como una vacuna. 14. El uso de conformidad con la reivindicación 10, en el cual el compuesto activo es un medicamento. 15. El uso de conformidad con la reivindicación 14, en el cual el medicamento se selecciona del grupo que consiste de agentes anti-cáncer, anti-angiogénicos, antivirales, anti-bacteriales anti-hongos, anti-protozoanos, compuestos activos en el sistema cardiovascular, o péptidos inmunogénicos. 16. El uso de conformidad con la reivindicación 15, en el cual el medicamento es un agente anti-cáncer o anti-angiogénico . 17. El uso de conformidad con la reivindicación 16, en el cual el agente anti-cáncer se selecciona del grupo que consiste de taxol o un derivado de camptotecina. 18. El uso de conformidad con la reivindicación 17, en el cual el derivado de camptotecina se selecciona del grupo que consiste de: -carbonitrilcamptotecina; 7-benciloxiiminometilcamptotecina, y 7-butoxiimino?t?etilcamptotecina . 19. El uso de una liposoma de conformidad con las reivindicaciones 7-9, para la preparación de una composición cosmética. 20. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una liposoma de conformidad con las reivindicaciones 7, 8, ó 9. 21. La composición de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque la liposoma contiene un compuestos farmacológicamente activo. 22. La composición de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque el compuesto activo es un plásmido o un polinucleótido que se presenta naturalmente o modificado. 23. La composición de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque el plásmido o polinucleótido es útil en la terapia genética. 24. La composición de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque el plásmido o polinucleótido codifica para un péptido o proteína útil como una vacuna. 25. Una composición cosmética, caracterizada porque comprende una liposoma de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 7-9. 26. La composición de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque la liposoma contiene una sustancia con actividad cosmética. 27. La composición de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque el compuesto se selecciona del grupo que consiste de agentes anti-cáncer, anti-angiogénicos, anti-virales, anti-bacteriales anti-hongos, anti-protozoanos, compuestos activos en el sistema cardiovascular, o péptidos inmunogénicos. 28. La composición de conformidad con las reivindicaciones 20-27, caracterizada porque se administra oralmente, parenteralmente, intravenosamente, intramuscularmente, subcutáneamente, transdermalmente, o en forma de un atomizado nasal o para la boca. 29. El uso de la liposoma, que comprende un compuesto de la fórmula (II) (p) donde: R3 es una cadena acilo, recta o ramificada, saturada o no saturada, con
- 4-26 átomos de carbono; R4 es una cadena alquilo recta o ramificada, saturada o no saturada, con 4-26 átomos de carbono; X" es el anión de un ácido farmacológicamente aceptable para el transporte de medicamentos o de sustancias con actividad cosmética. 30. El uso de conformidad con la reivindicación 29, en el cual R3 se selecciona preferiblemente del grupo que consiste de nonanoilo, dodecanoilo, miristoilo, palmitoilo, estearoilo, u oleoilo. 31. El uso de conformidad con la reivindicación 29, en el cual R4 se selecciona preferiblemente del grupo que consiste de nonilo, undecílo, tetradecilo, hexadecilo u oleilo . 32. El uso de conformidad con la reivindicación 30, en el cual X" se selecciona del grupo que consiste de cloro; bromo; yodo; aspartato; aspartato ácido; citrato; citrato ácido; tartrato; tartrato ácido; fosfato; fosfato ácido; fumarato; fumarato ácido; glicerofosfato; fosfato de glucosa; lactato; maleato; maleato ácido; mucato; oratato; oxalato; oxalato ácido; sulfato; sulfato ácido; tricloroacetato; trifluoroacetato; metano sulfonato; pamoato y pamoato ácido. 33. El uso de conformidad con las reivindicaciones 29-32, en el cual el compuesto se selecciona del grupo que consiste de - Éster undecilo del cloruro de palmitoil L-carnitina; Éster undecilo del cloruro de estearoil L-carnitina; Éster tetradecilo del cloruro de estearoil L-carnitina; Éster tetradecilo del cloruro de palmitoil L-carnitina; Éster tetradecilo del cloruro de miristoil L-carnitina; Éster hexadecil de bromuro de palmitoil L-carnitina; Éster oleil del cloruro de oleil L-carnitina. 34. El uso de conformidad con la reivindicación 29, en el cual el medicamento se selecciona del grupo que consiste de agentes anti-cáncer, anti-angiogénicos, antivirales, anti-bacteriales anti-hongos, anti-protozoanos, compuestos activos en el sistema cardiovascular, o péptidos inmunogénicos. 35. El uso de conformidad con la reivindicación 34, en el cual el medicamento es un agente anti-cáncer o anti-angiogénico . 36. El uso de conformidad con la reivindicación 35, en el cual el agente anti-cáncer se selecciona del grupo que consiste de taxol o un derivado de camptotecina. 37. El uso de conformidad con la reivindicación 36, en el cual el derivado de camptotecina se selecciona del grupo que consiste de - 7-benciloxiiminometilcamptotecina ó 7-butoxiiminometilcamptotecina . 38. El uso de conformidad con la reivindicación 29, en el cual la liposoma contienen adicionalmente lípidos auxiliares . 39. El uso de conformidad con la reivindicación 38, en el cual el lípido auxiliar se selecciona del grupo que consiste de colesterol, l-palmitoil-2-oleoil fosfatidil colina o doileil fosfatidil colína. 40. Una composición, caracterizada porque comprende una liposoma de conformidad con la reivindicación 29, para el transporte de medicamento o de una sustancia con actividad cosmética. 41. La composición de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada porque el medicamento se selecciona del grupo que consiste de agentes anti-cáncer, i . .. .. anti-angiogénicos, anti-virales, anti-bacteriales antihongos, anti-protozoanos, compuestos activos en el sistema cardiovascular, o péptidos inmunogénicos. 42. La composición de conformidad con las reivindicaciones 40-41, caracterizada porque puede administrarse oralmente, parenteralmente, intravenosamente, intramuscularmente, subcutáneamente, transdermalmente, o en forma de un atomizado nasal o para la boca. 43. El uso de una liposoma que comprende un compuesto de la fórmula (III): donde : R5 es una cadena acilo recta o ramificada, saturada o no saturada, con 4-26 átomos de carbono; R es una cadena alquilo recta o ramificada, saturada o no saturada, con 4-26 átomos de carbono; y X" es el anión de un ácido farmacológicamente aceptable; con la condición de que: cuando R5 es estearoilo, R no es estearilo, cuando R5 es oleoilo, R6 no es estearilo, cuando R5 es palmitoilo, Rß no es palmitilo, cuando R5 es miristoilo, R no es miristilo, cuando R5 es lauroilo, R6 no es laurilo, cuando R5 es oleoilo, R6 no es oleilo para el transporte de plásmidos o polinucleótidos que se presentan naturalmente o modificados. 44. El uso de conformidad con la reivindicación 43, en el cual R5 preferiblemente se selecciona del grupo que consiste de nonanoilo, dodecanoilo, miristoilo, palmitoilo, estearoilo u oleoilo. 45. El uso de conformidad con la reivindicación 43, en el cual R6 se selecciona preferiblemente del grupo que consiste de nonilo, undecilo, tetradecilo, hexadecilo, u oleilo. 46. El uso de conformidad con la reivindicación 43, en el cual X" se selecciona del grupo que consiste de cloro; bromo; yodo; aspartato; aspartato ácido; citrato; citrato ácido; tartrato; tartrato ácido; fosfato; fosfato ácido; fumarato; fumarato ácido; glicerofosfato; fosfato de glucosa; lactato; maleato; maleato ácido; ucato; oratato; oxalato; oxalato ácido; sulfato; sulfato ácido; tricloroacetato; trifluoroacetato; metano sulfonato; pamoato y pamoato ácido. 47. El uso de conformidad con las reivindicaciones 43-46, en el cual el compuesto se selecciona del grupo que consiste de: Éster undecilo del cloruro de palmitoil L-carnitina; Éster undecilo del cloruro de estearoil L-carnitina; Éster tetradecilo del cloruro de estearoil L-carnitina; - Éster tetradecilo del cloruro de palmitoil L-carnitina. 48. El uso de conformidad con la reivindicación 43, en el cual el plásmido o polinucleótido codifican para un péptido o proteína útil como una vacuna. 49. El uso de conformidad con la reivindicación 43, en el cual la liposoma contiene adicionalmente lípidos auxiliares . 50. El uso de conformidad con la reivindicación 49, en el cual el lípido auxiliar se selecciona del grupo que consiste de colesterol, l-palmitoil-2-oleoil fosfatidil colina o doileil fosfatidil colina. 51. Una composición, caracterizada porque comprende una liposoma de conformidad con la reivindicación 43, para el transporte de un plásmido o polinucleótido que se presenta naturalmente o modificado. 52. La composición de conformidad con la reivindicación 51, caracterizada porque el polinucleótido o plásmido codifican para un péptido o proteína útil como una vacuna. 53. La composición de conformidad con las reivindicaciones 51-52, caracterizada porque puede administrarse oralmente, parenteralmente, intravenosamente, intramuscularmente, subcutáneamente, transdermalmente, o en forma de atomizados nasales o para la boca. ESTERES DE L-CARNITINA O ALCANOIL L-CARNITINAS Y SU USO COMO LIPIDOS CATIONICOS APROPIADOS PARA FAVORECER LA ENTREGA INTRACELULAR DE COMPUESTOS FAMACOLOGICAMENTE ACTIVOS Resumen de la Invención. Se describen esteres de L-carnitina y alcanoil L-carnitinas que pueden usarse como lípidos catiónicos para la entrega intracelular de compuestos farmacológicamente activos. También se describen nuevos esteres de L-carnitina y alcanoil L-carnitinas de la fórmula (I) (I) en donde los grupos R son como se define en la descripción.
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