CZ302628B6 - Estery L-karnitinu nebo alkanoyl L-karnitinu vhodné jako kationické lipidy k prísunu farmakologicky úcinných sloucenin do bunky - Google Patents

Abstract

Estery L-karnitinu nebo alkanoyl L-karnitinu obecného vzorce I, liposomy s jejich obsahem, použití liposomu k príprave prípravku pro transport farmakologicky úcinných sloucenin, jako jsou prirozene se vyskytující nebo upravený plasmid nebo polynukleotid, které jsou výhodne vhodné pro genovou terapii nebo kódují peptid ci protein použitelný jako vakcína, nebo lécivo, kterým muže být antiangiogenní nebo protinádorová látka jako jsou napr. taxolové nebo kamptothecinové deriváty, farmaceutický a kosmetický prípravek s obsahem liposomu.

Description

Oblast techniky

Zde popsaný vynález se týká skupiny nových esterů L-karnitinu a acyl-L-karnitinů a jejich využití jako kationických lipidů vhodných k podpore přísunu farmakologicky účinných sloučenin do buňky a usnadňujících jejich transport membránou nebo podporujících jejich interakci se specifickými místy membrány (receptory).

Zde popsaný vynález se týká dalších známých esterů L-karnitinu a acyl-L-karnitinů vhodných ke stejným účelům jako výše zmíněné nové sloučeniny.

Dosavadní stav techniky „Přísunem do buňky“ se míní buněčný přenos (transfekce) polynukleotidy nebo plasmidy přirozeného původu nebo upravenými a vybavenými terapeutickými účinky (přísun genu) nebo zavedení léčiv nebo imunogenních peptidů do buněk.

Mnoho farmakologicky účinných látek jako například polypeptidy a proteiny nebo léčiva obecně musejí proniknout do buněk, aby mohly uplatnit své působení pri ovlivňování funkcí buněk na subcelu lární nebo molekulární úrovni. Pro tyto látky vytváří buněčná membrána selektivně nepropustnou bariéru. Buněčná membrána má ve skutečnosti ochrannou funkci, brání vstupu látkám potenciálně toxickým, ale také průchodu sloučenin majících terapeutické účinky. Komplikované složení buněčné membrány sestává z fosfolipidů, glykolipidů a proteinů; jejich funkce je ovlivněna cytoplasmatickými složkami jako je Ca²⁺, a další ionty, ATP, mikrovlákny, mikrotubuly, enzymy a proteiny, které váží Ca²⁺. Interakce mezi strukturními a cytoplasmatickými složkami buněk a odezvami na vnější podněty jsou odpovědné za selektivitu vykazovanou mnohými různými buněčnými typy i mezi nimi navzájem. Membránovému bariérovému efektu je možno předejít kombinováním látek do komplexů s lipidovými přípravky, které znovu vytvářejí směsi přirozeně se vyskytujících membránových lipidů. Tyto lipidy jsou schopné vazby na membrány a uvolnění látek s nimi spojenými do buněk. Lípidové komplexy jsou schopné nejen umožnit vnitrobuněčný přenos fúzí s membránami, ale mohou i snižovat odpuzující sílu náboje mezi membránou a molekulou, která do buňky musí vnikat. Amfipatické lipidy jako například membránové fosfolipidy vytvářejí ve vodných systémech lipidové ves i kuly nebo liposomy.

Liposomy jsou vesikuly, ve kterých je určitý objem vody zcela uzavřen jednou nebo více membránami složenými z lipídových molekul, obvykle fosfolipidů. Fosfolipidy, které sestávají zhydrofilní hlavy a páru uhlíkových řetězců (hydrofobní chvost) jsou hlavními složkami biologických membrán. Ve vodném roztoku se hydrofobní řetězce autoasociují za vyloučení vody, zatímco hydrofilní hlavy interagují s médiem vytvářejíce tak spontánně kolonie vesikul o různém průměru. Obecně jsou lipidy zwitterionové, neutrální nebo anionické. Tyto vesikuly mohou být využity jako nosiče léčiv, malých molekul, proteinů, nukleotidů a plasmidů.

Během posledních let byly kationické liposomy — skupina pozitivně nabitých vesikulů připravených ze syntetických lipidů - rozsáhle využívány k přenosu genetického materiálu do buněk. Negativně nabitá DNA může interagovat s pozitivními náboji kationických lipidů a vytvářet tak stabilní DNA-liposomový komplex. Jednoduchost a univerzálnost této techniky udělal z liposomů důležitého přenašeče pro přísun genů při genové terapii u lidských jedinců. Většina vektorů běžně používaných v genové terapii a schválených NIH Recombinant Advisory Committee obsahuje virové a syntetické systémy.

- 1 CZ 302628 B6

Mezi virové infekce patří řada komplexních mechanismů schopných napadat specifickou buňku a přinášet do jejího jádra DNA. Princip využívání virových vektorů v genové terapii spočívá v možnosti nahradit geny virů takovými geny, které kódují terapeutické funkce, aniž by se eliminovala schopnost virové částice infikovat buňky. Virová terapie musí být omezena na takové virové prvky, které jsou imunogenní, cytopatické a rekombinační.

Velká naděje v genové terapii se vkládá do využívání kationických lipidů. Tyto vektory mají v porovnání s vektory virového původu velký potenciál, protože jsou mnohem bezpečnější, méně toxické a jsou také schopny inkorporovat geny ve větším měřítku. V porovnání s vektory biolo10 gického typu však mají malý výtěžek transkripce nitrobuněčného genu. Proto je nutné vzít v úvahu, že využití takových přenosových systémů je v počáteční fázi výzkumu. Kationické lipidy hrají důležitou úlohu při tvorbě komplexu DNA-lipid, při interakcí buňky s komplexem, při fúzi s membránou, při uvolňování DNA uvnitř buňky a při transkripci.

Existují již důležité příklady aplikací kationických líposomů in vivo. První klinická zkouška genové terapie při léčbě melanomu byla provedena zaváděním expresního vektoru obsahujícího lidský gen HLA-B7 zakomplexovaný na liposom. Další důležitá aplikace se týká léčby pulmonární eystické fibrózy podáváním expresního vektoru SV-40C-FTR zakomplexovaného na liposom pulmonární cestou nebo pomocí nosního spreje. Mezi další klinické zkoušky, které zo pokračují, patří využití líposomů při genové terapii nádoru.

Ve struktuře kationických lipidů jsou obvykle identifikovány čtyři stavební prvky: pozitivně nabitá kationická hlava (head), vložka (spacer), kotevní lipid a spojovací vazba.

Kationická hlava je zodpovědná 2a interakci mezi kationickými liposomy a DNA a mezi komplexem DNA-liposom a buněčnou membránou a dalšími složkami buňky. Sestává z mono nebo polykationických skupin (v závislosti na počtu nábojů), které mohou být různě substituovány.

Vložka je ta část molekuly, která odděluje kationickou hlavu od hydrofobního chvostu a je zod30 povědná za zajištění optimálního kontaktu mezi kationickou hlavou a negativními náboji fosfátů. DNA.

Kotevní lipid je nepolární uhlovodíkovou částí molekuly a určuje fyzikální vlastnosti lipidové dvojvrstvy jako je tuhost a rychlost výměny s membránovými lipidy.

„Spojovací vazbou“ je míněna vazby mezi uhlovodíkovými řetězci a zbytkem molekuly. Tato vazba určuje chemickou stabilitu a biologickou degradovatelnost kationických lipidů.

V posledních letech se neustále zvyšuje používání líposomů v kosmetické oblasti. Úspěch liposoi(f mů v této oblasti padá na vrub těchto sloučenin díky tomu, že jsou pokožkou velmi dobře tolerovány. Používají se jak vehikuly účinných složek, tak jako sloučeniny pomáhající při jejich absorpci.

Vědecká a patentová literatura je bohatá na odkazy na preparáty a využívání líposomů; přesto existuje jen velmi málo odkazů popisujících využívání derivátů kamitinů vhodných pro přívod genů, zatímco pro přívod léčiv nejsou k dispozici žádné dokumenty zabývající se známými technologiemi přípravy sloučenin vzdáleně připomínající sloučeniny popisované v tomto vynálezu.

Patentová přihláška EP 0 279 887 popisuje využití derivátů karnitinu, tj fosfatidylkarnitinu,

5o případně ve směsi s dalšími fosfolipidy a lipidy (cholesterol, fosfatidylcholin, fosfatidyl serin) pro přípravu líposomů.

V uvedeném příkladu týkajícího se přípravy líposomů se vytvářejí liposomy fosfatidylkarnitinu, do kterých se inkorporuje propranolol - léčivo se známým účinkem jako antihypertensivní, anti55 anginosní a antiarytmícká látka. Kamitinový derivát se zde používá pro zřejmé myokardiální působení kamitinu, Toto působení zabraňuje líposomům, aby byly spíše metabolizovány játry, než by dosáhly požadovaného cílového místa.

Přítomnost fosfatidylkamitinu také umožňuje podávat liposomy orálně, protože jsou odolné 5 intestinálním lipázám.

V J, Med. Chem., 41 (13), 2207 až 15, 18. červen 1998 je popsán velký počet esterů L-kamitinu vhodných k přísunu genů, avšak nejsou popsány nebo navrženy jako vhodné látky pro přísun léčiv.

WO 96/39193 popisuje nové léčivé látky cílené pro vstup do mitochondrií přes translokázový systém karnitin-acylkamitin, avšak nenavrhuje je jako vhodné látky k přípravě liposomů.

EP 559 625 Bl popisuje velký počet esterů L-kamitinu a acyl-L-karnitinů se selektivními účin15 ky na svalové uvolnění gastrointestinálního traktu.

V posledních letech molekulární biologové identifikovali mnoho defektů na chromozomální úrovni, které způsobují dědičná onemocnění lidských jedinců.

Důležitá oblast moderní medicíny se týká léčby těchto genetických dědičných onemocnění založených na využívání protokolů genové terapie.

Jak již bylo zmíněno, kationické liposomy jsou ve velké míře využívány pro intracelulámí přísun farmakologicky účinných sloučenin usnadňujících transmembránový transport nebo umožňují25 cích jejich interakci se specifickými místy buněčné membrány (receptory).

Tyto vektory mají v porovnání s vektoiy biologického původu velké možnosti, protože jsou mnohem bezpečnější, méně toxické a jsou také ve větší míře schopny inkorporace genů. V porovnání s vektory biologického typu však mají nízký výtěžek intracelulámí genové transkripce.

Transfer genů zprostředkovaný běžnými kationickými lipidy navíc vyžaduje, aby byl plasmid DNA a kationické lipidy uchovávány odděleně, a aby bylo jejich míšení uskutečňováno bezprostředně před transferem genu.

Pokusy o stabilizaci těchto polynukleotidových komplexů dosud postrádaly povzbudivých výsledků; ve skutečnosti zůstávají stabilní pouze po krátkou dobu.

V oblasti genové terapie nebo přísunu genu a léčiva si tudíž silně uvědomujeme potřebu stabilních, reprodukováte 1 ných a lokálně specifických systémů, které jsou účinné také i po nějakém čase.

Podstata vynálezu

Nyní bylo zjištěno, že do skupiny kationických lipidů významně účinných při podporování intracelulámího přísunu farmakologicky účinných sloučenin náleží nové estery L-kamitinu aacyl-Lkamitinů.

Tyto nové sloučeniny jsou stabilní a vysoce selektivní, protože jsou při dosahování cílového orgánu lokálně specifické.

Tyto charakteristiky je určují jako zvláště vhodné pro transport účinných sloučenin přímo na místo, kde mohou projevit svůj farmakologický účinek.

Sloučeniny podle zde popsaného vynálezu jsou sloučeninami obecného vzorce (I):

- j CZ 302628 B6

O f-t,C — N

H// *

) I

O

O >J o, R2

O (i).

kde:

je celé číslo od 1 do 3;

R je vodík nebo alkanoyl, přímý nebo rozvětvený, se 2 až 6 uhlíkovými atomy;

Ri a R₂, které mohou být stejné nebo různé představují nasycený nebo nenasycený přímý acylový řetězec se 3 až 30 uhlíkovými atomy; a

X jc aniont farmakologicky přijatelné kyseliny.

Příklady R jsou acetyl, propionyl, butyryl, valeryl a isovaleryl.

i? Příklady Ri a R₂ jsou hexanoyl, undekanoyl, myristoyl, palmitoyl nebo oleoyl.

Sloučeninami, kterým se podle vynálezu dává přednost jsou:

• ester L-kamitinbromidu s 2-hydroxyacetyl-l ,3-dipalmítoylglycerolem (ST 770);

· ester acetyl-L-karnitinbromidu s 2-hydroxyacetyl-l,3- dipalmitoylglyeerolern (ST 771);

• ester propionyl-L-karnitinbromidu s 2-hydroxyacetyl-l,3-dipalmitoylglycerolem (ST 772);

• ester isobutyryl-L-karnitinbromidu s 2-hydroxyacetyl-l,3-dipalmitoylglycerolem (ST 773);

• ester isovaleryl-L-karnitinbromidu s 2-hydroxyacetyl-l,3-dipalmitoylglycerolem (ST 774);

• ester L-karnitinbromidu s l,3-dihexanoyl-2-hydroxyacetylglycerolem (ST 810);

• ester acetyl-L-karnitinbromidu s l,3-dihexanoyl-2-hydroxyacetylglycerolem (ST 809);

• ester propionyl-L-karnitinbromidu s l,3-dihexanoyl-2-hydroxyacetylglycerolem (ST 808).

An iontem farmakologicky přijatelné kyseliny se míní jakýkoliv aniont kyseliny, který nedává vznik nežádoucím toxickým nebo vedlejším jevům.

Tyto kyseliny jsou farmakologům a odborníkům ve farmaceutické technologii dobře známy.

Příklady těchto aniontů, i když se tím jejich výčet neomezuje, jsou: chlorid, bromid, jodid, aspartát, kyselý aspartát, citrát, kyselý citrát, vinan, kyselý vinan, fosforečnan, kyselý fosforečnan, fumarát, kyselý fumarát, glycerolfosfát, glukofosfát, mléčnan, maleinát, kyselý maleinát, mukát (ester kyseliny slizové), orotát, šťavelan, kyselý šťavelan, síran, kyselý síran, trich íoracetát, trifluoracetát, methansulfonát, palmitan, kyselý palmitan. I pro takto provedený výběr uvedených anionů platí podmínka farmakologické snášenlivosti, jak též uvedeno výše.

Sloučeniny obecného vzorce I ve formě lipidů jsou látky vhodné k přísunu přírodně se vyskytujících či modifikovaných plasmidů nebo nukleotidů vhodných pro genovou terapii nebo které kódují peptidy či proteiny vhodné jako vakciny a obecně k přísunu léčiv jako například protíná-4CZ 302628 B6 dorových léčiv, protiv i rových látek, protibakteriálních látek, fungicidů, antiprotozanů, léčiv vhodných při terapii onemocnění kardiovaskulárního systému nebo imunogenních peptidů a dalších léčiv vhodných pro terapii.

? Liposomy obsahující sloučeninu obecného vzorce I se připravují běžnými technologiemi odborníkům dobře známými; viz například Τ. M. Allen, Drugs, 56, 747 až 56, (1998). Liposomy mohou být podle předloženého vynálezu připraveny také za použití jiných složek odborníkům pracujícím v liposomové technologii dobře známých. U jednoho z řešení podle předloženého vynálezu mohou liposomy obsahovat pomocné lipidy, což je termín odborníkům tohoto oboru známý, io Příklady pomocných lipidů jsou cholesterol, l-palmitoyl-2-oteoylfosfatidylcholin nebo dioleoylfosfatidylcholin.

Liposomy podle předloženého vynálezu se vhodně prezentují jako přípravky. U řešení týkajícího se přísunu farmakologicky účinné sloučeniny se přípravkem rozumí takový farmaceutický přípravek obsahující případně farmaceuticky přijatelné vehikuly a/nebo excipienty.

Sloučeniny obecného vzorce I ve formě liposomů mohou být také vhodné pro přípravu kosmetických přípravků jak obsahujících liposom per se jako kosmeticky účinnou látku, tak pro přísun látek s kosmetickými účinky jako jsou například hydratační látky, nutrienty, látky k čištění pleti, látky proti vráskám, látky proti celulitidě a látky působící na strie (anti-stretch-mark).

Liposomy obsahující sloučeniny obecného vzorce I mohou být podávány orálně, parenterálně, intravenózně, intramuskulámě, subkutánně, transdermálně nebo ve formě nosních nebo ústních sprejů.

Vynález zde popsaný se také týká přídavných kationických lipidů obecného vzorce II známých již při různém jiném využívání (EP 559 625 zmiňovaný výše).

Podle předloženého vynálezu jsou sloučeninami obecného vzorce II estery L-karnítínu vhodné 3o pro přípravu liposomů majících výrazné účinky na přísun léčiv a charakterizovaných stabilitou a selektivitou při dosahování cílového orgánu srovnatelnou se sloučeninami obecného vzorce I popsanými výše. Stejné výhodné vlastnosti jsou aplikovatelné v případě kosmetiky.

Tyto sloučeniny mají obecný vzorec II:

h₃c _v

HC—N

Z

H,C

R3 (H), kde:

R.3 je nasycený nebo nenasycený přímý nebo rozvětvený acylový řetězec se 4 až 26 uhlíkovými atomy;

R₄ je nasycený nebo nenasycený přímý nebo rozvětvený alkylový řetězec se 4 až 26 uhlíkovými atomy; a

X je aniont farmakologicky přijatelné kyseliny.

-5 CZ 302628 B6

Příklady R₃, kterým se dává přednost jsou nonanoyl, dodekanoyl, myristoyl, palmitoyl, stearoyl nebo oleoyl.

Příklady R₄, kterým se dává přednost jsou nonyl, undecyl, tetradecyl, hexadeeyl nebo oleyl.

Příklady specifických sloučenin obecného vzorce 11 podle zde popsaného vynálezu jsou:

• undecyl ester palmitoyl-L-karnitinchloridu (ST 983);

• undecyl ester stearoyl-L-karnitinchloridu (ST 1055); io · tetradecyl ester stearoyl-L-karnitinchloridu (ST 1351);

• tetradecyl ester palmitoyl-L-karnitinchloridu (ST 1379);

• tetradecyl ester myristoyl-L-karnitinchloridu (ST 1380);

• hexadeeyl ester palmitoyl-L-karnitinbromidu (ST 1390);

• oleyl ester oleyl- L-karnitinchloridu (ST 1392).

Mnoho sloučenin obecného vzorce II, jmenovitě ST 1380, ST 1390 a ST 1392 jsou známy a popsány ve výše citovaném J. Med. Chem., 41, (13), 2207 až 15, (18. červen 1998) jako látky vhodné k přípravě liposomů pro přenos do buněk s terapeutickými účinky, avšak nebyly nikdy popsány jako látky vhodné k přípravě liposomů pro přísun léčiv.

Odborníci s průměrnou zkušeností v oblasti farmaceutických přípravků se obávají obtíží spojených s přípravou komplexů liposomů s léčivem; ve skutečnosti není možné předem určit, zda se může liposom vhodný pro přísun genu použít i k přísunu léčiva, vzhledem k mnoha problémům, kterým se musí předejít při získávání liposomů schopného zakomplexovat léčivo, které se má přivést cíleně k orgánu, který jeho léčivou schopnost vyžaduje.

Sloučeniny obecného vzorce II ve formě liposomů jsou vhodnými látkami k přísunu takových léčiv jako například látek protinádorových, antiangiogenních, proti virových, proti bakteriálních, fungicidů, antiprotozoanů nebo léčiv vhodných k terapii kardiovaskulárních onemocnění nebo

3o tmunogenních peptidů a dalších léčiv vhodných v terapii.

Sloučeniny obecného vzorce II ve formě liposomů jsou také vhodné pro přípravu kosmetických přípravků jako jsou kosmetické látky per se nebo pro přísun látek s kosmetickými účinky jako takovými, například hydratačních látek, nutrientů, pleťových čisticích prostředků a látek proti vráskám, látkám proti celulitidě a látky působící na strie (anti-stretch-mark).

Řečené liposomy mohou případně obsahovat pomocné lipidy jako v případě liposomů obsahujících sloučeniny obecného vzorce II.

4o Liposomy obsahující sloučeniny obecného vzorce II mohou být podávány orálně nebo parenterálně, intravenózně, intramuskulámě, subkutánně, transdermálně nebo ve formě nosních nebo ústních sprejů.

Vynález zde popsaný se také týká přídavných kationických lipidů obecného vzorce III známých již z různého jiného využívání (EP 559 625 zmiňovaný výše).

Podle předloženého vynálezu jsou sloučeninami obecného vzorce III estery L-karnitinu vhodné při přípravě liposomů majících silné účinky podporující přísun léčiv a charakterizovaných stabilitou a selektivitou při dosahování cílového orgánu srovnatelně se sloučeninami obecného vzorce 1 popsanými výše.

Tyto sloučeniny mají obecný vzorec III:

-6 CZ 302628 B6

(lil).

kde:

R₅ je nasycený nebo nenasycený přímý nebo rozvětvený acy lový řetězec se 4 až 26 uhlíkovými 5 atomy;

R_b je nasycený nebo nenasycený přímý nebo rozvětvený alkylový řetězec se 4 až 26 uhlíkovými atomy; a io X“ je aniont farmakologicky přijatelné kyseliny; s výjimkou, že:

pokud je R5 stearoyl, není R₆ stearyl, pokud je R_s oleoyl, není Ró stearyl, pokud je R₅ palmitoyl, není R« palmityl, pokud je R₅ myristoyl, není R₆ myristyl, pokud je R₅ lauroyl, není Rft lauryl, pokud je R5 oleoyl, není Rft oleyl.

Nenárokované sloučeniny ve formě liposomů jsou uvedeny v J. Med. Chem., 41 2207 až 2215, (1988) výhradně pro přísun genu.

Příklady R5, kterým se dává přednost jsou nonanoyl, dodekanoyl, myristoyl, palmitoyl, stearoyl 25 nebo oleoyl.

Příklady R₆, kterým se dává přednost jsou nonyl, undecyl, tetradecyl, hexadecyl nebo oleyl.

Příklady sloučenin obecného vzorce III, kterým se podle zde popsaného vynálezu dává přednost 30 jsou:

• undecyl ester palmitoyl-L-kamitinchloridu (ST 983);

• undecyl ester stearoyl-L-kamitinchloridu (ST 1055);

• tetradecyl ester stearoyl-L-kamitinchloridu (ST 1351);

· tetradecyl ester palmitoyl-L-kamitinchloridu (ST 1379),

Sloučeniny obecného vzorce III jsou látkami vhodnými k přísunu přirozeně se vyskytujících nebo upravených plasmidů nebo nukleotidů vhodných pro genovou terapii nebo které kódují peptidy nebo proteiny vhodné jako vakcína.

Sloučeniny obecného vzorce III mohou být podávány orálně nebo parenterálně, intravenózně, intramuskulámě, subkutánně, transdermálně nebo ve formě nosních nebo ústních sprejů.

-7CZ 302628 B6

Postup přípravy sloučenin obecného vzorce I podle vynálezu je uveden v následujících reakčních schématech, čímž se míní, že tato schémata platí pro celý obecný vzorec I. Odborníci mohou snadno získat všechny skupiny zmíněné jako jsou R, R, a R₂, protože všechna nezbytná činidla jsou komerčně dostupná nebo uvedená v literatuře a reakční podmínky jsou obecně aplikovatelné na celý rozsah předloženého vynálezu v jakékoliv úpravě a v případě potřeby jich lze docílit s běžnými obecnými znalostmi.

Schéma I

CH2OH CH₂OCO(CH₂)hCH₃

CO + 2 CICO-(CH:)i₄CH₃ --► OO (1) a)

CH?0H CH₂OCO(CH₂)₁₄CH₃

CH₂OCO(CH₂)_t4CH₃

C=O + NaBH₄

CHzOCO(CH₂)₁₄CH₃

CH₂OCO(CH₂)₁₄CH₃

I

CH-OH (2) b) > |

CH₂OCO{CH₂)₁₄CH₃

CH₂OCO(CH₂)i₄CH₃

CH-OH + ClOCCH₂Br

CH₂OCO{CH₂)₁₄CH₃

CH₂OCO(CH₂)₁₄CH₃ * CH-OCOCH₂Br (3)c)

CH₂OCO{CH₂}₁₄CH₃

CH₂OCO{CH₂)_t4CH₃

CH-OCOCH₂Br

CH₂OCO{CH₂)₁₄CH₃

CH₂OCO(CH₂)₁₄CH₃ i

-> CHOCO

CH₂OCO(CH₂)₁₄CH₃

ίο

S odkazem na výše uvedené reakční schéma 1 je příprava sloučenin obecného vzorce I podle vynálezu popsána dále.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1: znázorňuje účinnost přenosu plasmidu DNA liposomem ST 772 v Hela buňkách. Obr. 2: znázorňuje účinnost přenosu plasmidu DNA liposomem ST 772 v Hela buňkách. Obr. 3: znázorňuje hladinu akumulace CPT 184.

-8CZ 302628 B6

Příklady provedení vynálezu s Příklad 1

Příprava esteru propionyl-L-karnitinbromidu s 2-hydroxyacetyl-1,3-dipalniitoylglycerolem (ST 772) i o a) Příprava 1,3-d i hydroxy propan-2-on-1,3-dipalmitátu (1)

D i hydroxy aceton (7 g, 0,078 mol) byl při 0 °C (vnější teplota) rozpuštěn ve 300 ml bezvodého chloroformu za průtoku suchého dusíku.

K takto získanému roztoku byl po kapkách přidáván palmitoylchlorid (44 g; 0,16 mol) a bezvodý pyridin (15 ml).

Výsledná směs, jejíž teplota se ponechala vyrovnat s okolní teplotou, byla při ní za míchání udržována po dobu 24 hodin.

Potom byla směs extrahována v takovémto pořadí: se 300 ml vodného roztoku 0,5% kyseliny chlorovodíkového, se 300 ml vodného roztoku 5% hydrogenuhličitanu sodného a konečně se 300 ml vody.

Oddělená organická fáze byla vysušena nad bezvodým síranem sodným, zfiltrována celu losovým filtrem, zkoncentrována k suchu a byl získán surový produkt 1.

Čistý produkt byl získán krystalizací z 500 ml ethylalkoholu.

Bylo získáno 30,4 g produktu 1.

Výtěžek: 73 %.

tt. = 80až81 °C.

H'NMR (CDCb): 0,9 (6H, t, CH, CHr-); 1,3 (48H, m, (CH₂)„.₂₄); 1,55 (4H, m, OCOCH,CH,-): 2,4 (4H, t, —OCOCH,-); 4,7 (4H, s, -OCCHj-).

b) Příprava l,2,3-tnhydroxypropan-l,3”dipalmÍtátu(2)

K produktu I (5 g, 9 mmol) rozpuštěnému v tetrahydrofuranu (125 ml) a toluenu (25 ml) byla pomalu za míchání přidávána voda (7,5 ml).

Teplota získané mléčné bílé suspenze byla upravena na 5 °C (vnější teplota) a po malých částech byl přidáván borohydrid sodíku (500 mg; 13 mmol). Suspenze byla za míchání udržována při teplotě 5 °C po dobu 30 minut.

Potom byla pomalu přidávána ledová kyselina octová až do vyšumění pocházejícího od rozkladu nadbytečného borohydridu sodíku za získání roztoku.

K roztoku byl přidán chloroform (100 ml) a byl tak získán dvoufázový systém.

Spodní organická fáze sestávající zCHCh byla oddělena, a extrahována v tomto pořadí: vodou (25 ml), hydrogenuhličitanem sodným (25 ml 10% vodného roztoku) a vodou (25 ml).

-9CZ 302628 B6

Organický roztok obsahující 2 byl vysušen nad síranem sodným, /filtrován a vysušením /.koncentrován za získání voskového produktu.

Produkt 2 byl získán krystalizaci z acetonu jako surový voskový produkt.

Bylo získáno 4,8 g produktu 2.

Výtěžek: 94 %.

io t.t. -71 až 72 °C.

H'NMR (CDCh): 0,9 (6H, t, ClhCH,-); 1,3 (48H, m, (CH₂)„ ₂₄); 1,55 (4H, m, -OCOCfLChl·-); 2,4 (4H, t, -OCOCIh-); 4,2 (5H, m, CHCH₂O-).

c) Příprava l,3-dipalmitoyl-2-bromacetylglycerolu (3)

Produkt 2 (2,5 g; 4,4 mmol) byl za míchání při teplotě 0 °C (vnější teplota) rozpuštěn v bezvodém chloroformu (50 ml).

K takto získanému roztoku byl pomalu přidáván pyridin (0,42 ml) a po kapkách 3 ml chloroformového roztoku obsahujícího bromacetylchlorid (0,43 ml; 5,2 mmol).

Reakční směs byla udržována po dobu 30 minut na teplotě 0 °C (vnější teplota) a po dobu dalších 30 minut při teplotě okolí.

Potom byla reakční směs upravována tímto postupem: 1% vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové (přibližně 50 ml), 5% vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (přibližně 50 ml) a vodou.

Produkt 3 byl po dehydrataci reakční směsi (síranem sodným) přečištěn krystalizaci z acetonu a /koncentrován vysušením do sucha.

Bylo získáno 2,5 g produktu 3.

Výtěžek: 89 %.

t.t.-46 až 47 °C.

H'NMR (CDCh): 0,9 (6H, t, CH^CH?-: 1,3 (48H, m, (CH₂)_{ll 2}4); 1,55 (4H, m, -QCOCH_?CH_?-);

4o 2,4 (4H, t, (3COCIC- ); 3,9 (2H, s, -OCkbCOO-), 4.2 4,4 (5H, m, 4 11014)-); 5,25 (IH, m, CHCHQ).

d) Příprava esteru propionyl-L-karnitinbromidu s 2-hydroxyacetyl-l,3-dipalmitoylglycerolem (4)

Vnitřní komplexní sůl propionyl-L-karmtinu (0,95 g; 4,4 mmol) předem vysušená ve vakuu při 40 °C byla suspendována v bezvodém dimethylformamidu (přibližně 20 ml).

Do suspenze byl přidáván po malých částech produkt 3 (3 g; 4,7 mmol). Suspenze byla pomalu zahřívána na 38 °C a za těchto podmínek udržována až k získání roztoku.

Po 10 minutách byl roztok ochlazen na teplotu 0 °C a při této teplotě udržován po dobu 30 minut. Byla získána sraženina, která byla odfiltrována a promyta ethy letherem a rozpuštěna v chloroformu (100 ml). Získaný opaleskující roztok (30 ml) byl zfiltrován na celitu a zkoncentrován.

- 10CZ 302628 B6

K takto získanému roztoku byl přidán hexan (100 ml) a získaný vysrážený produkt 4 byl zfiltrován a vysušen ve vakuu při 35 °C.

Bylo získáno 3,19 g sloučeniny,

Výtěžek: 80 %.

t.t. -127 až 128 °C.

io (ct)²⁵o - -3,9° (C = 1 % chloroform)

Elementární analýza C47H₈8BrNO]₀

	%C	%H	%N	% Br
Výpočtem	62,23	9,78	1,54	8,81
Zjištěno	62,73	10,15	0,79	8,77

H^lNMR (CDCh): 0,9-0,95 (6H, t, CH₃CH₂CH₂-); 1,1-1,2 (3H, t, CH₃CH_?CO); 1,2-1,4 (24H, m, (CH₂)_n=24); 1,5-1,6 (4H, m, -OCCH.ČH^); 2,3-2,4 (4H, t, -OCCfTCtT-); 2,4-2,45 (4H, d.d., -CHCH_ZO-); 2,95 (2H, d, -CH₂COÓCPLCOO-T 3,5 (9H, s, N(CH₃)₃); 4,2 (4H, m, -CH₂OCQCH₂-): 4,35 (2H, m, -OTN-T 4,65 (2H, d, d, -OCPLCO-); 5,25 (IH, m, -OCH₂CHCH₃O~); 5,75 (IH, m, -CHCH₂N-).

Příklady 2 až 7

Stejným způsobem jako v minulém příkladu byly připraveny i tyto sloučeniny:

• ester L—karnitinbromidu s 2-hydroxyacetyl-l,3-dipalmitoylglycerolem (ST 770);

• ester acetyl-L-kamitinbromidu s 2-hydroxyacetyl-l,3-dipalmitoylglycerolem (ST 771);

• ester isobutyryl-L-kamitinbromidu s 2-hydroxyacetyl-l,3-dipalmitoylglycerolem (ST 773);

· ester isovaleryl-L-kamitinbromidu $ 2-hydroxyacetyl~l,3-dipalmitoylglycerolem (ST 774);

• ester L-kamitinbromidu s l,3-dihexanoyl-2—hydroxyacetylglycerolem (ST 810);

• ester acetyl-L-kamitinbromidu s 1,3-dihexanoyl-2-hydroxyacetylglycerolem (ST 809);

• ester propi ony l-L-kamitin brom idu s l,3-dihexanoyl-2-hydroxyacetylglycerolem (ST 808).

Jedno z řešení, kterému se v tomto vynálezu dává přednost, spočívá v přípravě liposomů s protinádorovými léčivy a zvláště liposomů, které působí jako vehikulum pro kamptotheciny, například takové, které jsou uvedeny ve WO 97/31003. Pri řešení, kterému se ve zde popisovaném vynálezu dává zvláště přednost, se využívají liposomy k přísunu kamptothecinů obecného vzorce IV:

- II C7, 302628 B6

kde R₇je skupina -C(Rn)=N-O_{ll)Rin, ve které je R_i0 vodík nebo Cj-C₅ alkylová nebo C|-C₅ alkenylová skupina, s přímým nebo rozvětveným řetězcem, nebo C₃-C_l0 cykloalkylová skupina nebo přímá nebo rozvětvená (Cr-Cio) cykloalkyl—(C|-C\) alkylová skupina nebo C₆-C|₄ aryl nebo přímá nebo rozvětvená (C_A-C_l4 aryl-ýCi-Cs) alkylová skupina nebo heterocyklická nebo přímá nebo rozvětvená heterocyklo-(C|-<Á) alkylová skupina, kde jmenovaná heterocyklická skupina obsahuje alespoň jeden heteroatom vybíraný z atomů dusíku, případně substituovaných (C|-C₅) alkylovou skupinou a/nebo kyslíku a/nebo síry; jmenovaná alkylová, alkenylová, cykloalkylová, arylová, arylalkylová, heterocyklická nebo heterocyklo-alkylová skupina je případně in substituována dalšími skupinami vybíranými z: vodíku, hydroxyiu, C_r-Cs alkylu, C|-C₅ alkoxylu, íěnylu, kyanoskupiny, nitroskupiny, NR|_?R,_;. kde Ri? a R₁₃, které mohou být stejné nebo různé, jsou vodík, přímý nebo rozvětvený (CJ , C\) alkyI, COOH skupina nebo jeden zjejich farmaceuticky přijatelných esterů; nebo skupina -CQNRuR^, kde R_!4 a R_]5 mohou být stejné nebo různé, a to vodík, přímý nebo rozvětvený (C|-C₅) alkyl; nebo

I 5

Rio je zbytek C₆-Cio aroylu, případně substituovaný jedním nebo více skupinami vybíranými z: halogenu, hydroxyiu, přímého nebo rozvětveného C1-C5 alkylu, přímého nebo rozvětveného C1-C5 alkoxylu, fenylu, kyanoskupiny, nitroskupiny, -NR^Rp, kde Ri$ a R_]7, mohou být stejné nebo různé, a to vodík, přímý nebo rozvětvený (Cj—C₅) alkyl;

2«

Rio je polyaminoalkylový zbytek; nebo Rin je glykosylový zbytek;

n je číslovka 0 nebo 1;

Rn je vodík, přímý nebo rozvětvený C1-C5 alkyl, přímý nebo rozvětvený C,-C_? alkenyl, C₃-C₁₀ cykloalkyl, přímý nebo rozvětvený (C₃-Cj₀) cykloalkyl-(C|-Cj) alkyl, C6-Cj₄ aryl, přímý nebo rozvětvený (C_A-C₁₄) aryl-(C|-C_s) alkyl;

Rs a R% které mohou být stejné nebo různé, a to vodík, hydroxyl, přímý nebo rozvětvený C)-C_s alkoxyl;

jejich N) oxidy, jednotlivé izomery, zvláště syn a anti izomery skupiny -C(Ru)⁼N-O_(n)Ri o Jejich možné enantiomery, diastereoizomery a odpovídající směsi, jejich farmaceuticky přijatelné sole ajejich účinné metabolity.

Sloučeniny obecného vzorce IV jsou popisovány v evropské patentové přihlášce 99830124.6 podané 9. března 1999.

Co se týká sloučenin obecného vzorce IV, ve kterých je n rovno 1 a R|₀ je podle definice uvedené výše s výjimkou aroylu, mohou být tyto sloučeniny připravovány z výchozího kamptothecin-7- 12 CZ 302628 B6 aldehydu (vzorce IVa, Rn je vodík), nebo kamptothecin-7-ketonu (vzorce IVa, Ru je jiná skupina než vodík).

(IVa), kde R₇je skupina ~C(Rn)=O a R_tl je definován u obecného vzorce IV, a R_s a Rg jsou definovány u obecného vzorce IV. Sloučenina obecného vzorce IVa reaguje se sloučeninou obecného vzorce Va RioO-NFh, kde R,_o je stejná jako výše a získané sloučeniny obecného vzorce I, ve kterých je R₇ skupina -C(Ri i)-N--O-R]₀. R₁₀ je definována jako u obecného vzorce IV vyjma aroytu.

Reakce může být provedena běžnými metodami odborníkům známými, a postup spočívá v norio mální tvorbě oximů. Molámí poměr kamptothecin-7-aldehydu nebo 7-ketonu ku hydroxy laminu má být přednostně v rozmezí od 1 : 3 do 3 : 1. Také lze použít odpovídající sole hydroxylaminu.

Reakce se provádí v přítomnosti báze, například anorganické báze jako je uhličitan draselný nebo organické báze jako je například triethylamin nebo diazabicyklononan za použití polárních rozpouštědel, nejlépe methanolu nebo ethanolu a provádí se při teplotě v rozmezí od okolní teploty do teploty varu rozpouštědla, případně v přítomnosti dehydratačních činidel, např. síranu sodného nebo horečnatého či molekulárních sít. Pokud to je nutné, může se reakce provádět také v přítomnosti katalyzátoru, např. Lewisovy kyseliny.

Výše uvedené sloučeniny se mohou také alternativně připravovat zoximu kamptothecin-720 aldehydu (získané podle popisu publikovaného Sawadou, et al., Chem. Pharm. Bull., 39, 2574, (1991), nebo 7-ketonu nebo z odpovídajícího 7-acylkamptothecinu reakcí s Ri₀-X halogenidem, kde X je přednostně jod v polárním rozpouštědle, např. tetrahydrofuranu nebo alkoholech a v přítomnosti báze, např. hydridu sodného nebo uhličitanu draselného.

Co se týká sloučenin obecného vzorce IV ve kterých je n rovno 1 a Rio je aroyl podle definice obecného vzorce IV, lze tyto sloučeniny připravovat reakcí z výchozího kamptothec in-7-ox i tnu, jehož příprava je popsána v předešlých odstavcích, s Rio-COCI acylchloridy v polárních rozpouštědlech a v přítomnosti báze, přednostně pyridinu nebo přímo v pyridinu, jak to popisuje Cho, et al., J. Org. Chem., 62, 2230, (1997).

Co se týká sloučenin obecního vzorce IV, ve kterých n je 0 a R_l0 je podle definice uvedené výše, s výjimkou aroylu, mohou být tyto sloučeniny připravovány z výchozího kamptothecin-7-aldehydu (obecný vzorec IVa, Ru je vodík) nebo kamptothec i n-7-ketonu (obecný vzorec IVa, R,, je jiná skupina než vodík).

- 13 CZ 302628 B6

kde R₇ je skupina -<(R_n)=O a R₍, je definována v obecném vzorci IV, R₈ a Rg jsou definovány v obecném vzorci IV. Sloučenina obecného vzorce IVa reaguje se sloučeninou obecného vzorce R10-NH1 Vb, kde R₁₀ je definována výše, a získají se sloučeniny obecného vzorce IV, ve kterých je R₇ skupina -C(Rn>N-R₁₀, kde R|₀ je definována stejně jako v obecném vzorci IV vyjma aroylu. Reakce může být uskutečněna běžnými způsoby odborníkům ve farmaceutické technologii známými a postup spočívá v normální tvorbě iminu. Molární poměr kamptothecín-7-aldehydu nebo 7-ketonu ku iminu má být přednostně v rozmezí od I : 3 do 3 : 1. Také lze použít odpovídající sole aminů. Reakce se provádí v přítomnosti báze, například anorganické báze jako je io uhličitan draselný, nebo organické báze jako je triethylamin nebo diazabicyklononan za použití polárních rozpouštědel, přednostně methanolu nebo ethanolu a teplota, za které se reakce provádí se pohybuje v rozmezí od okolní teploty do teploty varu rozpouštědla, případně v přítomnosti dehydrataěních činidel, např. síranu sodného nebo hořečnatého či molekulárních sít. Pokud to reakce vyžaduje, může se provádět v přítomnosti katalyzátoru, např. Lewisovy kyseliny, jak to je i? například popsáno Morettim a Torrem, Synthesis, 141, (1970); nebo Kobayashim, et al., Synlett,

115,(1977).

Kamptothecin-7-aldehyd a kamptothecin-7-oxim jsou popsány v přihlášce evropského patentu EP 0 056 692 a ve výše citovaném sdělení Sawady, et al., Chem. Pharm. Bull., 39, 2574, (1991).

N|-oxidy sloučenin obecného vzorce IV se připravují známými způsoby oxidace heteroaromatického dusíku, přednostně oxidací kyselinou octovou nebo trifluoroctovou a peroxidem vodíku nebo reakcí s organickými peroxykyselinami (Albíni, A. a Pietra, S., Heterocyclic N-oxides, CRC, 1991).

Co se týká různých důležitých R|₀ uváděných u různých reagens obecného vzorce V, tato reakční činidla jsou komerčně dostupná, nebo mohou být připravována způsoby z literatury známými a ke kterým mohou odborníci z této oblasti sáhnout podle svých zkušeností.

Farmaceuticky přijatelné sole se získají běžnými způsoby popsanými v literatuře a nevyžadují žádný další popis.

Příklad 8

7-benzyloxyiminomethylkamptothecin (CPT 172)

500 g (1,33 mmol) 7-formylkamptothecinu se rozpustí ve 100 ml ethanolu. Přidá se 15 ml pyridinu a 638 mg (4 mmol) O-benzylhydroxylamin hydrochloridu. Roztok se refluxuje po dobu

5 hodin. Rozpouštědlo se odpaří ve vakuu a takto získaný zbytek se přečistí flash chromatografii na silikagelu za použití směsi hexanu a ethylacetátu v poměru 4 : 6 jako elučního činidla.

Výtěžek: 65 %.

- 14 CZ 302628 B6

t.t.: 200 až 205 °C.

Získaný produkt sestává ze směsi dvou izomerů syn a anti v poměru přibližně 8 : 2 (izomer A: Rf 0,32; izomer B: Rf 0,19, na silikagelu Merck 60 F254; eluent: hexan : ethylacetát - 3 : 7).

HPLC: analýza byla provedena na přístroji vybaveném čtyřstupňovým čerpadlem (HP 1050) s injektorem Rheodyn (smyčka 20 μΙ) a mřížkovým diodovým detektorem Diode-array (HP 1050) řízeným softwarem HPLC-ChemStation. Spektra byla pořizována od 200 do 600 nm a chromatogramy byly zaznamenávány při 360 a 400 nm.

Kolona s reverzní fází Cl 8 (Rainin Cl 8; 25 x 0,4 cm. Varian) měla ještě předřazenou předkolonu RP18. Analýza byla prováděna při lineárním etučním gradientu počínaje od poměru acetonitrilu ku vodě 30:70 ke 100% acetonitrilu ve 20. minutě pri průtoku 1 ml.min“¹. Retenční časy: 12,51 mín pro izomer B a 14,48 min pro izomer A.

H'NMR (300 MHz; DMSO-d₆): δ: 0,88 (t, H3-I8A+H3-I8B), 1,87 (8m, (H₂-19A+H^19B), 5,18 (s, H₂-5B), 5,21 (8s, H₂-PhB), 5,30 (H₂-PhA), 5,40 (s, H₂-5A), 5,45 (s, H₂-17A+H₂-17B), 6,53 (s, -OHA+-OHB), 7,3-7,6 (m, Ar A+Ar B+H-14 A+H-14 B), 7,75 (m, H-l 1 A+H11 B), 7,85-7,95 (m, H-10 A+H-10 B), 7,98 (dd, H-12B), 8,18-8,27 (m, H-12A + H9-B), 8,45 (s, CH-N B), 8,59 (dd, H-9A), 9,38 (s, CH-N A),

Hmotnostní spektra m/z; 481 (M⁺100), 374 (30), 330 (70), 300 (30), 273 (20), 243 (20), 91 (34).

Příklad 9

7-butoxyiminomethylkamptothecin (CPT 184)

400 mg (1,06 mmol) 7-formylkamptothecinu bylo rozpuštěno v 80 ml ethanolu. Přidáno bylo 12 ml pyridinu a 400 mg (3,18 mmol) O-t-butylhydroxylaminhydrochloridu. Roztok byl ponechán 4 hodiny pod refluxem. Rozpouštědlo bylo odpařeno pod vakuem a takto získaný zbytek přečištěn flash chromatografií na silikagelu za použití eluční směsi hexanu s ethylacetátem v poměru 4 : 6.

Bylo získáno 322 mg (0,72 mmol) žluté tuhé látky.

Výtěžek byl 68 %.

t.t.: 250 °C

Získaný produkt se skládá ze směsi syn a anti izomerů v poměru přibližně 8 : 2 (izomer A: Rf0,31; izomer B: Rf 0,24 na silikagelu Merck 60 F 254, eluční činidlo: hexan a ethylacetát v poměru 3 : 7),

HPLC: analýzy byly provedeny na přístroji vybaveném čtyřstupňovým čerpadlem (HP 1050) s injektorem Rheodyn (smyčka 20 μΐ) a mřížkovým diodovým detektorem (HP 1050) řízeném softwarem HPLC-ChemStation. Spektra byla snímána od 200 do 600 nm a chromatogramy byly registrovány při 360 a 400 nm.

Byla použita reverzní kolona s fází 08 (Rainin Cl 8; 25 x 0,4 cm, Varian) s představenou predkolonou kolonou RPI8. Analýza byla provedena pri lineárním elučním gradientu počínajíc od směsi acetonitril; vodě v poměru 30:70 ke 100% acetonitrilu ve 20. minutě pri průtoku 1 ml.min“¹. Retenční časy byly: 12,92 min pro izomer B a 14,61 min pro izomer A.

- 15CZ 302628 B6 ¹ H-NMR (300 MHz; DMSO-d₆): δ: 0.88 (t, H -l8Λ+Η3-18B), 1,30 (s, t-but.B), 1,47 (s, t-but.A), 1,87 (m, H₂-I9A+II₂-19B), 5,1 8 (s, II₂-5B), 5,37 (H₂-5A), 5,42 (s, H₂-17A+H₂-17B), 6,54 (s, -OH Λ+-ΟΗ B), 7,35 (s, H-I4A), 7,36 (s, 11-14B), 7,69-7,83 (tn, H-l 1 A+H-l 1B), 7,85-7,98 (m, H-10A+H-10B), 8,07 (dd, H-9B), 8,16-8,27 (m, Η-9Λ+Η-Ι2Β), 8,40 (s, CH B),

8,62 (dd, H-l 2A), 9,31 (s, CH A).

Hmotnostní spektrum (m/z): 448 (M’28), 391 (40), 374 (100), 362 (40), 330(34), 57 (17).

Příprava liposomů

Sloučeniny podle vynálezu mohou být použity k přípravě mu Iti lamelám ích liposomů (MLV) i un i lamelám ích liposomů (SUV), obojích ve formě suchých prášků i jako suspenzí ve vodných roztocích.

Sloučeniny podle vynálezu připravené podle popisu v příkladech 1 až 7 se používají k přípravě liposomů podle následujícího postupu. Vhodné množství sloučeniny se rozpustí v chloroformu; roztok sc ve vakuové rotační odparce odpařuje do sucha až do vytvoření lipidového filmu, Lipidový film se pod silným vakuem vysuší až do odstranění posledních stop rozpouštědla, potom se rozpustí v terc-butylalkoholu nebo ve vodě. Takto získaný roztok se lyofilizuje a získá se jemný, suchý prášek.

Prášky se hydrátu jí vhodným množstvím vodného roztoku za získání liposomů použité sloučeniny, která se potom zakomplexuje polynukleotidem nebo požadovaným léčivem.

Jiný způsob přípravy liposomů spočívá v adsorpcí lipidového filmu obsahujícího sloučeninu podle vynálezu v rozpouštědle na vhodném inertním nosiči jako je například sorbitol, manitol nebo farmakologicky přijatelné cukry. Směs se vakuově odpaří za získání tuhé látky, kterou lze snadno a velmi rychle před použitím hydratovat.

Preparáty ve formě suchých prášků mají výhodu v tom, že jsou po dlouhou dobu stálé a snadno se používají.

Sloučeniny podle vynálezu mohou být navíc použity k přípravě liposomových komplexů s DNA nebo požadovaným léčivem ve formě suchých prášků podle následujícího postupu. Sloučenina podle vynálezu se rozpustí v terc-butylalkoholu nebo vodě; takto získaný roztok se smísí s DNA nebo požadovaným léčivem a směs se lyofilizuje za získání komplexu, který můžeme definovat jako proliposom-DNA nebo proliposom-léčivo, a to ve formě jemného suchého prášku.

Prášky takto získané (proliposomy) mohou být použity k přípravě farmaceutických přípravků,

41) které mohou být podávány jako aerosoly, nebo mohou být alternativně rekonstituovány vodou nebo ústojným roztokem a mohou být podávány parenterálně nebo orálně.

Liposomy zakomplexované s DNA nebo léčivem v tuhé formě mohou být také získány adsorpcí lipidového filmu na inertní nosič jako je sorbitol, manitol nebo jiné cukry způsobem popsaným výše.

Zkoušení vytváření liposomů

Vytváření liposomů bylo zkoušeno kolorimetricky za použití barviva rozpustného ve vodě podle následujícího postupu. Byl připraven vodný roztok ve vodě rozpustného barviva Arsenazo lil (m. hm. ~ 776,37; 2,3 mg.mr¹).

Tento roztok byl použit namísto vody k hydrataci lipidových filmů pocházejících zvýše uvedeného postupu.

- 16CZ 302628 B6

Alikvotní podíl suspenze obsahující liposom obsahující barvivo byl stonásobně zředěn vodou.

K získání první hodnoty optické hustoty měřené při 660 nm byly použity dva ml liposomové suspenze; odečet optické hustoty byl proveden proti stejnému vzorku připravenému jako slepá zkouška. K prvnímu vzorku bylo přidáno 200 μΐ roztoku CaCI₂ (15 mg-ml“'; 100 mM) a změřena optická hustota při 660 nm proti slepému pokusu, ke kterému bylo přidáno 200 μΐ vody. Získaná hodnota absorbance byla označena jako hodnota 2. Pokračovali jsme přidáním 100 μΙ roztoku Tritonu X-100 (5 % obj./obj.; 0,26 % konečná koncentrace) ke vzorku a 200 μΐ vody ke slepému pokusu; optická hustota při 660 nm byla označena jako hodnota 3. K výpočtu procenta adsorboio váného barviva bylo použito tohoto vzorce:

% adsorbovaného barviva = hodnota 3 - hodnota 2 x 100 hodnota 3

Procento adsorbovaného barviva dává míru vytvořeného liposomu a pohybuje se průměrně okolo 40 %; kontrola této hodnoty liposomu byla provedena přístrojem Laser Light Scattering s klad15 ným výsledkem.

Příklady přípravy líposomů zo Příprava líposomů undecylesteru palmitoyl-L-kamitinchloridu (ST 983) ve formě:

a) Lyofilizovaných prášků mg, 0,11 mmol undecylesteru palmitoyl-L-kamitinchloridu bylo ve 1 OOml baňce rozpuštěno 25 ve 20 ml chloroformu.

Roztok byl odpařen až do získání lipidového filmu, který byl sušen ve vakuu po dobu 3 hodin. Takto získaný produkt byl sušen ve vakuu po dobu 3 hodin. Takto získaný produkt byl rozpuštěn v terc-butylalkoholu a tento roztok byl rychle ochlazen na -70 °C kapalným dusíkem a lyofilizo30 ván po dobu 24 hodin.

Byla získána bílá houbovitá tuhá látka.

b) Adsorbovaných prášků

143 mg, 0,231 mmol undecylesteru palmitoyl-L-kamitinchloridu bylo rozpuštěno v 10 ml chloroformu. Takto získaný roztok byl po malých částech naléván do lOOml baňky obsahující 750 mg sorbitolu. Ke konci přidávání jednotlivých dávek chloroformového roztoku byl tento chloroform vždy rychle odpařen.

Takto získaná tuhá látka byla po dobu 3 hodin sušena pod vakuem.

Bylo získáno 893 mg pevného bílého produktu.

K získání isotonického roztoku byl produkt před použitím rychle hydratován vhodným množstvím vody.

c) MLV suspenzí

650 mg, 0,1 1 mmol undecylesteru palmitoyl-L-karnitinchloridu bylo ve 100ml baňce rozpuštěno ve 20 ml chloroformu.

- 17 CZ 302628 B6

Takto získaný roztok byl odpařen až do získání lipidového filmu, který byl sušen ve vakuu po dobu 3 hodin.

Lipidový film byl hydratován 10 ml vody při 30 °C po dobu 3 hodin a získána suspenze MLV.

Vhodně zředěná suspenze MLV byla zakomplexována polynukleotidem nebo léčivem a použita při biologických zkouškách, c) Suspenzí SUV

650 mg, 0,11 mmol undecylesteru palmitoyl-L-karnitinchloridu bylo ve lOOml baňce rozpuštěno ve 20 ml chloroformu.

Takto získaný roztok byl odpařen až do vzniku lipidovcho filmu, který byl sušen ve vakuu po 15 dobu 3 hodin.

Lipidový film byl hydratován 10 ml vody při 30 °C po dobu 3 hodin a získána suspenze MLV.

Suspenze MLV byla 1 Okřát prolisována polykarbonátovým filtrem s velikostí pórů 200 nm. Tak20 to získaná uni lamelami suspenze liposomů byla zakomplexována polynukleotidem nebo léčivem a použita při biologických zkouškách, f) Zkoušení fyzikální stability liposomů

Fyzikální stabilita liposomové suspenze byla zkoušena turbid i metricky po dobu 30 dní.

U každé zkoušené suspenze bylo provedeno měření absorbance při 600 nm v určitých časových intervalech. Střední hodnota absorbance v čase 0 zůstávala u všech přípravků stálá.

Navržené sloučeniny dávaly vyhovující hodnoty po celou uvažovanou dobu.

Liposomové suspenze MLV a SUV lze připravovat kombinováním sloučenin podle vynálezu s pomocnými lipidy jako je cholesterol, l palmitoyl-2-oleoyIfosfatidyleholin (POPC nebo díoleylfosfatidylcholin (DOPE).

Sloučeniny se kombinují s pomocnými lipidy za účelem získání liposomů se stabilnějšími membránami. V dále uvedeném odstavci popisujícím přípravu liposomů je uveden příklad přípravy ve kterém se sloučenina podle vynálezu kombinuje s pomocným lipidem jako je například cholesterol nebo POPC.

Příklady přípravy liposomů k přísunu léčiv

Příklad 10

Příprava taxol-ST 983 MLV liposomů (1 : 40) mg, 0,0234 mmol taxolu a 556 mg, 09417 mmol ST 983 bylo rozpuštěno ve 20 ml chloroformu.

Roztok byl koncentrován až do získání lipidového filmu na skleněné baňce.

Po odstranění posledních stop chloroformu pomocí vývěvy bylo k lipidovému filmu přidáno 20 ml tere-butylalkoholu a takto získaný roztok byl rozdělen do 19 podílů, které byly okamžitě

- 18 CZ 302628 B6 zmrazený kapalným dusíkem na -70 °C a lyofilizovány po dobu 24 hodin. Každý podíl tuhé látky obsahoval taxol (1,05 mg) a ST 983 (29,2 mg).

K získání výsledné liposomové suspenze byl lyofilizovaný produkt v okamžiku jeho použití 5 hydratován vodou (450 μΐ) nebo jinými roztoky solí, míchán po dobu 10 minut a ponechán stát po dobu zbylých 30 minut k dokončení procesu bobtnání (hydratace).

Byly získány ML V liposomy. ío Zkoušení fyzikální stability preparátů

Fyzikální stabilita preparátu byla zkoušena turbidimetricky záznamem TDC (křivka časové závislosti) pri 800 nm při 20 °C po dobu 20 hodin.

Průběh hodnot turbidity indikující stabilitu preparátu byl trvale zaznamenáván bez známek srážení.

Zkoušení chemické stability taxolu v preparátu 20 Chemická stálost preparátu byla zkoušena HPLC.

Podmínky chromatografického stanovení:

Kolona: pBondapackC-18 25 Eluent: acetonitril + voda v poměru 70 : 30

Detektor: UV-VIS: 227 nm Průtok: 1 ml. min“¹ Retenční čas: 4,5 min jo Koncentrace taxolu stanovená vztažením na standard byla 2,13 mg.ml+.

Obsah taxolu byl 98 %.

Příklad 11

Příprava SOV liposomů taxol - ST 983 mg, 0,0234 mmol taxolu a 556 mg, 0,9417 mmol ST 983 bylo rozpuštěno ve 20 ml chloro40 formu.

Roztok byl koncentrován až do získání lipidového filmu na skleněné baňce.

Po odstranění posledních stop chloroformu pomocí vývěvy pro získání vysokého vakua bylo 45 k lipidovému filmu přidáno 20 ml terc-buty lalkoholu a takto získaný roztok byl rozdělen do podílů, které byly okamžitě zmrazený kapalným dusíkem na -70 °C a lyofiltzovány po dobu 24 hodin. Každý podíl tuhé látky obsahoval taxol (1,05 mg) a ST 983 (29,2 mg).

K získání výsledné SUV liposomové suspenze byl lyofilizovaný produkt hydratován roztokem 50 PBS (1 ml) a homogenizován ultrazvukem po dobu 30 minut pri 0 °C.

K odstranění stop titanu uvolněného ultrazvukovou sondou byla potom provedena filtrace přes 400nm filtr.

- 19 CZ 302628 B6

Zkoušení fyzikální stability preparátu

Fyzikální stabilita preparátu byla zkoušena turbidimetrieky záznamem TDC (křivka časové závislosti) při 800 nm při 20 °C po dobu 20 hodin.

Průběh hodnot turbidity indikující stabilitu preparátu byl trvale zaznamenáván bez známek srážení.

κι Zkoušení chemické stability taxolu v preparátu Chemická stálost preparátu byla zkoušena HPLC.

Podmínky chromatografického stanovení:

Kolona: pBondapack C-l 8

Eluent: acetonitril + voda v poměru 70 : 30

Detektor: UV-VIS: 227 nm

Průtok: 1 ml.min ¹

Retenční čas: 4,5 min.

Analýza HPLC suspenze SUV liposomu dala stejné výsledky jako odpovídající suspenze MLV liposomu a také v tomto případě byl obsah taxolu 98 %.

Analýza HPLC byla opakována po 24 hodinách, kdy se neobjevily žádné další píky kromě píku taxolu indikující stabilitu účinné složky.

Příklad 12

Příprava liposomů taxol - ST 983 - cholesterol (1 : 15)

Tyto typy liposomů byly připraveny za účelem získání komplexů se stabilnějšími membránami.

V 10 ml chloroformu bylo rozpuštěno 6 mg, 0,0101 mmol taxolu, 62,2 mg, 0,105 mmol ST 983 a 40 mg cholesterolu, takto získaný roztok byl koncentrován až do získání lipidového filmu na skleněné baňce.

Po odstranění posledních stop chloroformu pomocí vývěvy pro získání vysokého vakua bylo k lipidovému filmu přidáno 6,3 ml terc-butylalkoholu a takto získaný roztok byl rozdělen do 5 podílů, které byly okamžitě zmrazený kapalným dusíkem na -70 °C a lyofílízovány po dobu 24 hodin. Každý podíl tuhé látky obsahoval taxol (1,2 mg), ST 983 (12,44 mg) a cholesterol (8 mg).

V době použití byl k získání výsledné liposomové suspenze lyofilizovaný produkt hydratován vodou (1000 μΙ) nebo jinými roztoky solí, míchán po dobu 10 minut a ponechán do konce 30. minuty stát k dokončení procesu bobtnání (hydratace).

Byly získány liposomy MLV.

-20CZ 302628 B6

Zkoušení fyzikální stability preparátu

Fyzikální stabilita preparátu byla zkoušena turbodimetricky záznamem TDC (křivka časové závislosti) pri 800 nm při 20 °C po dobu 6 hodin.

Průběh hodnot turbidity indikující stabilitu preparátu byl trvale zaznamenáván bez známek srážení.

i o Příklad 13

Příprava SOV liposomů taxol - ST 772 (1 : 70) mg, 0,0234 mmol taxolu a 1485 mg, 1,638 mmol ST 772 bylo rozpuštěno ve 20 ml chloroi5 formu.

Roztok byl koncentrován až do získání lipidového filmu na povrchu skleněné baňky.

Po odstranění posledních stop chloroformu pomocí vývěvy pro získání vysokého vakua bylo 20 k lipidovému filmu přidáno 20 ml terc-butylalkoholu. K získání Čirého roztoku se muselo zahřát na 60 °C. Roztok byl okamžitě zmrazen kapalným dusíkem na -70 °C a lyofilizován po dobu hodin.

K získání výsledné SUV liposomové suspenze byl lyofilizovaný produkt hydratován roztokem 25 PBS (20 ml) a homogenizován ultrazvukem po dobu 20 minut pri 0 °C.

K odstranění stop titanu uvolněného ultrazvukovou sondou byla potom provedena filtrace přes 400nm filtr.

Zkoušení fyzikální stability preparátu

Fyzikální stabilita preparátu byla zkoušena turbidimetricky záznamem TDC (křivka časové závislosti) pri 800 nm při 20 °C po dobu 6 hodin.

Průběh hodnot turbidity indikující stabilitu preparátu byl trvale zaznamenáván bez známek srážení.

Příklad 14

Příprava MLV liposomů CPT 83 - ST 983 (1 : 40)

6,3 mg, 0,0168 mmol CPT 83 (7-karbonitrilkamptothecin) popsaný ve WO 97/31003) a 400 mg, 0,667 mmol ST 983 bylo rozpuštěno ve 20 ml chloroformu.

Roztok byl koncentrován až do získání lipidového filmu na povrchu skleněné baňky.

Po odstranění posledních stop chloroformu pomocí vývěvy pro získání vysokého vakua bylo k lipidovému filmu přidáno 26 ml terc-butylalkoholu a takto získaný roztok byl rozdělen do

12 podílů, které byly okamžitě zmrazený kapalným dusíkem na -70 °C a lyofilizovány po dobu hodin. Každý podíl obsahoval CPT 83 (0,525 mg) a ST 983 (33,33 mg).

K získání výsledné SUV liposomové suspenze byl lyofilizovaný produkt hydratován vodou (1000 μΙ) nebo roztoky dalších solí a homogenizován ultrazvukem po dobu 10 minut.

-21 CZ 302628 B6

Byly získány MLV liposomy.

Zkoušení fyzikální stability preparátu

Fyzikální stabilita preparátu byla zkoušena tu rbid i metricky záznamem TDC (křivka Časové závislosti) při 800 nm při 20 °C po dobu 20 hodin.

Průběh hodnot turbidity indikující stabilitu preparátu byl trvale zaznamenáván bez známek srážení.

io

Zkoušení chemické stability CPT 83 v preparátu

Chemická stálost CPT 83 byla zkoušena HPLC. is Podmínky chromatografie kého stanovení:

Kolona: Supelkosil LC-ABZ

Eluent: 20 mM fosfátový ústojný roztok + methanol v poměru 40 : 60, pH - 7,3 Detektor: UV-VIS: 360 nm

Průtok: I ml.min ¹

Retenční čas: 4,033 min

Koncentrace CPT 83 stanovená vztažením na standard byla 0,502 mg.ml

Obsah adsorbovaného CPT 83 byl 99 %.

Příklad 15

Příprava SLIV liposomů CPT 83 - ST 983 (I : 40)

6,3 mg, 0,0168 mmol CPT 83 a 400 mg, 0,667 mmol ST 983 bylo rozpuštěno ve 20 ml chloroformu.

Roztok byl koncentrován až do získání lipidového filmu na povrchu skleněné baňky.

Po odstranění posledních stop chloroformu pomocí vývěvy pro získání vysokého vakua bylo k lipidovému filmu přidáno 26 ml terc-butylalkoholu a takto získaný roztok byl rozdělen do 12 podílů, které byly okamžitě zmrazený kapalným dusíkem na -70 °C a lyofílizovány po dobu

24 hodin. Každý podíl obsahoval CPT 83 (0,525 mg) a ST 983 (33,33 mg).

K získání výsledné SUV liposomové suspenze byl lyofilizovaný produkt hydratován vodou (1000 μΐ) a při 0 °C homogenizován ultrazvukem po dobu 40 minut.

K odstranění stop titanu uvolněného ultrazvukovou sondou byla potom provedena filtrace přes 400nm filtr.

Zkoušení chemické stability CPT 83 v preparátu 5o Chemická stálost CPT 83 byla zkoušena HPLC.

Podmínky chromatografie kého stanovení:

Kolona: Supelkosil LC-ABZ

-22CZ 302628 B6

Eluent: 20 mM fosfátový ústojný roztok + methanol v poměru 40 : 60, pH = 7,3 Detektor: UV-VIS: 360 nm Průtok: 1 ml.min“¹

Retenční čas: 4,033 min

Koncentrace CPT 83 stanovená vztažením na standard byla 0,3 mg.mr¹.

Obsah adsorbovaného CPT 83 byl 59 %.

ío Analýza HPLC byla opakována po 24 hodinách, kdy se neobjevily žádné další píky kromě píku CPT 83 indikující stabilitu sloučeniny.

Zkoušení fyzikální stability preparátu η Fyzikální stabilita preparátu byla zkoušena turbidimetricky záznamem TDC (křivka časové závislosti) pri 600 nm při 20 °C po dobu 20 hodin.

Průběh hodnot turbidity indikující stabilitu preparátu byl trvale zaznamenáván bez známek srážení.

Příklad 16

Příprava MLV liposomů CPT 184 - ST 983 (l : 40)

7,29 mg, 0,0168 mmol CPT 184 a 400 mg, 0,667 mmol ST 983 bylo rozpuštěno ve 20 ml chloroformu.

Roztok byl koncentrován až do získání lipidového filmu na povrchu skleněné baňky.

Po odstranění posledních stop chloroformu pomocí vývěvy bylo k lipidovému filmu přidáno 26 ml terc-butylalkoholu a takto získaný roztok byl rozdělen do 12 podílů, které byly okamžitě zmrazený kapalným dusíkem na -70 °C a lyofilizovány po dobu 24 hodin. Každý podíl obsahoval CPT 184 (0,607 mg) a ST 983 (33,33 mg).

K získání výsledné liposomové suspenze byl lyofilizovaný produkt hydratován vodou (1000 μΐ) nebo roztoky dalších solí a míchán po dobu 10 minut.

Byly získány MLV liposomy.

Zkoušení fyzikální stability preparátu

Fyzikální stabilita preparátů byla zkoušena turbidimetricky záznamem TDC (křivka časové závislosti) pri 600 nm při 20 °C po dobu 20 hodin.

Průběh hodnot turbidity indikuj žení.

Zkoušení chemické stability CPT 184 v preparátu Chemická stálost CPT 184 byla zkoušena HPLC. Podmínky chromatografického stanovení:

Kolona: Supelkosil LC--ABZ

Eluent: 20 mM fosfátový ústojný roztok t- methanol v poměru 40 : 60, pH = 7,3 Detektor: UV-V1S: 360 nm Průtok: I ml.min ¹ s Retenční čas: 25,5 min

Koncentrace CPI' 184 stanovená vztažením na standard byla 0,600 mg.ml

Obsah adsorbovaného CPT 184 byl 99 %.

nt

Příklad 17

Příprava SUV liposomu CPT 184 - ST 983 (1 : 40)

7,29 mg, 0,0168 mmol CPT 184 a 400 mg, 0,667 mmol ST 983 bylo rozpuštěno ve 20 ml chloroformu.

Roztok byl koncentrován až do získání lipidového filmu na povrchu skleněné baňky.

Po odstranění posledních stop chloroformu pomocí vývěvy pro získání vysokého vakua bylo k lipidovému filmu přidáno 26 ml terc-butylalkoholu a takto získaný roztok byl rozdělen do 12 podílů, které byly okamžitě zmrazený kapalným dusíkem na -70 °C a lyofílizovány po dobu 24 hodin. Každý podíl obsahoval CPT 184 (0,607 mg) a ST 983 (33,33 mg).

K získání výsledné SUV liposomové suspenze byl lyofilizovaný produkt hydratován vodou (1000 μΙ) a homogenizován ultrazvukem po dobu 40 minut při 0 °C.

K odstranění stop titanu uvolněného ultrazvukovou sondou byla potom provedena filtrace přes .to 400nm filtr.

Zkoušení chemické stability CPT 184 v preparátu

Chemická stálost preparátu byla zkoušena HPLC.

Podmínky chromatografíckého stanovení:

Kolona: Supelkosil LC-ABZ

Eluent: 20 mM fosfátový ústojný roztok + methanol v poměru 40 : 60, pH = 7,3 40 Detektor: UV-V1S: 360 nm

Průtok 1 ml.min ¹ Retenční čas: 25,5 min

Koncentrace CPT 184 stanovená vztažením na standard byla 0,36 mg.ml ^!.

Obsah adsorbovaného CPT 184 byl 70 %.

Analýza HPLC byla opakována po 24 hodinách, kdy se neobjevily žádné další píky kromě píku CPT 184 indikující stabilitu účinné složky.

Zkoušení fyzikální stability preparátu

-24CZ 302628 B6

Fyzikální stabilita preparátu byla zkoušena turbidimetricky záznamem TDC (křivka časové závislosti) při 600 nm pri 20 °C po dobu 20 hodin.

Průběh hodnot turbidity indikující stabilitu preparátu byl trvale zaznamenáván bez známek srážení.

V dalších příkladech byly liposomy připraveny za pomoci pomocných lipidů a/nebo kryptoprotektivních látek.

Příklad 18

Příprava liposomů CPT 184 - ST 983

Ve 21 baňce bylo ke 20 mg CPT 184 a 600 mg ST 983 přidáno 100 ml methylchloroformu a směs mírně zahřívána až do úplného rozpuštění látek. Získaný roztok byl koncentrován na rotační odparce až k získání lipidového filmu, který byl dále po dobu dvou hodin sušen pomocí vysokovakuové vývěvy, lipidový film byl potom hydratován roztokem laktózy (6 g ve 300 ml vody) při 45 °C a pokračováno v míchání v rotační odparce přibližně 2 hodiny. Suspenze byla potom míchána ultrazvukem po dobu 2 hodin s každým cyklem trvajícím půl hodiny. Následné byl produkt filtrován filtrem 200 nm a lyofilizovány.

Zkoušení chemické stability CPT 184 v preparátu

O chemické stabilitě CPT 184 jsme se ujistili HPLC. Během 24-hodinové zkoušky byl produkt stálý.

Zkoušení fyzikální stability preparátu

Fyzikální stabilita preparátu byla zkoušena turbidimetricky. Produkt byl během 24-hodinové zkoušky stabilní. Rovněž velikost částic byla stabilní (střední hodnota 100 nm).

Příklad 19

Příprava liposomů CPT 184 - ST 983

Pro 1 ml liposomového přípravku (POPC - 5 mM I-palmitoyl-2-oleoylfosfatidylcholin; l ,25 mM ST 983; 0,25 (?) CPT 184 a 150 mM trehalosa) byl použit tento postup:

0,11 mg, 0,25 pmol CPT 184 bylo rozpuštěno ve 250 μΐ ethylacetátu, 3,79 mg, 4,89 μηηοΐ POPC bylo rozpuštěno ve 100 μΐ ethanolu a 0,74 mg, 1,25 μιυοΙ ST 983 bylo rozpuštěno ve 100 μΐ ethanolu. Tyto tři roztoky byly spojeny dohromady a promíseny. Rozpouštědla byla za teploty místnosti odpařena na rotační odparce pri tlaku 8 kPa. Lipidový film byl v temnu sušen po dobu dvou hodin. Lipidový film byl potom suspendován v 1 ml 150mM roztoku dihydrátu D(+)-trehalosy (Fluka, HPLC 99 %), sterilizován na 0,22 nm filtru a po dobu dvou minut promícháván. Suspenze byla ponechána 21 krát projít 200 nm póly karbonátovým i filtry. Prošlá liposomová suspenze byla zmrazená kapalným dusíkem a lyofilizována po dobu 2 nocí. Byla získána bílá tuhá hmota.

-25CZ 302628 B6

Příklad 20

Příprava liposomů CPT 184 - ST 983

Byl použit stejný postup jako v příkladu 19 vyjma toho, že byla použita trehalosa o koncentraci 500 mM.

Protinádorové působení liposom ST 983 - - protinádorové komplexní látky

Jak bude z dalšího zřejmé, liposom ST 983 vykazuje na převažující akumulací v pulmonární oblasti. Tato charakteristika vedlejší specificity usnadnila jeho použití u myšího modelu pulmonární karcinogeneze.

i? Proti nádorovou látkou použitou v těchto pokusech byl taxol.

K vyvolání nádoru in vivo obdržely myši Balb/c bez anesteze injekce 3.10' buněk myšího pulmonárního karcinomu M109v0,l ml RPMI-1640 (Sigma) do kvadricepsů femoris pravé zadní končetiny.

Deset dnů po implantaci nádoru byl fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS, SIGMA, P-4417) zředěn liposom-taxolový komplex a intravenózně injikován v koncentraci 2,5 mg.ml ¹ ST 983 a 75 pg.ml '. taxolu.

Taxol (paclitaxel INDENA) použitý jako kontrolní látka byl rozpuštěn v kremoforovém vehikulu EL (BASF) na koncentraci 20 mg.ml’¹ a uchováván při +4 °C po následujících 24 hodin chráněný před světlem. V době použití byl zředěn fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (BPS, Sigma) a intravenózně injikován za stejných podmínek co se týká objemu a koncentrace, jaké byly popsány u taxolu transportovaného liposomem ST 983.

Kremofor byl připraven zředěním ethylalkoholem 1:1.

Podávání bylo realizováno sedm po sobě následujících dní počínaje 10. dnem po inokulaci nádoru. Zvířata byla pozorována do 17. dne po inokulaci, utracena cervikální dislokací ajejich plíce byly odejmuty ke stanovení počtu metastáz. Barvení plic ke stanovení metastáz bylo provedeno inkubací plic po dobu 10 dní v 5 ml Bouinova roztoku obsahujícího 71 % nasyceného roztoku kyseliny pikrové, 4,8% ledové kyseliny octové (Merck) a 24 % 10% formaldehydu (Fluka). Na konci inkubacní doby v Bouinově roztoku byly počítány metastázy.

V porovnání s kontrolními myšmi neukazoval taxol transportovaný kremoforem na žádné snížení počtu pulmonámích metastáz, i když tyto byly menší než u kontrolních zvířat, zatímco taxol zakomplexovaný s liposomem ST 983 vykazoval významné snížení jak počtu, tak velikosti pulmonámích metastáz.

Statistická analýza dat počtu metastáz byla provedena za použití Man-Whitneyových neparametrických testů nepárových hodnot.

Získané výsledky jsou uvedeny v následující tabulce 1.

-26CZ 302628 B6

Tabulka 1

Plicní metastázy 17. den po inokulaci nádoru Ml09 myším BALB/c, kterým byl podáván taxol a taxol s liposomem ST 983

Skupina	Metastázy střední hodnota ± std. odch.	Velikost metastáz
Kontrolní	21±12	M
Taxol	22±9	S
Taxol -ST9S3	10+2	S

M = střední (průměr 1 až 2 mm)

S = malé (průměr < 1 mm) ío Zkoušky toxicity in vitro

Zkoušky toxicity byly prováděny na HeLa a M109 buňkách na 96-jamkových destičkách. Ve dni nanesení destiček bylo na buňky působeno zkoušenými sloučeninami po dalších 48 hodin. Potom byly buňky promyty PBS a ponechány růst za normálních podmínek po dobu 48 hodin.

Po odstranění růstového média byly buňky inkubovány na ledu se 16% TCA, třikrát promyty vodou, po dobu 30 minut na ně působeno sulforhodaminem B (SRB) v 1% kyselině octové, třikrát promyto samotnou 1% kyselinou octovou, inkubováno 20 minut v 10 mM TRIS o pH 10,5 a konečně změřeno při 540 nm.

Zkoušky cytotoxicity s CTP 83

Zkoušky cytotoxicity in vitro CPT 83 byly provedeny za účelem vyhodnocení proti nádorové látky zakomplexované s liposomem jakožto předběžného ukazatele účinnosti působení,

K vyhodnocení schopnosti liposomu transportovat CPT 83 in vitro do buněk Ml09 byla použita výše popsaná zkouška se sulforhodaminem B.

Navíc byla také hodnocena cytotoxicita CPT 83 rozpuštěného v dimethylsulfoxidu (DMSO) a porovnána se stejnou látkou zakomplexovanou s liposomem ST 983.

Při zkouškách cytotoxicity byl použit komplex liposom-CPT83 v koncentracích uvedených v dalších tabulkách 2.1, 2.2 a 2.3 a to jak v konfiguraci SUV, tak MLV. Použitý molární poměr liposomu ku CPT 83 byl 40:1.

Střední hodnota cytotoxicity komplexů ST 983 - CPT 83 v konfiguraci jak SUV, tak MLV v níže uvedených tabulkách 2.1, 2.2 a 2.3 ukazuje, že liposom ST 983 je schopen transportovat CPT 83 stejným způsobem jako DMSO vykazujíc úroveň cytotoxicity stejného řádu.

-27CZ 302628 B6

Tabulka 2.1

Cytotoxicita (SRB) ST 983 SlJ V - CPT 83

Koncentrace jsou v μΜ
Kontrolní	1,3	0,13	0,013	0,0013
0,911	0,294	0,705	0,908	0,911
0,745	0,198	0,525	0,821	0,83
0,884	0,204	0,801	0,906	0,91
0,833	0,25	0,748	0,856	0,853
0,854	0,254	0,778	0,867	0,873
0,793	0,231	0,739	0,802	0,803
0,792	0,193	0,602	0,827	0,829
0,901	0,248	0,69	0,904	0,89
střed 0,839125	0,352444	0,635333	0,767111	0,7667
std. odch. 0,060645	0,034513	0,092925	0,042054	0,040149

Hodnoty v tabulce uvedené jsou hodnotami optické hustoty při 540 nm.

Tabulka 2.2
Cytotoxicita (SRB) ST 983 MLV -	-CPT 83
Koncentrace jsou v μΜ
Kontrolní	1,3	0,13	0,013	0,0013
0,895	0,038	0,04	0,095	0,088
0,82	0,038	0,046	0,109	0,124
0,896	0,041	0,049	0,128	0,127
0,847	0,041	0,042	0,105	0,115
0,863	0,041	0,053	0,111	0,107
0,794	0,043	0,041	0,073	0,095
0,829	0,039	0,044	0,08	0,085
0,893	0,041	0,044	0,064	0,065
střed 0,854625	0,04025	0,044875	0,095625	0,10075
std. odch. 0,038682	0,001753	0,004357	0,021738	0,021359

Hodnoty v tabulce uvedenéjsou hodnotami optické hustoty při 540 nm.

-28CZ 302628 B6

Tabulka 2.3

Cytotoxicita (SRB) DMSO - CPT 83

Koncentrace jsou v μΜ

Kontrolní	13	1,3	0,13	0,013	0,0013
0,898	0,281	0,33	0,406	0,8	0,809
0,774	0,267	0,302	0,407	0,804	0,816
0,857	0,3	0,285	0,57	0,863	0,886
0,787	0,286	0,287	0,383	0,836	0,841
0,808	0,285	0,318	0,474	0,851	0,863
0,745	0,288	0,317	0,467	0,79	0,795
0,775	0,312	0,328	0,429	0,806	0,831
0,864	0,318	0,305	0,421	0,81	0,878
0,8135	0,292125	0,309	0,444625	0,82	0,839875

std.odch. 0,053519 0,016848 0,017205 0,059269 0,026506 0,033237

Hodnoty v tabulce uvedené jsou hodnotami optické hustoty při 540 nm,

Biologické účinky komplexu liposom ST 983 - CPT 184 io

Byly zkoušeny biologické účinky liposomů příkladu 18 (dále nazývaný liposom A) a příkladu 20 (dále nazývaný liposom B).

Toxicita na zdravých myších

Liposomy A a B byly podávány orálně a intravenózně a porovnávány s volným CPT 184 v dávce l,2mg.kg^_l podle schématu q4dx4. Tyto dva liposomy nevykazovaly na tělesnou hmotnost, plíce, slezinu a ledviny významné působení. Liposom B intravenózně a liposom A orálně podávány ovlivňovaly hmotnost thymu podobně jako volný CPT 184. Intravenózní liposom A měl pouze minimální účinek. Hematologické hodnoty nevykazovaly u obou liposomů po 24 hodinách významné změny. Liposom A podávaný intravenózně vykazuje podle schématu qd5 toxicitu srovnatelnou s volným CPT 184.

Reakce plic na liposomy

Liposomy A a B se hlavně akumulují v pulmonámí oblasti. Liposomy byly podávány intravenózně 1,2 mg.kg^-1. Volná CPT 184 byla podávána orálně v dávce 1,2 mg.kg’ v DMSO. Zvířatazdravé myši - byly utraceny 24 hodin po poslední dávce. Plíce byly z těla vyjmuty a zmrazený v kapalném dusíku. Po rozmražení byly zhomogenizovány ve směsi 0,1% kyseliny octové a ace30 tonitrilu v poměru 1 : 5. Homogenáty byly rozděleny na tři díly, z nichž ke dvěma byl pro výpočet výtěžku přidán CPT 184. Tři vzorky byly centrifugo vány při 16 000 G (tíhové zrychlení, 1 G - 9,81 m.s“²) po dobu 5 minut. Supematanty byly sebrány a extrahovány dichlormethanem. Organická fáze byla vysušena rychlým vakuováním a zbytek byl opětně rozpuštěn v takovém množství acetonitrilu, aby od jednoho zvířete vycházel objem 50 μΙ pro nástřik do HPLC. HPLC pracoval s náplní Waters Symmetry C 18, 3,5 pm (4,6 x 7,5 mm). Jako detektor byl použit fluorimetr Merck s excitací při 370 nm a emisí 510 nm. Elučním činidlem byla isokratická směs vody a acetonitrilu v poměru 60 : 40. Objem vzorku byl 50 μΐ. Výtěžek byl 70 % CPT 184. Oba liposo-29 CZ 302628 B6 my Λ i B poskytly vyšší hladinu akumulace CPT 184 než volný CPT 184 v DMSO, jak to znázorňuje obrázek 3.

Transfer genu

Příprava komplexu liposom - DNA

Liposom a plasmid DNA byly vhodně a odděleně zředěny v PBS. K líposomu byla potom přidána DNA a komplex liposom - DNA byl ponechán přibližně 30 minut pří 4 °C k usnadnění tvorby io stabilního komplexu liposom - DNA.

Při pokusech ín vitro byl použit jako referenční kationický lipid I,2-dioleoyloxy-3-trimethylamonium propan (DOTAP); na 2.10⁵ buněk HeLa bylo použito 2,5 pg plasmídu DNA a koncentrace líposomu byla 9 μΜ.

I 5

Při pokusech in vivo byly použity jako referenční kationické lipidy jak DOTAP, tak [2,3-(dioleoyl)propyl]trimethylamonium (DOTMA).

Molární poměry udávané ve výsledcích ukazují na nanomolární koncentrace odpovídajících kationických lipidů na mg DNA.

IJ in vivo pokusů s přenosem bylo použito 25 pg plasmídu DNA na jedno zvíře.

Plasmid pCMVIuc použitý v těchto pokusech obsahoval cDNA genu luciferázy za řízené trans25 kripce promotoru cytomegaloviru (CMV).

Kvantitativní stanovení účinků luciferázy

Účinky proteinové luciferázy v buňkách a tkáních byly stanoveny za použití soupravy Boehringer

3» Mannheim (č. kat. 1669 893).

Buňky byly třikrát promyty PBS a potom stěrkou z plotny setřeny do lyžujícího ústojného roztoku (lOOmM fosforečnan draselný, pH 7,8, 1 mM dithiothreitol - DTT) a podrobeny třem po sobě jdoucím cyklům zmrazení a tání. Po zcentrifugování v l,5ml Eppendorfových kyvetách byl pro luminiscenční zkoušku použit supematant, a to ne později než 5 hodin po extrakci proteinů. Měření emise luminiscence byla prováděna luminometrem při 562 nm. Po prvním zmrazení v kapalném dusíku následovaném jemným rozmělněním za účelem získání prášku byly tkáně resuspendovány v lyžujícím ústojném roztoku a inkubovány po dobu 10 až 15 minut na ledu.

Potom byly vzorky zcentrifugovány ve 2ml Eppendorfových kyvetách a supematant zkoušen na účinnost luciferázy.

Blotting analýza (dot-blot)

Buněčná DNA byla extrahována postupem alkalického lyžování popsaným Sanbrookem, Fritschem a Man iatisem v Molecular Cloning, 1989.

pg DNA extrahované z buněk bylo předběžně absorbováno na nylonových filtrech (Boehringer) za použití zařízení Biorad dot-blot. Filtry byly potom prehybridizovány po dobu 4 hodin při

65 °C roztokem obsahujícím 0,5M pyrofosforečnan sodný (NaPi), 1 mM EDTA a 7% SDS.

Vzorky značené ³²P (alfa) byly připraveny za použití plasmídu pCMVIuc DNA jako matrice a soupravou s náhodným uspořádáním Amersham (random primed Amersham). Filtr byl hybridizován ve stejném prehybridizačním ústojném roztoku po dobu 12 hodin při 42 °C za použití 1.10⁶ CPM.ml Potom byl filtr podroben třem desetiminutovým promytím při 65 °C v ústojném roz55 toku obsahujícím 40 mM NaPi a 1% SDS. Autoradiografická analýza byla provedena s pomocí

-30CZ 302628 B6 luminiscenčního zobrazení, které používá luminiscenčního stínítka aktivovaného beta zářením, na kterém se odečítá a kvantifikuje pomocí fotonásobičového systému ve spojení s programem zobrazovací analýzy. Densitometrie skvrn (dot-blot) byla provedena s použitím programu zobrazovací analýzy IP-LabGek

Zkoušky přenosu plasmidu DNA

Byl proveden velký počet zkoušek přenosu plasmidu DNA, a to jak in vitro, tak in vivo.

io Jako referenční kationické plasmidy byly použity jak DOTAP, tak DOTMA, jejichž přenosová kapacita byla bohatě charakterizována a popsána Abkenetem, et al., Proč. Nati, Acad. Sci. USA, 90, 6518, (1993). Při pokusech in vivo byly za účelem stanovení účinnosti kationických lipidů a odpovídajících nejúčinnějších koncentrací pro přenos genů analyzovány různé molámí poměry kationických lipidů ku plasmidům DNA. Schopnost přenosu různých liposomů byla hodnocena jak in vitro, tak in vivo za použití přenašeče genu luciferázy obsaženého v pCMVIuc plasmidu, jehož aktivita byla vyjádřená pro snadnou kvantifikaci v relativních luminiscenčních jednotkách (RLU) (popsaná již dříve).

Přenosová účinnost velkého počtu kationických liposomů byla alternativně vyhodnocena densito20 metrickou analýzou (luminiscenční obrazovka) vzorků DNA extrahovaných z přenesených buněk předem absorbovaných na nitrocelulózových filtrech (dot-blot) a hybridizovaných markéry plasmidu DNA značenými ^J3P, jak to již bylo popsáno dříve.

Zkoušky přenosu in vivo

Závislost účinnosti přenosu in vivo na molámím poměru liposomů ST 983 ku DNA

Při těchto pokusech byla hodnocena závislost účinnosti přenosu na játra, plíce a srdce na molárním poměru liposomů ST 983 ku plasmidu DNA. Zkoušeny byly tyto nanomolámí poměry lipo30 somu na pg DNA: 12 : 1, 24 : l, 36 : 1 a 48 : 1.

K intravenóznímu podání výše uvedených množství komplexů liposom- DNA o objemu 200 μΙ PBS byly použity skupiny myší o 6 zvířatech Balb/c o hmotnosti přibližně 20 g, které byty utraceny 24 hodin po podání komplexu.

Aktivita luciferázy extrahované z tkáně plic, srdce a jater ukázala na převažující distribuci luciferázy všech analyzovaných molámích poměrů do plic. Ve skutečnosti bylo přibližně 99 % celkové luciferázy extrahované ze tří druhů tkání obsaženo v plicích. Ukázalo se, že molární poměr liposomu ku DNA 12 ; 1 je nejlepší. Získané výsledky jsou uvedeny v následující tabulce 3.

Tabulka 3

Účinnost přenosu ST 983 in vivo jako funkce molárního poměru ST 983 ku DNA (pg DNA)

Liposom	střední RLU.mg'1 proteinu ± std. odch.	Molární poměr ST 983 : DNA
Játra	Plíce	Srdce
ST 983	2589±140	8818442±449529	28875±2593	12:1
	1310+385	2257856±280480	7091±249	24:1
	1035±347	301107±21503	8351+477	36:1
	1571+156	112747±5655	5251+489	48:1
Kontrolní	396±55	458+45	755+55
DOTMA	1352+226	3828742+161332	3363+123	12:1

s Závislost účinnosti přenosu in vivo na rozdílech mezi preparáty liposomů ST 983

Hodnoty účinnosti luciferázy extrahované z plic myší Balb/c, které intravenózně obdržely různé preparáty liposomů ST 983 při molárním poměru liposom : DNA 12 : 1 jako relativní jednotky luminiscence (RLU) jsou uvedeny v tabulce 4.

io

Vedle toho, že získané hodnoty představují schopnost liposomů ST 983 transportovat plasmid DNA in vivo s hodnocením účinnosti vyšším než a/nebo srovnatelným s hodnotami pro DOTMA, vykazují také určitý stupeň variability mezi různými preparáty ST 983. To může být zaviněno různými fyzikálně chemickými charakteristikami jako je velikost liposomových vehikulů nebo relativním poměrem těchto vehikulů ve vztahu k unilamelámí nebo multilamelámí struktuře různých preparátů ST 983. Ve skutečnosti byly výše uvedené fyzikálně chemické parametry bohatě popsány Mahatem, R. 1., et al., Human Gene Therapy, 9, 2083, (1998) jako determinanty k dosažení optimální účinnosti přenosu in vivo a in vitro.

- 32 CZ 302628 B6

Tabulka 4

Účinnost přenosu ST 983 in vivo (různé preparáty)

Liposom	střední RLU.mg'1 proteinu ± std. odch.	Molární poměr
	Plíce	ST 983 : DNA
ST 983/#72	3118235+184726	12:1
ST 983/#73	7285835±827067	12:1
ST 983/#4	1022117±60402	12:1
Kontrolní	1523+98
DOTMA	3410125+189520	12:1

Závislost účinnosti přenosu in vivo na preinkubační dobu liposomového komplexu ST 983 DNA io

Tabulka 5 uvádí jednotky relativní luminiscence extraktů z jater, plic a srdce myší, kterým byl intravenózně podáván liposom ST 983 předem inkubovaný s plasmidem DNA po dobu 30 minut nebo 3 hodin. Zvířata, kletým byl podáván ST 983 předem inkubovaný po dobu 3 hodin s DNA vykazoval přibližně pětinásobný vzrůst aktivity luciferázy v plicích a srdci v porovnání se zvířa15 ty, která obdržela stejný liposom předem inkubovaný po dobu 30 minut.

Tyto výsledky svědčí o tom, že tvorba stabilního komplexu liposom - DNA je časově závislým jevem a hraje kritickou úlohu jakožto určující prvek v účinnosti přenosu in vivo.

Tabulka 5

Účinnost přenosu ST 983 in vivo jako funkce doby pre inkubace systému liposom - DNA

Liposom Čas střední RLU.mg¹ proteinu ±std. odch. Molární poměr

Játra Plíce Srdce ST 983 : DNA

ST 983 30 3526±260 874882+65917 8118+263 12:1 min.

ST983 3 2497+682 4225656±211731 37100±1853 12:1 hod.

-33CZ 302628 B6

Přenos plasmidu ONA s liposomem ST 772 v HeLa buňkách

Obrázky l a 2 znázorňují účinnost přenosu plasmidu ONA líposomem ST 772 v HeLa buňkách. Za tímto účelem byla provedena densitometrická analýza DNA extrahované z buněk přenesených ST 272 a DOTAP jako referenčním kationickým lipidem. Výsledky analýzy skvrn ukazují na množství plasmidu ONA stejného řádu jaký byl získán s DOTAP.

Claims (27)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Estery L—karnitinu nebo alkanoyl L-karnttinú obecného vzorce

   H,C,

   H.C—N H,C^Z X

   O \ / > Z \

   Q O (I),

   O Rl

   O R2

   1/ _Vi!

   O kde:

   n je celé číslo od 1 do 3;

   R je vodík nebo alkanoyl, přímý nebo rozvětvený, se 2 až 6 uhlíkovými atomy;

   R, a Ri, které mohou být stejné nebo různé představují nasycené nebo nenasycené přímé acylové řetězce se 3 až 20 uhlíkovými atomy; a

   25 X je aniont farmakologicky přijatelné kyseliny, vybraný ze skupiny zahrnující chloridy, bromidy, jodidy, aspartáty, kyselé aspartáty, citráty, kyselé citráty, vínany, kyselé vínany, fosforečnany, kyselé fosforečnany, fumaráty, kyselé fumaráty, glycerofosfát, glukofosfát, mléčnany, maleináty, kyselé maleináty, mukat (ester kyseliny slizové), orotát, šťavelany, kyselé šťavelany, sírany, kyselé sírany, trichloracetát, trifluoracetát, methansulfonát, palmitany a kyselé palmitany.
2. 2. Sloučeniny podle nároku 1 obecného vzorce I, ve kterém R je vybrán ze skupiny sestávající z acetylu, propionylu, butyrylu, valerylu a isovalerylu,
3. 3. Sloučeniny podle nároku 1 obecného vzorce I, ve kterém R| a R₂jsou vybírány ze skupiny

   35 sestávající z hexanoylu, undekanoylu, myristoylu, palmitoylu nebo oleoylu.
4. 4. Sloučeniny podle nároku 1 vybrané ze skupiny obsahující:

   • ester L-karnitinbromidu s 2-hydroxyacetyl-L3-dipalmitoylglycerolem;

   40 · ester acetyl-L-karnitinbromidu s 2-hydroxyacetyl-l,3-dipalmitoyiglycerolem;

   • ester propionyl-L-kamitinbromidu s 2-hydroxyacetyl-l,3-dipalmitoylglycerolem;

   • ester isobutyryT-L karnitinbromidu s 2-hydroxyacetyl-l,3-dipalmitoylglycerolem;

   • ester isovaleryl--L-karnitinbromidu s 2 hydroxyaeetyl L3 dipalmitoylglyeerolem;

   - 34CZ 302628 B6 • ester L-kamitinbromidu s l,3-dihexanoyl-2-hydroxyacetylglycerolem;

   • ester acetyl-L-kamitinbromidu s 1,3-dihexanoyl-2-hydroxyacetylglycerolem;

   • ester propionyl-L-karnitinbromidu s 1,3-dihexanoyl-2-hydroxyacetylglycerolem.
5. 5 5, Použití sloučeniny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 k přípravě liposomu.
6. 6. Liposom, vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4.

   io
7. 7. Liposom podle nároku 6, v y z n a č u j í c í se t í m , že obsahuje dále pomocný lipid.
8. 8. Liposom podle nároku 7, vyznačující se tím, že jmenovaný pomocný lipid je vybrán ze skupiny sestávající z cholesterolu, l-palmitoyl-2-oleoylfosfatidylcholinu nebo dioleoylfbsfatidylcholinu.
9. 9. Použití liposomu podle kteréhokoliv z nároků 6 až 8 k přípravě přípravku vhodného pro transport farmakologicky účinných sloučenin.
10. 10. Použití podle nároku 9, kde farmakologicky účinnou sloučeninou je přirozeně se vyskytující 20 nebo upravený plasmid nebo póly nukleotid.
11. 11. Použití podle nároku 10, kde plasmid nebo polynukleotid je vhodný pro genovou terapii.
12. 12. Použití podle nároku 10, kde plasmid nebo polynukleotid kóduje peptid nebo protein, který 25 je vhodný jako vakcína.
13. 13. Použití podle nároku 9, kde farmakologicky účinnou sloučeninou je léčivo.
14. 14. Použití podle nároku 13, kde jmenované léčivo je vybráno ze skupiny sestávající z proti30 nádorových, antiangiogenních, protiv i rových, protibakteriálních látek, fungicidů, antiprotozoanů, sloučenin účinkujících na kardiovaskulární systém nebo imunogenních peptidů.
15. 15. Použití podle nároku 14, kde jmenovaným léčivem je proti nádorová nebo antiangiogenní látka.
16. 16. Použití podle nároku 15, vyznačující se tím, že protinádorové látka je vybrána ze skupiny sestávající z taxo lových nebo kam ptothec i nových derivátů.
17. 17. Použití podle nároku 16, kde jmenovaný derivát kamptothecinu je vybrán ze skupiny obsa40 hující:

    • 7-karbonitri lkám ptothec i n;

    • 7-benzyloxyiminomethylkamptothecin; a • 7-butoxyiminomethylkamptothecin.
18. 18. Použití liposomu podle nároků 6 až 8 k přípravě kosmetických přípravků.
19. 19. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje liposom podle nároků 6, 7 nebo 8.
20. 20. Farmaceutický přípravek podle nároku 19, vyznačující se tím, že liposom obsahuje farmakologicky účinnou sloučeninu.

    - 35 CZ 302628 B6
21. 21. Farmaceutický přípravek podle nároku 20, vyznačující se tím, že ťarmakologicky účinnou sloučeninou je přirozeně se vyskytující nebo upravený plasmid nebo polynukleotid.
22. 22. Farmaceutický přípravek podle nároku 21, vyznačující se tím, že plasmid nebo 5 nukleotid je vhodný pro genovou terapii.
23. 23. Farmaceutický přípravek podle nároku 21, vyznačující se tím, že plasmid nebo nukleotid kóduje peptid nebo protein, kterýje vhodný jako vakcína.

    io
24. 24. Kosmetický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje liposom podle kteréhokoliv z nároků 6 až 8.
25. 25. Kosmetický přípravek podle nároku 24, vyznačující se tím, že liposom obsahuje látku s kosmetickými účinky.
26. 26. Farmaceutický přípravek podle nároku 20, vyznačující se tím, že farmakologicky účinná sloučenina je vybrána ze skupiny sestávající z látek protinádorových, antiangiogenních, protivirových, protibakteriálníeh, fungicidů, antiprotozoanů nebo léčiv vhodných k terapii kardiovaskulárního systému nebo imunogenních peptidů.
27. 27. Přípravky podle nároků 19 až 26, vyznačující se tím, že jsou ve formě pro orální, parenterální, intravenózní, intramuskulámí, subkutánní, transdermální podávání nebo ve formě nosního nebo ústního spreje.