KR20010113794A - 약리학적으로 활성인 화합물의 세포 내 전달을 위한양이온성 지질로서 유용한 ｌ-카르니틴 또는 알카노일ｌ-카르니틴의 에스테르 - Google Patents
약리학적으로 활성인 화합물의 세포 내 전달을 위한양이온성 지질로서 유용한 ｌ-카르니틴 또는 알카노일ｌ-카르니틴의 에스테르 Download PDFInfo
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Abstract
약리 활성 화합물의 세포 내 전달을 위한 양이온성 지질로서 사용될 수 있는 L-카르니틴 및 알카노일 L-카르니틴의 에스테르들이 개시되어 있다. R 그룹들이 발명의 상세한 설명에 정의되어 있는 바와 같은 하기 화학식 I의 신규한 L-카르니틴 및 알카노일 L-카르니틴의 에스테르들이 또한 개시되어 있다:
화학식 I
Description
본 발명에서 “세포 내 전달”이 의미하는 것은 치료 활성(유전자 전달)을 부여하거나, 또는 약물 또는 면역원성 펩티드를 세포 내로 도입시키는, 천연 또는 변형된 폴리뉴클레오티드 또는 플라스미드에 의한 세포의 형질감염이다.
다수의 약리 활성 물질들, 예를 들어 폴리펩티드 및 단백질 또는 약물들은일반적으로 세포 내로 침투되어 세포 이하 또는 분자 수준으로 세포 기능에 영향을 미침으로써 효과를 발휘하는 것을 필요로 한다. 이들 분자에 대해서 세포막은 선택적으로 불 투과성인 차단 층을 구성한다. 실제로, 세포막은 잠재적으로 독성인 물질의 침입을 방지하는 보호 기능을 수행하지만, 또한 치료 활성인 화합물의 통과를 막기도 한다. 세포막의 복합적인 조성에는 인지질, 당지질 및 단백질이 포함되며; 그의 기능은 세포질 성분들, 예를 들어 Ca++및 다른 이온들, ATP, 미세섬유, 미세소관, 효소 및 Ca++와 결합하는 단백질에 의해 영향을 받는다. 세포의 구조와 세포질 성분들간의 상호작용 및 외부 신호에 대한 반응은 많은 상이한 세포 유형들에 의해 나타나는 선택성에 기여한다. 세포막의 차단 효과는 물질들을 천연 막 지질의 조성을 재현한 지질 제형과 복합적으로 결합시킴으로써 극복될 수 있다. 이러한 지질들은 막과 융합하고 상기와 결합된 물질들을 세포 내로 방출시킬 수 있다. 상기 지질 복합체는 막과의 융합에 의한 세포 내 전달을 촉진시킬 뿐만 아니라 또한 막과 세포 내로 침투해야 하는 분자간의 전하 척력을 감소시킬 수 있다. 양쪽성 지질, 예를 들어 막 인지질은 수성 시스템에서 지질 소낭 또는 리포솜을 형성한다.
리포솜은 수성의 일정 부피가 지질 분자, 대개는 인지질로 구성된 하나 이상의 막에 의해 완전히 둘러싸인 소낭이다. 친수성 헤드와 한 쌍의 탄소 쇄(소수성 테일)로 이루어진 인지질은 생물 막의 주요 성분이다. 수용액에서, 상기 소수성 테일은 자동적으로 협력하여 물을 차단하는 반면, 친수성 헤드는 매질과 상호작용하여 가변 직경의 소낭 집단을 자발적으로 형성한다. 상기 지질은 일반적으로는 쯔비터이온, 중성 또는 음이온성이다. 이들 소낭을 약물, 소 분자, 단백질, 뉴클레오티드 및 플라스미드의 운반자로서 사용할 수 있다.
최근 수년에 걸쳐, 합성 지질로부터 제조된 양으로 하전된 소낭 군을 유전 물질의 세포 내로의 전달에 광범위하게 사용하여 왔다. DNA의 음 전하는 양이온성 지질의 양 전하와 상호 작용하여 안정한 DNA-리포솜 복합체를 형성시킬 수 있다. 이러한 기술의 간편성과 융통성은 리포솜을 인간 대상에서의 유전자 요법을 위한 유전자의 전달에 중요한 비히클로 만들었다. 현재, 유전자 요법에 사용되고 NIH 재조합 자문 위원회에 의해 승인된 대부분의 벡터들은 바이러스성과 합성 시스템을 포함한다.
바이러스 감염은 특정한 세포를 공격하여 DNA를 핵 내로 운반할 수 있도록 하는 일련의 복잡한 기전을 수반한다. 유전자 요법에 바이러스 벡터를 사용하는 근본 원리는 바이러스 입자가 세포를 감염시킬 수 있는 능력을 제거하지 않으면서, 치료 기능을 암호화하는 유전자로 상기 바이러스 유전자를 대체할 수 있다는 가능성을 근거로 한다. 상기 바이러스 요법의 한계는 면역원성이고, 세포 병원성이며, 재조합성일 수 있는 바이러스 요소를 사용해야 한다는 것이다.
유전자 요법을 위해서 양이온성 지질의 사용에 큰 희망을 걸고 있다. 이들 벡터는 생물 기원의 것들에 비해 큰 잠재성을 갖는데, 그 이유는 이들이 훨씬 더 안전하고, 덜 독성이며, 또한 큰 크기의 유전자를 결합시킬 수 있기 때문이다. 그러나, 생물 유형의 벡터에 비해, 이들은 세포 내 유전자 전사 수율이 낮다.그러나, 이러한 형질감염 시스템의 사용은 초기 연구 단계에 있다는 것을 명심해야 한다. 양이온성 지질은 DNA-지질 복합체의 형성, 세포-복합체 상호 작용, 막과의 융합, 세포 내부의 DNA-방출 및 전사에서 매우 중요한 역할을 한다.
양이온성 리포솜의 생체 내 적용에 대해 중요한 예들이 존재한다. 유전자 요법에 대한 첫 번째 임상적 시험은 흑색종의 치료를 위한 인간 리포솜과 복합체를 이룬 HLA-B7 유전자를 함유하는 발현 벡터를 도입시킴으로써 수행하였다. 또 다른 중요한 적용은 상기 리포솜과 복합체를 이룬 발현 벡터 SV-40C-FTR의 폐 경로 또는 코 분무를 통한 투여에 의한 폐 낭성 섬유증의 치료에 관한 것이다. 암에 대한 유전자 요법에 리포솜의 사용을 수반하는 다른 임상적 시험들이 현재 진행중이다.
4 개의 구성 요소들은 일반적으로 양이온성 지질의 구조, 즉 양으로 하전된 양이온성 헤드, 스페이서, 앵커 지질 및 링커 결합으로 확인되었다.
양이온성 헤드는 양이온성 리포솜과 DNA, DNA-리포솜 복합체와 세포막, 및 세포의 다른 성분들간의 상호 작용에 기여한다. 상기는 가변적으로 치환될 수 있는 모노- 또는 폴리양이온성 그룹(전하의 수에 따라)으로 이루어진다.
스페이서는 상기 양이온성 헤드를 소수성 테일로부터 분리시키는 분자 부분으로, 상기 양이온성 헤드와 DNA 포스페이트의 음 전하 간에 최적의 접촉을 보장하는데 관여한다.
앵커 지질은 분자의 비-극성 탄화수소 부분으로, 이중 지질 층의 물리적 성질, 예를 들어 그의 강도 및 막 지질과의 교환율을 결정한다.
“링커 결합”이 의미하는 것은 상기 탄화수소 쇄와 분자의 나머지 부분간의 결합이다. 이 결합은 양이온성 지질의 화학 안정성과 생분해성을 결정한다.
최근 몇 년 동안, 리포솜은 화장료 분야에서 그 사용이 꾸준히 증가하여 왔다. 이 분야에서의 리포솜의 성공은 이들 화합물이 피부에 매우 관대히 허용된다는 점이다. 이들은 유효 성분에 대한 비히클 및 상기 유효성분의 흡수를 돕는 화합물 모두로서 사용된다.
리포솜의 제조와 용도에 대한 과학 및 특허 참고 문헌들이 풍부하지만, 유전자 전달에 유용한 카르니틴 유도체의 용도를 기술하는 참고문헌은 매우 적으며, 반면에 약물 전달에 대해서 본 발명에 따른 화합물을 조금이나마 닮은 화합물의 공지된 제조 기술들을 다루는 문헌들은 입수할 수가 없다.
특허 출원 EP 0 279 887에는 리포솜의 제조를 위한, 임의로 다른 인지질 및 지질(콜레스테롤, 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 세린)과 혼합된, 카르니틴의 유도체, 즉 포스파티딜 카르니틴의 용도가 개시되어 있다.
리포솜의 제조에 관하여 제공된 예 중에서, 고혈압 치료제, 협심증 치료제 및 부정맥 치료제로서 활성인 것으로 알려진 약물인 프로프라놀올을 포함하는 포스파티딜 카르니틴의 리포솜을 제조하는 것이 있다. 여기에서 상기 카르니틴 유도체는 카르니틴의 현저한 심근 향성 때문에 사용된다. 이러한 향성은 리포솜이 목적하는 표적 부위에 도달하기보다는 간에 의해 대사되는 것을 피할 수 있게 한다.
포스파티딜 카르니틴의 존재는 또한 리포솜을 경구로 투여할 수 있게 하는데, 그 이유는 상기가 장 리파제에 내성이기 때문이다.
문헌[J. Med. Chem. 1998, Jun 18; 41(13): 2207-15]에는 유전자 전달에 유용한 다수의 L-카르니틴의 에스테르들이 개시되어 있으나, 이들은 약물 전달에 유용한 약제로서 개시되거나 제안되지 않았다.
EP 559 625 B1에는 선택적인 위장관 근육 이완 활성이 부여된 다수의 L-카르니틴 및 아실 L-카르니틴의 에스테르들이 개시되어 있다.
최근 몇 년 동안, 분자 생물학자들은 인간 대상자에서 유전성 질환을 일으키는 염색체 수준의 다수의 결함들을 확인하였다.
현대 의학의 중요 분야는 유전자 요법 프로토콜의 사용에 의한 이들 유전적인 유전자에 의거한 질환들의 치료와 관련된다.
이미 언급한 바와 같이, 양이온성 리포솜은 약리 활성 화합물의 세포 내 전달에 광범위하게 사용되어, 막을 통한 수송을 용이하게 하거나 특정한 세포막 부위(수용체)와의 상호 작용을 촉진시킨다.
이들 벡터는 생물 기원의 것들에 비해 큰 잠재성을 갖는데, 그 이유는 이들이 훨씬 더 안전하고, 덜 독성이며, 또한 큰 크기의 유전자를 결합시킬 수 있기 때문이다. 그러나, 생물 유형의 벡터에 비해, 이들은 세포 내 유전자 전사 수율이 낮다.
더욱이, 통상적인 양이온성 지질에 의해 매개되는 유전자 전달은 플라스미드 DNA와 양이온성 지질을 분리시켜 유지할 것을 요하며, 이들의 혼합을 유전자 전달 직전에 수행할 것을 요한다.
이들 폴리뉴클레오티드 복합체의 안정화를 위한 시도들은 지금까지 장려된 결과를 얻는데 실패했으며; 실제로 이러한 시도들은 단지 단기간 동안의 안정성에 머문다.
따라서 유전자 요법 또는 유전자 전달 및 약물 전달 분야에서, 적합한 기간 후에도 또한 활성인 안정하고 재현 가능한 부위-특이적인 시스템에 대한 요구가 강하게 인식되고 있다.
본 발명은 L-카르니틴 및 아실 L-카르니틴의 신규 에스테르 군, 및 약리 활성 화합물의 세포 내 전달을 돕거나, 그의 막간(transmembrane) 이동을 촉진시키거나, 또는 특정한 세포막 부위(수용체)와의 상호작용을 촉진시키기에 적합한 양이온성 지질로서의 그의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기 언급한 신규 화합물과 동일한 목적에 유용한, L-카르니틴 및 아실 L-카르니틴의 추가로 공지된 에스테르에 관한 것이다.
본 발명에 이르러 약리 활성 화합물의 세포 내 전달의 촉진에 강력하게 활성인 양이온성 지질 군이 L-카르니틴 및 아실 L-카르니틴의 신규 에스테드들을 포함함을 발견하였다.
이들 신규 화합물은 표적 기관에 도달함에 있어서 부위-특이적이므로 안정하고 대단히 선택성이다.
이러한 특징은 이들 화합물을 상기 화합물들이 그의 약리 활성을 발휘할 수 있는 부위로 직접 수송하는데 특히 유용하게 만든다.
본 발명에 따른 화합물은 하기 화학식 I의 화합물이다:
상기 식에서,
n은 1 내지 3의 정수이고;
R은 수소, 또는 탄소수 2 내지 6의 직쇄 또는 분지된 알카노일이고;
R1및 R2는 동일하거나 상이할 수 있으며, 탄소수 3 내지 20의 포화되거나 불포화된 직쇄 아실을 나타내고;
X-는 약리학적으로 허용가능한 산의 음이온이다.
R의 예로는 아세틸, 프로피오닐, 부티릴, 발레릴 및 이소발레릴이 있다.
R1및 R2의 예로는 헥사노일, 운데카노일, 미리스토일, 팔미토일 또는 올레오일이 있다.
본 발명에 따른 화합물의 바람직한 예는
-2-하이드록시아세틸-1,3-디팔미토일 글리세롤을 갖는 L-카르니틴 브로마이드의 에스테르(ST770);
-2-하이드록시아세틸-1,3-디팔미토일 글리세롤을 갖는 아세틸 L-카르니틴 브로마이드의 에스테르(ST771);
-2-하이드록시아세틸-1,3-디팔미토일 글리세롤을 갖는 프로피오닐 L-카르니틴 브로마이드의 에스테르(ST772);
-2-하이드록시아세틸-1,3-디팔미토일 글리세롤을 갖는 이소부티릴 L-카르니틴 브로마이드의 에스테르(ST773);
-2-하이드록시아세틸-1,3-디팔미토일 글리세롤을 갖는 이소발레릴 L-카르니틴 브로마이드의 에스테르(ST774);
-1,3-디헥사노일-2-하이드록시아세틸 글리세롤을 갖는 L-카르니틴 브로마이드의 에스테르(ST810);
-1,3-디헥사노일-2-하이드록시아세틸 글리세롤을 갖는 아세틸 L-카르니틴 브로마이드의 에스테르(ST809);
-1,3-디헥사노일-2-하이드록시아세틸 글리세롤을 갖는 프로피오닐 L-카르니틴 브로마이드의 에스테르(ST808).
약리학적으로 허용가능한 산의 음이온이 의미하는 것은 불필요한 독성 또는 부작용을 발생시키지 않는 산의 임의의 음이온이다.
이들 산은 약리학자들 및 약학 기술 전문가들에게 널리 공지되어 있다.
이들 음이온의 예로는 비 제한적으로 클로라이드; 브로마이드; 요오다이드; 아스파테이트; 산 아스파테이트; 시트레이트; 산 시트레이트; 타르트레이트; 산 타르트레이트; 포스페이트; 산 포스페이트; 푸마레이트; 산 푸마레이트; 글리세로포스페이트; 글루코스 포스페이트; 락테이트; 말리에이트; 산 말리에이트; 뮤케이트;오로테이트; 옥살레이트; 산 옥살레이트; 설페이트; 산 설페이트; 트리클로로아세테이트; 트리플루오로아세테이트; 메탄 설포네이트; 파모에이트 및 산 파모에이트가 있다.
화학식 I의 화합물은 리포솜의 형태로 유전자 요법에 유용하거나, 또는 백신으로서 유용한 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 천연 또는 변형된 플라스미드 또는 뉴클레오티드의 전달과, 약물, 예를 들어 항암 약물, 항바이러스제, 항균제, 항진균제, 항원생동물제, 심근계 질환의 치료에 유용한 약물, 또는 면역원성 펩티드 또는 치료에 유용한 다른 약물들의 일반적인 전달 모두에 유용한 약제이다.
화학식 I의 화합물을 함유하는 리포솜은 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려진 통상적인 기술에 의해 제조한다(예를 들어 문헌[Allen T.M. Drugs 56, 747-56(1998)]을 참조하시오). 본 발명에 따른 리포솜을 또한 리포솜 기법의 실행에 널리 알려진 다른 성분들을 사용함으로써 제조할 수도 있다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 상기 리포솜은 헬퍼 지질(helper lipid, 이 용어는 당해 분야에서 널리 이해되고 있다)을 함유할 수도 있다. 헬퍼 지질의 예로는 콜레스테롤, 1-팔미토일-2-올레오일 포스파티딜 콜린 또는 디올레일 포스파티딜 콜린이 있다.
본 발명에 따른 리포솜은 조성물로서 적합하게 제공된다. 약리 활성 화합물의 전달에 관한 실시태양에서, 상기 조성물은 임의로 약학적으로 허용가능한 비히클 및/또는 부형제를 포함하는 약학 조성물로서 이해된다.
리포솜 형태의 화학식 I의 화합물은 또한 리포솜 자체를 미용 활성 성분으로서 포함하는 화장료 조성물의 제조와, 미용 활성을 갖는 물질, 예를 들어 수화제, 영양분, 훼이셜 클렌징 물질, 주름 방지제, 셀룰라이트 억제제 및 임신선 생성 방지제의 전달에 유용할 수 있다.
화학식 I의 화합물을 포함하는 리포솜을 경구 또는 비경구, 정맥내, 근육내, 피하, 경피, 또는 코 또는 구강 스프레이의 형태로 투여할 수 있다.
본 원에 개시된 발명은 또한 이미 다른 용도로 공지된(상기 언급한 EP 559 625) 화학식 II의 추가적인 양이온성 지질에 관한 것이다.
본 발명에 따라, 화학식 II의 화합물은 효능 있는 약물 전달 활성을 가지며 표적 기관에 도달함에 있어서 상기 개시된 화학식 I의 화합물에 필적할만한 안정성과 선택성의 특징을 제공하는 리포솜의 제조에 유용한 L-카르니틴의 에스테르이다. 동일한 유리한 성질들을 화장료의 경우에도 적용할 수 있다.
이들 화합물은 하기 화학식 II를 갖는다:
상기 식에서,
R3는 탄소수 4 내지 26의 포화되거나 불포화된 직쇄 또는 분지된 아실 쇄이고;
R4는 탄소수 4 내지 26의 포화되거나 불포화된 직쇄 또는 분지된 알킬 쇄이고;
X-는 약리학적으로 허용가능한 산의 음이온이다.
R3의 바람직한 예는 노나노일, 도데카노일, 미리스토일, 팔미토일, 스테아로일 또는 올레오일이다.
R4의 바람직한 예는 노닐, 운데실, 테트라데실, 헥사데실 또는 올레일이다.
본 발명에 따른 화학식 II의 구체적인 화합물의 예는 하기와 같다:
-팔미토일 L-카르니틴 클로라이드 운데실 에스테르(ST983);
-스테아로일 L-카르니틴 클로라이드 운데실 에스테르(ST1055);
-스테아로일 L-카르니틴 클로라이드 테트라데실 에스테르(ST1351);
-팔미토일 L-카르니틴 클로라이드 테트라데실 에스테르(ST1379);
-미리스토일 L-카르니틴 클로라이드 테트라데실 에스테르(ST1380);
-팔미토일 L-카르니틴 브로마이드 헥사데실 에스테르(ST1390);
-올레일 L-카르니틴 클로라이드 올레일 에스테르(ST1392).
다수의 화학식 II의 화합물들, 즉 ST1380, ST1390 및 ST1392는 치료 활성이 부여된 세포 형질 감염을 위한 리포솜의 제조에 유용한 약제로서 공지되어 있고 상기 인용된 문헌[J. Med. Chem. 1998, Jun 18;41(13):2207-15]에 개시되어 있으나, 약물 전달용 리포솜의 제조에 유용한 약제로서는 결코 개시되지 않았다.
약학 제형 분야의 평균적인 경험을 가진 숙련가는 리포솜-약물 복합체의 제조에서 접하게되는 어려움을 잘 알고 있으며; 실제로, 약물과 복합체를 이룰 수 있는 리포솜을 얻기 위해 극복해야 하며 상기 약물이 치유 활성을 발휘해야 하는 기관에 우선적으로 상기 약물을 전달해야 하는 다수의 문제점들로 인해 유전자 전달에 유용한 리포솜을 약물 전달에 사용할 수 있는지를 정하는 것은 불가능하다.
리포솜 형태의 화학식 II의 화합물은 약물, 예를 들어 항암제, 혈관형성 억제제, 항바이러스제, 항균제, 항진균제, 항원생동물제, 또는 심근 질환의 치료에 유용한 약물, 또는 면역원성 펩티드 및 치료에 유용한 다른 약물들의 전달에 유용한 약제이다.
리포솜 형태의 화학식 II의 화합물은 또한 미용 약제 자체로서 화장료 조성물의 제조, 또는 미용 활성을 갖는 물질, 예를 들어 수화제, 영양분, 훼이셜 클렌징 물질, 주름 방지제, 셀룰라이트 억제제 및 임신선 생성 방지제의 전달에도 유용할 수 있다.
상기 리포솜은 화학식 II의 화합물을 포함하는 리포솜의 경우에서와 같이 헬퍼 지질을 임의로 포함할 수도 있다.
화학식 II의 화합물을 포함하는 리포솜을 경구 또는 비경구, 정맥내, 근육내, 피하, 경피, 또는 코 또는 구강 스프레이의 형태로 투여할 수 있다.
본 원에 개시된 발명은 또한 이미 다른 용도로 공지된(상기 언급한 EP 559 625) 화학식 III의 추가적인 양이온성 지질에 관한 것이다.
본 발명에 따라, 화학식 III의 화합물은 효능 있는 약물 전달 활성을 가지며 표적 기관에 도달함에 있어서 상기 개시된 화학식 I의 화합물에 필적할만한 안정성과 선택성의 특징을 제공하는 리포솜의 제조에 유용한 L-카르니틴의 에스테르이다.
이들 화합물은 하기 화학식 III를 갖는다:
상기 식에서,
R5는 탄소수 4 내지 26의 포화되거나 불포화된 직쇄 또는 분지된 아실 쇄이고;
R6는 탄소수 4 내지 26의 포화되거나 불포화된 직쇄 또는 분지된 알킬 쇄이고;
X-는 약리학적으로 허용가능한 산의 음이온이나; 단
R5가 스테아로일일 때, R6는 스테아릴이 아니고,
R5가 올레오일일 때, R6는 스테아릴이 아니고,
R5가 팔미토일일 때, R6는 팔미틸이 아니고,
R5가 미리스토일일 때, R6는 미리스틸이 아니고,
R5가 라우로일일 때, R6는 라우릴이 아니고,
R5가 올레오일일 때, R6는 올레일이 아니다.
유전자 전달에 대해서만 제외된 리포솜 형태의 화합물이 문헌[J. Med. Chem. 1988, 41, 2207-2215]에 개시되어 있다.
R5의 바람직한 예는 노나노일, 도데카노일, 미리스토일, 팔미토일, 스테아로일 또는 올레오일이다.
R6의 바람직한 예는 노닐, 운데실, 테트라데실, 헥사데실 또는 올레일이다.
본 발명에 따른 화학식 III의 바람직한 화합물의 예는 하기와 같다:
-팔미토일 L-카르니틴 클로라이드 운데실 에스테르(ST983);
-스테아로일 L-카르니틴 클로라이드 운데실 에스테르(ST1055);
-스테아로일 L-카르니틴 클로라이드 테트라데실 에스테르(ST1351);
-팔미토일 L-카르니틴 클로라이드 테트라데실 에스테르(ST1379).
화학식 III의 화합물은 유전자 요법에 유용하거나, 또는 백신으로서 유용한 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 천연 또는 변형된 플라스미드 또는 뉴클레오티드의 전달에 유용한 약제이다.
화학식 III의 화합물을 경구 또는 비경구, 정맥내, 근육내, 피하, 경피, 또는 코 또는 구강 스프레이의 형태로 투여할 수 있다.
본 발명에 따른 화학식 I 화합물의 제조 과정을 하기 반응식으로 나타내며, 이 반응식을 전체 화학식 I에 적용시키고자 한다. 숙련가는 모든 필요 시약들을 상업적으로 입수할 수 있거나 또는 이들 시약이 문헌에 개시되어 있으므로, R, R1및 R2가 의미하는 모든 그룹들을 쉽게 수득할 수 있으며, 반응 조건들을 일반적으로 본 발명의 전체 범위에 적용할 수 있고, 경우에 따라 임의의 변경을 일반적인 상식 내에서 통상적으로 수행한다.
상기 반응식 1과 관련하여, 본 발명에 따른 화학식 I 화합물의 제조 방법을 하기에 예시한다.
실시예 1
2-하이드록시 아세틸 1,3-디팔미토일 글리세롤을 갖는 프로피오닐 L-카르니틴 브로마이드의 에스테르(ST772)의 제조
a)1,3-디하이드록시프로판-2온 1,3-디팔미테이트(1)의 제조
디하이드록시아세톤(7 g; 0.078 몰)을 0 ℃(외부 온도)에서 무수 클로로포름 300 ㎖에 무수 질소 기류 하에서 용해시켰다.
상기 수득된 용액에 팔미토일 클로라이드(44 g; 0.16 몰) 및 무수 피리딘(15 ㎖)을 적가하였다.
온도를 주변 온도로 만든 생성 혼합물을 24 시간 동안 교반 하에서 유지시켰다.
이어서 상기 혼합물을 하기의 순서로 추출하였다: 0.5% 염산 수용액 300 ㎖, 5% 중탄산 나트륨의 수용액 300 ㎖ 및 마지막으로 물 300 ㎖.
분리된 유기 상을 무수 황산 나트륨 상에서 탈수시키고, 셀룰로즈 필터 상에서 여과하고 농축 건조시켜 조 생성물(1)을 수득하였다.
순수한 생성물(1)을 에틸 알콜 500 ㎖로부터 결정화시켜 수득하였다.
생성물(1) 30.4 g을 수득하였다.
수율: 73%
융점: 80 내지 81 ℃
1HNMR(CDCl3): 0.9(6H, t,CH 3 CH2-); 1.3(48H, m, (CH2)n=24); 1.55(4H, m, -OCOCH2 CH 2 -); 2.4(4H, t, -OCOCH 2 -); 4.7(4H, s, -OCCH 2 -).
b) 1,2,3-트리하이드록시프로판-1,3-디팔미테이트(2)의 제조
물(7.5 ㎖)을 테트라하이드로푸란(125 ㎖)과 톨루엔(25 ㎖)에 용해시킨 생성물(1)(5 g, 9 밀리몰)에 교반하면서 서서히 가하였다.
수득된 유백색 현탁액의 온도를 5 ℃(외부 온도)로 만들고 붕수소화 나트륨(500 ㎎; 13 밀리몰)을 조금씩 나누어 가하였다. 상기 현탁액을 5 ℃에서 30 분간 교반하면서 유지시켰다.
이어서 빙초산을 과잉의 붕수소화 나트륨의 분해에 의해 생성된 거품이 멈출 때까지 서서히 가하여 최종적으로 용액을 수득하였다.
클로로포름(100 ㎖)을 상기 용액에 가하여 2상 시스템이 형성되었다.
CHCl3로 이루어진 하부의 유기 상을 분리시키고, 이를 하기의 순서로 추출하였다: 물(25 ㎖), 중탄산 나트륨(10% 수용액 25 ㎖) 및 물(25 ㎖).
(2)를 함유하는 유기 용액을 황산 나트륨 상에서 탈수시키고, 농축 건조시켜 왁스형 생성물을 수득하였다.
생성물(2)를 상기 왁스형 조 생성물의 아세톤 결정화에 의해 수득하였다.
생성물(2) 4.8 g을 수득하였다.
수율: 94%
융점: 71 내지 72 ℃
1HNMR(CDCl3): 0.9(6H, t,CH 3 CH2-); 1.3(48H, m, (CH 2 )n=24); 1.55(4H, m, -OCOCH2 CH 2 -); 2.4(4H, t, -OCOCH 2 -); 4.2(5H, m, -CHCH 2 O-).
c) 1,3-디팔미토일-2-브로모아세틸 글리세롤(3)의 제조
생성물(2)(2.5 g; 4.4 밀리몰)를 0 ℃(외부 온도)에서 교반하면서 무수 클로로포름(50 ㎖)에 용해시켰다.
상기 수득된 용액에 피리딘(0.42 ㎖)을 서서히 가하고 브로모아세틸클로라이드(0.43 ㎖; 5.2 밀리몰)를 함유하는 클로로포름 용액 3 ㎖을 적가하였다.
반응 혼합물을 0 ℃(외부 온도)에서 30 분간 유지시키고 주변 온도에서 30 분간 유지시켰다.
이어서 반응 혼합물을 하기의 순서로 처리하였다: 1% 염산의 수용액(대략 50 ㎖), 5% 중탄산 나트륨의 수용액(대략 50 ㎖) 및 물.
생성물(3)을 아세톤 결정화에 의해 정제하고, 그 후에 반응 혼합물을 탈수(황산 나트륨에 의해)시키고 농축 건조시켰다.
생성물(3) 2.5 g을 수득하였다.
수율: 89%
융점: 46 내지 47 ℃
1HNMR(CDCl3): 0.9(6H, t,CH 3 CH2-); 1.3(48H, m, (CH2)n=24); 1.55(4H, m, -OCOCH2 CH 2 -); 2.4(4H, t, -OCOCH 2 -); 3.9(2H, s, -OCH 2 COO-); 4.2-4.4(5H, m, -CHCH 2 O-); 5.25(1H, m, -CHCH2O-).
d) 2-하이드록시아세틸-1,3-디팔미토일글리세롤을 갖는 에스테르 L-프로피오닐 카르니틴 브로마이드(4)의 제조
40 ℃에서 미리 진공 건조시킨 L-프로피오닐 카르니틴 내염(0.95 g, 4.4 밀리몰)을 무수 디메틸포름아미드(대략 20 ㎖)에 현탁시켰다.
생성물(3)(3 g, 4.7 밀리몰)을 조금씩 나누어 상기 현탁액에 가하였다. 상기 현탁액을 38 ℃로 서서히 가열하고 용액이 수득될 때까지 상기 조건 하에서 유지시켰다.
10 분 후에, 상기 용액의 온도를 30 분간 0 ℃로 만들었다. 침전물이 수득되고, 이를 여과하고 에틸 에테르로 세척하고 클로로포름(100 ㎖)에 용해시켰다. 수득된 유백광 용액(30 ㎖)을 셀라이트 상에서 여과하고 농축시켰다. 이 용액에 헥산(100 ㎖)을 가하고 수득된 생성물(4)의 침전물을 여과하고 35 ℃에서 진공 건조시켰다.
표제 화합물 3.19 g을 수득하였다.
수율: 80%
융점: 127 내지 128 ℃
[α]25 D=-3.9(c=1% 클로로포름)
C47H88BrNO10에 대한 원소분석
계산치(%): C, 62.23; H, 9.78; N, 1.54; Br, 8.81
실측치(%): C, 62.73; H, 10.15; N, 0.79; Br, 8.77
1HNMR(CDCl3): 0.9-0.95(6H, t,CH 3 CH2CH2-); 1.1-1.2(3H, t,CH 3 CH2CO); 1.2-1.4(24H, m, CH2n=24); 1.5-1.6(4H, m, -OCCH2 CH 2 -); 2.3-2.4(4H, t, -OCCH 2 CH2-); 2.4-2.45(4H, d.d., -CHCH 2 O-); 2.95(2H, d, -CH 2 COOCH2COO-); 3.5(9H, s, N(CH3)3); 4.2(4H, m, -CH 2 OCOCH2-); 4.35(2H, m, -CH 2 N-); 4.65(2H, d,d, -OCH 2 CO-); 5.25(1H, m, -OCH2 CHCH2O-); 5.75(1H, m, -CHCH2N-).
실시예 2 내지 7
하기의 화합물들을 선행 실시예에서와 동일한 방식으로 제조하였다:
-2-하이드록시아세틸-1,3-디팔미토일 글리세롤을 갖는 L-카르니틴 브로마이드의 에스테르(ST770);
-2-하이드록시아세틸-1,3-디팔미토일 글리세롤을 갖는 아세틸 L-카르니틴 브로마이드의 에스테르(ST771);
-2-하이드록시아세틸-1,3-디팔미토일 글리세롤을 갖는 이소부티릴 L-카르니틴 브로마이드의 에스테르(ST773);
-2-하이드록시아세틸-1,3-디팔미토일 글리세롤을 갖는 이소발레릴 L-카르니틴 브로마이드의 에스테르(ST774);
-1,3-디헥사노일-2-하이드록시아세틸 글리세롤을 갖는 L-카르니틴 브로마이드의 에스테르(ST810);
-1,3-디헥사노일-2-하이드록시아세틸 글리세롤을 갖는 아세틸 L-카르니틴 브로마이드의 에스테르(ST809);
-1,3-디헥사노일-2-하이드록시아세틸 글리세롤을 갖는 프로피오닐 L-카르니틴 브로마이드의 에스테르(ST808).
본 발명의 하나의 바람직한 실시태양은 항암 약물을 갖는 리포솜, 및 특히 캠토테신에 대한 비히클로서 작용하는 리포솜의 제조이며, 이의 예가 WO 97/31003에 개시되어 있다. 보다 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 하기 화학식 IV의 캠토테신, 그의 N1-옥사이드, 단일 이성체, 특히 -C(R11)=N-O(n)R10그룹의 syn 및 anti 이성체, 그의 가능한 에난티오머, 디아스테레오머 및 관련 혼합물, 그의 약학적으로 허용가능한 염 및 그의 활성 대사산물의 전달을 위한 리포솜을 제공한다:
상기 식에서,
R7은 -C(R11)=N-O(n)R10그룹이고, 여기에서
R10은 수소, 또는 직쇄 또는 분지된 C1-C5알킬 또는 C1-C5알케닐 그룹, 또는 C3-C10사이클로알킬 그룹, 또는 직쇄 또는 분지된 (C3-C10) 사이클로알킬-(C1-C5) 알킬 그룹, 또는 C6-C14아릴, 또는 직쇄 또는 분지된 (C6-C14)아릴-(C1-C5) 알킬 그룹, 또는 헤테로사이클릭 또는 직쇄 또는 분지된 헤테로사이클릭-(C1-C5) 알킬 그룹이며, 이때 상기 헤테로사이클릭 그룹은 (C1-C5) 알킬 그룹에 의해 임의로 치환되며 질소 및/또는 산소 및/또는 황 원자 중에서 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 함유하고; 상기 알킬, 알케닐, 사이클로알킬, 아릴, 아릴-알킬, 헤테로사이클릭 또는 헤테로사이클로-알킬 그룹은 할로겐, 하이드록시, C1-C5알킬, C1-C5알콕시, 페닐, 시아노, 니트로, -NR12R13(여기에서 R12및 R13은 동일하거나 상이하게 수소, 직쇄 또는분지된 (C1-C5) 알킬이다), -COOH 그룹 또는 그의 약학적으로 허용가능한 에스테르; 및 -CONR14R15그룹(여기에서 R14및 R15는 동일하거나 상이하게 수소, 직쇄 또는 분지된 (C1-C5) 알킬이다) 중에서 선택된 다른 그룹들로 임의로 치환되거나;
R10은 할로겐, 하이드록시, 직쇄 또는 분지된 C1-C5알킬, 직쇄 또는 분지된 C1-C5알콕시, 페닐, 시아노, 니트로, -NR16R17(여기에서 R16및 R17은 동일하거나 상이하게 수소, 직쇄 또는 분지된 C1-C5알킬이다) 중에서 선택된 하나 이상의 그룹에 의해 임의로 치환된 C6-C10아로일 잔기이거나;
R10은 폴리아미노알킬 잔기이거나; 또는
R10은 글리코실 잔기이고;
n은 0 또는 1이고;
R11은 수소, 직쇄 또는 분지된 C1-C5알킬, 직쇄 또는 분지된 C1-C5알케닐, C3-C10사이클로알킬, 직쇄 또는 분지된 (C3-C10) 사이클로알킬-(C1-C5) 알킬, C6-C14아릴, 직쇄 또는 분지된 (C6-C14) 아릴-(C1-C5) 알킬이고;
R8및 R9는 동일하거나 상이하게 수소, 하이드록실, 직쇄 또는 분지된 C1-C5알콕시이다.
화학식 IV의 화합물은 1999년 3월 9일자로 출원된 유럽 특허 출원 제99830124.6에 개시되어 있다.
n이 1이고 R10이 아로일을 제외하고 상기 정의한 바와 같은 화학식 IV의 화합물에 대해서, 상기 화합물을 캠토테신 7-알데히드(화학식 IVa, R11수소) o 캠토테신 7-케토(화학식 IVa, R11수소 이외의 것)로부터 출발하여 제조할 수 있다:
상기 식에서,
R7은 -C(R11)=O 그룹이고, 여기에서 R11은 화학식 IV에서 정의한 바와 같고,
R8및 R9는 화학식 IV에서 정의한 바와 같다.
화학식 IVa의 화합물을 화학식 Va 화합물 R10O-NH2(여기에서 R10은 상기와 같다)와 반응시켜 R7이 -C(R11)=N-O-R10그룹이고, R10이 아로일을 제외하고 화학식 IV에서와 같이 정의되는 화학식 I의 화합물을 수득한다.
상기 반응을 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 통상적인 방법들을 사용하여 수행할 수 있으며, 이때 상기 방법은 통상적인 옥심 제조 방법이다. 바람직하게는 캠토테신 7-알데히드 o 7-케토 대 하이드록실아민의 몰 비는 1:3 내지 3:1의 범위이어야 한다. 관련된 하이드록실아민 염들도 또한 사용할 수 있다. 상기 반응을 염기, 예를 들어 탄산 칼륨과 같은 무기 염기, 또는 트리에틸아민 또는 디아자비사이클로노난과 같은 유기 염기의 존재 하에서 극성 용매, 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올을 사용하여 수행하며, 임의로 탈수제, 예를 들어 황산 나트륨 또는 마그네슘, 분자체의 존재 하에서 주변 온도 내지 용매의 비점 범위의 온도에서 수행한다. 경우에 따라, 상기 반응을 또한 촉매, 예를 들어 루이스 산의 존재 하에서 수행할 수도 있다.
한편으로, 상기 언급한 화합물들을 극성 용매, 예를 들어 테트라하이드로푸란 또는 알콜 중에서 염기, 예를 들어 수소화 나트륨 또는 탄산 칼륨의 존재 하에 캠토테신 7-알데히드의 옥심(문헌[Sawada et al Chem. Pharm. Bull. 39, 2574(1991)]에 개시된 바와 같이 수득함) 또는 7-케톤으로부터, 또는 R10-X 할라이드(여기에서 X는 바람직하게는 요오드이다)와의 반응에 의해 상응하는 7-아실캠토테신으로부터 제조할 수 있다.
화학식 IV에서 정의한 바와 같이 n이 1이고 R10이 아로일인 화학식 IV의 화합물에 대해서, 상기 화합물을 문헌[Cho et al., J. Org. Chem. 62, 2230(1997)]에 개시된 바와 같이 캠토테신 7-옥심(그의 제조 방법은 선행 단락에 개시되어 있다)으로부터 출발하여 R10-COCl 아실 클로라이드를 사용하여 극성 용매 중에서 염기, 바람직하게는 피리딘의 존재 하에서 또는 피리딘 중에서 직접 제조할 수 있다.
n이 0이고 R10이 아로일을 제외하고 상기 정의한 바와 같은 화학식 IV의 화합물에 대해서, 상기 화합물을 캠토테신 7-알데히드(화학식 IVa, R11수소) 또는 캠토테신 7-케토(화학식 IVa, R11수소 이외의 것)로부터 출발하여 제조할 수 있다:
화학식 IVa
상기 식에서,
R7은 -C(R11)=O 그룹이고, 여기에서 R11은 화학식 IV에서 정의한 바와 같고,
R8및 R9는 화학식 IV에서 정의한 바와 같다.
화학식 IVa의 화합물을 화학식 Vb 화합물 R10-NH2(여기에서 R10은 상기 정의한 바와 같다)와 반응시켜 화학식 IV의 화합물(이때 R7은 -C(R11)=N-R10그룹이고, R10은 아로일을 제외하고 화학식 IV에서와 같이 정의된다)을 수득한다. 상기 반응을 약학 기술 전문가들에게 공지된 통상적인 방법으로 수행할 수 있으며, 상기 방법은 통상적인 이민 제조 방법이다. 바람직하게는 캠토테신 7-알데히드 또는 7-케토 대이민의 몰 비는 1:3 내지 3:1의 범위이어야 한다. 관련된 아민 염들도 또한 사용할 수 있다. 상기 반응을 염기, 예를 들어 탄산 칼륨과 같은 무기 염기, 또는 트리에틸아민 또는 디아자비사이클로노난과 같은 유기 염기의 존재 하에서 극성 용매, 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올을 사용하여 수행하며, 임의로 탈수제, 예를 들어 황산 나트륨 또는 마그네슘, 분자체의 존재 하에서 주변 온도 내지 용매의 비점 범위의 온도에서 수행한다. 경우에 따라, 상기 반응을 또한 촉매, 예를 들어 루이스 산의 존재 하에서 수행할 수도 있다(예를 들어 문헌[Moretti and Torre, Synthesis, 1970, 141; 또는 Kobayashi et al, Synlett, 1977, 115]을 참조하시오).
캠토테신 7-알데히드 및 캠토테신 7-옥심은 유럽 특허 출원 EP 0056692 및 상기 인용된 문헌[Sawada et al, Chem. Pharm. Bull. 39, 2574(1991)]에 개시되어 있다.
화학식 IV 화합물의 N-옥사이드를 공지된 헤테로방향족 질소 산화 방법에 따라, 바람직하게는 아세트산 또는 트리플루오로아세트산 및 과산화 수소에 의한 산화, 또는 유기 과산소산과의 반응에 의해 제조한다(A. Albini and S. Pietra, Heterocyclic N-oxides, CRC, 1991).
상이한 화학식 V의 시약들 중에 존재하는 R10의 가변적인 의미에 대해서, 상기 시약들을 상업적으로 입수하거나, 또는 문헌으로부터 친숙한 방법들에 따라 제조할 수 있으며, 상기 분야의 숙련가는 상기 방법들을 주제에 대한 그 자신의 지식에 따라 보충하여 재분류할 수 있다.
약학적으로 허용가능한 염을 문헌에 개시된 통상적인 방법에 따라 수득하며, 추가로 개시할 필요는 없다.
실시예 8
7-벤질옥시이미노메틸캠토테신(CPT172)
7-포르밀캠토테신 500 ㎎(1.33 밀리몰)을 에탄올 100 ㎖에 용해시킨다. 피리딘 15 ㎖ 및 O-벤질하이드록실아민 하이드로클로라이드 638 ㎎(4 밀리몰)을 가한다. 상기 용액을 5 시간 동안 환류시킨다. 용매를 진공 증발시키고 수득된 잔사를 용출제로서 헥산/에틸 아세테이트의 4:6 혼합물을 사용하여 실리카 겔 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제시킨다.
수율: 65%
융점: 200 내지 205 ℃(분해)
수득된 생성물은 대략 8:2의 2 개의 syn 및 anti 이성체의 혼합물로 이루어진다(이성체 A: Rf 0.32; 이성체 B, Rf 0.19, Merck 60 F254 실리카겔 상에서; 용출제: 헥산:에틸 아세테이트 3:7).
HPLC: 레오다인 사출기(Rheodyne injector)(20 ㎕ 루프)를 갖는 4 급 펌프(HP 1050)와 HPLC-켐스테이션(ChemStation) 프로그램에 의해 실행되는 다이오드-배열 검출기(HP 1050)가 장착된 장치 상에서 분석을 수행하였다. 스펙트럼을 200 내지 600 nm에서 얻고 크로마토그램을 360 및 400 nm에서 기록하였다.
RP18 프리컬럼을 갖는 C18 역상 컬럼(Rainin C18; 25 x 0.4 ㎝, Varian)을사용하였다. 분석을 20 분간 아세토니트릴:물 30:70에서 출발하여 아세토니트릴 100%까지의 선형 용출 구배로 1㎖/분의 유속으로 수행하였다. 체류 시간은 이성체 B에 대해서 12.51 분이고 이성체 A에 대해서 14.48 분이었다.
1H-NMR(300 MHz; DMSO-d6): δ: 0.88(t, H3-18A+H3-18B), 1.87 8m, (H2-19A+H2-19B), 5.18(s, H2-5B), 5.21(8s, H2-Ph B), 5.30(H2-Ph A), 5.40(s, H2-5A), 5.45(s, H2-17A+H2-17B), 6.53(s, -OH A+ -OH B), 7.3-7.6(m, Ar A+ Ar B+ H-14A+H-14B), 7.75(m, H-11A+H-11B), 7.85-7.95(m, H-10A+H-10B), 7.98(dd, H-12B), 8.18-8.27(m, H-12A+H9-B), 8.45(s, CH=N B), 8.59(dd, H-9A), 9.38(s, CH=N A).
질량 m/z 481(M+100) 374(30) 330(70) 300(30) 273(20) 243(20) 91(34).
실시예 9
7-부톡시이미노메틸캠토테신(CPT 184)
7-포르밀캠토테신 400 ㎎(1.06 밀리몰)을 에탄올 80 ㎖에 용해시킨다. 피리딘 12 ㎖ 및 O-t-부틸하이드록실아민 하이드로클로라이드 400 ㎎(3.18 밀리몰)을 가한다. 상기 용액을 4 시간 동안 환류시킨다. 용매를 진공 증발시키고 수득된 잔사를 용출제로서 헥산/에틸 아세테이트의 4:6 혼합물을 사용하여 실리카 겔 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제시킨다.
황색 고체 322 ㎎(0.72 밀리몰)을 수득한다.
수율: 68%
융점: 250 ℃(분해)
수득된 생성물은 대략 8:2의 2 개의 syn 및 anti 이성체의 혼합물로 이루어진다(이성체 A: Rf 0.31; 이성체 B, Rf 0.24, Merck 60 F254 실리카겔 상에서; 용출제: 헥산:에틸 아세테이트 3:7).
HPLC: 레오다인 사출기(20 ㎕ 루프)를 갖는 4 급 펌프(HP 1050)와 HPLC-켐스테이션 프로그램에 의해 실행되는 다이오드-배열 검출기(HP 1050)가 장착된 장치 상에서 분석을 수행하였다. 스펙트럼을 200 내지 600 nm에서 얻고 크로마토그램을 360 및 400 nm에서 기록하였다.
RP18 프리컬럼을 갖는 C18 역상 컬럼(Rainin C18; 25 x 0.4 ㎝, Varian)을 사용하였다. 분석을 20 분간 아세토니트릴:물 30:70에서 출발하여 아세토니트릴 100%까지의 선형 용출 구배로 1㎖/분의 유속으로 수행하였다. 체류 시간은 이성체 B에 대해서 12.92 분이고 이성체 A에 대해서 14.61 분이었다.
1H-NMR(300 MHz; DMSO-d6): δ: 0.88(t, H3-18A+H3-18B), 1.30(s, t-but.B), 1.47(s, t-but.A), 1.87(m, H2-19A+H2-19B), 5.18(s, H2-5B), 5.37(H2-5A), 5.42(s, H2-17A+H2-17B), 6.54(s, -OH A+ -OH B), 7.35(s H-14A), 7.36(s, H-14B), 7.69-7.83(m, H-11A+H-11B), 7.85-7.98(m, H-10A+H-10B), 8.07(dd, H-9B), 8.16-8.27(m, H-9A+H-12B), 8.40(s, CH B), 8.62(dd, H-12A), 9.31(s, CH A).
질량 m/z 448(M+28) 391(40) 374(100) 362(40) 330(34) 57(17).
리포솜의 제조
본 발명에 따른 화합물을 사용하여 건조 분말 형태 및 수용액 중의 현탁액으로서 다층 리포솜(MLV)과 단층 리포솜(SUV)을 제조할 수 있다.
실시예 1 내지 7에 개시된 바와 같이 제조된 본 발명에 따른 화합물을 사용하여 하기 과정에 따라 리포솜을 제조한다. 적합한 양의 화합물을 클로로포름에 용해시키고; 상기 용액을 지질 막이 얻어질 때까지 회전 증발기에서 진공 농축 건조시킨다. 상기 지질 막을 용매의 마지막 잔량이 제거될 때까지 고 진공 하에서 건조시키고 이어서 3급-부틸 알콜 또는 물로 용해시킨다. 상기 수득된 용액을 동결 건조시켜 연질의 건조 분말을 수득한다.
상기 분말을 적합한 양의 수용액으로 수화시켜 사용된 화합물의 리포솜을 수득하고, 이어서 이를 폴리뉴클레오티드 또는 목적하는 약물과 복합체로 만든다.
또 다른 리포솜 제조 방법은 용매 중의 본 발명에 따른 화합물로 이루어진 지질 막을 적합한 불활성 지지체, 예를 들어 솔비톨, 만니톨 또는 다른 약리학적으로 허용가능한 탄수화물 상에 흡착시키는 것이다. 상기 혼합물을 진공 건조시켜 고체를 수득하며, 이를 사용 전에 용이하고 매우 빠르게 수화시킬 수 있다.
건조 분말 형태의 제제는 장기적으로 안정한 이점을 제공하며 사용하기 용이하다.
더욱 또한, 본 발명에 따른 화합물을 하기의 과정에 따라 사용하여 DNA 또는 목적하는 약물과 복합체를 이룬 건조 분말 형태의 리포솜을 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 화합물을 3급-부틸 알콜 또는 물로 용해시키고; 상기 수득된 용액을 DNA 또는 목적하는 약물과 혼합하고, 혼합물을 동결 건조시켜 연질의 건조 분말 형태의, 프로리포솜-DNA 또는 프로리포솜-약물이라 정의할 수 있는 복합체를 수득한다.
상기 수득된 분말(프로리포솜)을 약학 조성물의 제조에 사용할 수 있으며, 상기 조성물을 에어로졸을 통해 투여하거나, 또는 한편으로 물 또는 적합한 완충액으로 재조성하는 경우 비경구 또는 경구로 투여할 수 있다.
고체 형태의, DNA 또는 약물과 복합체를 이룬 리포솜을 또한 상기 개시된 방법에 의해 지질 막을 불활성 지지체, 예를 들어 솔비톨, 만니톨 또는 다른 탄수화물 상에 흡착시키는 방법으로 수득할 수 있다.
리포솜 형성에 대한 시험
리포솜 형성을 하기 과정에 따라 수용성 염료를 사용하여 비색법에 의해 시험하였다. 수용성 염료인 아르센아조 III의 수용액을 수득하였다(m.w.=776.37; 2.3 ㎎/㎖).
상기 용액을 물 대신에 사용하여 상기 언급한 제법으로부터 얻은 지질 막을 수화시켰다.
상기 염료를 둘러싼 리포솜을 함유하는 현탁액의 분액을 물로 100 배 희석하였다.
2 ㎖의 리포솜 현탁액을 사용하여 660 ㎚에서 첫 번째 흡광도를 판독하였으며; 블랭크로서 한정된 동등한 샘플에 관해서도 판독하였다. CaCl2용액(15 ㎎/㎖) 200 ㎕를 상기 첫 번째 샘플에 가하고, 블랭크에 대해서 660 ㎚에서 흡광도를 측정하고, 여기에 물 200 ㎕를 가하였다. 상기 얻어진 흡광도 값을 판독 2로서 나타내었다. 상기 샘플에 트리톤 X-100(5% v/v; 최종 농도 0.26%) 용액 100 ㎕를 가하고 블랭크에 물 200 ㎕를 가하였으며; 660 ㎚에서 판독한 흡광도를 판독 3으로 정의하였다. 캡슐화된 염료의 퍼센트를 계산하기 위해서, 하기 식을 사용하였다:
캡슐화된 염료%=(판독 3-판독 2)/판독 3 x 100
상기 캡슐화된 염료의 퍼센트는 리포솜 형성의 척도를 제공하며, 평균적으로 대략 40%이고; 리포솜 크기 검사를 레이저 광 산란을 사용하여 수행하여 양의 결과가 나왔다.
리포솜의 제조예
하기 형태들의 팔미토일 L-카르니틴 클로라이드 운데실 에스테르(ST983)의 리포솜의 제조:
a) 동결 건조 분말
팔미토일 L-카르니틴 클로라이드 운데실 에스테르 65 ㎎(0.11 밀리몰)을 100 ㎖의 플라스크에서 클로로포름 20 ㎖에 용해시켰다.
상기 용액을 지질 막이 얻어질 때까지 증발시키고 3 시간 동안 진공 건조시켰다. 상기 수득된 생성물을 3급-부틸 알콜에 용해시키고 상기 용액을 액체 질소로 -70 ℃로 급속히 냉각시키고 24 시간 동안 동결 건조시켰다.
스폰지형의 연질 백색 고체를 수득하였다.
b) 흡착 분말
팔미토일 L-카르니틴 클로라이드 운데실 에스테르 143 ㎎(0.231 밀리몰)을 클로로포름 10 ㎖에 용해시켰다. 상기 수득된 용액을 솔비톨 750 ㎎을 함유하는 100 ㎖의 플라스크에 조금씩 나누어 부었다. 다양한 분취량의 상기 클로로포름 용액의 첨가 종료시에 클로로포름을 급속히 증발시켰다.
상기 수득된 고체를 3 시간 동안 진공 건조시켰다.
백색 고체 생성물 893 ㎎을 수득하였다.
사용에 앞서, 상기 생성물을 적합한 분량의 물로 신속히 수화시켜 등장성 용액을 얻는다.
c) MLV 현탁액
팔미토일 L-카르니틴 클로라이드 운데실 에스테르 65 ㎎(0.11 밀리몰)을 100 ㎖의 플라스크에서 클로로포름 20 ㎖에 용해시켰다.
상기 수득된 용액을 지질 막이 얻어질 때까지 증발시키고 이어서 3 시간 동안 진공 건조시켰다.
상기 지질 막을 30 ℃에서 3 시간 동안 물 10 ㎖로 수화시켜 MLV 현탁액을 수득하였다.
적합하게 희석된 상기 MLV 현탁액을 폴리뉴클레오티드 또는 약물과 복합체로 만들어 생물학적 분석에 사용하였다.
e) SUV 현탁액
팔미토일 L-카르니틴 클로라이드 운데실 에스테르 65 ㎎(0.11 밀리몰)을 100㎖의 플라스크에서 클로로포름 20 ㎖에 용해시켰다.
상기 수득된 용액을 지질 막이 얻어질 때까지 증발시키고 이어서 3 시간 동안 진공 건조시켰다.
상기 지질 막을 30 ℃에서 3 시간 동안 물 10 ㎖로 수화시켜 MLV 현탁액을 수득하였다.
상기 MLV 현탁액을 기공 크기 200 ㎚의 폴리카보네이트 필터를 통해 10 회 압출시켰다. 상기 수득된 단 층 리포솜 현탁액을 폴리뉴클레오티드 또는 약물과 복합체로 만들고 생물학적 분석에 사용하였다.
f) 리포솜의 물리적 안정성에 대한 시험
리포솜 현탁액의 물리적 안정성을 30 일간 탁도 측정에 의해 시험하였다.
특정한 시간 간격으로 600 ㎚에서 시험할 각 현탁액에 대한 흡광도 측정을 수행하였다. 0 시간 째에 측정한 평균 흡광도 값은 시험된 모든 제형에 대해 일정하였다.
고려되는 분자들은 고려되는 기간에 걸쳐 순응적인 값들을 제공하였다.
MLV 및 SUV 리포솜 현탁액을 본 발명에 따른 화합물과 헬퍼 지질, 예를 들어 콜레스테롤, 1-팔미토일-2-올레오일 포스파티딜 콜린(POPC) 또는 디올레일 포스파티딜 콜린(DOPE)을 배합시킴으로써 제조할 수 있다.
상기 화합물을 보다 안정한 막을 갖는 리포솜을 수득하기 위해서 헬퍼 지질과 배합시킨다. 하기 리포솜의 제조를 개시하는 부분에서, 본 발명에 따른 화합물과 콜레스테롤 또는 POPC와 같은 헬퍼 지질을 배합하는 제조예를 제공한다.
약물 전달을 위한 리포솜의 제조예
실시예 10
탁솔-ST983 MLV 리포솜(1:40)의 제조
탁솔 20 ㎎(0.0234 밀리몰) 및 ST983 556 ㎎(0.9417 밀리몰)을 클로로포름 20 ㎖에 용해시켰다.
상기 용액을 지질 막이 유리 플라스크의 표면에 얻어질 때까지 농축시켰다.
진공 펌프의 도움으로 마지막 잔량의 클로로포름을 제거한 후에, 3급-부틸 알콜 20 ㎖을 상기 지질 막에 가하고, 상기 수득된 용액을 19 개의 분획으로 나누고, 이들을 액체 질소로 -70 ℃에서 즉시 냉동시키고 24 시간 동안 동결 건조시켰다. 각각의 고체 분획은 탁솔(1.05 ㎎) 및 ST983(29.2 ㎎)을 함유하였다.
최종 리포솜 현탁액을 수득하기 위해서, 상기 동결 건조된 생성물을 물(450 ㎕) 또는 다른 염수 용액으로 사용 시에 수화시키고, 10 분간 교반하고, 30 분간 방치시켜 팽윤(수화) 과정을 완료시켰다.
MLV 리포솜을 수득하였다.
제제의 물리적 안정성에 대한 시험
상기 제제의 물리적 안정성을 800 ㎚, 20 ℃에서 20 시간 동안 TDC(시간 구동 곡선)를 기록하면서 탁도 측정에 의해 시험하였다.
제제의 안정성을 가리키는 일정한 탁도 경향이 기록되었으며 침전 현상은 없었다.
제제 중의 탁솔의 화학적 안정성에 대한 시험
탁솔의 화학적 안정성을 HPLC에 의해 시험하였다.
크로마토그래피 조건은 하기와 같다:
컬럼: μ본다팩(Bondapack) C-18
용출제: 아세토니트릴:물 70:30
검출기 UV-VIS: 227 ㎚
유속: 1 ㎖/분
체류 시간: 4.5 분
기준에 대해 측정된 탁솔 농도는 2.13 ㎎/㎖이었다.
캡슐화된 탁솔의 퍼센트는 98%이었다.
실시예 11
탁솔-ST983 SUV 리포솜의 제조
탁솔 20 ㎎(0.0234 밀리몰) 및 ST983 556 ㎎(0.9417 밀리몰)을 클로로포름 20 ㎖에 용해시켰다.
상기 용액을 지질 막이 유리 플라스크의 표면에 얻어질 때까지 농축시켰다.
고-진공 펌프의 도움으로 마지막 잔량의 클로로포름을 제거한 후에, 3급-부틸 알콜 20 ㎖을 상기 지질 막에 가하고, 상기 수득된 용액을 19 개의 분획으로 나누고, 이들을 액체 질소로 -70 ℃에서 즉시 냉동시키고 24 시간 동안 동결 건조시켰다. 각각의 고체 분획은 탁솔(1.05 ㎎) 및 ST983(29.2 ㎎)을 함유하였다.
최종 SUV 리포솜 현탁액을 수득하기 위해서, 상기 동결 건조된 생성물을 PBS 용액(1 ㎖)으로 수화시키고 0 ℃에서 20 분간 초음파 처리하였다.
이어서 400 ㎚ 필터 상에서 여과를 수행하여 초음파기 탐침에 의해 방출된 티탄의 잔량을 제거하였다.
제제의 물리적 안정성에 대한 시험
상기 제제의 물리적 안정성을 800 ㎚, 20 ℃에서 20 시간 동안 TDC(시간 구동 곡선)를 기록하면서 탁도 측정에 의해 시험하였다.
제제의 안정성을 가리키는 일정한 탁도 경향이 기록되었으며 침전 현상은 없었다.
제제 중의 탁솔의 화학적 안정성에 대한 시험
탁솔의 화학적 안정성을 HPLC에 의해 시험하였다.
크로마토그래피 조건은 하기와 같다:
컬럼: μ본다팩 C-18
용출제: 아세토니트릴:물 70:30
검출기 UV-VIS: 227 ㎚
유속: 1 ㎖/분
체류 시간: 4.5 분
상기 SUV 리포솜 현탁액의 HPLC 분석은 상응하는 MLV 리포솜 현탁액과 동일한 결과를 낳았으며, 이 경우에도 역시 캡슐화된 탁솔의 퍼센트는 98%이었다.
24 시간 후에 반복된 HPLC 분석은 탁솔 피크 이외에 다른 새로운 피크가 없음을 보였으며, 이는 유효 성분의 안정성을 가리킨다.
실시예 12
탁솔-ST983-콜레스테롤 리포솜(1:15)의 제조
보다 안정한 막을 갖는 복합체를 수득하기 위해서 상기 유형의 리포솜을 제조하였다.
탁솔 6 ㎎(0.0101 밀리몰), ST983 62.2 ㎎(0.105 밀리몰) 및 콜레스테롤 40 ㎎을 클로로포름 10 ㎖에 용해시켰다.
상기 수득된 용액을 지질 막이 유리 플라스크의 표면에 얻어질 때까지 농축시켰다.
고-진공 펌프의 도움으로 마지막 잔량의 클로로포름을 제거한 후에, 3급-부틸 알콜 6.3 ㎖을 상기 지질 막에 가하고, 상기 수득된 용액을 5 개의 분획으로 나누고, 이들을 액체 질소로 -70 ℃에서 즉시 냉동시키고 24 시간 동안 동결 건조시켰다. 각각의 고체 분획은 탁솔(1.2 ㎎), ST983(12.44 ㎎) 및 콜레스테롤(8 ㎎)을 함유하였다.
최종 리포솜 현탁액을 수득하기 위해서, 상기 동결 건조된 생성물을 사용 시에 물(1000 ㎕) 또는 다른 염수 용액으로 수화시키고, 10 분간 교반하고, 30 분간 방치시켜 팽윤(수화) 과정을 완료시켰다.
MLV 리포솜을 수득하였다.
제제의 물리적 안정성에 대한 시험
상기 제제의 물리적 안정성을 800 ㎚, 20 ℃에서 6 시간 동안 TDC(시간 구동 곡선)를 기록하면서 탁도 측정에 의해 시험하였다.
제제의 안정성을 가리키는 일정한 탁도 경향이 기록되었으며 침전 현상은 없었다.
실시예 13
탁솔-ST772 SUV 리포솜(1:70)의 제조
탁솔 20 ㎎(0.0234 밀리몰) 및 ST772 1485 ㎎(1.638 밀리몰)을 클로로포름 20 ㎖에 용해시켰다.
상기 용액을 지질 막이 유리 플라스크의 표면에 얻어질 때까지 농축시켰다.
고-진공 펌프의 도움으로 마지막 잔량의 클로로포름을 제거한 후에, 3급-부틸 알콜 20 ㎖을 상기 지질 막에 가하였다. 등명한 용액을 수득하기 위해서, 상기를 60 ℃로 가열해야 했다. 상기 용액을 액체 질소로 -70 ℃에서 즉시 냉동시키고 24 시간 동안 동결 건조시켰다.
최종 SUV 리포솜 현탁액을 수득하기 위해서, 상기 동결 건조된 생성물을 PBS 용액(20 ㎖)으로 수화시키고 0 ℃에서 20 분간 초음파 처리하였다.
이어서 400 ㎚ 필터 상에서 여과를 수행하여 초음파기 탐침에 의해 방출된 티탄의 잔량을 제거하였다.
제제의 물리적 안정성에 대한 시험
상기 제제의 물리적 안정성을 800 ㎚, 20 ℃에서 6 시간 동안 TDC(시간 구동 곡선)를 기록하면서 탁도 측정에 의해 시험하였다.
제제의 안정성을 가리키는 일정한 탁도 경향이 기록되었으며 침전 현상은 없었다.
실시예 14
CPT83-ST983 MLV 리포솜(1:40)의 제조
CPT83(7-카보니트릴 캠토테신, WO 97/31003에 개시되어 있음) 6.3 ㎎(0.0168 밀리몰) 및 ST983 400 ㎎(0.667 밀리몰)을 클로로포름 20 ㎖에 용해시켰다.
상기 용액을 지질 막이 유리 플라스크의 표면에 얻어질 때까지 농축시켰다.
진공 펌프의 도움으로 마지막 잔량의 클로로포름을 제거한 후에, 3급-부틸 알콜 26 ㎖을 상기 지질 막에 가하고, 상기 수득된 용액을 12 개의 분획으로 나누고, 이들을 액체 질소로 -70 ℃에서 즉시 냉동시키고 24 시간 동안 동결 건조시켰다. 각각의 고체 분획은 CPT83(0.525 ㎎) 및 ST983(33.33 ㎎)을 함유하였다.
최종 리포솜 현탁액을 수득하기 위해서, 상기 동결 건조된 생성물을 사용 시에 물(1000 ㎕) 또는 다른 염수 용액으로 수화시키고 10 분간 교반하였다.
MLV 리포솜을 수득하였다.
제제의 물리적 안정성에 대한 시험
상기 제제의 물리적 안정성을 800 ㎚, 20 ℃에서 20 분간 TDC(시간 구동 곡선)를 기록하면서 탁도 측정에 의해 시험하였다.
제제의 안정성을 가리키는 일정한 탁도 경향이 기록되었으며 침전 현상은 없었다.
제제 중의 CPT83의 화학적 안정성에 대한 시험
CPT83의 화학적 안정성을 HPLC에 의해 시험하였다.
크로마토그래피 조건은 하기와 같다:
컬럼: 슈펠코실(Supelcosil) LC-ABZ
용출제: 인산염 완충제 20 mM:메탄올 40:60, pH=7.3
검출기 UV-VIS: 360 ㎚
유속: 1 ㎖/분
체류 시간: 4.033 분
기준에 대해 측정된 CPT83의 농도는 0.502 ㎎/㎖이었다.
캡슐화된 CPT83의 퍼센트는 99%이었다.
실시예 15
CPT83-ST983 SUV 리포솜(1:40)의 제조
CPT83 6.3 ㎎(0.0168 밀리몰) 및 ST983 400 ㎎(0.667 밀리몰)을 클로로포름 20 ㎖에 용해시켰다.
상기 용액을 지질 막이 유리 플라스크의 표면에 얻어질 때까지 농축시켰다.
고-진공 펌프의 도움으로 마지막 잔량의 클로로포름을 제거한 후에, 3급-부틸 알콜 26 ㎖을 상기 지질 막에 가하고, 상기 수득된 용액을 12 개의 분획으로 나누고, 이들을 액체 질소로 -70 ℃에서 즉시 냉동시키고 24 시간 동안 동결 건조시켰다. 각각의 고체 분획은 CPT83(0.525 ㎎) 및 ST983(33.33 ㎎)을 함유하였다.
최종 SUV 리포솜 현탁액을 수득하기 위해서, 상기 동결 건조된 생성물을 물(1000 ㎕)로 수화시키고 0 ℃에서 40 분간 초음파 처리하였다.
이어서 400 ㎚ 필터 상에서 여과를 수행하여 초음파기 탐침에 의해 방출된 티탄의 잔량을 제거하였다.
제제 중의 CPT83의 화학적 안정성에 대한 시험
CPT83의 화학적 안정성을 HPLC에 의해 시험하였다.
크로마토그래피 조건은 하기와 같다:
컬럼: 슈펠코실 LC-ABZ
용출제: 인산염 완충제 20 mM:메탄올 40:60, pH=7.3
검출기 UV-VIS: 360 ㎚
유속: 1 ㎖/분
체류 시간: 4.033 분
기준에 대해 측정된 CPT 83의 농도는 0.3 ㎎/㎖이었다.
캡슐화된 CPT83의 퍼센트는 59%이었다.
24 시간 후에 반복된 HPLC 분석은 CPT83 피크 이외에 다른 새로운 피크가 없음을 보였으며, 이는 유효 성분의 안정성을 가리킨다.
제제의 물리적 안정성에 대한 시험
상기 제제의 물리적 안정성을 600 ㎚, 20 ℃에서 20 시간 동안 TDC(시간 구동 곡선)를 기록하면서 탁도 측정에 의해 시험하였다.
제제의 안정성을 가리키는 일정한 탁도 경향이 기록되었으며 침전 현상은 없었다.
실시예 16
CPT184-ST983 MLV 리포솜(1:40)의 제조
CPT184 7.29 ㎎(0.0168 밀리몰) 및 ST983 400 ㎎(0.677 밀리몰)을 클로로포름 20 ㎖에 용해시켰다.
상기 용액을 지질 막이 유리 플라스크의 표면에 얻어질 때까지 농축시켰다.
진공 펌프의 도움으로 마지막 잔량의 클로로포름을 제거한 후에, 3급-부틸 알콜 26 ㎖을 상기 지질 막에 가하고, 상기 수득된 용액을 12 개의 분획으로 나누고, 이들을 액체 질소로 -70 ℃에서 즉시 냉동시키고 24 시간 동안 동결 건조시켰다. 각각의 고체 분획은 CPT184(0.607 ㎎) 및 ST983(33.33 ㎎)을 함유하였다.
최종 리포솜 현탁액을 수득하기 위해서, 상기 동결 건조된 생성물을 사용 시에 물(1000 ㎕) 또는 다른 염수 용액으로 수화시키고 10 분간 교반하였다.
MLV 리포솜을 수득하였다.
제제의 물리적 안정성에 대한 시험
상기 제제의 물리적 안정성을 600 ㎚, 20 ℃에서 20 시간 동안 TDC(시간 구동 곡선)를 기록하면서 탁도 측정에 의해 시험하였다.
제제의 안정성을 가리키는 일정한 탁도 경향이 기록되었으며 침전 현상은 없었다.
제제 중의 CPT184의 화학적 안정성에 대한 시험
CPT184의 화학적 안정성을 HPLC에 의해 시험하였다.
크로마토그래피 조건은 하기와 같다:
컬럼: 슈펠코실 LC-ABZ
용출제: 인산염 완충제 20 mM:메탄올 40:60, pH=7.3
검출기 UV-VIS: 360 ㎚
유속: 1 ㎖/분
체류 시간: 25.5 분
기준에 대해 측정된 CPT184의 농도는 0.600 ㎎/㎖이었다.
캡슐화된 CPT184의 퍼센트는 99%이었다.
실시예 17
CPT184-ST983 SUV 리포솜(1:40)의 제조
CPT184 7.29 ㎎(0.0168 밀리몰) 및 ST983 400 ㎎(0.667 밀리몰)을 클로로포름 20 ㎖에 용해시켰다.
상기 용액을 지질 막이 유리 플라스크의 표면에 얻어질 때까지 농축시켰다.
고-진공 펌프의 도움으로 마지막 잔량의 클로로포름을 제거한 후에, 3급-부틸 알콜 26 ㎖을 상기 지질 막에 가하고, 상기 수득된 용액을 12 개의 분획으로 나누고, 이들을 액체 질소로 -70 ℃에서 즉시 냉동시키고 24 시간 동안 동결 건조시켰다. 각각의 고체 분획은 CPT184(0.607 ㎎) 및 ST983(33.33 ㎎)을 함유하였다.
최종 SUV 리포솜 현탁액을 수득하기 위해서, 상기 동결 건조된 생성물을 물(1000 ㎕)로 수화시키고 0 ℃에서 40 분간 초음파 처리하였다.
이어서 400 ㎚ 필터 상에서 여과를 수행하여 초음파기 탐침에 의해 방출된 티탄의 잔량을 제거하였다.
제제 중의 CPT184의 화학적 안정성에 대한 시험
CPT184의 화학적 안정성을 HPLC에 의해 시험하였다.
크로마토그래피 조건은 하기와 같다:
컬럼: 슈펠코실 LC-ABZ
용출제: 인산염 완충제 20 mM:메탄올 40:60, pH=7.3
검출기 UV-VIS: 360 ㎚
유속: 1 ㎖/분
체류 시간: 25.5 분
기준에 대해 측정된 CPT184의 농도는 0.36 ㎎/㎖이었다.
캡슐화된 CPT184의 퍼센트는 70%이었다.
24 시간 후에 반복된 HPLC 분석은 CPT184 피크 이외에 다른 새로운 피크가 없음을 보였으며, 이는 유효 성분의 안정성을 가리킨다.
제제의 물리적 안정성에 대한 시험
상기 제제의 물리적 안정성을 600 ㎚, 20 ℃에서 20 시간 동안 TDC(시간 구동 곡선)를 기록하면서 탁도 측정에 의해 시험하였다.
제제의 안정성을 가리키는 일정한 탁도 경향이 기록되었으며 침전 현상은 없었다.
하기의 실시예들에서, 리포솜을 헬퍼 지질 및/또는 항냉동제를 사용하여 제조하였다.
실시예 18
CPT184-ST983 리포솜의 제조
2 ℓ 플라스크 중에서, 메틸클로로포름 100 ㎖을 CTP184 20 ㎎ 및 ST983 600 ㎎에 가하고 상기 혼합물을 완전히 용해될 때까지 가볍게 가온시켰다. 수득된용액을 지질 막이 얻어질 때까지 회전증발기 상에서 농축시키고, 이를 고 진공 펌프에서 2 시간 동안 추가로 건조시켰다. 상기 지질 막을 45 ℃에서 락토오즈 용액(6 g/물 300 ㎖)으로 수화시키고 약 2 시간 동안 회전 증발기에서 교반 하에 방치시켰다. 이어서 상기 현탁액을 2 시간 동안 초음파 처리하고, 각 주기를 30 분 동안 지속시켰다. 후속적으로, 생성물을 200 ㎚ 필터를 통해 여과하고 동결 건조시켰다.
제제 중의 CPT184의 화학 안정성에 대한 시험
CPT184의 화학 안정성을 HPLC에 의해 확인하였다. 생성물은 24 시간의 시험 기간 동안 안정하였다.
제제의 물리적 안정성에 대한 시험
제제의 물리적 안정성을 탁도 측정에 의해 시험하였다. 생성물은 24 시간의 시험 기간 전체를 통해 안정하였다. 입자 크기도 또한 안정하였다(평균 값 100 ㎚).
실시예 19
CPT184-ST983 리포솜의 제조
리포솜 제형(POPC - 1-팔미토일-2-올레오일 포스파티딜 콜린 5 mM; ST983 1.25 mM; CPT184 0.25 및 트레할로즈 150 mM) 1 ㎖에 대해서, 하기의 과정을 사용하였다:
CPT184 0.11 ㎎(0.25 μ몰)을 에틸 아세테이트 250 ㎕에 용해시키고, POPC 3.79 ㎎(4.89 μ몰)을 에탄올 100 ㎕에 용해시키고, ST983 0.74 ㎎(1.25 μ몰)을에탄올 100 ㎕에 용해시켰다. 상기 3 개의 용액들을 함께 혼합하고 와동시켰다. 용매를 실온, 80 밀리바에서 회전 증발기로 증발시켰다. 지질 막을 암실에서 2 시간 동안 건조시켰다. 상기 지질 막을 150 mM D(+)-트레할로즈 디하이드레이트(Fluka, HPLC 99%) 용액 1 ㎖에 현탁시키고, 0.22 ㎚ 필터를 통해 멸균시키고 2 분간 와동시켰다. 상기 현탁액을 200 ㎚ 폴리카보네이트 필터를 통해 21 회 압출시켰다. 상기 압출된 리포솜 현탁액을 액체 질소 중에서 냉동시키고 2 일 밤 동안 동결 건조시켰다. 백색 고체를 수득하였다.
실시예 20
CPT184-ST983 리포솜의 제조
트레할로즈 500 mM을 사용함을 제외하고 실시예 19와 동일한 과정을 사용하였다.
ST983 리포솜-항암제 복합체의 항암 활성
하기에서 알 수 있는 바와 같이, ST983 리포솜은 폐 수준에서 우세한 축적을 보였다. 이러한 특징적인 부위-특이성은 폐의 발암에 대한 쥐 모델에서의 상기 리포솜의 사용을 유리하게 하였다.
본 실험에 사용된 항암제는 탁솔이었다.
생체 내에서 종양을 유발시키기 위해서, 마취시키지 않은 Balb/c 마우스의 오른쪽 뒷발의 대퇴부 사두근에 RPMI-1640(Sigma) 0.1 ㎖ 중의 쥐 폐 암종 M109 3 x 105개의 세포를 주입하였다.
상기 종양 이식 후 10 일 째에 리포솜-탁솔 복합체를 인산염 완충된 염수 용액(PBS, SIGMA, P-4417)으로 희석하고 ST983 2.5 ㎎/㎖ 및 탁솔 75 ㎍/㎖의 농도로 정맥내 주입하였다.
대조용으로서 사용된 탁솔(패클리탁셀 INDENA)을 크레모포어 비히클 EL(BASF)에 20 ㎎/㎖의 농도로 용해시키고 다음 24 시간 동안 +4 ℃에서 보관하고, 빛을 차단시켰다. 사용 시에, 상기를 인산염 완충된 염수 용액(PBS, SIGMA)으로 희석하고 ST983 리포솜에 의해 수송되는 탁솔에 대해 개시된 바와 동일한 부피 및 농도 조건으로 정맥내 주입하였다.
크레모포어는 에틸 알콜로 1:1로 희석시켜 제조하였다.
상기 종양 접종 후 10 일 째에 출발하여 연속해서 7 일간 투여하였다. 동물들을 접종 후 17 일까지 계속 관찰하고 경부 탈구에 의해 죽이고, 그들의 폐를 전이 수를 측정하기 위해서 회수하였다. 전이를 탐지하기 위해서 상기 폐들을 10 일간 피크르산 포화 용액 71%, 빙초산(Merck) 4.8% 및 10% 포름알데히드(Fluka) 24%로 이루어진 뷰인액 5 ㎖ 중에서 배양시킴으로써 염색시켰다. 상기 뷰인액 중에서의 배양 기간의 끝에서, 전이의 수를 세었다.
비 처리된 대조용 마우스에 비해, 상기 크레모포어-수송된 탁솔은 폐 전이 수에 대해 감소 효과를 보이지 않았지만 상기 비 처리된 대조 군에 비해 그 크기가 보다 작었으며, 반면에 ST983 리포솜과 복합체를 이룬 탁솔은 폐 전이의 수 및 크기 모두에 있어서 현저한 감소를 보였다.
폐 전이 수에 대한 데이터의 통계학적 분석을 쌍을 이루지 않은 데이터에 대해서 만-휘트니 비-파라메트릭 시험을 사용하여 수행하였다.
얻어진 결과들을 하기 표 1에 나타낸다.
생체 외 세포독성 시험
독성 분석을 96-웰 플레이트에서 HeLa 및 M109 세포에 대해 수행하였다. 도말한 다음날, 세포들을 다음 48 시간 동안 시험할 분자로 처리하였다. 이어서 상기 세포들을 PBS로 세척하고 48 시간 동안 전형적인 성장 조건 하에서 방치시켰다. 성장 배지를 제거한 후에, 세포들을 16% TCA와 함께 얼음 상에서 배양하고, H2O로 3 회 세척하고, 1% 아세트산 중의 설포르호다민 B(SRB)로 30 분간 처리하고, 1% 아세트산 단독으로 3 회 세척하고, 트리스 10 mM(pH 10.5) 중에서 20 분간 배양하고, 마지막으로 540 ㎚에서 판독하였다.
CPT83에 의한 세포독성 시험
생체 외에서 CPT83에 의한 세포독성 시험을 유효 활성의 예비적인 표시로서리포솜과 복합체를 이룬 항암제의 세포독성을 평가하기 위해서 수행하였다.
생체 외에서 M109 세포에서 CPT83을 수송하는 상기 리포솜의 능력을 평가하기 위해서, 상기 개시된 설포르호다민 B를 사용하였다.
또한, 디메틸설폭사이드(DMSO)에 용해된 CPT83의 세포독성을 또한 ST983 리포솜과 복합체를 이룬 동일 분자의 것과 비교하여 평가하였다.
상기 리포솜-CPT83 복합체를 SUV 및 MLV 형태 모두에서 하기 표 2.1, 2.2 및 3.3에 나타낸 농도로 세포독성 분석에 사용하였다. 사용된 리포솜:CPT83의 몰비는 40:1이었다.
하기 표 2.1, 2.2 및 2.3에 나타낸 SUV 및 MLV 형태 모두에서의 ST983-CPT83 복합체의 평균적인 세포독성 값은 상기 ST983 리포솜이 DMSO와 훨씬 더 동일한 방식으로 CPT83을 수송할 수 있으며, 이는 동일한 정도의 세포독성 수준을 제공함을 가리킨다.
ST983 리포솜-CPT184 복합체의 생물 활성
실시예 18의 리포솜(하기에 리포솜 A라 명명함) 및 실시예 20의 리포솜(하기에 리포솜 B라 명명함)의 생물 활성을 시험하였다.
건강한 마우스에서의 독성
리포솜 A 및 B를 유리 CPT184와 비교하여 q4dx4 안에 따라 1.2 ㎎/㎏의 용량으로 경구, 정맥 내 제공하였다. 상기 2 개의 리포솜은 체중, 폐, 비장 및 신장에 대해 현저한 효과를 나타내지 않았다. 정맥 내 제공된 리포솜 B 및 경구 제공된 리포솜 A는 유리 CPT184와 유사하게 흉선 중량에 영향을 미쳤다. 정맥 내 제공된 리포솜 A는 단지 최소의 효과만을 가졌다. 혈액학적 변수들은 24 시간 후에 상기 두 리포솜에 의해서 현저한 변화를 나타내지 않았다. qd5 안에 따라 정맥 내 제공된 리포솜 A는 유리 CPT184에 필적할만한 독성을 나타내었다.
리포솜의 폐 향성
리포솜 A 및 B는 폐 수준에서 우세한 축적을 보였다. 상기 리포솜들을 정맥 내로 1.2 ㎎/㎏으로 제공하였다. 유리 CPT184를 DMSO 중에서 경구로 1.2 ㎎/㎏으로 제공하였다. 건강한 마우스를 최종 투여 후 24 시간째에 죽였다. 상기 시체로부터 폐를 절제하여 액체 질소 중에서 냉동시켰다. 일단 해동되면, 기관들을 모아 0.1% 아세트산/아세토니트릴 1:5 중에서 균질화시켰다. 균질물을 3 개의 분액으로 나누고, 회수율을 추정하기 위해서 이들 중 2 개에 CPT184를 가하였다. 3 개의 샘플을 5 분간 16,000 g에서 원심분리시켰다. 상등액을 모으고 디클로로포름으로 추출하였다. 유기 상을 스피드백(speedvac)으로 건조시키고 HPLC에 걸기 위해서 50 ㎕ 중에 한 마리의 동물에 해당하는 양을 갖도록 아세토니트릴에 잔사를 재 용해시켰다. HPLC를 워터스 시메트리(Waters Symmetry) C18 3.5 ㎛(4.6 x 7.5 ㎜) 상에서 실시하였다. 머크(Merck) 형광측정계로 370 ㎚에서 여기를, 510 ㎚에서 방출을 검출하였다. 용출제는 균등하게 물/아세토니트릴 60:40이었다. 샘플 부피는 50 ㎕이었다. CPT184의 회수율은 약 70%이었다. 리포솜 A와 B 모두 도 3에 나타낸 바와 같이 DMSO 중의 유리CPT184보다 큰 CPT184 축적 수준을 제공하였다.
유전자 전달
리포솜-DNA 복합체의 제조
리포솜과 플라스미드 DNA를 별도로 PBS로 적합하게 희석하였다. 이어서 상기 DNA를 상기 리포솜에 가하고 상기 리포솜-DNA 복합체를 4 ℃에서 대략 30 분간 방치시켜 안정한 리포솜-DNA 상호 작용의 형성을 촉진시켰다.
생체 외 실험에서, 1,2-디올레오일옥시-3-트리메틸암모늄 프로판(DOTAP)을 기준 양이온성 지질로 사용하였으며; 플라스미드 DNA 2.5 ㎍을 2 x 105HeLa 세포 당 사용하였으며, 리포솜 농도는 9 μM이었다.
생체 내 실험에서, DOTAP 및 [2,3-(디올레오일)프로필] 트리메틸암모늄(DOTMA)을 기준 양이온성 지질로서 사용하였다.
결과 중에 한정된 몰비는 DNA ㎎ 당 각각의 양이온성 지질의 nmol 농도를 지칭하는 것이다.
생체 내 형질 감염 실험에서, 동물 당 플라스미드 DNA 25 ㎍을 사용하였다.
이들 실험에 사용된 플라스미드 pCMVluc는 세포확대바이러스(CMV) 프로모터의 전사 조절 하의 루시페라제 유전자의 cDNA를 함유하였다.
루시페라제 활성의 정량적 측정
세포 및 조직에서의 단백질 루시페라제 활성을 베링거 만하임 키트(카탈로그 번호 1669 893)를 사용하여 측정하였다.
세포를 PBS로 3 회 세척하고 이어서 용균 완충액(100 mM 인산 칼륨 pH 7.8, 1 mM 디티오쓰레이톨-DTT) 중에서 스크래퍼를 사용하여 플레이트로부터 제거하여 3 회의 연속적인 냉동 및 해동 주기를 가하였다. 1.5 ㎖의 에펜도르프 튜브에서 원심분리시킨 후에, 상등액을 단백질 추출 후 5 시간 이내에 발광 시험에 사용하였다. 발광 방출 측정은 발광계를 사용하여 562 ㎚에서 수행하였다. 액체 N2중에서 처음 냉동시킨 다음 미분시켜 분말을 수득한 후에, 조직을 용균 완충액에 재 현탁시키고 얼음 중에서 10 내지 15 분간 배양시켰다.
이어서 샘플을 2 ㎖ 에펜도르프 튜브에서 원심분리시키고 상등액을 루시페라제 활성에 대해 시험하였다.
도트-블럿 분석
세포 DNA를 문헌[Sanbrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning, 1989]에 개시된 알칼리 용균 과정에 따라 추출하였다.
세포로부터 추출된 DNA 5 ㎍을 바이오래드 도트-블럿 어플라이언스(Biorad dot-blot appliance)를 사용하여 나일론 필터(베링거) 상에 예비 흡수시켰다. 이어서 상기 필터를 65 ℃에서 4 시간 동안 피로인산 나트륨(NaPi) 0.5 M, 1 mM EDTA, 7% SDS를 함유하는 용액과 예비 하이브리드화시켰다.32P(알파)로 표지된 탐침을 주형으로서 플라스미드 pCMVluc DNA와 랜덤하게 프라임 처리된 에머샴 키트(Amersham Kit)를 사용하여 제조하였다. 상기 필터를 1 x 106CPM/㎖을 사용하여 42 ℃에서 12 시간 동안 동일한 예비 하이브리드화 완충액에서 하이브리드화시켰다. 이어서 상기 필터를 40 mM NaPi, 1% SDS 함유 완충액으로 65 ℃에서 3 회 10 분 세척하였다. 상 분석 프로그램과 함께 광배율기 시스템에 의해 판독되고 정량화되는 베타 조사에 의해 활성화되는 인 스크린을 사용하는 인 영상기의 도움으로 자동 방사능 사진 분석을 수행하였다. 도트 블럿 상에서 수행된 광 농도 측정을 IP-LabGel 상 분석 프로그램을 사용하여 수행하였다.
플라스미드 DNA 형질 감염 시험
다수의 플라스미드 DNA 형질 감염 시험을 생체 외 및 생체 내 모두에서 수행하였다.
DOTAP 및 DOTMA를 모두 기준 양이온성 지질로서 사용하였으며, 그의 형질 감염 능력은 문헌[Abkenet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90, 6518]에 충분히 특성화되고 개시되어 있다. 생체 내 실험에서, 상기 양이온성 지질의 활성과 유전자 전달에 가장 효율적인 각각의 농도들을 측정하기 위해서 상기 양이온성 지질 대 플라스미드 DNA의 여러 상이한 몰 비를 분석하였다. 여러 리포솜들의 형질 감염 능력을 pCMVluc 플라스미드 중에 함유된 루시페라제 유전자 수송자를 사용하여 생체 외 및 생체 내 모두에서 평가하고, 용이한 정량분석을 위해서 그의 활성을 상대적인 형광 단위(RLU)(이전에 개시되었음)의 항으로 나타내었다.
한편으로, 다수의 양이온성 리포솜들의 형질 감염 효율을 니트로셀룰로즈 필터 상에 예비 흡수시킨 형질 감염된 세포로부터 추출된 DNA 샘플(도트-블럿)의 광 밀도 측정 분석(인 영상기)에 의해 평가하고 상기 개시한 바와 같이32P-표지된 플라스미드 DNA 마커와 하이브리드화시켰다.
생체 내 형질 감염 시험
ST983 리포솜:DNA 몰 비에 대한 생체 내 형질 감염 효율 의존성
본 실험에서, ST983 리포솜:플라스미드 DNA 몰비에 대한 간, 폐 및 심장 형질 감염 효율 의존성을 평가하였다. 하기의 DNA ㎍ 당 리포솜의 nmol 비를 시험하였다: 12:1, 24:1, 36:1 및 48:1.
체중이 대략 20 g인 6 마리의 Balb/c 마우스 그룹들을 PBS 200 ㎕ 부피 중의 상기 언급한 양의 리포솜-DNA 복합체로 정맥 내로 처리하고 상기 복합체 투여 후 24 시간 째에 죽였다.
상기 폐, 심장 및 간 조직으로부터 추출한 루시페라제 활성은 분석된 모든 몰 비에서 루시페라제의 우세한 폐 분포를 드러내었다. 실제로, 상기 3 개의 조직들로부터 추출된 전체 루시페라제의 대략 99%가 폐에 위치하였다. 12:1의 리포솜:DNA 몰 비가 최상인 것으로 입증되었다. 얻은 결과를 하기 표 3에 나타낸다.
SRT983 리포솜 제제들 간의 차이에 대한 생체 내 형질 감염 효율 의존성
12:1의 리포솜:DNA 몰 비에서 상이한 ST983 리포솜 제제들을 정맥 내로 처리한 Balb/c 마우스의 폐로부터 추출된 루시페라제 활성 값(상대 발광 유니트, RLU)을 표 4에 나타낸다.
DOTMA보다 높고/높거나 필적할만한 효율 등급을 갖는 데이터는 ST983 리포솜이 생체 내에서 플라스미드 DNAI을 수송할 수 있음을 입증하는 것 이외에, 또한 상이한 ST983 제제들 간의 변화 정도를 나타낸다. 이는 다수의 물리화학적 특징들, 예를 들어 리포솜 소낭들의 크기, 또는 상이한 ST983 제제들의 단층(SUV) 또는 다층 구조와 관련된 상기 소낭들의 상대적인 비율에 기인할 수 있다. 사실상, 상기 열거된 물리화학적 변수들은 문헌[R.I. Mahato et al., Human Gene Therapy9. 1998:2083]에 최적의 생체 내 및 생체 외 형질 감염 효율을 성취하기 위한 결정자로서 충분히 개시되어 있다.
ST983-DNA 리포솜 복합체 예비 배양 시간에 대한 생체 내 형질 감염 효율 의존성
표 5는 플라스미드 DNA와 30 분 동안 또는 투여 전 3 시간 동안 예비 배양시킨 ST983 리포솜을 정맥 내로 처리한 마우스의 간, 폐 및 심장으로부터 추출된 상대 발광 단위를 나타낸다. DNA와 3 시간 동안 예비 배양시킨 ST983으로 처리된 동물들은 30 분간 예비 배양시킨 동일한 리포솜으로 처리된 동물들에 비해 폐 및 심장에서 대략 5 배의 루시페라제 활성 증가를 보인다. 이러한 결과는 안정한 리포솜-DNA 복합체의 형성이 시간 의존적인 현상이며 생체 내 형질 감염 효율의 결정자로서 중요한 역할을 함을 암시한다.
ST772 리포솜에 의한 HeLa 세포에서의 플라스미드 DNA 형질 감염
도 1 및 2는 HeLa 세포에서의 ST772 리포솜의 플라스미드 DNA 형질 감염 효율을 나타낸다. 이를 위해서, 기준 양이온성 지질로서 ST272 및 DOTAP로 형질 감염시킨 세포로부터 추출된 DNA에 대한 광 밀도 측정 분석을 수행하였다. 상기 블럿 분석의 결과는 DOTAP에 의해 수득된 정도와 동일한 정도의 플라스미드 DNA의 양을 보였다.
Claims (53)
- 하기 화학식 I의 화합물:화학식 I상기 식에서,n은 1 내지 3의 정수이고;R은 수소, 또는 탄소수 2 내지 6의 직쇄 또는 분지된 알카노일이고;R1및 R2는 동일하거나 상이할 수 있으며, 탄소수 3 내지 20의 포화되거나 불포화된 직쇄 아실을 나타내고;X-는 약리학적으로 허용가능한 산의 음이온이다.
- 제 1 항에 있어서, R이 아세틸, 프로피오닐, 부티릴, 발레릴 및 이소발레릴로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 화합물.
- 제 1 항에 있어서, R1및 R2가 헥사노일, 운데카노일, 미리스토일, 팔미토일 및 올레오일로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 화합물.
- 제 1 항에 있어서, X-가 클로라이드; 브로마이드; 요오다이드; 아스파테이트; 산 아스파테이트; 시트레이트; 산 시트레이트; 타르트레이트; 산 타르트레이트; 포스페이트; 산 포스페이트; 푸마레이트; 산 푸마레이트; 글리세로포스페이트; 글루코스 포스페이트; 락테이트; 말리에이트; 산 말리에이트; 뮤케이트; 오로테이트; 옥살레이트; 산 옥살레이트; 설페이트; 산 설페이트; 트리클로로아세테이트; 트리플루오로아세테이트; 메탄 설포네이트; 파모에이트 및 산 파모에이트로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 화합물.
- 제 1 항에 있어서,-2-하이드록시아세틸-1,3-디팔미토일 글리세롤을 갖는 L-카르니틴 브로마이드의 에스테르;-2-하이드록시아세틸-1,3-디팔미토일 글리세롤을 갖는 아세틸 L-카르니틴 브로마이드의 에스테르;-2-하이드록시아세틸-1,3-디팔미토일 글리세롤을 갖는 프로피오닐 L-카르니틴 브로마이드의 에스테르;-2-하이드록시아세틸-1,3-디팔미토일 글리세롤을 갖는 이소부티릴 L-카르니틴 브로마이드의 에스테르;-2-하이드록시아세틸-1,3-디팔미토일 글리세롤을 갖는 이소발레릴 L-카르니틴 브로마이드의 에스테르;-1,3-디헥사노일-2-하이드록시아세틸 글리세롤을 갖는 L-카르니틴 브로마이드의 에스테르;-1,3-디헥사노일-2-하이드록시아세틸 글리세롤을 갖는 아세틸 L-카르니틴 브로마이드의 에스테르;-1,3-디헥사노일-2-하이드록시아세틸 글리세롤을 갖는 프로피오닐 L-카르니틴 브로마이드의 에스테르로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 화합물.
- 리포솜의 제조를 위한 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 용도.
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는 리포솜.
- 제 7 항에 있어서, 헬퍼 지질(helper lipid)을 추가로 함유하는 리포솜.
- 제 8 항에 있어서, 헬퍼 지질이 콜레스테롤, 1-팔미토일-2-올레오일 포스파티딜 콜린 및 디올레일 포스파티딜 콜린으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 리포솜.
- 약리학적으로 활성인 화합물의 수송에 유용한 조성물의 제조를 위한, 제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 리포솜의 용도.
- 제 10 항에 있어서, 약리학적으로 활성인 화합물이 천연 또는 변형된 플라스미드 또는 폴리뉴클레오티드인 용도.
- 제 11 항에 있어서, 플라스미드 또는 폴리뉴클레오티드가 유전자 요법에 유용한 용도.
- 제 11 항에 있어서, 플라스미드 또는 폴리뉴클레오티드가 백신으로서 유용한 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 용도.
- 제 10 항에 있어서, 활성 화합물이 약물인 용도.
- 제 14 항에 있어서, 약물이 항암제, 혈관생성 억제제, 항바이러스제, 항균제, 항진균제, 항원생동물제, 심혈관계에 대해 활성인 화합물, 및 면역원성 펩티드로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 용도.
- 제 15 항에 있어서, 약물이 항암제 또는 혈관생성 억제제인 용도.
- 제 16 항에 있어서, 항암제가 탁솔 및 캠토테신 유도체로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 용도.
- 제 17 항에 있어서, 캠토테신 유도체가-7-카보니트릴캠토테신;-7-벤질옥시이미노메틸캠토테신 및-7-부톡시이미노메틸캠토테신으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 용도.
- 화장료 조성물의 제조를 위한 제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 리포솜의 용도.
- 제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 리포솜을 포함하는 약학 조성물.
- 제 20 항에 있어서, 리포솜이 약리 활성 화합물을 함유하는 조성물.
- 제 21 항에 있어서, 활성 화합물이 천연 또는 변형된 플라스미드 또는 폴리뉴클레오티드인 조성물.
- 제 22 항에 있어서, 플라스미드 또는 폴리뉴클레오티드가 유전자 요법에 유용한 조성물.
- 제 22 항에 있어서, 플라스미드 또는 폴리뉴클레오티드가 백신으로서 유용한 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 조성물.
- 제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 리포솜을 포함하는 화장료 조성물.
- 제 25 항에 있어서, 리포솜이 미용 활성을 갖는 물질을 함유하는 조성물.
- 제 21 항에 있어서, 화합물이 항암제, 혈관생성 억제제, 항바이러스제, 항균제, 항진균제, 항원생동물제, 심혈관계에 대해 활성인 화합물, 및 면역원성 펩티드로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 조성물.
- 제 20 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 경구, 비 경구, 정맥 내, 근육 내, 피하, 경피, 또는 코 또는 구강 스프레이의 형태로 투여될 수 있는 조성물.
- 약물 또는 미용 활성을 갖는 물질의 수송을 위한 하기 화학식 II의 화합물을 포함하는 리포솜의 용도:화학식 II상기 식에서,R3는 탄소수 4 내지 26의 포화되거나 불포화된 직쇄 또는 분지된 아실 쇄이고;R4는 탄소수 4 내지 26의 포화되거나 불포화된 직쇄 또는 분지된 알킬 쇄이고;X-는 약리학적으로 허용가능한 산의 음이온이다.
- 제 29 항에 있어서, R3가 바람직하게는 노나노일, 도데카노일, 미리스토일, 팔미토일, 스테아로일 및 올레오일로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 용도.
- 제 29 항에 있어서, R4가 바람직하게는 노닐, 운데실, 테트라데실, 헥사데실 및 올레일로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 용도.
- 제 30 항에 있어서, X-가 클로라이드; 브로마이드; 요오다이드; 아스파테이트; 산 아스파테이트; 시트레이트; 산 시트레이트; 타르트레이트; 산 타르트레이트; 포스페이트; 산 포스페이트; 푸마레이트; 산 푸마레이트; 글리세로포스페이트; 글루코스 포스페이트; 락테이트; 말리에이트; 산 말리에이트; 뮤케이트; 오로테이트; 옥살레이트; 산 옥살레이트; 설페이트; 산 설페이트; 트리클로로아세테이트; 트리플루오로아세테이트; 메탄 설포네이트; 파모에이트 및 산 파모에이트로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 용도.
- 제 29 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서,화합물이-팔미토일 L-카르니틴 클로라이드 운데실 에스테르;-스테아로일 L-카르니틴 클로라이드 운데실 에스테르;-스테아로일 L-카르니틴 클로라이드 테트라데실 에스테르;-팔미토일 L-카르니틴 클로라이드 테트라데실 에스테르;-미리스토일 L-카르니틴 클로라이드 테트라데실 에스테르;-팔미토일 L-카르니틴 브로마이드 헥사데실 에스테르;-올레오일 L-카르니틴 클로라이드 올레일 에스테르로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 용도.
- 제 29 항에 있어서, 약물이 항암제, 혈관생성 억제제, 항바이러스제, 항균제, 항진균제, 항원생동물제, 심혈관계에 대해 활성인 화합물, 및 면역원성 펩티드로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 용도.
- 제 34 항에 있어서, 약물이 항암제 또는 혈관생성 억제제인 용도.
- 제 35 항에 있어서, 항암제가 탁솔 및 캠토테신 유도체로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 용도.
- 제 36 항에 있어서,캠토테신 유도체가-7-벤질옥시이미노메틸캠토테신 및-7-부톡시이미노메틸캠토테신으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 용도.
- 제 29 항에 있어서, 리포솜이 헬퍼 지질을 추가로 함유하는 용도.
- 제 38 항에 있어서, 헬퍼 지질이 콜레스테롤, 1-팔미토일-2-올레오일 포스파티딜 콜린 및 디올레일 포스파티딜 콜린으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 용도.
- 약물 또는 미용 활성을 갖는 물질의 수송을 위한 제 29 항에 따른 리포솜을 포함하는 조성물.
- 제 40 항에 있어서, 약물이 항암제, 혈관생성 억제제, 항바이러스제, 항균제, 항진균제, 항원생동물제, 심혈관계에 대해 활성인 화합물, 및 면역원성 펩티드로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 조성물.
- 제 40 항 또는 제 41 항에 있어서, 경구, 비 경구, 정맥 내, 근육 내, 피하, 경피, 또는 코 또는 구강 스프레이의 형태로 투여될 수 있는 조성물.
- 천연 또는 변형된 플라스미드 또는 폴리뉴클레오티드의 수송을 위한 하기 화학식 III의 화합물을 포함하는 리포솜의 용도:화학식 III상기 식에서,R5는 탄소수 4 내지 26의 포화되거나 불포화된 직쇄 또는 분지된 아실 쇄이고;R6는 탄소수 4 내지 26의 포화되거나 불포화된 직쇄 또는 분지된 알킬 쇄이고;X-는 약리학적으로 허용가능한 산의 음이온이나; 단R5가 스테아로일일 때, R6는 스테아릴이 아니고,R5가 올레오일일 때, R6는 스테아릴이 아니고,R5가 팔미토일일 때, R6는 팔미토일이 아니고,R5가 미리스토일일 때, R6는 미리스토일이 아니고,R5가 라우로일일 때, R6는 라우릴이 아니고,R5가 올레오일일 때, R6는 올레일이 아니다.
- 제 43 항에 있어서, R5가 바람직하게는 노나노일, 도데카노일, 미리스토일, 팔미토일, 스테아로일 및 올레오일로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 용도.
- 제 43 항에 있어서, R6가 바람직하게는 노닐, 운데실, 테트라데실, 헥사데실 및 올레일로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 용도.
- 제 43 항에 있어서, X-가 클로라이드; 브로마이드; 요오다이드; 아스파테이트; 산 아스파테이트; 시트레이트; 산 시트레이트; 타르트레이트; 산 타르트레이트; 포스페이트; 산 포스페이트; 푸마레이트; 산 푸마레이트; 글리세로포스페이트; 글루코스 포스페이트; 락테이트; 말리에이트; 산 말리에이트; 뮤케이트; 오로테이트; 옥살레이트; 산 옥살레이트; 설페이트; 산 설페이트; 트리클로로아세테이트; 트리플루오로아세테이트; 메탄 설포네이트; 파모에이트 및 산 파모에이트로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 용도.
- 제 43 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서,화합물이-팔미토일 L-카르니틴 클로라이드 운데실 에스테르;-스테아로일 L-카르니틴 클로라이드 운데실 에스테르;-스테아로일 L-카르니틴 클로라이드 테트라데실 에스테르;-팔미토일 L-카르니틴 클로라이드 테트라데실 에스테르로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 용도.
- 제 43 항에 있어서, 플라스미드 또는 폴리뉴클레오티드가 백신으로서 유용한 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 용도.
- 제 43 항에 있어서, 리포솜이 헬퍼 지질을 추가로 함유하는 용도.
- 제 49 항에 있어서, 헬퍼 지질이 콜레스테롤, 1-팔미토일-2-올레오일 포스파티딜 콜린 및 디올레일 포스파티딜 콜린으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 용도.
- 천연 또는 변형된 플라스미드 또는 폴리뉴클레오티드의 수송을 위한 제 43 항에 따른 리포솜을 포함하는 조성물.
- 제 51 항에 있어서, 플라스미드 또는 폴리뉴클레오티드가 백신으로서 유용한 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 조성물.
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