DE60025961T2 - Verwendung von Estern von L-Carnitinsäure oder von Alkanoyl L-Carnitinsäure als kationische Lipide für die intrazelluläre Verabreichung therapeutischer Stoffe - Google Patents

Verwendung von Estern von L-Carnitinsäure oder von Alkanoyl L-Carnitinsäure als kationische Lipide für die intrazelluläre Verabreichung therapeutischer Stoffe Download PDF

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Description

  • Die hierin beschriebene Erfindung betrifft die Verwendung von bekannten Estern von L-Carnitin und Acyl-L-carnitin als kationische Lipide, die zur Favorisierung der intrazellulären Abgabe von pharmakologisch aktiven Verbindungen, wodurch deren Transmembrantransport erleichtert wird, oder zur Förderung ihrer Interaktion mit spezifischen Zellmembranstellen (Rezeptoren) geeignet sind.
  • Mit dem Ausdruck "intrazelluläre Abgabe" ist hierin eine zellulare Transfektion mit Polynukleotiden oder Plasmiden natürlichen Ursprungs oder die modifiziert sind, die eine therapeutische Aktivität (Gen-Abgabe) aufweisen, oder die Einführung von Arzneimitteln oder immunogenen Peptiden in die Zelle gemeint.
  • Viele der pharmakologisch aktiven Substanzen wie beispielsweise Polypeptide und Proteine oder Arzneimittel müssen im allgemeinen in die Zellen eindringen, um ihre Wirkungen auszuüben, indem Zellfunktionen beim subzellulären oder molekularen Niveau beeinflußt werden. Für diese Moleküle macht die Zellmembran eine selektiv undurchlässige Sperre aus. Die Zellmembran übt tatsächlich eine Schutzfunktion, wobei das Eindringen von möglicherweise toxischen Substanzen verhindert wird, aber ebenso die Passage von Verbindungen mit therapeutischer Aktivität aus. Die komplexe Zusammensetzung der Zellmembran umfaßt Phospholipide, Glycolipide und Proteine; ihre Funktion wird durch cytoplasmatische Komponenten wie Ca++ und andere Ionen, ATP, Mikrofilamente, Mikrotubuli, Enzyme und Proteine, die Ca++ binden, beeinflußt. Die Interaktion zwischen den strukturellen und cytoplasmatischen Komponenten der Zellen und die Antwort auf externe Signale sind für die Selektivität verantwortlich, die durch die verschiedenen unterschiedlichen Zelltypen und unter diesen gezeigt wird. Die Sperrwirkung der Membrane kann durch Kombinieren von Substanzen in Komplexen mit Lipidformulationen überwunden werden, die die Zusammensetzung von natürlich auftretenden Membranlipiden reproduzieren. Diese Lipide sind in der Lage, mit den Membranen zu fusionieren und die Substanzen freizusetzen, die mit diesen in den Zellen kombiniert sind. Die Lipidkomplexe sind nicht nur in der Lage, den intrazellulären Transfer mit Hilfe der Fusion mit den Membranen zu erleichtern, sondern können ebenfalls die Ladungsabstoßung zwischen der Membran und dem Molekül vermindern, das in die Zelle eindringen muß. Amphipathische Lipide, wie Membranphospholipide, bilden Lipidvesikel oder Liposomen in den wäßrigen Systemen.
  • Liposome sind Vesikel, worin ein wäßriges Volumen vollständig durch ein oder mehrere Membranen, die aus Lipidmolekülen zusammengesetzt sind, eingeschlossen sind, üblicherweise Phospholipide. Phospholipide, die aus einem hydrophilen Kopf und einem Paar von Kohlenstoffketten (hydrophober Schwanz) bestehen, sind die Hauptkomponenten von biologischen Membranen. In der wäßrigen Lösung autoassoziieren die hydropholen Schwänze zum Ausschluß von Wasser, während die hydrophilen Köpfe mit dem Medium interagieren, wobei spontan Populationen von Vesikeln mit unterschiedlichen Durchmessern gebildet werden. Die Lipide sind im allgemeinen zwitterionisch, neutral oder anionisch. Diese Vesikel können als Träger von Arzneimitteln, kleinen Molekülen, Proteinen, Nukleotiden und Plasmiden verwendet werden.
  • Während der letzten Jahre wurden kationische Liposomen, eine Klasse von positiv geladenen Vesikeln, hergestellt aus synthetischen Lipiden, extensiv für den Transfer von genetischem Material in die Zellen verwendet. Die negative Ladung der DNA kann mit den positiven Ladungen der kationischen Lipide interagieren, wobei ein stabiler DNA-Liposom-Komplex gebildet wird. Die Einfachheit und Vielfältigkeit dieser Technologie machte die Liposomen zu einem wichtigen Vehikel für die Abgabe von Genen für Gentherapie bei menschlichen Subjekten. Gegenwärtig umfassen die meisten Vektoren, die für die Gentherapie verwendet werden und durch die NIH Recombinant Advisory Committee akzeptiert werden, virale und synthetische Systeme.
  • Die virale Infektion beinhaltet eine Serie von komplexen Mechanismen, um in der Lage zu sein, eine spezifische Zelle zu attackieren und die DNA in den Kern zu tragen. Die Rationale für die Verwendung von viralen Vektoren für die Gentherapie basiert auf der Möglichkeit, die viralen Gene durch Gene zu ersetzen, die eine therapeutische Funktion codieren, ohne die Fähigkeit des viralen Partikels zu eliminieren, die Zellen zu infizieren. Die Beschränkungen der viralen Therapie haben mit solchen viralen Elementen zu tun, die immunogen, cytopoathisch oder rekombinogen sein können.
  • Große Hoffnungen liegen bei der Verwendung von kationischen Lipiden für die Gentherapie. Diese Vektoren besitzen ein großes Potential im Vergleich zu solchen biologischen Ursprungs, weil sie viel sicherer, weniger toxisch und ebenfalls in der Lage sind, Gene mit größerer Größe einzufügen. Im Vergleich zu Vektoren vom biologischen Typ haben sie jedoch eine geringe intrazelluläre Gentranskriptionsausbeute. Es sollte berücksichtigt werden, daß die Verwendung solcher Transfektionssysteme sich im frühen Zustand der Forschung befindet. Kationische Lipide spielen eine sehr wichtige Rolle bei der Bildung des DNA-Lipid-Komplexes, der Zell-Komplex-Interaktion, der Fusion, der DNA-Freisetzung im Inneren der Zelle und der Transkription.
  • Es gibt wichtige Beispiele von in- vivo Anwendungen von kationischen Liposomen. Der erste klinische Versuch bei der Gentherapie wurde durch Einfügen eines Expressionsvektors, umfassend das menschliche Liposom komplexierte HLA-B7-Gen für die Behandlung von Melanoma. Eine andere wichtige Anwendung betrifft die Behandlung von cystischer pulmonarer Fibrose mit Hilfe der Verabreichung über die Pulmonarroute oder als Nasenspray des Liposom-komplexierten Expressionsvektors SV-40C-FTR. Andere klinische Versuche, die die Verwendung von Liposomen bei der Gentherapie für Krebs beinhalten, schreiten gegenwärtig fort.
  • Vier Bestandteilselemente sind im allgemeinen bei der Struktur der kationischen Lipide identifiziert: der positiv geladene kationische Kopf, der Abstandshalter, das Ankerlipid und die Linkerbindung.
  • Der kationische Kopf ist verantwortlich für die Interaktionen zwischen kationischen Liposomen und DNA, zwischen dem DNA-Liposom-Komplex und der Zellmembran und den anderen Komponenten der Zelle. Er besteht aus mono- oder polykationischen Gruppen (in Abhängigkeit von der Anzahl der Ladungen), die variabel substituiert sein können.
  • Der Abstandshalter ist der Teil des Moleküls, der den kationischen Kopf vom hydrophoben Schwanz trennt und ist beim Sicherstellen des optimalen Kontaktes zwischen dem kationischen Kopf und den negativen Ladungen der DNA-Phosphate involviert.
  • Das Ankerlipid ist der nicht-polare Kohlenwasserstoffteil des Moleküls und bestimmt die physikalischen Eigenschaften der Doppellipidschicht wie die Steifheit und die Rate des Austausches mit Membranlipiden.
  • Mit Linkerbindung ist die Bindung zwischen den Kohlenwasserstoff-Ketten und dem Rest des Moleküls gemeint. Die Bindung bestimmt die chemische Stabilität und Bioabbaubarkeit der kationischen Lipide.
  • Die wissenschaftliche und Patentliteratur ist reich an Referenzen bezüglich der Herstellung und Verwendung von Liposomen; es gibt jedoch sehr wenige Referenzen, die die Verwendung von Carnitin-Derivaten beschreiben, die für die Genabgabe nützlich sind, während für die Arzneimittelabgabe kein Dokument erhältlich ist, das sich mit bekannten Techniken für die Herstellung von Verbindungen beschäftigt, die entfernt jenen gemäß der hierin beschriebenen Erfindung ähneln.
  • Die Patentanmeldung EP 0 279 887 beschreibt die Verwendung eines Carnitin-Derivates, d.h. Phosphatidylcarnitin, wahlweise in Mischungen mit anderen Phospholipiden und Lipiden (Cholesterin, Phosphatidylcholin, Phosphatidylserin) zur Herstellung von Liposomen.
  • Bei dem Beispiel, das bezüglich der Herstellung von Liposomen angegeben wird, werden Liposome von Phosphatidylcarnitin hergestellt, die Propanolol beinhalten, ein Arzneimittel, das bekanntermaßen als antihypertonisches, Antiangina- und Antiarrhythmiemittel aktiv ist. Das Carnitin-Derivat wird hier wegen des ausgeprägten Myokardtropismus von Carnitin verwendet. Dieser Tropismus ermöglicht es, zu verhindern, daß die Liposomen durch die Leber metabolisiert werden und nicht die gewünschte Zielstelle erreichen.
  • Das Vorhandensein von Phosphatidylcarnitin ermöglicht es ebenfalls, die Liposomen oral zu verabreichen, weil sie für Intestinallipasen resistent sind.
  • In J. Med. Chem. 18. Jun. 1998; 41 (13): 2207–15 wird eine Vielzahl von Estern von L-Carnitin, die für Genabgabe nützlich sind, beschrieben, aber sie werden nicht als nützliche Mittel für die Arzneimittelabgabe beschrieben oder vorgeschlagen.
  • EP 559 625 B1 beschreibt eine Anzahl von Estern von L-Carnitin und Acyl-L-carnitinen, die eine selektive muskelrelaxierende Aktivität für den Gastrointestinaltrakt aufweisen.
  • WO 96/39193 beschreibt neue Zielarzneimittel, die für den Eintritt in die Mitochondrien über das Carnitinacylcarnitin-Translokasesystem bezweckt sind, legt aber nicht nahe, daß diese nützliche Mittel für die Herstellung von Liposomen sind.
  • Wie bereits erwähnt werden kationische Liposomen extensiv für die intrazelluläre Abgabe von pharmakologisch aktiven Verbindungen verwendet, wodurch der Transmembrantransport erleichtert oder deren Interaktion mit spezifischen Zellmembranstellen (Rezeptoren) gefördert wird. Diese Vektoren haben ein großes Potential im Vergleich zu jenen biologischen Ursprungs, weil sie viel sicherer und weniger toxisch sind.
  • Auf dem Gebiet der Arzneimittelabgabe gibt es ein starkes Bedürfnis für stabile, reproduzierbare stellenspezifische Systeme, die ebenfalls nach einer geeigneten Zeitperiode aktiv sind.
  • Es wurde nun festgestellt, daß eine Klasse von kationischen Lipiden, die stark aktiv bei der Förderung der intrazellulären Abgabe von pharmakologisch aktiven Verbindungen sind, die Verwendung des Liposoms umfaßt, umfassend die bekannten Ester von L-Carnitin und Acyl-L-carnitinen mit der Formel (II) zur Herstellung eines Medikamentes zum Transport von Arzneimitteln.
  • Diese Verbindungen sind stabil und selektiv, weil die stellenspezifisch beim Erreichen des Zielorgans sind.
  • Dieses Charakteristikum macht sie besonders nützlich für den direkten Transport von aktiven Verbindungen zu der Stelle, wo sie ihre pharmakologische Aktivität entfalten können.
  • Die Verbindungen mit der allgemeinen Formel (II) sind für eine andere Verwendung bereits bekannt ( EP 559 625 , oben erwähnt).
  • Die Verbindungen der Formel (22) sind Ester von L-Carnitin, nützlich für die Herstellung von Liposomen, die eine starke Aktivität für die Arzneimittelabgabe aufweisen, und präsentieren Charakteristiken der Stabilität und Selektivität beim Erreichen des Zielorgans.
  • Die Verbindungen haben die allgemeine Formel (II):
    Figure 00050001
    worin R3 eine gesättigte, geradkettige oder verzweigte Acylkette mit 4 bis 26 Kohlenstoffatomen ist,
    R4 eine gesättigte oder ungesättigte, geradkettige oder verzweigte Alkylkette mit 4 bis 26 Kohlenstoffatomen ist und
    X– das Anion einer pharmakologisch akzeptablen Säure ist.
  • Bevorzugte Beispiele von R3 sind Nonanoyl, Dodecanoyl, Myristoyl, Palmitoyl oder Stearoyl.
  • Bevorzugte Beispiele von R4 sind Nonyl, Undecyl, Tetradecyl, Hexadecyl oder Oleyl.
  • Beispiele von spezifischen Verbindungen der Formel (II) gemäß der hierin beschriebenen Erfindung sind:
    • – Palmitoyl-L-carnitinchloridundecylester (ST 983);
    • – Stearoyl-L-carnitinchloridundecylester (ST 1055);
    • – Stearoyl-L-carnitinchloridtetradecylester (ST 1351);
    • – Palmitoyl-L-carnitinchloridtetradecylester (ST 1379);
    • – Myristoyl-L-carnitinchloridtetradecylester (ST 1380);
    • – Palmitoyl-L-carnitinbromidhexadecylester (ST 1390).
  • Mit einem Anion einer pharmakologisch akzeptablen Säure ist irgendein Anion einer Säure gemeint, die keine unerwünschten toxischen oder Nebenwirkungen bringt.
  • Diese Säuren sind den Pharmakologen und den Experten auf dem Gebiet der pharmazeutischen Technologie gut bekannt.
  • Beispiele dieser Anionen umfassen, obwohl sie nicht exklusiv aufgelistet sind: Chlorid, Bromid, Iodid, Aspartat, saures Aspartat, Citrat, saures Citrat, Tartrat, saures Tartrat, Phosphat, saures Phosphat, Fumarat, saures Fumarat, Glycerophosphat, Glucosephosphat, Lactat, Maleat, saures Maleat, Mucat, Orotat, Oxalat; saures Oxalat, Sulphat, saures Sulphat, Trichloracetat, Trifluoracetat, Methansulphonat, Pamoat und saures Pamoat.
  • Die Liposomen, umfassend die Verbindung der Formel (II), werden mit Hilfe von konventionellen Techniken, die der Person mit Durchschnittswissen auf dem Gebiet bekannt sind, hergestellt, siehe beispielsweise Allen T. M. Drugs 56, 747–56 (1998). Die Liposomen gemäß dieser Erfindung können ebenfalls unter Verwendung von anderen Komponenten, die in der Praxis der Liposomtechnologie bekannt sind, hergestellt werden. In einem Ausführungsbeispiel der Erfindung können die Liposomen Helferlipide enthalten, ein Ausdruck, der auf diesem Gebiet gut verstanden wird. Beispiele der Helferlipide sind Cholesterin, 1-Palmitoyl,-2-oleoylphosphatidylcholin oder Dioleylphosphatidylcholin.
  • Die Liposomen gemäß der Erfindung werden geeignet als Zusammensetzungen präsentiert. In dem Ausführungsbeispiel bezüglich der Abgabe von pharmakologisch aktiven Verbindungen werden die Zusammensetzungen als pharmazeutische verstanden, wahlweise umfassend pharmazeutisch akzeptable Vehikel und/oder Exzipienten.
  • Eine Anzahl von Verbindungen der Formel (II), nämlich ST 1380 und ST 1390 sind bekannt und in dem bereits genannten J. Med. Chem. 18. Jun. 1998, 41 (13): 2207–15 als nützliche Mittel für die Herstellung von Liposomen für cellulare Transfektion, die therapeutische Aktivität aufweisen, beschrieben, aber wurden niemals als nützliche Mittel für die Herstellung von Liposomen für die Arzneimittelabgabe beschrieben.
  • Der Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet der pharmazeutischen Formulierungen ist sich der Schwierigkeiten bei der Herstellung von Liposom-Arzneimittelkomplexen bewußt; tatsächlich ist es unmöglich, a priori festzustellen ob ein Liposom, das für die Genabgabe nützlich ist, für die Arzneimittelabgabe verwendet werden kann, aufgrund der zahlreichen Probleme, die überwunden werden müssen, um ein Liposom zu erhalten, das ein Arzneimittel komplexieren kann und das dieses bevorzugt zu dem Organ abgeben wird, wo es die heilende Wirksamkeit entfalten soll.
  • Verbindungen der Formel (II) sind in der Form von Liposomen nützliche Mittel für die Abgabe von Arzneimitteln wie beispielsweise Antikrebs-, antiangiogenen, Antivirus-, antibakteriellen, Antipilz-, Antiprotozoa-Mittel oder Arzneimittel, die für die Therapie von kardiovaskulären Erkrankungen nützlich sind, oder immunogene Peptide und andere Arzneimittel, die bei der Therapie nützlich sind.
  • Diese Liposomen können wahlweise Helferlipide enthalten.
  • Liposome, umfassend Verbindungen der Formel (II), können oral oder parenteral, intravenös, intramuskulär, subkutan, transdermal oder in der Form von Nasen- oder Mundsprays verabreicht werden.
  • Beispiel 1
  • 7-Benzyloxyiminomethylcamptothecin (CPT 172)
  • 500 mg (1,33 mmol) 7-Formylcamptothecin werden in 100 ml Ethanol aufgelöst. 15 ml Pyridin und 638 mg (4 mmol) O-Benzylhydroxylaminhydrochlorid werden zugegeben. Die Lösung wird 5 Stunden unter Rückfluß gehalten. Das Lösungsmittel wird im Vakuum verdampft und der erhaltene Rest durch Flash-Chromatographie auf Silicagel unter Verwendung einer 4:6-Mischung von Hexan/Ethylacetat als Eluent gereinigt.
    Ausbeute: 65%
    Schmelzpunkt: 200–205°C; Zers.
  • Das erhaltene Produkt besteht aus einer ungefähr 8:2-Mischung der beiden syn- und anti-Isomeren (Isomer A: Rf 0,32; Isomer B: Rf 0,19 auf Merck 60 F254 Silicagel; Eluent: Hexan:Ethylacetat 3:7).
  • HPLC: Die Analysen wurden auf einer Anlage durchgeführt, ausgerüstet mit einer quaternären Pumpe (HP 1050) mit einem Rheodyne-Injektor (20 μl-Schleife) und einem Diodenarraydetektor (HP 1050), die entsprechend dem HPLC-ChemStation-Programm lief. Der Erwerb der spektralen Daten erfolgte bei 200 bis 600 nm und die Chromatogramme wurden bei 360 und 400 nm aufgezeichnet.
  • Eine C18-Umkehrphasensäule (Rainin C18; 25–0,4 cm, Varian) wurde mit einer RP18-Vorsäule verwendet. Die Analyse wurde mit einem linearen Elutionsgradienten, beginnend mit Acetonitril:Wasser 30:70 bis Acetonitril 100% in 20 min mit einer Fließrate von 1 ml/min durchgeführt. Die Retentionszeiten waren: 12,51 min für Isomer B und 14,48 min für Isomer A.
    1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 0,88 (t, H3-18A + H3-18B), 1,87 8m, (H2-19A – H2-19B), 5,18 (s, H2-5B), 5,21 (8s, H2-Ph B), 5,30 (H2-Ph A), 5,40 (s, H2-5A), 5,45 (s, H2-17A + H2-17B), 6,53 (s, -OH A + -OH B), 7,3–7,6 (m, Ar A + Ar B + H – 14A + H-14B), 7,75 (m, H-11A + H-11B), 7,85–7,95 (m, H-10A – H-10B), 7,98 (dd, H-12B), 8,18–8,27 (m, H-12A + H9-B), 8,45 (s, CH=N B), 8,59 (dd, H-9A), 9,38 (s, CH=N A).
    Masse m/z 481 (M+ 100) 374 (30) 330 (70) 300 (30) 273 (20) 243 (20) 91 (34).
  • Beispiel 2
  • 7-Butoxyiminomethylcamptothecin (CPT 184)
  • 400 mg (1,06 mmol) 7-Formylcamptothecin werden in 80 ml Ethanol aufgelöst. 12 ml Pyridin und 400 mg (43,18 mmol) O-t-Butylhydroxylaminhydrochlorid werden zugegeben. Die Lösung wird 4 Stunden unter Rückfluß gehalten. Das Lösungsmittel wird im Vakuum verdampft und der erhaltene Rest durch Flash-Chromatographie auf Silicagel unter Verwendung einer 4:6-Mischung von Hexan/Ethylacetat als Eluent gereinigt.
    322 mg (0,72 mmol) gelber Feststoff wurden erhalten.
    Ausbeute: 68%
    Schmelzpunkt: 250°C; Zers.
  • Das erhaltene Produkt besteht aus einer ungefähr 8:2-Mischung der beiden syn- und anti-Isomeren (Isomer A: Rf 0,31; Isomer B: Rf 0,24 auf Merck 60 F254 Silicagel; Eluent: Hexan:Ethylacetat 3:7).
  • HPLC: Die Analysen wurden auf einer Anlage durchgeführt, ausgerüstet mit einer quaternären Pumpe (HP 1050) mit einem Rheodyne-Injektor (20 μl-Schleife) und einem Diodenarraydetektor (HP 1050), die entsprechend dem HPLC-ChemStation-Programm lief. Der Erwerb der spektralen Daten erfolgte bei 200 bis 600 nm und die Chromatogramme wurden bei 360 und 400 nm aufgezeichnet.
  • Eine C18-Umkehrphasensäule (Rainin C18; 25–0,4 cm, Varian) wurde mit einer RP18-Vorsäule verwendet. Die Analyse wurde mit einem linearen Elutionsgradienten, beginnend mit Acetonitril:Wasser 30:70 bis Acetonitril 100% in 20 min mit einer Fließrate von 1 ml/min durchgeführt. Die Retentionszeiten waren: 12,92 min für Isomer B und 14,61 min für Isomer A.
    1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 0,88 (t, H3-18A + H3-18B), 1,30 (s, t-but.B), 1,47 (s, t-but.A), 1,87 (m, H2-19A + H2-19B), 5,18 (s, H2-5 B), 5,37 (H2-5 A), 5,42 (s, H2-17A + H2-17B), 6,54 (s, -OH A + -OH B), 7,35 (s H-14A), 7,36 (s, H-14B), 7,69–7,83 (m, H-11A + J-11B), 7,85–7,98 (m, H-10A + H-10B), 8,07 (dd, H-9B), 8,16–8,27 (m, H-91·H-12B), 8,40 (s, CH B), 8,62 (dd, H-12A), 9,31 (s, CH A).
    Masse m/z 448 (M+ 28) 391 (40) 374 (100) 362 (40) 330 (34) 57 (17).
  • Herstellung von Liposomen
  • Die bekannten Verbindungen können zur Herstellung von multilamellaren Liposomen (MLV) und unilamellaren Liposomen (SUV), beide in der Form von trockenen Pulvern und als Suspension in wäßrigen Lösungen verwendet werden.
  • Die Verbindungen werden zur Erzeugung der Liposomen entsprechend dem folgenden Vorgang verwendet. Eine geeignete Menge der Verbindung wird in Chloroform aufgelöst; die Lösung wird im Vakuum im Rotationsverdampfer zur Trockene konzentriert, bis ein Lipidfilm erhalten wird. Der Lipidfilm wird unter hohem Vakuum getrocknet, bis die letzten verbleibenden Spuren des Lösungsmittels eliminiert sind, und wird dann in tert-Butylalkohol oder mit Wasser aufgelöst. Die somit erhaltene Lösung wird lyophilisiert, unter Erhalt eines weichen trockenen Pulvers.
  • Die Pulver werden mit einer geeigneten Menge einer wäßrigen Lösung hydratisiert, unter Erhalt des Liposoms der verwendeten Verbindung, das dann mit dem gewünschten Arzneimittel komplexiert wird.
  • Ein anderes Verfahren zur Herstellung der Liposomen besteht in der Adsorption eines Lipidfilmes, bestehend aus einer Verbindung gemäß der Erfindung in einem Lösungsmittel, auf einem geeigneten inerten Träger wie Sorbit, Mannit oder anderen pharmakologisch akzeptablen Kohlenhydraten. Die Mischung wird im Vakuum getrocknet, unter Erhalt eines Feststoffes, der leicht und sehr schnell vor der Verwendung hydratisiert werden kann.
  • Präparate in der Form von trockenen Pulvern präsentieren den Vorteil, daß sie für lange Zeit stabil und leicht zu verwenden sind.
  • Darüber hinaus können die Verbindungen zur Herstellung von Liposomen, die mit dem gewünschten Arzneimittel komplexiert sind, in der Form von trockenen Pulvern entsprechend der folgenden Vorgehensweise verwendet werden. Die Verbindung dieser Erfindung wird in tert-Butylalkohol oder mit Wasser aufgelöst; die somit erhaltene Lösung wird mit dem gewünschten Arzneimittel vermischt und die Mischung wird lyophilisiert, unter Erhalt des Komplexes, den wir als Proliposom-Arzneimittel definieren können, in der Form eines weichen, trockenen Pulvers.
  • Die somit erhaltenen Pulver (Proliposomen) können für die Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden, die über Aerosol oder alternativ nach Rekonstitution mit Wasser oder mit einer geeigneten Pufferlösung parenteral oder oral verabreicht werden können.
  • Mit Arzneimittel in fester Form komplexierte Liposomen können ebenfalls mit dem Verfahren der Adsorption des Lipidfilmes auf einem inerten Träger wie Sorbit, Mannit oder anderen Kohlenhydraten mit Hilfe des oben beschriebenen Verfahrens erhalten werden.
  • Test der Liposombildung
  • Die Liposombildung wurde mit Hilfe eines colorimetrischen Verfahrens unter Verwendung eines wasserlöslichen Farbstoffes entsprechend der folgenden Vorgehensweise untersucht. Eine wäßrige Lösung des wasserlöslichen Farbstoffes Arsenazo III wurde erhalten (Mw. = 776,37; 2,3 mg/ml).
  • Diese Lösung wurde anstelle von Wasser zum Hydratisieren der Lipidfilme, die von dem oben erwähnten Präparat kommen, verwendet.
  • Ein Aliquot der Suspension, umfassend das Liposom, das den Farbstoff einkapselt, wurde mit Wasser 100-fach verdünnt.
  • 2 ml der Liposomsuspension wurden verwendet, zum Erhalt des Ablesens der ersten optischen Dichte bei 660 nm; das Ablesen wurde in bezug auf eine gleiche Probe erhalten, die als Blanko definiert wurde. 200 μl einer CaCl2-Lösung (15 mg/ml; 100 mM) wurden zu der ersten Probe gegeben und die optische Dichte wurde bei 660 nm gegenüber dem Blanko gemessen, wozu 200 μl Wasser gegeben waren. Der erhaltene Absorbanswert wurde als Ablesen 2 angezeigt. Wir fuhren fort, indem zu der Probe 100 μl einer Lösung aus Triton X-100 (5% V/V; 0,26%ige endgültige Konzentration) und zum Blanko 200 μl Wasser gegeben wurden; das Ablesen der optischen Dichte bei 660 nm ergab den Wert der optischen Dichte definiert als Ablesen 3. Zum Berechnen des Prozentsatzes des eingekapselten Farbstoffes wurde die folgende Formel verwendet:
  • Figure 00100001
  • Der Prozentsatz des eingekapselten Farbstoffes ergibt ein Ausmaß der Liposombildung und ist im Durchschnitt ungefähr 40%: der Liposomengrößencheck wurde unter Verwendung der Laserlichtstreuung mit einem positiven Ausstoß durchgeführt.
  • Beispiele zur Herstellung von Liposomen
  • Herstellung der Liposome von Palmitoyl-L-carnitinchloridundecylester (ST 983) in der Form von:
  • a) Lyophilisierten Pulvern
  • 65 mg, 0,11 mmol Palmitoyl L-Carnitinchloridundecylester wurden in 20 ml Chloroform in einem 100 ml-Kolben aufgelöst.
  • Die Lösung wurde eingeengt, bis ein Lipidfilm erhalten wurde, der 3 Stunden vakuumgetrocknet wurde. Das somit erhaltene Produkt wurde in tert-Butylalkohol aufgelöst und diese Lösung wurde schnell auf –70°C mit flüssigem Stickstoff gekühlt und 24 Stunden lang lyophilisiert.
  • Ein schwammiger weicher weißer Feststoff wurde erhalten.
  • b) Adsorbierten Pulvern
  • 143 mg, 0,231 mmol Palmitoyl-L-carnitinchloridundecylester wurden in 10 ml Chloroform aufgelöst. Die somit erhaltene Lösung wurde in kleinen Portionen in einen 100 ml-Kolben mit 750 mg Sorbit gegossen. Am Ende der Zugabe der verschiedenen Portionen der Chloroformlösung wurde das Chloroform schnell verdampft.
  • Der somit erhaltene Feststoff wurde 3 Stunden im Vakuum getrocknet.
  • 893 mg eines weißen festen Produktes wurden erhalten.
  • Vor der Verwendung wird das Produkt schnell mit einem geeigneten Volumen an Wasser hydratisiert, unter Erhalt einer isotonischen Lösung.
  • c) MLV-Suspensionen
  • 65 mg, 0,11 mmol Palmitoyl-L-carnitinchloridundecylester wurden in einem 100 ml-Kolben in 20 ml Chloroform aufgelöst. Die somit erhaltene Lösung wurde verdampft, bis ein Lipidfilm erhalten wurde, der dann 3 Stunden im Vakuum getrocknet wurde.
  • Der Lipidfilm wurde mit 10 ml Wasser bei 30°C 3 Stunden lang hydratisiert, unter Erhalt einer MLV-Suspension.
  • Die geeignet verdünnte MLV-Suspension wurde mit einem Arzneimittel komplexiert und für biologische Assays verwendet.
  • a) SUV-Suspensionen
  • 65 mg, 0,11 mmol Palmitoyl-L-carnitinchloridundecylester wurden in einem 100 ml-Kolben in 20 ml Chloroform aufgelöst. Die somit erhaltene Lösung wurde verdampft, bis ein Lipidfilm erhalten wurde, der dann 3 Stunden im Vakuum getrocknet wurde. Der Lipidfilm wurde mit 10 ml Wasser bei 30°C 3 Stunden hydratisiert, unter Erhalt einer MLV-Suspension. Die MLV-Suspension wurde 10-mal durch ein Polycarbonat-Filter mit einer Porengröße von 200 nm extrudiert. Die somit erhaltene unilamellare Liposom- Suspension wurde mit einem Arzneimittel komplexiert und für biologische Assays verwendet.
  • b) Testen der physikalischen Stabilität der Liposome
  • Die physikalische Stabilität der Liposomsuspension wurde mit Hilfe der Trübheitsmessung für einer Periode von 30 Tagen untersucht. Eine Absorbansmessung bei 600 nm für ein bestimmtes Zeitintervall wurde für jede zu untersuchende Suspension durchgeführt. Der mittlere Absorbanswert, gemessen zum Zeitpunkt 0, verblieb für alle untersuchten Formulierungen konstant. Die betrachteten Moleküle präsentierten konforme Werte über die berücksichtigten Zeitperioden.
  • MLV- und SUV-Liposom-Suspensionen können durch Kombinieren der Verbindungen dieser Erfindung mit Helferlipiden wie Cholesterin, 1-Palmitoyl-2-oleoylphosphatidylcholin (POPC) oder Dioleylphosphatidylcholin (DOPE) hergestellt werden.
  • Die Verbindungen werden mit Helferlipiden kombiniert, um Liposome mit stabileren Membranen zu erhalten. In dem Abschnitt, der die Herstellung der Liposome beschreibt, wird nachfolgend ein Beispiel für die Herstellung angegeben, worin eine Verbindung gemäß der Erfindung mit einem Helferlipid wie Cholesterin oder POPC kombiniert wird.
  • Beispiele zur Herstellung von Liposomen für die Arzneimittelabgabe
  • Beispiel 3
  • Herstellung von Taxol-ST 983 MLV-Liposomen (1:40)
  • 20 mg 0,0234 mmol Taxol und 556 mg, 0,9417 mmol ST 983 wurden in 20 ml Chloroform aufgelöst.
  • Die Lösung wurde konzentriert, bis ein Lipidfilm auf der Oberfläche des Glaskolbens erhalten wurde.
  • Nach Eliminieren der letzten Spuren von Chloroform mit Hilfe einer Vakuumpumpe wurden 20 ml tert-Butylalkohol zum Lipidfilm gegeben und die somit erhaltene Lösung in 19 Fraktionen unterteilt, die unmittelbar bei –70°C mit flüssigem Stickstoff gefroren und 24 Stunden lyophilisiert wurden. Jede Fraktion des Feststoffes enthielt Taxol (1,05 mg) und ST 983 (29,2 mg).
  • Für den Erhalt der endgültigen Liposom-Suspension wurde das lyophilisierte Produkt zum Zeitpunkt der Verwendung mit Wasser (450 μl) oder anderen Salzlösungen hydratisiert, 10 min gerührt und 30 min stehengelassen, zur Ermöglichung der Vervollständigung des Quell(Hydratisier)vorgangs. MLV-Liposomen wurden erhalten.
  • Testen der physikalischen Stabilität des Präparates
  • Die physikalische Stabilität des Präparates wurde mit Hilfe der Trübheitsmessung unter Aufzeichnen einer TDC (Zeitantriebskurve) bei 800 nm bei 20°C 20 Stunden lang untersucht.
  • Ein konstanter Trübheitstrend wurde aufgezeichnet ohne Ausfällphänomene, was die Stabilität des Präparates anzeigt.
  • Testen der chemischen Stabilität von Taxol im Präparat
  • Die chemische Stabilität von Taxol wurde durch HPLC getestet.
  • Die chromatographischen Bedingungen waren die folgenden:
    Säule: μBondapack C-18
    Eluent: Acetonitril:Wasser 70:30
    Detektor UV-VIS: 227 nm
    Fließrate: 1 ml/min
    Retentionszeit: 4,5 min
  • Die Taxol-Konzentration, bestimmt gegenüber einem Standard, war 2,13 mg/ml. Der Prozentsatz des eingekapselten Taxols war 98%.
  • Beispiel 4
  • Herstellung von Taxol-ST 983 SUV Liposomen
  • 20 mg, 0,0234 mmol Taxol und 556 mg, 0,9417 mmol ST 983 wurden in 20 ml Chloroform aufgelöst.
  • Die Lösung wurde konzentriert, bis ein Lipidfilm auf der Oberfläche des Glaskolbens erhalten wurde.
  • Nach Eliminieren der letzten Spuren von Chloroform mit einer Hochvakuumpumpe wurden 20 ml tert-Butylalkohol zum Lipidfilm gegeben und die somit erhaltene Lösung in 19 Fraktionen unterteilt, die unmittelbar bei –70°C mit flüssigem Stickstoff gefroren und 24 Stunden lyophilisiert wurden. Jede Fraktion des Feststoffes enthielt Taxol (1,05 mg) und ST 983 (29,2 mg).
  • Für den Erhalt der endgültigen SUV-Liposomensuspendion wurde das lyophilisierte Produkt, hydratisiert mit einer PBS-Lösung (1 ml), 20 min bei 0°C mit Ultraschall behandelt.
  • Die Filtration wurde dann auf einem 400 nm-Filter zum Eliminieren von Spuren von Titan durchgeführt, das durch die Ultraschallsonde freigesetzt wurde.
  • Testen der physikalischen Stabilität des Präparates
  • Die physikalische Stabilität des Präparates wurde mit Hilfe der Trübheitsmessung unter Aufzeichnen einer TDC (Zeitantriebskurve) bei 800 nm bei 20°C 20 Stunden lang untersucht.
  • Ein konstanter Trübheitstrend wurde aufgezeichnet ohne Ausfällphänomene, was die Stabilität des Präparates anzeigt.
  • Testen der chemischen Stabilität von Taxol im Präparat
  • Die chemische Stabilität von Taxol wurde durch HPLC getestet.
  • Die chromatographischen Bedingungen waren die folgenden:
    Säule: μBondapack C-18
    Eluent: Acetonitril:Wasser 70:30
    Detektor UV-VIS: 227 nm
    Fließrate: 1 ml/min
    Retentionszeit: 4,5 min
  • Die HPLC-Analyse für die SUV-Liposomsuspension ergab die gleichen Ergebnisse wie bei der entsprechenden MLV-Liposomsuspension und in diesem Fall war der Prozentsatz des eingekapselten Taxols ebenfalls 98%.
  • Die HPLC-Analyse, wiederholt nach 24 Stunden, ergab keine neuen anderen Peaks als den Taxol-Peak, wodurch die Stabilität des aktiven Bestandteils angezeigt wird.
  • Beispiel 5
  • Herstellung von Taxol-ST 983-Cholesterinliposomen (1:15)
  • Diese Arten von Liposomen wurden hergestellt, unter Erhalt von Komplexen mit stabileren Membranen.
  • 6 mg, 0,0101 mmol Taxol und 62,2 mg, 0,105 mmol ST 983 wurden in 10 ml Chloroform aufgelöst.
  • Die Lösung wurde konzentriert, bis ein Lipidfilm auf der Oberfläche des Glaskolbens erhalten wurde.
  • Nach Eliminieren der letzten Spuren von Chloroform mit einer Hochvakuumpumpe wurden 6,3 ml tert-Butylalkohol zum Lipidfilm gegeben und die somit erhaltene Lösung in 5 Fraktionen unterteilt, die unmittelbar bei –70°C mit flüssigem Stickstoff gefroren und 24 Stunden lyophilisiert wurden. Jede Fraktion des Feststoffes enthielt Taxol (1,2 mg), ST 983 (12,44 mg) und Cholesterin (8 mg).
  • Für den Erhalt der endgültigen Liposomsuspension wurde das lyophilisierte Produkt zum Zeitpunkt der Verwendung mit Wasser (1000 μl) oder anderen Salzlösungen hydratisiert, 10 min gerührt und 30 min stehengelassen, um die Vollendung des Quell(Hydratisierungs)vorgangs zu ermöglichen.
  • MLV-Liposome wurden erhalten.
  • Testen der physikalischen Stabilität des Präparates
  • Die physikalische Stabilität des Präparates wurde mit Hilfe der Trübheitsmessung unter Aufzeichnen einer TDC (Zeitantriebskurve) bei 800 nm bei 20°C 6 Stunden lang untersucht.
  • Ein konstanter Trübheitstrend wurde aufgezeichnet ohne Ausfällphänomene, was die Stabilität des Präparates anzeigt.
  • Beispiel 6
  • Herstellung von CPT 83-ST 983 MLV Liposomen (1:40)
  • 6,3 mg, 0,0168 mmol CPT 83 (7-Carbonitrilcamptothecin, beschrieben in WO 97/31003) und 400 mg, 0,667 mmol ST 983 wurden in 20 ml Chloroform aufgelöst.
  • Die Lösung wurde konzentriert, bis ein Lipidfilm auf der Oberfläche des Glaskolbens erhalten wurde.
  • Nach Eliminieren der letzten Spuren von Chloroform mit Hilfe eine Vakuumpumpe wurden 26 ml tert-Butylalkohol zum Lipidfilm gegeben und die somit erhaltene Lösung in 12 Fraktionen unterteilt, die unmittelbar mit flüssigem Stickstoff auf –70°C gefroren und 24 Stunden lyophilisiert wurden. Jede Fraktion des Feststoffes enthielt CPT 83 (0,525 mg) und ST 983 (33,33 mg).
  • Für den Erhalt der endgültigen Liposomsuspension wurde das lyophilisierte Produkt zum Zeitpunkt der Verwendung mit Wasser (1000 μl) oder anderen Salzlösungen hydratisiert und 10 min gerührt.
  • MLV-Liposomen wurden erhalten.
  • Testen der physikalischen Stabilität des Präparates
  • Die physikalische Stabilität des Präparates wurde mit Hilfe der Trübheitsmessung unter Aufzeichnen einer TDC (Zeitantriebskurve) bei 800 nm bei 20°C 20 Stunden lang untersucht.
  • Ein konstanter Trübheitstrend wurde aufgezeichnet ohne Ausfällphänomene, was die Stabilität des Präparates anzeigt.
  • Testen der chemischen Stabilität von CPT 83 im Präparat
  • Die chemische Stabilität von CPT 83 wurde durch HPLC getestet.
  • Die chromatographischen Bedingungen waren wie folgt:
    Säule: Supelcosil LC-ABZ
    Eluent: Phosphatpuffer 20 mM:Methanol 40:60, pH = 7,3
    Detektor UV-VIS: 360 nm
    Fließrate: 1 ml/min
    Retentionszeit: 4,033 min
  • Die CPT 83-Konzentration, bestimmt gegenüber einem Standard, war 0,502 mg/ml.
  • Der Prozentsatz des eingekapselten CPT 83 war 99%.
  • Beispiel 7
  • Herstellung von CPT 83-ST 983 SUV Liposomen (1:40)
  • 6,3 mg, 0,0168 mmol CPT 83 und 400 mg, 0,667 mmol ST 983 wurden in 20 ml Chloroform aufgelöst.
  • Die Lösung wurde konzentriert, bis ein Lipidfilm auf der Oberfläche des Glaskolbens erhalten wurde.
  • Nach Eliminieren der letzten Spuren von Chloroform mit einer Hochvakuumpumpe wurden 26 ml tert-Butylalkohol zum Lipidfilm gegeben und die somit erhaltene Lösung in 12 Fraktionen unterteilt, die unmittelbar bei –70°C mit flüssigem Stickstoff gefroren und 24 Stunden lyophilisiert wurden. Jede Fraktion des Feststoffes enthielt CPT 83 (0,525 mg) und ST 983 (33,33 mg).
  • Für den Erhalt der endgültigen SUV-Liposomensuspension wurde das lyophilisierte Produkt, hydratisiert mit Wasser (1000 μl) 40 min bei 0°C mit Ultraschall behandelt.
  • Die Filtration wurde dann auf einem 400 nm-Filter durchgeführt, zum Eliminieren von Spuren von Titan, das durch die Ultraschallsonde freigesetzt wurde.
  • Testen der chemischen Stabilität von CPT 83 im Präparat
  • Die chemische Stabilität von CPT 83 wurde durch HPLC getestet.
  • Die chromatographischen Bedingungen waren wie folgt:
    Säule: Supelcosil LC-ABZ
    Eluent: Phosphatpuffer 20 mM:Methanol 40:60, pH = 7,3
    Detektor UV-VIS: 360 nm
    Fließrate: 1 ml/min
    Retentionszeit: 4,033 min
  • Die CPT 83-Konzentration, bestimmt gegenüber einem Standard, war 0,3 mg/ml.
  • Der Prozentsatz des eingekapselten CPT 83 war 59%.
  • Die HPLC-Analyse, wiederholt nach 24 Stunden, ergab keine neuen anderen Peaks als den CPT 83-Peak, was die Stabilität der Verbindung anzeigt.
  • Testen der physikalischen Stabilität des Präparates
  • Die physikalische Stabilität des Präparates wurde mit Hilfe der Trübheitsmessung unter Aufzeichnung einer TDC (Zeitantriebskurve) bei 600 nm bei 20°C für 20 Stunden getestet.
  • Ein konstanter Trübheitstrend, der die Stabilität des Präparates anzeigte, wurde ohne Ausfällphänomene aufgezeichnet.
  • Beispiel 8
  • Herstellung von CPT 184-ST 983 MLV-Liposomen (1:40)
  • 7,29 mg, 0,0168 mmol CPT 184 und 400 mg, 0,677 mmol ST 983 wurden in 20 ml Chloroform aufgelöst.
  • Die Lösung wurde konzentriert, bis ein Lipidfilm auf der Oberfläche des Glaskolbens erhalten wurde.
  • Nach Eliminieren der letzten Spuren von Chloroform mit Hilfe einer Vakuumpumpe wurden 26 ml tert-Butylalkohol zum Lipidfilm gegeben und die somit erhaltene Lösung in 12 Fraktionen unterteilt, die unmittelbar bei –70°C mit flüssigem Stickstoff gefroren und 24 Stunden lyophilisiert wurden. Jede Fraktion des Feststoffes enthielt CPT 184 (0,607 mg) und ST 983 (33,33 mg).
  • Für den Erhalt der endgültigen Liposomsuspension wurde das lyophilisierte Produkt zum Zeitpunkt der Verwendung mit Wasser (1000 μl) oder anderen Salzlösungen hydratisiert und 10 min gerührt.
  • MLV Liposomen wurden erhalten.
  • Testen der physikalischen Stabilität des Präparates
  • Die physikalische Stabilität des Präparates wurde mit Hilfe der Trübheitsmessung unter Aufzeichnen einer TDC (Zeitantriebskurve) bei 600 nm bei 20°C 20 Stunden lang untersucht.
  • Ein konstanter Trübheitstrend wurde aufgezeichnet ohne Ausfällphänomene, was die Stabilität des Präparates anzeigt.
  • Testen der chemischen Stabilität von CPT 184 im Präparat
  • Die chemische Stabilität von CPT 184 wurde durch HPLC getestet.
  • Die chromatographischen Bedingungen waren wie folgt:
    Säule: Supelcosil LC-ABZ
    Eluent: Phosphatpuffer 20 mM:Methanol 40:60, pH = 7,3
    Detektor UV-VIS: 360 nm
    Fließrate: 1 ml/min
    Retentionszeit: 25,5 min
  • Die CPT 184-Konzentration, bestimmt gegenüber einem Standard, war 0,600 mg/ml.
  • Der Prozentsatz des eingekapselten CPT 184 war 99%.
  • Beispiel 9
  • Herstellung von CPT 184-ST 983 SUV Liposomen (1:40)
  • 7,29 mg, 0,0168 mmol CPT 184 und 400 mg, 0,677 mmol ST 983 wurden in 20 ml Chloroform aufgelöst.
  • Die Lösung wurde konzentriert, bis ein Lipidfilm auf der Oberfläche des Glaskolbens erhalten wurde.
  • Nach Eliminieren der letzten Spuren von Chloroform mit Hilfe einer Vakuumpumpe wurden 26 ml tert-Butylalkohol zum Lipidfilm gegeben und die somit erhaltene Lösung in 12 Fraktionen unterteilt, die unmittelbar bei –70°C mit flüssigem Stickstoff gefroren und 24 Stunden lyophilisiert wurden. Jede Fraktion des Feststoffes enthielt CPT 184 (0,607 mg) und ST 983 (33,33 mg).
  • Für den Erhalt der endgültigen Liposomsuspension wurde das. lyophilisierte Produkt, das mit Wasser (1000 μl) hydratisiert war, 40 min bei 0°C mit Ultraschall behandelt.
  • Die Filtration wurde dann auf einem 400 nm-Filter zum Eliminieren von Spuren von Titan durchgeführt, das durch die Ultraschallsonde freigesetzt wurde.
  • Testen der chemischen Stabilität von CPT 184 im Präparat
  • Die chemische Stabilität von CPT 184 wurde durch HPLC getestet.
  • Die chromatographischen Bedingungen waren wie folgt:
    Säule: Supelcosil LC-ABZ
    Eluent: Phosphatpuffer 20 mM:Methanol 40:60, pH = 7,3
    Detektor UV-VIS: 360 nm
    Flußrate: 1 ml/min
    Retentionszeit: 25,5 min
  • Die CPT 184-Konzentration, bestimmt gegenüber einem Standard, war 0,36 mg/ml.
  • Der Prozentsatz des eingekapselten CPT 184 war 70%.
  • Die HPLC-Analyse, die nach 24 Stunden wiederholt wurde, ergab keine neuen anderen Peaks als den CPT184-Peak, was die Stabilität des aktiven Bestandteils anzeigt.
  • Testen der physikalischen Stabilität des Präparates
  • Die physikalische Stabilität des Präparates wurde mit Hilfe der Trübheitsmessung unter Aufzeichnen einer TDC (Zeitantriebskurve) bei 600 nm bei 20°C 20 Stunden lang untersucht.
  • Ein konstanter Trübheitstrend wurde aufgezeichnet ohne Ausfällphänomene, was die Stabilität des Präparates anzeigt.
  • In den folgenden Beispielen wurden Liposome durch Verwendung von Helferlipiden und/oder cryoprotektierenden Mitteln hergestellt.
  • Beispiel 10
  • Herstellung von CPT 184-ST 983-Liposomen
  • In einen 2 l-Kolben wurden 100 ml Methylchloroform zu 20 mg CPT 184 und 600 mg ST 983 gegeben und die Mischung wurde leicht bis zur vollständigen Auflösung erwärmt. Die erhaltene Lösung wurde auf einem Rotationsverdampfer konzentriert, bis ein Lipidfilm erhalten wurde, der weiterhin 2 Stunden mit einer Hochvakuumpumpe getrocknet wurde. Der Lipidfilm wurde mit einer Lactoselösung (6 g/300 ml Wasser) bei 45°C hydratisiert und unter Rühren im Rotationsverdampfer für etwa 2 Stunden gelassen. Die Suspension wurden dann 2 Stunden mit Ultraschall behandelt, wobei jeder Cyclus eine halbe Stunde dauerte. Anschließend wurde das Produkt durch ein 200 nm-Filter filtriert und lyophilisiert.
  • Testen der chemischen Stabilität von CPT 184 im Präparat
  • Die chemische Stabilität von CPT 184 wurde durch HPLC sichergestellt. Das Produkt war während des 24-stündigen Tests stabil.
  • Testen der physikalischen Stabilität des Präparates
  • Die physikalische Stabilität des Präparates wurde mit Hilfe der Trübheitsmessung getestet. Das Produkt war während des 24-stündigen Tests stabil. Die Teilchengröße war ebenfalls stabil (Mittelwert von 100 nm).
  • Beispiel 11
  • Herstellung von CPT 184-ST 983 Liposomen
  • Für 1 ml der liposomalen Formulierung (POPC – 1-Palmitoyl-2-oleoylphosphatidylcholin 5 mM; ST 983 1,25 mM; CPT 184 0,25 und Trehalose 150 mM) wurde die folgende Vorgehensweise angewandt:
  • 0,11 mg, 0,25 μmol CPT 184 wurden in 250 μl Ethylacetat aufgelöst, 3,79 mg, 4,89 μmol POPC wurden in 100 μl Ethanol aufgelöst und 0,74 mg, 1,25 μmol ST 983 wurden in 100 μl Ethanol aufgelöst. Die drei Lösungen wurden zusammen vermischt und verwirbelt. Die Lösungsmittel wurden mit einem Rotationsverdampfer bei Raumtemperatur, 80 mbar verdampft. Der Lipidfilm wurde zwei Stunden im Dunkeln getrocknet. Der Lipidfilm wurde in einer 1 ml Lösung aus 150 mM D(+)-Trehalosedihydrat (Fluka, HPLC 99%) suspendiert, durch ein 0,22 nm-Filter sterilisiert und zwei Minuten verwirbelt. Die Suspension wurde 21-mal durch 200 nm Polycarbonat-Filter extrudiert. Die extrudierte Liposomensuspension wurde in flüssigem Stickstoff gefroren und zwei Nächte lyophilisiert. Ein weißer Feststoff wurde erhalten.
  • Beispiel 12
  • Herstellung von CPT 184-ST 983-Liposomen
  • Die gleiche Vorgehensweise von Beispiel 11 wurde verwendet, mit der Ausnahme, daß Trehalose 500 mM verwendet wurde.
  • Antikrebsaktivität von ST 983 Liposom-Antikrebsmittel-Komplex
  • Wie nachfolgend ersichtlich ist, zeigte das ST 983 Liposom eine prädominante Akkumulation beim pulmonaren Niveau. Dieses Charakteristikum der Stellenspezifität hat dessen Verwendung in einem Mäusemodell von Pulomonarkarzinogenese favorisiert.
  • Das bei diesem Experiment verwendete Antikrebsmittel war Taxol.
  • Zum Erzeugen des Tumors in vivo erhielten nicht-anästhesierte Balb/c-Mäuse Injektionen von 3 × 105 Zellen Mäusepulmonarkarzinom M109 in 0,1 ml RPMP-1640 (Sigma) im Qudriceps femoris der rechten Hinterpfote.
  • Zehn Tage nach der Implantation des Tumors wurde der Liposom-Taxol-Komplex mit phosphatgepufferter Salinelösung (PBS, SIGMA, P-4417) verdünnt und intravenös bei einer Konzentration von 2,5 mg/ml St 983 und 75 μg/ml Taxol injiziert.
  • Taxol (Paclitaxel INDENA), das als Kontrolle verwendet wurde, wurde im Cremophor-Vehikel EL (BASF) bei einer Konzentration von 20 mg/ml aufgelöst und bei +4°C für die nächsten 24 Stunden abgeschirmt gegenüber Licht gelagert. Zum Zeitpunkt der Verwendung wurde es mit phosphatgepufferter Salinelösung (PBS, SIGMA) verdünnt und intravenös im gleichen Volumen und unter gleichen Konzentrationsbedingungen wie für Taxol, das durch das ST 983 Liposom transportiert wurde, injiziert.
  • Das Cremophor wurde durch 1:1-Verdünnen mit Ethylalkohol hergestellt.
  • Verabreichungen erfolgten für sieben aufeinanderfolgende Tag, beginnend am Tag 10 nach Impfung des Tumors. Die Tiere wurden unter Beobachtung bis zum Tag 17 nach der Impfung gehalten und durch Zervikaldislokation getötet und deren Lungen wurden für die Bestimmung der Anzahl der Metastasen entfernt. Das Färben der Lungen zum Ermitteln von Metastasen erfolgte durch Inkubieren der Lungen für 10 Tage in 5 ml Bouin's-Lösung, bestehend aus 71%iger gesättigter Picrinsäure-Lösung, 4,8% Eisessig (Merck) und 24% 10%igem Formaldehyd (Fluka). Am Ende der Inkubationsperiode in Bouinis-Lösung wurde die Anzahl der Metastasen gezählt.
  • Im Vergleich zu den nicht-behandelten Kontrollmäusen zeigte das Cremophor-transportierte Taxol keine reduzierende Wirkung bezüglich der Anzahl der Pulmonarmetastaten, obwohl die zuletzt genannten kleiner waren als jene der unbehandelten Kontrollen, während Taxol, das mit dem ST 983-Liposom komplexiert war, eine signifikante Reduktion bei der Anzahl und der Größe der Pulmonalmetastasen zeigte.
  • Die statistische Analyse der Daten für die Anzahl der Lungenmetastasen erfolgte unter Verwendung der nicht-parametrischen Mann-Whitney-Tests für ungepaarte Daten.
  • Die erhaltenen Daten sind unten in Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1 Lungenmetastasen am 17. Tag nach M109-Tumorimpfung in BALB/c-Mäusen nach Behandlung mit Taxol und Taxol/Liposom ST983
    Figure 00210001
    • M
    = mittel (1–2 mm Durchmesser)
    S
    = klein (< 1 mm Durchmesser)
  • In vitro-Cytotoxizitätstests
  • Toxizitätstests erfolgten auf HeLa- und M109-Zellen in 96 Wellplatten. Am Tag nach dem Auftragen wurden die Zellen mit den zu untersuchenden Molekülen für die nächsten 48 Stunden behandelt. Die Zellen wurden dann mit PBS gewaschen und unter normalen Wachstumsbedingungen 48 Stunden gelassen. Nach Entfernung des Wachstumsmediums wurden die Zellen auf Eis mit 16% TCA inkubiert, 3-mal in H2O gewaschen, 30 Minuten mit Sulforhodamin B (SRB) in 1% Essigsäure behandelt, 3-mal in 1%iger Essigsäure alleine gewaschen, 20 Minuten in TRIS 10 mM pH 10,5 inkubiert und schließlich wurden Ablesungen bei 540 nm durchgeführt.
  • Cytotoxizitätstest mit CPT 83
  • In vitro-Cytotoxizitätstests mit CPT 83 wurden durchgeführt, um die Cytotoxizität des Antikrebsmittels, das mit dem Liposom komplexiert war, als vorläufige Anzeige der effizienten Aktivität auszuwerten.
  • Zum Auswerten der Fähigkeit des Liposoms zum Transport von CPT 83 in vitro in M109 Zellen wurde der oben beschriebene Sulforhodamin B-Test verwendet.
  • Zusätzlich wurde die Cytotoxizität von CPT 83, aufgelöst in Dimethylsulfoxid (DMSO), ebenfalls im Vergleich zu der des gleichen Moleküls, das mit ST 983 Liposom komplexiert war, ausgewertet.
  • Der Liposom-CPT 83-Komplex wurde bei den Cytotoxizitäts-Assays mit den in den Tabellen 2.1, 2.2 und 3.3 angezeigten Konzentrationen sowohl bei der SUV als auch der MLV-Konfiguration verwendet. Das molare Verhältnis von Liposom:CPT 83 war 40:1.
  • Die mittleren Cytotoxizitätswerte der ST 983-CPT 83-Komplexe in den SUV- und MLV-Konfigurationen, angegeben in den Tabellen 2.1, 2.2 und 2.3 unten, zeigen an, daß das ST983 Liposom in der Lage ist, CPT 83 auf gleiche Weise wie DMSO zu transportieren, wobei Cytotoxizitätswerte der gleichen Größenordnung präsentiert werden.
  • Tabelle 2.1 Cytotoxizität (SRB) von ST 983 SUV-CPT 83 Konzentration in μM
    Figure 00220001
  • Die in der Tabelle angegebenen Werte betreffen die Ablesungen der optischen Dichte bei 540 nm.
  • Tabelle 2.2 Cytotoxizität (SRB) von ST 983 MLV-CPT 83 Konzentration in μM
    Figure 00230001
  • Die in der Tabelle angegebenen Werte betreffen die Ablesungen der optischen Dichte bei 540 nm.
  • Tabelle 2.3 Cytotoxizität (SRB) von DMSO-CPT 83 Konzentration in μM
    Figure 00230002
  • Die in der Tabelle angegebenen Werte betreffen die Ablesungen der optischen Dichte bei 540 nm.
  • Biologische Aktivität der ST 983 Liposom-CPT 184-Komplexes
  • Die biologische Aktivität der Liposomen von Beispiel 10 (nachfolgend als Liposom A bezeichnet) und von Beispiel 12 (nachfolgend als Liposom B bezeichnet) wurde getestet.
  • Toxizität in gesunden Mäusen
  • Liposomen A und B wurden oral, intravenös im Vergleich zum freien CPT 184 bei einer Dosis von 1,2 mg/kg entsprechend dem g4dx4-Schema gegeben. Die beiden Liposomen hatten keine signifikanten Wirkungen beim Gewicht des Körpers, den Lungen, Milz und Nieren. Liposom B intravenös und Liposom A oral verabreicht, beeinflußten das Thymusgewicht gleichermaßen wie freies CPT 184. Intravenöses Liposom A hatte nur eine minimale Wirkung. Hämatologische Parameter zeigten keine signifikanten Variationen nach 24 Stunden mit beiden Liposomen. Liposom A, intravenös entsprechend qd5-Schema verabreicht, zeigte eine Toxizität, die mit freiem CPT 184 vergleichbar war.
  • Lungentropismus von Liposomen
  • Liposomen A und B zeigten prädominante Akkumulation beim pulmonaren Niveau. Die Liposomen wurden i.v. 1,2 mg/kg verabreicht. Freies CPT 184 wurde oral 1,2 mg/kg in DMSO verabreicht. Die Tiere, gesunde Mäuse, wurden 24 Stunden nach der letzten Verabreichung getötet. Lungen wurden vom Körper exzisiert und in flüssigem Stickstoff gefroren. Nach Auftauen wurden die Organe gesammelt und in 0,1% Essigsäure/Acetonitril 1:5 homogenisiert. Homogenate wurden in drei Aliquote unterteilt, wobei zwei von diesen mit CPT 184 für die Wiedergewinnungsberechnung versetzt wurden. Die drei Proben wurden bei 16 000 g 5 Minuten zentrifugiert. Die Überstände wurden gewonnen und mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wurde mit einer Speedvac getrocknet und der Rest wurde erneut in Acetonitril aufgelöst unter Erhalt der Menge, die einem Tier in 50 μl entspricht, zum Beladen in HPLC. HPLC wurde auf einer Waters Symmetry C18 3,5 μm (4,6 × 7,5 mm) durchgeführt. Ein Merck-Fluorimeter war der Detektor bei der 370 nm-Exzitation und 510 nm Emission. Der Eluent war Wasser/Acetonitril 60:40, isokratisch. Das Probenvolumen war 50 μl. Die CPT 184 Wiedergewinnung war etwa 70%. Sowohl das Liposom A als auch das Liposom B ergab einen Akkumulationsgehalt für CPT 184, der höher ist als freies CPT 184 in DMSO, wie in 1 gezeigt ist.

Claims (11)

  1. Verwendung des Liposoms, umfassend eine Verbindung der Formel (II):
    Figure 00250001
    worin R3 eine gesättigte, geradkettige oder verzweigte Acylkette mit 4 bis 26 Kohlenstoffatomen ist, R4 eine gesättigte oder ungesättigte, geradkettige oder verzweigte Alkylkette mit 4 bis 26 Kohlenstoffatomen ist und X– das Anion einer pharmakologisch akzeptablen Säure ist, zur Herstellung eines Medikamentes zum Transportieren von Arzneimitteln.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, worin R3 bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Nonanoyl, Dodecanoyl, Myristoyl, Palmitoyl oder Stearoyl.
  3. Verwendung nach Anspruch 1, worin R4 bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Nonyl, Undecyl, Tetradecyl, Hexadecyl oder Oleyl.
  4. Verwendung nach Anspruch 1, worin X– ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Chlorid, Bromid, Iodid, Aspartat, saurem Aspartat, Citrat, saurem Citrat, Tartrat, saurem Tartrat, Phosphat, saurem Phosphat, Fumarat, saurem Fumarat, Glycerophosphat, Glucosephosphat, Lactat, Maleat, saurem Maleat, Mucat, Orotat, Oxalat; saurem Oxalat, Sulphat, saurem Sulphat, Trichloracetat, Trifluoracetat, Methansulphonat, saurem Sulphat und saurem Pamoat.
  5. Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 4, worin die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus – Palmitoyl-L-carnitinchloridundecylester – Stearoyl-L-carnitinchloridundecylester; – Stearoyl-L-carnitinchloridtetradecylester; – Palmitoyl-L-carnitinchloridtetradecylester; – Myristoyl-L-carnitinchloridtetradecylester; – Palmitoyl-L-carnitinbromidhexadecylester.
  6. Verwendung nach Anspruch 1, worin das Arzneimittel ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Antikrebs-, antiangiogenen, Antivirus-, antibakteriellen, Antipilz-, Antiprotozoanmitteln, Verbindungen, die für das kardiovaskuläre System aktiv sind, oder immunogenen Peptiden.
  7. Verwendung nach Anspruch 6, worin das Arzneimittel ein Antikrebs- oder antiangiogenes Mittel ist.
  8. Verwendung nach Anspruch 7, worin das Antikrebsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Taxol oder einem Derivat von Camptothecin.
  9. Verwendung nach Anspruch 8, worin das Derivat von Camptothecin ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus – 7-Benzyloxyiminomethylcamptothecin oder – 7-Butoxyiminomethylcamptothecin.
  10. Verwendung nach Anspruch 1, worin das Liposom zusätzlich Helferlipide enthält.
  11. Verwendung nach Anspruch 10, worin das Helferlipid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cholesterol, 1-Palmitoyl-2-oleoylphosphatidylcholin oder Dioleylphosphatidylcholin.
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