DE602004002699T2

DE602004002699T2 - P-Selectin Zielgerichtetenligand und dessen Zusammensetzung

Info

Publication number: DE602004002699T2
Application number: DE602004002699T
Authority: DE
Inventors: C. Chantal APPELDOORN; Josephus Theodorus VAN BERKEL; Anna Erik BIESSEN
Original assignee: Astellas Pharma Inc
Current assignee: Astellas Pharma Inc
Priority date: 2003-05-30
Filing date: 2004-06-01
Publication date: 2007-08-16
Anticipated expiration: 2024-06-02
Also published as: JP2007500200A; WO2004105783A1; JP4771291B2; CA2527438A1; EP1638588A1; ES2273260T3; EP1481683A1; US8003596B2; US20070185348A1; EP1638588B1; DE602004002699D1; ATE341337T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft P-Selectin-Targeting-Liganden und Zusammensetzungen, die solche Liganden enthalten, einschließlich Kits.
Hintergrund der Erfindung
Entzündungen und entzündliche Prozesse spielen eine Hauptrolle in der Pathophysiologie von zahlreichen Krankheiten und Zuständen. Zustände des Gehirns, in denen erhöhte Spiegel von Entzündungsvermittlern gefunden wurden, schließen schwere traumatische Gehirnverletzung, rezidivierend-remittierende multiple Sklerose, Gehirnarterienverschluss, Ischämie und Schlaganfall ein. Zustände des Herzens, in denen Vermittler, wie z.B. Selectine, in Verdacht stehen, eine Rolle zu spielen, schließen akuten Herzinfarkt, Arterienverletzung, die beispielsweise bei der Angioplastie erzeugt wird, und Ischämie ein. In gleicher Weise sind Selectine in Zuständen der Nieren involviert, wie z.B. Nierenverletzung aus Ischämie und Reperfusion sowie Nierenversagen. Darüber hinaus scheinen Selectine eine Rolle bei der Organtransplantatabstoßung, der kalten Ischämie, dem hämorrhagischen Schock, dem septischen Schock, der Tumormetastase, der chronischen Entzündung, dem Gelenkrheumatismus, der entzündlichen Darmkrankheit, der Atherosklerose, der Restenose, der Angiogenese, der disseminierten intravaskulären Gerinnung, der posttraumatischen Lungeninsuffizienz und dem Kreislaufschock zu spielen.
Zelloberflächenadhäsionsmoleküle wurden als Schlüsselvermittler in zahlreichen zellulären Prozessen einschließlich Zellwachstum, Differenzierung, Immunzellentransmigration und -antwort und Krebsmetastase erkannt. Vier Hauptkategorien von Adhäsionsmolekülen wurden identifiziert: die Zelladhäsionsmoleküle (CAMs) aus der Immunoglobulinsuperfamilie, Cadherine, Integrine und Selectine. Die Selectine stellen eine Familie von derzeit drei tramsmembranösen Kohlenhydrat-bindenden Glycoproteinen dar: "endotheliales" E-Selectin, L-Selectin auf Leukozyten und P-Selectin auf Thrombozyten. Alle drei Selectine sind an ein zweiwertiges Kation (z.B. Calcium) gebunden und besitzen eine extrazelluläre Domäne mit einem Kohlenhydrat-Erkennungsmotiv, einem epidermalen Wachstumsfaktormotiv und einigen kleineren auf Komplementregulatorproteine bezogene Domänen.
Humanes P-Selectin (das auch als GMP-140, LECAM-3, PADGEM, CD62, CD62P bezeichnet wird) wird durch Thrombozyten und Endothelzellen exprimiert. Wenn es auf deren Zelloberflächen exprimiert wird, ist seine nennenswerteste Wirkung das Verlangsamen von Leukozyten beim Verlassen der Kapillaren und Eintreten in die postkapillaren Venülen, wobei letztere die Hauptregionen für Leukozyt-Endotheladhäsion darstellen. Der Verlangsamungsprozess wird als Leukozytenrollen beobachtet, wodurch eine anfängliche Adhäsion mit relativ geringer Affinität bezeichnet. Die feste Adhäsion von rollenden Leukozyten wird vornehmlich durch Integrine vermittelt.
In Endothelzellen wird P-Selectin auf Weibel-Palade-Körperchen gelagert; in Thrombozyten wird es in α-Granula gefunden. Nach der Aktivierung wird P-Selectin innerhalb von wenigen Minuten als Reaktion auf eine Vielzahl von Entzündungserregern und thrombenbildenden Mitteln zur Zelloberfläche mobilisiert. Die Hauptfunktion des endothelialen P-Selectins ist das Begleiten der Leukozyten in die postkapillaren Venülen, während P-Selectin auf Thrombozyten auch zur Bildung von Thromben führt. Einer der derzeit bekannten natürlichen Liganden von P-Selectin ist PSGL-1 (P-Selectin-Glycoprotein-Ligand-1), ein 160 kDa-Sialoprotein, das an der Oberfläche von Leukozyten exprimiert wird, wo es an dem Uropod konzentriert vorliegt.
Detailliertere Beschreibungen der Struktur und Funktionen des P-Selectins sind in zahlreichen Publikationen, wie z.B. J. Panes, Pathophysiology 5: 271 (1999); F. Chamoun et al., Frontiers in Bioscience 5: e103 (01. Nov. 2000); S.-I. Hayashi, Circulation 102: 1710 (2000), zu finden.
P-Selectin scheint auch direkter in der Blutplättchenaggregation involviert zu sein, wie kürzlich durch Studien der Ca-unabhängigen Wechselwirkungen von P-Selectin mit 3-sulfatiertem Galactosylceramid (auch als Sulfatide bezeichnet) gezeigt wurde. Diese Wechselwirkung findet wahrscheinlich an einer anderen Bindungsregion des P-Selectins statt, da die Bindung durch den Antikörper WASP12.2, jedoch nicht durch AK4 inhibiert werden kann, während die Bindung des natürlichen P-Selectin-Liganden PSGL-1, der in der Leukozytenadhäsion involviert ist, sowohl durch WASP12.2 als auch durch AK4 blockiert wird. Die Bindungsregionen scheinen jedoch zu überlappen. Es wird vermutet, dass Sulfatid-Wechselwirkungen Blutplättchenaggregate stabilisieren.
Andererseits scheint es plausibel zu sein, diese und andere Zustände, die die Aktivierung von Endothelzellen und Leukozyten und insbesondere die Mobilisierung und Exprimierung von P-Selectin einbeziehen, durch spezifisches Unterbrechen der P-Selectin-Kaskaden zu verbessern. Dies kann beispielsweise durch Verabreichung von Liganden geschehen, die selektiv an humanes P-Selectin binden, jedoch nicht seine biologische Wirksamkeit besitzen. Durch dieses Verfahren könnte mobilisiertes P-Selectin inaktiviert und Leukozyteninduzierte Gewebeschädigung verhindert werden. Voraussichtlich könnte dieselbe Wirkung durch Gentherapie erzielt werden, vorausgesetzt, dass der P-Selectin-Ligand oder -Antagonist ein Peptid oder modifiziertes Peptid ist. Gemäß diesem Verfahren würden Körperzellen einer Person, die einer Therapie bedarf, mit einem Expressionsvektor transfiziert werden, der eine DNA-Sequenz encodierend für einen P-Selectin-Antagonisten trägt.
Andererseits können P-Selectin-bezogene Krankheiten und Zustände durch Wirkstoffe behandelt oder verhindert werden, die nicht direkt mit P-Selectin interagieren, jedoch einige der nachteiligen Wirkungen der P-Selectin-Aktivierung in den entsprechenden Zellen und Geweben unterdrücken. Unter diesen Wirkstoffen sind entzündungshemmende Mittel, wie z.B. Glucocorticoide, zur therapeutischen Intervention potenziell nützlich.
Ein Hauptnachteil jeglicher systemischer Therapie mit hochaktiven Verbindungen ist ihre Verteilung innerhalb des Organismus und die Aussetzung von nicht betroffenen Zellen und Geweben, die potenziell zu substanziellen Nebenwirkungen führen. Es würde äußerst wünschenswert sein, über Verfahren und Wirkstofftransportsysteme zu verfügen, die den gezielten Transport von Wirkstoffen, insbesondere zu betroffenen Zellen, ohne substanzielles Aussetzen nicht betroffener Zellen zu ermöglichen.
Während derzeit kein pharmazeutisches Produkt auf dem Markt erhältlich ist, das ein zellspezifisches gezieltes Wirkstofftransportsystem umfasst, wurden eine Reihe von experimentellen Transportsystemen in der wissenschaftlichen und Patentliteratur beschrieben. Wirkstofftargeting kann auf Konjugaten von Wirkstoffen mit Target-erkennenden Liganden basieren, wobei solche Konjugate molekulare Wirkstofftransportsysteme darstellen. Ein genereller Nachteil solcher Konjugate ist das geringe Verhältnis von Wirkstoff pro Ligand (oft nur 1:1), was zu einer Einwirkung von hohen Ligandenspiegeln führt.
Als Beispiel berichten Everts et al. (J. Immunol. 168: 883 (2002)) von einem selektiven intrazellulären Transport von Dexamethason in aktivierte Endothelzellen unter Verwendung eines E-Selectin-bezogenen Immunokonjugats. Dexamethason war kovalent an einen Anti-E-Selectin-Antikörper gebunden, was zu einem sogenannten Dexamethason-anti-E-Selectin-Konjugat führte. Die Bindung des Konjugats an E-Selectin wurde unter Verwendung von Oberflächenplasmonresonanz und Immunhistochemie untersucht. Darüber hinaus wurde die Internalisierung des Konjugats unter Verwendung von konfokaler Laserrastermikroskopie und Immuno-Transmissionselektronenmikroskopie untersucht. Es wurde gezeigt, dass das Dexamethason-anti-E-Selectin-Konjugat genauso wie der nicht-modifizierte Anti-E-Selectin-Antikörper selektiv an TNF-α-stimulierte Endothelzellen und nicht an ruhende Endothelzellen gebunden war. Nach der Bindung wurde das Konjugat internalisiert und zu multivesikulären Körperchen geleitet, die einen Lyosom-bezogenen Zellraum darstellen. Nach intrazellulärem Abbau wurde pharmakologisch aktives Dexamethason freigesetzt, wie in Endothelzellen gezeigt wurde, die mit einem Glucocorticoid-Responsive-Reportergen transfiziert wurden. Darüber hinaus war extrazellulär transportiertes Dexamethason fähig, das proinflammatorische Gen IL-8 runterzuregulieren.
Alternativ können Träger-basierte Wirkstofftransportsysteme durch Anlagerung von geeigneten Target-erkennenden Liganden auf ihrer Oberfläche Target-spezifisch gemacht werden. Beispielsweise wurde diese Vorgehensweise unter Verwendung von Liposomen als Träger eingesetzt. Einige der kürzlichen auf dieser Vorgehensweise basierenden Entwicklungen wurden durch Maruyama (Biosci. Rep. 22: 251 (2002)) zusammengefasst.
Zum Beispiel wurden Verfahren für den gezielten Wirkstofftransport von E-Selectin von Spragg et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. USA 94: 8795 (1997)) untersucht. Gemäß dieser Druckschrift wurde E-Selectin als molekulares Target für den Endothel-selektiven Transport von therapeutischen Wirkstoffen oder Genen zur Behandlung von verschiedenen Krankheitszuständen ausgewählt. Liposome verschiedenen Typs (klassische, sterisch stabilisierte, kationische, pH-empfindliche), die jeweils mit mAb H18/7 konjugiert wurden, einem murinen monoklonalen Antikörper, der die extrazelluläre Domäne des E-Selectins erkennt, binden selektiv und spezifisch an IL-1 β-aktivierten HWEC bei bis zu 275-fach so hohen Levels wie an nicht-aktiviertem HWEC. E-Selectin-Targeted-Immunoliposome traten in sauren, perinuklearen Vesikeln 2-4 h nach der Bindung an die Zelloberfläche übereinstimmend mit der Internalisierung über den endosomallysomalen Pathway auf. Aktiviertes, mit E-Selectin-Targeted-Immunoliposomen inkubiertes HWEC, das mit dem zytotoxischen Wirkstoff Doxorubicin beladen war, wies signifikant erniedrigtes Zellüberleben auf, während nicht-aktiviertes HWEC durch eine solche Behandlung nicht betroffen war.
Andererseits gibt es Beweise, dass P-Selectin zumindest als geeignetes molekulares Target für aktivierte Endothelzellen auch in entzündlichen Prozessen involviert sein kann, wie oben beschrieben wurde. Es gibt daher einen Bedarf für Wirkstofftransportsysteme, die spezifisch auf dieses Mitglied der Selectinfamilie und dadurch auf Zellen und Gewebe ausgerichtet sind, die eine (erhöhte) P-Selectin-Expression oder Darstellung zeigen.
Die meisten der derzeit bekannten P-Selectin-bindenden Verbindungen sind Kohlenhydrate, die auf Sialyl Lewis X (sLeX), ein Tetrasaccharid und natürlicher Ligand der Selectine, basieren. Diese Imitatoren weisen jedoch den Nachteil auf, eine geringe Affinität (im mikromolaren bis millimolaren Bereich) und eine geringe spezifische Wirksamkeit zu zeigen, da sie dazu neigen, an andere Mitglieder der Selectinfamilie mit nahezu derselben Affinität zu binden, die sie für P-Selectin aufweisen.
Daher existiert auch Bedarf an solchen, auf P-Selectin gerichteten gezielten Wirkstofftransportsystemen, die eine hohe Affinität und spezifische Wirksamkeit für das Targetmolekül aufweisen.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von P-Selectin-Targeting-Ligandenmolekülen.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von Zusammensetzungen, die solche P-Selectin-Targeting-Ligandenmoleküle umfassen und zur Verwendung als pharmazeutische Zubereitungen, die sicher und effektiv verabreicht werden können, und als diagnostische Zubereitungen nützlich sind.
In einem weiteren Aspekt ist ein erfindungsgemäßes Ziel, Kits zur Herstellung von solchen Zusammensetzungen bereitzustellen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
In einem ersten Aspekt stellt die Erfindung ein Targeting-Ligandenmolekül, umfassend:

– einen Target-erkennenden Rest
– einen Abstandhalter, der aus einem wasserlöslichen Oligomer oder Polymer gebildet wird und
– einen Verankerungsrest, der aus einem amphiphilen Lipid gebildet wird, das aus mindestens einem hydrophoben apolaren Rest und einer hydrophilen polaren Kopfgruppe besteht, dadurch gekennzeichnet, dass sich der Target-erkennende Rest aus folgenden ableitet:
(1) einem Peptid, Peptoid oder Derivat davon mit einer Aminosäuresequenz X(A_X)_mA₃A₁A₂A₁Y, oder einem funktionellen Äquivalent der Sequenz, worin:
– A₁ D- oder L-Cystein (C), D- oder L-Valin (V) oder ein Analogon oder Mimetika davon ist;
– A₂ D- oder L-Asparaginsäure (D) oder ein Analogon davon ist;
– A₃ D- oder L-Phenylanalin (F) oder D- oder L-Tryptophan (W) oder ein Analogon oder Mimetika davon ist;
– A_X eine D- oder L-Aminosäure ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Glutaminsäure (E), Asparaginsäure (D), Glycin (G) und Cystein (C) und Analoga oder Mimetika davon besteht;
– X die N-terminale Seite der Sequenz darstellt und Wasserstoff oder ein Rest ist, der 1 bis 6 D- oder L-Aminosäuren oder Analoga davon umfasst;
– Y die C-terminale Seite der Sequenz darstellt und -OH oder ein Rest ist, der 1 bis 11 D- oder L-Aminosäuren oder Analoga davon umfasst; worin X und Y zusammen ein cyclisches System bilden können; dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eines von X und Y oder X + Y mit der Gruppe R¹-(Z)_n- substituiert ist, worin:
– Z aus -CO-, -O-, -NR²- und -CO-NR²- ausgewählt ist;
– worin R¹ und R² unabhängig voneinander aus folgenden ausgewählt sind:
a) H;
b) einer C₁-C₈-Alkylgruppe;
c) einer C₂-C₈-Alkylgruppe, worin mindestens ein C-Atom durch ein Stickstoff-, Sauerstoff- oder Schwefelatom ersetzt ist;
d) einer C₆-C₁₄-Arylgruppe, die mit mindestens einer Gruppe substituiert sein kann, die aus Halogen, C₁-C₆-Alkyl, -CF₃, -OH, -O-C₁-C₆-Alkyl, -COOH, -COO-C₁-C₆-Alkyl, -NO₂, -NH₂, -NH-C₁-C₆-Alkyl, -N-(C₁-C₆-Alkyl)₂ und -SO₃H ausgewählt ist;
e) einer Heteroarylgruppe, die aus 5- oder 6-gliedrigen Ringsystemen und Benzo-kondensierten Ringsystemen ausgewählt ist und mindestens ein Heteroatom aufweist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel besteht, worin die Heteroarylgruppe mit mindestens einer Gruppe substituiert sein kann, die aus einem Halogen, -C₁-C₆-Alkyl, -CF3, -OH, -O-C₁-C₆-Alkyl, -COOH, -COO-C₁-C₆-Alkyl, -NO₂, -NH₂, -NH-C₁-C₆-Alkyl, -N-(C₁-C₆-Alkyl)₂ und -SO₃H ausgewählt ist;
f) einer Aralkylgruppe, die eine Alkylgruppe, wie in b) oder c) definiert, und eine Arylgruppe oder Heteroarylgruppe, wie in d) oder e) definiert, umfasst; und
– m und n ganze Zahlen sind, die unabhängig voneinander aus 0 und 1 ausgewählt werden, unter der Maßgabe, dass n nicht 0 ist, wenn R¹ H ist;
(2) einer Verbindung, die durch die folgende Formel Ia dargestellt ist:
und seinem Stereoisomer, das durch die folgende Formel Ib dargestellt ist:
worin: X eine optionale Gruppe ist, die -O-, -OCH₂-, -S-, -SCH₂-, -NH- oder -NHCH₂- darstellt; R¹ QR⁴ darstellt, worin Q -O-, -NH-, -NH-(C=O)-, -O-(C=O), -NH-(C=O)-O- oder NH-(C=O)-NH- darstellt; und worin R⁴ Wasserstoff oder eine Verbindung darstellt, die mindestens ein Kohlenstoffatom umfasst; R² ein Rest ist, der eine negative Ladung trägt und R³ jede Gruppe sein kann, unter der Maßgabe, dass X vorhanden ist, wenn Q = -O- und R⁴ -H ist;
(3) Gallussäure oder einem Derivat davon, einem Polyphenol oder einem Polyhydroxyphenol der Strukturformel II:
dadurch gekennzeichnet, dass: R¹ = Wasserstoff; eine geradkettige oder verzweigte aliphatische (C₁-C₄)-Alkylgruppe oder eine aromatische Gruppe, die jeweils optional mit einer Hydroxylgruppe, einer Carbonsäuregruppe, einer Aminogruppe oder einer geradkettigen oder verzweigten aliphatischen Alkylgruppe substituiert sind; R² = eine optionale Gruppe, die eine geradkettige oder verzweigte aliphatische (C₁-C₄)-Alkylgruppe ist; R³ = eine geradkettige oder verzweigte aliphatische (C₁-C₄)-Alkylgruppe, die optional mit einer oder mehreren Carbonsäuregruppen substituiert ist; eine geradkettige oder verzweigte aliphatische (C₁-C₄)-Alkylamidgruppe; oder eine (C₃-C₈)-Cycloalkylgruppe, die optional mit einer geradkettigen oder verzweigten aliphatischen (C₁-C₄)-Alkylgruppe oder einer oder mehreren Carbonsäuregruppen substituiert ist.

Als Targeting-Ligandenmoleküle sind Verbindungen mit selektiver Affinität für P-Selectin bevorzugt.
In diesen Molekülen kann der Target-erkennende Rest aus einem Peptid, Peptoid oder Derivat davon stammen.
Peptide werden als Amide definiert, die aus zwei oder mehreren Aminosäuren durch Kombination der Aminogruppe einer Säure mit der Carboxylgruppe der anderen (Merriam Webster Medical Dictionary 2001) hergeleitet werden. Wie hierin verwendet wird, kann sich ein Peptid auch auf eine peptidische Struktur innerhalb eines Moleküls beziehen. Typischerweise sind Peptide aus natürlich vorkommenden L-α-Aminosäuren zusammengesetzt, nämlich Alanin (Ala oder A), Arginin (Arg oder R), Asparagin (Asn oder N), Asparaginsäure (Asp oder D), Cystein (Cys oder C), Glutamin (Gln oder Q), Glutaminsäure (Glu oder E), Glycin (Gly oder G), Histidin (His oder H), Isoleucin (Ile oder I), Leucin (Leu oder L), Lysin (Lys oder K), Methionin (Met oder M), Phenylalanin (Phe oder F), Prolin (Pro oder P), Serin (Ser oder 5), Threonin (Thr oder T), Tryptophan (Trp oder W), Tyrosin (Tyr oder Y) und Valin (Val oder V).
Funktionelle Äquivalente der erfindungsgemäßen Peptide sind Protein-Moleküle, die dieselbe Art der Bindungsaktivität für humanes P-Selectin, aber nicht notwendigerweise den gleichen Betrag aufweisen und können beispielsweise modifizierte Peptide, Peptoide, Peptidanaloga oder Peptidomimetika sein.
Modifizierte Peptide sind Moleküle, die aus Peptiden durch Einführung von Substituenten oder funktionellen Gruppen hergeleitet werden, die nicht in natürlich vorkommenden Aminosäuren vorliegen. Der Begriff schließt auch Verbindungen ein, die durch Reaktion von Peptiden mit Molekülen anderer chemischer Klassen erhalten werden, unabhängig davon, ob diese Moleküle natürlich vorkommen oder nicht. Beispielsweise werden biotinylierte Peptide, Glycoproteine und Lipoproteine oft in der Natur gefunden, während Peptide, die mit Polyethylenglycol modifiziert sind, wie z.B. PEG-Interferone, Beispiele für chemisch modifizierte Peptide sind, die entworfen wurden, um einige, jedoch nicht alle der peptidischen Eigenschaften zu ändern.
Peptoide sind genauso wie Peptide Amide aus zwei oder mehreren Aminosäuren. Sie werden jedoch oft nicht direkt aus natürlich vorkommenden Aminosäuren, sondern aus verschiedenen Typen chemisch synthetisierter L- oder D-Aminosäuren hergeleitet.
Peptidomimetika sind im weitesten Sinne Verbindungen, die in ihrer funktionellen Struktur mehr oder weniger einem Peptid ähnlich sind, die jedoch auch nicht-peptidische Bindungen in der Hauptkette oder D-Aminosäuren enthalten können. Im allgemeinen dienen Peptidomimetika als Substitute für natürliche Peptide in der Wechselwirkung von Rezeptoren und Enzymen (Pharmaceutical Biotechnology, Hrsg. D. J. A. Crommelin und R. D.Sindelar, Harwood Academic Publishers, 1997, S. 138). Pseudopeptide, eine Klasse von Peptidomimetika, sind Verbindungen, die Amidbindungsisoester anstelle von Amidbindungen enthalten (siehe oben, Seiten 137-140).
Erfindungsgemäße Peptidliganden schließen außerdem Salze von Peptiden oder funktionelle Äquivalente, wie z.B. pharmazeutisch annehmbare Säure- oder Base-Additionssalze, ein.
Bevorzugte peptidische Targeting-Liganden umfassen einen Target-erkennenden Rest mit einer Aminosäuresequenz XA_XA₃A₁A₂A₁Y oder ein funktionelles Äquivalent dieser Sequenz, worin A₁ ein D- oder L-Cystein (C), D- oder L-Valin (V) oder ein Analogon davon ist; A₂ eine D- oder L-Asparaginsäure (D) oder ein Analogon oder Mimetikum davon ist; A₃ ein D- oder L-Phenylalanin (F), D oder D- oder L-Tryptophan (W) oder ein Analogon oder Mimetikum davon ist; A_X eine D- oder L-Aminosäure ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Glutaminsäure (E), Asparaginsäure (D), Glycin (G) und Cystein (C) oder Analoga oder Mimetika davon ist; und worin X die N-terminale Seite der Sequenz darstellt und Wasserstoff oder ein Rest ist, der 1 bis 6 D- oder L-Aminosäuren oder Analoga davon umfasst; Y die C-terminale Seite der Sequenz darstellt und -OH oder ein Rest ist, der 1 bis 11 D- oder L-Aminosäuren oder Analoga davon umfasst; worin X und Y zusammen ein cyclisches System bilden können. In einer der besonders bevorzugten Ausführungsformen umfassen die Liganden die Aminosäuresequenz XEWVDVY oder ein funktionelles Äquivalent dieser Sequenz. Peptidverbindungen, die diese Aminosäuresequenz umfassen, wurden detailliert in WO 03/020753 und WO 04/018502 beschrieben, deren Offenbarung unter Bezugnahme darauf hierin eingeschlossen ist und auf deren Offenbarung der Leser insbesondere bezüglich Details hinsichtlich der Herstellung verwiesen wird.
Der Targeting-erkennende Teil kann auch aus den chemischen Verbindungen hergeleitet werden, die in WO 04/033473 und in der nicht vorveröffentlichten internationalen Patentanmeldung PCT/EP04/004898 offenbart werden.
Die Verbindungen, die in WO 04/033473 offenbart werden, sind durch die Formeln Ia und Ib in dieser Anmeldung dargestellt. Diese Glucose-basierenden Verbindungen sind dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Substituenten R¹ an dem C-2 der Monosaccharidstruktur besitzen. Dieser Substituent R¹ ist sehr viel entscheidender als der Substituent R³. Ohne an jegliche Theorie gebunden zu sein, wird vermutet, dass R¹ eine aktive Rolle in der Erkennung von oder der Selektivität zu P-Selectin spielt. R¹ stellt QR⁴ dar, worin Q -O-, -NH-, -NH-(C=O)-, -O-(C=O), -NH-(C=O)-O- oder -NH-(C=O)-NH und vorzugsweise -NH-(C=O)- darstellt und worin R⁴ einen Substituenten, umfassend mindestens ein Kohlenstoffatom, darstellt. Bevorzugte Gruppen R⁴ sind lineare oder verzweigte Alkyl- oder Arylgruppen, lineare oder verzweigte Aralkyl- oder Alkarylgruppen, wobei die Gruppen ein oder mehrere Heteroatome, wie z.B. Stickstoff-, Sauerstoff-, Phosphor-, Schwefelatome, enthalten können und vorzugsweise bis zu 20 Kohlenstoffatomen, besonders bevorzugt zwischen 1 und 12 Kohlenstoffatomen, aufweisen und die Gruppen mit Halogenatomen, Hydroxylgruppen, Sauerstoffatomen, Alkoxy- und Aryloxygruppen, Amino- oder substituierten Aminogruppen als auch anderen Substituenten substituiert sein können. In besonders bevorzugten Ausführungsformen sind an den aromatischen Resten elektronenziehende Gruppen vorhanden.
Insbesondere bevorzugt ist R⁴ H, ein Alkylrest, ein aromatischer Rest oder ein elektronenziehender Rest.
Der aromatische Rest kann beispielsweise eine Phenyl-, Naphthyl-, Cresyl-, Tolyl-, Anthracyl-, Phenanthryl-, Pyridyl-, Pyrazyl-, Pyridazyl- oder Chinolylgruppe sein, die jeweils optional substituiert sein können. Bevorzugt ist R⁴ eine Phenyl- oder Naphthylgruppe.
In einer anderen Ausführungsform ist R⁴ eine Gruppe, die einen elektronenziehenden Rest umfasst. Vorzugsweise ist der elektronenziehende Rest ein Rest, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Nitro, -(C=O)-Alkyl, Cyanonitril, -SO₃H, CCl₃ oder CF₃ besteht; besonders bevorzugt ist die elektronenziehende Gruppe eine Nitrogruppe.
In dieser Erfindung sind weitere Verbindungen, aus denen der Targeting-erkennende Rest hergeleitet werden kann, Gallussäure und Derivate davon, Polyphenole und Polyhydroxyphenole, wie in der nicht vorveröffentlichten internationalen Patentanmeldung PCT/EP04/004898 beschrieben wird.
Gallussäure oder 3,4,5-Trihydroxybenzoesäure ist ein natürliches Polyhydroxyphenol, das in Früchten, Gemüse und Kräutern, wie z.B. Galläpfeln, Walnüssen, Mangokernen, roten Trauben, grünem Tee und Olivenöl, gefunden wird. In vielen Pflanzenprodukten ist Gallussäure in Form von Vorläufern enthalten, wie z.B. Tanninsäure, die auch als Tannin oder Gallotannin bezeichnet wird und eine Klasse von Verbindungen mit einer komplexen und nicht einheitlichen chemischen Struktur beschreibt. Tannine können in zwei Gruppen unterteilt werden: (a) Derivate von Flavanolen, sogenannte kondensierte Tannine und (b) hydrolysierbare Tannine (die wichtigere Gruppe), die Ester eines Zuckers sind, gewöhnlich Glucose, mit ein oder mehreren Trihydroxybenzolcarbonsäuren. Gallussäure ist ein Haupthydrolyseprodukt von Tannin.
Ferner kann der Targeting-erkennende Rest aus Gallussäurederivaten und Verbindungen hergeleitet werden, die chemisch verwandt mit Gallussäure sind oder ein oder mehrere Gallussäurereste enthalten. Ebenfalls eingeschlossen sind (Vorläufer-)Verbindungen, die nach Verabreichung einem chemischen oder enzymatischen Abbau zur in situ-Erzeugung von Gallussäure unterliegen, die Gallussäurederivate oder die Verbindung, die chemisch verwandt mit Gallussäure ist, enthält einen oder mehrere Gallussäure-haltige Reste. Erfindungsgemäße Gallussäurederivate schließen chemische Strukturen ein, die aus Gallussäure hergeleitet werden, wie z.B. Konjugate, Dimere, Multimere, Salze, Ester, Ether, Amide usw. Darüber hinaus schließen die Derivate solche Verbindungen ein, die sich zu einem gewissen Ausmaß chemisch von Gallussäure unterscheiden, wie z.B. durch die Anzahl und/oder Position der phenolischen Hydroxygruppen oder durch die Gegenwart von einem oder mehreren zusätzlichen Substituenten, die jedoch eine Affinität zu P-Selectin aufweisen. Beispiele für andere Polyhydroxyphenole sind:
n-Dodecylgallat, Kaffeesäure und 3,4,5-Trihydroxyzimtsäure.
Polyphenole zeigen sich in ähnlicher Weise zu mehr oder weniger gleichem Ausmaß nützlich wie Polyhydroxyphenole, nämlich Gallussäure und Derivate davon. Polyphenole werden als Verbindungen definiert, die mehr als 6 Kohlenstoffatome tragende aromatische Ringe mit ein oder mehreren daran gebundenen Hydroxygruppen einschließen. Beispiele für solche Polyphenole sind (-)-Epigallocatechingallat, (Epi)catechin, m-Galloylgallussäure und Ellagsäure.
In dieser Anmeldung werden die Polyhydroxyphenole, aus denen der Targeting-erkennende Rest hergeleitet werden kann, durch die Formel II dargestellt. Einige weitere Erläuterungen über die Bedeutung der Substituenten sind unten aufgeführt.
Eine geradkettige oder verzweigte aliphatische (C₁-C₄)-Alkylgruppe sind beispielsweise Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl und dergleichen. Eine aromatische Gruppe ist eine Gruppe mit 6 bis 14 Kohlenstoffatomen und umfasst eine carbocyclische Aryl- oder eine heterocyclische Arylgruppe. Die carbocyclische Arylgruppe ist monocyclisch bis tricyclisch und vorzugsweise Phenyl, Naphthyl, Anthryl oder Phenanthryl und dergleichen.
Die heterocyclische Arylgruppe ist eine monocyclische bis tricyclische Gruppe mit 1 bis 4 Heteroatomen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus einem Stickstoffatom, Sauerstoffatom oder Schwefelatom besteht. Die heterocyclische Gruppe ist Pyrrolyl, Pyrazolyl, Imidazolyl, Thiazolyl, Oxazolyl, Isothiazolyl, Isooxazolyl, 1,3,5-Triazolyl, 1,2,4-Triazolyl, 1,3,5-Thiadiazolyl, 1,3,5-Oxadiazolyl, Pyrizyl, Pyridazinyl, Pyrimidyl, Pyrazyl, Benzofuranyl, Isobenzofuranyl, Benzothienyl, Indolyl, Chromenyl, Chinolyl, Isochinolyl, Phthalazinyl oder Chinoxalinyl und dergleichen.
Die (C₃-C₈)-Cycloalkylgruppe stellt Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl oder Cyclooctyl dar. Darüber hinaus ist die (C₃-C₈)-Cycloalkylgruppe optional mit einer geradkettigen oder verzweigten aliphatischen (C₁-C₄)-Alkylgruppe oder einer oder mehreren Carbonsäuregruppen substituiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Polyhydroxyphenole verwendet, die dadurch gekennzeichnet sind, dass:
R¹ = Ethyl, Phenylmethyl, Indolylmethyl oder 4-Hydroxyphenylmethyl ist;
R² = eine geradkettige aliphatische (C₁-C₄)-Alkylgruppe ist;
R³ = eine geradkettige oder aliphatische (C₁-C₄)-Alkylgruppe, die mit einer oder zwei Carbonsäuregruppen substituiert ist, die optional mit einer geradkettigen oder verzweigten aliphatischen (C₁-C₄)-Alkylgruppe substituiert sind.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden Polyhydroxyphenole verwendet, worin:
R¹ = Ethyl, Phenylmethyl, Indolylmethyl oder 4-Hydroxyphenylmethyl ist;
R² = Wasserstoff, Ethyl, Propyl oder Isopropyl ist;
R³ = Ethylcarbonsäure oder Propyldicarbonsäure ist.
Um als Targeting-Ligand effektiv zu sein, sollten die Molekülstrukturen, die eine Affinität zu dem anvisierten P-Selectin aufweisen, auf oder an der Oberfläche von kolloidalen Trägern des Wirkstofftransportsystems vorhanden sein. Diese können kovalent oder nicht-kovalent an Trägerkomponenten gebunden sein. In einer Ausführungsform umfassen die Liganden nicht nur Target-erkennende Strukturen oder Reste, sondern auch einen Molekülteil, der als Verankerungsrest dienen kann, d.h. der geeignet ist, den Liganden mit dem Träger zu verankern, vorzugsweise so, dass der Ligand an Ort und Stelle gehalten wird, selbst wenn der Target-erkennende Rest bis zur oder durch die Oberfläche des Trägers reicht. Beispielsweise kann der Verankerungsteil ein Polymer darstellen.
Wenn der kolloidale Träger ein Liposom ist, sind eine der am meisten nützlichen Arten von Liganden Konjugate, die einen peptidischen Target-erkennenden Rest und einen lipidischen Verankerungsrest und wahlweise einen Abstandhalter zwischen diesen Resten umfassen.
Der Verankerungsrest wird vorzugsweise aus einem amphiphilen Lipid gebildet, das aus mindestens einem hydrophoben apolaren Rest und einer hydrophilen polaren Kopfgruppe besteht. Das amphiphile Lipid ist aus der Gruppe ausgewählt, die aus Phospholipiden, Glycolipiden, Ceramiden, Cholesterin und Derivaten, gesättigten oder ungesättigten, verzweigten oder geradkettigen C₈-C₁₀₀-Mono- oder Dialkylaminen, Arylalkylaminen, Cycloalkylalkylaminen, Alkanolen, Aldehyden, Carbohalogeniden oder Alkansäuren und Anhydriden davon besteht und dadurch charakterisiert ist, dass die Gesamtzahl an C-Atomen 25 oder größer ist. Vorzugsweise enthält das amphiphile Lipid mindestens zwei hydrophobe apolare Reste, und Beispiele davon, die besonders bevorzugt verwendet werden können, sind aus der Gruppe ausgewählt, die aus 1-Heptadecyloctadecylamin, N-Succinyl-di-octadecylamin und Distearylphosphatidylethanolamin besteht.
Das wasserlösliche Polymer ist ein Polyethylenglycol, eine Poly(aminosäure), ein Poly(aminosäurederivat), ein Poly(aminosäureanalogon), ein Polyvinylpyrrolidon oder Gangliosid GM1. Für weitere Details bezüglich der Poly(aminosäure)-basierenden Polymere wird auf WO 02/98952 verwiesen, die hierin unter Bezugnahme darauf eingeschlossen ist.
Beispielsweise ist eine bevorzugte Ausführungsform das Targeting-Ligandenmolekül, worin der Target-erkennende Rest die Aminosäuresequenz XEWVDVY einschließt, der lipidische Verankerungsrest durch einen Phospholipidrest dargestellt wird und der Abstandhalter ein Polymer oder Oligomer ist. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform ist das Molekül XEWVDVY-PEG-DSPE.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen kolloidalen Träger und mindestens einen der oben beschriebenen Targeting-Liganden mit einer Affinität zu P-Selectin umfasst, der mit der Oberfläche des Trägers verbunden ist.
Wirkstofftransportsysteme sind üblicherweise hochentwickelte pharmazeutische Zubereitungen oder Zubereitungskomponenten, die im allgemeinen darauf abzielen, den Transport von Wirkstoffen zu optimieren, während gleichzeitig die Zustimmung durch das Favorisieren von einfacheren nicht aufdringlichen Transportverfahren maximiert wird. Wirkstofftransportsysteme wurden für nahezu alle möglichen Wege der Verabreichung entwickelt. Ein gezieltes Wirkstofftransportsystem bezeichnet jegliche Zubereitung oder Zubereitungskomponente, die einen selektiveren Transport der Wirkstoffsubstanz zu einem Ziel innerhalb des Körpers bewirkt. Im Sinne der vorliegenden Erfindung wird das Target durch Zellen oder Gewebe dargestellt, die P-Selectin exprimieren. Daher impliziert gezielter Wirkstofftransport, dass das Transportsystem dafür sorgt, dass die Targetzellen dem Wirkstoff in erhöhtem Ausmaße, verglichen mit beispielsweise einer einfachen Lösung des Wirkstoffs, die intravenös injiziert wird, ausgesetzt sind.
Ein Wirkstoff, wie er hierin verwendet wird, ist jede therapeutische oder diagnostische Substanz einschließlich natürlichen oder künstlichen Mischungen oder Kombinationen von Substanzen. Wirkstoffe können aus natürlichen, halbsynthetischen oder synthetischen kleinen oder großen organischen oder anorganischen Molekülen ausgewählt werden.
Wirkstoffe schließen beispielsweise Peptide, Proteine, Nukleinsäuren, wie z.B. DNA, RNA, kleine Haarnadel-RNA, Oligonukleotide und Antisense-Oligonukleotide, ein.
Das erfindungsgemäße Wirkstofftransportsystem umfasst insbesondere (a) einen kolloidalen Träger, (b) einen Wirkstoff, der mit dem Träger verbunden ist, und (c) mindestens einen wie oben beschriebenen Targeting-Liganden mit einer Affinität zu P-Selectin, der mit der Oberfläche des Trägers verbunden ist.
Der Begriff "kolloidale Träger" wird verwendet, um alle festen, halbfesten oder flüssigen Partikel oder supramolekulare Strukturen oder einzelne Makromoleküle im niedrigen Mikrometer- oder Submikrometer-Größenbereich, der im allgemeinen der nützlichste Größenbereich für intravaskuläre Verabreichung ist, einzuschließen. Beispiele für kolloidale Träger sind Mikro- und Nanopartikel, Mikro- und Nanosphären, Mikro- und Nanokapseln, Mizellen, vernetzte Mizellen, kolloidale Hydrogele, Komplexe, Vesikel, wie z.B. Liposome und Neosome, Virosome, Dendrimere, Emulsionstropfen und Sternpolymere. Besonders geeignete Träger sind Partikel oder supramolekulare Strukturen.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen kolloidalen Träger Vesikel und besonders bevorzugt Liposome, welche mit Flüssigkeit gefüllte Vesikel aus konzentrisch angeordneten Schichten (typischerweise Doppelschichten) von Lipiden sind, wie z.B. Phospholipide, Ceramide und Sterole. In Abhängigkeit von ihrer Größe und Struktur werden Vesikel und/oder Liposome manchmal in Unterkategorien klassifiziert, wie z.B. kleine unilamellare Vesikel (SUV), große unilamellare Vesikel (LUV), multilamellare Vesikel (MLV) oder Riesenliposome, um nur einige zu nennen. Liposome können so entworfen werden, dass sie fast jeden Durchmesser zwischen etwa 30 nm und einigen Mikrometern aufweisen.
Unter den bevorzugten Liposomen sind solche, die einen relativ kleinen Durchmesser aufweisen, wie z.B. nicht mehr als 1.000 nm, unabhängig von ihrer Lamellarität. Der Durchmesser, wie er hierin verwendet wird, ist ein mittlerer Durchmesser, der durch konventionelle, auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren, wie z.B. Messungen unter Verwendung von Photonenkorrelationsspektroskopie und dynamische Lichtstreuungsuntersuchung, bestimmt werden. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform weisen die Liposome einen Durchmesser von weniger als 400 nm auf, welches eine Partikelgröße ist, mit der eine hohe physikalische Stabilität der jeweiligen Suspension oder eine geringe Tendenz der Liposome verbunden ist, sich abzusetzen oder aufzuschwemmen. In Abhängigkeit von der bestimmten Produktanwendung oder Verwendung kann es nützlich sein, den Durchmesser der Liposome (oder, wenn andere Träger verwendet werden, den Durchmesser der entsprechenden Partikel oder Strukturen) auf eine noch kleinere Größe, wie z.B. nicht mehr als 200 nm, zu beschränken. Beispielsweise kann es mit Trägern dieses Größenbereichs einfacher sein, eine längere Blutkreislaufhalbwertszeit zu erzielen.
Liposome können aus verschiedenen Typen von Lipiden, wie z.B. natürliche, halbsynthetische oder synthetische Phospholipide, Sphingolipide, Ceramide, Sterole oder anderen lipidähnlichen Materialien, die in Lipiddoppelschichten eingebaut werden können, hergestellt werden. Bevorzugte Lipide sind solche, die physiologisch sicher und tolerierbar sind, wie z.B. neutrale (oder eher zwitterionische) Phospholipide, einschließlich Phosphatidylcholin (das eine Mischung ist, die hauptsächlich aus neutralen Phospholipiden zusammengesetzt ist), hydratisiertes Phosphatidylcholin, Lecithin, hydratisiertes Lecithin, Dimyristoylphosphatidylcholin, Distearoylphosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin, ungesättigte Phosphatidylcholine mit ein oder zwei Ölsäureketten, wahlweise gemischt mit Sterolen, wie z.B. Cholesterin.
Der Wirkstoff kann mit dem Träger auf verschiedene Art und Weise verbunden sein, was von dem jeweilig ausgewählten Träger, dem Herstellungsverfahren und der Natur des Wirkstoffs selber, insbesondere im Hinblick auf die physikochemischen Eigenschaften abhängt. Wenn der Träger beispielsweise ein Liposom und der Wirkstoff ein lipophiles, schwach lösliches Molekül ist, wird letzterer wahrscheinlich mit den lipophilen Bereichen der Lipiddoppelschichten verbunden sein. Wenn der Wirkstoff andererseits eine lösliche hydrophile Substanz ist, könnte sie innerhalb des wässrigen inneren Kernbereiches des Liposoms eingeschlossen sein. Wenn der Träger ein polymeres Mikro- oder Nanopartikel ist, könnte der Wirkstoff in der Polymer-(oder Hydrogel-)matrix eingebettet sein. In Kern-Schalen-Strukturen, wie z.B. Mikro- oder Nanokapseln, könnte der Wirkstoff im Kern eingeschlossen sein. Alternativ könnte er entweder physikochemisch oder chemisch mit der Schale verbunden oder an die Schale gebunden sein.
Wenn das Wirkstofftransportsystem für systemische intravaskuläre Verabreichung ausgelegt ist, kann die Wahrscheinlichkeit der spezifischen Wechselwirkung mit den Targetzellen oder -geweben erhöht werden, wenn die Clearance des Trägers reduziert wird, da die meisten Prozesse, die auf die Clearance gerichtet sind, mit der Target-Wechselwirkung konkurrieren. Kolloidale Partikel neigen dazu, recht schnell aus dem Blutkreis entfernt zu werden, da sie auf effiziente Weise durch die Makrophagen des Reticuloendothelialsystems aufgenommen werden, das hauptsächlich in der Leber und in der Milz vorkommt. In Abhängigkeit von der Größe und den Oberflächeneigenschaften der kolloidalen Partikel können sie aus dem Kreislauf innerhalb einer Halbwertszeit von Minuten entfernt werden. Durch Auswählen einer relativ kleinen Partikelgröße und insbesondere durch Modifizieren der Partikeloberfläche, kann die Eliminierungshalbwertszeit jedoch mindestens auf Stunden erhöht werden. Verschiedene polymere Beschichtungen sind bekannt, die die Blutkreislaufzeit von Liposomen, Nanopartikeln und anderen kolloidalen Wirkstoffträgern ausdehnen. Eine der am meisten wirksamen Polymerbeschichtungen, die bis heute bekannt ist, ist aus Polyethylenglycol oder Copolymeren, die Polyethylenglycol umfassen, zusammengesetzt. Vorliegend ist daher eine bevorzugte Ausführungsform, dass die Beschichtung der erfindungsgemäßen Träger Polyethylenglycol oder mit Polyethylenglycol verwandte Reste umfasst. Andere Beschichtungen, die aus Poly(aminosäuren), Poly(aminosäurederivaten), Poly(aminosäureanaloga), Polyvinylpyrrolidonen und Gangliosid GM1 basieren, schienen jedoch genauso wirksam wie Polyethylenglycol zu sein.
Das erfindungsgemäße Wirkstofftransportsystem dient als Mittel zum Geleiten (Targeting) von Wirkstoffen zu Zellen oder Geweben, die P-Selectin exprimieren, einem Membranglycoprotein, das durch vaskuläre Endothelzellen und Thrombozyten exprimiert wird und in der Leukozytenadhäsion an das Endothel und Thrombozyten involviert ist. Es ist besonders nützlich zum Targeting von Zellen oder Geweben, die P-Selectin überexprimieren, oder von Zellen, die eine erhöhte P-Selectinaktivität aufweisen. Beispielsweise weisen aktivierte Endothelzellen mehr P-Selectin-Moleküle an ihren Oberflächen auf. Folglich ist die typische pharmakologische Aktivität eines Wirkstoffs, der in das Transportsystem eingebaut ist und erfindungsgemäß mit dem kolloidalen Träger verbunden ist, so dass die Verbindung für die Vorbeugung, Diagnose oder Behandlung von Krankheiten und Zuständen geeignet ist, die mit einer P-Selectin-Aktivität oder Überaktivität verbunden sind. Unter diesen bis heute bekannten Bedingungen, die wahrscheinlich P-Selectin einbeziehen, sind Herzkranzgefäßkrankheit, Thrombose, Atherothrombose, Krebs, chronische Entzündungskrankheiten, Gelenkrheumatismus, entzündliche Darmkrankheit, Multiple Sklerose, Atherosklerose, Restenose, Ischämie, Reperfusionsverletzung einschließlich Niereninsuffizienz, Tumormetastase, bakterieller Sepsis, disseminierter intravaskulärer Gerinnung, posttraumatische Lungeninsuffizienz, Schlaganfall, Angiogenese, Transplantatabstoßung, Beinvenenthrombose, Herzinfarkt oder Kreislaufschock.
Insbesondere Verbindungen, die gegen den entzündlichen Prozess in P-Selectin-aktivierten Zellen wirken, sind nützliche Kandidaten für solche Wirkstoffe.
Entzündungshemmende Verbindungen schließen, wie hierin definiert wird, Steroide, insbesondere Glucocorticoide, nicht-steroidale entzündungshemmende Wirkstoffe und Immunosuppressiva ein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Wirkstoff aus der Gruppe der Glucocorticoide, wie z.B. Dexamethason, Betamethason, Prednisolon, Methylprednisolon, Cortison, Hydrocortison, Triamcinolon, Deflazacort, Rimexolon, Cloprednol und Fluocortolon, ausgewählt.
Das Targeting zu Zellen, die P-Selectin exprimieren oder vorweisen, wird mit Hilfe von Targeting-Liganden erreicht, die mit der Oberfläche der kolloidalen Träger verbunden sind, die in dem erfindungsgemäßen Wirkstofftransportsystem umfasst sind. Diese Targeting-Liganden müssen eine selektive Affinität zu P-Selectin aufweisen. "Selektiv" bedeutet hierin, dass die Liganden eine höhere Affinität zu P-Selectin aufweisen als für andere molekulare Strukturen, die üblicherweise auf Zelloberflächen gefunden werden. In einem etwas engeren Sinne bezieht sich Selektivität auf solche Liganden, die eine höhere Affinität für P-Selectin haben als für andere Zelladhäsionsmoleküle, die mit P-Selectin verwandt sind, wie z.B. E-Selectin. Die Affinität oder Bindungseigenschaften von Verbindungen oder Liganden zu P-Selectin kann beispielsweise anhand der Konzentration bei 50 % Inhibierung der Bindung (IC₅₀) quantifiziert werden.
Üblicherweise würde eine Konzentration von 50-100 μM oder weniger als Beweis für Affinität und Bindung angesehen werden. Wünschenswertere Liganden sind Substanzen mit Konzentrationswerten bei 50 % Inhibierung der Bindung von 10 μM oder weniger. Die höchsten erreichbaren Werte für den nicht-kovalenten Bindungstyp, der eine Rolle bei den erfindungsgemäßen Wechselwirkungen oder Bindungen spielt, ist 10^–15 M. Im allgemeinen sind die Werte aber höher als 10^–12 M und in den meisten Fällen höher als etwa 10^–9 M.
Um eine ausreichende Bindungswahrscheinlichkeit zwischen dem kolloidalen Träger und dem Targetmolekül P-Selectin zu sichern, sollten vorzugsweise mindestens zwei Targeting-Liganden mit der Oberfläche eines Trägerpartikels verbunden sein. Besonders bevorzugt sollte die Zahl der Liganden pro Träger beträchtlich höher als zwei, z.B. mindestens 5 oder mindestens 10, sein. Unter der Annahme einer statistischen räumlichen Verteilung der Liganden über die Trägeroberfläche würde die Anzahl der Liganden pro Träger, die angemessen scheint, um eine substanzielle Wahrscheinlichkeit einer Wechselwirkung mit dem Target zu sichern, auch vom Durchmesser der Trägerpartikel abhängen. Beispielsweise können kleine Träger im Bereich von etwa 50 bis 100 nm nahezu als gespickt bezeichnet werden, wenn sie mit einer Zahl von mehreren Dutzend bis mehreren hundert Liganden beladen sind. Größere Träger. im niedrigen Mikrometerbereich zeigen andererseits erwartungsgemäß eine signifikante Targeting-Effizienz, wenn sie zumindest etwa ein paar hundert Liganden auf ihrer Oberfläche aufweisen. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Trägerpartikelgröße weniger als 400 nm und die Zahl der Targeting-Liganden pro Trägerpartikel 20 bis 10.000.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die ein wie oben definiertes gezieltes Wirkstofftransportsystem umfasst. Üblicherweise umfasst eine solche pharmazeutische Zusammensetzung weitere Hilfsstoffe, die anhand der pharmazeutischen Formulierungstechniken des Standes der Technik ausgewählt werden. Ein Hilfsstoff, wie er hierin verwendet wird, ist jede pharmazeutisch annehmbare Substanz oder Mischung von Substanzen mit nahezu keiner pharmakologischen Aktivität, die als Vehikel oder Hilfssubstanz zur Formulierung einer Verbindung oder eines Wirkstofftransportsystems in einer Dosierungsform verwendet werden kann, die stabil und leicht zu verabreichen ist. Beispiele für pharmazeutisch annehmbare Hilfsstoffe sind in den Einzeldarstellungen aller Hauptarzneibücher zu finden.
In einer Ausführungsform ist die Zusammensetzung für die parenterale Injektion, vorzugsweise für die intravaskuläre Injektion, wie z.B. intravenös oder intraarteriell, aber auch für intramuskuläre, subkutane, intraläsionale, intraperitoneale oder andere Wege der parenteralen Verabreichung formuliert und verarbeitet. Dieselben Prinzipien, die die Zubereitungen anderer Wirkstoffe für diese Verabreichungswege bestimmen, lehren dem Fachmann auch, wie diese Zusammensetzungen herzustellen sind. Beispielsweise ist eines der Erfordernisse für parenterale Dosierungsformungen ihre Sterilität. Andere Erfordernisse werden in allen Hauptarzneibüchern, wie z.B. in USP 24, in der Einzeldarstellung "General Requirements for Tests and Assays. 1. Injections", S. 1775- 1777.
Um die Stabilität einer Zubereitung zu erhöhen, ist es notwendig, eine Trockendosierungsform bereitzustellen, die wiederhergestellt werden muss, bevor sie verabreicht werden kann. Ein Beispiel für eine solche Dosierungsform ist eine gefriergetrocknete oder lyophilisierte Zubereitung. Zur weiteren Erhöhung der Bequemlichkeit und Sicherheit kann die trockene Dosierungsform mit einer geeigneten flüssigen Zusammensetzung kombiniert werden, mit der sie zur Bildung einer Flüssigkeit wieder hergestellt werden kann. Mit anderen Worten stellt diese erfindungsgemäße Ausführungsform ein Kit zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung dar, das eine feste und eine flüssige Komponente umfasst, worin die feste Komponente ein gezieltes Wirkstofftransportsystem zum Transport eines Wirkstoffs zu Zellen umfasst, die P-Selectin exprimieren, wie oben definiert, während die flüssige Komponente eine wässrige Zusammensetzung ist. Parenterale Zubereitungen liegen natürlich innerhalb des Bereichs der Erfindung.
Hilfsstoffe, die besonders nützlich zur Herstellung von parenteralen Zubereitungen sind, sind Lösungsmittel, Hilfslösungsmittel und flüssige oder halbflüssige Träger, wie z.B. steriles Wasser, Ethanol, Glycerol, Propylenglycol, Polyethylenglycol, Butandiol, Fettöle, kurz- oder mittelkettige Triglyceride, Lecithin, Polyoxyethylen-Kastoröl-Derivate; Substanzen zur Einstellung der Osmolalität und des pH-Werts, wie z.B. Zucker, insbesondere Glucose, Zuckeralkohole, insbesondere Mannitol, Natriumchlorid, Natriumcarbonat, Zitronensäure, Acetat, Phosphat, Phosphorsäure, Salzsäure, Natriumhydroxid usw.; Stabilisatoren, Antioxidantien und Konservierungsmittel, wie z.B. Ascorbinsäure, Natriumsulfit oder -hydrogensulfit, EDTA, Benzylalkohol usw.; andere Hilfsstoffe und Lyophilisierungshilfsmittel, wie z.B. Albumin, Dextran usw.
Alternativ können die pharmazeutischen Zusammensetzungen für die orale Verabreichung entworfen werden und entsprechend verarbeitet werden. Geeignete orale Dosierungsformen schließen Tabletten, harte Kapseln, weiche Kapseln, Pulver, Granalien, Dosierungsformen, die sich im Mund auflösen, Sirupe, Tropfen, Suspensionen, Brausetabletten, Kautabletten, orale Filme, lyophilisierte Dosierungsformen, Langzeitwirkende Dosierungsformen, Controlled-Release-Dosierungsformen ein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die orale Dosierungsform eine magensaftresistente feste Dosierungsform zum Schutz der Verbindung vor der sauren und proteolytischen Umgebung im Magen.
Es kann außerdem vorteilhaft sein, das erfindungsgemäße gezielte Wirkstofftransportsystem als eine transmukosale Dosierungsform oder Zusammensetzung zu verabreichen. Dieser Weg der Verabreichung ist nicht invasiv und patientenfreundlich; gleichzeitig kann er zu einer verbesserten Bioverfügbarkeit im Vergleich zur oralen Verabreichung führen. Die transmukosale Verabreichung ist beispielsweise über nasale, bukkale, sublinguale, gingivale oder vaginale Dosierungsformen möglich. Diese Dosierungsformen können durch bekannte Techniken hergestellt werden; sie können als Nasentropfen oder Sprays, Einlagen, Filme, Lappen, Gele, Salben oder Tabletten zubereitet werden. Vorzugsweise schließen die für eine transmukosale Dosierungsform verwendeten Hilfsstoffe ein oder mehrere Substanzen ein, die zur Mukoadhäsion dienen, wodurch die Kontaktzeit der Dosierungsform mit der Absorptionsstelle verlängert wird und damit potenziell das Ausmaß der Absorption erhöht wird.
In einer weiteren Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Wirkstofftransportsystem über den pulmonalen Weg unter Verwendung eines Dosierungsinhalators, eines Zerstäubers, eines Aerosolsprays oder eines Trockenpulverinhalators verabreicht. Geeignete Zubereitungen können durch bekannte Verfahren und Techniken hergestellt werden. Transdermale, rektale oder Okulare Verabreichungen können in einigen Fällen auch praktikabel sein. Vorliegend werden jedoch injizierbare Zusammensetzungen besonders bevorzugt, die das auf P-Selectin abgezielte Wirkstofftransportsystem enthalten.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter erläutern, jedoch nicht ihren Bereich auf die darin dargestellten Ausführungsformen beschränken.
Beispiele
Beispiel 1: Synthese eines peptidischen Targeting-Liganden mit Affinität zu P-Selectin.
Das Peptid H₂N-DVEWVDVSY-COOH (Pstar), das humanes P-Selectin bindet, wurde mittels Festphasenchemie unter Verwendung des Applied Biosystems 9050 peptide synthesizers (Warrington, UK) und Standard Fmoc-Chemie synthetisiert. Das Peptid wurde auf einer C8 RP-Säule (Alltech, Breda, Niederlande) unter Verwendung eines Acetonitril/Wasser-Gradienten mit 0,1 % TFA gereinigt. Die Sequenz und Reinheit wurde durch MALDI/LC-MS und Größenausschlusschromatographie unter Verwendung eines SMART-Systems (Pep30-Säule) bestimmt.
In einem zweiten Schritt wurde das Peptid gemäß dem ICl-Verfahren radioaktiv markiert. Freies ¹²⁵I wurde durch Sephadex G10-Filtration mit PBS als Eluent entfernt. Die Reinheit wurde durch SDS-PAGE-Gelelektrophorese (20 %) bestimmt und unter Verwendung eines Phosphorimagers analysiert. Das Peptid wurde bei 4°C in PBS gelagert.
In einem dritten Schritt wurde das radioaktiv markierte Peptid in HEPES-Puffer(Biosolve, Valkenswaard, Niederlande) (10 mM HEPES, pH 6,6) gelöst, und N-Hydroxysuccimidylpoly(ethylenglycol)distearoylphosphatidylethanolamin (MW 3400)(DSPE-PEG3400-NHS: 7 Äquivalente) (Shearwater Polymers Inc., Huntsville, U.S.A.) wurde zu dieser Lösung in mehreren Portionen hinzugefügt. Nach sanftem Rühren bei Raumtemperatur für 18 Stunden wurden die verbleibenden NHS-Gruppen durch Addition von Glycin gequencht. Die Bildung des DSPE-PEG-(¹²⁵I)-Pstar wurde durch SDS-PAGE-Gelelektrophorese (20 %) und SMART-Analyse unter Verwendung einer Pep30- oder Superose 6-Säule mit PBS (0,02 % NaN₃ und 1 mM EDTA (Roche Molecular Biochemicals)) als Eluent bestimmt.
Beispiel 2: Herstellung eines Liposom-Wirkstofftransportsystems, umfassend Dexamethason
Liposome wurden durch Extrusion hergestellt. Kurz gesagt wurden Eidotter-Phosphatidylcholin (Lipoid, Ludwigshafen, Deutschland) (EYPC; 100 mg/ml in MeOH/CHCl₃, V/V 1:1) und Cholesterin (10 mg/ml in MeOH/CHCl₃ V/V 1:1) in einem Gewichtsverhältnis von 5,0:0,44 (mg/mg) gemischt, und die Mischung wurde unter einem Stickstoffstrom getrocknet. Nach Hydratation der Lipide in 2 ml Puffer (0,1 M KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) wurde die Suspension 31-mal durch eine Whatman Nuclepore-Polycarbonatmembran (100 nm, Pleasanton, CA) unter Verwendung eines Liposo Fast-Pneumatic (Cavestin Inc., Ottawa, Kanada) extrudiert. Die Partikelgröße wurde durch Photonenkorrelationsspektroskopie (Malvern 4700 C System, Malvern Instruments, Malvern, UK) bei 27°C und einem Winkel von 90° zwischen dem Laser und dem Detektor (65-73 nm, Polydispersität 0,1-0,27) bestimmt. Der Phosphatidylcholingehalt der Liposome wurde enzymatisch unter Verwendung eines Enzym-Kits für Phospholipide von Roche Molecular Biochemicals mit Precipath L (Roche Molecular Biochemicals) als internen Standard bestimmt. Fluoreszierend markierte Liposome wurden durch Zugabe von 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanid (Molecular Probes, Leiden, Niederlande) (DiI; 1 % in MeOH/CHCl₃, V/V 1:1) zu der Rohlipidmischung hergestellt. Dexamethasonphosphat (10 mg) wurde zu einem Ultraschallpuffer hinzugegeben, um Dexamethasonphosphat-haltige Liposome zu erhalten.
In einem nachfolgenden Schritt wurde der Targeting-Ligand DSPE-PEG(¹²⁵I)-Pstar (gemäß Beispiel 1 hergestellt) mit den Liposomen verbunden. Die gewünschten Mengen von DSPE-PEG₃₄₀₀-(¹²⁵I)-P-star und Poly(ethylenglycol)distearoylphosphatidylethanolamin (MW 2000) (Shearwater Polymers Inc., Huntsville, U.S.A.) (DSPE-PEG₂₀₀₀% insgesamt 5 mol%) wurden durch Inkubation mit den Liposomen bei 37°C für 2 Stunden eingebaut. Die Anzahl der verbundenen Konjugate pro 70 nm Liposome wurde unter der Annahme von 1,12 × 1011 Liposomen/mg Phospholipide berechnet. Liposome, enthaltend 100 (LP₁₀₀) und 500 (LP₅₀₀) wurden hergestellt. Zur Herstellung der Kontrolliposome (P0) wurde dieselbe Menge an mit Glycin gequenchtem DSPE-PEG-NHS hinzugefügt. Eine Probe dieser Liposome wurde dann einer SMART-Analyse unter Verwendung einer Superose 6-Säule bei 50 ul/min mit PBS mit 10 mM EDTA und 0,02 % NaN₃ als Eluent unterzogen.
Beispiel 3: Bewertung der Affinität
Die Affinität des in Beispiel 2 hergestellten Liposom-Wirkstofftransportsystems wurde unter Verwendung eines Verdrängungsassays bewertet. TM11-PO, ein durch Molenaar et al. (Blood 100: 3570-3577 (2002)) beschriebener tetramerer TM11/strepPO-Komplex, wurde durch Inkubieren von Streptavidin-Peroxidase (Amersham Life Science, Little Chalfont, Großbritannien) (strep-PO; 8,4 μl, 2,0 μM) und Biotin-CDVEWVDVSSLEWDLPC (synthetisiert von Dr. Van der Zee, Department of Immunology, Universität von Utrecht, Utrecht, Niederlande) (TM11-Biotin; 1,5 μl 190 mM) für 2 Stunden bei Raumtemperatur in einem Assay-Puffer (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, pH 7,4) frisch hergestellt. Für Verdrängungsstudien wurde eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (wells) (hochbindend, Flachboden, Costar, Corning, U.S.A.) über Nacht bei 4°C mit 10 μg/ml Ziege-antihumanes IgG (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, Niederlande) in einem Beschichtungspuffer (50 mM NaHCO₃, pH 9,6) beschichtet. Anschließend wurden die Vertiefungen mit einem Assay-Puffer gewaschen und für eine Stunde bei 37°C mit einem Blocking-Puffer (3 % BSA im Assay-Puffer) inkubiert. Nach dem Waschen mit Assay-Puffer wurden die Vertiefungen für 2 Stunden bei 37°C mit humanem P-Selectin/IgG-Fc (R & D Systems Europe Ltd., Abingdon, Großbritannien) (0,3 μg/ml) inkubiert. Anschließend wurden die Vertiefungen mit Assay-Puffer gewaschen und für eine Stunde bei 4°C mit dem TM11-PO-Komplex inkubiert. Die Vertiefungen wurden sechsmal mit einem Waschpuffer (0,1 % Tween 20 im Assay-Puffer) gewaschen. 3,3',5,5'-Tetramethylbenzamidin (TMB)/Wasserstoffperoxid (H₂O₂) (Pierce, Rochford, U.S.A.) wurde hinzugefügt, und die Vertiefungen wurden bei Raumtemperatur für 15 Minuten inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 2 M-H₂SO₄ gestoppt, und die Absorption wurde bei 450 nm gemessen. Im Ergebnis zeigten die P₁₀₀- und die P₅₀₀-Liposome eine höhere Affinität (IC₅₀ = 0,78 bzw. 0,34 nM) für P-Selectin als beide Kontroll-Liposome ohne Targeting-Liganden, die keine Affinität zeigten, und freies Pstar, das eine niedrige mikromolare Affinität (IC₅₀ = 7 μM) zeigte.
Beispiel 4: Bewertung der Targeting-Eigenschaften
Die Targeting-Eigenschaften des in Beispiel 2 hergestellten Liposom-Wirkstofftransportsystems wurden unter Verwendung eines Zellkulturmodells bewertet. Zur Bestimmung der Targeting-Wirksamkeit der Dexamethason-beladenen P₁₀₀- und P₅₀₀-Liposome wurde ihre Kapazität, Corticosteroid-Responsive-Gen-Exprimierung zu induzieren, gemessen und mit Liposomen ohne Liganden (P₀) verglichen.
Humane CHO-Zellen, die stabil mit humanen P-Selectin (CHO-P-Zellen, großzügige Spende von Dr. Modderman, University of Amsterdam, Amsterdam, Niederlande) transfiziert wurden, wurden in DMEM gezüchtet, das 10 % fötales Kälberserum (Bio Whittaker, Verviers, Belgien), 5 mM L-Glutamin, 20.000 Einheiten Penicillin/Streptomycin (BioWhittaker, Verviers, Belgien) und 5 mM nicht-essenzielle Aminosäuren enthielt. Kulturkolben wurden bei 37°C in 5 % CO₂ für 3 oder 4 Tage inkubiert, bis die Zellen bis zum Zusammenfluss gewachsen waren. Die Zellen wurden in Kulturplatten mit 24 Vertiefungen (ca. 100.000 Zellen pro Vertiefung) ausgesät und bis zu 90%igem Zusammenfluss in steroidfreiem DMEM (10 % FCS) aufgezogen. Die Zellen wurden durch Inkubation für 5 Stunden mit einer frisch hergestellten Lipofectinmischung inkubiert, die ein Reportergenkonstrukt, codierend für Firefly-Luziferase aus Glucocorticoid-Responsive-Element aus (Clontech) (TAT₃-Luc-Gen; 10 ng/Vertiefung), pCMV-Luc, codierend für Renilla-Luziferase (Promega) (0,1 ng/Vertiefung) enthielt, und ein leerer Vektor wurde bis zu 1 μg DNA/Vertiefung in Optimem hinzugefügt. Die Renilla-Luziferase aus CMC wurde zur Korrektur für die Transfizierungswirksamkeit hinzugefügt. Die Transfizierungsmischung wurde entfernt und steroidfreies DMEM zu den Zellen hinzugegeben. Nach 18 Stunden wurden P₅₀₀-Liposome (1 nM mit oder ohne Dexamethasonphosphat), die Kontrolle P0 (1 nM) oder Dexamethasonphosphat (1 μM) zu den Zellen hinzugegeben und zur Inkubierung für 5 Stunden stehen gelassen. Das Medium wurde entfernt und die Zellen wurden mit PBS gewaschen. Nach Inkubierung mit einem Lysispuffer wurden die Renilla- und Firefly-Luziferaseaktivität gleichzeitig mit einem Dual-Luziferase-Assay-Kit (Promega) gemessen.
Die Luziferase-Exprimierung wurde 5 Stunden nach der Transfizierung beobachtet: die relative Transfizierung wurde mit Dexamethason-beladenem P₅₀₀ im Vergleich zu P0 und P₅₀₀ ohne Dexamethason 5-fach erhöht. Bei einer Liposom-Konzentration von 1 nM weisen diese Liposome eine vergleichbare Wirkung auf die Liziferaseaktivität wie freies Dexamethason bei einer Konzentration von 1 μM auf.

Claims

Targeting-Ligandenmolekül umfassend: – einen Target-erkennenden Rest – einen Abstandhalter, der aus einem wasserlöslichen Oligomer oder Polymer gebildet wird und – einen Verankerungsrest, der aus einem amphiphilen Lipid gebildet wird, das aus mindestens einem hydrophoben apolaren Rest und einer hydrophilen polaren Kopfgruppe besteht, dadurch gekennzeichnet, dass sich der Target-erkennende Rest aus folgenden ableitet: (1) einem Peptid, Peptoid oder Derivat davon mit einer Aminosäuresequenz X(A_X)_mA₃A₁A₂A₁Y, oder einem funktionellen Äquivalent der Sequenz, worin: – A₁ D- oder L-Cystein (C), D- oder L-Valin (V) oder ein Analogon davon ist; – A₂ D- oder L-Asparaginsäure (D) oder ein Analogon davon ist; – A₃ D- oder L-Phenylanalin (F) oder D- oder L-Tryptophan (W) oder ein Analogon davon ist; – A_X eine D- oder L-Aminosäure ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Glutaminsäure (E), Asparaginsäure (D), Glycin (G) und Cystein (C) besteht; – X die N-terminale Seite der Sequenz darstellt und Wasserstoff oder ein Rest ist, der 1 bis 6 D- oder L-Aminosäuren oder Analoga davon umfasst; – Y die C-terminale Seite der Sequenz darstellt und -OH oder ein Rest ist, der 1 bis 11 D- oder L-Aminosäuren oder Analoga davon umfasst; worin X und Y zusammen ein cyclisches System bilden können; dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eines von X und Y oder X + Y mit der Gruppe R¹-(Z)_n- substituiert ist, worin: – Z aus -CO-, -O-, -NR²- und -CO-NR²- ausgewählt ist; – worin R¹ und R² unabhängig voneinander aus folgenden ausgewählt sind: a) H; b) einer C₁-C₈-Alkylgruppe; c) einer C₂-C₈-Alkylgruppe, worin mindestens ein C-Atom durch ein Stickstoff-, Sauerstoff- oder Schwefelatom ersetzt ist; d) einer C₆-C₁₄-Arylgruppe, die mit mindestens einer Gruppe substituiert sein kann, die aus Halogen, C₁-C₆-Alkyl, -CF₃, -OH, -O-C₁-C₆-Alkyl, -COOH, -COO-C₁-C₆-Alkyl, -NO₂, -NH₂, -NH-C₁-C₆-Alkyl, -N-(C₁-C₆-Alkyl)₂ und -SO₃H ausgewählt ist; e) einer Heteroarylgruppe, die aus 5- oder 6-gliedrigen Ringsystemen und Benzo-kondensierten Ringsystemen ausgewählt ist und mindestens ein Heteroatom aufweist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel besteht, worin die Heteroarylgruppe mit mindestens einer Gruppe substituiert sein kann, die aus einem Halogen, -C₁-C₆-Alkyl, -CF₃, -OH, -O-C₁-C₆-Alkyl, -COOH, -COO-C₁-C₆-Alkyl, -NO₂, -NH₂, -NH-C₁-C₆-Alkyl, -N-(C₁-C₆-Alkyl)₂ und -SO₃H ausgewählt ist; f) einer Aralkylgruppe, die eine Alkylgruppe, wie in b) oder c) definiert, und eine Arylgruppe oder Heteroarylgruppe, wie in d) oder e) definiert, umfasst; und – m und n ganze Zahlen sind, die unabhängig voneinander aus 0 und 1 ausgewählt werden, unter der Maßgabe, dass n nicht 0 ist, wenn R¹ H ist; (2) einer Verbindung, die durch die folgende Formel Ia dargestellt ist:
und seinem Stereoisomer, das durch die folgende Formel Ib dargestellt ist:
worin: X eine optionale Gruppe ist, die -O-, -OCH₂-, -S-, -SCH₂-, -NH- oder -NHCH₂- darstellt; R¹ QR⁴ darstellt, worin Q -O-, -NH-, -NH-(C=O)-, -O-(C=O), -NH-(C=O)-O- oder NH-(C=O)-NH- darstellt; und worin R⁴ Wasserstoff oder eine Verbindung darstellt, die mindestens ein Kohlenstoffatom umfasst; R² ein Rest ist, der eine negative Ladung trägt und R³ jede Gruppe sein kann, unter der Maßgabe, dass X vorhanden ist, wenn Q = -O- und R⁴ -H ist; (3) Gallussäure oder einem Derivat davon, einem Polyphenol oder einem Polyhydroxyphenol der Strukturformel II:
dadurch gekennzeichnet, dass: R¹ = Wasserstoff; eine geradkettige oder verzweigte aliphatische (C₁-C₄)-Alkylgruppe oder eine aromatische Gruppe, die jeweils optional mit einer Hydroxylgruppe, einer Carbonsäuregruppe, einer Aminogruppe oder einer geradkettigen oder verzweigten aliphatischen Alkylgruppe substituiert sind; R² = eine optionale Gruppe, die eine geradkettige oder verzweigte aliphatische (C₁-C₄)-Alkylgruppe ist; R³ = eine geradkettige oder verzweigte aliphatische (C₁-C₄)-Alkylgruppe, die optional mit einer oder mehreren Carbonsäuregruppen substituiert ist; eine geradkettige oder verzweigte aliphatische (C₁-C₄)-Alkylamidgruppe; oder eine (C₃-C₈)-Cycloalkylgruppe, die optional mit einer geradkettigen oder verzweigten aliphatischen (C₁-C₄)-Alkylgruppe oder einer oder mehreren Carbonsäuregruppen substituiert ist.
Ligandenmolekül gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Aminosäurensequenz XEWVDVY oder ein funktionelles Äquivalent der Sequenz umfasst.
Ligandenmolekül gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer des Abstandhalters ein wasserlösliches Polymer ist.
Ligandenmolekül gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das wasserlösliche Polymer ein Polyethylenglycol, eine Poly(aminosäure), ein Poly(aminosäurederivat), ein Poly(aminosäureanalogon), ein Polyvinylpyrrolidon oder Gangliosid GM1 ist.
Ligandenmolekül gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das amphiphile Lipid aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Phospholipiden, Glycolipiden, Ceramiden, Cholesterin und Derivaten, gesättigten oder ungesättigten, verzweigten oder geradkettigen C₈-C₁₀₀-Mono- oder Dialkylaminen, Arylalkylaminen, Cycloalkylaminen, Alkanolen, Aldehyden, Carbohalogeniden oder Alkansäuren und Anhydriden davon besteht, und dadurch gekennzeichnet ist, dass die Gesamtanzahl der Kohlenstoffatome 25 oder größer ist.
Ligandenmolekül gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das amphiphile Lipid mindestens zwei hydrophobe apolare Reste enthält.
Ligandenmolekül gemäß Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass das amphiphile Lipid aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus 1-Heptadecyloctadecylamin, N-Succinyl-di-octadecylamin und Distearylphosphatidylethanolamin besteht.
Ligandenmolekül gemäß mindestens einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es XEWVTDVY-PEG-DSPE ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die (a) einen Träger und (b) mindestens ein Targeting-Ligandenmolekül gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8 umfasst, das mit der Oberfläche des Trägers verbunden ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger ein kolloidaler Träger, der aus Partikeln zusammengesetzt ist, die aus Vesikeln wie Liposomen und Niosomen, Nanokapseln, Mikrokapseln, Nanopartikeln, Mikropartikeln, Mizellen ausgewählt ist, oder ein Lipidkomplex, ein kolloidales Hydrogel oder eine Mikroemulsion ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel des kolloidalen Trägers einen mittleren Durchmesser von weniger als 1 μm haben.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel des kolloidalen Trägers einen mittleren Durchmesser von weniger als 400 nm haben.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß mindestens einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger aus Liposomen zusammengesetzt ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß mindestens einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen pharmakologischen Wirkstoff oder ein diagnostisches Mittel enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass der pharmakologische Wirkstoff ein Mittel zur Vorbeugung oder Behandlung einer Krankheit oder eines Zustands ist, in der oder dem P-Selectin einbezogen ist, ausgewählt aus Herzkranzgefäßkrankheit, Thrombose, Atherothrombose, Krebs, chronischen Entzündungskrankheiten, Gelenkrheumatismus, entzündlicher Darmkrankheit, Multipler Sklerose, Atherosklerose, Restenose, Ischämie, Reperfusionsverletzung einschließlich Niereninsuffizienz, Tumormetastase, bakterieller Sepsis, disseminierter intravaskulärer Gerinnung, posttraumatischer Lungeninsuffizienz, Schlaganfall, Angiogenese, Transplantatabstoßung, Kreislaufschock, Beinvenenthrombose oder Herzinfarkt.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß mindestens einem der Ansprüche 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Targeting-Ligandenmolekül ein Peptid, ein Peptoid oder ein Derivat davon ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß mindestens einem der Ansprüche 10 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger eine Beschichtung umfasst, die für eine verlangsamte Aufnahme der Zusammensetzung durch Zellen des Reticuloendothelialsystems sorgt.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Beschichtung des Trägers ein oder mehrere wasserlösliche Polymere umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das wasserlösliche Polymer aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Polyethylenglycolen, Poly(aminosäuren), Poly(aminosäurederivaten), Poly(aminosäureanaloga), Polyvinylpyrrolidonen und Gangliosid GM1 besteht.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass das Targeting-Ligandenmolekül einen Verankerungsrest umfasst, der zur Verankerung des Liganden mit dem Träger fähig ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass der Verankerungsrest des Targeting-Ligandenmoleküls aus der Gruppe der Phospholipide ausgewählt ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß mindestens einem der Ansprüche 10 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung XEWVDVY-PEG-DSPE umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß mindestens einem der Ansprüche 10 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens zwei Targeting-Ligandenmoleküle enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß mindestens einem der Ansprüche 10 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens zehn Targeting-Ligandenmoleküle enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß mindestens einem der Ansprüche 10 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass sie 20 bis 10.000 Targeting-Ligandenmoleküle enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß mindestens einem der Ansprüche 10 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung auf oralem, parenteralem, transmukosalem oder pulmonalem Weg verabreicht wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung auf parenteralem Weg verabreicht wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß mindestens einem der Ansprüche 10 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung zur Erhöhung der Bioverfügbarkeit verwendet wird.
Kit zur Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß mindestens einem der Ansprüche 10 bis 28, das eine flüssige und ein feste Komponente umfasst, wobei die flüssige Komponente eine wässrige Zusammensetzung ist und die feste Komponente (a) einen kolloidalen Träger und (b) mindestens ein Targeting-Ligandenmolekül umfasst, und durch konventionelle Verfahren und nachfolgende Entfernung des Wassers hergestellt wird.