DE60318585T2

DE60318585T2 - Verbindungen die p-selectin binden

Info

Publication number: DE60318585T2
Application number: DE60318585T
Authority: DE
Inventors: Chantal Catharina Appeldoorn; Erik Anna Biessen; Thomas Jacobus Molenaar; Johan Lacdr Kuiper; Theodorus Josephus Van Berkel
Original assignee: Astellas Pharma Europe BV
Current assignee: Astellas Pharma Europe BV
Priority date: 2002-08-09
Filing date: 2003-07-04
Publication date: 2009-01-08
Anticipated expiration: 2023-07-05
Also published as: DE60318585D1; ES2299749T3; AU2003250899A1; EP1527086A1; JP2006513141A; WO2004018502A8; ATE383370T1; US20100323969A1; US20060217294A1; CA2493471C; EP1527086B1; WO2004018502A1; CA2493471A1; JP2010209088A; JP4563806B2; US20090062186A1; MXPA05001599A; BR0313019A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen, die selektiv an das Adhäsionsmolekül humanes P-Selectin binden, Verfahren zur Herstellung solcher Verbindungen, die Verwendung solcher Verbindungen in therapeutischen oder diagnostischen Verfahren und in pharmazeutischen Zusammensetzungen, die Bindemoleküle, die an die Verbindungen binden, und ein Verfahren zur Bestimmung, ob eine Verbindung zur Bindung an P-Selectin fähig ist.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
In den letzten Jahren wurden Zelloberflächenadhäsionsmoleküle als Schlüsselmediatoren in zahlreichen zellulären Vorgängen, einschließlich Zellwachstum, -Differenzierung, Immunzell-Transmigration und -reaktion bzw. -antwort und Metastase von Krebs, anerkannt.
Vier Hauptkategorien von Adhäsionsmolekülen sind identifiziert worden: Die Zelladhäsionsmoleküle (CAMs) der Immunglobulinsuperfamilie, Cadherine, Integrine und Selectine.
Die Selectine stellen eine Familie von gegenwärtig drei transmembranen, kohlenhydratbindenden Glycoproteinen dar: „endotheliales" E-Selectin, „Leukozyten"-L-Selectin und „Blutplättchen"-P-Selectin. Alle drei Selectine sind von zweiwertigen Kationen (z. B. Calcium) abhängig und besitzen eine extrazelluläre Domäne mit einem Kohlenhydraterkennungsmotiv, einem epidermaler-Wachstumsfaktor-ähnlichen Motiv und einige kleinere Domänen, die mit Komplementregulatorproteinen verwandt sind.
Humanes P-Selectin (auch bezeichnet als GMP-140, LECAM-3, PADGEM, CD62 und CD62P) wird von Blutplättchen und Endothel zellen exprimiert. Wenn es auf der Oberfläche dieser Zellen exprimiert wird, ist seine bemerkenswerteste Wirkung die Verlangsamung von Leukozyten, wenn diese die Kapillaren verlassen und in die postkapillaren Venulen eindringen, wobei die letzteren den Hauptort der Leukozyten-Endothel-Adhäsion darstellen. Der Verlangsamungsprozess wird beobachtet als Leukozytenrollen, was eine Anfangsadhäsion mit relativ niedriger Affinität bedeutet. Die feste Adhäsion der rollenden Leukozyten ist hauptsächlich durch Integrine vermittelt.
In Endothelzellen wird P-Selectin in Weibel-Palade-Körperchen gespeichert, in Blutplättchen wird es in den α-Granula gefunden. Nach der Aktivierung wird P-Selectin innerhalb einiger Minuten in Reaktion auf eine Vielzahl von inflammatorischen oder thrombogenen Agenzien zu den Zelloberflächen mobilisiert. Die Hauptfunktion des endothelialen P-Selectins ist es, Leukozyten in postkapillare Venulen zu rekrutieren, während Blutplättchen-P-Selectin auch in der Bildung von Thrombi resultiert. Einer der gegenwärtig bekannten natürlichen Liganden von P-Selectin ist PSGL-1 (P-Selectin-Glycoprotein-Ligand-1), ein 120-kDa-Sialoprotein, das auf der Oberfläche von Leukozyten exprimiert wird, wo es am Uropodium konzentriert wird. Detailliertere Beschreibungen der Struktur und der Funktionen von P-Selectin werden in zahlreichen Publikationen gefunden (z. B. J. Panes, Pathophysiology 5: 271 (1999); F. Chamoun et al., Frontiers in Bioscience 5: e103 (1. Nov. 2000) und S. -I. Hayachi, Circulation 102: 1710 (2000)).
Entzündung und entzündliche Vorgänge spielen eine Hauptrolle in der Pathophysiologie zahlreicher Erkrankungen und Zustände. Zustände des Gehirns, bei denen erhöhte Selectinspiegel gefunden werden und die deshalb mit Selectin-vermittelten pathophysiologischen Ereignissen zusammenhängen können, umfas sen schwere traumatische Gehirnverletzung, rezidivierenderemittierende Multiple Sklerose, Okklusion cerebraler Arterien, Ischämie und Schlaganfall. Zustände des Herzens, bei denen nahegelegt wurde, dass Selectine eine Rolle spielen, umfassen akuten Myocardinfarkt, arterielle Schädigung, wie durch Angioplastie erzeugt, und Ischämie. Gleichermaßen hängen Selectine mit Zuständen der Nieren, wie Nierenschädigung aufgrund von Ischämie und Reperfusion und Nierenversagen zusammen. Ferner scheinen Selectine eine Rolle zu spielen in der Organtransplantatabstoßung, kalten Ischämie, im hämorrhagischen Schock, septischen Schock, der Tumormetastase, chronischer Entzündung, rheumatoider Arthritis, entzündlicher Darmerkrankung, Atherosklerose, Restenose, Angiogenese, der disseminierten intravaskulären Koagulation, dem Atemnotssyndrom von Erwachsenen und Kreislaufschock.
Somit erscheint es machbar, diese und andere Zustände, die mit der Aktivierung von Endothelzellen und Leukozyten und spezifisch der Mobilisierung und Expression von P-Selectin zusammenhängen, zu verbessern, indem die P-Selectin-Kaskaden spezifisch unterbrochen werden. Dies kann zum Beispiel durch die Verabreichung von Liganden, die selektiv an humanes P-Selectin binden, aber nicht dessen Bioaktivität besitzen, erfolgen. Mittels dieses Verfahrens könnte mobilisiertes P-Selectin inaktiviert und eine Leukozyten-induzierte Gewebsschädigung verhindert werden. Möglicherweise könnte die gleiche Wirkung mittels Gentherapie erreicht werden, vorausgesetzt, dass der P-Selectin-Ligand oder -Antagonist ein Peptid oder modifiziertes Peptid ist. Gemäß diesem Verfahren würden somatische Zellen einer Person, die einer Therapie bedarf, mit einem Expressionsvektor transfiziert werden, der eine DNA-Sequenz, codierend für einen P-Selectin-Antagonisten, trägt.
P-Selectin-Liganden oder -Antagonisten können auch zur Verhinderung von oben beschriebenen Erkrankungen und Zuständen verwendet werden. Ferner können solche Liganden auch in der In-vivo- oder In-vitro-Diagnose dieser Erkrankungen nützlich sein.
Zahlreiche Versuche sind in den vergangenen Jahren gemacht worden, um solche selektiven Liganden von P-Selectin zu identifizieren oder zu erzeugen. Insoweit wurde eine Zahl von Substanzen getestet, jedoch haben bislang keine klinischen Studien einen schlüssigen Beweis erbracht, dass eine dieser Verbindungen die gewünschten klinischen Wirkungen erzeugt, während sie hinsichtlich Nebenwirkungen tolerierbar ist.
Zum Beispiel wurde festgestellt, dass Antikörper gegen P-Selectin, die erzeugt und in Tiermodellen getestet wurden, die Nieren vor einer ischämischen Reperfusionsschädigung schützen (H. C. Rabb et al., JASN 5: 907 (1997) und US-A-6,033,667 ). In einer weiteren Studie wurde eine rekombinante lösliche Form von P-Selectin-Glycoprotein-Ligand-1 (rPSGL-Ig) verwendet, um Thrombose bei Katzen zu inhibieren (M. J. Eppihimer et al., Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biologe 20: 2483 (2000)). Die WO 96/09309 offenbart Oligosaccharidstrukturen, die Liganden von E- und P-Selectin sind. Die WO 99/41363 offenbart Podocalyxin-ähnliche Proteine, die an Selectine binden. Die WO 00/41711 beschreibt zahlreiche kleiner Peptide oder Peptidsequenzen, die an Mitglieder der humanen Selectinfamilie binden; die meisten der Sequenzen umfassen eine oder mehrere Einheiten von Leucin oder Isoleucin.
In einem weiteren Ansatz zum Inhibieren der P-Selectin-Kaskade wurde festgestellt, dass zahlreiche Peptide, abgeleitet von der Lectindomäne der Selectinfamilie, die Neutrophilenadhäsion an P-Selectin inhibieren (z. B. US-A-6,111,065 und US-A-5,916,876 ); diese Peptide binden wahrscheinlich an P-Selectin-Rezeptoren auf Leukozyten.
In der WO 94/05269 sind Peptide beschrieben, die die Bindung von Selectinen, wie P-Selectin, E-Selectin und L-Selectin, inhibieren. Diese Peptide haben Teile der Sequenz der Aminosäuren 11-18 („11-18 amino acid sequence") von P-Selectin, E-Selectin oder L-Selectin als ihre Kernregion. Ferner betrifft die WO 95/31210 Peptide und Verbindungen, die Selectine binden, einschließlich endothelium leukocyte adhesion molecule 1 (ELAM-1). Diese Peptide werden zum Blockieren der Adhäsion von Leukozyten an die Selectine, d. h. insbesondere E-Selectin, aber auch P-Selectin oder L-Selectin, zum Zwecke der Inhibierung einer Entzündung verwendet.
In der nicht vorveröffentlichten europäischen Patentanmeldung Nr. 01203314.8 sind Verbindungen offenbart worden, welche die peptidische Sequenz XA_xA₃A₁A₂A₁Y oder ein funktionelles Äquivalent davon umfassen und eine selektive Affinität zu humanem P-Selectin aufweisen, worin:
A₁ D- oder L-Cystein (C), D- oder L-Methionin (M), D- oder L-Valin (V) oder ein Analogon ist;
A₂ D- oder L-Asparaginsäure (D) ist oder ein Analogon davon ist;
A₃ D- oder L-Phenylalanin (F), D- oder L-Tyrosin (Y) oder D- oder L-Tryptophan (W) oder ein Analogon davon ist;
A_x eine D- oder L-Aminosäure ist;
X die N-terminale Seite der Sequenz markiert und
Y die C-terminale Seite der Sequenz markiert oder
X und Y zusammen ein cyclisches System bilden können.
Die Verbindung EWVDV, beschrieben in der oben genannten Anmeldung, weist eine Affinität für P-Selectin auf, wie durch einen IC₅₀-Wert von etwa 2 μM ausgedrückt. Sein Tetramer an Streptavidin weist einen IC₅₀ von etwa 2 μM auf.
Eine ähnliche Offenbarung ist zu finden in Molenaar et al., 2002, Blood 100, S. 3570–3577.
Trotz der oben beschriebenen Anstrengungen besteht dennoch ein Bedarf an Substanzen mit selektiver Affinität für P-Selectin, die zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen zur Diagnose, Verhinderung und Behandlung von zahlreichen Erkrankungen und Zuständen, die mit der Adhärenz von Leukozyten an Gefäßendothelzellen oder an Blutplättchen zusammenhängen, verwendet werden können. Für eine in-vivo-Verwendung wäre es in hohem Maße wünschenswert, relativ einfache Verbindungen mit einer sehr hohen Affinität für P-Selectin zu besitzen. Es besteht auch ein Bedarf an P-Selectin-Liganden, die als Targetierungsmoleküle oder -Gruppierungen in pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Targetierung von Wirkstoffen oder genetischem Material auf P-Selectin exprimierende Gewebe verwendet werden können.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist demnach eine Aufgabe der Erfindung, Verbindungen mit selektiver Affinität zu humanem P-Selectin bereitzustellen.
Insbesondere ist es eine Aufgabe der Erfindung, Verbindungen bereitzustellen, die als Antagonisten oder partielle Antagonisten von P-Selectin wirken.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, Verbindungen bereitzustellen, die als Targetierungsliganden wirken, mit einer Fähigkeit, Wirkstoffe und genetisches Material auf Zellen und Gewebe, die P-Selectin exprimieren, zu targetieren.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von Verfahren zur Herstellung solcher Verbindungen.
Noch eine weitere Aufgabe ist die Darstellung von Verwendungen solcher Verbindungen und von Zusammensetzungen, welche die Verbindungen enthalten.
LEGENDEN ZU DEN FIGUREN
1 zeigt die chemischen Strukturen der Acylgruppierungen 1-7, eingeführt in die Kernsequenzverbindung 8.
2 ist eine schematische Darstellung der Festphasensynthese der Verbindungsbibliothek 10. Die Kernsequenzverbindung 8 wurde unter Verwendung von Standard-Fmoc-Chemie an einem Tentagel S-NH₂-Harz mit einem HMPA-Linker synthetisiert. Dann wurde das Kernpeptid am N-Terminus (nach Entfernung des Fmoc) oder am C-Terminus (nach selektiver Entfernung der DDE-Gruppe mittels 2% Hydrazin) mit 7 verschiedenen Carbonsäuren (siehe 1) derivatisiert. Die Peptide wurden aus dem Harz mittels TFA-Spaltung freigesetzt, was in der Verbindungsbibliothek 10 resultierte. Fmoc, N-(9-Fluorenyl)methoxycarbonyl; HMPA, 4-Hydroxymethylphenoxyessigsäure; Boc, N-(t-Butoxycarbonyl); tBu, tert.-Butyl; TFA, Trifluoressigsäure; DDE, 4,4-Dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-yliden-ethyl.
3 ist eine graphische Darstellung der Fähigkeit der derivatisierten Peptide HP10-HP77, die Ligandenbindung an humanes P-Selectin zu inhibieren. Rohe derivatisierte Peptide wurden in einem kompetitiven Assay auf ihre Fähigkeit zur Verdrängung der Bindung von TM11-PO an humanes P-Selectin getestet. Jeder Balken stellt die Bindung von TM11-PO in Gegenwart von derivatisiertem Peptid (5 μM, n = 3–5) dar. Die Peptide sind mit HPij codiert, wobei sich i und j auf die Acylgruppierungen 1-7, wie in 1 gezeigt und an den N- bzw. C-Terminus gebunden, beziehen. N/C-unmodifizierte Aminogruppen sind durch 0 angezeigt.
Die 4–6 zeigen die chemische Struktur (4A) und biologische Aktivität der Verbindungsbibliothek 14 (4B, 5C und 6D). Die rohe Peptidbibliothek 14 (1 μM) wurde in einem kompetitiven Assay der TM11-PO-Bindung an humanes P-Selectin getestet. Drei verschiedene Spacer zwischen der Acylgruppierung und der WVDV-Kernsequenz wurden verwendet (R₁): kein Spacer (weiße Balken), ein Glycylspacer (graue Balken) und ein Aminobuttersäurespacer (schwarze Balken). Die chemische Struktur der eingeführten Acylmodifikation (R₂) ist unterhalb dieser Balken dargestellt.
7 zeigt eine graphische Darstellung der Kompetition bzw. Verdrängung der Biotin-PAA-Le^a-SO₃-Bindung an humanes P-Selectin (
), Maus-P-Selectin (☐), humanes L-Selectin (
) und humanes E-Selectin (
) durch Peptid 28. Wells bzw. Vertiefungen wurden mit jedem Selectin (0,3 μg/ml) beschichtet und mit 0,33 μg/ml Biotin-PAA-Le^a-SO₃ mit oder ohne Peptid 28 wie in Beispiel 3 beschrieben inkubiert.
8 ist eine graphische Darstellung der Kompetition bzw. Verdrängung der HL-60-Zellbindung an CHO-P-Zellen durch Peptid 28 (
) oder EWVDV (
). CHO-P-Zellen, angeimpft in 96 Wells, wurden mit Calcein-markierten HL-60-Zellen in Gegenwart von Peptid 28 oder EWVDV inkubiert. Die Datenpunkte sind Mittelwerte von 12 Datenpunkten aus vierfacher Wiederholung.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung weisen eine selektive Affinität zu humanem P-Selectin auf und sind Derivate von Peptiden, wiedergegeben durch X(A_x)_mA₃A₁A₂A₁Y, worin:

– A₁ D- oder L-Cystein (C) oder D- oder L-Valin (V) ist;
– A₂ D- oder L-Asparaginsäure (D) ist;
– A₃ D- oder L-Phenylalanin (F) oder D- oder L-Tryptophan (W) ist;
– A_x eine D- oder L-Aminosäure ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Glutaminsäure (E), Asparaginsäure (D), Glycin (G) und Cystein (C);
– X die N-terminale Seite der Sequenz markiert und Wasserstoff oder ein Rest, umfassend 1 bis 6 D- oder L-Aminosäuren oder Analoga davon, ist;
– Y die C-terminale Seite der Sequenz markiert und -OH oder ein Rest, umfassend 1 bis 11 D- oder L-Aminosäuren oder Analoge davon, ist;

-R¹-(Z)_n

– Z -CO- ist und worin
– R₁ ausgewählt ist aus:
– einer (C₂-C₈)-Alkylgruppe, in der wenigstens ein C-Atom durch ein Stickstoffatom ersetzt ist;
– einer (C₆-C₁₄)-Arylgruppe, die mit wenigstens einer Gruppe, ausgewählt aus -OH oder -COOH, substituiert sein kann; und worin m und n ganze Zahlen darstellen, unabhängig ausgewählt aus 0 und 1.

Peptide sind definiert als Amide, die von zwei oder mehr Aminosäuren durch Kombination der Aminogruppe von einer Säure mit der Carboxylgruppe einer weiteren abgeleitet sind (Merriam Webster Medical Dictionary ^©2001). Wie hierin verwendet, kann sich ein Peptid auch auf eine peptidische Struktur innerhalb eines Moleküls beziehen. Typischerweise bestehen Peptide aus natürlich vorkommenden L-α-Aminosäuren. Diese sind Alanin (Ala oder A), Arginin (Arg oder R), Asparagin (Asn oder N), Asparaginsäure (Asp oder D), Cystein (Cys oder C), Glutamin (Gin oder Q), Glutaminsäure (Glu oder E), Glycin (Gly oder G), Histidin (His oder H), Isoleucin (Ile oder I), Leucin (Leu oder L), Lysin (Lys oder K), Methionin (Met oder M), Phenylalanin (Phe oder F), Prolin (Pro oder P), Serin (Ser oder S), Threonin (Thr oder T), Tryptophan (Trp oder W), Tyrosin (Tyr oder Y) und Valin (Val oder V).
Gemäß der Erfindung sind die zwei Einheiten von A₁ innerhalb der Sequenz unabhängig ausgewählt; sie können identisch oder voneinander verschieden sein. Vorzugsweise stellt wenigstens eine der A₁-Einheiten Valin (V) dar. Stärker bevorzugt sind beide A₁-Einheiten Valin (V). In einer weiteren Ausführungsform ist A₁ D- oder L-Cystein (C) oder Valin (V).
Insbesondere umfasst die Erfindung auch ein Verfahren zur Bestimmung, ob eine Verbindung zur Bindung an humanes P-Selectin fähig ist, umfassend Ersetzung einer Aminosäure in einer erfindungsgemäßen Verbindung durch eine konservative Aminosäure und Bestimmung, ob die resultierende Verbindung zur Bindung an das P-Selectin fähig ist. Gemäß der Erfindung ist A₂ D- oder L-Asparaginsäure mit einer lösungsmittelexponierten Seitenkette, die bei physiologischem pH eine negative Ladung trägt.
A₃ ist eine D- oder L-Aminosäure mit einer aromatischen Seitenkette, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Phenylalanin (F) und Tryptophan (W). Stärker bevorzugt ist A₃ eine L-Aminosäure, die aus dieser Gruppe ausgewählt ist. Tryptophan (W) ist am stärksten bevorzugt.
A_x ist eine D- oder L-Aminosäure, wie oben definiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Glutaminsäure (E), Asparaginsäure (D), Glycin (G) und Cystein (C). In einer der be vorzugten Ausführungsformen ist A_x D- oder L-Glutaminsäure (E).
Es ist zu bemerken, dass die zwei Einheiten von A₁ unabhängig ausgewählt sind, d. h. sie können identisch oder voneinander verschieden sein.
X markiert die N-terminale Gruppe. X kann einfach Wasserstoff sein. In einer weiteren Ausführungsform ist X eine Sequenz von bis zu 6 D- oder L-Aminosäuren oder Analoga davon. Der Typ der Aminosäure(n) sollte natürlich die Erkennung durch P-Selectin nicht in einer solchen Weise beeinträchtigen, dass die beabsichtigte Wirkung nicht mehr erhalten wird, zum Beispiel indem die Konfiguration des Peptids verändert wird oder indem die räumliche Orientierung der terminalen Carbonsäure bezüglich des Kernpeptids verändert wird. Geeignete Analoga umfassen aminosubstituierte Carbonsäuren, z. B. Aminocyclohexansäure, Aminobenzoesäure und Aminocapronsäure.
Y markiert die C-terminale Gruppe. Y kann eine Hydroxylgruppe sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist Y ein Rest, umfassend 1 bis 11 D- oder L-Aminosäuren, der eine terminale Hydroxylgruppe trägt. Die Erkennung durch P-Selectin ist gegenüber Substituenten am C-Terminus toleranter. Auch ist bevorzugt, dass wenigstens eine Aminosäure mit einer negativ geladenen Seitenkette in Y vorhanden ist, vorzugsweise durch ein bis drei Aminosäuren von der restlichen X(A_x)_mA₃A₁A₂A₁-Sequenz getrennt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist Y D- oder L-Lysin (K) oder umfasst D- oder L-Lysin (K).
Die erfindungsgemäße Verbindung kann ein cyclisches oder auf andere Weise gespanntes bzw. beschränktes („constrained") Grundgerüst bzw. Rückgrat besitzen. In diesem Falle können X + Y zusammen in geeigneter Weise durch eine S-S-Bindung ver knüpft sein, obgleich natürlich auch andere Typen von (chemischen) Verknüpfungen bzw. Bindungen vorliegen können, wie eine Amidbindung, eine Thioetherbindung, eine Carbamatbindung oder eine Esterbindung.
Die Länge der Gruppe X + Y ist nicht besonders kritisch, solange die Kernsequenz durch P-Selectin erkannt wird. Im Allgemeinen korrespondiert die minimale Länge von X + Y mit der Lange von 5-6 Aminosäuren.
Die Gruppe R¹-(Z)_n-, mit der X oder Y oder beide, X und Y, unabhängig substituiert sind, kann ausgewählt sein aus R-CO-Gruppen, worin R eine Aryl- oder Heteroalkylgruppe ist. Die Heteroalkylgruppe besitzt vorzugsweise 2 bis 8 Kohlenstoffatome, wenigstens eines von diesen ist durch ein Stickstoffatom ersetzt. Eine Arylgruppe besitzt vorzugsweise 6 bis 14 Kohlenstoffatome und die Gruppe kann mit wenigstens einer Gruppe, ausgewählt aus -OH oder -COOH, substituiert sein.
Beispiele der Verbindungen sind jene, worin Z -CO- ist und R¹ die folgenden Gruppen darstellt: 4-Hydroxyphenylcarbonyl, 3,5-Dihydroxyphenylcarbonyl, 3-Hydroxy-5-carbonyloxyphenylcarbonyl, 3,4,5-Trimethoxyphenylcarbonyl, 4-Carboxyphenylcarbonyl, 3-Carbonylbuttersäure, 3-Carboxyphenylcarbonyl. Jedoch sind besonders bevorzugte Gruppen Acylgruppen und insbesonddere 3,5-Dicarboxyphenylcarbonyl- und 3,4,5-Trihydroxyphenylcarbonylgruppen.
Ferner sind auch Modifikationen, basierend auf Gerbsäure, Kaffeesäure („caffeinic acid"), Oligohydroxyarylgruppen und Oligocarboxyarylgruppen sowie Derivaten davon bevorzugt, insbesondere an der Gruppe X. Die 3,4,5-Trihydroxyphenylcarbonylgruppe kann jedoch vorteilhafterweise sowohl an der Gruppe X als auch an der Gruppe Y verwendet werden.
Es wird angenommen, dass die R¹-(Z)_n-Modifikation eine zusätzliche Wechselwirkung der Peptidverbindung mit der P-Selectin-Bindungstasche bei der P-Auswahl („on P-selection") ermöglicht, möglicherweise durch elektrostatische Wechselwirkung oder H-Brückenbildung. Dies führt zu einem Gewinn an Affinität für P-Selectin.
Sehr gute Ergebnisse werden für jene Verbindungen erhalten, die eine N-terminale Amidfunktion aufweisen. Sehr gute Ergebnisse werden auch erhalten, wenn ein Linker zwischen der N-terminalen Substituentengruppe und Aminosäure A_x oder A₃ in der Aminosäuresequenz der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet wird. Geeignete Linker oder Spacer sind Glycin und Aminobuttersäure.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen lineare, verzweigte, cyclische oder gespannte bzw. beschränkte („constrained") Grundgerüste bzw. Rückgrate. Zum Beispiel können Peptide mit wenigstens zwei Cystein (C)-Einheiten mittels Oxidation cyclisiert werden. Falls eine Verbindung über eine solche Disulfidbindung cyclisiert wird, ist es bevorzugt, dass die teilhabenden Cysteineinheiten Mitglieder von X bzw. Y sind. Cyclische Strukturen sind in der Tat ein Beispiel für konformationell beschränkte Grundgerüste. Andere Typen von gespannten bzw. beschränkten Strukturen kennen ebenfalls eingeführt werden, um die konformationelle Flexibilität der Verbindung zu senken. Zu diesem Zweck kann insbesondere das Vorhandensein von olefinischen Bindungen oder kleinen Ringstrukturen im Grundgerüst bzw. Rückgrat dienen. Beispiele für derartige Beschränkungen sind zu finden in Pharmaceutical Biotechnology, Hrsg. D. J. A. Crommelin und R. D. Sindelar, Harwood Academic Publishers, 1997, S. 139f.
In einer der bevorzugten Ausführungsformen werden die erfindungsgemäßen Verbindungen als Multimere aus den derivatisierten Peptiden bereitgestellt.
In einem weiteren Typ von Multimer, das erzeugt werden kann, um die erfindungsgemäßen Verbindungen zu bilden, sind einzelne derivatisierte Peptidketten gemäß der Erfindung an ein biokompatibles Protein, wie humanes Serumalbumin, humanisierte Antikörper, Liposome, Micellen, synthetische Polymere, Nanopartikel und Phagen gekuppelt. Multimere können auch derivatisierte Peptide darstellen, die seriell miteinander über Spacer gekuppelt sind, d. h. Konkatamere oder Dendrimere oder Cluster.
Die Verbindungen können allgemein mittels der Verfahren, die zur Herstellung von Peptiden und Derivaten davon bekannt sind, hergestellt werden. Kleinere Verbindungen, die nur einige Aminosäuren und vorzugsweise nicht mehr als 30-50 Einheiten enthalten, können mittels chemischer und/oder enzymatischer Ligationstechniken entweder unter Verwendung der klassischen Herangehensweise, bei der die Reaktionen in Lösung oder Suspension stattfinden, oder durch Einsatz der moderneren Festphasenherangehensweise, in der das Peptid zusammengesetzt wird, während es an einer festen Oberfläche, wie einem polymeren Kügelchen, verankert ist, hergestellt werden. Größere Verbindungen werden typischerweise mittels automatisierter Festphasenpeptidsynthesegeräte synthetisiert. Die erhaltenen Verbindungen werden dann durch Umsetzung mit einer geeigneten R¹(Z)_n-Quelle, vorzugsweise einer R₁(Z)_n-OH-Gruppe modifiziert. Die genannte Quelle reagiert mit einer primären Aminogruppe in der Peptidverbindung.
Wenn die Peptidsequenz in den Verbindungen gemäß der Erfindung mittels Standard-Fmoc-Chemie hergestellt wird und die Fmoc-Schutzgruppe entfernt wird, ist der N-Terminus sofort für eine Umsetzung zur Einführung der R¹(Z)_n-Gruppe verfügbar.
Wenn der C-Terminus kein verfügbares freies Amin aufweist, kann die genannte Quelle mit einem hinzugefügten Lysin umgesetzt werden, wobei das Lysin zweckdienlicherweise als sein DDE-Derivat zugesetzt werden kann. DDE ist 4,4-Dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-yliden-ethyl; es kann selektiv mit 2% Hydrazin entfernt werden, ohne die säurelabilen Seitenkettenschutzgruppen zu beeinträchtigen.
Einige umfassendere Zusammenfassungen von Verfahren, die in der Herstellung der Verbindungen angewendet werden können, sind beschrieben in: W. F. Anderson, Nature 392 Supp., 30. April 1998, S. 25–30; Pharmaceutical Biotechnology, Hrsg. D. J. A. Crommelin und R. D. Sindelar, Harwood Academic Publishers, 1997, S. 53–70, 167–180, 123–152, 8–20; Protein Synthesis: Methods and Protocols, Hrsg. R. Martin, Humana Press, 1998, S. 1–442; Solid-Phase Peptide Synthesis, Hrsg. G. B. Fields, Academic Press, 1997, S. 1–780; Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford University Press, 1997, S. 1–89.
Salze der Derivate der Peptide werden mittels bekannter Verfahren hergestellt, die typischerweise das Mischen des Derivats des Peptids mit entweder einer pharmazeutisch verträglichen Säure zur Bildung eines Säureadditionssalzes oder mit einer pharmazeutisch verträglichen Base zur Bildung eines Basenadditionssalzes umfassen. Abhängig von der beabsichtigten Verwendung umfassen pharmazeutisch verträgliche Säuren organische und anorganische Säuren, wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Milchsäure, Glycolsäure, Oxalsäure, Brenztraubensäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Malonsäure, Zimtsäure, Schwefelsäure, Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Salpetersäure, Perchlorsäure, Phosphorsäure und Thiocyansäure, die Ammoniumsalze mit freien Aminogruppen der derivatisierten Peptide bilden. Pharmazeutisch verträgliche Basen, die Carboxylatsalze mit freien Carbonsäuregruppen der derivatisierten Peptide bilden, umfassen Ethylamin, Methylamin, Dimethylamin, Triethylamin, Isopropylamin, Diisopropylamin und andere Mono-, Di- und Trialkylamine, sowie Arylamine.
Darüber hinaus sind auch pharmazeutisch verträgliche Solvate umfasst.
Multimere der derivatisierten Peptide gemäß der Erfindung können zum Beispiel auf eine ähnliche Weise wie Multimere von Peptiden hergestellt werden, zum Beispiel mittels Biotinylierung der N-Terminus-Ketten und nachfolgende Komplexierung mit Streptavidin, wobei, sofern für nötig gehalten, das Verfahren an die spezifischen Verbindungen angepasst wird. Da Streptavidin dazu fähig ist, 4 Biotinmoleküle oder -konjugate mit hoher Affinität zu binden, können mittels dieses Verfahrens sehr stabile tetramere Peptidkomplexe gebildet werden. Multimere können aus identischen oder verschiedenen derivatisierten Peptiden bestehen. Vorzugsweise bestehen die erfindungsgemäßen Multimere jedoch aus zwei oder mehr identischen derivatisierten Peptiden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen haben eine Affinität zu humanem P-Selectin, ein Membranprotein, exprimiert durch Gefäßendothelzellen und Blutplättchen, das an der Leukozytenadhäsion an das Endothel und Blutplättchen beteiligt ist. Die Affinität oder Bindungseigenschaften von Verbindungen zu/bezüglich P-Selectin können zum Beispiel als der IC₅₀-Wert quantifiziert werden. Typischerweise würde ein IC₅₀-Wert von etwa 50–100 μM oder weniger als Beweis für Affinität und Bindung angesehen werden. Für Liganden sind Substanzen mit IC₅₀-Werten von etwa 10 μM oder weniger wünschenswerter. Der niedrigste IC₅₀-Wert, der für Bindungen vom nicht-kovalenten Typ, die eine Rolle in den Wechselwirkungen oder Bindungen gemäß der vorliegenden Erfindung spielen, erreichbar ist, beträgt etwa 10^–15 M. Im Allgemeinen sind die IC₅₀-Werte höher als etwa 10^–12 M und in den meisten Fällen höher als 10^–9 M.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen weisen IC₅₀-Werte gegenüber P-Selectin im niedrigen Mikromol- bis niedrigen Nanomolbereich auf, was sie etwa gleich wirksam wie den natürlichen Liganden P-Selectin-Glyoprotein-Ligand-1 macht.
Es wurde festgestellt, dass N-terminal modifizierte Verbindungen der Erfindung effektiver (wirksamer und/oder spezifischer) als die entsprechenden C-terminal modifizierten Verbindungen, die die gleichen Modifikationen enthalten, waren. Sehr gute Ergebnisse wurden mit einer Modifikation durch 1,3,5-Tricarbonsäure oder Gallussäure erhalten.
Zusätzlich können die Verbindungen gemäß der Erfindung die Peptide aufgrund der Derivatisierung gegen Proteasen, insbesondere gegen N-Exopeptidasen stabiler machen. Die Verbindungen können ferner eine gesteigerte Spezifität für P-Selectin aufweisen und daher eine pharmakologische Wirkung, wie eine Wechselwirkung zwischen Monozyt und Blutplättchen, die zwischen Monozyt und Endothelzellen, die zwischen Thrombozyten und Thrombozyten, modulieren. Auf diese Weise können auch potenzielle Nebenwirkungen verhindert werden. Die Verbindungen wären in vielen Spezies kreuzreaktiv.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf die Verwendungen der offenbarten Verbindungen. Da die Verbindungen selektiv an P-Selectin binden, können sie, abhängig vom Typ ihrer Wechselwirkung mit P-Selectin nach der Bindung, als Antagonisten, partielle Antagonisten oder nur als Targetierungsmittel zum Targetieren konjugierter Substanzen auf Zellen und Gewebe, die P-Selectin exprimieren, dienen. Die Ver bindungen können vorteilhafterweise in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die die erfindungsgemäßen Verbindungen enthalten, können für zahlreiche Verabreichungswege, wie den parenteralen, oralen, transmukosalen, nasalen oder pulmonalen Weg angepasst werden. Sie können ferner Wirkstofftargetierungsmittel, die Bioverfügbarkeit erhöhende Mittel oder aktive Inhaltsstoffe außer den erfindungsgemäßen Verbindungen enthalten und eine sofortige oder modifizierte Freisetzung ermöglichen.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „pharmazeutische Zusammensetzung" auf therapeutische und diagnostische Zusammensetzungen, sowie auf Medikamente und Diagnostika, die solche Zusammensetzungen enthalten. Therapeutische Zusammensetzungen und Medikamente werden zur Verhinderung oder Behandlung von Erkrankungen und anderen Zuständen von Säugetieren, deren Verbesserung wünschenswert ist, verwendet. Die Diagnostika und diagnostischen Zusammensetzungen werden zur Diagnose von solchen Erkrankungen in vivo und in vitro verwendet.
Eine bevorzugte Verwendung der Verbindungen ist die Herstellung therapeutischer Zusammensetzungen oder Medikamente zur Verhinderung oder Verbesserung von Erkrankungen und Zuständen, die mit der Adhäsion von Leukozyten, wie Monozyten und Neutrophilen, an das Gefäßendothel und an Blutplättchen zusammenhängen. Die Verbindungen können auch in Zusammensetzungen zur Behandlung von Erkrankungen, bei denen die Inhibierung einer P-Selectin-vermittelten intrazellulären Signalisierung wünschenswert ist, verwendet werden.
Zum Beispiel können Zusammensetzungen, enthaltend eine oder mehrere erfindungsgemäße Verbindungen, zur Kontrolle von Leu kozyten vermittelten entzündlichen Vorgängen beitragen. Es ist bekannt, dass aktivierte Leukozyten toxische Moleküle freisetzen, die normales Gewebe schädigen können. Diese entzündlichen Reaktionen, von denen einige auch mit einer P-Selectin-vermittelten Thrombozytenaktivierung bzw. Blutplättchenaktivierung zusammenhängen, sind Teil etlicher pathologischer Zustände, wie Transplantatabstoßung, kalte Ischämie, hämorrhagischer Schock, septischer Schock, Tumormetastase, Thrombose, chronische Entzündung, rheumatoide Arthritis, entzündliche Darmerkrankung, Atherosklerose, Restenose, Angiogenese, disseminierte intravaskuläre Koagulation, Atemnotssyndrom bei Erwachsenen, Kreislaufschock, schwere traumatische Gehirnverletzung, rezidivierende-remittierende Multiple Sklerose, Okklusion cerebraler Arterien, Ischämie, Schlaganfall, akuter Myocardinfarkt, tiefe Venenthrombose, arterielle Schädigung bzw. Verletzung, wie durch Angioplastie verursacht, myocardiale Ischämie, Nierenschädigung aufgrund von Ischämie und Reperfusion und Nierenversagen.
In einer weiteren Ausführungsform werden die Verbindungen bei der Herstellung von diagnostischen Zusammensetzungen oder Produkten verwendet. Solche Zusammensetzungen können für invitro-Tests zum Quantifizieren von P-Selectin-Konzentrationen in Körperflüssigkeiten als Marker für die oben beschriebenen Erkrankungen und Zustände verwendet werden. Sie können auch für diagnostische Bildgebungsverfahrensweisen in vivo verwendet werden, um P-Selectin-vermittelte Atherosklerose, Aneurismen, Restenose nach perkutaner transluminaler Koronarangioplastie (Post-PTCA-Restenose) und andere Zustände, ausgewählt aus jenen, bei denen P-Selectin mobilisiert wird, zu überwachen. Als eine Option für diese Verwendung kann eine erfindungsgemäße Verbindung mit einem Chelatbildner konjugiert sein, der nachfolgend mit einer Isotopenmarkierung („isotropic label") komplexiert wird, die mittels des gewählten Überwachungssystems detektierbar ist.
Eine weitere Verwendung der Verbindungen ist die eines Tools bzw. Werkzeugs in der Forschung. Zum Beispiel können sie verwendet werden, um die Bindungsaffinität von Molekülen gegenüber P-Selectin zu testen. Um dieses Testverfahren durchzuführen, würde P-Selectin mit einem Molekül, zu testen auf Bindungsaffinität, und mit einer erfindungsgemäßen Verbindung in Kontakt gebracht und inkubiert werden. Eine verringerte Bindung der erfindungsgemäßen Verbindung würde eine Affinität des Moleküls gegenüber P-Selectin anzeigen.
Die Verbindungen können auch als Targetierungsmoleküle oder -konjugate in pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Targetierung von Wirkstoffen oder genetischem Material auf Gewebe, das P-Selectin exprimiert, verwendet werden. Als Konjugate können die Verbindungen direkt mit aktiven Molekülen oder Nukleinsäuren gekuppelt sein, die an derartige Gewebe abgegeben werden sollen. Alternativ können sie in die Oberfläche von Liposomen oder anderen Lipidvesikeln, Emulsionströpfchen, Polymeren, Nano- oder Mikropartikeln eingearbeitet oder darauf verankert werden, um targetierte Vehikel für Wirkstoffe oder genetisches Material zu erhalten, welche/welches an P-Selectin-exprimierende Gewebe abgegeben werden sollen/soll.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen enthalten bevorzugt eine oder mehrere Verbindungen mit P-Selectin-Affinität, wie hierin offenbart, und wenigstens ein(en) Träger oder Exzipiens. Wie hierin verwendet ist ein Träger oder Exzipiens eine pharmazeutisch verträgliche Substanz oder ein Gemisch von Substanzen, die/das keine wesentliche pharmakologische Aktivität aufweist, welcher/welches als Vehikel oder Hilfssubstanz zum Formulieren einer Verbindung in eine Dosierungsform, die stabil und leicht zu verabreichen ist, verwendet werden kann. Beispiele für pharmazeutisch verträgliche Exzi pienzien sind in den Monographien aller wesentlichen Pharmakopöen zu finden.
In einer Ausführungsform ist die Zusammensetzung für parenterale Injektion, vorzugsweise für intravasculäre Injektion, wie intravenöse oder intraarterielle Injektion, aber auch für intramuskuläre, subkutane, intraläsionale, intraperitoneale oder andere Wege der parenteralen Verabreichung formuliert und bearbeitet. Dieselben Prinzipien, die die Formulierung von anderen Arzneimitteln für diese Verabreichungswege steuern, werden auch den Fachmann lehren, wie solche Zusammensetzungen herzustellen sind. Zum Beispiel ist deren Sterilität eine der Anforderung an parenterale Dosierungsformen. Andere Anforderungen sind in allen wesentlichen Pharmakopöen beschrieben, wie in USP 24, in der Monographie „General Requirements for Tests and Assays. 1. Injektions", S. 1775–1777. Um die Stabilität einer parenteralen Formulierung zu erhöhen, kann es nötig sein, eine getrocknete Dosierungsform bereitzustellen, die rekonstituiert werden muss, bevor sie verabreicht werden kann. Ein Beispiel für eine solche Dosierungsform ist eine gefriergetrocknete oder lyophilisierte Formulierung.
Es kann wünschenswert sein, eine erfindungsgemäße Verbindung als parenterale freisetzungskontrollierte Dosierungsform zu verabreichen, um häufige Injektionen zu vermeiden und um die Wirksamkeit und Bequemlichkeit bzw. Zweckmäßigkeit der Therapie zu verbessern. Zahlreiche Verfahren zur Herstellung solcher Depotformulierungen sind bekannt. Eine verlängerte Freisetzung kann mittels fester Implantate, Nanopartikel, Nanokapseln, Mikropartikel, Mikrokapseln, Emulsionen, Suspensionen, öligen Lösungen, Liposomen oder ähnlichen Strukturen bereitgestellt werden.
Exzipienzien, die zur Herstellung von parenteralen Formulierungen verwendbar sind, sind Lösungsmittel, Colösungsmittel und flüssige oder halbfeste Träger, wie steriles Wasser, Ethanol, Glycerin, Propylenglycol, Polyethylenglycol, Butandiol, fette Öle, kurz- und mittelkettige Triglyceride, Lecithin, Polyoxyethylenderivate von Rizinusöl; Substanzen zum Einstellen von Osmolalität und pH, wie Zucker, insbesondere Glucose, Zuckeralkohole, insbesondere Mannit, Natriumchlorid, Natriumcarbonat, Zitronensäure, Acetat, Phosphat, Phosphorsäure, Salzsäure, Natriumhydroxid usw.; Stabilisatoren, Antioxidantien und Konservierungsmittel, wie Ascorbinsäure, Natriumsulfit oder -hydrogensulfit, EDTA, Benzylalkohol usw.; andere Exzipienzien und Lyophilisierungshilfsstoffe, wie Albumin, Dextran usw.
Alternativ können die pharmazeutischen Zusammensetzungen für die orale Verabreichung konzipiert und demgemäß bearbeitet sein. Geeignete orale Dosierungsformen umfassen Tabletten, harte Kapseln, weiche Kapseln, Pulver, Granulate, oral zerfallende Dosierungsformen, Sirupe, Tropfen, Suspensionen, Brausetabletten, kaubare Tabletten, orale Filme bzw. Folien, lyophilisierte Dosierungsformen, Dosierungsformen mit anhaltender Freisetzung und Dosierungsformen mit kontrollierter Freisetzung. In einer der bevorzugten Ausführungsformen ist die orale Dosierungsform eine magensaftresistent überzogene feste Dosierungsform, um einen Schutz der Verbindung vor der sauren und proteolytischen Umgebung des Magens bereitzustellen.
Es kann ebenfalls vorteilhaft sein, eine erfindungsgemäße Verbindung in einer transmucosalen Dosierungsform zu verabreichen. Dieser Verabreichungsweg ist nicht-invasiv und patientenfreundlich; zur gleichen Zeit kann er zu einer verbesserten Bioverfügbarkeit der Verbindung verglichen mit oraler Verabreichung führen, insbesondere falls die Verbindung in den Flüssigkeiten des Verdauungssystems nicht stabil ist oder falls sie zu groß ist, um wirksam aus dem Intestinum („gut") absorbiert zu werden. Die transmucosale Verabreichung ist zum Beispiel über nasale, bukkale, sublinguale, gingivale oder vaginale Dosierungsformen möglich. Diese Dosierungsformen können mittels bekannter Techniken hergestellt werden; sie können so formuliert sein, dass sie Nasentropfen oder Sprays, Inserts, Filme bzw. Folien, Plaster, Gele, Salben oder Tabletten darstellen. Vorzugsweise umfassen die für eine transmucosale Dosierungsform verwendeten Exzipienzien eine oder mehrere Substanzen, die für Mucoadhäsion bzw. Anhaftung an der Schleimhaut sorgen, wodurch die Kontaktzeit der Dosierungsform mit der Absorptionsstelle verlängert wird und wodurch das Ausmaß der Absorption potentiell erhöht wird.
In einer weiteren Ausführungsform werden die Verbindungen auf dem pulmonalen Weg unter Verwendung eines Dosieraerosols („metered dose inhaler"), eines Verneblers, eines Aerosolsprays oder eines Trockenpulverinhalators verabreicht. Geeignete Formulierungen können mittels bekannter Verfahren und Techniken hergestellt werden. In manchen Fällen kann auch eine transdermale, rektale oder Okulare Verabreichung machbar sein.
Es kann vorteilhaft sein, fortgeschrittene Wirkstoffabgabe- oder -targetierungsverfahren einzusetzen, um eine erfindungsgemäße Verbindung wirksamer abzugeben. Zum Beispiel kann, falls ein nicht-parenteraler Verabreichungsweg gewählt wird, eine geeignete Dosierungsform ein die Bioverfügbarkeit steigerndes Mittel enthalten, das eine Substanz oder ein Gemisch von Substanzen sein kann, welche/welches die Verfügbarkeit der Verbindung erhöht. Dies kann zum Beispiel durch Schützen der Verbindung vor einem Abbau, wie mittels eines Enzyminhibitors oder eines Antioxidans, erreicht werden. Stärker bevorzugt erhöht das Erhöhungsmittel bzw. Verstärkungsmittel die Bioverfügbarkeit der Verbindung, indem die Permeabilität der Absorptionsbarriere, welche typischerweise eine Schleimhaut ist, erhöht wird. Permeationsverstärker können über verschiedene Mechanismen wirken; einige erhöhen die Fluidität von Schleimhautmembranen, während andere die Nexen („gap junctions") zwischen Schleimhautzellen öffnen oder erweitern. Andere verringern die Viskosität des die Schleimhautzellschicht bedeckenden Schleims. Zu den bevorzugten Bioverfügbarkeitserhöhern gehören amphiphile Substanzen, wie Cholsäurederivate, Phospholipide, Ethanol, Fettsäuren, Ölsäure, Fettsäurederivate, EDTA, Carbomere, Polycarbophil und Chitosan.
Unter einem weiteren Aspekt sind Moleküle, fähig zur Bindung an die oben offenbarten Verbindungen, innerhalb des Rahmens der Erfindung. Zum Beispiel kann eine Standardhybridisierungstechnologie angewendet werden, um spezifische monoklonale Antikörper gegen eine Verbindung herzustellen. Andere Techniken sind verfügbar, um kleine Moleküle, fähig zur Bindung einer erfindungsgemäßen Verbindung, zu entwerfen bzw. zu konzipieren und herzustellen.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiterhin, sollen jedoch ihren Rahmen nicht auf die darin wiedergegebenen Ausführungsformen beschränken.
BEISPIELE
Beispiel 1
Chemische Synthese von harzgebundener Kernsequenzverbindung 9 Die Kernsequenzverbindung 9 (FmocHN-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Val-Asp(OtBu)-Val-Lys(DDE)-GABA-HMPA-Harz; siehe 1) wurde auf einem Peptidsynthesegerät vom Typ Applied Biosystems 9050 (Warrington, UK) unter Verwendung von Standard-Fmoc-Chemie synthetisiert. Kurz gesagt, wurde Tentagel S-NH₂ (Beladung 0,26 mmol/g) mit 4-Hydroxymethylphenoxyessigsäure (HMPA) als Linker bereitgestellt, was in Verbindung 8 (siehe 1) resultierte. Fmoc-GABA-OH (10 Äq.) wurde an das HMPA-Harz 8 unter der Wirkung von N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC, 5 Äq.) und 4-Dimethylaminopyridin (DMAP, 0,5 Äq.) gebunden. Alle anderen Aminosäuren, mit Schätzung der säurelabilen Seitenkette, wo nötig, wurden mittels Kupplung in Gegenwart von HOBt/TBTU/Dipea (4/4/8 Äq.) gebunden. Nach der Kupplung wurde das Harz mit DMF, Isopropanol und Diethylether gewaschen und nachfolgend getrocknet.
Beispiel 2
Synthese von Verbindung 10
Die Festphasensynthese der Verbindungsbibliothek 10 (siehe 1) wurde unter Verwendung eines Flexchem^®-Systems (Robbins Scientific, Sunnyvale, USA) durchgeführt. Nach Entfernung der N-terminalen Fmoc-Gruppe von Verbindung 9 mittels 20% Piperidin in DMF wurde das Harz gewaschen (DMF) und getrocknet. Das Harz wurde in Mengen von 10 mg über eine lösungsmittelbeständige 48-Well-Filterplatte verteilt. Nach Waschen mit DMF wurde ein Gemisch aus der gewünschten Carbonsäure (40 Äq.), BOP (20 Äq.), HOBt (20 Äq.) und NMM (100 Äq.) zugegeben (Gesamtvolumen 300 μl) und das suspendierte Harz wurde darin für 3 Stunden unter kontinuierlicher Begasung mit N₂ („perspiration with N₂") inkubiert. Nachfolgend wurde das Harz mit DMF gewaschen und dreimal für 3 Minuten mit Hydrazinmonohydrat (2% in DMF) zur Entfernung der DDE (4,4-Dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-yliden-ethyl)-Gruppe inkubiert. Nach Waschen mit DMF wurde ein Gemisch aus der zweiten Car bonsäure, BOP, HOBt und NMM (gleiche Mengen wie oben beschrieben) zugegeben und es wurde wiederum für 3 Stunden inkubiert. Derivatisierte Peptide, die nur an C-terminalen Lysin modifiziert waren (siehe HP01-HP07 hiernach), wurden mit Di-tert.-butyldicarbonat ((t-Boc)₂O; 0,25 M) und Dipea (0,125 M in NMP) vor der Umsetzung N-boculiert („N-boculated"), um die N-terminale Aminfunktion zu schützen. Nach Entfernung des Lösungsmittels wurden die Peptide mit einem Gemisch aus Trifluoressigsäure (TFA), Triisopropylsilan (TIS) und Wasser (95:2,5:2,5 V/V/V) abgespalten. Jede Probe wurde lyophilisiert und bis zur Verwendung bei –20°C gelagert.
Beispiel 3
Synthese der Verbindungen 11-13, der Verbindungsbibliothek 14 und der Verbindungen 27-33
Die derivatisierten Peptide 11-13, die Verbindungsbibliothek 14 und die derivatisierten Peptide 27-33 wurden auf die gleiche Weise wie für die Bibliothek 10 beschrieben aus der harzgebundenen Kernsequenz FmocHN-Trp(Boc)-Val-Asp(OtBu)-Val-HMPA-Harz hergestellt. Das derivatisierte Peptid 11 wurde unter Verwendung von Essigsäureanhydrid (0,25 M) und Dipea (0,125 M) in NMP acetyliert.
Beispiel 4
Kompetitiver bzw. Verdrängungsassay mit TM11-PO
Erfindungsgemäße Verbindungen, wie in den Beispielen 1, 2 und 3 hergestellt, und einige Referenzpeptidverbindungen wurden auf ihre Fähigkeit zum Inhibieren der TM11-PO-Bindung an humanes P-Selectin untersucht. TM11-PO, ein tetramerer TM11/strepPO-Komplex, für den zuvor gezeigt wurde, dass er mit hoher Affinität und Spezifität an humanes P-Selectin bindet (Molenaar et al., Blood 2002, 100, 3570–3577), wurde frisch hergestellt, indem Streptavidin-Peroxidase (Strep-PO (Amersham Life Science, Little Chalfont, Vereinigtes Königreich), 8,4 μl, 2,0 μM) und TM11-Biotin (Biotin-CDVEWVDVSSLEWDLPC (synthetisiert von Dr. Van der Zee, Department of Immunology, University of Utrecht, Utrecht, Niederlande), 1,5 μl, 190 mM) für 2 Stunden bei Raumtemperatur in Assaypuffer (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, pH 7,4) inkubiert wurden. Für kompetitive bzw. Verdrängungsstudien wurde eine 96-Well-Mikrotiterplatte (hohe Bindung, flacher Boden, Costar, Corning, USA) über Nacht bei 4°C mit 10 μg/ml Ziege-Anti-Human-IgG (Fc-spezifisch) (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, Niederlande) in Beschichtungspuffer (50 mM NaHCO₃, pH 9,6) beschichtet. Nachfolgend wurden die Wells mit Assaypuffer gewaschen und für 1 Stunde bei 37°C mit Blockierungspuffer (3% BSA in Assaypuffer) inkubiert. Nach Waschen mit Assaypuffer wurden die Wells für 2 Stunden bei 37°C mit der humanes P-Selectin-IgG-Fc-Chimäre (R&D Systems Europe Ltd., Abingdon, Vereinigtes Königreich) (0,3 μg/ml) inkubiert. Nachfolgend wurden die Wells mit Assaypuffer gewaschen und für 1 Stunde bei 4°C mit dem TM11-PO-Komplex inkubiert. Die Wells wurden sechsmal mit Waschpuffer (0,1% Tween 20 in Assaypuffer) gewaschen. 3,3',5,5'-Tetramethylbenzamidin (TMB)/Wasserstoffperoxid (H₂O₂) (Pierce, Rochford, USA) wurde zugegeben und die Wells wurden für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde mittels Zugabe von 2 M H₂SO₄ gestoppt und die Absorption wurde bei 450 nm gemessen.
Bezüglich der Ergebnisse siehe die unten stehenden Tabellen und 3. Tabelle 1: Derivatisiertes Peptid und IC₅₀ (μM)

HP14 1,02

HP16 0,31

HP17 0,45

HP61 0,19

HP62 0,28

HP63 3,40

HP65 2,35

HP60 1,10

HP06 6,00
Die derivatisierten Peptide sind mit HPij codiert, worin sich i und j auf die Acylgruppierungen R¹ und R², gebunden an den N- bzw. C-Terminus von Formel 10 (1), beziehen. Eine nicht modifizierte Aminogruppe ist durch 0 angezeigt. Die Acylgruppierungen 1 bis 7 sind in 2 gezeigt.

Die Affinität der Verbindungen wurde mittels eines Zelladhäsionsassays bestätigt, in dem chinesischer-Hamster-Ovarzellen, die humanes P-Selectin exprimieren, mit HL60-Zellen, die PSGL-1 exprimieren, in Gegenwart genau bestimmter („titered") Mengen der Verbindungen inkubiert wurden. Tabelle 2: Derivatisierte Peptide und deren IC₅₀-Werte für humanes P-Selectin, wie mittels kompetitivem ELISA bestimmt

Peptid	Sequenz	IC₅₀ (μM)^a
TM11	CDVEWVDVSSLEWDLPC	2^b
A29	EWVDV	8^b
A129	DWVDV	16^b
A130	KWVDV	28^b
A131	AWVDV	27^b
A138	WVDV	> 1000^b
11	Ac-WVDV	27
12	GA-WVDV	0,037
13	GA-EWVDV	0,031

^a Die Ergebnisse sind der Mittelwert aus wenigstens 3 Versuchen bei 8 verschiedenen Konzentrationen an Peptid, wie im kompetitiven TM11-PO-ELISA bestimmt (Materialien und Methoden).
^b Aus der nicht vorveröffentlichten europäischen Patentanmeldung 01 203 314.8 .

₅₀

^a Die Werte sind der Mittelwert aus wenigstens 3 Versuchen bei 8 verschiedenen Konzentrationen an Peptid, wie im kompetitiven TM11-PO-ELISA bestimmt (Materialien und Methoden).

Beispiel 5
Kompetitiver Assay mit PAA-Le^a-SO₃H
Um in der Lage zu sein, die Bindung von erfindungsgemäßen Verbindungen auch an anderen Mitgliedern der Selectinfamilie (d. h. E- und L-Selectin) zu untersuchen, wurde Biotin-PAA-Le^a-SO₃H (Synthesone, München, Deutschland) anstelle von TM11-PO als Ligand im kompetitiven Assay verwendet. Dieses Polyacrylamid(PAA)-basierte Polymer mit daran gebundenen Sulfo-Lewis-A-Gruppen ist ein etablierter Selectinligand.
Experimentell wurde die gleiche Vorgehensweise wie in Beispiel 1, jedoch mit den folgenden Unterschieden, verwendet. Nach Waschen mit Assaypuffer wurden die Wells 2 Stunden bei 37°C mit der humanes P-Selectin-IgG-Fc-Chimäre, Maus-P-Selectin-IgG-Fc-Chimäre, humanes L-Selectin-IgG-Fc-Chimäre bzw. der humanes E-Selectin-IgG-Fc-Chimäre (alle von R&D Systems Europe Ltd., Abingdon, Vereinigtes Königreich) (0,3 μg/ml) inkubiert. Nachfolgend wurden die Wells der Mikrotiterplatte mit Biotin-PAA-Le^a-SO₃H (0,33 μg/ml) für 2 Stunden bei 37°C statt mit dem TM11-PO-Komplex inkubiert.
Bezüglich der Ergebnisse siehe 7.
Beispiel 6
Inhibierung von dynamischen Wechselwirkungen zwischen HL60-Zellen und humanes P-Selectin-exprimierenden chinesischer-Hamster-Ovarzellen
Chinesischer-Hamster-Ovar (CHO)-Zellen, stabil transfiziert mit humanem P-Selectin (CHO-P), wurden freundlicherweise von Dr. Modderman (University of Amsterdam, Amsterdam, Niederlande) bereitgestellt. Die Zellen wurden in DMEM (BioWhittaker Europe, Verviers, Belgien), enthaltend 10% fötales Kälberserum (FCS) (BioWhittaker), 5 mM L-Glutamin, 20.000 Einheiten Penicillin/Streptomycin (BioWhittaker) und 5 mM nicht essentielle Aminosäuren (Gibco, Paisley, Vereinigtes Königreich), gezüchtet. Kolben mit Zellen wurden bei 37°C für 3 bis 4 Tage in 5% CO₂ inkubiert, bis die Zellen beinahe zur Konfluenz gewachsen waren.
HL60-Zellen stammten von der ATCC und wurden in RPMI-1640-Medium (BioWhittaker) mit 10% FCS, 5 mM L-Glutamin und 20.000 Einheiten Penicillin/Streptomycin gezüchtet.
Die HL-60-Zellen wurden fluoreszenzmarkiert, indem sie für 30 Minuten bei 37°C mit 5 μM Calcein-AM (Molecular Probes, Leiden, Niederlande) in RPMI inkubiert wurden. Diese Zellen (50.000/Well) wurden zu kultivierten P-Selectinexprimierenden CHO-Zellen (CHO-P-Zellen, kultiviert in DMEM mit 10% FCS, 5 mM nicht essentielle Aminosäuren, 5 mM L-Glutamin und 20.000 Einheiten Penicillin/Streptomycin) gegeben, in 96-Well-Platten in Gegenwart oder Abwesenheit der P-Selectin-Antagonisten inokuliert (1 h, 4°C). Nach sanftem Wa schen mit RPMI wurde die CHO-P-assoziierte Fluoreszenz gemessen (λ_exc 485/λ_em 530 nm).
Bezüglich der Ergebnisse siehe 8.

Claims

Verbindung mit Affinität zu humanem P-Selectin, welche ein Derivat eines Peptids, wiedergegeben durch die Sequenz X(A_x)_mA₃A₁A₂A₁Y, ist, worin: – A₁ D- oder L-Cystein (C) oder D- oder L-Valin (V) ist; – A₂ D- oder L-Asparaginsäure (D) ist; – A₃ D- oder L-Phenylalanin (F) oder D- oder L-Tryptophan (W) ist; – A_x eine D- oder L-Aminosäure ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Glutaminsäure (E), Asparaginsäure (D), Glycin (G) und Cystein (C); – X die N-terminale Seite der Sequenz markiert und Wasserstoff oder ein Rest, umfassend 1 bis 6 D- oder L-Aminosäuren oder Analoga davon, ist; – Y die C-terminale Seite der Sequenz markiert und -OH oder ein Rest, umfassend 1 bis 11 D- oder L-Aminosäuren oder Analoge davon, ist; worin X und Y zusammen ein cyclisches System bilden können; dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens einer von X und Y oder X + Y mit der Gruppe R¹-(Z)_n substituiert ist, worin: – Z -CO- ist und worin R¹ ausgewählt ist aus: a) einer (C₂-C₈)-Alkylgruppe, worin wenigstens ein C-Atom durch ein Stickstoffatom ersetzt ist; b) einer (C₆-C₁₄)-Arylgruppe, die mit wenigstens einer Gruppe, ausgewählt aus -OH oder -COOH, substituiert sein kann; und worin m und n ganze Zahlen sind, die unabhängig ausgewählt sind aus 0 und 1.
Verbindung nach Anspruch 1, worin A_x D- oder L-Glutaminsäure (E) oder D- oder L-Asparaginsäure darstellt.
Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, worin A₁ D- oder L-Valin (V) darstellt.
Verbindung nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin A₃ D- oder L-Tryptophan (W) ist.
Verbindung nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin Y ein Rest, umfassend D- oder L-Lysin, ist.
Verbindung nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin R¹ unsubstituiertes Phenyl oder Phenyl, substituiert mit wenigstens einem Substituenten, wie in Anspruch 1 definiert, ist.
Verbindung nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin n 0 ist und R¹ 3,4,5-Trihydroxyphenylcarbonyl oder 3,5-Dicarboxyphenylcarbonyl ist.
Verbindung nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin X keine Aminosäuren umfasst und Y D- oder L-Lysin umfasst.
Verbindung nach Anspruch 8, worin n 0 ist und R¹ 3,4,5-Trihydroxyphenylcarbonyl oder 3,5-Dicarboxyphenylcarbonyl ist.
Verbindung nach Anspruch 1, worin m 0 ist, worin Z -COist und worin Z über einen D- oder L-Glycin- oder Aminobuttersäurespacer an Y gebunden ist.
Verbindung nach einem der vorstehenden Ansprüche, umfassend eine cyclische oder gespannte bzw. beschränkte („constrained") Grundgerüststruktur.
Zusammensetzung, umfassend eine oder mehrere Verbindungen nach einem der vorstehenden Ansprüche.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach einem der vorstehenden Ansprüche, umfassend eine Reihe von Stufen, worin Aminosäuremonomere, Aminosäureoligomere oder Mono- oder Oligomere von Aminosäureanaloga oder -minetika durch chemische oder enzymatische Ligation zusammengesetzt werden und wobei die Stufen in einer flüssigen Phase und/oder an der Grenzfläche zu einer funktionalisierten festen Phase durchgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 13, umfassend die Umsetzung des HMPA-Linkers der Formel 8 (1) mittels Standard-Fmoc-Chemie, um eine Verbindung der Sequenz X(A_x)_mA₃A₁A₂A₁Y zu erhalten, worin X, A_x, A₃, A₁, A₂, Y und m wie in Anspruch 1 definiert sind und worin die Aminogruppen anfänglich durch Schutzgruppen geschützt sind und R-CO durch Ersetzen der Schutzgruppen durch Verwendung von Standardverfahren eingeführt wird.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Verwendung in der Therapie oder Diagnose.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung der Leukozytenbindung an Blutplättchen und/oder Endothelzellen.
Verwendung nach Anspruch 15 oder 16 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung, Verhinderung oder Diagnose von chronischen entzündlichen Erkrankungen, rheumatoider Arthri tis, entzündlicher Darmerkrankung, multipler Sklerose, Atherosklerose, Restenose, Ischämie, Reperfusionsschädigung einschließlich Nierenversagen, Tumormetastase, bakterieller Sepsis, disseminierter intravaskulärer Koagulation, Atemnotsyndrom bei Erwachsenen, Schlaganfall, Angiogenese, Transplantatabstoßung, Thrombose oder Kreislaufschock.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 11 und ein(en) oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Träger oder Exzipientien.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18, die für parenterale Verabreichung, vorzugsweise für intravaskuläre, intramuskuläre, subkutane oder intraläsionale Injektion formuliert und bearbeitet ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18, die für orale Verabreichung, vorzugsweise in Form einer Tablette, einer Kapsel, von Körnchen, einer magensaftresistenten festen Dosierungsform, einer festen Dosierungsform, die eine anhaltende oder kontrollierte Freisetzung bereitstellt, oder einer oral zerfallenden Dosierungsform formuliert und bearbeitet ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18, die für transmukosale Verabreichung, wie nasale, bukkale, sublinguale oder vaginale Verabreichung formuliert und bearbeitet ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18, die für pulmonale Verabreichung durch ein Dosieraerosol („metered dose inhaler"), einen Vernebler, einen Aerosolsprühdispenser oder einen Trockenpulverinhalator formuliert und bearbeitet ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 18 bis 22, ferner umfassend ein Wirkstofftargetierungsmittel und/oder ein die Bioverfügbarkeit erhöhendes Mittel.
Verfahren zur Bestimmung, ob ein Molekül eine Bindungsaffinität für P-Selectin umfasst, umfassend das Inkontaktbringen von P-Selectin mit dem Molekül und mit einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1–11 und Bestimmen, ob die Bindung der Verbindung an das P-Selectin verringert wird.
Bindemolekül, fähig zur spezifischen Bindung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1–11, umfassend einen Antikörper oder einen funktionellen Teil davon.