DE10239832A1

DE10239832A1 - Sarcolysyl-Derivate und Verfahren zu deren Herstellung

Info

Publication number: DE10239832A1
Application number: DE10239832A
Authority: DE
Inventors: Dhanapal Dr. Boopathy
Original assignee: LIPAL BIOCHEMICALS AG C O UNIV; Lipal Biochemicals AG c/o University of Zurich
Current assignee: LIPAL BIOCHEMICALS AG C O UNIV; Lipal Biochemicals AG c/o University of Zurich
Priority date: 2002-08-29
Filing date: 2002-08-29
Publication date: 2004-03-18
Also published as: WO2004024755A3; AU2003264134A1; WO2004024755A2

Abstract

Die Erfindung betrifft eine chemische Verbindung der allgemeinen Formel (I) DOLLAR F1 wobei R·1· und R·2· gleich oder verschieden sind und wobei im Falle, daß R·1· und R·2· gleich sind, R·1· und R·2· ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus substituiertem Benzoyl-, substituierten und unsubstituierten Alkyl, Aryl, Aralkyl, Sulfoxy, aliphatischen und heteroaromatischen Acyl, wobei der Grundkörper des aliphatischen Restes 1 bis 16 Kohlenstoffatome enthält, sowie einem N-substituierten Aminosäurerest, und im Falle, daß R·1· und R·2· verschieden sind, R·1· oder R·2· ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus H, substituierten Benzoyl-, substituierten und unsubstituierten Benzyl, Sulfoxy, aliphatischen und heteroaromatischen Acyl, wobei der Grundkörper des aliphatischen Acyl-Restes 1 bis 16 Kohlenstoffatome enthält, sowie einem N-substituierten Aminosäurerest, R·3· eine Aminosäure oder ein (Poly)peptid bzw. deren substituierte oder teilweise substituierte Derivate sind, sowie die physiologisch verträglichen Salze dieser Verbindungen. Weiter betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der chemischen Verbindung sowie ihre Verwendung als Medikament gegen Krebsleiden.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft m-L-Sarcolysylderivate, ein Verfahren zu deren Herstellung sowie pharmazeutische Zusammensetzungen diese Verbindungen enthaltend, insbesondere zur Behandlung von Krebsleiden.
Peptide kommen in einer Vielzahl von Variationen in der Natur vor und haben spezifische Aufgaben. Sie regulieren viele Funktionen des Metabolismus, in dem sie als chemische Neurotransmitter, Stimulatoren oder Inhibitoren wirken. Sie binden an spezifische Rezeptoren, die insbesondere zu der Oberfamilie von G-Protein gekoppelten Rezeptoren gehören. Peptide werden daher als ideale Trägermittel für diagnostische und therapeutische Anwendungen unter Verwendung von Paul Ehrlichs Konzept der „magischen Kugel" verwendet. Tumorgewebe, die Peptidrezeptoren exprimieren, können durch das spezifische Peptid, oder verschieden gelabelte Analoga erkannt werden. In Abhängigkeit von dem Label kann der Tumor visualisiert oder therapeutisch behandelt werden. Die spezifische Bindung an Rezeptoren kann dazu verwendet werden, die wichtigste Anforderung bei der Behandlung von Tumoren zu erfüllen, nämlich „das selektive Ansprechen des Neoplasmas". Peptide sind einfach synthetisierbar und können auch harten Reaktionsbedingungen in Bezug auf ihre Modifikation und ihrem Labeling standhalten. Aufgrund ihrer vergleichsweise geringen Größe, zeigen Peptide verglichen mit makromolekularen Trägermitteln, wie beispielsweise Antikörpern, hohe Ziel-zu-Hintergrund-Verhältnisse. Peptide verursachen weniger häufig immungenetische Antworten, und die Durchdringung des Krebsgewebes und ihre Aufnahme durch den Tumor erfolgen schneller.
Es ist bekannt, dass Melphalan (4-[bis(2-Chlorethyl)amino]-L-phenylalalanin), das von der Firma Glaxo-Wellcome, unter dem Handelsnamen Alkeran^® vertrieben wird, als alkylierendes Zytostatikum wirkt. m-L-Sarcolysin (oder auch kurz Sarcolysin genannt) ist ein Isomer von Melphalan, wobei die bis-(2-Chlorethyl)-aminogruppe in meta Position zur α-Aminosäuregruppe am Phenylrest substituiert ist. Wergel und Stock (Ann. Res. Br. Emp. Cancer Camp 31, 6, 1953) Larionov, et al. (The Lancet 2, 169, 1955) berichteten über eine Zunahme bei der Spezifizität von Sarcolysin für bestimmte Tumorzellen aufgrund der Substitution der Methylgruppe von Methylchlorethylamin mit Phenylalanin. Der Vergleich der drei strukturellen Isomere von bis-(2-Chlorethyl)amino-L-phenylalanin zeigte, dass das m-Isomer aktiver als das p-Isomer und weiter weniger toxisch als das o-Isomer ist. Chemotherapeutische Mittel, die aus synthetischen Peptiden zusammengesetzt sind, und eine cytotoxische Aktivität aufgrund der alkylierenden Gruppe und selektive Trägerfunktion gegenüber einer spezifischen Zielzelle aufweisen, sind bekannt (De Barbieri, A, Farmaco 38, 205 – 218, 1983).
Die Chemotherapie ist derzeit die Haupttherapie zur Behandlung von Krebsleiden. Eines der Hauptprobleme bei der klassischen Chemotherapie ist die nicht spezifische Toxizität der meisten Anti-Krebsmittel, gegenüber normalen, d.h. nicht cancerogenen Zellen. Effizientes Design von Medikamenten, die nur auf spezifische Krebszellen wirken, ist daher wünschenswert, da dies die schweren, in Abhängigkeit von der Dosis auftretenden Nebeneffekte bei der Verabreichung von Cytostatika mindern kann. Um die therapeutische Wirkung zu erhöhen, werden Systeme zur Medikamentenfreisetzung benötigt, die selektiv die anti-neoplastischen Mittel zum Tumor transportieren. Die chemische Kopplung von cytotoxischen Medikamenten an Peptide ist daher ein weiterer Zugang, um die Selektivität gegenüber Tumorzellen zu erhöhen.
Aus der WO 01/96367 A1 sind Melphalan enthaltende Di- bzw. Tripeptide bekannt, die als alkylierende chemotherapeutische Krebsmedikamente verwendet werden können. Insbesondere können diese neuen Verbindungen die Resistenz vieler Säugetierzellen gegenüber Melphalan überwinden. Diese Verbindungen weisen gegenüber reinem Sarcolysin geringere Toxizität und eine höhere Aktivität auf und konnten für ein weites Spektrum von Tumorarten eingesetzt werden.
So ist beispielsweise weiter aus der WO 99-2177 bekannt, dass ein Proteinkomplex aus 6 Peptiden, die jeweils m-L-Sarcolysin als Baustein enthalten, unter dem Namen „Peptichemio" für die Chemotherapie gegen Krebs eingesetzt wird. Es wurde gefunden, dass dieses Produkt eine cytostatische Wirkung hat, und sowohl für die Myelom- als auch für die Melanomtherapie eingesetzt werden kann. Diese Kombination aus 6 Peptiden ist weniger toxisch gegenüber menschlichen Lymphoplasten, als m-L-Sarcolysin alleine. Außerdem wurde zusätzlich zu der verminderten Toxizität von Peptichemio im Vergleich zu m-L-Sarcolysin eine geringere DNA-Vernetzung festgestellt. Es wurde jedoch ebenfalls eine erhöhte Cytotoxizität von Peptichemio gegenüber menschlichen Melanomzellinien verglichen mit m-L-Sarcolysin festgestellt.
Nachteilig bei dem Verfahren zur Herstellung dieser Kombination von 6 Peptiden sind die geringen Ausbeuten, die geringere erzielte Reinheit der Produkte sowie die umständlichen Synthesewege. Darüber hinaus ist die Toxizität von "Peptichemio" gegenüber menschlichen Lymphoplasten immer noch zu hoch, um gefahrlos eingesetzt werden zu können.
Daher war es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Verbindungen zur Verfügung zu stellen, die eine geringe Toxizität gegenüber gesunden Zellen mit einem einfachen Syntheseweg mit hoher Ausbeute vereinen.
Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I) gelöst:
wobei
R¹ und R² gleich oder verschieden sind,
wobei im Falle, daß R¹ und R² gleich sind, R¹ und R² ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, substituiertem Benzoyl-, substituierten und unsubstituierten Alkyl, Aryl, Aralkyl, Sulfoxy, aliphatischen und heteroaromatischen Acyl, wobei der Grundkörper des aliphatischen Restes 1 bis 16 Kohlenstoffatome enthält, sowie einem N-substituierten Aminosäurerest, oder dass NR₁R₂ ein Carbamat, Hydrazin, Hydrazon-, Hydroxam- und Harnsäurederivat ist.
und im Falle, daß R¹ und R² verschieden sind, R¹ oder R² ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, substituiertem Benzoyl-, substituierten und unsubstituierten Benzyl, Sulfoxyl, aliphatischen und heteroaromatischen Acyl, wobei der Grundkörper des aliphatischen Acyl-Restes 1 bis 16 Kohlenstoffatome enthält, sowie einem N-substituierten Aminosäurerest, oder dass NR₁R₂ ein Carbamat, Hydrazin, Hydrazon-, Hydroxam- und Harnsäurederivat ist.
R³ eine Aminosäure oder ein (Poly)peptid bzw. deren substituierte oder teilweise substituierten Derivate ist, sowie die physiologisch verträglichen Salze dieser Verbindungen, beispielsweise die Hydrochloride, Hydrobromide, Acetate, Tartrate, ohne dass diese Aufzählung als abschließend verstanden werden soll. Es versteht sich, dass auch am aromatischen Ring des Sarcolysyl-Grundkörpers substituierte Derivate, die über einfache, dem Fachmann an sich bekannte Synthesen hergestellt werden können, in den Offenbarungsgehalt der Erfindung fallen.
Verbindungen der allgemeinen Formel (I) weisen gegenüber gesunden Säugetierzellen eine äußerst geringe Toxizität auf, so dass sie auch in größeren Dosierungen verabreicht werden können.
Weitere, nicht beschränkende Beispiele für erfindungsgemäße Substituenten R₁ bzw. R₂ sind in der nachstehenden Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1: Beispiele für die Substituenten R₁ und R₂
Weiter wird die Aufgabe der vorliegenden Erfindung durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung der chemischen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) gelöst, wobei das Verfahren den folgenden Schritt umfasst: Reaktion eines (Poly)peptids der allgemeinen Formel m-L-Sarcolysyl-(Polypeptid) mit einer Verbindung umfassend eine Carbonsäure, ein Carbonsäurederivat, eine Nsubstituierte Aminosäure, eine Sulfonsäure, ein Sulfonsäurederivat, einem Alkyl-, Aryloder Aralkylhalogenid.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht durch den Einsatz einfacher Ausgangsmaterialien in einer Synthese in wenigen Schritten, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen in hoher Ausbeute von im Allgemeinen mehr als 95% erhalten werden können. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens aufgrund der verwendeten, in den Beispielen aufgeführten Lösungsmittel einfach umkristallisierbar und damit besonders einfach zu reinigen.
Bevorzugt wird im Falle der Reaktion des (Poly)peptids mit einer Carbonsäure, einer Nsubstituierten Aminosäure oder einer Sulfonsäure ein Aktivierungsmittel vor der Reaktion zugegeben. Damit wird ermöglicht, dass die Reaktion besonders schnell und besonders vollständig ablaufen kann, so dass die Gesamtausbeute auch dadurch beträchtlich erhöht werden kann.
Weiter vorteilhaft ist die Durchführung der Reaktion in einem wasserfreien Lösungsmittel, so dass eine eventuelle Spaltung von hydrolyseempfindlichen Bindungen innerhalb der verwendeten Ausgangsverbindungen nicht auftritt und auch damit die Gefahr von unerwünschten Nebenreaktionen, Nebenprodukten oder einer geringeren Ausbeute weitgehend vermieden wird. Wasserfreie Lösungsmittel umfassen bevorzugt beispielsweise DMF, DCM, MTBE, DIPEA und Mischungen davon. Damit verbunden ist auch eine hohe Ausbeute im Vergleich zu bislang bekannten Syntheseverfahren bei der Reaktion von Synthonen mit gleichen oder ähnlichen funktionellen Gruppen.
Selbstverständlich kann dieses Verfahren vorteilhafterweise auch als parallelisiertes Verfahren zur simultanen Herstellung vieler verschiedener erfindungsgemäßer Verbindungen verwendet werden. Zudem lässt es sich über die Anwendung der Synthese an der Festphase problemlos für die parallele Herstellung einer großen Anzahl erfindungsgemäßer Verbindungen verwenden.
Verbindungen der allgemeinen Formel (I) werden bevorzugt in pharmazeutischen Formulierungen zur Verwendung als Medikament eingesetzt. In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform umfasst dabei die pharmazeutische Formulierung ebenfalls weitere pharmakologisch aktive Wirkstoffe, die mit den pharmazeutisch aktiven Verbindungen der allgemeinen Formel (I) synergistisch wirken können. Dies sind insbesondere an sich bekannte Anti-Tumor-Mittel für die Chemotherapie.
Bevorzugt werden erfindungsgemäße Verbindungen der allgemeinen Formel (I) allein oder in pharmazeutischen Formulierungen zur Behandlung von Tumoren eingesetzt. Verbindungen der allgemeinen Formel (I) weisen eine erhöhte Zytotoxizität auf und können gegenüber einer Vielzahl von Tumoren eingesetzt werden, beispielsweise gegen Leukämie, maligne Lymphome, Hodenkrebs, Brustkrebs, Eierstockkrebs, Dickdarmkrebs, Wilms-Tumore und Melanome.
Selbstverständlich ist es auch möglich, dass in der Formulierung allgemein übliche flüssige oder feste Excipienten, Verdünnungsmittel und dergleichen vorhanden sind. Dies hängt jedoch von der gewählten Verabreichungsform ab.
Bevorzugt werden pharmazeutische Formulierungen umfassend eine erfindungsgemäße Verbindung der allgemeinen Formel (I) intravenös in wässriger Lösung, bzw. in einer Flüssigkeit injiziert. Jedoch sind auch andere Verabreichungsformen möglich, wie beispielsweise oral, parenteral, rektal usw. Dies hängt jedoch insbesondere von dem zu behandelnden Tumor, vom Patienten, vom Verlauf der Krankheit und dergleicheriab.
Die geeignete Verabreichungsform wird im Einzelfall vom Urteil eines Mediziners abhängen.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand einiger nicht einschränkender Ausführungs- beispiele erläutert.
Ausführungsbeispiele
Definitionen:
Unter dem Begriff „Aminosäure" werden sowohl die natürlich vorkommenden α-Aminosäuren Ala = L-Alanin, Arg = L-Arginin, Asn = L-Asparagin, Asp = L-Aspartamsäure, Cys = L-Cysteine, Glu = L-Glutamatsäure, Gln = L-Glutamin, Gly = Glycin, His = L-Histidin, Ile = L-Isoleucin, Leu = L-Leucin, Lys = L-Lysin, Met = L-Methionin, Phe = L-Phenylalanin, Pro = L-Prolin, Ser = L-Serin, Thr = L-Threonin, Trp = L-Tryptophan, Tyr = L-Tyrosin, Val = L-Valin als auch deren substituierte Derivate, sowie sämtliche α-Aminocarbonsäurederivate verstanden. Insbesondere umfassen derartige α-Aminocarbonsäuren, die ebenfalls im Rahmen der Erfindung verwendet werden können: C₄al = L-3-Cyclobutylalanin, C₅al = L-3-Cyclopentylalanin, C₆al = L-3-Cyclohexylalanin, AIle = L-Alloisoleucine, Nal = L-3-(1-Naphthylalanin), Nle = L-Norleucin, Nva = L-Norvalin, Orn = L-Ornithin, Orn(CHO) = N⁵-Formyl-L-ornithin, L-Phg=L-Phenylglycin, Tza = L-3-(2-Thiazolyl)alanin, wobei diese Auswahl nicht als beschränkend verstanden werden soll.
Abkürzungen:
Die vor- und nachstehend verwendeten Abkürzungen bedeuten folgendes:
D Tag (day)
HSD Höchste lösliche Dosis (Highest soluble dose)
MBWC Änderung des durchschnittlichen Körpergewichts (Mean Body Weight Change)
MPH Melphalan
MTD Maximal tolerierte Dosis
S Signifikant
SD Standardabweichung (Standard Deviation)
SPF Spezifisch Pathogen Frei
Z Benzyloxycarbonyl
Boc tert.-Butyloxycarbonyl
(Boc)₂O di-tert.-Butyldicarbonat
Fmoc 9-Fluorenylmethoxycarbonyl
Alloc Allyloxycarbonyl
Teoc Trimethylsilylethoxycarbonyl
Tcc Trichlorethoxycarbonyl
Nps o-Nitrophenylsulfonyl
Trt Triphenylmethyl (oder Trityl)
DIPEA N, N-Diisopropylethylamin
HOBt N-Hydroxybenzotriazol
TBTU 2-(1H-Benzotriazol-l-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborat
HBTU 2-(1H-Benzotriazol-l-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphat
DCM Dichlormethan
DMF Dimethylformamid
MTBE Methyl-tert-butylether
Soweit nicht anders angegeben wurden die verwendeten Reagenzien von den Firmen Fluka AG, Buchs, Bachem AG, Senn Chemicals AG (alle Schweiz) bezogen.
Ausführungsbeispiel 1
Synthese von 3-{3-[Bis-(2-chlorethyl)-amino]phenyl}-2-tert-butoxycarbonylaminopropionsäure (Boc-m-L-Sarcolysin, AG 808)
In einem 100 ml Reaktionskolben wurde m-L-Sarcolysin (8.22 g, 27 mmol, hergestellt nach der Vorschrift in Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Vol. 5, pp. 2985-2988, (1995)) in DMF/H₂O (150 ml/20 ml) suspendiert und unter Erwärmen mit dem Fön langsam gelöst. Beim anschließenden Abkühlen auf Raumtemperatur bleibt Sarcolysin in Lösung. Zu dieser Lösung wurde DIPEA (13.9 ml, 81 mmol) sowie (Boc)₂O (6.54 g, 30 mmol, gelöst in 20 ml DMF) zugefügt, wobei sich das Reaktionsgemisch leicht trübte. Der pH-Wert betrug 10-11. Anschließend wurde bei Raumtemperatur 10-15 Stunden gerührt. Der Reaktionsverlauf wurde mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) verfolgt (Dichlormethan : Methanol 10 : 1) bis zum völligen Verschwinden des Ausgangsmaterials. Nach Vervollständigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit 1 M HCl angesäuert, mit EtOAc extrahiert, mit Wasser gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Nach Filtration und dem Abziehen des Lösungsmittels wurde das Rohprodukt erhalten, das über Silicagel-Chromatographie unter Verwendung eines Dichlormethan : Methanol Gradienten im Verhältnis von 20 : 1 zu 10 : 1 gereinigt wurde. Die Fraktion, die das Produkt enthielt, wurde eingedampft, um 9.12 g eines leicht gelbgefärbten reinen Produkts in einer Reinheit von > 95% zu ergeben. Ausbeute: 9.12 g (84%), Reinheit: > 95% über HPLC, Summenformel: C₁₈H₂₆N₂O₄Cl₂, Molekulargewicht: 404 g/mol.
Ausführungsbeispiel 2
Synthese des Dipeptides 2-(2-Amino-3-{3-[bis-(2-chlorethyl)-amino)phenyl}propionylamino)-3-(4-fluorophenyl)-propionsäureethylester H-m-Sarcolysyl-Phe(4F)-OEt, MD703)
In einem 750 ml Reaktionskolben wurden Boc-m-L-Sarcolysin (41.g, 0.101 mol) in 400 ml trockenem Dichlormethan gelöst. Dann wurde p-Fluorphenylalaninethylester (21 g, 0.101 mol) zugegeben. Zu dieser Suspension wurde DIPEA (34.5 ml, 0.202 mol) zugefügt und in einem Eisbad während 10 Minuten gerührt. DCC (20.8 g, 0.10 mol) wurde in DMF (30 ml) gelöst und zu der Reaktionsmischung zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und wurde während vier Stunden gerührt. Der Reaktionsverlauf wurde mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) verfolgt (Dichlormethan : Methanol 10 : 1). Nach Vervollständigung der Reaktion wurde das Nebenprodukt Dicyclohexylharnstoff vom Reaktionsgemisch abfiltriert und das Gemisch 10 Stunden bei Raumtemperatur weiter gerührt. Es wurde mit 1 M HCl angesäuert (pH 3-4), mit EtOAc extrahiert, mit Wasser gewaschen und über MgSO, getrocknet und in warmem Ethanol umkristallisiert. Ausbeute: 55.7 g (92%).
Boc-m-L-Sarcolysyl-Phe(4F)-OEt-t (50 g, 0.084 mol) wurde in Ethanol mit einem Gehalt von 43% HCl (300 ml) 10 min über einem Eisbad, dann 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Eindampfen wurde das Reaktionsgemisch mit 1 M NaHCO₃ (pH 7-8), anschließend mit EtOAc extrahiert, mit Wasser gewaschen, schließlich über MgSO₄ getrocknet und in warmem Ethylacetat/Diethylether (1:1) umkristallisiert.
Ausbeute: 39.7 g (0.79 mol, 78%), Reinheit: > 90% über HPLC, Summenformel: C₂₄H₃N₃O₃Cl₂F, Molekulargewicht: 497.4 g/mol.
Ausführungsbeispiel 3
Synthese von 2-[3-{3-[3-Chlor-1-(2-chlor-ethyl)-propyl]-phenyl}-2-(toluo'-4-sulfonylamino)-3-(4-fluro-phenylamin)-propionsäureethylester (MTA-5)
In einem 10 ml Reaktionskolben wurden 4 ml trockenes DCM zu dem Dipeptid (H-m-Sarcolysyl-Phe(4F)-OEt; 300 mg, 0.6 mmol) zugeben. Zu dieser Suspension wurde DIPEA (257 μl) zugefügt und in einem Eisbad während 10 Minuten gerührt. 4-Toluolsulfonylchlorid (Fluka Nr. 89730, 126 mg) wurde zu der Reaktionsmischung zugefügt. Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und während zwei Stunden gerührt. Der Reaktionsverlauf wurde mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) verfolgt (EtOAc : Hexan 1 : 1). Nach Vervollständigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit 1 M HCl angesäuert, mit EtOAc extrahiert, mit Wasser gewaschen und über MgSO, getrocknet. Nach Filtration und dem Abziehen des Lösungsmittels wurde das Rohprodukt erhalten, das über Silicagel-Chromatographie unter Verwendung eines Hexan : EtOAc Gradienten im Verhältnis von 4 : 1 zu 2 : 1 gereinigt wurde. Die Fraktion, die das Produkt enthielt wurde eingedampft, um 108 mg eines leicht gelbgefärbten reinen Produkts in einer Reinheit von 95% zu ergeben. Ausbeute: 108 mg (28%), Reinheit:. 95 % über HPLC, Summenformel: C₃₂H₃₇N₂O₅FCl₂S, Molekulargewicht: 651,8 g/mol
Ausführungsbeispiel 4
Synthese von 1-{2-[{3-[Bis-(2-chlorethyl)-amino]-benzyl}-(2-chlorbenzoyl)-amino]acetyl}-pyrrolidin-2-carbonsäureethylester (MTA-1)
In einem 10 ml Reaktionskolben wurden 4 ml trockenes DCM zu dem Dipeptid (H-m-Sarcolysyl-Pro-OEt) (600 mg, 1,40. mmol) zugegeben. Zu dieser Suspension wurde DIPEA (720 μl) zugefügt und in einem Eisbad während 10 Minuten gerührt. 2-Chlorbenzoylchlorid (Fluka Nr. 23730, 196 μl) wurde zu der Reaktionsmischung zugetropft. Die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur erwärmt und während zwei Stunden gerührt. Der Reaktionsverlauf wurde mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) verfolgt (EtOAc : Hexan 3 : 1). Nach Vervollständigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit 1 M HCl angesäuert, mit EtOAc extrahiert, mit Wasser gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Nach Filtration und dem Abziehen des Lösungsmittels wurde das Rohprodukt erhalten, das über Silicagel-Chromatographie unter Verwendung eines Hexan : EtOAc Gradienten im Verhältnis von 4 : 1 zu 2 : 1 gereinigt wurde. Die Fraktion, die das Produkt enthielt wurde eingedampft, um 250 mg eines öligen Produkts in einer Reinheit von 90% zu ergeben. Ausbeute: 250 mg, Reinheit: 90% über HPLC, Summenformel: C₂₇H₃₂N₃O₄Cl₃, Molekulargewicht: 567,34 g/mol.
Ausführungsbeispiel 5
Synthese von 2-[2-(2-Amino-3-{3-[bis-(2-chlorethyl)-amino]-phenyl}-propionylamino)-3-(3-hydroxyphenyl)-propionylamino]-4-methyl-pentansäure (MD 735)
In einem 25 ml Reaktionskolben wurden 4 ml trockenes DCM zu dem Dipeptid, (H-Tyr(Bzl)-Leu-Bzl ester) (Senn Chemicals, 500 mg, 1.09. mmol) zugefügt. Zu dieser Suspension wurde DIPEA (257 μ1) zugefügt und in einem Eisbad während 10 Minuten gerührt. Boc-m-Sarcolysin (404 mg, 1.09 mmol), HOBt (147 mg, 1.09 mmol) und HBTU (413 mg, 1.09 mmol) wurden in DMF (10 ml) gelöst und zu der Reaktionsmischung zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und wurde während vier Stunden gerührt. Der Reaktionsverlauf wurde mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) verfolgt (EtOAc:Hexan 1:1). Nach Vervollständigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit 1 M HCl angesäuert, mit EtOAc extrahiert, mit Wasser gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Nach Filtration und dem Abziehen des Lösungsmittels wurde das Rohprodukt erhalten, das über Silicagel-Chromatographie unter Verwendung eines Hexan : EtOAc Gradienten im Verhältnis von 4 : 1 zu 2 : 1 gereinigt wurde. Die Fraktion, die das Produkt enthielt, wurde eingedampft, um 740 mg (80%) eines reinen Produkts in einer Reinheit von 88% zu ergeben. Das Produkt (100 mg) wurde anschließend in Ethanol mit einem Gehalt von 43% HCl (10 ml) 10 Stunden bei weißen Produkts in einer Reinheit von 92% zu ergeben. Ausbeute: 56 mg (81%), Reinheit: 92% über HPLC, Summenformel: C₂₈H₃₈N₄O₅Cl₂, Molekulargewicht: 580 g/mol.
Ausführungsbeispiel 6
Synthese von 2-(2-{2-(2-Amino-3-{3-{bis-(2-chlorethyl)-amino]-phenyl}-propionyl)pyrrolidin-2-carbonyl]-amino}-3-phenyl-propionylamino)-3-(4-fluorphenyl)propionsäureethylester (MTA-3)
In einem 10 ml Reaktionskolben wurden 2 ml trockenes DMF zu dem Tripeptidethylester (Pro-Phe-Phe(F)-OEt, 105 mg, 0.23 mmol) in einem zugegeben. Zu dieser Suspension wurde DIPEA (70 μl) zugefügt und in einem Eisbad während 10 Minuten gerührt. Boc-m-Sarcolysin (93 mg, 0.23mmol) und HBTU (87 mg, 0.23 mmol) wurden in DMF (2ml) gelöst und zu der Reaktionsmischung zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und wurde während vier Stunden gerührt. Der Reaktionsverlauf wurde mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) verfolgt (EtOAc:Hexan 1:1). Nach Vervollständigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit 1 M HCl angesäuert, mit EtOAc extrahiert, mit Wasser gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Nach Filtration und dem Abziehen des Lösungsmittels wurde das Rohprodukt erhalten, das über Silicagel-Chromatographie unter Verwendung eines Hexan : EtOAc Gradienten im Verhältnis von 4 1 zu 2 : 1 gereinigt wurde. Die Fraktion, die das Produkt enthielt, wurde eingedampft, um 165 mg eines reinen Produkts in einer Reinheit von 95% zu ergeben. Das Produkt wurde anschließend in Ethanol mit einem Gehalt von 43% HCl (10 ml) 10 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, um das freie Tetrapeptid zu ergeben. Ausbeute: 120 mg (34%), Reinheit: > 90%o über HPLC, Summenformel: C₃₈H₄₆N₅O₅Cl₂F Molekulargewicht: 742,2 g/mol.
Ausführungsbeispiel 7
Synthese von 2-{3-{-[Bis-(2-Chlorethyl)-amino]-phenyl}-2-[(1-phenyl-5-thiophen-3-yl1H-pyrazole-3-carbonyl)-amino]propionylamino}-3-(4-fluoro-phenyl)propionsäureethylester (MTA-2)
In einem 10 ml Reaktionskolben wurden 4 ml trockenes DCM zu dem Dipeptidethylester (H-m-Sarcolysyl-Phe(4F)-OEt, 300 mg, 0.6 mmol zugefügt. Zu dieser Suspension wurde DIPEA (282 μl) zugefügt und in einem Eisbad während 10 Minuten gerührt. 1-Phenyl-5-thiophen-3-yl-1H-pyrazol-3-carbonsäure (synthetisiert nach G. Coispeau, J. Elguero und F. Jaquier, Bull. Soc. Chim. France (1970), p. 689 und A. Chucholowski et al., Chimia Vol. 50, p. 530 (1996)) (162 mg, 0.6mmol), HBTU (228 mg, 0.6 mmol), und HOBt (81 mg, 0.6 mmol) wurden in DMF gelöst und zu der Reaktionsmischung zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und während vier Stunden gerührt. Anschließend wurde wieder DIPEA (200 μl) zugegeben. Der Reaktionsverlauf wurde mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) verfolgt (EtOAc : Hexan 1 : 1). Nach Vervollständigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit 1 M HCl angesäuert, mit EtOAc extrahiert, mit Wasser gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Nach Filtration und dem Abziehen des Lösungsmittels wurde das Rohprodukt erhalten, das mittels Silicagel-Chromatographie unter Verwendung eines Hexan : EtOAc Gradienten im Verhältnis von 4 : 1 zu 2 : 1 gereinigt wurde. Die Fraktion, die das Produkt enthielt wurde eingedampft, um 120 mg des Produkts in einer Reinheit von 95% zu ergeben. Ausbeute: 120mg (34%), Reinheit: > 95% mittels HPLC, Summenformel: C₂₉H₃₀N₄O₃Cl₂SF, Molekulargewicht: 750.7 g/mol
Ausführungsbeispiel 8
Synthese von 3-{3-[bis-(2-Chlorethyl(-amino]-phenyl}-2-[(1-phenyl-5-thiophen-3-yl-1Hpyrazol-3-carbonyl)-amino]-propionsäureethylester (MTA-4)
In einem 10 ml Reaktionskolben wurden 2 ml trockenes DCM zu m-L-Sarcolysylethylester HCl (205 mg, 0.55mmol) zugegeben. Zu dieser Suspension wurde DIPEA (374 μl) zugefügt und in einem Eisbad während 10 Minuten gerührt. 1-Phenyl-5-thiophen-3-yl-1Hpyrazole-3-carbonsäure (synthetisiert nach G. Coispeau, J. Elguero und F. Jaquier, Bull. Soc. Chim. France (1970), p. 689 und A. Chucholowski et al., Chimia Vol. 50, p. 530 (1996); 150 mg, 0.55 mmol), HBTU (209mg, 0.55 mmol), HOBt (74 mg, 0.55 mmol) wurden in DMF (4ml) gelöst und zu der Reaktionsmischung zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und während vier Stunden gerührt. Anschließend wurde wieder DIPEA (100 μl) zugegeben. Der Reaktionsverlauf wurde mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) verfolgt (EtOAc : Hexan 1 : 1). Nach Vervollständigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit 1 M HCl angesäuert, mit EtOAc extrahiert, mit Wasser gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Nach Filtration und dem Abziehen des Lösungsmittels wurde das Rohprodukt erhalten, das über Silicagel-Chromatographie unter Verwendung eines Hexan : EtOAc Gradienten im Verhältnis von 4 1 zu 2 : 1 gereinigt wurde. Die Fraktion, die das Produkt enthielt wurde eingedampft, um 108 mg des Produkts in einer Reinheit von 97% zu ergeben. Ausbeute: 108 mg (34%), Reinheit: > 97% mittels HPLC, Summenformel: C₂₉H₃₀N₄O₃Cl₂SF, Molekulargewicht: 585.5 g/mol.
Ausführungsbeispiel 9
Synthese von 2-Fluoro-benzoyl-L-m-[di-2-chlorethyl)amino]-L-phenylalanyl-p-fluoro-L- phenylalaninethylester (MD 812)
In einem 10 ml Reaktionskolben wurden 3 ml trockenes DCM zu dem Dipeptid (H-m-Sarcolysyl-Phe(4F)-OEt; 300 mg, 0.5 mmol) gegeben. Zu dieser Suspension wurde DIPEA (257 μl) zugefügt und in einem Eisbad während 10 Minuten gerührt. 2-Fluorbenzoylchlorid (Fluka Nr. 46740, 60μl) wurde zu der Reaktionsmischung zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und während zwei Stunden gerührt. Der Reaktionsverlauf wurde mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) verfolgt (EtOAc : Hexan 1 : 1). Nach Vervollständigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit 1 M HCl angesäuert, mit EtOAc extrahiert, mit Wasser gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Nach Filtration und dem Abziehen des Lösungsmittels wurde das Rohprodukt erhalten, das über Silicagel-Chromatographie unter Verwendung eines Hexan : EtOAc Gradienten im Verhältnis von 4 : 1 zu 2 : 1 gereinigt wurde. Die Fraktion, die das Produkt enthielt wurde eingedampft, um 120 mg des reinen Produkts in einer Reinheit von 92% zu ergeben. Ausbeute: 120 mg (38%), Reinheit: > 92% bei HPLC, Summenformel: C₃₁H₃₃N₃O₄Cl₂F₂ , Molekulargewicht: 620.5 g/mol.
Ausführungsbeispiel 10
Synthese von 2-Chlorbenzoyl-L-m-[di-2-chlorethyl)amino]-L-phenylalanyl-p-fluoro-Lphenylalaninethylester (MD 818)
In einem 10 ml Reaktionskolben wurden 3 ml trockenes DCM zu dem Dipeptid (H-m-Sarcolysyl-Phe(4F)-OEt; 300 mg, 0.6 mmol) gegeben. Zu dieser Suspension wurde DIPEA (257 μl) zugefügt und in einem Eisbad während 10 Minuten gerührt. 2-Chlorbenzoylchlorid (Fluka Nr. 23730, 58 μl) wurde zu der Reaktionsmischung zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und während zwei Stunden gerührt. Der Reaktionsverlauf wurde mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) verfolgt (EtOAc:Hexan 1:1). Nach Vervollständigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit 1 M HCl angesäuert, mit EtOAc extrahiert, mit Wasser gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Nach Filtration und dem Abziehen des Lösungsmittels wurde das Rohprodukt erhalten, das über Silicagel-Chromatographie unter Verwendung eines Hexan : EtOAc Gradienten im Verhältnis von 4 : 1 zu 2 : 1 gereinigt wurde. Die Fraktion, die das Produkt enthielt wurde eingedampft, um 145 mg des reinen Produkts in einer Reinheit von 97%o zu ergeben. Ausbeute: 145 mg (38%), Reinheit: > 97% über HPLC, Summenformel: C₃₁H₃₃N₃O₄Cl₃F, Molekulargewicht: 636.9 g/mol.
Ausführungsbeispiel 11
Synthese von 2-{3-{-[Bis-(2-chlorethyl)-amino]-phenyl}-2-[(3H-1-δ-4-thiophene-3-carbonyl)-amino]-propionylamino}-3-(4-fluoro-phenyl) propionsäureethylester (MD 814)
In einem 10 ml Reaktionskolben wurden 3 ml trockenes DCM zu dem Dipeptid (H-m-Sarcolysyl-Phe(4F)-OEt; 300 mg, 0.5 mmol) gegeben. Zu dieser Suspension wurde DIPEA (257 μl) zugefügt und in einem Eisbad während 10 Minuten gerührt. Thiophen-2-acetylchlorid (Fluka Nr. 88973, 81 μl) wurde zu der Reaktionsmischung zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und während zwei Stunden gerührt. Der Reaktionsverlauf wurde mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) verfolgt (EtOAc : Hexan 1 : 1). Nach Vervollständigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit 1 M HCl angesäuert, mit EtOAc extrahiert, mit Wasser gewaschen und über MgSO₄. getrocknet. Nach Filtration und dem Abziehen des Lösungsmittels wurde das Rohprodukt erhalten, das über Silicagel-Chromatographie unter Verwendung eines Hexan : EtOAc Gradienten im Verhältnis von 4 : 1 zu 2 : 1 gereinigt wurde. Die Fraktion, die das Produkt enthielt wurde eingedampft, um 138 mg des reinen Produkts in einer Reinheit von 97% zu ergeben. Ausbeute: 138 mg (38%), Reinheit: > 97% über HPLC, Summenformel: C₃₀H₃₄N₃O₄Cl₂FS, Molekulargewicht: 623 g/mol.
Ausführungsbeispiel 12
Synthese von 3-{[Bis-(2-chlorethyl)-amino]phenyl}-2-{3-(4N-imidazol-4-yl)-2-[(5-oxopyrrolidine-2-carbonyl)-amino]-propionylamino}-propionsäureethylester (MK222-3)
In einem 10 ml Reaktionskolben wurden 2 ml trockenes DCM zu dem m-L-Sarcolysylethylester (100 mg, 0.233mmol) gegeben. Zu dieser Suspension wurde DIPEA (118 mg) zugefügt und in einem Eisbad während 10 Minuten gerührt. Z-Pyr-His-OH (Senn Chemicals, 86 mg, 0.233 mmol), TBTU (75 mg, 0.233 mmol), wurden in DMF (4ml) gelöst und zu der Reaktionsmischung zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und während fünf Stunden gerührt. Anschließend wurde erneut DIPEA (100 μl ) zugegeben. Der Reaktionsverlauf wurde mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) verfolgt (EtOAc : Hexan 1 : 1). Nach Vervollständigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit 1 M HCl angesäuert, mit EtOAc extrahiert, mit Wasser gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Nach Filtration und dem Abziehen des Lösungsmittels wurde das Rohprodukt erhalten, das über Silicagel-Chromatographie unter Verwendung eines Hexan : EtOAc Gradienten im Verhältnis von 4 : 1 zu 2 : 1 gereinigt wurde. Die Fraktion, die das Produkt enthielt wurde eingedampft, um 55 mg des reinen Produkts in einer Reinheit von 97% zu ergeben. Das leicht gelbliche Produkt wurde mit 5% Pd/C in Ethanol mit 1% HCl hydriert und ergab das gewünschte Produkt. Ausbeute: 40 mg, Reinheit: > 95% by HPLC, Summenformel: C₂₆H₃₄Cl₂N₆O₅, Molekulargewicht: 580.5 g/mol.
Ausführungsbeispiel 13
Synthese von 2-Nitrophenyl-furoyl-L-m-[di-2-chlorethyl)amino]-L-phenylalanylethylester (MK220-2)
In einem 10 ml Reaktionskolben wurden 2 ml trockenes DCM zu m-L-Sarcolysylethylester (110 mg, 0.298 mmol) gegeben. Zu dieser Suspension wurde DIPEA (154 μl) zugefügt und in einem Eisbad während 10 Minuten gerührt. 2-Nitrophenyl-furoylchlorid (75mg, 0.298 mmol) wurde zu der Reaktionsmischung zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur erwärmt lassen und während zwei Stunden gerührt. Der Reaktionsverlauf wurde mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) verfolgt (EtOAc:Hexan 1:1). Nach Vervollständigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit 1 M HCl angesäuert, mit EtOAc extrahiert, mit Wasser gewaschen und über MgSO₄. getrocknet. Nach Filtration und dem Abziehen des Lösungsmittels wurde das Rohprodukt erhalten, das über Silicagel-Chromatographie unter Verwendung eines Hexan : EtOAc Gradienten im Verhältnis von 4 : 1 zu 2 : 1 gereinigt wurde. Die Fraktion, die das Produkt enthielt wurde eingedampft, um 54 mg des reinen Produkts in einer Reinheit von 94% zu ergeben. Ausbeute: 54 mg (77%), Reinheit: > 94% über HPLC, Summenformel: C₂₆H₂₇N₃O₆Cl₂ , Molekulargewicht: 548.43 g/mol.
Ausführungsbeispiel 14
Synthese von 2-(3-{3-Bis-(2-Chlorethyl)-amino]-phenyl}-2-hexadecanoylaminopropionylamino)-3-(4-fluoro-phenyl) propionsäureethylester (MK 245):
Verwendete Reagenzien:
H-m-Sarcolysyl-Phe(4F)-OEt (I): 0,2 mmol 100 mg, Palmitoyl-Osu (II): 0,2 mmol 71 mg, K₂CO₃ (III) : 0,6 mmol 83 mg, DMF: 3 ml.
In einem trockenen Reaktionskolben werden 100 mg (I) und 71 mg (II) in 3 ml DMF bei Raumtemperatur gelöst. Nach Zugabe von 83 mg (III), wurde der Reaktionskolben unter Stickstoff verschlossen und bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Nach Extraktion mit H₂O und MTBE, wurde die organische Phase über MgSO₄ getrocknet und das Lösungsmittel abgezogen. Die Aufreinigung erfolgte mittels Silicagel- Chromatographie (Hexan/MTBE 2:1) und ergab 70 mg eines gelblichen Pulvers. Dieses wurde in McCN/MeOH gelöst und mit H₂O ausgefällt. Ausbeute: 60 mg (41%) eines weißen Pulvers in einer Reinheit von 86% (bestimmt über HPLC). (Um eine höhere Reinheit zu erhalten, sollte die Silicagel Chromatographie mit einem Hexan/MTBE Gradienten von 5:1 → 2:1 durchgeführt werden). Ausbeute: 60 mg (77%), Reinheit: > 86% über HPLC, Summenformel: C₄₀H₆₀N₃O₆Cl₂F, Molekulargewicht: 736.93 g/mol.
Ausführungsbeispiel 15
Synthese von 2-[3-{3-[Bis-(2-chlorethyl)-amino]-phenyl}-2-(2-hexadecanoylaminoacetylamino)-propionylamino}-3-(4-fluoro-phenyl) propionsäureethylester (MK 246):
Verwendete Reagenzien:
H-m-Sarcolysyl-Phe(4F)-OEt (I): 0,2 mmol, 100 mg, Palmitoyl- Gly-OH (II): 70 mg K₂CO₃ (III): 0,6 mmol, 83 mg, HBTU: 0,2 mmol 76 mg, HOBT: 0,2 mmol, 27 mg, DMF, 4 ml, DCM: 2 ml
In einem trockenen Reaktionskolben werden 100 mg (I) in 4 ml DMF bei Raumtemperatur gelöst und 76 mg (IV) sowie 27 mg HOBt zugegeben. 70 mg (II) wurden zugegeben und mithilfe von 2 ml DCM gelöst. Nach Zugabe von 83 mg (III), wurde der Reaktionskolben unter Stickstoff verschlossen und bei Raumtemperatur über Nacht gerührt (nach 10 min Reaktionszeit wurde die Lösung klar). Nach Extraktion mit H₂O und MTBE, wurde die organische Phase über MgSO₄ getrocknet und das Lösungsmittel abgezogen. Die Aufreinigung erfolgte mittels Silicagel-Chromatographie (Hexan/MTBE 2:1) und ergab 70 mg eines gelblichen Pulvers. Ausbeute: 70 mg (77%), Reinheit: > 86% über HPLC, Summenformel: C₄₂H₆₃Na₄O₅Cl₂F, Molekulargewicht: 793.99 g/mol
Toxizitätstest:
Die Verbindungen der vorstehenden Ausführungsbeispiele wurden auf ihre Toxizität und Verträglichkeit gegenüber Säugetieren bei einer Testpopulation von Mäusen getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengestellt:
Melphalan (MPH) und die sechs MTA Derivate wurden wie vorstehend erläutert synthetisiert.
MPH und die sechs erfindungsgemäßen MTA Verbindungen wurden in DMSO bei einer Konzentration von 20 mg Base Verbindung/Milliliter gelöst und auf das Zehnfache mit Wasser unmittelbar vor der Injektion in die Mäuse verdünnt.
Testpopulation:
Es wurden 48 gesunde weibliche DBA/2 Mäuse im Alter von 5 – 6 Wochen mit einem Gewicht von 17 – 21 g von Harlan (Garnac, Frankreich) erhalten. Vor der Behandlung wurden die Tiere sieben Tage in spezifischen pathogenfreien Käfigen gehalten.
Die Testtiere wurden in Räumen bei einer Temperatur von 23 ± 2°C, einer Feuchtigkeit von 45 ± 5% und einer Tag-/Nachtperiode von 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkelheit und Luftaustausch gehalten. Die Haltung und Ernährung der Tiere erfolgte gemäß den geseetzlichen Vorschriften über die Durchführung von Tierexperimenten.
Durchführung des Experiments und Behandlungen:
1. Toxizitätsstudien von MPH und den sechs MTA Derivaten bei gesunden DBA/2 Mäusen.
Die Bestimmung des MTD bei intravenöser Verabreichung erfolgte in zwei Schritten:
Schritt 1:
Zwei gesunde DBA/2 Mäuse/Dosiswerte wurden der Behandlung beim Tag 0 (D0) unterzogen. Diese Behandlung bestand aus einer einzigen intravenösen Injektion von MPH, MPH Biokonjugaten und den sechs erfindungsgemäßen MTA Derivaten bei einer Dosis von HSD, HSD/1,5 und HSD/2 mg Base Sys/kg. Die Überlebensrate der Mäuse am 21. Tag (D21) war das Ende des Experiments. Die Tiere wurden vor der Behandlung und 24 Stunden danach gewogen. Falls die Mäuse schnell nach der Injektion starben oder wenn sie mehr als 25% ihres Körpergewichts (< 24 h) verloren, wurde die Dosis halbiert und zweimal innerhalb eines 3-Stunden Intervalls injiziert. Wenn die Mäuse wiederum nach 24 Stunden starben, wurde die Dosis gemäß dem gleichen Verfahren erniedrigt.
Schritt 2:
Dieser Schritt hing von den Resultaten, die in Schritt 1 erhalten wurden, ab: Wenn keine der getesteten Dosierungen letal war, sollte das HSD für in vivo Antitumorexperimente verwendet werden.
Falls das HSD allein oder HSD/1,5 letal waren und HSD/2 nicht letal war:
Zwei DBA/2 Mäuse pro Dosiswert erhielten die Behandlung am Tag 0. Diese Behandlung bestand aus einer einzigen intravenösen Injektion der Testsubstanz von einem bis drei Dosiswerten zwischen der letalen und der nicht-letalen Dosis. Die Bestimmung der Überlebensfähigkeit der Mäuse am 21. Tag war der Schluss des Experiments.
Wenn auch HSD/2 letal war, erfolgte eine Verminderung der Dosis gemäß dem vorstehend beschriebenen Weg, eine letale Dosis zu finden.
Die Mäuse wurden zweimal wöchentlich während 21 Tagen nach der letzten Injektion beobachtet. Körpergewicht und das Überleben wurden registriert, ein 30% Verlust des Körpergewichts und/oder Tod wurden als das ausschlaggebende Kriterium in Bezug auf Toxizität betrachtet.
2. Ergebnisse:
Toxizitätsstudie von MPH und den sechs MTA Derivaten in gesunden DBA/2 Mäusen:
Für sämtliche getesteten Verbindungen entsprachen die HSD, HSD/1,5 und HSD/2 Werte 16,0, 10,67 und 8,0 mg Base MPH/kg.
Eine Maus starb am 9. Tag nach einer einzigen intravenösen Injektion von MPH bei 16,00 mg base/kg. In den anderen behandelten Gruppen starb keine Maus.
Eine große Abnahme des Körpergewichts von gesunden DBA/2 Mäusen, die intravenös mit MPH bei 16,00 mg base/kg auf HSD behandelt wurden, wurde zwischen dem 1. und 6. Tag beobachtet, verglichen mit der Gruppe, die mit Wasser verdünnte Verbindungen erhielt (Wasser PPI) mit -8,10 ± 3,46%, was den Tod einer Maus am 9. Tag hervorrief. Kein Verlust an Körpergewicht wurde bei gesunden DBA/2 Mäusen, die intravenös mit MPH mit Gehalten von 10,67 und 8,00 mg base/kg (HSD/1,5 und HSD/2) zwischen dem 1. und 6., dem 1. und 13. sowie dem 1. und 27. Tag behandelt wurden.
Kein Körpergewichtsverlust bei gesunden DBA/2 Mäusen, die intravenös mit den sechs MTA Derivaten mit 16,00, 10,67 und 8,00 mg base/kg (HSD, HSD/1,5 und HSD/2) behandelt wurden, wurde zwischen dem 1. und 6., dem 1. und 13. sowie dem 1. und 27. Tag beobachtet.
MPH, das intravenös mit einem Wert von 16,0 mg base/kg injiziert wurde, wurde von gesunden DBA/2 Mäusen nicht toleriert, aber MPH, was intravenös bei 10,67 und 8,00 mg base/kg injiziert wurde, wurde gut vertragen. Das MTD_iv von MPH beträgt zwischen 10,67 und 16,00 mg base/kg.
Die sechs MTA Derivate (MTA1 – MTA6), die intravenös bei 16,00, 10,67 und 8,99 mg base/kg injiziert wurden, wurden von gesunden DBA/2 gut vertragen.
Tabelle 1: Toxizitätstest erfindungsgemäßer chemischer Verbindungen:
Behandlungsdosen:
Die MTD von MPH und den sechs MPH Derivaten bei intravenöser (iV) Verabreichung über die IV Route wurde gemäß dem nachstehenden Verabreichungsprotokoll bestimmt. Die Dosismengen der Testsubstanzen sind in mg base/kg angegeben. Den Mäuse wurde eine einzige IV Injektion (single iV Injection) von MPH und den sechs MTA Verbindungen der allgemeinen Formel (I), (3 Dosierungsmengen in mg Base/kg, 2 Mäuse/Gruppe): HSD, HSD/1.5, HSD/2 bis zu 8 ml/kg der Trägerlösung (IV Injizierung von 0.2 ml für eine Maus mit 25g) verabreicht.
Die Testsubstanzen wurden intravenös (IV) über die Schwanzvene in gesunde DBA/2 Mäuse injiziert.
Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, sind die erfindungsgemäßen Verbindungen auch bei längerer intravenöser Verabreichung nur gering toxisch.

Claims

Chemische Verbindung der allgemeinen Formel (I)
wobei R¹ und R² gleich oder verschieden sind, wobei im Falle, daß R¹ und R² gleich sind, R¹ und R² ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, substituiertem Benzoyl-, substituierten und unsubstituierten Alkyl, Aryl, Aralkyl, Sulfoxy, aliphatischen und heteroaromatischen Acyl, wobei der Grundkörper des aliphatischen Restes 1 bis 16 Kohlenstoffatome enthält, sowie einem N-substituierten Aminosäurerest, oder dass NR₁R₂ ein Carbamat, Hydrazin, Hydrazon-, Hydroxam- und Harnsäurederivat ist. und im Falle, daß R¹ und R² verschieden sind, R¹ und/oder R² ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, substituiertem Benzoyl-, substituierten und unsubstituierten Benzyl, Sulfoxy, aliphatischen und heteroaromatischen Acyl, wobei der Grundkörper des aliphatischen Acyl-Restes 1 bis 16 Kohlenstoffatome enthält, sowie einem N-substituierten Aminosäurerest, oder dass NR₁R₂ ein Carbamat, Hydrazin, Hydrazon-, Hydroxam- und Harnsäurederivat ist. R³ ein Aminosäurerest, ein C₁ – C₁₂ Alkyletherrest, insbesondere Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl und deren verzeigte Isomere oder ein (Poly)peptidrest bzw. deren substituierte oder teilweise substituierten Derivate ist, sowie die physiologisch verträglichen Salze dieser Verbindungen.
Chemische Verbindung nach Anspruch 1, wobei R¹ H ist und R² ausgewählt ist aus: einem substituiertem Benzoyl-, substituierten oder unsubstituierten Sulfoxyl-, einen heteroaromatischen und/oder aliphatischen Acylrest wobei der Grundkörper des aliphatischen Acyl-Restes 1 bis 16 Kohlenstoffatome enthält, sowie einem Nsubstituierten Aminosäurerest und wobei der heteroraromatische Acylrest ein N, S oder O Atom enthält.
Verfahren zur Herstellung einer chemischen Verbindung der allgemeinen Formel 1 umfassend den folgenden Schritt: Reaktion eines (Poly)peptids der allgemeinen Formel L-m-Sarcolysyl-(Polypeptid) mit einer Verbindung umfassend eine Carbonsäure, ein Carbonsäurederivat, eine Nsubstituierte Aminosäure, eine Sulfonsäure, ein Sulfonsäurederivat, einem Alkyl-, Aryl- oder Aralkylhalogenid
Verfahren nach Anspruch 3, wobei im Falle der Reaktion des (Poly)peptids mit einer Carbonsäure, einer N-substituierten Aminosäure oder einer Sulfonsäure ein Aktivierungsmittel vor der Reaktion zugegeben wird.
Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei die Reaktion in einem wasserfreien Lösungsmittel durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei das Verfahren als parallelisierbares Verfahren durchgeführt wird.
Pharmazeutische Formulierung umfassend eine Verbindung der allgemeinen Formel (I).
Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 7, weiter umfassend einen pharmakologisch aktiven Wirkstoff.
Verbindung der allgemeinen Formel (I) zur Behandlung von Tumoren.
Verwendung der Verbindung der allgemeinen Formel (I) zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Tumoren.