WO2004024755A2 - Sarcolysyl-derivate und verfahren zu deren herstellung - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to m-L-sarcolysyl derivatives, a process for their preparation and pharmaceutical compositions containing these compounds, in particular for the treatment of cancer.
  • Peptides occur in nature in a multitude of variations and have specific functions. They regulate many functions of metabolism by acting as chemical neurotransmitters, stimulators or inhibitors. They bind to specific receptors, which belong in particular to the superfamily of G protein-coupled receptors. Peptides are therefore used as ideal vehicles for diagnostic and therapeutic applications using Paul Ehrlich's concept of the "magic ball”. Tumor tissues that express peptide receptors can be recognized by the specific peptide or differently labeled analogs. Depending on the label, the Tumor can be visualized or treated therapeutically. The specific binding to receptors can be used to meet the most important requirement in the treatment of tumors, namely "the selective response of the neoplasm".
  • Peptides are easy to synthesize and can withstand harsh reaction conditions in terms of their modification and labeling. Because of their comparatively small size, peptides show high target-to-background ratios compared to macromolecular carriers such as antibodies. Peptides cause immunogenetic responses less frequently, and cancer tissue penetration and uptake by the tumor are faster.
  • melphalan (4- [bis (2-chloroethyl) amino] -L-phenylalalanine), which is sold by Glaxo-Wellcome under the trade name Alkeran®, as alkylating cytostatic works.
  • mL-sarcolysin (or sarcolysin for short) is an isomer of melphalan, the bis- (2-chloroethyl) amino group being substituted in the meta position to the ⁇ -amino acid group on the phenyl radical.
  • Wergel and Stock (Ann. Res. Br. Emp. Cancer Camp 31, 6, 1953) Larionov, et al.
  • Chemotherapy is currently the main therapy for the treatment of cancer.
  • One of the main problems with classic chemotherapy is the non-specific toxicity of most anti-cancer drugs to normal, i.e. non carcinogenic cells. Efficient design of drugs that only act on specific cancer cells is therefore desirable, since this can reduce the serious side effects of cytostatics depending on the dose.
  • drug delivery systems are required that selectively transport the anti-neoplastic agents to the tumor. The chemical coupling of cytotoxic drugs to peptides is therefore another approach to increasing the selectivity towards tumor cells.
  • WO 01/96367 AI discloses melphalan-containing di- or tripeptides which can be used as alkylating chemotherapeutic cancer drugs.
  • these new compounds can increase the resistance of many mammalian cells overcoming melphalan. Compared to pure sarcolysin, these compounds have lower toxicity and higher activity and could be used for a wide range of tumor types.
  • a protein complex of 6 peptides each containing mL-sarcolysin as a building block, is used under the name "Peptichemio" for chemotherapy against cancer. It has been found that this product is a has a cytostatic effect and can be used for both myeloma and melanoma therapy. This combination of 6 peptides is less toxic to human lymphoplasts than mL-sarcolysin alone.
  • Peptichemio In addition to the reduced toxicity of Peptichemio compared to mL -Sarcolysin found less DNA cross-linking, but Peptichemio was also found to be more cytotoxic to human melanoma cell lines compared to mL-sarcolysin.
  • R 1 and R 2 are the same or different, where in the case that R 1 and R 2 are the same, R 1 and R 2 are selected from the group consisting of H, substituted benzoyl, substituted and unsubstituted alkyl, aryl,
  • NRjR 2 is a carbamate, hydrazine, hydrazone, hydroxam and
  • Uric acid derivative is.
  • R 1 and R 2 are selected from the group consisting of H, substituted benzoyl, substituted and unsubstituted benzyl, sulfoxyl, aliphatic and heteroaromatic acyl, the base body of the aliphatic acyl Residue contains 1 to 16 carbon atoms, and an N-substituted amino acid residue, or that NR ⁇ is a carbamate, hydrazine, hydrazone, hydroxamic and uric acid derivative.
  • R 3 is an amino acid or a (poly) peptide or its substituted or partially substituted derivatives,
  • Compounds of the general formula (I) have an extremely low toxicity towards healthy mammalian cells, so that they can also be administered in larger doses.
  • the object of the present invention is further achieved by the provision of a process for the preparation of the chemical compounds of the general formula (I), the process comprising the following step:
  • the process according to the invention enables the compounds according to the invention to be obtained in a high yield of generally more than 95%.
  • the compounds according to the invention are easy to recrystallize in the context of the process according to the invention owing to the solvents used, which are listed in the examples, and are therefore particularly easy to clean.
  • an activating agent is preferably added before the reaction. This enables the reaction to proceed particularly quickly and particularly completely, so that the overall yield can also be increased considerably as a result.
  • Anhydrous solvent preferably include for example DMF, DCM, MTBE, DIPEA and mixtures thereof. Associated with this is also a high yield compared to previously known synthetic processes in the reaction of synthons with the same or similar functional groups.
  • this method can advantageously also be used as a parallelized method for the simultaneous production of many different compounds according to the invention.
  • this method can advantageously also be used as a parallelized method for the simultaneous production of many different compounds according to the invention.
  • by using synthesis on the solid phase it can be used without problems for the parallel production of a large number of compounds according to the invention.
  • compositions for use as a medicament are preferably used in pharmaceutical formulations for use as a medicament.
  • the pharmaceutical formulation likewise comprises further pharmacologically active substances which can act synergistically with the pharmaceutically active compounds of the general formula (I). These are in particular known anti-tumor agents for chemotherapy.
  • Compounds of the general formula (I) according to the invention are preferably used alone or in pharmaceutical formulations for the treatment of tumors.
  • Compounds of the general formula (I) have an increased cytotoxicity and can be used against a large number of tumors, for example against leukemia, malignant lymphomas, testicular cancer, breast cancer, ovarian cancer, colon cancer, Wilms tumors and melanomas.
  • the formulation may contain generally customary liquid or solid excipients, diluents and the like. However, this depends on the chosen form of administration.
  • Pharmaceutical formulations comprising a compound of the general formula (I) according to the invention are preferably injected intravenously in aqueous solution or in a liquid.
  • other forms of administration are also possible, for example orally, parenterally, rectally, etc. However, this depends in particular on the tumor to be treated, the patient, the course of the disease and the like.
  • Boc-mL sarcolysin (41 g, 0.101 mol) was dissolved in 400 ml of dry dichloromethane in a 750 ml reaction flask. Then p-fluorophenylalanine ethyl ester (21 g, 0.101 mol) was added. DIPEA (34.5 ml, 0.202 mol) was added to this suspension and stirred in an ice bath for 10 minutes. DCC (20.8 g, 0.10 mol) was dissolved in DMF (30 ml) and added dropwise to the reaction mixture. The reaction mixture was warmed to room temperature and was stirred for four hours.
  • Boc-mL-sarcolysyl-Phe (4F) -OEt -t (50 g, 0.084 mol) was stirred in ethanol containing 43% HC1 (300 ml) for 10 min over an ice bath, then for 2 hours at room temperature. After evaporation, the reaction mixture was extracted with 1 M NaHCO 3 (pH 7-8), then extracted with EtOAc, washed with water, finally dried over MgSO 4 and recrystallized in warm ethyl acetate / diethyl ether (1: 1). Yield: 39.7 g (0.79 mol, 78%), purity:> 90% via HPLC, empirical formula: C ⁇ HaoNaOsC ⁇ F, molecular weight: 498.4 g / mol.
  • Toluene sulfonyl chloride (Fluka No. 89730, 126 mg) was added to the reaction mixture. The reaction mixture was warmed to room temperature and for two
  • reaction mixture was acidified with 1 M HC1, extracted with EtOAc, washed with water and dried over MgSO 4 . After filtration and removal of the solvent obtain the crude product which was purified on silica gel chromatography using a 4: 1 to 2: 1 hexane: EtOAc gradient. The fraction containing the product was evaporated to give 250 mg of an oily product in 90% purity. Yield: 250 mg, purity: 90% via HPLC, empirical formula: C 27 H 32 N 3 O 4 Cl 3 , molecular weight: 568.93 g / mol.
  • Fluorobenzoyl chloride (Fluka No. 46740, 60 ⁇ l) was added dropwise to the reaction mixture.
  • Hm-Sarcolysyl-Phe (4F) -OEt (I): 0.2 mmol, 100 mg, palmitoyl-Gly-OH (II): 70 mg K 2 CO 3 (in): 0.6 mmol, 83 mg, HBTU : 0.2 mmol 76 mg, HOBT: 0.2 mmol, 27 mg, DMF, 4 ml, DCM: 2 ml
  • MPH and the six MTA compounds according to the invention were dissolved in DMSO at a concentration of 20 mg base compound / milliliter and diluted tenfold with water immediately before the injection into the mice.
  • mice 48 healthy DBA / 2 mice aged 5-6 weeks weighing 17-21 g were obtained from Harlan (Garnac, France). The animals were kept in specific pathogen-free cages for seven days prior to treatment.
  • test animals were kept in rooms at a temperature of 23 ⁇ 2 ° C., a humidity of 45 ⁇ 5% and a day / night period of 12 hours of light and 12 hours of darkness and air exchange.
  • the animals were kept and fed in accordance with the legal regulations on the conduct of animal experiments.
  • the MTD for intravenous administration was determined in two steps:
  • mice / dose values were treated at day 0 (DO).
  • This treatment consisted of a single intravenous injection of MPH, MPH bioconjugates and the six MTA derivatives according to the invention at a dose of HSD, HSD / 1.5 and HSD / 2 mg base Sys / kg.
  • the survival rate of the mice on day 21 (D21) was the end of the experiment.
  • the animals were weighed before treatment and 24 hours after. If the mice died quickly after the injection or if they lost more than 25% of their body weight ( ⁇ 24 h), the dose was halved and injected twice within a 3 hour interval. If the mice died again after 24 hours, the dose was decreased according to the same procedure.
  • step 1 This step depended on the results obtained in step 1:
  • the HSD should be used for in vivo anti-tumor experiments.
  • mice per dose received treatment on day 0.
  • This treatment consisted of a single intravenous injection of the test substance from one to three dose values between the lethal and the non-lethal dose. The determination of the survivability of the mice on day 21 was the end of the experiment.
  • HSD / 2 was also lethal, the dose was decreased according to the way described above to find a lethal dose.
  • mice were observed twice a week for 21 days after the last injection. Body weight and survival were recorded, a 30% loss in body weight and / or death were considered the main criteria for toxicity. 2 results:
  • HSD, HSD / 1.5 and HSD / 2 values corresponded to 16.0, 10.67 and 8.0 mg base MPH / kg.
  • MPH injected intravenously at 16.0 mg base / kg was not tolerated in healthy DBA / 2 mice, but MPH injected intravenously at 10.67 and 8.00 mg base / kg became good tolerated.
  • the MTD iv of MPH is between 10.67 and 16.00 mg base / kg.
  • the six MTA derivatives (MTAl - MTA6) injected intravenously at 16.00, 10.67 and 8.99 mg base / kg were well tolerated by healthy DBA / 2.
  • the MTD of MPH and the six MPH derivatives when administered intravenously (iN) via the IV route was determined according to the administration protocol below.
  • the dose amounts of the test substances are given in mg base / kg.
  • the mice were given a single IV injection of MPH and the six MTA compounds of the general formula (I), (3 dosage amounts in mg base / kg, 2 mice / group): HSD, HSD / 1.5, HSD / 2 up to 8 ml / kg of the carrier solution (IV injection of 0.2 ml for a mouse with 25 g) administered.
  • test substances were injected intravenously (IV) via the tail vein into healthy DBA / 2 mice.
  • IV intravenously
  • the compounds according to the invention are only slightly toxic even after prolonged intravenous administration.
  • the cytotoxicity of the compounds according to the invention was also determined using the KB cell line (ATCC CCL 17) [Swanson, SM, & Pezzuto, JM In Drug Bioscreening. Drug evaluation techniques in pharmacology; Thompson, EB Ed .; VCH: New York, Weinheim, Cambridge, 1990; pp 273-297].
  • the tests were carried out using the screening technique in 96-well microwell plates (Falcon) with the addition of 2.5 x 10 cells / milliliter per well.
  • the test solutions were prepared as stock solutions in DMA water.
  • the test concentrations were freshly prepared by diluting the stock solution with water to the required level Concentration.
  • the final DMA concentration was 1% or less by volume. The volume was 150 ⁇ l.
  • methyl-thiazonyl-tetrazolium chloride (MTT, company Fluka 5 mg / ml in PBS) were added after 72 hours). During the incubation at 37 ° C for four hours, the surviving cells metabolized MTT into an insoluble formazan dye. The culture medium was removed and the formazan dye was dissolved using 150 ul of a 10% SDS (sodium dodekyl sulfate) solution in water. After an incubation period of 24 hours at room temperature, the optical density at 540 nm was measured using a microplate reader (MRX Dynex Technologies, Emrach, Switzerland). To determine the IC 50 values, the optical density was plotted against the logarithmic concentration and six different concentrations were tested. Each test was carried out at least twice and all experiments were repeated twice. The observed maximum standard deviation was 20% (in absolute values). Positive control measurements were also made.
  • MTT methyl-thiazonyl-tetrazolium chloride
  • the best compounds are guanidyl-PSF-OEt, MK 1494-2, MK 246 and MD 818.
  • the insertion of the guanidyl, 3- ⁇ itro ⁇ henylfuroyl, palmitoyl or 2-chlorobenzoyl substituent increases the cytotoxicity and selectivity.
  • Neritatien according to the invention were also tested for the treatment of tumors, in particular lymphatic tumors in dogs of the breed German Shepherd, with regard to their cytotoxicity.
  • the three animals were treated with Espor, Winchristin, Cyclophasphomite, Doxorubicin, Chloroambozil, Mitroterate and Actinomycin over a period of 18 or in the case of the second animal over 19 months.
  • 2nd animal 2 x 0.4 mg, 2x 0.6 mg.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Chemische Verbindung der allgemeinen Formel (I) wobei R1 und R2 gleich oder verschieden sind und wobei im Falle, dass R1 und R2 gleich sind, R1 und R2 ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus substituiertem Benzoyl-, substituierten und unsubstituierten Alkyl, Aryl, Aralkyl, Sulfoxy, aliphatischen und heteroaromatischen Acyl, wobei der Grundkörper des aliphatischen Restes 1 bis 16 Kohlenstoffatome enthält, sowie einem N-substituierten Aminosäurerest, und im Falle, daß R1 und R2 verschieden sind, R1 oder R2 ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, substituiertem Benzoyl-, substituierten und unsubstituierten Benzyl, Sulfoxy, aliphatischen und heteroaromatischen Acyl, wobei der Grundkörper des aliphatischen Acyl-Restes 1 bis 16 Kohlenstoffatome enthält, sowie einem N-substituierten Aminosäurerest, R3 eine Aminosäure oder ein (Poly)peptid bzw. deren substituierte oder teilweise substituierten Derivate ist, sowie die physiologisch verträglichen Salze dieser Verbindungen. Weiter betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der chemischen Verbindung sowie ihre Verwendung als Medikament gegen Krebsleiden.

Description

SARCOLYSYL-DERIVATE UND VERFAHREN ZU DEREN HERSTELLUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft m-L-Sarcolysylderivate, ein Verfahren zu deren Herstellung sowie pharmazeutische Zusammensetzungen diese Verbindungen enthaltend, insbesondere zur Behandlung von Krebsleiden.
Peptide kommen in einer Vielzahl von Variationen in der Natur vor und haben spezifische Aufgaben. Sie regulieren viele Funktionen des Metabolismus, in dem sie als chemische Neurotransmitter, Stimulatoren oder Inhibitoren wirken. Sie binden an spezifische Rezeptoren, die insbesondere zu der Oberfamilie von G-Protein gekoppelten Rezeptoren gehören. Peptide werden daher als ideale Trägermittel für diagnostische und therapeutische Anwendungen unter Verwendung von Paul Ehrlichs Konzept der „magischen Kugel" verwendet. Tumorgewebe, die Peptidrezeptoren exprimieren, können durch das spezifische Peptid, oder verschieden gelabelte Analoga erkannt werden. In Abhängigkeit von dem Label kann der Tumor visualisiert oder therapeutisch behandelt werden. Die spezifische Bindung an Rezeptoren kann dazu verwendet werden, die wichtigste Anforderung bei der Behandlung von Tumoren zu erfüllen, nämlich „das selektive Ansprechen des Neoplasmas". Peptide sind einfach synthetisierbar und können auch harten Reaktionsbedingungen in Bezug auf ihre Modifikation und ihrem Labeling standhalten. Aufgrund ihrer vergleichsweise geringen Größe, zeigen Peptide verglichen mit makromolekularen Trägermitteln, wie beispielsweise Antikörpern, hohe Ziel-zuHintergrund-Verhältnisse. Peptide verursachen weniger häufig immungenetische Antworten, und die Durchdringung des Krebsgewebes und ihre Aufnahme durch den Tumor erfolgen schneller.
Es ist bekannt, dass Melphalan (4-[bis(2-Chlorethyl)amino]-L-phenylalalanin), das von der Firma Glaxo-Wellcome unter dem Handelsnamen Alkeran® vertrieben wird, als alkylierendes Zytostatikum wirkt. m-L-Sarcolysin (oder auch kurz Sarcolysin genannt) ist ein Isomer von Melphalan, wobei die bis-(2-Chlorethyl)-aminogruppe in meta Position zur α-Aminosäuregruppe am Phenylrest substituiert ist. Wergel und Stock (Ann. Res. Br. Emp. Cancer Camp 31, 6, 1953) Larionov, et al. (The Lancet 2, 169, 1955) berichteten über eine Zunahme bei der Spezifizität von Sarcolysin für bestimmte Tumorzellen aufgrund der Substitution der Methylgruppe von Methylchlorethylamin mit Phenylalanin. Der Vergleich der drei strukturellen Isomere von bis-(2-Chlorethyl)amino-L-phenylalanin zeigte, dass das m-Isomer aktiver als das p-Isomer und weiter weniger toxisch als das o- Isomer ist. Chemotherapeutische Mittel, die aus synthetischen Peptiden zusammengesetzt sind, und eine cytotoxische Aktivität aufgrund der alkylierenden Gruppe und selektive Trägerfunktion gegenüber einer spezifischen Zielzelle aufweisen, sind bekannt (De Barbieri, A, Farmaco 38, 205 - 218, 1983).
Die Chemotherapie ist derzeit die Haupttherapie zur Behandlung von Krebsleiden. Eines der Hauptprobleme bei der klassischen Chemotherapie ist die nicht spezifische Toxizität der meisten Anti-Krebsmittel, gegenüber normalen, d.h. nicht cancerogenen Zellen. Effizientes Design von Medikamenten, die nur auf spezifische Krebszellen wirken, ist daher wünschenswert, da dies die schweren, in Abhängigkeit von der Dosis auftretenden Nebeneffekte bei der Verabreichung von Cytostatika mindern kann. Um die therapeutische Wirkung zu erhöhen, werden Systeme zur Medikamentenfreisetzung benötigt, die selektiv die anti-neoplastischen Mittel zum Tumor transportieren. Die chemische Kopplung von cytotoxischen Medikamenten an Peptide ist daher ein weiterer Zugang, um die Selektivität gegenüber Tumorzellen zu erhöhen.
Aus der WO 01/96367 AI sind Melphalan enthaltende Di- bzw. Tripeptide bekannt, die als alkylierende chemotherapeutische Krebsmedikamente verwendet werden können. Insbesondere können diese neuen Verbindungen die Resistenz vieler Säugetierzellen gegenüber Melphalan überwinden. Diese Verbindungen weisen gegenüber reinem Sarcolysin geringere Toxizität und eine höhere Aktivität auf und konnten für ein weites Spektrum von Tumorarten eingesetzt werden.
So ist beispielsweise weiter aus der WO 99-2177 bekannt, dass ein Proteinkomplex aus 6 Peptiden, die jeweils m-L-Sarcolysin als Baustein enthalten, unter dem Namen „Peptichemio" für die Chemotherapie gegen Krebs eingesetzt wird. Es wurde gefunden, dass dieses Produkt eine cytostatische Wirkung hat, und sowohl für die Myelom- als auch für die Melanomtherapie eingesetzt werden kann. Diese Kombination aus 6 Peptiden ist weniger toxisch gegenüber menschlichen Lymphoplasten, als m-L-Sarcolysin alleine. Außerdem wurde zusätzlich zu der verminderten Toxizität von Peptichemio im Vergleich zu m-L-Sarcolysin eine geringere DNA- Vernetzung festgestellt. Es wurde jedoch ebenfalls eine erhöhte Cytotoxizität von Peptichemio gegenüber menschlichen Melanomzellinien verglichen mit m-L-Sarcolysin festgestellt.
Nachteilig bei dem Verfahren zur Herstellung dieser Kombination von 6 Peptiden sind die geringen Ausbeuten, die geringere erzielte Reinheit der Produkte sowie die umständlichen Synthesewege. Darüber hinaus ist die Toxizität von "Peptichemio" gegenüber menschlichen Lymphoplasten immer noch zu hoch, um gefahrlos eingesetzt werden zu können.
Daher war es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Verbindungen zur Verfügung zu stellen, die eine geringe Toxizität gegenüber gesunden Zellen mit einem einfachen Syntheseweg mit hoher Ausbeute vereinen.
Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I) gelöst:
Figure imgf000006_0001
(I)
wobei
R1 und R2 gleich oder verschieden sind, wobei im Falle, daß R1 und R2 gleich sind, R1 und R2 ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, substituiertem Benzoyl-, substituierten und unsubstituierten Alkyl, Aryl,
Aralkyl, Sulfoxy, aliphatischen und heteroaromatischen Acyl, wobei der Grundkörper des aliphatischen Restes 1 bis 16 Kohlenstoff atome enthält, sowie einem N-substituierten
Aminosäurerest, oder dass NRjR2 ein Carbamat, Hydrazin, Hydrazon-, Hydroxam- und
Harnsäurederivat ist.
und im Falle, daß R1 und R2 verschieden sind, R1 oder R2 ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, substituiertem Benzoyl-, substituierten und unsubstituierten Benzyl, Sulfoxyl, aliphatischen und heteroaromatischen Acyl, wobei der Grundkörper des aliphatischen Acyl-Restes 1 bis 16 Kohlenstoffatome enthält, sowie einem N-substituierten Aminosäurerest, oder dass NR^ ein Carbamat, Hydrazin, Hydrazon-, Hydroxam- und Harnsäurederivat ist. R3 eine Aminosäure oder ein (Poly)peptid bzw. deren substituierte oder teilweise substituierten Derivate ist,
sowie die physiologisch verträglichen Salze dieser Verbindungen, beispielsweise die Hydrochloride, Hydrobromide, Acetate, Tartrate, ohne dass diese Aufzählung als abschließend verstanden werden soll. Es versteht sich, dass auch am aromatischen Ring des Sarcolysyl-Grundkörpers substituierte Derivate, die über einfache, dem Fachmann an sich bekannte Synthesen hergestellt werden können, in den Offenbarungsgehalt der Erfindung fallen.
Verbindungen der allgemeinen Formel (I) weisen gegenüber gesunden Säugetierzellen eine äußerst geringe Toxizität auf, so dass sie auch in größeren Dosierungen verabreicht werden können.
Weitere, nicht beschränkende Beispiele für erfindungsgemäße Substituenten R, bzw. R2 sind in der nachstehenden Tabelle 1 aufgeführt.
Tabelle 1: Beispiele für die Substituenten Rt und R2
Figure imgf000008_0001
Figure imgf000009_0001
Figure imgf000010_0001
Weiter wird die Aufgabe der vorliegenden Erfindung durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung der chemischen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) gelöst, wobei das Verfahren den folgenden Schritt umfasst:
Reaktion eines (Poly)peptids der allgemeinen Formel m-L-Sarcolysyl-(Polypeptid) mit einer Verbindung umfassend eine Carbonsäure, ein Carbonsäurederivat, eine N- substituierte Aminosäure, eine Sulfonsäure, ein Sulfonsäurederivat, einem Alkyl-, Aryl- oder Aralkylhalogenid.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht durch den Einsatz einfacher Ausgangsmaterialien in einer Synthese in wenigen Schritten, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen in hoher Ausbeute von im Allgemeinen mehr als 95% erhalten werden können. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens aufgrund der verwendeten, in den Beispielen aufgeführten Lösungsmittel einfach umkristallisierbar und damit besonders einfach zu reinigen.
Bevorzugt wird im Falle der Reaktion des (Poly)peptids mit einer Carbonsäure, einer N- substituierten Aminosäure oder einer Sulfonsäure ein Aktivierungsmittel vor der Reaktion zugegeben. Damit wird ermöglicht, dass die Reaktion besonders schnell und besonders vollständig ablaufen kann, so dass die Gesamtausbeute auch dadurch beträchtlich erhöht werden kann.
Weiter vorteilhaft ist die Durchführung der Reaktion in einem wasserfreien Lösungsmittel, so dass eine eventuelle Spaltung von hydrolyseempfindlichen Bindungen innerhalb der verwendeten Ausgangsverbindungen nicht auftritt und auch damit die Gefahr von unerwünschten Nebenreaktionen, Nebenprodukten oder einer geringeren Ausbeute weitgehend vermieden wird. Wasserfreie Lösungsmittel umfassen bevorzugt beispielsweise DMF, DCM, MTBE, DIPEA und Mischungen davon. Damit verbunden ist auch eine hohe Ausbeute im Vergleich zu bislang bekannten Syntheseverfahren bei der Reaktion von Synthonen mit gleichen oder ähnlichen funktionellen Gruppen.
Selbstverständlich kann dieses Verfahren vorteilhafterweise auch als parallelisiertes Verfahren zur simultanen Herstellung vieler verschiedener erfindungsgemäßer Verbindungen verwendet werden. Zudem lässt es sich über die Anwendung der Synthese an der Festphase problemlos für die parallele Herstellung einer großen Anzahl erfindungsgemäßer Verbindungen verwenden.
Verbindungen der allgemeinen Formel (I) werden bevorzugt in pharmazeutischen Formulierungen zur Verwendung als Medikament eingesetzt. In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform umfasst dabei die pharmazeutische Formulierung ebenfalls weitere pharmakologisch aktive Wirkstoffe, die mit den pharmazeutisch aktiven Verbindungen der allgemeinen Formel (I) synergistisch wirken können. Dies sind insbesondere an sich bekannte Anti-Tumor-Mittel für die Chemotherapie.
Bevorzugt werden erfindungsgemäße Verbindungen der allgemeinen Formel (I) allein oder in pharmazeutischen Formulierungen zur Behandlung von Tumoren eingesetzt. Verbindungen der allgemeinen Formel (I) weisen eine erhöhte Zytotoxizität auf und können gegenüber einer Vielzahl von Tumoren eingesetzt werden, beispielsweise gegen Leukämie, maligne Lymphome, Hodenkrebs, Brustkrebs, Eierstockkrebs, Dickdarmkrebs, Wilms-Tumore und Melanome.
Selbstverständlich ist es auch möglich, dass in der Formulierung allgemein übliche flüssige oder feste Excipienten, Verdünnungsmittel und dergleichen vorhanden sind. Dies hängt jedoch von der gewählten Verabreichungsform ab. Bevorzugt werden pharmazeutische Formulierungen umfassend eine erfindungsgemäße Verbindung der allgemeinen Formel (I) intravenös in wässriger Lösung, bzw. in einer Flüssigkeit injiziert. Jedoch sind auch andere Verabreichungsformen möglich, wie beispielsweise oral, parenteral, rektal usw. Dies hängt jedoch insbesondere von dem zu behandelnden Tumor, vom Patienten, vom Verlauf der Krankheit und dergleichen ab.
Die geeignete Verabreichungsform wird im Einzelfall vom Urteil eines Mediziners abhängen.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand einiger nicht einschränkender Ausführungsbeispiele erläutert.
Ausführungsbeispiele
Definitionen:
Unter dem Begriff „Aminosäure" werden sowohl die natürlich vorkommenden α- Aminosäuren Ala = L-Alanin, Arg = L-Arginin, Asn = L-Asparagin, Asp = L- Aspartamsäure, Cys = L-Cysteine, Glu = L-Glutamatsäure, Gin = L-Glutamin, Gly = Glycin, His = L-Histidin, He = L-Isoleucin, Leu = L-Leucin, Lys = L-Lysin, Met = L- Methionin, Phe = L-Phenylalanin, Pro = L-Prolin, Ser = L-Serin, Thr = L-Threonin, Trp = L-Tryptophan, Tyr = L-Tyrosin, Val = L-Valin als auch deren substituierte Derivate, sowie sämtliche -Aminocarbonsäurederivate verstanden. Insbesondere umfassen derartige - Aminocarbonsäuren, die ebenfalls im Rahmen der Erfindung verwendet werden können: C4al = L-3-Cyclobutylalanin, C5al = L-3-Cyclopentylalanin, C6al = L-3-Cyclohexylalanin, Alle = L-Alloisoleucine, Nal = L-3-(l-Naphthylalanin), Nie •= L-Norleucin, Nva = L- Norvalin, Orn = L-Ornithin, Orn(CHO) = N5-Formyl-L-ornithin, L-Phg=L-Phenylglycin, Tza = L-3-(2-Thiazolyl)alanin, wobei diese Auswahl nicht als beschränkend verstanden werden soll.
Abkürzungen:
Die vor- und nachstehend verwendeten Abkürzungen bedeuten folgendes:
D Tag (day)
HSD Höchste lösliche Dosis (Highest soluble dose) MB WC Änderung des durchschnittlichen Körpergewichts (Mean Body Weight
Change)
MPH Melphalan
MTD Maximal tolerierte Dosis
S Signifikant SD Standardabweichung (Standard Deviation)
SPF Spezifisch Pathogen Frei
Z Benzyloxycarbonyl
Boc tert. -Butyloxycarbonyl
(Boc)2O di-tert. -Butyldicarbonat Fmoc 9-Fluorenylmethoxycarbonyl
Alloc Allyloxycarbonyl
Teoc Trimethylsilylethoxycarbonyl
Tcc Trichlorethoxycarbonyl
Nps o-Nitrophenylsulfonyl Trt Triphenylmethyl (oder Trityl) DIPEA N, N-Diisopropylethylamin
HOBt N-Hydroxybenzotriazol
TBTU 2-(lH-Benzotriazol-l-yl)-l,l,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborat
HBTU 2-(l H-Benzotriazol- 1 -yl)- 1 , 1 ,3 ,3-tetramethyluronium hexafluorophosphat
DCM Dichlormethan
DMF Dimethylformamid
MTBE Methyl-tert-butylether
PSF Prolin-meta-Sarcolysin-perfluorophenylalanin-ethylester
DMA Dimethylacetamid
MTT Methyl-thiazonyl-tetrazoliumchlorid
RWPSF Arg-Trp-Pro-m-Sar-Phe-(4-F)-OEt
Soweit nicht anders angegeben wurden die verwendeten Reagenzien von den Firmen Fluka AG, Buchs, Bachem AG, Senn Chemicals AG (alle Schweiz) bezogen.
Ausführungsbeispiel 1
Synthese von 3-{3-[Bis-(2-chlorethyl)-amino]phenyl}-2-tert-butoxycarbonylamino- propionsäure (Boc-m-L-Sarcolysin, AG 808)
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AG 808
In einem 100 ml Reaktionskolben wurde m-L-Sarcolysin (8.22 g, 27 mmol, hergestellt nach der Vorschrift in Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Vol. 5, pp. 2985-2988, (1995)) in DMF/H20 (150 ml/20 ml) suspendiert und unter Erwärmen mit dem Fön langsam gelöst. Beim anschließenden Abkühlen auf Raumtemperatur bleibt Sarcolysin in Lösung. Zu dieser Lösung wurde DIPEA (13.9 ml, 81 mmol) sowie (Boc)2O (6.54 g, 30 mmol, gelöst in 20 ml DMF) zugefügt, wobei sich das Reaktionsgemisch leicht trübte. Der pH- Wert betrug 10-11. Anschließend wurde bei Raumtemperatur 10-15 Stunden gerührt. Der Reaktionsverlauf wurde mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) verfolgt (Dichlormethan : Methanol 10: 1) bis zum völligen Verschwinden des Ausgangsmaterials. Nach Vervollständigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit 1 M HC1 angesäuert, mit EtOAc extrahiert, mit Wasser gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Nach Filtration und dem Abziehen des Lösungsmittels wurde das Rohprodukt erhalten, das über Silicagel-Chromatographie unter Verwendung eines Dichlormethan : Methanol Gradienten im Verhältnis von 20 : 1 zu 10 : 1 gereinigt wurde. Die Fraktion, die das Produkt enthielt, wurde eingedampft, um 9.12 g eines leicht gelbgefärbten reinen Produkts in einer Reinheit von > 95 % zu ergeben. Ausbeute: 9.12 g (84 %), Reinheit: > 95 % über HPLC, Summenformel: C18H26N2O4Cl2, Molekulargewicht: 405.32 g/mol.
Ausführungsbeispiel 2
Synthese des Dipeptides 2-(2-Amino-3-{3-[bis-(2-chlorethyl)-amino]-phenyl}- propionylamino)-3-(4-fluorophenyl)-propionsäureethylester H-m-Sarcolysyl-Phe(4F)- OEt, MD703)
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MD703
In einem 750 ml Reaktionskolben wurden Boc-m-L-Sarcolysin (41. g, 0.101 mol) in 400 ml trockenem Dichlormethan gelöst. Dann wurde p-Fluorphenylalaninethylester (21 g, 0.101 mol) zugegeben. Zu dieser Suspension wurde DIPEA (34.5 ml, 0.202 mol) zugefügt und in einem Eisbad während 10 Minuten gerührt. DCC (20.8 g, 0.10 mol) wurde in DMF (30 ml) gelöst und zu der Reaktionsmischung zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und wurde während vier Stunden gerührt. Der Reaktionsverlauf wurde mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) verfolgt (Dichlormethan : Methanol 10: 1). Nach Vervollständigung der Reaktion wurde das Nebenprodukt Dicyclohexylharnstoff vom Reaktionsgemisch abfiltriert und das Gemisch 10 Stunden bei Raumtemperatur weiter gerührt. Es wurde mit 1 M HC1 angesäuert (pH 3-4), mit EtOAc extrahiert, mit Wasser gewaschen und über MgSO4 getrocknet und in warmem Ethanol umkristallisiert. Ausbeute: 55.7 g (92%).
Boc-m-L-Sarcolysyl-Phe(4F)-OEt -t (50 g, 0.084 mol) wurde in Ethanol mit einem Gehalt von 43 % HC1 (300 ml) 10 min über einem Eisbad, dann 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Eindampfen wurde das Reaktionsgemisch mit 1 M NaHCO3 (pH 7-8), anschließend mit EtOAc extrahiert, mit Wasser gewaschen, schließlich über MgSO4 getrocknet und in warmem Ethylacetat/Diethylether (1:1) umkristallisiert. Ausbeute: 39.7 g (0.79 mol, 78 %), Reinheit: > 90 % über HPLC, Summenformel: C^HaoNaOsC^F, Molekulargewicht: 498.4 g/mol.
Ausführungsbeispiel 3
Synthese von 2-[3-{3-[3-Chlor-l-(2-chlor-ethyl)-propyl]-phenyl}-2-(toluo '-4- sulfonylamino)-3-(4-fluro-phenylamin)-propionsäureethylester (MTA-5)
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MTA-5
In einem 10 ml Reaktionskolben wurden 4 ml trockenes DCM zu dem Dipeptid (H-m- Sarcolysyl-Phe(4F)-OEt; 300 mg, 0.6 mmol) zugeben. Zu dieser Suspension wurde DIPEA
(257 μl) zugefügt und in einem Eisbad während 10 Minuten gerührt. 4-
Toluolsulfonylchlorid (Fluka Nr. 89730, 126 mg) wurde zu der Reaktionsmischung zugefügt. Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und während zwei
Stunden gerührt. Der Reaktionsverlauf wurde mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) verfolgt (EtOAc : Hexan 1 : 1). Nach Vervollständigung der Reaktion wurde die
Reaktionsmischung mit 1 M HC1 angesäuert, mit EtOAc extrahiert, mit Wasser gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Nach Filtration und dem Abziehen des Lösungsmittels wurde das Rohprodukt erhalten, das über Silicagel-Chromatographie unter Verwendung eines
Hexan : EtOAc Gradienten im Verhältnis von 4 : 1 zu 2 : 1 gereinigt wurde. Die Fraktion, die das Produkt enthielt wurde eingedampft, um 108 mg eines leicht gelbgefärbten reinen Produkts in einer Reinheit von 95 % zu ergeben. Ausbeute: 108 mg (28 %), Reinheit: = 95 % über HPLC, Summenformel: C31H36N3O5FCl2S, Molekulargewicht: 652,62 g/mol.
Ausführungsbeispiel 4
Synthese von l-{2-[{3-[Bis-(2-chlorethyl)-amino]-benzyl}-(2-chlorbenzoyl)-amino]- acetyl}-pyrrolidin-2-carbonsäureethylester (MTA-l)
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MTA-1
In einem 10 ml Reaktionskolben wurden 4 ml trockenes DCM zu dem Dipeptid (H-m- Sarcolysyl-Pro-OEt) (600 mg, 1,40. mmol) zugegeben. Zu dieser Suspension wurde DIPEA (720 μl) zugefügt und in einem Eisbad während 10 Minuten gerührt. 2- Chlorbenzoylchlorid (Fluka Nr. 23730, 196 μl) wurde zu der Reaktionsmischung zugetropft. Die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur erwärmt und während zwei Stunden gerührt. Der Reaktionsverlauf wurde mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) verfolgt (EtOAc : Hexan 3 : 1). Nach Vervollständigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit 1 M HC1 angesäuert, mit EtOAc extrahiert, mit Wasser gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Nach Filtration und dem Abziehen des Lösungsmittels wurde das Rohprodukt erhalten, das über Silicagel-Chromatographie unter Verwendung eines Hexan : EtOAc Gradienten im Verhältnis von 4 : 1 zu 2 : 1 gereinigt wurde. Die Fraktion, die das Produkt enthielt wurde eingedampft, um 250 mg eines öligen Produkts in einer Reinheit von 90 % zu ergeben. Ausbeute: 250 mg, Reinheit: 90 % über HPLC, Summenformel: C27H32N3O4Cl3, Molekulargewicht: 568,93 g/mol.
Ausführungsbeispiel 5
Synthese von 2-[2-(2-Amino-3-{3-[bis-(2-chlorethyl)-amino]-phenyl}-propionylamino)-3- (3-hydroxyphenyl)-propionylamino]-4-methyl-pentansäure (MD 735)
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MD 735
In einem 25 ml Reaktionskolben wurden 4 ml trockenes DCM zu dem Dipeptid, (H- Tyr(Bzl)-Leu-Bzl ester) (Senn Chemicals, 500 mg, 1.09. mmol) zugefügt. Zu dieser Suspension wurde DIPEA (257 μl) zugefügt und in einem Eisbad während 10 Minuten gerührt. Boc-m-Sarcolysin (404 mg, 1.09 mmol), HOBt (147 mg, 1.09 mmol) und HBTU (413 mg, 1.09 mmol) wurden in DMF (10ml) gelöst und zu der Reaktionsmischung zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und wurde während vier Stunden gerührt. Der Reaktionsverlauf wurde mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) verfolgt (EtOAc:Hexan 1:1). Nach Vervollständigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit 1 M HC1 angesäuert, mit EtOAc extrahiert, mit Wasser gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Nach Filtration und dem Abziehen des Lösungsmittels wurde das Rohprodukt erhalten, das über Silicagel-Chromatographie unter Verwendung eines Hexan : EtOAc Gradienten im Verhältnis von 4 : 1 zu 2 : 1 gereinigt wurde. Die Fraktion, die das Produkt enthielt, wurde eingedampft, um 740 mg (80%) eines reinen Produkts in einer Reinheit von 88 % zu ergeben. Das Produkt (100 mg) wurde anschließend in Ethanol mit einem Gehalt von 43 % HCl (10 ml) 10 Stunden bei weißen Produkts in einer Reinheit von 92 % zu ergeben. Ausbeute: 56 mg (81 %), Reinheit: 92 % über HPLC, Summenformel: C28H38N4O5Cl2, Molekulargewicht: 581.54 g mol.
Ausführungsbeispiel 6
Synthese von 2'(2-{[l-(2-Amino-3-{3-[bis-(2-chlorethyl)-amino]-phenyl}-propionyl)- pyrrolidin-2-carbonyl]-amino}-3-phenyl-propionylamino)-3-(4-fluorphenyl)- propionsäureethylester (MTA-3)
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MTA-3
In einem 10 ml Reaktionskolben wurden 2 ml trockenes DMF zu dem Tripeptidethylester (Pro-Phe-Phe(F)-OEt, 105 mg, 0.23 mmol) in einem zugegeben. Zu dieser Suspension wurde DIPEA (70 μl) zugefügt und in einem Eisbad während 10 Minuten gerührt. Boc-m- Sarcolysin (93 mg, 0.23mmol) und HBTU (87 mg, 0.23 mmol) wurden in DMF (2ml) gelöst und zu der Reaktionsmischung zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und wurde während vier Stunden gerührt. Der Reaktionsverlauf wurde mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) verfolgt (EtOAc:Hexan 1:1). Nach Vervollständigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit 1 M HCl angesäuert, mit EtOAc extrahiert, mit Wasser gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Nach Filtration und dem Abziehen des Lösungsmittels wurde das Rohprodukt erhalten, das über Silicagel- Chromatographie unter Verwendung eines Hexan : EtOAc Gradienten im Verhältnis von 4 : 1 zu 2 : 1 gereinigt wurde. Die Fraktion, die das Produkt enthielt, wurde eingedampft, um 165 mg eines reinen Produkts in einer Reinheit von 95 % zu ergeben. Das Produkt wurde anschließend in Ethanol mit einem Gehalt von 43 % HCl (10 ml) 10 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, um das freie Tetrapeptid zu ergeben. Ausbeute: 120 mg (34 %), Reinheit: > 90 % über HPLC, Summenformel: C38H46NsO5Cl2F Molekulargewicht: 743,2 g/mol.
Ausführungsbeispiel 7
Synthese von 2-{3-{-[Bis-(2-chlorethyl)-amino]-phenyl}-2-[(l-phenyl-5-thiophen-3-yl- lH-pyrazole-3-carbonyl)-amino]-propionylamino}-3-(4-fluoro-phenyl)- propionsäureethylester (MTA-2)
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MTA-2
In einem 10 ml Reaktionskolben wurden 4 ml trockenes DCM zu dem Dipeptidethylester (H-m-Sarcolysyl-Phe(4F)-OEt, 300 mg, 0.6 mmol zugefügt. Zu dieser Suspension wurde DIPEA (282 μl) zugefügt und in einem Eisbad während 10 Minuten gerührt. l-Phenyl-5- thiophen-3-yl-lH-pyrazol-3-carbonsäure (synthetisiert nach G. Coispeau, J. Elguero und F. Jaquier, Bull. Soc. Chim. France (1970), p. 689 und A. Chucholowski et al., Chimia Vol. 50, p. 530 (1996)) (162 mg, O.ömmol), HBTU (228 mg, 0.6 mmol), und HOBt (81 mg, 0.6 mmol) wurden in DMF gelöst und zu der Reaktionsmischung zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und während vier Stunden gerührt. Anschließend wurde wieder DIPEA (200 μl) zugegeben. Der Reaktionsverlauf wurde mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) verfolgt (EtOAc : Hexan 1 : 1). Nach Vervollständigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit 1 M HCl angesäuert, mit EtOAc extrahiert, mit Wasser gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Nach Filtration und dem Abziehen des Lösungsmittels wurde das Rohprodukt erhalten, das mittels Silicagel-Chromatographie unter Verwendung eines Hexan : EtOAc Gradienten im Verhältnis von 4 : 1 zu 2 : 1 gereinigt wurde. Die Fraktion, die das Produkt enthielt wurde eingedampft, um 120 mg des Produkts in einer Reinheit von 95 % zu ergeben. Ausbeute: 120mg (34 %), Reinheit: > 95 % mittels HPLC, Summenformel: C38H38N4O4Cl2FS, Molekulargewicht: 736.70 g/mol.
Ausführungsbeispiel 8
Synthese von 3-{3-[bis-(2-chlorethyl(-amino]-phenyl}-2-[(l-phenyl-5-thiophen-3-yl-lH- pyrazol-3-carbonyl)-amino]-propionsäureethylester (MTA-4)
Figure imgf000026_0001
MTA-4 In einem 10 ml Reaktionskolben wurden 2 ml trockenes DCM zu m-L-Sarcolysylethylester HCl (205 mg, 0.55mmol) zugegeben. Zu dieser Suspension wurde DIPEA (374 μl) zugefügt und in einem Eisbad während 10 Minuten gerührt. l-Phenyl-5-thiophen-3-yl-lH- pyrazole-3-carbonsäure (synthetisiert nach G. Coispeau, J. Elguero und F. Jaquier, Bull. Soc. Chim. France (1970), p. 689 und A. Chucholowski et al., Chimia Vol. 50, p. 530 (1996); 150 mg, 0.55 mmol), HBTU (209mg, 0.55 mmol), HOBt (74 mg, 0.55 mmol) wurden in DMF (4ml) gelöst und zu der Reaktionsmischung zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und während vier Stunden gerührt. Anschließend wurde wieder DIPEA (100 μl) zugegeben. Der Reaktionsverlauf wurde mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) verfolgt (EtOAc : Hexan 1 : 1). Nach Vervollständigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit 1 M HCl angesäuert, mit EtOAc extrahiert, mit Wasser gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Nach Filtration und dem Abziehen des Lösungsmittels wurde das Rohprodukt erhalten, das über Silicagel- Chromatographie unter Verwendung eines Hexan : EtOAc Gradienten im Verhältnis von 4 : 1 zu 2 : 1 gereinigt wurde. Die Fraktion, die das Produkt enthielt wurde eingedampft, um 108 mg des Produkts in einer Reinheit von 97 % zu ergeben. Ausbeute: 108 mg (34 %), Reinheit: > 97 % mittels HPLC, Summenformel: C29H30N4O3C12S, Molekulargewicht: 589.65 g/mol.
Ausführungsbeispiel 9
Synthese von 2-Fluoro-benzoyl-L-m-[di-2-chlorethyl)amino]-L-phenylalanyl-p-fluoro-LX phenylalaninethylester (MD 813)
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MD 813
In einem 10 ml Reaktionskolben wurden 3 ml trockenes DCM zu dem Dipeptid (H-m- Sarcolysyl-Phe(4F)-OEt; 300 mg, 0.5 mmol) gegeben. Zu dieser Suspension wurde DIPEA
(257 μl) zugefügt und in einem Eisbad während 10 Minuten gerührt. 2-
Fluorbenzoylchlorid (Fluka Nr. 46740, 60μl) wurde zu der Reaktionsmischung zugetropft.
Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und während zwei Stunden gerührt. Der Reaktionsverlauf wurde mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) verfolgt (EtOAc : Hexan 1 : 1). Nach Vervollständigung der Reaktion wurde die
Reaktionsmischung mit 1 M HCl angesäuert, mit EtOAc extrahiert, mit Wasser gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Nach Filtration und dem Abziehen des Lösungsmittels wurde das Rohprodukt erhalten, das über Silicagel-Chromatographie unter Verwendung eines
Hexan : EtOAc Gradienten im Verhältnis von 4 :1 zu 2 :1 gereinigt wurde. Die Fraktion, die das Produkt enthielt wurde eingedampft, um 120 mg des reinen Produkts in einer Reinheit von 92 % zu ergeben. Ausbeute: 120 mg (38 %), Reinheit: > 92 % bei HPLC, Summenformel: C31H33N3O4Cl2F2 , Molekulargewicht: 620.5 g/mol.
Ausführungsbeispiel 10
Synthese von 2-Chlorbenzoyl-L-m-[di-2-chlorethyl)amino]-L-phenylalanyl-p-fluoro-L- phenylalaninethylester (MD 818)
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MD 818
In einem 10 ml Reaktionskolben wurden 3 ml trockenes DCM zu dem Dipeptid (H-m- Sarcolysyl-Phe(4F)-OEt; 300 mg, 0.6 mmol) gegeben. Zu dieser Suspension wurde DIPEA (257 μl) zugefügt und in einem Eisbad während 10 Minuten gerührt. 2- Chlorbenzoylchlorid (Fluka Nr. 23730, 58 μl) wurde zu der Reaktionsmischung zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und während zwei Stunden gerührt. Der Reaktionsverlauf wurde mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) verfolgt (EtOAc:Hexan 1:1). Nach Vervollständigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit 1 M HCl angesäuert, mit EtOAc extrahiert, mit Wasser gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Nach Filtration und dem Abziehen des Lösungsmittels wurde das Rohprodukt erhalten, das über Silicagel-Chromatographie unter Verwendung eines Hexan : EtOAc Gradienten im Verhältnis von 4 : 1 zu 2 : 1 gereinigt wurde. Die Fraktion, die das Produkt enthielt wurde eingedampft, um 145 mg des reinen Produkts in einer Reinheit von 97 % zu ergeben. Ausbeute: 145 mg (38 %), Reinheit: > 97 % über HPLC, Summenformel: C31H33N3O4Cl3F, Molekulargewicht: 637.0 g/mol.
Ausführungsbeispiel 11
Synthese von 2-{3-{-[Bis-(2-chlorethyl)-amino]-phenyl}-2-[(3H-l-δ-4-thiophene-3- carbonyl)-amino]-propionylamino}-3-(4-fluoro-phenyl)-propionsäureethylester (MD 814)
Figure imgf000030_0001
MD 814
In einem 10 ml Reaktionskolben wurden 3 ml trockenes DCM zu dem Dipeptid (H-m- Sarcolysyl-Phe(4F)-OEt; 300 mg, 0.5 mmol) gegeben. Zu dieser Suspension wurde DIPEA (257 μl) zugefügt und in einem Eisbad während 10 Minuten gerührt. Thiophen-2- acetylchlorid (Fluka Nr. 88973, 81 μl) wurde zu der Reaktionsmischung zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und während zwei Stunden gerührt. Der Reaktionsverlauf wurde mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) verfolgt (EtOAc: Hexan 1:1). Nach Vervollständigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit 1 M HCl angesäuert, mit EtOAc extrahiert, mit Wasser gewaschen und über MgSO4. getrocknet. Nach Filtration und dem Abziehen des Lösungsmittels wurde das Rohprodukt erhalten, das über Silicagel-Chromatographie unter Verwendung eines Hexan : EtOAc Gradienten im Verhältnis von 4 : 1 zu 2 : 1 gereinigt wurde. Die Fraktion, die das Produkt enthielt wurde eingedampft, um 138 mg des reinen Produkts in einer Reinheit von 97 % zu ergeben. Ausbeute: 138 mg (38 %), Reinheit: > 97 % über HPLC, Summenformel: C30H34N3O4C12FS, Molekulargewicht: 622.56 g/mol.
Ausführungsbeispiel 12
Synthese von 3-{[Bis-(2-chlorethyl)-amino]phenyl}-2-{3-(4H-imidazol-4-yl)-2-[(5-oxo- pyrrolidine-2-carbonyl)-amino]-propionylamino}-propionsäureethylester (MK 222-3)
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MK 222-3
In einem 10 ml Reaktionskolben wurden 2 ml trockenes DCM zu dem m-L- Sarcolysylethylester (100 mg, 0.233mmol) gegeben. Zu dieser Suspension wurde DIPEA (118 mg) zugefügt und in einem Eisbad während 10 Minuten gerührt. Z-Pyr-His-OH (Senn Chemicals, 86 mg, 0.233 mmol), TBTU (75 mg, 0.233 mmol), wurden in DMF (4ml) gelöst und zu der Reaktionsmischung zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und während fünf Stunden gerührt. Anschließend wurde erneut DIPEA (100 μl ) zugegeben. Der Reaktionsverlauf wurde mittels Dünnschichtchromato- graphie (TLC) verfolgt (EtOAc : Hexan 1 : 1). Nach Vervollständigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit 1 M HCl angesäuert, mit EtOAc extrahiert, mit Wasser gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Nach Filtration und dem Abziehen des Lösungsmittels wurde das Rohprodukt erhalten, das über Silicagel-Chromatographie unter Verwendung eines Hexan : EtOAc Gradienten im Verhältnis von 4 : 1 zu 2 : 1 gereinigt wurde. Die Fraktion, die das Produkt enthielt wurde eingedampft, um 55 mg des reinen Produkts in einer Reinheit von 97 % zu ergeben. Das leicht gelbliche Produkt wurde mit 5% Pd/C in Ethanol mit 1% HCl hydriert und ergab das gewünschte Produkt. Ausbeute: 40 mg, Reinheit: > 95 % by HPLC, Summenformel: C26H34Cl2N6O5 , Molekulargewicht: 581.495 g mol.
Ausführungsbeispiel 13
Synthese von 2-Nürophenyl-furoyl-L-m-[di-2-chlorethyl)amino]-L-phenylalanyl- ethylester (MK220-2)
Figure imgf000032_0001
MK 220-2 In einem 10 ml Reaktionskolben wurden 2 ml trockenes DCM zu m-L-Sarcolysylethylester (110 mg, 0.298 mmol) gegeben. Zu dieser Suspension wurde DIPEA (154 μl) zugefügt und in einem Eisbad während 10 Minuten gerührt. 2-Nitrophenyl-furoylchlorid (75mg, 0.298 mmol) wurde zu der Reaktionsmischung zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur erwärmt lassen und während zwei Stunden gerührt. Der Reaktionsverlauf wurde mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) verfolgt (EtOAc:Hexan 1:1). Nach Vervollständigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit 1 M HCl angesäuert, mit EtOAc extrahiert, mit Wasser gewaschen und über MgSO4. getrocknet. Nach Filtration und dem Abziehen des Lösungsmittels wurde das Rohprodukt erhalten, das über Silicagel-Chromatographie unter Verwendung eines Hexan : EtOAc Gradienten im Verhältnis von 4 : 1 zu 2 : 1 gereinigt wurde. Die Fraktion, die das Produkt enthielt wurde eingedampft, um 54 mg des reinen Produkts in einer Reinheit von 94 % zu ergeben. Ausbeute: 54 mg (77 %), Reinheit: > 94 % über HPLC, Summenformel: C26H27N3O6Cl2 , Molekulargewicht: 548.43 g/mol.
Ausführungsbeispiel 14
Synthese von 2-(3-{3-[Bis-(2-chlorethyl)-amino]-phenyl}-2-hexadecanoylamino- propionylamino)-3-(4-fluoro-phenyl)-propionsäureethylester (MK245):
Figure imgf000033_0001
MK 245
Verwendete Reagenzien:
H-m-Sarcolysyl-Phe(4F)-OEt (I): 0,2 mmol 100 mg, Palmitoyl-Osu (II): 0,2 mmol 71 mg, K2CO3 (in) : 0,6 mmol 83 mg, DMF: 3 ml.
In einem trockenen Reaktionskolben werden 100 mg (I) und 71 mg (II) in 3 ml DMF bei Raumtemperatur gelöst. Nach Zugabe von 83 mg (III), wurde der Reaktionskolben unter
Stickstoff verschlossen und bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Nach Extraktion mit
H2O und MTBE, wurde die organische Phase über MgSO4 getrocknet und das
Lösungsmittel abgezogen. Die Aufreinigung erfolgte mittels Silicagel- Chromatographie
(Hexan/MTBE 2:1) und ergab 70 mg eines gelblichen Pulvers. Dieses wurde in MeCN/MeOH gelöst und mit H2O ausgefällt. Ausbeute: 60 mg (41%) eines weißen
Pulvers in einer Reinheit von 86% (bestimmt über HPLC). (Um eine höhere Reinheit zu erhalten, sollte die Silicagel Chromatographie mit einem Hexan/MTBE Gradienten von 5:1
→ 2:1 durchgeführt werden). Ausbeute: 60 mg (77 %), Reinheit: > 86 % über HPLC,
Summenformel:
Figure imgf000034_0001
Molekulargewicht: 736.84 g/mol.
Ausführungsbeispiel 15
Synthese von 2-[3-{3-[Bis-(2-chlorethyl)-amino]-phenyl}-2-(2-hexadecanoylamino- acetylamino)-propionylamino]-3-(4-fluoro-phenyl)-propionsäureethylester (MK246):
Figure imgf000035_0001
MK 246
Verwendete Reagenzien:
H-m-Sarcolysyl-Phe(4F)-OEt (I): 0,2 mmol, 100 mg, Palmitoyl- Gly-OH (II): 70 mg K2CO3 (in): 0,6 mmol, 83 mg, HBTU: 0,2 mmol 76 mg, HOBT: 0,2 mmol, 27 mg, DMF, 4 ml, DCM: 2 ml
In einem trockenen Reaktionskolben werden 100 mg (I) in 4 ml DMF bei Raumtemperatur gelöst und 76 mg (IV) sowie 27 mg HOBt zugegeben. 70 mg (II) wurden zugegeben und mithilfe von 2 ml DCM gelöst. Nach Zugabe von 83 mg (III), wurde der Reaktionskolben unter Stickstoff verschlossen und bei Raumtemperatur über Nacht gerührt (nach 10 min Reaktionszeit wurde die Lösung klar). Nach Extraktion mit H2O und MTBE, wurde die organische Phase über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel abgezogen. Die Aufreinigung erfolgte mittels Silicagel-Chromatographie (Hexan/MTBE 2:1) und ergab 70 mg eines gelblichen Pulvers. Ausbeute: 70 mg (77 %), Reinheit: > 86 % über HPLC, Summenformel: C42H63N4O5Cl2F, Molekulargewicht: 793.89 g/mol. Ausführungsbeispiel 16
Toxizitätstest:
Die Verbindungen der vorstehenden Ausführungsbeispiele 1-15 wurden auf ihre Toxizität und Verträglichkeit gegenüber Säugetieren bei einer Testpopulation von Mäusen getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengestellt:
Melphalan (MPH) und die sechs MTA Derivate wurden wie vorstehend erläutert synthetisiert.
MPH und die sechs erfindungsgemäßen MTA Verbindungen wurden in DMSO bei einer Konzentration von 20 mg base Verbindung/Milliliter gelöst und auf das Zehnfache mit Wasser unmittelbar vor der Injektion in die Mäuse verdünnt.
Testpopulation:
Es wurden 48 gesunde weibliche DBA/2 Mäuse im Alter von 5 - 6 Wochen mit einem Gewicht von 17 - 21 g von Harlan (Garnac, Frankreich) erhalten. Vor der Behandlung wurden die Tiere sieben Tage in spezifischen pathogenfreien Käfigen gehalten.
Die Testtiere wurden in Räumen bei einer Temperatur von 23 ± 2°C, einer Feuchtigkeit von 45 ± 5% und einer Tag-/Nachtperiode von 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkelheit und Luftaustausch gehalten. Die Haltung und Ernährung der Tiere erfolgte gemäß den geseetzlichen Vorschriften über die Durchführung von Tierexperimenten.
Durchführung des Experiments und Behandlungen:
1. Toxizitätsstudien von MPH und den sechs MTA Derivaten bei gesunden DBA/2 Mäusen.
Die Bestimmung des MTD bei intravenöser Verabreichung erfolgte in zwei Schritten:
Schritt 1:
Zwei gesunde DBA/2 Mäuse/Dosiswerte wurden der Behandlung beim Tag 0 (DO) unterzogen. Diese Behandlung bestand aus einer einzigen intravenösen Injektion von MPH, MPH Biokonjugaten und den sechs erfindungsgemäßen MTA Derivaten bei einer Dosis von HSD, HSD/1,5 und HSD/2 mg base Sys/kg. Die Überlebensrate der Mäuse am 21. Tag (D21) war das Ende des Experiments. Die Tiere wurden vor der Behandlung und 24 Stunden danach gewogen. Falls die Mäuse schnell nach der Injektion starben oder wenn sie mehr als 25% ihres Körpergewichts (< 24 h) verloren, wurde die Dosis halbiert und zweimal innerhalb eines 3-Stunden Intervalls injiziert. Wenn die Mäuse wiederum nach 24 Stunden starben, wurde die Dosis gemäß dem gleichen Verfahren erniedrigt.
Schritt 2:
Dieser Schritt hing von den Resultaten, die in Schritt 1 erhalten wurden, ab:
Wenn keine der getesteten Dosierungen letal war, sollte das HSD für in vivo Antitumorexperimente verwendet werden.
Falls das HSD allein oder HSD/1,5 letal waren und HSD/2 nicht letal war:
Zwei DBA/2 Mäuse pro Dosiswert erhielten die Behandlung am Tag 0. Diese Behandlung bestand aus einer einzigen intravenösen Injektion der Testsubstanz von einem bis drei Dosiswerten zwischen der letalen und der nicht-letalen Dosis. Die Bestimmung der Überlebensfähigkeit der Mäuse am 21. Tag war der Schluss des Experiments.
Wenn auch HSD/2 letal war, erfolgte eine Verminderung der Dosis gemäß dem vorstehend beschriebenen Weg, eine letale Dosis zu finden.
Die Mäuse wurden zweimal wöchentlich während 21 Tagen nach der letzten Injektion beobachtet. Körpergewicht und das Überleben wurden registriert, ein 30% Verlust des Körpergewichts und/oder Tod wurden als das ausschlaggebende Kriterium in Bezug auf Toxizität betrachtet. 2. Ergebnisse:
Toxizitätsstudie von MPH und den sechs MTA Derivaten in gesunden DBA/2 Mäusen:
Für sämtliche getesteten Verbindungen entsprachen die HSD, HSD/1,5 und HSD/2 Werte 16,0, 10,67 und 8,0 mg base MPH/kg.
Eine Maus starb am 9. Tag nach einer einzigen intravenösen Injektion von MPH bei 16,00 mg base/kg. In den anderen behandelten Gruppen starb keine Maus.
Eine große Abnahme des Körpergewichts von gesunden DBA/2 Mäusen, die intravenös mit MPH bei 16,00 mg base/kg auf HSD behandelt wurden, wurde zwischen dem 1. und 6. Tag beobachtet, verglichen mit der Gruppe, die mit Wasser verdünnte Verbindungen erhielt (Wasser PPI) mit -8,10 ± 3,46%, was den Tod einer Maus am 9. Tag hervorrief. Kein Verlust an Körpergewicht wurde bei gesunden DBA/2 Mäusen, die intravenös mit MPH mit Gehalten von 10,67 und 8,00 mg base/kg (HSD/1,5 und HSD/2) zwischen dem 1. und 6., dem 1. und 13. sowie dem 1. und 27. Tag behandelt wurden.
Kein Körpergewichtsverlust bei gesunden DBA/2 Mäusen, die intravenös mit den sechs MTA Derivaten mit 16,00, 10,67 und 8,00 mg base/kg (HSD, HSD/1,5 und HSD/2) behandelt wurden, wurde zwischen dem 1. und 6., dem 1. und 13. sowie dem 1. und 27. Tag beobachtet.
MPH, das intravenös mit einem Wert von 16,0 mg base/kg injiziert wurde, wurde von gesunden DBA/2 Mäusen nicht toleriert, aber MPH, was intravenös bei 10,67 und 8,00 mg base/kg injiziert wurde, wurde gut vertragen. Das MTDiv von MPH beträgt zwischen 10,67 und 16,00 mg base/kg. Die sechs MTA Derivate (MTAl - MTA6), die intravenös bei 16,00, 10,67 und 8,99 mg base/kg injiziert wurden, wurden von gesunden DBA/2 gut vertragen.
Tabelle 2: Toxizitätstest erfindungsgemäßer chemischer Verbindungen:
Figure imgf000041_0001
Behandlungsdosen:
Die MTD von MPH und den sechs MPH Derivaten bei intravenöser (iN) Verabreichung über die IV Route wurde gemäß dem nachstehenden Verabreichungsprotokoll bestimmt. Die Dosismengen der Testsubstanzen sind in mg base/kg angegeben. Den Mäuse wurde eine einzige IV Injektion (single iV Injection) von MPH und den sechs MTA Verbindungen der allgemeinen Formel (I), (3 Dosierungsmengen in mg base/kg, 2 Mäuse/Gruppe): HSD, HSD/1.5, HSD/2 bis zu 8 ml/kg der Trägerlösung (IV Injizierung von 0.2 ml für eine Maus mit 25g) verabreicht.
Figure imgf000042_0001
Die Testsubstanzen wurden intravenös (IV) über die Schwanzvene in gesunde DBA/2 Mäuse injiziert. Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, sind die erfindungsgemäßen Verbindungen auch bei längerer intravenöser Verabreichung nur gering toxisch.
Ausführungsbeispiel 17
Weitere Cytotoxitiäts-Studien wurden unter Verwendung von KB-Zellen durchgeführt.
Die Cytotoxizität der erfindungsgemäßen Verbindungen wurde ebenfalls unter Verwendung der KB-Zelllinie (ATCC CCL 17) bestimmt [Swanson, S.M., & Pezzuto, J.M. In Drug Bioscreening. Drug Evaluation Techniques in Pharmacology; Thompson, E.B. Ed.; VCH: New York, Weinheim, Cambridge, 1990; pp 273-297]. Die Tests wurden mittels Screening Technik in Mikrotiterplättchen mit 96 Vertiefungen (Falcon) unter Zugabe von 2,5 x 10 -Zellen/Milliliter pro Vertiefung. Die Testlösungen wurden als Voratslösungen im DMA- Wasser hergestellt. Die Testkonzentrationen wurden frisch hergestellt unter Verdünnung der Vorratslösung mit Wasser bis hin zur erforderlichen Konzentration. Die End-DMA-Konzentration betrug 1 % oder weniger bezogen auf das Volumen. Das Volumen betrug 150 μl. Zur Quantifizierung der Cytotoxizität, wurden 15 μl einer wässrigen Lösung von Methyl-Thiazonyl-Tetrazoliumchlorid (MTT, Firma Fluka 5 mg/ml im PBS) nach 72 Stunden zugegeben). Während der Inkubation bei 37 °C über vier Stunden, metabolisierten die überlebenden Zellen MTT in einen unlöslichen Formazan-Farbstoff. Das Kulturmedium wurde entfernt und der Formazan-Farbstoff wurde aufgelöst unter Verwendung von 150 μl einer 10%igen SDS (Natriumdodekylsulfat)- Lösung in Wasser. Nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden bei Raumtemperatur, wurde die optische Dichte bei 540 nm gemessen unter Verwendung eines Mikroplättchen-Lesers (MRX Dynex Technologies, Emrach, Schweiz). Zur Bestimmung der IC50- Werte, wurde die optische Dichte gegenüber der logarithmischen Konzentration aufgetragen und sechs verschiedene Konzentrationen wurden getestet. Jeder Test wurde wenigstens zweifach durchgeführt und sämtliche Experimente wurden zweimal wiederholt. Die beobachtete maximale Standardabweichung betrug 20 % (in Absolutwerten). Positive Kontrollmessungen wurden ebenfalls durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefasst.
Figure imgf000044_0002
Figure imgf000044_0001
r fB
ES (t> ω π o o
N
ST n sr
Figure imgf000045_0002
Figure imgf000045_0001
Die Strukturen der in Tabelle 3 angeführten getesteten erfindungsgemäßen Nerbindungen sind in nachstehender Tabelle 4 noch einmal aufgeführt.
Tabelle 4: Strukturformeln der Verbindungen aus Tabelle 2
Figure imgf000046_0001
Wie aus Tabelle 4 ersichtlich ist sind die besten Nerbindungen Guanidyl-PSF-OEt, MK 1494-2, MK 246 und MD 818. Die Einfügung des Guanidyl-, 3-Νitroρhenylfuroyl-, Palmitoyl- bzw. 2-Chlorobenzoyl-Substituenten erhöht die Zytotoxizität und die Selektivität.
Ausführungsbeispiel 18
Unter denselben Testbedingungen wie im Ausführungsbeispiel 16 beschrieben wurden erfindungsgemäße Nerbindungen auch zur Behandlung von Tumoren, insbesondere von Lymphtumoren an Hunden der Rasse deutscher Schäferhund in Bezug auf Ihre Cytotoxizität getestet.
Vor der Therapie mit der erfindungsgemäßen Verbindung Guanidyl-PSF-OEt wurden die drei Tiere über einen Zeitraum von 18 beziehungsweise im Falle des zweiten Tiers über 19 Monate hinweg mit jeweils Espor, Winchristin, Cyclophasphomit, Doxorubicin, Chloroambozil, Mitroterat und Aktinomyzin behandelt.
Dabei wurde festgestellt, dass das Volumen der Tumore jeweils zunahm und eines der Versuchstiere nach zwei Monaten starb.
Den verbleibenden beiden Hunden wurde nach 18 beziehungsweise 19 Monaten der vorhergehenden Chemotherapie die Substanz Guanidyl-PSF-OEt in folgenden Dosen pro Kilo Gewicht zugeben:
1. Tier: 2 x 0,4 mg, anschließend 2 x 0,6 mg
2. Tier: 2 x 0,4 mg, 2x 0,6 mg.
Schon nach ca. 1 Monat wurde eine Abnahme des Tumorvolumens von 20 % beobachtet. Im Gegensatz zu der vorherigen Chemotherapie, bei der Übergeben, Gewichtsverlust und Blutvergiftung auftrat, wurden mit der Substanz Guanidyl-PSF-OEt keine unerwünschten Nebeneffekte beobachtet.
Trotz der mittlerweile angeschwollenen Tumore durch die vorgehende wirkungslose Chemotherapie, erhöhte sich die Überlebensdauer der Testtiere um drei beziehungsweise sechs Monate.
Auch diese Studie zeigt, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen gegenüber Lymphknotenkrebs äußerst wirksam sind und weniger toxisch als die in bislang verwendeten Chemotherapien eingesetzten Verbindungen. Darüber hinaus führt der Einsatz der erfindungsgemäßen Verbindung zu einer signifikanten Reduktion des Volumen des behandelten Tumors.

Claims

PATENT ANSPRÜCHE
1. Chemische Verbindung der allgemeinen Formel (I)
Figure imgf000049_0001
(I)
, wobei
R1 und R2 gleich oder verschieden sind,
wobei im Falle, daß R1 und R2 gleich sind, R1 und R2 ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, substituiertem Benzoyl-, substituierten und unsubstituierten Alkyl, Aryl, Aralkyl, Sulfoxy, aliphatischen und heteroaromatischen Acyl, wobei der Grundkörper des aliphatischen Restes 1 bis 16 Kohlenstoffatome enthält, sowie einem N-substituierten oder unsubstituierten Aminosäurerest und/oder einem Derivat davon, oder dass NR1R 2 ein Carbamat, Hydrazin, Hydrazon-, Hydroxam- und Harnsäurederivat ist.
und im Falle, daß R1 und R2 verschieden sind, R1 und/oder R2 ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, substituiertem Benzoyl-, substituierten und unsubstituierten Benzyl, Sulfoxy, aliphatischen und heteroaromatischen Acyl, wobei der Grundkörper des aliphatischen Acyl-Restes 1 bis 16 Kohlenstoffatome enthält, sowie einem N-substituierten oder unsubstituierten Aminosäurerest oder einem Derivat davon, oder dass NR1R2ein Carbamat, Hydrazin, Hydrazon-, Hydroxam- und Harnsäurederivat ist.
R3 ein Aminosaurerest oder in Aminosäureesterrest ist, ein - C12 Alkyletherrest, insbesondere Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl und deren verzeigte Isomere oder ein (Poly)peptidrest bzw. deren substituierte oder teilweise substituierten Derivate ist,
sowie die physiologisch verträglichen Salze dieser Verbindungen.
2. Chemische Verbindung nach Anspruch 1, wobei R1 H ist und R2 ausgewählt ist aus:
einem substituiertem Benzoyl-, substituierten oder unsubstituierten Sulfoxyl-, einen heteroaromatischen und/oder aliphatischen Acylrest wobei der Grundkörper des aliphatischen Acyl-Restes 1 bis 16 Kohlenstoff atome enthält, sowie einem N- substituierten Aminosäurerest und/oder ein Derivat davon, insbesondere ein Aminosäureesterrest und wobei der heteroraromatische Acylrest ein N, S oder O Atom enthält.
3. Chemische Verbindung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei R1 H ist, R2 ein Guanidyl-Rest oder ein Derivat davon ist und R3 einen para- Fluorophenylalaminalkylester bedeutet, wobei der Alkylester ein bis C12 Alkylester, insbesondere ein Methyl, Ethyl, Propyl, Butylester, ist.
4. Verfahren zur Herstellung einer chemischen Verbindung der allgemeinen Formel 1 umfassend den folgenden Schritt:
Reaktion eines (Poly)peptids der allgemeinen Formel L-m-Sarcolysyl-(Polypeptid) mit einer Verbindung umfassend eine Carbonsäure, ein Carbonsäurederivat, eine N- substituierte Aminosäure, eine Sulfonsäure, ein Sulfonsäurederivat, einem Alkyl-, Aryl- oder Aralkylhalogenid.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei im Falle der Reaktion des (Poly)peptids mit einer Carbonsäure, einer N-substituierten Aminosäure oder einer Sulfonsäure ein Aktivierungsmittel vor der Reaktion zugegeben wird.
6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei die Reaktion in einem wasserfreien Lösungsmittel durchgeführt wird.
7 . Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei das Verfahren als parallelisierbares Verfahren durchgeführt wird.
8. Pharmazeutische Formulierung umfassend eine Verbindung der allgemeinen Formel (I).
9 . Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 8, weiter umfassend einen pharmakologisch aktiven Wirkstoff.
10. Verbindung der allgemeinen Formel (I) zur Behandlung von Tumoren.
1 1.Verwendung der Verbindung der allgemeinen Formel (I) zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Tumoren.
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