DE69528531T2

DE69528531T2 - D-2-alkyltryptophan enthaltende polypeptide mit wachstumhormon freisetzender aktivitaet

Info

Publication number: DE69528531T2
Application number: DE69528531T
Authority: DE
Inventors: Edinburgh Eh2 3Ns Ardana Bioscience Limited
Original assignee: Ardana Bioscience Ltd
Current assignee: Ardana Bioscience Ltd
Priority date: 1994-09-27
Filing date: 1995-09-13
Publication date: 2003-06-05
Anticipated expiration: 2015-09-14
Also published as: IL115381A0; CN1121413C; ES2186730T3; IL115381A; CZ91497A3; KR100369105B1; JPH10506114A; SK39997A3; EP0783521A1; RU2157378C2; JP3810083B2; AU700066B2; HUT77525A; ATE225806T1; PL181588B1; DE69528531D1; AU3566895A; SK284550B6; US5795957A; CZ291798B6

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Oligopeptidverbindungen, die eine D-2-Alkyltryptophan-aminosäure enthalten und die Wachstumshormon (GH) aus Somatotropen freisetzen können und die auf oralem Wege wirksam sind.

Hintergrund der Erfindung

Die Zunahme der Wachstumshormon(GH)-Spiegel bei Säugetieren nach der Verabreichung von Verbindungen, die eine GH-Freisetzung induzieren, kann zu einer Wachstumsbeschleunigung und Zunahme der Muskelmasse und einer erhöhten Milchproduktion führen, wenn ausreichend hohe GH-Spiegel nach der Verabreichung erhalten werden. Außerdem ist bekannt, dass die Zunahme der Wachstumshormonspiegel bei Säugetieren durch Verabreichen bekannter Mittel zur Freisetzung von Wachstumshormon, wie Growth Hormone Release Hormones (GHRH), erreicht werden kann.
Die Zunahme der Wachstumshormonspiegel bei Säugetieren kann auch durch das Verabreichen von Wachstumshormonfreisetzungspeptiden, von denen einige bereits beschrieben sind, beispielsweise in US 4 223 019, US 4 223 020, US 4 223 021, US 4 224 316, US 4 226 857, US 4 228 155, US 4 228 156, US 4 228 157, US 4 228 158, US 4 410 512, US 4 410 513, US 4 411 890 und 4 839 344 erreicht werden.
Daher werden derzeit ziemlich einfache kurzkettige Polypeptide, die die Freisetzung von Wachstumshormon fördern können, unter der Bedingung, dass sie problemlos und günstig hergestellt werden können, sowie problemlos gereinigt und formuliert werden können und bei Verabreichung auf oralem Wege wirksam sind, gewünscht.
Eines der stärker untersuchten Wachstumshormonfreisetzungspeptide (GHRP) ist seit vielen Jahren als GHRP-6 bekannt (C. Y. Bowers et al., Endocrinology 114: 1537 (1984)) und es besitzt die Formel His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH&sub2;. GHRP-6 setzt Wachstumshormon in vitro und in vivo frei und es ist bei Tieren und bei Menschen oral wirksam. Dessen molekularer Mechanismus sowie der von dessen analogem Heptapeptid GHRP-1 wurde untersucht (Cheng et al., Endocrinology 124: 2791)1989), M. S. Akman et al., Endocrinology 132: 1286 (1993)). Es wurde ermittelt, dass im Gegensatz zu natürlich vorkommendem GHRH diese Peptide über unterschiedliche Rezeptoren für die Freisetzung von GH und über einen unterschiedlichen Mechanismus, der von cAMP unabhängig ist und über andere intrazelluläre Pfade, wie die Mobilisierung von Calciumspeichern und ein Proteinkinase-C(PKC)-abhängiges Verfahren läuft, wirken (L. Bresson-Bépoldin und L. Dufy- Barbe, Cell. Calcium 15, 247 (1994)).

Zusammenfassung der Erfindung

Auf vollkommen überraschende Weise wurde nun ermittelt, dass die Einführung eines D-2-Alkyltryptophan (2-Mrp) in das Oligopeptid der GHRP-Reihe den bekannten intrazellulären Mechanismus der GH-Freisetzung modifiziert. In einigen Fällen wurde eine wesentliche Zunahme der Aktivität der Adenylcyclase im Hypophysevorderlappen sowohl murinen Ursprungs als auch humanen Ursprungs bewiesen, doch ist der spezielle Mechanismus noch vollständig aufzuklären.
Daher ist die Modifikation, die durch eine einzige Alkylgruppe an der 2-Position von Tryptophan (in dessen D- Konformation) gegeben ist, neben einer günstigen Erhöhung der Stabilität des Trp-Rests (R. Deghenghi WO 91/18016, veröffentlicht am 28.11.1991 und R. Deghenghi et al., Life Sciences 54, 1321 (1994) für eine vollständig unerwartete Veränderung der intrazellulären Mechanismen verantwortlich, die nun von Calcium unabhängig, manchmal von Adenylcyclase abhängig sind und ähnlicher denen von GHRH sowie anderen Peptidhormonen sind. (James D. Wason et al., Molecular Biology of the Gene, 4. Auflage, The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., Menlo Park, California, 1987, S. 60).
Ein weiteres unerwartetes charakteristisches Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die sehr hohe Wirksamkeit einiger Penta-, Hexa- und Heptapeptide und das günstige Verhältnis orale Aktivität/Wirksamkeit auch der kleineren Tetrapeptide der Reihe.
Die Oligopeptide der vorliegenden Erfindung sind ausgewählt aus der Gruppe von:
IMA-D-Mrp-D-Trp-Phe-LysNH&sub2;,
IMA-D-Mrp-D-β-Nal-Phe-LysNH&sub2;,
INIP-D-Mrp-D-Trp-Phe-LysNH&sub2;,
INIP-D-Mrp-D-β-Nal-Phe-LysNH&sub2;,
GAB-D-Mrp-D-Trp-Phe-LysNH&sub2;,
GAB-D-Mrp-D-β-Nal-Phe-LysNH&sub2;,
GAB-D-Mrp-D-β-Nal-NH&sub2;,
GAB-D-Mrp-D-β-Nal-OC&sub2;H&sub5;,
4-(Aminomethyl)cyclohexancarbonyl-D-Mrp-D-Trp-Phe-LysNH&sub2;,
4-(Aminomethyl)cyclohexancarbonyl-D-Mrp-D-β-Nal-Phe-LysNH&sub2;,
Imidazolacetyl-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-LysNH&sub2;,
D-Ala-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-LysNH&sub2;,
D-Thr-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-LysNH&sub2;,
His-D-Mrp-Ala-TrpNH&sub2;,
D-Thr-D-Mrp-Ala-TrpNH&sub2;,
His-D-Mrp-Ala-Phe-D-Trp-LysNH&sub2;,
D-Thr-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-D-ThrNH&sub2;,
D-Thr-His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-LysNH&sub2;,
His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-ThrNH&sub2;,
His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-D-ThrNH&sub2;,
und deren Additionssalzen mit pharmazeutisch akzeptablen organischen oder anorganischen Säuren, wobei Mrp 2-(C&sub1;-C&sub3;)- Alkyltryptophan ist, und
Gly = Glycin
Tyr = L-Tyrosin
Ile = L-Isoleucin
Glu = L-Glutaminsäure
Thr = L-Threonin
Phe = L-Phenylalanin
Ala = L-Alanin
Lys = L-Lysin
Asp = L-Asparginsäure
Cys = L-Cystein
Arg = L-Arginin
Gln = L-Glutamin
Pro = L-Prolin
Leu = L-Leucin
Met = L-Methionin
Ser = L-Serin
Asn = L-Asparagin
His = L-Histidin
Trp = L-Tryptophan
Val = L-Valin
Ferner gilt
D-β-Nal = D-β-Napthylalanin,
INIP = Isonipecotyl,
IMA = Imidazolylacetyl,
GAB 4-Aminobutyryl,
Mrp = 2-Alkyltryptophan.
Gemäß der vorliegenden Erfindung soll Alkyl Niederalkyl, das 1-3 Kohlenstoffatome umfasst, sein. Beispiele für Niederalkyl sind Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl. Von diesen ist die Methylgruppe bevorzugt.
Alle Drei-Buchstaben-Abkürzungen der Aminosäuren, denen ein "D" voransteht, geben die D-Konfiguration des Aminosäurerests an.
Diese Verbindungen können parenteral, jedoch bequemer intranasal und oral verabreicht werden oder sie können in Systemen mit gesteuerter Freisetzung, wie biologisch abbaubaren Mikrokapseln, Mikrokügelchen, subkutanen Implantaten u. dgl. formuliert werden.
Die Polypeptidverbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung können gemäß den üblichen Verfahren der Peptidchemie, sowohl in fester Phase als auch in Lösung, oder mittels einschlägig bekannter klassischer Verfahren synthetisiert werden. Die Festphasensynthese beginnt am C-termialen Ende des Peptids. Ein geeignetes Startmaterial kann durch beispielsweise Binden der erforderlichen geschützten α- Aminosäure an ein chlormethyliertes Harz, ein hydroxymethyliertes Harz, ein Benzhydrylaminharz (BHA) oder ein p-Methylbenzhydrylaminharz (p-Me-BHA) hergestellt werden. Beispielsweise wird ein chlormethyliertes Harz mit der Handelsbezeichnung BIOBEADS® SX 1 von BioRad Laboratories, Richmond, California, vertrieben. Die Herstellung des Hydroxymethylharzes ist bei Bodansky et al., Chem. Ind. (London) 38, 15997 (1966) beschrieben. Das BHA-Harz ist bei Pietta und Marshall, Chem. Co mm., 650 (1970) beschrieben und bei Peninsula Laboratories Inc., Belmont, California, im Handel erhältlich.
Nach der Bindung am Anfang kann die Schutzgruppe der α-Aminosäure mittels unterschiedlicher saurer Reagenzien, die in organischen Lösemitteln bei Raumtemperatur gelöste Trifluoressigsäure (TFA) oder Salzsäure (HCl) umfassen, entfernt werden. Nach dem Entfernen der Schutzgruppe der α-Aminosäure können die übrigen geschützten Aminosäuren Schritt für Schritt in der gewünschten Reihenfolge gekoppelt werden. Jede geschützte Aminosäure kann in einem Überschuss von etwa der dreifachen Menge unter Verwendung einer geeigneten carboxylaktivierenden Gruppe, wie Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) oder Diisopropylcarbodiimid (DIC), die beispielsweise in Methylenchlorid (CH&sub2;Cl&sub2;) oder Dimethylformamid (DMF) und deren Gemischen gelöst sind, umgesetzt werden. Nach der Fertigstellung der gewünschten Aminosäuresequenz kann das gewünschte Peptid von dem Trägerharz durch Behandlung mit einem Reagens, wie Fluorwasserstoff (HF), das nicht nur das Peptid vom Harz, sondern auch die üblicheren Schutzgruppen von den Seitenketten abspaltet. Wenn ein chlormethyliertes Harz oder ein hydroxymethyliertes Harz verwendet wird, führt die Behandlung mit HF zur Bildung des sauren Peptids in freier Form. Wenn ein BHA- oder p-Me-BHA-Harz verwendet wird, führt die Behandlung mit HF direkt zur Bildung des Amidpeptids in freier Form.
Das im vorhergehenden diskutierte Festphasenverfahren ist einschlägig bekannt und wurde bei Atherton und Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis (IRL Press, Oxford, 1989) beschrieben.
Einige Verfahren in Lösung, die zur Synthese der Peptideinheiten der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind detailliert bei Bodansky et al., Peptide Synthesis, 2. Auflage, John Wiley & Sons, New York, N. Y. 1976 und bei Jones, The Chemical Synthesis of Peptides (Clarendon Press, Oxford, 1994) angegeben.
Diese Verbindungen können an Tiere und Menschen mit einer wirksamen Dosis, die vom Experten auf dem Gebiet ohne weiteres bestimmt werden kann, und die gemäß der Art, dem Alter, dem Geschlecht und dem Gewicht des behandelten Objekts variieren kann, verabreicht werden. Beispielsweise fällt bei Menschen bei intravenöser Verabreichung die bevorzugte Dosis in den Bereich von etwa 0,1 ug bis 10 ug des Gesamtpeptids pro kg Körpergewicht. Bei oraler Verabreichung sind typischerweise höhere Mengen notwendig. Beispielsweise beträgt bei Menschen die Dosismenge zur oralen Verabreichung typischerweise etwa 30 ug bis etwa 1000 ug Polypeptid pro kg Körpergewicht. Die genaue Menge kann ohne weiteres empirisch auf der Basis der obigen Offenbarung bestimmt werden.
Zusammensetzungen, die als Wirkstoff die organischen und anorganischen Additionssalze der im vorhergehenden beschriebenen Polypeptide und deren Kombinationen optional im Gemisch mit einem Vehikel, Verdünnungsmittel, einer Matrix oder einem Überzug zur verzögerten Freisetzung umfassen, werden ebenfalls vom Umfang der vorliegenden Erfindung umfasst. Die pharmazeutischen Formen mit verzögerter Freisetzung, die biologisch erodierbare Matrizes umfassen, die zur subkutanten Implantation geeignet sind, sind besonders interessant. Beispiele für diese Matrizes sind in WO9222600 und WO9512629 beschrieben.

Biologische Aktivität

Die In-vivo-Aktivität dieser Verbindungen wurde bei Tage alten Ratten bestimmt, die subkutan (sc) eine Dosis von 300 ug/kg oder unterschiedliche Dosen in Dosis- Ansprechen-Untersuchungen erhielten, gemäß der detaillierten Beschreibung bei R. Deghenghi et al., Life Sciences 54, 1321 (1994) bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst, wobei das freigesetzte GH 15 min nach der Behandlung ermittelt wurde.
Das GHRP-2 (Bezugsstandard) hat die Struktur D-Ala-D-β-Nal-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH&sub2; (Chen und Clarke, J. Neuroend. 7, 179 (1995). TABELLE
Die In-Vitro-Aktivität bezüglich Adenylcyclaseaktivität wurde in Hypophysenvorderlappenzellen von Ratten, die 150 g wogen, ermittelt und sie zeigte im Vergleich zur Grundlinie mit EC&sub5;&sub0; = 0,23 nm für das Peptid D-Ala-D-Mrp- Ala-Trp-D-Phe-LysNH&sub2; eine Zunahem von 30%, wobei GHRP-6 (His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-LysNH&sub2;) inaktiv blieb.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.

Beispiel 1

Synthese von GAB-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-HH&sub2; (Mrp = 2-Methyltryptophan)

Die Synthese wurde durch Festphasensynthese mit 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl(Fmoc)-aminosäuren, die die Harzzubereitung und die Anordnung in einer Reaktorsäule gemäß einem von mehreren Verfahren, die einem Fachmann zur Verfügung stehen, beispielsweise nach "Solid phase peptide synthesis" von E. Atherton und R. C. Sheppard, IRL press bei Oxford University press, 1989 durchgeführt. Die geschützten Aminosäuren sind Fmoc-Lys(Fmoc)-Opfp (Opfp = Pentafluorphenylester), Fmoc-Phe-Opfp, Fmoc-D-Trp-Opfp, Fmoc-D-2-MeTrp-Opfp und Fmoc-GAB-Opfp (GAB = γ-Aminobuttersäure). Alternativ können die Castro-Reagenzien BOP und PyBOP (s. Le Nguyen und Castro (1988) in Peptide Chemistry 1987, S. 231-238, Protein Research Foundation Osaka; und Tetrahedron Letters 31, 205 (1990)) ebenfalls vorteilhafterweise als direkte Kopplungsreagenzien verwendet werden.
Nach der Abspaltung und Isolation wurde das Titelpeptid als Acetatsalz gereinigt. Reinheit (HPLC): 98%, MG (M + H&spplus;) = 764,3 (theoretisch 763,9).

Beispiel 2

Gemäß den in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurden die folgenden Peptide hergestellt und als Acetatsalze erhalten:
INIP-D-Mrp-D-Trp-Phe-LysNH&sub2;; Reinheit (HPLC) = 99,0%, MG (M + H&spplus; = 790,4; theoretisch 790,0);
INIP-D-Mrp-D-β-Nal-Phe-LysNH&sub2;; Reinheit (HPLC) = 96,5%, MG (M + H&spplus; = 801,4; theoretisch 801,0);
IMA-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH&sub2;; Reinheit (HPLC) = 99,2%, MG (M + H&spplus; = 786,5; theoretisch 786,8);
IMA-D-Mrp-D-β-Nal-Phe-Lys-NH&sub2;; Reinheit (HPLC) = 97,3%, MG (M + H&spplus; = 798,3; theoretisch 797,9);
GAB-D-Mrp-D-β-Nal-Phe-Lys-NH&sub2;;
4-(Aminomethyl)cyclohexancarbonyl-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH&sub2;;
4-(Aminomethyl)cyclohexancarbonyl-D-Mrp-D-β-Nal-Phe-Lys- NH&sub2;;
D-Ala-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-LysNH&sub2;;
D-Thr-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-LysNH&sub2;;
His-D-Mrp-Ala-Phe-D-Trp-LysNH&sub2;;
Tyr-His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-LysNH&sub2;;
His-D-Mrp-Ala-T rpNH&sub2;;
D-Thr-D-Mrp-Ala-TrpNH&sub2;;
worin Mrp 2-Methyltryptophan ist und INIP, IMA und GAB wie im vorhergehenden definiert sind.

Claims

1. Peptid, das ausgewählt ist aus der Gruppe von:

IMA-D-Mrp-D-Trp-Phe-LysNH&sub2;,

IMA-D-Mrp-D-β-Nal-Phe-LysNH&sub2;,

INIP-D-Mrp-D-Trp-Phe-LysNH&sub2;,

INIP-D-Mrp-D-β-Nal-Phe-LysNH&sub2;,

GAB-D-Mrp-D-Trp-Phe-LysNH&sub2;,

GAB-D-Mrp-D-β-Nal-Phe-LysNH&sub2;,

GAB-D-Mrp-D-β-Nal-NH&sub2;,

GAB-D-Mrp-D-β-Nal -OC2H5,

4-(Aminomethyl)cyclohexancarbonyl-D-Mrp-D-Trp-Phe-LysNH&sub2;,

4-(Aminomethyl)cyclohexancarbonyl-D-Mrp-D-β-Nal-Phe-LysNH&sub2;,

Imidazolacetyl-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-LysNH&sub2;,

D-Ala-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-LysNH&sub2;,

D-Thr-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-LysNH&sub2;,

His-D-Mrp-Ala-TrpNH&sub2;,

D-Thr-D-Mrp-Ala-TrpNH&sub2;,

His-D-Mrp-Ala-Phe-D-Trp-LysNH&sub2;,

D-Thr-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-D-ThrNH&sub2;,

D-Thr-His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-LysNH&sub2;,

His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-ThrNH&sub2;,

His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-D-ThrNH&sub2;,

worin Mrp 2-(C&sub1;-C&sub3;)Alkyltryptophan ist, und die Säureadditionssalze desselben mit pharmazeutisch akzeptablen organischen oder anorganischen Säuren.

2. Peptid nach Anspruch 1, worin Mrp 2-Methyltryptophan ist.

3. Verwendung der Peptide nach Anspruch 1-2 zur Herstellung eines Medikaments, das zur Förderung der Freisetzung eines Wachstumshormons in einem Lebewesen verwendbar ist.

4. Verwendung nach Anspruch 3, wobei das Medikament in der Humanmedizin verwendbar ist.

5. Verwendung der Peptide nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments, das zur Förderung der Erhöhung der intrazellulären Aktivität von Adenylcyclase verwendbar ist.

6. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine wirksame Menge von mindestens einem Peptid nach Anspruch 1 als Wirkstoff optional im Gemisch mit Trägern und Streckmitteln umfassen.

7. Zusammensetzungen nach Anspruch 6 zur parenteralen, intranasalen, oralen Verabreichung mit gesteuerter Freisetzung oder für subkutane Implantate.