DE60313970T2

DE60313970T2 - Lineare kationische peptide mit fungizider wirksamkeit

Info

Publication number: DE60313970T2
Application number: DE60313970T
Authority: DE
Inventors: Valerie Arranz
Original assignee: Diatos SA
Current assignee: Diatos SA
Priority date: 2002-07-08
Filing date: 2003-07-08
Publication date: 2008-01-24
Anticipated expiration: 2023-07-09
Also published as: JP4431036B2; PT1519951E; DK1519951T3; WO2004005339A2; WO2004005339A3; EP1519951A2; JP2006512053A; US7884070B2; ES2287527T3; AU2003264696A8; FR2841902A1; DE60313970D1; US20050277589A1; CA2491011A1; AU2003264696A1; ATE362769T1; EP1519951B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft den Bereich der Behandlung von Mykosen beim Menschen, Tier oder bei den Pflanzen. Sie zielt insbesondere auf die Verwendung von Peptiden zur Herstellung von Zusammensetzungen ab, die zur Vorbeugung und/oder Behandlung von Pilzinfektionen bestimmt sind.
Zahlreiche Mikroorganismen, die pathogen und für schwere Infektionen beim Menschen und beim Tier verantwortlich sind, weisen gegenüber üblicherweise in der Klinik verwendete Antibiotika Resistenzen auf. Die rasante Entwicklung mikrobieller Resistenzen ist ein großes Problem im Gesundheitswesens. Auch entwickelte sich seit den letzten Jahren ein beachtliches Interesse an der Identifizierung neuer Moleküle und besonders das Studium kurzer Peptide (15 bis 30 Aminosäuren), die antibakterielle und fungizide Aktivitäten besitzen und anders wirken als die üblicherweise verwendeten Antibiotika. Zahlreiche Peptide sind von menschlichen, tierischen oder pflanzlichen Proteinen abgeleitet, die dafür bekannt sind, dass sie antimikrobielle Eigenschaften besitzen, währenddessen andere auf der Grundlage physikalisch-chemischer Studien synthetisch generiert werden.
Das lineare 14-mer Peptid der Sequenz KLAKLAKKLAKLAK wurde in der Literatur als ein nicht hämolytisches Peptid mit einer antibakteriellen Aktivität beschrieben (Javadpour MM, Juban MM, Lo WC, Bishop SM, Alberty JB, Cowell SM, Becker CL, McLaughlin ML. De novo antimicrobial peptides with low mammalian cell toxicity. J Med Chem. 1996 Aug 2;39(16): 3107-23). Gezielte Studien mit diesem Peptid haben eine Aktivität auf drei Bakterienstämme (E. coli, P. aeruginosa und S. aureus) während einer kurzen Inkubationszeit von 4 Stunden nachgewiesen. Ergebnisse mit längeren Inkubationszeiten wurden niemals beschrieben.
Die Antragstellerin hat die fungiziden Eigenschaften dieses Peptids anhand von in vitro Studien unter Standard-Evaluierungsbedingungen (Inkubationszeit 18 Stunden) untersucht, bei denen keine biologische Aktivität zu den in der Literatur beschriebenen Konzentrationen nachgewiesen wurde. Dem gegenüber konnte jetzt gezeigt werden, dass das Motiv KLAKLAK auf unerwartete Weise in der Lage war, Peptiden, die dieses Motiv und eine Peptidsequenz, die keine fungiziden Eigenschaften hat, umfassen, fungizide Eigenschaften zu verleihen.
Die vorliegende Erfindung hat demzufolge die Verwendung eines vorzugsweise linearen und kationischen Peptids zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung und/oder Vorbeugung einer Pilzinfektion beim Menschen oder beim Tier zur Aufgabe, umfassend oder bestehend aus:

– einer ersten Peptidsequenz der Formel (KLAKLAK), wobei K die Aminosäure Lysin, L die Aminosäure Leucin und A die Aminosäure Alanin ist, und
– einer zweiten Peptidsequenz der Formel (B), wobei B ein positiv geladenes pH-neutrales Peptid aus 4 bis 14 Aminosäuren ist, umfassend oder bestehend aus mindestens einem Peptidmotiv der Formel βXXβ, wobei β eine basische Aminosäure und X irgend eine Aminosäure ist, und in welcher die erste Peptidsequenz n-Mal wiederholt wird und die besagte zweite Peptidsequenz m-Mal wiederholt wird, wobei n und m ganze Zahlen von 1 bis 5 sind. n ist vorzugsweise eine ganze Zahl von 1 bis 3. m ist in vorteilhafter Weise größer als 1 und die zweiten Peptidsequenzen (B) sind identisch oder unterschiedlich.

Die erfindungsgemäßen Peptide können also mehrere zweite identische oder unterschiedliche Peptidsequenzen (B) umfassen und damit mehrere identische oder unterschiedliche Peptidmotive der Formel βXXβ in jeder zweiten Peptidsequenz (B).
Die erfindungsgemäßen Peptide sind in vorteilhafter Weise linear. Sie entsprechen demnach der folgenden allgemeinen Formel (I): (KLAKLAK)_n(B)_m, in welcher die erste(n) und zweite(n) Peptidsequenz(en):

– abwechselnd, oder
– an dem einen und/oder dem anderen N- und C-terminalen Ende einen oder der besagten ersten und zweiten Peptidsequenz(en) gruppiert ist/sind.

In den Peptiden der Erfindung ist/sind die erste/n Peptidsequenz(en) vorzugsweise an dem einen und/oder anderen N- und C-terminalen Ende der zweiten Peptidsequenz(en) gruppiert.
Die besagte(n) erste(n) und zweite(n) Peptidsequenz(en) sind durch kovalente Verbindungen verbunden, vorzugsweise Peptidverbindungen.
Im Peptidmotiv der Formel βXXβ ist β eine basische Aminosäure, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, die Arginin (R) und Lysin (K) umfasst, und X ist vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt, die Leucin (L), Glycin (G) und Histidin (H) umfasst.
Als spezielles Beispiel für die zweite Peptidsequenz, die in die Zusammensetzung der erfindungsgemäßen Peptide eingeht, wären die folgenden Sequenzen zu nennen:

– SEQ ID NO. 1: VKRGLKL
– SEQ ID NO. 2: KHLKKHLKKHLK
– SEQ ID NO. 3: GKRKKKGKLGKKRDP

Diese zweiten Peptidsequenzen können mit einer ersten zweimal wiederholten Peptidsequenz verbunden sein: KLAKLAKKLAKLAK (SEQ ID NO. 4), um kationische lineare Peptide zu generieren, die nach 18 Stunden Inkubation mit Fadenpilzen oder Hefen eine fungizide Aktivität haben.
Die erfindungsgemäßen Peptide können durch chemische Synthese oder gentechnisch in einer prokaryotischen Zelle wie eine Bakterie, in einer eukaryotischen Zelle wie eine Hefe, eine CHO-Zelle, eine NSO-Zelle, bei einem transgenen Tier, zum Beispiel in der Milch von transgenen Kaninchen, Ziegen, Schafen oder in einer transgenen Pflanze wie zum Beispiel Tabakpflanzen hergestellt werden.
Die Erfindung betrifft ebenfalls funktionale Äquivalente der oben definierten Peptide, wie Peptide, die Modifikationen aus posttranslatorischen Verfahren wie die Glykosylierung oder aus chemischen Modifikationen wie die Kopplung mit Lipiden, Zuckern, Nukleotidsequenzen umfassen, insofern diese Modifikationen gemäß der im nachfolgenden experimentellen Teil beschriebenen Tests nicht die fungizide Aktivität der besagten Peptide verändern. Die funktionalen Äquivalente umfassen ebenfalls Peptide, von denen eine oder mehrere Aminosäuren Aminosäuren der D-Konformation sind. Die Erfindung deckt ebenfalls die Retro-Peptide und die Retro-Inverso-Peptide ab.
Die vorliegende Erfindung beschreibt demzufolge eine pharmazeutische, kosmetische oder agroalimentäre Zusammensetzung, die als Wirkprinzip mindestens ein Peptid umfasst, so wie zuvor definiert, das in der besagten Zusammensetzung mit einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen Trägersubstanzen, Verdünnungs- oder Bindemitteln verbunden ist. Die erfindungsgemäßen Peptide weisen eine schwache Toxizität auf und zusätzlich sind diese Peptide nicht hämolytisch.
Die Trägersubstanzen, Verdünnungs- und Bindemittel sind in Abhängigkeit von Typ der Anwendung der Zusammensetzung zu pharmazeutischen, kosmetischen oder agronomischen Zwecken ausgewählt.
Damit hat die Erfindung weiterhin die Verwendung eines Peptids, wie zuvor definiert, für die Zubereitung einer pharmazeutischen, kosmetischen, dermatologischen oder agroalimentären Zusammensetzung mit fungizidem Ziel zum Gegenstand.
Die erfindungsgemäßen Peptide besitzen gegenüber einer großen Bandbreite von Fadenpilzen und Hefen eine Aktivität, wobei die zweiten und ersten Sequenzen isoliert betrachtet unter den ausgewählten Evaluierungsbedingungen keine Aktivität haben.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen beugen sowohl vor und heilen.
Die Verabreichung von erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen kann durch eine beliebige für therapeutische Wirkstoffe akzeptierte Verabreichungsart erfolgen. Diese Verfahren umfassen die systemische, topische oder auch zentrale, zum Beispiel auf intrakraniellem chirurgischen Weg, oder auch die intraokulare Verabreichung. Weiterhin wäre die subkutane Implantation biologisch abbaubarer Implantate zu nennen.
Die orale Verabreichung kann mit Tabletten, Gelkapseln, weichen Kapseln, Formulierungen mit verzögerter oder verlängerter Freisetzung eingeschlossen, Pillen, Pulvern, Granulaten, Elixieren, Tinkturen, Suspensionen, Sirups und Emulsionen erfolgen. Diese Form der Präsentation ist insbesondere zur Durchdringung der Darmbarriere und für die üblichsten Anwendung fungizider Verbindungen geeignet.
Die parenterale Verabreichung fungizider Verbindungen erfolgt im allgemeinen durch intramuskuläre oder intravenöse Injektion durch Perfusion. Die injizierbaren Zusammensetzungen können in klassischen Formen hergestellt werden, entweder als Suspension oder flüssige Lösung, oder in fester Form, die für eine in einer entsprechenden Flüssigkeit auf Rezept zubereitete Lösung geeignet ist, Formulierungen mit verzögerter oder verlängerter Freisetzung eingeschlossen, wie die Inklusion von Peptiden in biologisch abbaubare Mikro- oder Nanopartikel lipidischer, Dextran- oder PLGA-Formulierung oder Äquivalente. Diese Form der Präsentation ist insbesondere zur Durchdringung der Blut-Hirn-Schranke und für die Verwendung fungizider Verbindungen im Krankenhaus geeignet.
Eine Möglichkeit für die parenterale Verabreichung nutzt die Implantation eines Systems mit langsamer oder verlängerter Freisetzung, das die Aufrechterhaltung eines konstanten Dosierungsniveaus gewährleistet.
Eine andere Möglichkeit besteht darin, die erfindungsgemäßen Peptide durch Adsorption oder anders auf einem Träger wie einem Katheter, einer Prothese oder einem biologischen Kleber zu fixieren.
Für die intranasale Verabreichung kann man geeignete intranasale Trägerstoffe verwenden.
Andere übliche topische Zubereitungen umfassen die Cremes, die Salben, die Lotionen, die Gele und die Aerosolsprays. Letztere sind insbesondere zur Behandlung von Pilzerkrankungen der Bronchien und Lungen geeignet.
Die Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide in kosmetischen Zusammensetzungen ist im wesentlichen vorbeugend nützlich und besteht darin, die besagten Peptide in die Cremes, die Nagellacke, die Hygieneprodukte für Genitalorgane, die Zahncremes, die Lösungen zur Mundhygiene einzuarbeiten oder sie in Mikropartikel mit langsamer Diffusion in wässriger Phase einzuschließen, die zum Beispiel in Windelhöschen, Q-Tips, Pflaster, Abschminkpads, Toilettenpapier oder auch in Tierstreu eingeschlossen sind.
Die Verbindungen können in Abhängigkeit von der Art der Verabreichung in fester, halbfester oder flüssiger Form sein.
Für die festen Zusammensetzungen wie Tabletten, Pillen, Pulver oder Granulate in freiem Zustand oder in Gelkapseln eingeschlossen, kann das Wirkprinzip kombiniert sein mit:

– Verdünnungsmitteln, zum Beispiel der Laktose, der Dextrose, der Saccharose, dem Mannitol, dem Sorbitol, der Zellulose und/oder Glycin,
– Schmiermitteln, zum Beispiel der Kieselsäure, dem Talkum, der Stearinsäure, ihrem Magnesium- oder Kalziumsalz und/oder Polyethylenglycol,
– Bindemitteln, zum Beispiel dem Magnesium- und Aluminiumsilikat, der Stärkepaste, der Gelatine, dem Traganthgummi, der Methylzellulose, der Natriumcarboxymethylzellulose und/oder ggf. dem Polyvinylpyrrolidon,
– Spaltprodukten, zum Beispiel der Stärke, dem Agar, der Alginsäure oder ihrem Natriumsalz, oder Sprudelmischungen, und/oder
– Adsorptionsmitteln, Farbstoffen, Aromastoffen und Süßstoffen. Die Bindemittel können zum Beispiel Mannitol, Laktose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talkum, Zellulose, Glukose, Saccharin, Magnesiumcarbonat und analoge Stoffe in pharmazeutischer Qualität sein.

Für halbfeste Zusammensetzung wie Zäpfen kann das Bindemittel zum Beispiel eine Emulsion oder Suspension, fettig oder auf der Grundlage von Polyalkylenglycol, wie Polypropylenglycol, sein.
Die flüssigen Zusammensetzungen, die insbesondere injizierbar oder in eine weiche Kapsel einzuschließen sind, können zum Beispiel durch Auflösen, Dispersion usw. des Wirkprinzips in einem reinen pharmazeutischen Lösungsmittel wie zum Beispiel dem Wasser, der physiologischen Lösung, der wässrigen Dextrose, dem Glycerol, dem Ethanol, einem Öl und ähnlichem zubereitet werden.
Die erfindungsgemäßen Peptide können ebenfalls in Form von Freisetzungssystemen vom Typ Liposome verabreicht werden, wie in Form kleiner unilamellarer Bläschen, großer unilamellarer Bläschen und multilamellarer Bläschen. Die Liposome können aus verschiedenen Phospholipiden gebildet sein, die Cholesterin, Stearylamin oder Phosphatdylcholine enthalten. In einer Ausführungsform kann ein Film flüssiger Verbindungen mit einer wässrigen Lösung des Arzneimittels befeuchtet sein, um eine das Arzneimittel einkapselnde Lipidschicht zu bilden.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können sterilisiert sein und/oder nicht toxische Zusatz- und Hilfsstoffe enthalten wie Konservierungsmittel, Stabilisatoren, Benetzungsmittel oder Emulgatoren, Mittel, die die Auflösung fördern, Salze zur Regulierung des osmotischen Drucks und/oder Puffer. Weiterhin können sie ebenfalls andere Substanzen enthalten, die von therapeutischem Interesse sind. Die Zusammensetzungen werden jeweils anhand klassischer Verfahren des Mischens, der Granulation oder der Umhüllung zubereitet, und sie enthalten ca. 0,1 bis 75 %, vorzugsweise ca. 1 bis 50 % Wirkprinzip.
Die erfindungsgemäßen Peptide können ebenfalls mit löslichen Polymeren gekoppelt sein wie gezielt einsetzbaren Arzneimittelträgern. Derartige Polymere können das Polyvinylpyrrolidon, das Kopolymer Pyran, das Polyhydroxypropylmethacrylamidphenol, das Polyhydroxyethylaspanamidphenol oder das Poly(ethylenoxid)polylysin, substituiert durch Palmitoylreste, das Dextran umfassen. Weiterhin können die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung an eine Klasse biologisch abbaubarer Polymere gekoppelt sein, die zur gesteuerten Freisetzung eines Arzneimittels dienen, zum Beispiel die Poly(Milchsäure), das Poly(epsilon-Caprolacton), die Poly(Hydroxybuttersäure), die Polyorthoester, die Polyacetale, die Polydihydropyrane, die Polycyanoacrylate und die sequenzierten retikulierten oder amphipatischen Hydrogelcopolymere.
Das Dosierungsschema für die Verabreichung der erfindungsgemäßen Peptide wird in Abhängigkeit vieler Faktoren wie Typ, Art, Alter, Gewicht, Geschlecht und medizinischer Zustand des Individuums ausgewählt, der Schwere des zu behandelnden Zustands, des Weges der Verabreichung, des Zustands der Nieren- und Leberfunktionen des Individuums und der Art der einzelnen Verbindung, oder des Salzes, die verwendet wird. Ein Arzt oder ein Veterinär mit normalen Erfahrungen wird problemlos die Menge bestimmen und verschreiben, die zur Vorbeugung, Bekämpfung oder zum Stoppen des zu behandelnden medizinischen Zustands notwendig ist.
Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung kann 0,1 bis 99 %, vorzugsweise 1 bis 70 %, Wirkprinzip enthalten.
Die oralen Dosierungsschemata der erfindungsgemäßen Peptide bewegen sich zwischen inklusive ca. 0,5 und 1 mg/Tag auf oralem Weg und werden vorzugsweise in Form von Tabletten zur Verfügung gestellt, die 0,5, 1, 2,5, 5, 10, 15, 25, 50, 100, 250, 500 und 1.000 mg Wirkprinzip enthalten. Die plasmatisch wirksamen Peptidkonzentrationen werden ab einer Dosierung erreicht, die von 0,002 mg bis 50 mg je kg Körpergewicht und pro Tag geht.
Die erfindungsgemäßen Peptide können in Form täglicher Einmaldosen oder in zwei, drei oder vier Dosen pro Tag verabreicht werden.
Die Erfindung zielt nicht nur auf die Verabreichung der zuvor beschriebenen Peptide ab, sondern auch auf die Verwendung der diese Peptide codierenden
Polynukleotidsequenzen zur Transformation von Pflanzenzellen. Diese Sequenzen werden gemäß den gentechnischen Methoden verwendet, die in der Literatur beschrieben sind.
Folglich beschreibt die Erfindung ebenfalls ein Polynukleotid, das ein zuvor beschriebenes Peptid codiert, ein Nukleinsäuremolekül, DNA oder RNA, als einen Vektor, der das besagte Polynukleotid umfasst, und eine Pflanzenzelle, die das besagte Nukleinsäuremolekül umfasst.
Als Beispiele für Polynukleotide, die zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet werden können, wären zu nennen:

– die Sequenz 5' GTT AAA CGT GGT TTG AAA TTG AAA TTG GCT AAA TTG GCT AAA AAA TTG GCT AAA TTG GCT AAA 3' (SEQ ID NO. 5), die das Peptid VKRGLKLKLAKLAKKLAKLAK (SEQ ID NO. 6) codiert,
– die Sequenz 5' AAA TTG GCT AAA TTG GCT AAA AAA TTG GCT AAA TTG GCT AAA AAA CAT TTG AAA AAA CAT TTG AAA AAA CAT TTG AAA 3' (SEQ ID NO. 7), die das Peptid KLAKLAKKLAKLAKKHLKKHLKKHLK (SEQ ID NO. 8) codiert,
– die Sequenz 5' AAA TTG GCT AAA TTG GCT AAA AAA TTG GCT AAA TTG GCT AAA GGT AAA CGT AAA AAA AAA GGT AAA TTG GGT AAA AAA CGT GAT CCT 3' (SEQ ID NO. 9), die das Peptid KLAKLAKKLAKLAKGKRKKKGKLGKKRDP (SEQ ID NO. 10) codiert.

Die Erfindung ist demzufolge auch für agronomische Anwendungen der zuvor beschriebenen Peptide interessant, um Pflanzen gegenüber phytopathogenen Pilzen resistent zu machen und somit die Verwendung von chemischen Pestiziden zur Vorbeugung oder Heilung zu reduzieren, die für die Umwelt toxisch sind. Das direkte Applizieren einer wirksamen Menge des fungiziden Peptids oder einer Zusammensetzung, die davon enthält, auf die Pflanze stellt eine erste Form der Umsetzung der agronomischen Anwendung dar. Eine zweite Form der Umsetzung dieser Anwendung basiert auf Techniken der Transgenese, die darin besteht, in die DNA einer Pflanzenzelle eine Polynukleotidsequenz, die für ein obiges fungizides Peptid oder mehrere obige fungizide Peptide codierend ist, stabil zu inkorporieren. Mit den auf diese Art und Weise transformierten Pflanzenzellen kann eine Pflanze gebildet werden, die den Resistenzcharakter gegenüber Pilzinfektionen an ihre Nachkommenschaft überträgt. Als Beispiele für Pflanzen wären der Reis, der Mais, der Raps, die Rübe, der Weizen, der Tabak, die Tomate, die Kartoffel zu nennen.

Die Aminosäuren der Peptidsequenzen sind im allgemeinen mit ihrem aus einem Buchstaben bestehenden Code dargestellt, gemäß der nachfolgenden Nomenklatur können sie aber auch mit ihrem aus drei Buchstaben bestehenden Code dargestellt sein.

A	Ala	Alanin
C	Cys	Cystein
D	Asp	Asparaginsäure
E	Glu	Glutaminsäure
F	Phe	Phenylalanin
G	Gly	Glycin
H	His	Histidin
I	Ile	Isoleucin
K	Lys	Lysin
L	Leu	Leucin
M	Met	Methionin
N	Asn	Asparagin
P	Pro	Prolin
Q	Gin	Glutamin
R	Arg	Arginin
S	Ser	Serin
T	Thr	Threonin
V	Val	Valin
W	Trp	Tryptohan
Y	Tyr	Tyrosin

Andere Vorteile und Merkmale der Erfindung ergeben sich aus den folgenden Beispielen, die der Veranschaulichung dienen und bei denen auf die Zeichnungen in der Anlage Bezug genommen wird, von denen:
die 1 die Untersuchung der hämolytischen Aktivität der Peptide Nr. 1, Nr. 2 und Nr. 3 bzw. der Sequenzen SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 10 auf humane Erythrozyten darstellt,
die 2 die Stabilität des Peptids Nr. 2 (SEQ ID NO. 8) in humanem Plasma darstellt.
MATERIAL
1) Lineare Peptide

Nr. 1: VKRGLKLKLAKLAKKLAKLAK (SEQ ID NO. 6)
Nr. 2: KLAKLAKKLAKLAKKHLKKHLKKHLK (SEQ ID NO. 8)
Nr. 3: KLAKLAKKLAKLAKGKRKKKGKLGKKRDP (SEQ ID NO. 10)

2) Fadenpilze und Hefen
Die verwendeten und in den verschiedenen Ergebnissen aufgeführten Stämme stammen aus den Banken und Sammlungen der ATCC (American Type Culture Collection) und dem Institut Pasteur.
3) Zellen
Humane Erythrozyten aus Vollblut aus dem Etablissement Français du Sang (EFS), bei +4 °C konserviert.
4) Zubereitung der Peptide
Die Peptidsynthesen wurden gemäß den Techniken vorgenommen, die dem Fachmann bekannt sind. Die Peptide sind wasserlöslich.
Ergebnisse
I – Bestimmung der minimalen inhibierenden Konzentration (CMI) in flüssigem Medium für Fadenpilze und Hefen
Getestete Peptidkonzentrationen: von 0,2 μg/ml bis 100 μg/ml.

Die folgende Tabelle 4 stellt die Aktivität der Peptide gegen Pilze dar. Tabelle 4

CMI-Sequenz (μg(ml)	C. neoformans Cn52D	C. albicans ATCC 90028	A. Fumigatu s 2001/143.02
Nr. 1	12,5	AND*	AND
Nr. 2	1,56	AND	AND
Nr. 3	1,56	AND	AND
*AND: Nicht festgestellte Aktivität bei 100 μg/ml

Die Ergebnisse zeigen, dass die 3 getesteten Peptide gegenüber Cryptococcus neoformans wirksam sind.
II – Bewertung der hämolytischen Aktivität der Peptide
1 × 10⁶ humane Erythrozyten werden 30 Minuten mit steigenden Peptidkonzentrationen (von 0 bis 500 μg/ml) in einem finalen Volumen von 150 μl inkubiert. Die hämolytische Aktivität wird durch Absorbanzmessung (Abs) bei einer Wellenlänge von 414 nm (Absorbanz des Hämoglobins) der Zellüberstände bestimmt. Die Absorbanz des Überstands nach Inkubation der Erythrozyten in Wasser entspricht 100 % (Abs₁₀₀) der Hämolyse und die Absorbanz des Überstands nach Inkubation der Erythrozyten in PBS entspricht 0 % der Hämolyse (Abs₀). Die hämolytische Aktivität der Peptide, ausgedrückt in Prozent, entspricht (Abs_Peptid – Abs₀)/Abs₁₀₀ × 100.
Die 4 stellt die Untersuchung der hämolytischen Aktivität der Peptide Nr. 1, Nr. 2 und Nr. 3 auf die humanen Erythrozyten dar. Die Peptide zeigen keine hämolytische Aktivität.
III – Bewertung der Stabilität der Peptide
Ein Volumen von 3,9 ml humanes Plasma wird 100 μl Peptid Nr. 2 bei 2 mM hinzugefügt. Die Stabilität ist bei 37 °C hergestellt. Nach 0, 0,5, 1, 2, 4 und 6 Stunden werden 3 × 200 μl entnommen und 10 μl internem Standard (Peptid Nr. 1) bei 500 μM in Wasser hinzugefügt, denen 800 μl Trifluoressigsäure (TFA) 0,1 % in Wasser hinzugefügt werden. Ein Volumen von 1 ml dieses Gemischs wird auf Harz C2(EC) verbracht, das zuvor mit 1 ml TFA 1 % in Wasser, 1 ml TFA 0,1 % in Acetonitril und 1 ml TFA 0,1 % in Wassser equilibriert wurde. Nach zwei Wäschen mit 1 ml TFA 0,1 % in Wasser erfolgt die Flution des Peptids und seiner Metaboliten durch 1 ml TFA 0,1 % in Methanol. Dieses wird dann unter Luftstrom getrocknet und in 200 μl TFA 0,1 % in Wasser übernommen. Ein Volumen von 100 μl wird durch HPLC über einer Luna-Säule C18(2), 3 μ, 4,6 × 100 mm (Phenomenex) mit TFA 0,1 % in Wasser als Lösungsmittel A und TFA 0,1 % in Acetonitril als Lösungsmittel B analysiert. Ein Gradient von 15-45 % von B in 12 Minuten wird für die Flution mit einer Durchflussmenge von 1,2 ml/min verwendet, und der Nachweis wird bei 214 nm vorgenommen.
Die 5 stellt die Untersuchung der Stabilität des Peptids 2 in drei Partien humanem Plasma verschiedener Blutgruppen dar: A⁺ (A), B⁺ (B) und 0⁺ (C). (♦: Peptid Nr. 2, ☐ und Δ: Metaboliten).
Zwei wichtigsten Metaboliten werden durch Aufspalten des Peptids Nr. 2 generiert. Das Peptid Nr. 2 wird nach 6 Stunden Inkubation in humanem Plasma maximal auf 41 % degradiert. Unabhängig von der Blutgruppe, von der das Plasma stammt, gibt es keinen signifikanten Unterschied bei der Degradation des Peptids.
IV – Beurteilung der in vivo Toxizität der Peptide
Die maximal tolerierte Dosis (DMT) für jedes Peptid wird auf weiblichen OF1-Mäusen 28 Tage nach einer Injektion bestimmt. Die DMT wird als die maximale nicht letale Dosis definiert, die injiziert werden kann. Die Peptide werden auf intravenösem Weg mit einem Tropf ca. 15 Minuten lang verabreicht. Das Injektionsvolumen beträgt 10 μl/g, die Infusionszeit beträgt 1,2 ml/Std. und das Bindemittel ist eine NaCl-Lösung 0,8 %.
Die folgende Tabelle 5 stellt die DMT der Peptide Nr. 1 und Nr. 2 dar. Tabelle 5

Peptid DM

Peptid 1 > 23,2 mg/kg

Peptid 2 13,5 mg/kg
Sequenzliste

Claims

Verwendung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung aus einem Peptid, die zur Behandlung und/oder Vorbeugung einer Pilzinfektion beim Menschen oder beim Tier bestimmt ist, umfassend oder bestehend aus: (i) einer ersten Peptidsequenz der Formel (KLAKLAK), wobei K die Aminosäure Lysin, L die Aminosäure Leucin und A die Aminosäure Alanin ist, und (ii) einer zweiten Peptidsequenz der Formel (B), wobei B ein Peptid aus 4 bis 15 Aminosäuren ist, das positiv bis pH-neutral geladen ist, umfassend oder bestehend aus mindestens einem Peptidmotiv der Formel βXXβ, wobei β eine basische Aminosäure und X irgend eine Aminosäure ist, und in welcher die besagte erste Peptidsequenz n-Mal wiederholt wird und die besagte zweite Peptidsequenz m-Mal wiederholt wird, wobei n und m ganze Zahlen von 1 bis 5 sind.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die hergestellte pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung und/oder Vorbeugung einer Pilzinfektion bestimmt ist, die von einem Fadenpilz oder einer Hefe verursacht wird.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Anzahl der Wiederholungen (n) der ersten Sequenz des besagten Peptids eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Anzahl der Wiederholungen (m) der zweiten Peptidsequenz (b) des besagten Peptids größer als 1 ist und dadurch, dass die zweiten Peptidsequenzen (B) identisch oder unterschiedlich sind.
Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Peptidmotive der Formel βXXβ in allen zweiten Peptidsequenzen (B) identisch oder unterschiedlich sind.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die erste(n) und zweite(n) Peptidsequenz(en) des besagten Peptids: – abwechselnd, oder – an dem einen und/oder anderen N- und C-terminalen Ende einer oder der besagten ersten oder zweiten Peptidsequenz(en) gruppiert ist/sind.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die erste oder die ersten Peptidsequenz(en) an dem einen und/oder an dem anderen N- und C-terminalen Ende der zweiten Peptidsequenz(en) gruppiert ist/sind.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die erste(n) und zweite(n) Peptidsequenz(en) durch kovalente Verbindungen verbunden sind, vorzugsweise Peptidverbindungen.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass im Peptidmotiv der Formel βXXβ des besagten Peptids β eine basische Aminosäure ist, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, die Arginin (R) und Lysin (K) umfasst, und X aus der Gruppe ausgewählt ist, die Leucin (L), Glycin (G) und Histidin (H) umfasst.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Peptidsequenz der Formel (b) eine Sequenz ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 3 umfasst.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid aus der Gruppe ausgewählt ist, die SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 8 und SEQ ID Nr. 10 umfasst.
Verwendung eines Peptids, so wie in einem der Ansprüche 1 bis 11 definiert, als Fungizid bei der Pflanze.
Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das besagte Peptid eine Aktivität gegen Fadenpilze und Hefen hat.
Verwendung nach einem der Ansprüche 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass das besagte Peptid von einem Polynukleotid codiert ist, das in einem Nukleinsäurevektor enthalten ist, wobei der besagte Vektor zuvor in der besagten Pflanze transformiert wurde.
Pflanzenzelle, ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 14 umfassend.
Eine aus einer Pflanzenzelle nach Anspruch 15 generierte Pflanze.