PT1519951E

PT1519951E - Péptidos lineares catiónicos possuindo propriedades antifúngicas.

Info

Publication number: PT1519951E
Application number: PT03762746T
Authority: PT
Inventors: Valerie Arranz
Original assignee: Diatos Sa
Priority date: 2002-07-08
Filing date: 2003-07-08
Publication date: 2007-08-31
Also published as: DK1519951T3; CA2491011A1; WO2004005339A3; US7884070B2; WO2004005339A2; DE60313970D1; AU2003264696A8; ATE362769T1; EP1519951A2; DE60313970T2; JP4431036B2; FR2841902A1; ES2287527T3; AU2003264696A1; EP1519951B1; US20050277589A1; JP2006512053A

Description

ΡΕ1519951 1 DESCRIÇÃO "PÉPTIDOS LINEARES CATIÓNICOS POSSUINDO PROPRIEDADES ANTIFÚNGICAS" A presente invenção refere-se ao domínio do tratamento das infecções fúngicas no homem, no animal ou nas plantes. Esta visa mais particularmente, utilização de péptidos para o fabrico de composições destinadas a prevenir e ou tratar infecções por fungos. Vários microrganismos patogénicos e responsáveis por graves infecções no homem e no animal apresentam resistências a antibióticos vulgarmente utilizados em clínica. 0 desenvolvimento crescente das resistências microbianas é um problema grave de saúde pública. Também se desenvolveu, nos últimos anos, um interesse considerável para a identificação de novas moléculas e particularmente, para o estudo de péptidos curtos (15 a 30 aminoácidos) que possuam actividades antibacterianas e antifúngicas e possuindo um modo de acção diferente dos antibióticos normalmente utilizados. Vários péptidos derivados de proteínas humanas, animais e vegetais conhecidos como possuindo propriedades antimicrobianas, entre outras, são produzidos de forma sintética com base em estudos físico-químicos. O péptido de 14 meros linear de sequência KLAKLAKKLAKLAK foi descrito na literatura como um péptido 2 ΡΕ1519951 não hemolítico possuindo uma actividade antibacteriana (Javadpour MM, Juban MM, Lo WC, Bishop SM, Alberty JB, Cowell SM, Becker CL, McLaughlin ML. De novo antimicrobial peptides with low mammalian cell toxicity. J Med Chem. 1996 Aug 2; 39(16): 3107-23). Os estudos restritos efectuados com este péptido mostraram uma actividade sobre três estirpes de bactérias (E. coli, P. aeruginosa e S. aureus) durante um tempo de incubação curto de 4 horas. Os resultados com os tempos de incubação mais longos nunca foram descritos O requerente efectuou estudos in vitro das propriedades antifúngicas deste péptido nas condições padrão de avaliação (incubação de 18 horas) que não mostraram nenhuma actividade biológica as concentrações descritas na literatura. Pelo contrário, é agora posto em evidência, que de forma inesperada, o motivo KLAKLAK era capaz de conferir propriedades antifúngicas a péptidos compreendendo este motivo e uma sequência peptidica não possuindo propriedade antifúngica. A presente invenção tem deste modo por objectivo a utilização para o fabrico de uma composição farmacêutica, destinada a tratar e/ou prevenir uma infecção fúngica no homem ou no animal de um péptido, vantajosamente linear e catiónico, compreendendo ou consistindo em: uma primeira sequência peptidica de fórmula (KLAKLAK), em que K é o aminoácido Lisina, L é o aminoácido Leucina e A é o aminoácido Alanina, e 3 ΡΕ1519951 uma segunda sequência peptídica de fórmula (B),em que B é um péptido de 4 a 15 aminoácidos carregados positivamente a pH neutro, compreendendo ou consistindo em, pelo menos, um motivo peptidico de fórmula βΧΧβ, em que β é um aminoácido básico e X é um aminoácido qualquer, e na qual, a referida primeira sequência peptídica é repetida n vezes e a referida segunda sequência peptídica é repetida m vezes, sendo nem números inteiros compreendidos entre 1 e 5. De preferência, n é um número inteiro compreendido entre 1 e 3. Vantajosamente m é superior ale as segundas sequências peptídicas (B) são idênticas ou diferentes.

Os péptidos de acordo com a invenção podem, deste modo, compreender várias segundas sequências peptídicas (B) idênticas ou diferentes e, deste modo, vários motivos peptídicos de fórmula βΧΧβ, idênticas ou diferentes, em cada uma das segundas sequências peptídicas (B).

Os péptidos de acordo com a invenção são vantajosamente lineares. Estes respondem, deste modo, à fórmula geral (I) seguinte: (KLAKLAK) n (B)m, na qual as primeira (s) e segunda(s) sequências peptídicas são: alternadas, ou 4 ΡΕ1519951 - reagrupadas com uma e/ou com a outra das extremidades N e C terminais de uma ou das referidas primeira(s) ou segunda(s) sequências peptidicas.

De preferência, nos péptidos da invenção, a ou as primeiras sequências peptidicas são reagrupadas com uma e/ou com a outra das extremidades N e C terminais da ou das segunda(s) sequência(s) peptidica(s).

Preferencialmente, as referidas primeira(s) e segunda(s) sequências peptidicas são ligadas por ligações covalentes, vantajosamente peptidicas.

No motivo peptidico de fórmula βΧΧβ, β é um aminoácido básico, de preferência, seleccionado no grupo compreendendo a arginina (R) e a Lisina (K) e X é, de preferência, seleccionado no grupo compreendendo a Leucina (L), a glicina (G) e a histidina (H). A titulo de exemplo especifico da segunda sequência peptidica que entra na composição dos péptidos, de acordo com a invenção, podem citar-se as sequências seguintes:

- SEQ ID NO.1: VKRGLKL

- SEQ ID NO.2: KHLKKHLKKHLK

- SEQ ID NO.3: GKRKKKGKLGKKRDP 5 ΡΕ1519951

As segundas sequências peptídicas podem estar associadas a uma primeira sequência peptidica repetida duas vezes: KLAKLAKKLAKLAK (SEQ ID NO.4) de forma a produzir péptidos lineares catiónicos possuindo uma actividade antifúngica após 18 horas de incubação com os fungos filamentosos ou as leveduras.

Os péptidos de acordo com a invenção podem ser preparados por sintese quimica ou por engenharia genética numa célula procariótica como uma bactéria, numa célula eucariótica como uma levedura, uma célula CHO, uma célula NSO, num animal transgénico, por exemplo, no leite de coelho, de cabra, de ovelha, transgénicos ou numa planta transgénica como, por exemplo, nas plantas de tabaco. A invenção refere-se também a equivalentes funcionais dos péptidos definidos acima, tais como os péptidos compreendendo modificações derivadas de processos pós-tradução como a glicosilação ou modificações químicas tais como o acoplamento com lípidos, açúcares, sequências de nucleótidos desde que essas modificações não modifiquem a actividade antifúngica dos referidos péptidos conforme os testes apresentados na parte experimental a seguir. Os equivalentes funcionais compreendem também péptidos em que um ou vários aminoácidos são aminoácidos de conformação D. A invenção cobre igualmente os retro-péptidos e os retro-péptidos inversos. 6 ΡΕ1519951 A presente invenção descreve, deste modo, uma composição farmacêutica, cosmética ou agro-alimentar compreendendo como principio activo, pelo menos, um péptido tal como definido anteriormente, associado numa referida composição com um ou vários veículos, diluentes ou exci-pientes farmaceuticamente aceitáveis. Os péptidos de acordo com a invenção apresentam uma fraca toxicidade e além disso, estes péptidos são não hemolíticos.

Os veículos, diluentes e excipientes são selec-cionados em função do tipo de aplicação da composição a título farmacêutico, cosmética ou agronómica.

Além disso, a invenção tem ainda por objectivo a utilização de um péptido, tal como definido anteriormente, para a preparação de uma composição farmacêutica, cosmética, dermatológica ou agro-alimentar com objectivo antifúngico.

Os péptidos da invenção possuem uma actividade contra uma grande variedade de fungos filamentosos e leveduras desde que as segundas e primeiras sequências utilizadas isoladamente não possuam actividade nas condições de avaliação seleccionadas.

As composições de acordo com a invenção são úteis tanto a título preventivo como curativo. 7 ΡΕ1519951 A administração de composição farmacêutica de acordo com a invenção pode ser efectuada por qualquer dos modos de administração aceites pelos agentes terapêuticos. Estes procedimentos compreendem a administração sistémica, tópica ou ainda central, por exemplo por via cirúrgica intracraniana ou ainda a administração intra-ocular. Pode citar-se também a implantação subcutânea de implantes biodegradáveis. A administração oral pode fazer-se através de comprimidos, drageias, cápsulas moles, e compreendem as formulações com a libertação diferida ou prolongada, pilulas, pós, grânulos, elixires, tinturas, suspensões, xaropes e emulsões. Esta forma de apresentação é, mais particularmente, adaptada à passagem da barreira intestinal e a utilização mais vulgar dos compostos antifúngicos. A administração parentérica de compostos antifúngicos faz-se geralmente pela injecção intramuscular ou intravenosa por perfusão. As composições injectáveis podem ser preparadas sob formas clássicas, seja em suspensão ou solução liquida, seja sob a forma sólida conveniente a uma dissolução extemporânea num liquido adequado, e compreende as formulações de libertação diferida ou prolongada como a inclusão de péptidos em micro ou nanoparticulas biodegradáveis de formulação lipídica ou de formulação de dextrano ou ainda de PLGA ou equivalentes. Esta forma de apresentação é, mais particularmente, ΡΕ1519951 adaptada à passagem da barreira hemato-encefálica e à utilização hospitalar de compostos antifúngicos.

Uma possibilidade para a administração paren-térica utiliza a implantação de um sistema de libertação lento ou libertação prolongada que assegura a manutenção de um nivel de dose constante.

Uma outra possibilidade consiste na fixação por adsorção ou por outro modo os péptidos da invenção sobre um suporte, como um cateter, uma prótese ou uma cola biológica .

Para a administração intranasal, podem utilizar-se veículos intranasais convenientes.

Outras preparações tópicas habituais compreendem os cremes, os unguentos, as loções, os géis e as pulverizações aerossóis. Estes últimos são, mais particularmente, adaptados para o tratamento das infecções bronco-pulmonares fúngicas. A utilização dos péptidos da invenção em composições cosméticas é útil a título essencialmente preventivo consistindo em incluir os referidos péptidos nos cremes, nos vernizes para unhas, no produtos de higiene dos órgãos genitais, nas pastas dentífricas, nas soluções de higiene bucal ou em incluí-los em micropartículas de difusão lenta, em fase aquosa, inclui por exemplo nas cuecas-fraldas, 9 ΡΕ1519951 tiras de algodão, pensos, algodões desmaquilhantes, toalhetes higiénicos ou ainda camas para animais.

Em função do modo de administração, os compostos podem estar na forma sólida, semi-sólida ou líquida.

Para as composições sólidas, tais como comprimidos, pílulas, pós ou granulados no estado livre ou incluídos nas drageias, o princípio activo pode ser combinado com: diluentes, por exemplo a lactose, a dextrose, a sacarose, o manitol, o sorbitol, a celulose e/ou a glicina; lubrificantes, por exemplo a sílica, o talco, o ácido esteárico, o seu sal de magnésio ou de cálcio e/ou o polietilenoglicol; ligantes, por exemplo o silicato de magnésio e de alumínio, a pasta de amido, a gelatina, a goma adra-gante, a metilcelulose, a carboximetilcelulose sódica e/ou a polivinilpirrolidona; se for o caso, desintegrantes, por exemplo o amido, o agar, o ácido algínico ou seu sal de sódio, ou misturas efervescentes; e/ou absorventes, corantes, aromatizantes e edulcorantes. Os excipientes podem ser, por exemplo, manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, talco, celulose, glucose, sacarose, carbonato de magnésio e análogos de qualidade farmacêutica. 10 ΡΕ1519951

Para as composições semi-sólidas, tais como supositórios, o excipiente pode, por exemplo, ser uma emulsão ou suspensão gorda, ou à base de polialquileno-glicol, tal como o polipropilenoglicol.

As composições liquidas, em particular injectá-veis ou a incluir numa cápsula mole, podem ser preparadas, por exemplo, por dissolução, dispersão, etc., do princípio activo num solvente farmaceuticamente puro tal como, por exemplo, a água, o soro fisiológico, a dextrose aquosa, o glicerol, o etanol, um óleo e análogos.

Os péptidos de acordo com a invenção podem igualmente ser administradas sob a forma de sistemas de libertação do tipo lipossomas, tais como sob a forma de pequenas vesículas unilamelares, de grandes vesículas unilamelares e de vesículas multilamelares. Os lipossomas podem ser formados a partir de uma diversidade de fosfo-lípidos, contendo colesterol, da estearilamina ou fosfati-dilcolinas. Numa forma de execução, um filme de componentes líquidos pode ser hidratado com uma solução aquosa do medicamento para formar uma camada lipídica que encapsula o medicamento.

As composições de acordo com a invenção podem ser esterilizadas e/ou conter adjuvantes e substâncias auxiliares não tóxicas, tais como, agentes de conservação, ΡΕ1519951 de estabilização, de humedecimento ou de emulsificação, agentes que favorecem a dissolução, sais para regular a pressão osmótica e/ou tampões. Por outro lado, estas podem igualmente conter outras substâncias que apresentem um interesse terapêutico. As composições são preparadas, respectivamente, através de procedimentos clássicos de mistura, granulação ou revestimento e estas contêm cerca de 0,1 a 75%, de preferência, cerca de 1 a 50%, de princípio activo.

Os péptidos de acordo com a invenção podem ser igualmente acoplados com polímeros solúveis, tais como suportes do medicamento alvo. Tais polímeros podem compreender a polivinilpirrolidona, o copolímero pirano, o poli-hidroxipropilmetacrilamidonol, o pohidroxi-etil-aspanami-dofenol ou o poli(óxido de etileno)-polilisina substituída por resíduos palmitoílo, o dextrano. Por outro lado, os compostos de acordo com a presente invenção podem ser acoplados a uma classe de polímeros biodegradáveis úteis para realizar uma libertação controlada de um medicamento, por exemplo, o poli(ácido láctico), a poli(epsilon-capro-lactona), o poli(ácido hidroxibutírico), os poli-orto-ésteres, os poliacetais, os polidi-hidropiranos, os poli-cianoacrilatos e os copolímeros de hidrogel sequenciados reticulados ou anfipáticos. A posologia para a administração dos péptidos de acordo com a invenção é seleccionada em função de vários 12 ΡΕ1519951 factores e compreendem o tipo, a espécie, a idade, o peso, o sexo e o estado médico do sujeito; a gravidade do estado a tratar; a via de administração; o estado das funções renal e hepática do sujeito e a natureza do composto particular, ou sal, empregue. Um médico ou veterinário normalmente experiente determinará facilmente, e irá prescrever, a quantidade eficaz para prevenir, contrariar ou interromper o progresso do estado médico a tratar.

Uma composição de acordo com a invenção pode conter de 0,1 a 99%, de preferência, 1 a 70% de principio activo. A titulo de exemplos, as posologias orais dos péptidos de acordo com a invenção estarão compreendidos entre cerca de 0,5 e 1 mg/dia por via oral e, de preferência, fornecidos sob a forma de comprimidos contendo 0,5, 1, 2,5, 5, 10, 15, 25, 50, 100, 250, 500 e 1 000 mg de principio activo. As concentrações plasmáticas eficazes de péptidos serão obtidas a partir de uma posologia variando de 0,002 mg a 50 mg por kg de peso corporal e por dia.

Os péptidos da invenção podem ser administrados sob a forma de doses quotidianas únicas, ou em duas, três ou quatro doses por dia. A invenção visa não somente a administração dos 13 ΡΕ1519951 péptidos descritos anteriormente, mas, igualmente, a utilização das sequências polinucleotidicas que codificam estes péptidos para transformar células vegetais. Estas sequências são utilizadas de acordo com as técnicas de engenharia genética descritas na literatura.

Por consequência, a invenção descreve, igualmente, um polinucleótido que codifica um péptido descrito anteriormente, uma molécula de ácido nucleico, ADN ou ARN, como um vector, compreendendo o referido polinucleótido, e uma célula vegetal compreendendo a referida molécula de ácido nucleico. A título de exemplos de polinucleótidos, que podem ser utilizados para transformar células vegetais pode citar-se: a sequência 5' GTT AAA CGT GGT TTG AAA TTG AAA TTG GCT AAA TTG GCT AAA AAA TTG GCT AAA TTG GCT AAA 3' (SEQ ID NO. 5) que codifica o péptido VKRGLKLKLAKLAKKLAKLAK (SEQ ID NO. 6), a sequência 5' AAA TTG GCT AAA TTG GCT AAA AAA TTG GCT AAA TTG GCT AAA AAA CAT TTG AAA AAA CAT TTG AAA AAA CAT TTG AAA 3' (SEQ ID NO. 7) que codifica O péptido KLAKLAKKLAKLAKKHLKKHLKKHLK (SEQ ID NO. 8).

a sequência 5' AAA TTG GCT AAA TTG GCT AAA AAA TTG GCT 14 ΡΕ1519951 AAA TTG GCT AAA GGT AAA CGT AAA AAA AAA GGT AAA TTG GGT AAA AAA CGT GAT CCT 3' (SEQ ID NO.9) que codifica O péptido KLAKLAKKLAKLAKGKRKKKGKLGKKRDP (SEQ ID NO. 10). A invenção interessa-se, deste modo, também pelas aplicações agronómicas dos péptidos descritos anteriormente para tornar as plantas resistentes aos fungos fitopa-togénicos e reduzir assim a utilização, a titulo preventivo ou curativo, de pesticidas químicos tóxicos para o ambiente. A aplicação directa sobre a planta de uma quantidade eficaz de péptidos antifúngicos ou de uma composição que os contenha representa uma primeira forma de realizar a aplicação agronómica. Uma segunda forma de realizar esta aplicação é baseada em técnicas de transgénese que consistem na incorporação de forma estável no ADN de uma célula vegetal, uma sequência polinucleotídica que codifica para um ou vários péptidos antifúngicos acima. As células vegetais assim transformadas permitem regenerar uma planta transmitindo o carácter de resistência às infecções fúngicas à sua descendência. A título de exemplos de plantas, pode citar-se o arroz, o milho, a colza, a beterraba, o trigo, o tabaco, o tomate, a batata.

Os aminoácidos das sequências peptídicas são geralmente representados pelo seu código de uma letra, mas podem também ser representados pelo seu código de três letras, de acordo com a nomenclatura a seguir: ΡΕ1519951 - 15 - A Ala Alanina C Cys Cisteina D Asp Ácido Aspártico E Glu Ácido Glutâmico F Phe Fenilalanina G Gly Glicina H His Histidina I Ile Isoleucina K Lys Lisina L Leu Leucina M Met Metionina N Asn Asparagina P Pro Prolina Q Gin Glutamina R Arg Arginina S Ser Serina T Thr Treonina V Vai Valina w Trp Triptofano Y Tyr Tirosina Outras vantagens e caracteristicas da invenção surgirão a partir dos exemplos que se seguem, dados a titulo ilustrativo, e nos quais será feita referência às figuras em anexo , em que: a figura 1 representa o estudo da actividade hemo- litica dos péptidos No, • 1, No. 2 e No. 3, respec- tivamente, de sequências SEQ ID NO.6, SEQ ID NO.8, SEQ ID NO.10 em eritrócitos humanos. 16 ΡΕ1519951 a figura 2 representa a estabilidade do péptido No. 2 (SEQ ID NO.8) no plasma humano. MATERIAL. 1) Péptidos lineares.

No. 1: VKRGLKLKLAKLAKKLAKLAK (SEQ ID NO.6)

No. 2: KLAKLAKKLAKLAKKHLKKHLKKHLK (SEQ ID NO.8)

No. 3: KLAKLAKKLAKLAKGKRKKKGKLGKKRDP (SEQ ID NO.10) 2) Fungos filamentosos e leveduras.

As estirpes utilizadas e referenciadas nos diversos resultados são itens de bancos de colecção da ATCC (American Type Culture Collection) e do Instituto Pasteur. 3) Células.

Hemácias humanas itens de sangue total são provenientes de Etablissement Français du Sang (EFS) e conservadas a +4°C. 4) Preparação dos péptidos.

As sinteses peptidicas foram realizadas de acordo com as técnicas conhecidas do especialista da técnica. Os péptidos são solúveis na água. 17 ΡΕ1519951 RESULTADOS . I - Determinação da concentração mínima inibitória (CMI) em meio líquido para os fungos filamentosos e as leveduras.

Concentrações de péptido testadas: de 0,2 pg/mL a 100 pg/mL. A tabela 4 a seguir refere-se à actividade dos péptidos contra os fungos.

Tabela 4

Sequência CMI (pg/mL) C. neoformans Cn52D C. albicans ATCC90028 A. Fumigatus 2001/143.02 No. 1 12,5 AND* AND No. 2 1,56 AND AND No. 3 1,56 AND AND * AND: Actividade Não Detectada a 100 pg/mL

Os resultados mostram que os 3 péptidos testados são activos sobre Cryptococcus neoformans. II - Avaliação da actividade hemolítica dos péptidos. lxlO6 eritrócitos humanos são incubados durante 30 minutos com concentrações crescentes de péptidos (de 0 a 500 pg/mL) num volume final de 150 pL. A actividade hemolítica é avaliada por medida da absorvência (Abs) a um 18 ΡΕ1519951 comprimento de onda de 414 nm (Absorvência da hemoglobina) dos sobrenadantes celulares. A absorvência do sobrenadante após incubação dos eritrócitos em água corresponde a 100% (AbslOO) de hemólise e absorvência do sobrenadante após incubação dos eritrócitos em PBS corresponde a 0% de hemólise (Abso) . A actividade hemolitica dos péptidos expressos em percentagem corresponde a (Abspéptido_Abso) /Absioo X 100. A figura 4 representa o estudo da actividade hemolitica dos péptidos No. 1, No. 2 e No. 3 sobre os eritrócitos humanos. Os péptidos não mostram actividade hemolitica. III - Avaliação da estabilidade dos péptidos.

Um volume de 3,9 mL de plasma humano é adicionado a 100 pL de péptido No. 2 a 2 mM. A estabilidade é realizada a 37 °c. Após 0, 0,5, 1, 2, 4 e 6 horas, 3x200 pL são retirados e adicionados a 10 pL de padrão interno (péptido No. 1) a 500 pM em água, nos quais foram adicionados 800 pL de ácido trifluoroacético (TFA) 0,1% em água. Um volume de 1 mL desta mistura é colocada sobre a resina C2 (EC) previamente equilibrada com 1 mL de TFA 0,1% em água, 1 mL de TFA 0,1% em acetonitrilo e 1 mL de TFA 0,1% em água. Após duas lavagens com 1 mL de TFA 0,1% em água, a eluição do péptido e dos seus metabolitos faz-se por 1 mL de TFA 0,1% em metanol. Este é de seguida seco sob um fluxo de ar e recolocado em 200 pL de TFA 0,1% em água. Um volume de 100 pL é analisado por HPLC sobre uma coluna 19 ΡΕ1519951

Luna Cl8 (2), 3 P, 4,6 x 100 mm (Phenomenex) com TFA 0,1% em água como solvente A e TFA 0,1% em acetonitrilo como solvente B. Um gradiente de 15-45% de B em 12 minutos é utilizado para eluição com um débito de 1,2 mL/min e a detecção é realizada a 214 nm. A figura 5 representa o estudo da estabilidade do péptido 2 em três lotes de plasma humano proveniente de grupos sanguíneos diferentes: A+(A); B+(B) e 0+(C). (♦:péptido No. 2, e Δ: metabolitos

Dois metabolitos principais são produzidos por clivagem do péptido No. 2. O péptido No. 2 é degradado ao máximo a 41% após 6 horas de incubação em plasma humano. Qualquer que seja o grupo de onde o plasma é proveniente, não existe diferença significativa na degradação do péptido. IV - Avaliação da toxicidade dos péptidos in vivo. A dose máxima tolerada (DMT) para cada péptido é determinada em ratinhos OF1 fêmeas 28 dias após uma injecção. A DMT é definida como a dose não letal máxima que pode ser injectada. Os péptidos são administrados por via intravenosa em perfusão de 15 minutos aproximadamente. O volume de injecção é de 10 pL/g, o tempo de perfusão é de 1,2 mL/hora e o excipiente é uma solução de NaCl a 0,8%. A tabela 5 a seguir apresenta a DMT dos péptidos

No.l e No.2. ΡΕ1519951 20

Tabela 5 Péptido DMT Péptido 1 >23,2 mg/kg Péptido 2 13,5 mg/kg

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> DIATOS SA <120> Péptidos lineares e catiónicos possuindo propriedades antibacterianas e/ou antifúngicas

<130> 25998FR <14 0> PCT/FR03/XXXXX <141> 2003-07-08 <150> FR02/08565 <151> 2002-07-08 <16 0 > 10 <170> Patentln versão 3.1

<210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> não identificado 21 ΡΕ1519951 <2 2 Ο > <221> PÉPTIDO <222> (1) .. (7) <2 2 3> < 4 Ο Ο > 1

Vai Lya Âtg fíiy £nsu Lys 1 5

<210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> não identificado <220> <221> PÉPTIDO <222> (1)..(12) <223> < 4 0 0 > 2

Lys Elis Leu Lys x»ys sis Leu £*ya Lys Sis leu Lys 1 $ 1Ô

<210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> não identificado 22 ΡΕ1519951 <2 2 Ο > <221> PÉPTIDO <222> (1).. (15) <223> < 4 0 0 > 3

<210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> não identificado <220> <221> PÉPTIDO <222> (1)..(14) <223> < 4 0 0 > 4 hys táú Ma Lys Lee Ala Lys Lys A1& Jtyb Leu Α1Λ lysS 1 S 10

<210> 5 <211> 63 <212> DNA <213> não identificado <2 2 0 > 23 ΡΕ1519951

<221> CDS <222> (1) .. (63) <223> Sequência que codifica o péptido 1 < 4 0 0 > 5 a&a ô§t §06. tt§ asa tt§ tt§ fçfe aaA tfeg aaa fetf

Vai Lys Arg Sly Leu Lys Leu Ltfs Leá àla Lys Leu &la Lys Lye Leu

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Alâ. Lys Lati Ala Lys 20

<210> 6 <211> 21 <212> PRT <213> não identificado <400> 6

Vai Lya Atg Giy Leu Lya Leu. Lys Leu Ala Lye Leu Ale Lye Ly» 1 S 10 15

Ala 1,-ys Leu Ala lys 20

<210> 7 <211> 78 <212> DNA <213> não identificado <220> <221> CDS <222> (1) . . (78) 24 ΡΕ1519951 <223> Sequência que codifica o péptido 2 <400> 7 asa ttg g>;t ttg gct áaa sas ttg get aaa tfcg get S.iâ.ij cat 4A X/ys Leu Ala Lye Leu Ala Lys Lys Leu A.ia tys Lsu Ma Lys HiS I s 10 IS ttg aaa eat ttg aaa & cat ttg s.a,a 78 teu .Ove sis Ley tys Ijiyg His Leu Lys 25

<210> 8 <211> 26 <212> PRT <213> não identificado < 4 0 0 > 8 íry» feçu Ala 1<ys Lçai Ala. Lys Ly# Ala LéU Ais f-ys Lys His I 5 20 1.5

Imv &ys lis Lm tys hys His Leu Lys 20 25

<210> 9 <211> 87 <212> DNA <213> não identificado <220> <221> CDS <222> (1)..(87) <223> Sequência que codifica o péptido 3 25 ΡΕ1519951 <4Ο0> 9 àâá ÇCt SÍ4S ttg QCt asa aáa ttg gct aaa. ttg gct a as ggt aaa £»ys teu Ãit tye teu aí a. &ys Ly» teu Ílâ Lys teu. A.la Lya 01y Lys 7 s 1.0 is çgfc £|S^. 3(¾.1¾ mt asa ttg g:gt saa •SLââ: sgt gst c<*fc feg iys tvs Lys Síy hys teu Gly fys tys Axg Asp Fík?

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Lisboa, 21 de Agosto de 2007

Claims

ΡΕ1519951 1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização para o fabrico de uma composição farmacêutica, destinada a tratar e/ou prevenir uma infecção fúngica no homem ou no animal, de um péptido compreendendo ou consistindo em: (i) uma primeira sequência peptidica de fórmula (KLAKLAK) , em que K é o aminoácido Lisina, L é o aminoácido Leucina e A é o aminoácido Alanina, e (ii) uma segunda sequência peptidica de fórmula (B), em que B é um péptido de 4 a 15 aminoácidos carregados positivamente a pH neutro, compreendendo ou consistindo em, pelo menos, um motivo peptidico de fórmula βΧΧβ, em que β é um aminoácido básico e X é um aminoácido qualquer, e no qual, a referida primeira sequência peptidica é repetida n vezes e a referida segunda sequência peptidica é repetida m vezes, sendo nem números inteiros compreendidos entre 1 e 5.
2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a composição farmacêutica fabricada ser destinada a tratar e/ou prevenir uma infecção fúngica causada por um fungo filamentoso ou uma levedura.
3. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada por o número de repetição (n) da 2 ΡΕ1519951 primeira sequência do referido péptido ser um número inteiro compreendido entre 1 e 3.
4. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por o número de repetição (m) da segunda sequência peptidica (B) do referido péptido ser superior a 1 e em que as segundas sequências peptidicas (B) são idênticas ou diferentes.
5. Utilização de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por os motivos peptídicos de fórmula βχχβ serem idênticos ou diferentes, em cada uma das segundas sequências peptidicas (B).
6. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada por as primeira (s) e segunda(s) sequências peptidicas dos referido péptidos serem: - alternadas, ou - reagrupadas com uma e/ou com a outra das extremidades N e C terminais de uma ou das referidas primeira(s) ou segunda (s) sequências peptidicas.
7. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada por a ou as primeiras sequências peptidicas serem reagrupadas com uma e/ou com a outra das extremidades N e C terminais da ou das segundas sequências peptidicas. 3 ΡΕ1519951
8. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada por as primeira (s) e segunda(s) sequências peptidicas estarem ligadas por ligações covalentes, vantajosamente ligações peptidicas .
9. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada por no motivo peptidico de fórmula βΧΧβ do referido péptido, β ser um aminoácido básico, de preferência seleccionado no grupo compreendendo a arginina (R) e a lisina (K) , e X é seleccionado no grupo compreendendo a leucina (L), a glicina (G) e a histidina (H).
10. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada por a segunda sequência peptídica de fórmula (B) ser uma sequência seleccionada no grupo compreendendo SEQ ID NO.l, SEQ ID NO.2 e SEQ ID NO.3.
11. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada por o péptido ser seleccionado no grupo compreendendo SEQ ID NO.6, SEQ ID NO.8 e SEQ ID NO.10.
12. Utilização, como antifúngico numa planta, de um péptido tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11. 4 ΡΕ1519951
13. Utilização de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por o referido péptido possuir uma actividade contra os fungos filamentosos e as leveduras.
14. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 ou 13, caracterizada por o referido péptido ser codificado por um polinucleótido compreendido num vector de ácido nucleico, sendo o referido vector previamente transformado na referida planta.
15. Célula vegetal compreendendo uma molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 14.
16. Planta produzida a partir de uma célula vegetal de acordo com a reivindicação 15. Lisboa, 21 de Agosto de 2007