KR100897915B1

KR100897915B1 - 경피전달을 위한 약제 조성물

Info

Publication number: KR100897915B1
Application number: KR1020077009791A
Authority: KR
Inventors: 이승규; 이상규; 이동호
Original assignee: 포휴먼텍(주)
Priority date: 2004-11-03
Filing date: 2005-11-03
Publication date: 2009-05-18
Also published as: US8067376B2; KR20070083862A; EP1809291A4; CN101072566B; US20080306075A1; CN101072566A; EP1809291A1; WO2006049442A1; JP4933440B2; JP2008519068A

Abstract

본 발명은 메토트렉세이트 (methotrexate)와 PTD (protein transduction domain)의 컨쥬게이트를 함유하는 경피전달 약제 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 메토트렉세이트를 피부를 통해 국소부위로 전달할 수 있으므로, 건선, 류마티스 및 염증관련 질병의 치료에 널리 사용되는 메토트렉세이트의 부작용을 최소화할 수 있다.

Description

경피전달을 위한 약제 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR TRANSDERMAL DELIVERY}

본 발명은 메토트렉세이트 (methotrexate)와 PTD (protein transduction domain)의 컨쥬게이트를 함유하는 신규한 경피전달 약제 조성물에 관한 것이다.

일반적으로 메토트렉세이트 (methotrexate)는 세포내에서 DNA 합성과 세포성장 및 분열에 필요한 엽산 (folic acid) 대사를 저해하는 것으로 널리 알려져 있다. 구체적으로, 메토트렉세이트는 엽산 대사에 관계되는 효소계 중의 하나인 디하이드로 엽산 환원효소 (Dihydrofolate reductase: DHFR)의 효소 활성을 저해한다. 이와 같이, 메토트렉세이트는 세포증식을 억제하여 다양한 질환에 적용될 수 있는 약물로서, 류마티스 관절염 및 건선 등 과 같은 자가면역질환에 효과가 있으며, 투여 후 2주 정도면 증상이 완화되는 매우 빠른 약효를 나타낸다. 그러나, 메토트렉세이트는 환자에 따라 심각한 간 독성, 위장 장애, 신장과 조혈기관의 손상을 일으키는 부작용이 계속하여 보고되고 있어 장기간 사용하는 것이 곤란하다. 또한, 주로 경구투여 또는 주사제로서 처방 되고 있으나, 경구 투여의 경우 통상 일주일 간격으로 유효약물 2.5 mg을 12시간마다 3회에 복용하여야 하는 등 매우 불편하였다. 따라서, 메토트텍세이트의 약물 전달 효율을 증가시켜 그 투여량을 감소시킴으로써 부작용을 최소화하고, 주사 및 경구투여의 불편함을 해소할 수 있는 새로운 약물전달방법에 대한 개발의 필요성이 지속적으로 요구되어 왔다.

한편, PTD(protein transduction domain)는 숙주세포내로 생리활성분자를 침투시키는데 이용되는 저분자량의 펩타이드를 일컫는 것으로서, 1998년 HIV 바이러스의 표면단백질에서 발견된 TAT가 최초로 보고된 PTD이다. 이 TAT PTD는 분자량 120 kDa 이상의 대형 단백질을 단시간 내에 효율적으로 세포 내로 전달하는 것으로 보고되었다. TAT PTD 이후 이와 유사한 기능을 하는 몇 개의 다른 아미노산 서열의 PTD 펩타이드 들이 발견되었고, 이들을 이용한 새로운 개념의 신약개발 및 DDS 연구의 방향이 제시되어, 의약 및 약학 분야의 선진국들은 새로운 PTD의 발견 및 이를 이용한 새로운 신약개발을 위하여 많은 노력을 기울여 왔다. 본 발명자들 역시 이러한 PTD의 개발을 위한 연구를 수행하였으며, 그 결과 기존에 보고된 PTD들 보다 in vitro 및 in vivo에서 단백질 등 거대분자를 세포내로 전달하는데 있어 훨씬 더 우수한 효과를 나타내는 신규한 PTD를 개발하였다 (PCT/KR2003/000121 및 PCT/KR2003/000122).

이에 본 발명자들은 메토트렉세이트의 효과적 국소 전달을 위해, PTD와 메토트렉세이트의 컨쥬게이트를 제조하고, 이를 함유하는 신규한 경피전달 약제 조성물을 피부 위에 도포하여 그 결과를 관찰하였다. 그 결과 메토트렉세이트가 표피를 통과하여 병소부위에 전달되어 약리효과를 나타낸다는 놀라운 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

기술적 과제

본 발명은 메토트렉세이트와 PTD의 컨쥬게이트를 함유하는 신규한 약제조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 다른 목적은 메토트렉세이트를 경피투여에 의해 국소전달하는 방법에 관한 것이다.

도 1은 펩타이드 결합에 의한 메토트랙세이트 (MTX; methotrexate)와 PTD(protein transduction domain) 컨쥬게이트 (MTX-PTD)의 제조를 나타낸다.

도 2는 본 발명에 따른 MTX-PTD 컨쥬게이트에 대한 HPLC 결과를 나타낸다.

도 3 및 4는 본 발명에서 사용된 PTD의 경피전달을 나타내는 공초점현미경 사진이다.

도 5는 본 발명에 따른 MTX-PTD의 세포 증식 억제효과를 나타내는 그래프이다.

도 6는 본 발명에 따른 MTX-PTD의 처리에 따른 관절염 지수 (arthritis index) 변화를 나타내는 그래프이다.

도 7은 본 발명에 따른 MTX-PTD 처리 후의 혈액 내 IL-4 및 IFN-γ의 함유량을 나타내는 그래프이다.

도 8는 본 발명에 따른 MTX-PTD 처리 후의 혈액 내 IL-6 및 TNF-α 함량을 나타내는 그래프이다.

도 9은 본 발명에 따른 MTX-PTD 처리 후의 혈액 내 관절염 요인 (RA factor) 을 나타내는 그래프이다.

도 10은 본 발명에 따른 MTX-PTD 처리 후의 염증부위 조직을 나타내는 사진이다.

도 11은 TPA 유발 염증 동물 모델에서 MTX-PTD의 부종 억제 효과를 나타내는 그래프이다.

발명의 실시를 위한 최선의 형태

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 펩타이드인 PTD (protein transduction domain)와 하기 화학식 1의 메토트렉세이트 (MTX)의 컨쥬게이트를 제공한다. 본 발명의 컨쥬게이트는 먼저 PTD를 고상합성법으로 합성한 다음, MTX의 -COOH 기와PTD 의 N 말단을 펩타이드 결합으로 연결함으로써 수득할 수 있다(도 1 참조).

화학식 1:

본 발명에 따른, MTX-PTD는 PTD의 세포내 침투 및 전달효과에 의해 용이하게 표피를 통과하여 병소부위의 세포내로 전달되고, 세포내로 전달된 컨쥬게이트는 세포내의 단백질 분해효소에 의해 분해되며, 그 결과 분리된 MTX가 약리효과를 나타낸다. 본 발명에서 사용된 PTD는 단백질, 펩타이드 및 화학화합물 등을 피부, 안구 또는 기도를 통해 체내로 전달하는 특성이 매우 우수하므로, MTX와 컨쥬게이트로서 제공되는 경우 다양한 투여 경로를 통해 이를 체내 국소부위로 전달할 수 있다. 또한, MTX와 PTD컨쥬게이트는 다양한 링커에 의해 연결될 수 있으며, 특히 링커를 특정 분해효소에 의해 특이적으로 분해되는 부위를 포함하도록 구성함으로써, MTX를 목적하는 국소부위에서 보다 더 효과적으로 작용할 수 있도록 디자인 할 수 있다. 링커는 치료의 목적 및 방향의 설정에 따라 여러가지 가능하며, 국소부위의 효과를 극대화하기 위해서는 세포내에서 쉽게 분해되는 -O- 또는 -S-S- 의 결합을 포함한 링커를 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 전신적인 효과를 목적으로 하는 경우에는, 펩티드 결합을 포함한 스페이서 (spacer) 개념의 링커를 도입하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 PTD는 본 발명자들이 개발하여 특허출원한 것으로서 하기 서열번호: 1 및 서열번호: 2의 펩타이드를 고상 합성법에 의해 제작하여 이용하였으나, 목적하는 전달 부위 및 사용하는 링커에 따라 다른 종류의 PTD 가 이용되거나, 상기 서열번호: 1 및 서열번호: 2의 아미노산 서열과 70％ 이상 상동인 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드가 본 발명의 목적으로 위해 이용 될 수 있음은 물론이다. PTD는 아미노산이 3 내지 30개로 구성되고 아미노산 중 적어도 30％ 이상이 아르기닌인 것이 바람직하다.

Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg: (서열번호: 1)

Ala Lys Ala Ala Arg Gln Ala Ala Arg: (서열번호 2)

피부를 통한 약물의 전달은 피부의 구조적, 물리적 특성상 여러 가지 제한이 있다. 특히, 피부의 최외각층인 각질층은 피부의 주요 구성 세포인 케라티노사이트 (keratinocyte)가 자연사 되어 피부의 최외각층에 치밀하게 구조를 이루고 있으며, 외부의 물질의 침투 및 수분의 증발을 억제한다. 또한 땀 및 각종 지질로 인하여 pH 5 부근의 산성 영역에 있다. 이러한 각질층을 투과하기 위해서는 분자량이 1,000 이하로 작아야 하고, 친지질 특성을 보유하고 있어야 가능하다.

본 발명에 따른 조성물은 조성물의 중량을 기준으로 MTX-PTD 컨쥬게이트 0.01％∼0.5％ 및 약제학적 담체를 함유한다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 조성물의 중량을 기준으로 에탄올 3％∼5％, 유동파라핀 5％~10％, 바세린 30％∼40％, 글리세린 5％∼10％, 폴리에틸렌글리콜 20％∼30％ 및 MTX-PTD 컨쥬게이트 0.05％∼0.2％를 포함한다.

본 발명은 일 구체예에서, 본 발명에서 사용된 PTD의 세포 내 침투 효과에 대한 측정 결과를 제시한다. PTD에 FITC 형광물질을 연결한 복합체를 사용하여 형광세기를 측정하였으며, 그 결과 PTD가 매우 효율적으로 FITC를 세포내로 전달하였음을 확인하였다.

다른 일구체예에서, 본 발명은 HeCaT 세포주 (충남대학교 피부과로부터 입수)를 사용하고 MTX 단독, MTX-PTD 컨쥬게이트 및 MTX-ACA-PTD 컨쥬게이트를 이용하여 이들 각각의 세포증식억제 효과를 분석하였다. 그 결과 MTX-ACA-PTD가 가장 우수한 억제효과를 보였으며, 다음으로 MTX-PTD 컨쥬게이트였으며, MTX를 단독으로 사용한 것이 가장 낮은 증식억제효과를 나타냈다.

다른 일구체예에서, 본 발명은 관절염 동물모델에서의 MTX-ACA-PTD의 약리효 과를 측정하였다. 그 결과 MTX-ACA-PTD의 연고제형군 (M3)이 MTX-ACA-PTD의 I.P.주사군 (M2) 및 단독의 MTX의 I.P. 주사군 (M1)과 거의 동일한 효과를 나타냄을 확인 하였다 (도 7, 도 8 및 도 9). 또한, IL-4, IL-6, TNF-α 수준과 관절염 요인 (arthritis factor)에 대한 측정 결과는 MTX-ACA-PTD가 피부를 투과하여 각종 염증세포 및 면역세포의 활성을 효과적으로 억제하였음을 제시한다.

본 발명에서, 용어 "면역세포"는 T cell, B cell 를 의미한다.

본 발명에서, 용어 "염증세포"는 대식세포 (macrophage), 호산구 (eosinophil), 호중구 (neutorphil), 호염기구 (basophil)를 의미한다.

본 발명의 약학 조성물은 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화할 수 있다. 경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경.연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제(elixirs) 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유할 수 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다.

또한, 트립토렐릭스-1 및 이의 유사체를 유효 성분으로 함유 하는 약학 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사를 주입하는 방법에 의한다. 이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 상기 트립토렐릭스-1 및 이의 유사체를 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제조할 수 있다.

상기 약학 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.

본 발명의 펩타이드를 세포내로 도입하기 위해 단백질 운반 도메인 (PTD: protein transduction domain)을 상기 펩타이드와 융합하여 융합단백질을 생성하여 이용할 수 있다. 단백질 운반 도메인 (PTD)는 종래기술에 알려진 임의의 PTD를 사용할 수 있다.

유효 성분으로서 트립토렐릭스-1 및 이의 유사체는 사람을 포함하는 포유동물에 대해 하루에 0.01 내지 500 mg/kg(체중), 바람직하게는 0.1 내지 50 mg/kg(체중)의 양으로 1일 1회 또는 분할하여 경구 또는 비경구적 경로를 통해 투여할 수 있다. 투여량은 환자의 연령, 성별, 질병의 경중에 따라 적절히 선택할 수 있다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 좀더 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: PTD-MTX 의 합성

PTD-MTX를 고상반응을 통하여 합성하였다. PTD 는 서열번호: 1 (Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg) 및 서열번호: 2 (Ala Lys Ala Ala Arg Gln Ala Ala Arg)의 펩타이드를 제조하여 실험에 이용하였다. 아미노산은 PTD 합성 전에 반응상에서 부반응을 초래할 수 있는 부분을 보호 (protection)하였다. A (알라닌), V (발린), G (글리신), P (프롤린)등의 측쇄는 반응성이 없으므로, NH 만 Fmoc (Fluorenylmethoxy carbonyl)으로 보호된 제품을 사용하였으며 R (아르기닌)과 Y (티로신), K (리신) 은 측쇄 반응성이 있으므로 Pmc (2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl), tBU (t-butyl)을 사용하여 각각 보호하였다. NH₂ 는 위의 다른 제품과 마찬가지로 Fmoc (Fluoreny lmethoxy carbonyl)로써 보호하였다. MBHA 수지 (입수처: Beadtech, cat. No. SHI-B16) (0.1 mmol) DMF (dimethylformamide) 에 15분간 스윌링 (swelling)시킨 후 피페리딘 (piperidine) : DMF (50:50) 용액으로 15분간 2회에 걸쳐 Fmoc을 제거했다. 보호된 아미노산 0.15 mmol에 DIC (1,3-Diisopropyl-cabodiimide) 0.15 mmol과 HOBt (N-Hydroxybenzotriazole) 0.15 mmol을 DMF 용액에 혼합하여 30분간 활성화 시킨 후에 Fmoc이 제거된 MBHA 수지와 같이 혼합한 다음 4시간 정도 반응시키고 이를 3회 반복하였다. 상기 반응을 반복하여 PTD-수지의 펩타이드를 합성하였다. 다음 MTX (0.15 mmol)를 PyBOP (Benzotriazole-1-yl-oxy-tris-pyrrolidino- phophoniumhexafluorophosphate) 0.15 mmol, HOBt (N-Hydroxybenzotriazole) 0.15 mmol과 DMF 용액에 혼합하여 30분간 활성화 시킨 후에 완성된 PTD-수지와 혼합하여 4시간 동안 반응시켰다. 최종적으로 TFA:H2O:EDT:티아조아니솔 (thioanisole):페놀 (phenol) = 8.25:0.5:0.25:0.25:0.75 조성의 용액으로 24시간 동안 반응시켜 각각의 아미노산 보호기와 수지를 제거한 다음 HPLC로 분리 정제하여 질량 측정 후 HPLC상에서 분리정제 된 MTX-PTD 컨쥬게이트를 동결건조함으로써 최종 생성물을 수득했다.

한편, PTD 는 펩타이드로서 α-helix 구조를 이루어 MTX와 융합 되는 경우, 펩타이드의 3차원적 구조에 따른 입체효과 (steric hindrance effect)로 인해 MTX가 그 약효를 나타내기 매우 힘들다. 이에 본 발명자는 PTD 와 MTX 사이에 구조적으로 거리를 유지할 수 있는 직선형의 링커를 도입하여 이를 해결하였다. 본 실험에서는 링커로서 아미노카프론산 (amino caproic acid)을 이용하였다. 고상합성에서 ACA-PTD-수지를 동일한 공정으로 합성하고, PTD-MTX 컨쥬게이트 합성과 동일한 방법으로 ACA-PTD-수지에 반응시켜 PTD-ACA-MTX 컨쥬게이트를 합성하였다 (도 4 및 도 5, 서열번호: 1의 PTD를 사용한 것만 도시).

실시예 2: 경피 전달 효과

PTD의 경피 전달 효과를 측정하기 위하여, PTD에 형광 물질인 FITC를 화학적으로 융합하고 이를 피부로 전달하여, 전달 정도를 측정하였다.

PTD-FITC는 아미노카프론산 (amino caproic acid)을 링커로 사용하여 제조하였다. 전달 피부는 사람의 피부와 표피 (epidermis) 의 두께가 유사한 4일령의 돼지의 피부를 이용하였다. 경피 전달 실험을 위한 조성물은 PTD-FITC를 10 mM의 농 도로 (바세린:폴리에틸렌글리콜 = 8:2)로 구성된 크림 형태의 조성물에 혼합하여 연고 제형을 제조하여 이용하였다.

4일령 돼지의 등에 일반 면도기를 이용하여 제모하고, 5cm 정도의 부위를 고르게 연고 제형을 도포한 다음 2시간 경과 후, 돼지를 희생시켜 등 피부를 적출하여 동결절단 (frozen section) 후, 공초점현미경 (confocal microscope)으로 관찰하여 피부의 전달 효율을 분석하였다. 관찰 결과, 표피 뿐만 아니라 진피 (dermis) 까지 전달됨을 확인하였으며, 이 결과를 통해 경피 전달을 통한 약물 전달의 가능성을 확인하였다 (도 5, 서열번호: 2의 PTD는 도시하지 않음).

실시예 3: in vitro 에서의 PTD-MTX 의 효과

본 실시예에서는 in vitro에서 WST-1 검정 (Roche Biochemical)을 통한 세포증식억제 효과를 관찰하였다.

PTD-MTX의 세포증식억제 효과를 분석하기 위하여, HeCaT 세포주 (충남대학교 피부과로부터 입수)를 사용하여 세포 사멸을 분석하였다. 96 웰 플레이트 상의 DMEM (10％ FCS, 항생제 (GIBCO)) 배지에 세포 (1 x 10⁶ cell/well)를 접종한 후, 하룻 밤 배양하고 MTX 단독, 실시예 1의 PTD-MTX 컨쥬게이트 및 PTD-ACA-MTX를 각각 0.2, 1.5, 4.4, 13.3, 40 μM의 농도로 첨가하여 2일 경과 후, WST-1 검정을 통해 증식 억제를 분석하였다.

WST-1 검정에서, 테트라졸리움 염 (Tetrazolium salt)은 미토콘드리아의 호흡사슬에 존재하여 생존 세포에만 활성이 있는 숙시네이트-테트라졸리움-환원제 (succinate-tetrazolium-reductase)에 의해 포르마잔 (formazan) 색소로 분해되고, 생존 세포수가 증가하면 시료중의 미토콘드리아 탈수소효소 전체의 활성이 증가하므로, 이 효소활성의 증가가 포르마잔 색소의 생성증가를 유도하기 때문에 포르마잔 색소와 배지 중의 대사활성이 있는 세포의 수와는 직선적인 상관을 나타내게 된다. ELISA 리더로 색소 용액의 흡광도를 측정하여 대사활성이 있는 세포가 만들어내는 포르마잔 색소를 정량하여 세포증식능력이나 세포생존능력을 관찰하였다.

실험결과 세포증식 억제 효과는 MTX 단독 < PTD-MTX < PTD-ACA-MTX의 순서로 분석되었다. 기존에 효소 테스트에서 PTD-MTX 컨쥬게이트가 단독의 MTX에 비하여 낮은 효과를 나타내는 것과 대비되는 이러한 결과는, ⅰ) PTD 에 의해 증진된 MTX의 세포내 전달 효과 및 ⅱ) 세포내에서의 대사작용에 의한 PTD의 대사에 의해 PTD의 입체영향 효과가 제거되기 때문인 것으로 보인다. 또한, 본 발명에서 제조한 MTX와 PTD의 컨쥬게이트는 MTX의 활성 부위를 보존하고 있기 때문에 PTD에 의한 장애 효과는 무시되는 것으로 판단된다 (도 6, 서열번호: 2의 PTD는 도시하지 않음).

실시예 4: 관절염 동물모델에서의 PTD-ACA-MTX 의 효과

PTD-ACA-MTX컨쥬게이트의 약리효과의 in vivo 검증을 위해, DBA/lJ 마우스(입수처: 샘타코)에 콜라겐 e II형 (입수처: sigma)을 주사하여 류마티스 관절염을 유발하였다. 시험군은 실시예에 따라 제조한 PTD-ACA-MTX 컨쥬게이트 I.P. 주사군, 실시예 1에서 제조한 PTD-ACA-MTX 컨쥬게이트의 경피투여용 조성물, MTX 단독의 I.P. 주사군으로 구분하였다. 주사군은 MTX 기준으로 0.3 mg/kg의 용량으로 4 주간 주사하고, 경피투여용 조성물은 조성물 중량을 기준으로 에탄올 5％, 유동파라핀 15％, 바세린 40％, PTD-ACA-MTX 컨쥬게이트 0.1％ 및 글리세린 10％, 폴리에틸렌글리콜 30％로 구성된 크림형태의 조성물에 PTD-ACA-MTX를 0.1 wt％로 함유시켜 제조한 후, 주 4 회 류마티스가 유발된 관절부위에 도포하였다. 약물 처리 후, 관절염 지수 (arthritis index)를 주 1회씩 모니터링 하였으며, 4 주 후 동물을 희생하여 혈액에서의 IL-4, IL-6, TNF-α 수준과 관절염 요인 (arthritis factor)를 측정했다 (도 7, 도 8 및 도 9, 각 도에서 서열번호: 2의 PTD를 사용한 것의 결과는 도시하지 아니함). 도 7, 도 8 및 도 9에서 N은 정상 마우스, CT는 콜라겐을 주사하여 류마티스 관절염을 유발시킨 마우스, M1은 단독의 MTX의 I.P. 주사군, M2는 PTD-ACA-MTX의 I.P. 주사군, M3는 PTD-ACA-MTX의 연고제형군이다.

그 결과 최근 류마티스 관절염에서 가장 중요한 TNF-α 같은 염증 매개 사이토카인 (cytokine)의 양은 크게 감소되고, 조직 (tissue) 사진에서도 염증 부위로 침투된 염증세포가 약물의 처리에 따라 크게 감소되었음이 확인되었다. 이는 PTD-ACA-MTX가 피부를 투과하여 각종 염증세포 및 면역세포의 활성을 효과적으로 억제하였음을 제시한다(도 8, 서열번호: 2의 PTD를 사용한 결과는 도시하지 아니함). 도 8에서 상단 사진은 H＆E 염색법, 하단 사진은 M-T 염색법을 사용하여 염색 후 사진이며, Normal DBA/1J는 샘타코로부터 입수한 정상의 DBA/1J 마우스, CIA control은 콜라겐 e II형을 주사하여 류마티스 관절염을 유발시킨 마우스, M1은 단독의 MTX의 I.P. 주사군, M2는 PTD-ACA-MTX의 I.P. 주사군, M3는 PTD-ACA-MTX의 연고제형군이다.

실시예 5: 염증질환 모델의 PTD-ACA-MTX 효과

건선에 대한 치료 효과를 확인하기 위해, 실시예 1에서 제조한 PTD-ACA-MTX 컨쥬게이트를 사용하여 피부 염증에 대한 치료 효과를 분석하였다. ICR 마우스 (입수처: 샘타코)의 귀에 TPA (12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate, Alexis biochemical, San Diego) 를 3일간 매일 1회씩 도포하여 피부 염증을 유발하였다. 실험 시작 5일 후에 귀 두께를 계기 (micrometer screw), 측정하여 팽윤된 두께를 계산하여 만성 부종 (edema)의 척도로서 사용하고 귀를 펀칭하여 염증 부위의 염증 세포를 분석하였다. PTD-ACA-MTX는 경피투여용 조성물을 이용한 피부 도포로 실시하였다. 경피투여용 조성물은 상기 실시예에서와 마찬가지로 제조하였으며, 1일 1회씩 10일간 도포하였다 (도 11).

실시예 6: 랫트를 이용한 단회 피하 투여 독성시험

실시예 1의 PTD-ACA-MTX의 단회피하투여에 의한 독성을 조사하였다. Sprague Dawley(SD, 구입처 : 샘타코) 계통 암수 랫트에 멸균주사용수를 투여한 부형제 대조군과 본 발명의 컨쥬게이트 5, 50 및 500 mg/kg을 투여한 시험물질 투여군을 설정하여 시험하였다. 각 군별 동물 수는 10 마리 (암수 각 5 마리)로 하였고, 2 주간의 사망률, 일반증상, 체중변화 및 부검소견을 관찰하였다. 모든 시험방법은 한국 식품의약품안전청의 독성시험 지침에 의하여 수행하였고, 시험결과는 다음과 같았다.

ⅰ) 모든 시험기간동안 시험물질에 의한 사망동물은 관찰되지 않았다.

ⅱ) 암수 500 mg/kg 투여군에서 시험물질에 의해 투여 1 일째부터 울혈이 관찰되었고, 2 일째부터 가피형성이 관찰되었다. 수컷 500 mg/kg 투여군에서는 전신 적인 부종도 관찰되었다. 또한, 투여 4 일째부터 6 일째까지 산발적으로 설사 및 연변이 관찰되었다.

ⅲ) 체중 변화에서 시험물질에 의해 수컷 500 mg/kg 투여군에서 3 일, 7 일 및 14 일째 체중증가억제가 관찰되었다.

ⅳ) 부검소견에서는 암수 500 mg/kg 투여군에서 시험물질에 의해 투여부위 가피형성 및 붉은 액체저류가 관찰되었고, 암컷에서는 비장비대가 관찰되었다.

이상의 결과로 보아 본 시험 조건 하에서 본 발명의 컨쥬게이트의 랫트에 대한 피하투여는 500 mg/kg 투여군에서의 최소치사량(MLD)은 500 mg/kg을 상회하는 것으로 판단되었다.

실시예 7: 비이글 개 (Beagle dog)를 이용한 단회 피하 투여 독성시험

본 발명의 컨쥬게이트의 단회 투여에 의한 독성을 조사하였다. 암수 비이글 개에 본 발명의 컨쥬게이트를 각각 4, 20 및 100 mg/kg씩 피하 투여하였다. 각 군별 동물 수는 4 마리(암수 각 2 마리)였으며, 2 주간의 사망률, 일반증상, 체중변화 및 부검소견을 관찰하였다. 모든 시험방법은 한국 식품의약품안전청의 독성시험 지침에 의하여 수행하였으며, 시험결과는 다음과 같았다.

ⅱ) 암수 20 mg/kg 이상의 투여군 모두에서 시험물질 투여후 1시간째부터 6시간째까지 안검의 부종이 관찰되었고 100 mg/kg 투여군에서 암수 각 1 마리씩 투여후 1시간째부터 자발운동감소가 관찰되었다. 수컷 20 mg/kg 투여군의 1 마리의 부종과 암컷 100 mg/kg 투여군의 1 마리의 부종과 자발운동감소가 투여후 2일째까 지 지속되었다. 수컷 100 mg/kg 투여군에서는 투여후 2 일째부터 4일째까지 식욕부진이 있었고 투여 후 3일째에 설사가 관찰되었다.

ⅲ) 체중 변화에서 시험물질에 의해 암수 모두 100 mg/kg 투여군에서 투여후 3 일째 일시적인 체중 증가 억제가 관찰되었다.

ⅳ) 부검소견에서는 이상 소견이 관찰되지 않았다.

요약하면, 본 시험 조건 하에서 본 발명의 컨쥬게이트의 비이글 개에 대한 피하투여는 암수 20 mg/kg 이상의 투여군에서 안검의 부종, 수컷 100 mg/kg 투여군에서 자발운동감소, 일시적인 식욕저하와 설사, 암컷 100 mg/kg 투여군에서 자발운동감소가 있었고, 100 mg/kg 투여군에서 투여후 3 일째 일시적인 체중의 감소가 관찰되었다. 이상의 결과로 볼 때 피하투여에 의한 최소 치사량은 암수 모두 100 mg/kg을 상회하는 것으로 나타났다.

실시예 8: 토끼를 이용한 피부자극 시험

본 발명의 컨쥬게이트의 피부자극성을 조사하였다. 뉴우질랜드 화이트계 백색 토끼의 건강한 피부 및 찰과 피부에 적용한 후 본 발명의 컨쥬게이트를 적용하지 않은 건강한 피부 및 찰과 피부와 반응을 비교 평가하였다.

ⅰ) 일반증상에서 시험물질 적용에 의한 이상은 관찰되지 않았다.

ⅱ) 체중의 변화에서 시험물질 적용에 의한 이상변화는 관찰되지 않았다.

ⅲ) 시험물질 적용 후 전 관찰기간동안 정상부위 및 찰과 부위에서 아무런 이상도 관찰되지 않았다.

ⅳ) 피부자극성의 평가결과 본 시험물질의 피부자극지수는 0으로 비자극성 물질에 해당되었다. 대조물질의 경우 피부자극지수는 0.17로 비자극성 물질에 해당되었다.

본 시험조건 하에서 본 발명의 컨쥬게이트는 뉴질랜드 화이트계 백색 토끼의 피부에 대한 피부 자극시험 결과 비자극성 물질에 해당되었다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 메토트렉세이트와 PTD의 컨쥬게이트를 함유하는 경피전달 약제 조성물은, 이 조성물을 간편하게 피부에 도포함으로써 부작용을 최소화하면서 메토트렉세이트를 병소부위에 효과적으로 전달할 수 있다.

Claims

메토트렉세이트 (Methotrexate)와 PTD (protein transduction domain)의 컨쥬게이트 0.01wt％ 내지 0.5wt％ 및 부형제를 함유하는, 자가면역질환을 치료하기 위한 경피전달 약제 조성물.
제 1항에 있어서, PTD가 서열번호: 1의 아미노산 서열 또는 이들 아미노산 서열과 70％ 이상 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드임을 특징으로 하는, 자가면역질환을 치료하기 위한 경피전달 약제 조성물.
제 1항에 있어서, PTD가 서열번호: 2의 아미노산 서열 또는 이들 아미노산 서열과 70％ 이상 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드임을 특징으로 하는, 자가면역질환을 치료하기 위한 경피전달 약제 조성물.
제 1항에 있어서, PTD가 5개 내지 30개의 아미노산으로 구성되고, 구성 아미노산 중 30％ 이상이 아르기닌 (arginine)임을 특징으로 하는, 자가면역질환을 치료하기 위한 경피전달 약제 조성물.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, PTD와 메토트렉세이트가 직접적인 공유결합, 펩타이드 결합 또는 링커에 의해 연결됨을 특징으로 하는, 자가면 역질환을 치료하기 위한 경피전달 약제 조성물.
제 5항에 있어서, 링커가 -O- 또는 -S-S- 결합을 포함함을 특징으로 하는, 자가면역질환을 치료하기 위한 경피전달 약제 조성물.
제 5항에 있어서, 링커가 아미노산카프론산 (amino caproic acid)임을 특징으로 하는, 자가면역질환을 치료하기 위한 경피전달 약제 조성물.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 자가면역질환이 건선 또는 류마티스 관절염임을 특징으로 하는, 자가면역질환을 치료하기 위한 경피전달 약제 조성물.
제 5항에 있어서, 자가면역질환이 건선 또는 류마티스 관절염임을 특징으로 하는, 자가면역질환을 치료하기 위한 경피전달 약제 조성물.
제 6항에 있어서, 자가면역질환이 건선 또는 류마티스 관절염임을 특징으로 하는, 자가면역질환을 치료하기 위한 경피전달 약제 조성물.
제 7항에 있어서, 자가면역질환이 건선 또는 류마티스 관절염임을 특징으로 하는, 자가면역질환을 치료하기 위한 경피전달 약제 조성물.
매토트랙세이트와 PTD 컨쥬게이트를 유효성분으로 하는 면역질환 또는 염증질환 억제용 경피 조성물.
제 12항에 있어서, PTD가 서열번호: 1의 아미노산 서열 또는 이들 아미노산 서열과 70％ 이상 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드임을 특징으로 하는 조성물.
제 12항에 있어서, PTD가 서열번호: 2의 아미노산 서열 또는 이들 아미노산 서열과 70％ 이상 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드임을 특징으로 하는 조성물.