KR20220124921A - 메토트렉세이트 접합체 화합물 및 이를 포함한 경피 투여용 조성물 - Google Patents
메토트렉세이트 접합체 화합물 및 이를 포함한 경피 투여용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 메토트렉세이트(methotrexate)와 피부 투과 촉진을 위한 펩타이드의 신규 접합체(conjugate) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 화합물을 유효 성분으로 포함하는 약학 조성물, 바람직하게는 국소 투여용 경피 전달 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 접합체 화합물은 그 자체로 우수한 약리 활성을 나타낼 뿐만 아니라, 경피 투여에 용이하다. 따라서 본 발명의 화합물은 건선, 류마티스 및 염증 관련 질병의 치료에 널리 사용되는 메토트렉세이트의 부작용을 최소화할 수 있다.
Description
본 발명은 메토트렉세이트(methotrexate)의 신규 유도체 화합물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 화합물을 유효 성분으로 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 화합물을 유효 성분으로 포함하는 경피 투여용 약학 조성물에 관한 것이다.
메토트렉세이트(methotrexate)는 세포내에서 DNA 합성과 세포성장 및 분열에 필요한 엽산 (folic acid) 대사를 저해하는 것으로 알려져 있다. 구체적으로, 메토트렉세이트는 엽산 대사에 관계되는 효소계 중의 하나인 디하이드로 엽산 환원효소 (Dihydrofolate reductase: DHFR)의 효소 활성을 저해한다. 이러한 효소 활성 저해를 통해, 메토트렉세이트는 세포증식을 억제하여 다양한 질환에 적용될 수 있는 약물이며, 류마티스 관절염, 건선 등과 같은 자가면역질환, 염증, 암 등에 효과가 있다.
그러나, 메토트렉세이트는 환자에 따라 심각한 간 독성, 위장 장애, 신장과 조혈기관의 손상을 일으키는 부작용이 보고되고 있어 장기간 사용하는 것이 곤란하다. 또한, 메토트렉세이트는 주로 경구투여 또는 주사제로서 처방 되고 있으나, 경구 투여의 경우 통상 일주일 간격으로 유효약물 2.5 mg을 12시간마다 3회에 복용하여야 하는 등 매우 불편하다.
이러한 메토트렉세이트의 단점을 개선하기 위하여, 한국 등록특허 제10-0897915호에서는 PTD (protein transduction domain)라 일컫는 특정 서열의 펩타이드를 메토트렉세이트와 연결한 접합체 화합물을 제조하였다. 이러한 메토트렉세이트 접합체 화합물은 메토트텍세이트의 경피 전달 효율을 증가시켜 그 투여량을 감소시킴으로써 부작용을 최소화하고, 경피 투여가 가능하게 함으로써 주사 및 경구투여의 불편함을 개선할 수 있다.
그러나, 한국 등록특허 제10-0897915호에 개시된 접합체들의 경우 피투 투과성이 개선되기는 하였으나, 접합체 형성으로 인해 그 약리 효과가 감소되는 문제가 있었다.
따라서 본 개시가 해결하고자 하는 과제는 구조 내에 PTD (protein transduction domain)를 포함하여 경피 전달 또는 국소 전달 효율이 개선됨에도 불구하고 메토트렉세이트 대비 약리 효과가 떨어지지 않는 신규 접합체(conjugate) 화합물을 제공하는 것이다.
본 개시가 해결하고자 하는 다른 과제는 이러한 신규 접합체 화합물을 유효 성분으로 포함하는 약학 조성물, 바람직하게는 경피 투여용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 개시는 하기 화학식 1a로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.
[화학식 1a]
본 개시의 상기 화학식 1a는 하기 화학식 1b와 같이 표시될 수 있다.
[화학식 1b]
본 개시는 또한 상기 화학식 1a의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 포함하는 약학 조성물, 바람직하게는 경피 투여용 약학 조성물을 제공한다.
메토트렉세이트의 경우 분자 구조 내에 COOH 기를 2개 가지고 있는데, 등록특허 제10-0897915호의 경우 하기 화학식 2와 같은 연결을 가진 접합체 화합물(이하, '비교예 화합물'이라 명명함)을 개시하고 있다.
[화학식 2]
본 발명자들은, 상기 화학식 2의 화합물 대신에, 세포 투과를 위한 특정 서열의 펩타이드를 아미노카프론산 링커를 이용하여 메토트렉세이트 모핵에서 조금 더 떨어져 있는 propanoic acid moiety에 연결시킬 경우 메토트렉세이트의 효소 저해 활성이 거의 동일하게 유지하면서도 (즉, 효소 저해 활성의 저하 없이) 세포 투과 펩타이드를 연결하여 경피 투여가 가능하게 할 수 있다는 놀라운 사실을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명 화합물의 이와 같은 효과는 경피 투여를 위한 펩타이드의 특정 서열, 링커로 사용된 화합물 및 메토트렉세이트의 연결 부위 등이 종합적으로 작용하여 바람직한 입체 구조를 나타냄으로써 나타나는 것으로 추측되나, 본 발명은 이러한 이론적 추측에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어 "약학적으로 허용 가능한 염"은 상기 언급한 화합물들에서 발견되는 특정 치환체에 의존하는 비교적 비독성 산으로 제조된 활성 화합물의 염들을 포함한다. 산성 부가 염들은 충분한 양의 원하는 산, 순수한 또는 적당한 비활성(inert) 용매로 그러한 화합물들의 중성 형태를 접촉하여 얻을 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 산성 부가 염의 예들은 초산, 프로피온산, 이소부틸산, 옥살릭산(oxalic), 마레익(maleic), 말로닉(malonic), 안식향성, 숙신산, 수버릭(suberic), 푸마릭(fumaric), 만데릭(mandelic), 프탈릭(phthalic), 벤젠설포닉(benzenesulfonic), p-토릴설포닉(tolylsulfonic), 구연산, 주석산, 메탄솔포닉(methanesulfonic), 및 그 유사체를 포함하는 상대적으로 비독성 유기산에서 유래한 염들 뿐만 아니라, 염산, 브롬화 수소, 질산, 탄산, 일수소탄산(monohydrogencarbonic), 인산(phosphoric), 일수소인산, 이수소인산, 황산, 일수소황산, 요오드화수소 또는 아인산(phosphorous acid) 및 그 유사체를 포함한다. 또한 알긴네이트(arginate)와 그 유사체와 같은 아미노산의 염 및 글루쿠로닉(glucuronic) 또는 갈락투노릭(galactunoric) 산들과 그 유사체와 같은 유기산의 유사체를 포함한다. 예를 들어, 본 개시의 일 양태에 있어, 본 개시의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은 염산 염 또는 트리플루오로아세틱산(trifluoroacetic acid) 염이다. 바람직한 본 개시의 일 양태에 있어, 약학적으로 허용 가능한 염은 염산 염이다.
본 명세서에서 사용된 용어인 "본 발명의 화합물" 또는 "접합체 화합물"은 화학식 1a 또는 1b의 화합물뿐만 아니라, 이들의 클라드레이트(clathrates), 수화물, 용매화물, 또는 다형체를 포함하는 의미이다. 또한 용어 "본 발명의 화합물"은 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 언급되지 않을 경우 본 발명 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염도 포함하는 의미이다. 일 실시예에 본 발명의 화합물은 입체이성질체적으로 순수한 화합물들(예를 들어, 다른 입체이성질체가 실질적으로 없는(예를 들어, 85% ee 이상, 90% ee 이상, 95% ee 이상, 97% ee 이상, 또는 99% ee 이상))로 존재할 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 화학식 1a의 화합물 또는 그의 염이 호변이성적(tautomeric) 이성질체 및/또는 입체이성질체(예를 들어, 기하이성질체(geometrical isomer) 및 배좌 이성질체(conformational isomers))일 경우 그들의 분리된 이성질체 및 혼합물 각각 또한 본 발명의 화합물의 범주에 포함된다. 본 발명의 화합물 또는 그의 염이 구조 내에 비대칭 탄소(asymmetric carbon)를 가지고 있는 경우에, 그들의 광학 활성 화합물 및 라세믹 혼합물들 또한 본 발명의 화합물의 범위에 포함된다.
본 명세서에서 사용될 경우, 용어 "결정다형(polymorph)"은 본 발명의 화합물의 고체 결정 형태 또는 그것의 복합체를 의미한다. 같은 화합물의 다른 결정다형은 다른 물리적, 화학적 그리고/또는 스펙트럼적 특성을 보인다. 물리적 특성 측면의 차이점으로는 안정성(예를 들어, 열 또는 빛 안정성), 압축성과 밀도(제제화 및 생산물 제조에 중요함), 그리고 용해율(생물학적 이용률에 영향을 줄 수 있음)을 포함하나, 이에 한정되지 아니한다. 안정성에서 차이는 화학반응성 변화들(예를 들어, 또 다른 다형으로 구성되었을 때보다 하나의 다형으로 구성되었을 때 더 빠르게 변색이 되는 것 같은 차별적 산화) 또는 기계적인 특징들(예를 들어 동역학적으로 선호된 다형체로서 저장된 정제 파편들이 열역학 적으로 더 안정된 다형으로 변환) 또는 둘 다(하나의 다형의 정제는 높은 습도에서 더 분해에 예민)를 야기한다. 결정다형의 다른 물리적 성질들은 그들의 가공에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 한 결정다형은 또 다른 결정다형에 비하여, 예를 들어, 그것의 형태 또는 입자의 크기 분포에 기인하여 용매화합물을 형성할 가능성이 많을 수 있거나, 여과 또는 세척이 더 어려울 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "용매 화합물"은 비공유 분자간의 힘에 의해 결합된 화학량론적 또는 비-화학량론적인 양의 용매를 포함하는 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 의미한다. 바람직한 용매들은 휘발성이고, 비독성이며, 인간에게 극소량 투여될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "수화물(hydrate)"은 비공유 분자간의 힘에 의해 결합된 화학량론적 또는 비-화학량론적인 양의 물을 포함하는 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "클라드레이트(clathrate)"은 게스트 분자(예를 들어, 용매 또는 물)를 가두어 놓은 공간(예를 들어, 채널(channel))을 포함한 결정 격자의 형태의 본 발명의 화합물 또는 그것의 염을 의미한다.
용어 "약학적으로 허용 가능한"은 약학적 제제로 사용하기에 적합한 것을 의미하며, 일반적으로 이러한 사용을 위하여 안전한 것으로 간주되며, 이러한 사용을 위하여 국가의 관리 기관에 의하여 공식적으로 승인되거나 한국 약전 또는 미국 약전의 명단에 있는 것을 의미한다.
본 개시의 일 측면은 또한 정제된 화학식 1a의 화합물을 제공하며, 특히 상기 화학식 2의 화합물이 제거(분리)된 정제된 화합물을 제공한다. 화학식 1a의 화합물과 화학식 2의 화합물이 혼합된 경우 후술하는 preparative HPLC 등을 이용하여 분리될 수 있으나, 본 발명은 이러한 분리(정제) 방법에 한정되는 것은 아니다.
따라서 본 개시의 다른 측면은 유효 성분으로 상기 화학식 1a의 화합물을 포함하고, 상기 화학식 2의 화합물을 실질적으로 포함하지 않는 약학 조성물, 바람직하게는 경피 투여용 약학 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "정제된(purified)"은 분리될 때, 분리체는 90% 이상 순수한 것을 의미하며, 일 실시예에서는 95% 이상 순수하고, 다른 실시 예에서는 99% 이상 순수하고, 또 다른 실시예에서는 99.9% 이상 순수한 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "실질적으로 포함하지 않는"은 조성물 총 중량 대비 10 중량% 미만으로 포함하는 것을 의미하며, 바람직하게는 5 중량% 미만으로 포함하는 것을 의미하고, 더욱 바람직하게는 1 중량% 미만으로 포함하는 것을 의미하고, 더욱 더 바람직하게는 0.5 중량% 미만으로 포함하는 것을 의미한다.
본 개시의 일 측면은 또한 화학식 1a의 화합물과 화학식 2의 화합물이 혼합되어 있을 경우 preparative LC를 이용하여 이들을 분리하는 방법을 제공한다. 본 개시에 따른 상기 분리 방법은 다음과 같다.
- Gradient: 15 v/v% isocratic (A: 85%, B: 15%)
- Eluent A: 0.05% TFA in water
- Eluent B: 0.05% TFA in ACN
- Injection: 10 μL
- Flow: 1.2 mL/min
- Detection wavelength: 230 nm
- Oven temperature: 35 ℃
- Column: 4.6 x 250 mm, 5 min (DIKMA)
상기 LC 조건에서는 본 개시의 화학식 1a의 화합물이 화학식 2의 화합물보다 머무름 시간(retention time)이 상대적으로 빠르며, 따라서, 화학식 1a의 화합물과 화학식 2의 화합물이 혼합되어 있을 경우 머무름 시간이 빠른 피크의 화합물이 화학식 1a의 화합물이다.
결과적으로, 어떠한 화합물이 화학식 1a의 화합물인지 아니면 화학식 2의 화합물인지는 (a) 분자량 및 (b) 상기 LC 조건으로 표준품(standard)와 머무름 시간을 비교하여 확인할 수 있다. 예를 들어, 화학식 1a의 화합물 표준품과 샘플을 혼합 후 상기 LC 측정 시 피크의 수는 변동 없이 면적(area)만 증가한다면 샘플은 화학식 1a의 화합물이다. 반대로 화학식 2 화합물 표준품과 샘플을 혼합 후 상기 LC 측정 시 표준품 피크보다 앞선 피크가 나타나고 표준품 크로마토그램 면적에 차이가 없다면 샘플은 화학식 1a의 화합물이다.
본 개시의 일 양태는 본 발명에 따른 상기 화학식 1a로 표시되는 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 포함하는 조성물, 바람직하게는 약학 조성물을 제공한다.
본 개시의 일 양태는 또한 본 발명에 따른 상기 화학식 1a로 표시되는 화합물을 유효 성분으로 포함하는 경피 투여용 약학 조성물을 제공한다. 본 개시의 화합물은 국소 투여에 효과적인 펩타이드 서열을 포함하고 있어 경피 투여에 적당하다. 또한, 본 개시의 화합물은 세포 또는 체액 내 펩타이드 분해효소에 의해 분해되어 메토트렉세이트에 가까운 형태로 약리 효과를 나타낼 뿐만 아니라 펩타이드 분해효소로 되기 전 접합체 화합물 그 자체로도 좋은 약리 효과를 나타내어 후술하는 의약 용도로 유용하다.
메토트렉세이트는 유방암, 백혈병, 폐암, 림프종, 골육종 등을 포함하는 암의 치료에 유용할 뿐만 아니라, 건선, 류머티스 관절염, 크론병 등의 자가면역질환의 치료에도 유용하며, 염증질환의 치료에도 유용하다. 따라서 본 발명의 신규 접합체 화합물 또한 이러한 의약 용도로 사용될 수 있다. 다만, 본 발명의 화합물이 경피 투여에 적합한 화합물이라는 점에서 본 발명의 접합체 화합물은 건선, 류머티스 관절염 등의 치료에 더욱 유용하다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화할 수 있다. 경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제(elixirs) 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유할 수 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다.
다만, 본 발명에 따른 약학 조성물의 목적상 본 발명의 조성물은 경피 투여를 위한 조성물로 제형화되는 것이 바람직하며, 이러한 경피 투여 제형 또는 조성물은 본 발명이 속한 분야에 잘 알려져 있다.
본 개시의 일 양태에 있어, 본 발명에 따른 경피 투여용 조성물은 조성물의 중량을 기준으로 본 발명의 접합체 화합물 0.01-0.5 중량% 및 약제학적 담체를 함유한다. 예를 들어, 본 발명의 경피 투여 조성물은 조성물의 중량을 기준으로 에탄올 3-5 중량%, 유동파라핀 5-10 중량%, 바세린 30-40 중량%, 글리세린 5-10 중량%, 폴리에틸렌글리콜 20-30 중량% 및 본 개시에 따른 접합체 화합물 0.05-0.2 중량%를 포함한다. 본 개시의 일 양태에 따른 경피 투여 조성물은 국소 부위에 적절한 시간 간격으로 도포함으로써 투여될 수 있다.
본 개시는 국소 전달을 위한 펩타이드가 연결되어 있으면서도 약리 효과가 우수한 메토트렉세이트 유도체 화합물을 제공한다. 본 개시는 또한 이러한 화합물을 유효 성분으로 포함하는 경피 투여용 약학 조성물을 제공한다.
도 1은 합성 후 정제(분리)를 위해 수행한 preparative HPLC의 크로마토그램이다. 도 1에서 동그라미 피크는 본 발명의 접합체 화합물 피크이며, 세모는 비교예 화합물의 피크이다.
도 2는 디하이드로 엽산 환원효소 (Dihydrofolate reductase: DHFR)에 대한 저해 활성을 평가한 실험 결과이다. 도 2에서, 동그라미는 메토트렉세이트 결과이며, 세모는 본 발명 신규 접합체 화합물의 결과이고, 네모는 비교예 화합물의 평가 결과이다.
도 3은 본 발명 화합물과 비교예 화합물인 메토트렉세이트의 피부 투과 평가 결과이다. 도 3에서 마름모는 본 발명 화합물의 누적 피부 투과량이며, 세모는 메토트렉세이트의 누적 피부 투과량이다.
도 2는 디하이드로 엽산 환원효소 (Dihydrofolate reductase: DHFR)에 대한 저해 활성을 평가한 실험 결과이다. 도 2에서, 동그라미는 메토트렉세이트 결과이며, 세모는 본 발명 신규 접합체 화합물의 결과이고, 네모는 비교예 화합물의 평가 결과이다.
도 3은 본 발명 화합물과 비교예 화합물인 메토트렉세이트의 피부 투과 평가 결과이다. 도 3에서 마름모는 본 발명 화합물의 누적 피부 투과량이며, 세모는 메토트렉세이트의 누적 피부 투과량이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 본 발명이 속한 분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 새로운 구조의 MTX-aca-YARVRRRGPRR 화합물의 제조
Fmoc Chemistry에 기반을 둔 Solid Phase Peptide Synthesis 방법으로 다음의 절차에 따라 합성을 진행하였다.
Resin loading 및 Fmoc 제거: 2-Chlorotrityl chloride resin
(1.41 mmol/g, 100 mmol，71 g)을 DCM 500 mL로 30 분간 swelling 후 DCM 300 mL로 2 회 세척하였다． Fmoc-Arg(pbf)-OH(0.7 eq, 70 mm이，45 g) 및 DIEA (2 eq. 200 mm하 35 mL)를 DCM 233 mL에 넣고 4시간 반응시켜 아미노산을 loading한 후 DCM 500 mL로 3회 세척하였다．Capping 용액 (DCM:MeOH:DIEA=17:2:1) 500 mL을 넣고 10분 동안 교반 후 DCM 500 mL로 2회 세척하였다. 그 후 치환율을 uv로 측정하였다（치환율： 0.50 mmol/g). DMF 500 mL로 3회 세척하였다. 20% Piperidine/DMF 500 mL용액을 넣고 10분 동안 교반시킨 후 drain하였다. 이 과정을 2회 반복하였다. 그 다음 resin을 DMF 500 mL로 6회 세척하였다.
Fmoc-Arg(pbf)-OH coupling: Fmoc-Arg(Pbf)-OH (150 mmol, 3 eq, 97 g), HOBt (165 mmol, 3.3eq, 22 g) 및 DMF (500 mL) 혼합액을 상기 Fmoc이 제거된 resin에 넣고，DIC (150 mmol, 3 eq, 23 ml)을 넣은 후 실온에서 4시간 교반시켰다.
Fmoc deprotection: 20% Piperidine/DMF 500 mL을 resin이 있는 반응기에 투입하고，10분 동안 교반시킨 후 drain하였다. 이 과정을 2회 반복하였다. 그 후 resin을 DMF 500 mL로 6회 세척하였다．
Fmoc-Pro-OH coupling: Fmoc-Pro-OH (150 mmol, 3 eq. 51 g), HOBt (165 mmol, 3.3 eq, 22 g) 및 DMF (500 mL) 혼합액을 상기 Fmoc이 제거된 resin에 넣고，DIC (150 mmol, 3 eq, 23 ml)을 넣은 후 실온에서 4시간 교반시켰다. 이후 앞선 방법과 동일하게 Fmoc deprotection 과정을 수행하였다.
Fmoc-Gly-OH coupling: Fmoc-GIy-OH (150 mmol, 3 eq, 45 g), HOBt (165 mmol, 3.3 eq, 22 g) 및 DMF (500 ml) 혼합액을 상기 Fmoc이 제거된 resin에 넣고， DIC (150 mm이，3 eq, 23 ml)을 넣은 후 실온에서 4시간 교반시켰다. 이후 앞선 방법과 동일하게 Fmoc deprotection 과정을 수행하였다.
Fmoc-Arg(pbf)-OH coupling: Fmoc-Arg(Pbf)-OH (150 mmol, 3 eq, 97 g), HOBt (165 mmol, 3.3 eq, 22 g) 및 DMF(500 mL) 혼합액을 상기 Fmoc이 제거된 resin에 넣고，DIC (150 mmol, 3 eq, 23 ml)을 넣은 후 실온에서 4시간 교반시켰다．4시간 후 resin을 소량 채취하여 cleavage를 1시간한 후 HPLC, Mass로 반응이 완료되었는지 확인하였다. 이후 앞선 방법과 동일하게 Fmoc deprotection 과정을 수행하였다.
이후, 앞선 coupling 방법들과 유사한 방법으로, Fmoc-Arg(Pbf)-OH coupling 반응, Fmoc-Arg(Pbf)-OH coupling 반응, Fmoc-Val-OH coupling 반응, Fmoc-Arg(pbf)-OH coupling 반응, Fmoc-Ala-OH coupling 반응, Fmoc-Tyr(tbu)-OH coupling 반응, 및 Fmoc-Aca-OH coupling 반응을 수행하였다.
MTX coupling: 메토트렉세이트 (100 mm이，2 eq, 45 g), HOBt (100 mmol，2 eq, 14 g) 및 DMF(333 mL) 혼합액을 상기 Fmoc이 제거된 resin에 넣고, DIC (100 mmol，2 eq, 16 ml)을 넣은 후 실온에서 4시간 교반시켰다．4시간 후 resin을 소량 채취하여 cleavage를 1시간한 후 HPLC, Mass로 반응이 완료되었는지 확인하였다. 마지막 아미노산까지 커플링을 완료한 후 resin을 DMF 500 mL로 3회 세척하였으며, 그 후 DCM 500 mL로 3회 세척하였다
Global cleavage: 상기에서 얻은 resin 50 mmol에 cleavage 용액 (TFA/Thioanisole/H20/EDT(v:v)=87.5 : 5 : 5 : 2.5) 3 L를 5-10 ℃로 냉각 후 넣고 실온에서 4시간 교반시켰다. drain후 소량의 trifluoroacetic acid로 resin을 세척하고 여액을 합하여 Ether 12 L에 넣어 결정화시켰다. 생성된 고체를 여과하여 불순물이 다소 혼합된 crude 상태의 화합물을 얻었다.
실시예 2: 새로운 구조의 본 발명 화합물의 분리(정제)
이후 semi-preparative HPLC를 사용하여 다음과 같은 방법으로 본 발명의 접합체 화합물과 메토트렉세이트의 다른 부위에 결합된 불순물(비교예 화합물) 등을 분리하였다. 분리된 화합물들은 동결 건조되고, 다시 순도 등이 분석되었다.
semi-preparative HPLC 조건은 다음과 같았다.
- Gradient: 15 v/v% isocratic (A: 85%, B: 15%)
- Eluent A: 0.05% TFA in water
- Eluent B: 0.05% TFA in ACN
- Injection: 10 μL
- Flow: 1.2 mL/min
- Detection wavelength: 230 nm
- Oven temperature: 35 ℃
- Column: 4.6 x 250 mm, 5 min (DIKMA)
이 때 얻은 크로마토그램을 도 1에 나타내었다. 분리정제 후 노란색 파우더 형태의 목적하는 화합물을 얻었으며, 화합물의 순도는 99.0% 이상이었다. (LC/MS (M + H)+ (m/z) 1992.1)
실험예 1: 본 발명 화합물의 효과 평가
다음과 같은 방법으로 디하이드로 엽산 환원효소 (Dihydrofolate reductase: DHFR)에 대한 저해 활성을 평가하였다.
Sigma Aldrich에서 판매하고 있는 DHFR Assay Kit (Product code. cs0340)에서 제공한 manual에 의거하여 실험하였다. 파우더 형태의 시료를 250mM sodium carbonate (pH 9.5)에 녹였다. 각 시험물질은 은박지로 싸서 냉동상태에 보관하였으며, 보관기간은 15일을 넘지 않았다. 구체적 시험 방법은 다음과 같았다.
(1) 반응액
Kit에서 제공하고 있는 Assay buffer 10X를 멸균 증류수로 10배 희석하여 Assay buffer 1X로 사용하였다. 이 buffer는 주로 시약들을 녹이거나, 각 반응튜브당 동량이 되도록 하는데 사용하였다.
(2) 반응조건
Assay buffer 1X를 최종량 1ml에 맞도록 각 반응 시약 양을 뺀 양을 tube에 넣어주었다. 그 다음 1.35 X 10-2 units의 DHFR을 넣어주고 Reaction mixture 군을 뺀 튜브에 양성대조군과 실험군을 넣어주었다. 이 반응군들을 잘 섞어준 후 cuvette에 넣고 측정하기 바로 전에 120uM NADPH와 100uM DHF (Dihydrofolic acid)를 넣고 잘 섞어주었다.
(3) 처리 농도 결정
반응액은 manual에서 제시한 농도 범위에서 정하였고, 양성대조군과 실험군은 측정값을 IC50 값을 찾을 수 있는 농도로, 세번의 실험을 거쳐 결과와 같은 범위를 선택하였다.
(4) 통계 및 판정
Multiskan Spectrum (Thermo Labsystem사, Model no. 1500)를 이용해서 cuvette에서 값을 측정하였다. 측정된 값은 manual에서 소개한 계산법대로 Excel programme을 이용해서 값을 환산하였다.
그 결과를 도 2 및 하기 표 1에 종합하여 나타내었다.
| Inhibitor | IC50 (nM) |
| 메토트렉세이트 | 24 |
| 비교예 (화학식 2) | 813 |
| 본 발명 화합물 (화학식 1) | 52 |
상기 표 1 및 도 2에 나타나는 바와 같이, 본 발명의 신규 접합체 화합물은 메토트렉세이트와 유사한 정도의 DHFR 억제 활성을 나타낸 반면, 비교예 화합물은 DHFR 억제 활성이 상대적으로 매우 낮았다.
실험예 2: 본 발명 화합물의 피부 투과 개선 평가
Franz cell을 이용하여 본 발명 화합물의 피부 투과율 개선 정도를 평가하였다. 시험 조건은 다음과 같았다.
Franz diffusion cell (Modified vertical diffusion cell)
- Donor chamber: 10 mg 본 발명 화합물 및 메토트렉세이트 (MTX) in 0.4 ml 0.5 M Tris buffer (pH 10.8) (C0 = 1 x 104 μg/0.4 ml)
- Receptor chamber: 4.6 ml DPBS
Transdermal condition:
- 37 ± 0.5 ℃ for 24 hr with stirring
- The skin was pre-hydrated for 1 hr on Franz cell
Kinetic sample:
- Sampling time: 1, 3, 5, 7, 9, 12, 24 hr
- Withdrawn 0.1 ml from receptor chamber and immediately replace same volume of buffer
- HPLC analysis
Instrument: Waters Alliance 2695/ 2996 PAD
Column: Vydac 218TP54 (C18, 5 mm, 4.6 mm i.d. x 250 mm)
Eluents: A: H2O w 0.1% TFA, B: AcN w 0.1% TFA
Gradient: 5-25% eluent B
Detection: UV 280 nm
Membrane (skin):
- 8 weeks old, male, hairless mouse (HR-1), dorsal skin
- Effective skin (diffusion) area: 0.45 cm x 0.45 cm x ð = 0.636 cm2
실험결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타나는 바와 같이, 본 발명의 화합물은 비교예인 메토트렉세이트 대비 피부 투과량이 월등히 높았다.
Claims (5)
- 하기 화학식 1a로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
[화학식 1a]
- 하기 화학식 1a로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 포함하는 약학 조성물.
[화학식 1a]
- 제2항에 있어서, 상기 약학 조성물은 경피투여용인 약학 조성물.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 조성물은 면역질환 또는 염증질환의 치료용인 약학 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 약학 조성물은 건선 또는 류마티스 관절염의 치료용인 약학 조성물.
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| KR100897915B1 (ko) | 2004-11-03 | 2009-05-18 | 포휴먼텍(주) | 경피전달을 위한 약제 조성물 |
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