KR20130079431A - 엽산-표적 작용제를 위한 향상된 방법 - Google Patents

엽산-표적 작용제를 위한 향상된 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20130079431A
KR20130079431A KR1020127032401A KR20127032401A KR20130079431A KR 20130079431 A KR20130079431 A KR 20130079431A KR 1020127032401 A KR1020127032401 A KR 1020127032401A KR 20127032401 A KR20127032401 A KR 20127032401A KR 20130079431 A KR20130079431 A KR 20130079431A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
compound
formula
buffer
reaction mixture
acylating agent
Prior art date
Application number
KR1020127032401A
Other languages
English (en)
Inventor
다니엘 에스. 레노
케써린 마리에 스탠포드
이온초 라도슬라보브 블라호브
Original Assignee
엔도사이트, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 엔도사이트, 인코포레이티드 filed Critical 엔도사이트, 인코포레이티드
Publication of KR20130079431A publication Critical patent/KR20130079431A/ko

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/02—Linear peptides containing at least one abnormal peptide link
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/55—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds
    • A61K47/551—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds one of the codrug's components being a vitamin, e.g. niacinamide, vitamin B3, cobalamin, vitamin B12, folate, vitamin A or retinoic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 명세서에서 설명된 본 발명은 엽산-표적 접합체 EC145를 제조하기 위한 향상된 방법 및 향상된 방법을 이용하여 제조된 접합체 EC145, 그리고 향상된 방법을 이용하여 제조된 접합체 EC145를 포함하는 제약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

엽산-표적 작용제를 위한 향상된 방법{IMPROVED PROCESS FOR A FOLATE-TARGETED AGENT}
관련된 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 2010년 5월 19일에 제출된 미국 가출원 61/346,444, 및 2010년 6월 3일에 제출된 61/351,022의 이익을 청구하며, 이들 각각은 참조로서 본 명세서에 편입된다.
기술 분야
본 명세서에서 설명된 본 발명은 엽산-표적 접합체 EC145를 제조하기 위한 향상된 방법 및 향상된 방법을 이용하여 제조된 접합체 EC145, 그리고 향상된 방법을 이용하여 제조된 접합체 EC145를 포함하는 제약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 배경기술 및 요약
엽산-표적 약물은 암 치료법으로서 임상 시험에서 개발되고 검사되었다. EC145는 엽산에 접합된, 고강력 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid) 세포독성 화합물인, 데스아세틸빈블라스틴 하이드라자이드(desacetylvinblastin hydrazide, DAVLBH)를 포함한다. EC145 분자는 비-소세포 폐종양 (NSCLC), 난소, 자궁내막 및 신장암, 및 나팔관 및 원발성 복막 암종을 포함한 기타 암을 포함한 상피성 종양의 표면상에서 고수준으로 발견되는 엽산 수용체를 표적한다. EC145가 정상 조직은 피하면서 암세포로 직접 빈카 모이어티를 전달하는 엽산 수용체를 발현하는 종양에 결합하는 것으로 간주된다. 따라서, 결합시, EC145는 세포내섭취(endocytosis)를 통하여 암세포에 들어가고, DAVLBH를 방출하고 그리고 세포 사멸을 일으키거나 세포 기능을 저해한다. EC145는 다음의 화학식을 갖고 화합물 요약집 등록 번호 742092-03-1을 부여받았다:
Figure pct00001
EC145.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 단락에 따라서, 용어 EC145는 화합물, 또는 제약학적으로 허용되는 이의 염을 의미하고; 화합물은 양성자첨가된 형태(protonated form)를 포함하여, 이온화 형태로 고형, 용액 또는 현탁액에서 존재할 수 있다.
EC145는 미국 특허 제 7,601,332, 그리고 WO　2007/022493에서 개시되고; 특정 용도 및 정맥내 투여를 위한 수성 액상 pH 7.4, 포스페이트-완충 제제는 WO　2011/014821에서 개시된다.
미국 특허 제　7,601,332, 및 WO　2007/022493에서 개시된 EC145의 제조를 위한 절차는 실험실 규모에서, 가령 최대 10 밀리그램까지 EC145를 제조하는데 적합하다; 하지만 규모를 증가시키는 데 있어 문제점이 발생할 수 있다.
개시된 절차에서, EC145는 티오설포네이트- 또는 피리딜디티오-활성화 빈블라스틴 중간체로, EC119로 알려진 하기 화학식:
Figure pct00002
의 티올을 이용하여 디설파이드 결합을 형성함으로써 제조된다. 예를 들어, 하기 화학식:
Figure pct00003
의 카르바모일 디설파이드 중간체 (CDSI)는 디클로로메탄 (DCM)에서 제조되었고 실리카 겔 크로마토그래피 후에 단리되었다. 이후, CDSI를 테트라하이드로퓨란 (THF)에서 용해시켰고 EC119의 수성 용액에 첨가되었으며, 여기서 pH는 EC119를 용해하기 위해 소듐 바이카보네이트로 조정되었다. 반응의 완료시, 소규모 혼합물 (5-10mL)에서, THF는 회전 증발기를 이용하여 제거될 수 있다; 하지만 진공 하에 기포형성(foaming)은 너무 문제가 있어 이 작업은 대규모에서는 실현 가능하지 않았다. 따라서, 반응의 완료에서, 혼합물은 물로 희석되었고, 냉동 및 동결건조되었다. 이후, 미가공 고형은 물에서 용해되었고 역상 크로마토그래피에 의해 정제되었다. EC145의 90% 초과 피크(peak) 면적을 갖는 크로마토그래피의 분획물은 결합되었고, 물로 희석되었고, 그리고 동결건조되었다. 전형적으로, 정제된 산출량은 90-93% 범위 내의 순도로 30-40% 범위 내에 있었다. 동결건조와 연관있는 용량은 그램(gram) 양 이상의 제조를 매우 어렵게 만들었다.
더욱이, 규모 확대에서, EC145의 일부는 디설파이드 결합의 형성에서 유리된 머캅토피리딘에 의해 반응 혼합물의 작업 동안 분해되었다는 점이 확인되었다.
이러한 분해가 억제될 수 있다는 점이 확인되었고 이는 본 발명의 한 측면을 제공한다. 따라서, 한가지 실시양태와 같이, pH 8 미만의 수성 완충액의 존재에서, 하기 화학식:
Figure pct00004
의 화합물, 여기서 X는 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아릴티오 또는 헤테로아릴티오이다;로 화학식 (EC119)의 화합물을 처리하는 단계를 포함한 EC145를 제조하기 위한 방법이 제공된다:
Figure pct00005
(EC119).
방법의 한가지 실시양태에서, X는 2-티오피리디닐 또는 3-니트로-2-티오피리디닐이다. 방법의 한가지 실시양태에서, X는 2-티오피리디닐이다.
상기 내용 중 어느 하나에 대하여, 한가지 실시양태에서, 완충액은 약 7 미만의 pH를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 완충액은 6.5 미만의 pH를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 완충액은 5.9 내지 6.3의 pH를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 완충액은 5.9 내지 6.1의 pH를 갖는다.
상기 내용 중 어느 하나에 대하여, 한가지 실시양태에서, 완충액은 포스페이트 완충액이다. 또 다른 실시양태에서, 완충액은 소듐 포스페이트 완충액이다. 본 명세서에서 개시된 바와 같이, 완충액의 이용은 소듐 바이카보네이트의 이용보다 더 나은 pH의 조절 및 분해의 문제점을 제공한다.
상기 방법의 또 다른 실시양태는 5.9 내지 6.3의 pH를 갖는 소듐 포스페이트 완충액의 존재에서, 하기 화학식:
Figure pct00006
의 화합물로 화학식(EC119)의 화합물을 처리하는 단계를 포함한다:
Figure pct00007
(EC119).
상기 내용 중 어느 하나에 대하여, 한가지 실시양태는 아세토니트릴을 포함하는 액상 배지에서 처리가 일어나는 방법이다.
상기 내용 중 어느 하나에 대하여, 추가적 양면은 화학식 Y-CO-O-(CH2)2-S-X의 아실화제, 또는 이의 산 부가염, 여기서 Y는 이탈기이다;으로 데스아세틸빈블라스틴 하이드라자이드를 처리하여, 하기 화학식:
Figure pct00008
의 화합물을 포함하는 반응 혼합물을 형성하는 단계; 및 하기 화학식:
Figure pct00009
의 화합물을 단리시키는 것 없이 반응 혼합물로 화학식 (EC119)의 화합물을 직접적으로 처리하는 단계를 추가로 포함하는 방법이다:
Figure pct00010
(EC119).
이탈기 Y는 하이드라자이드의 아실화에 적절한 임의의 많은 이탈기일 수 있다. 한가지 실시양태에서, Y는 카르복실산으로 또는 탄산의 모노에스터로 활성 에스터를 형성하는 알코올의 잔기, 예를 들어, 4-니트로페녹시 잔기, 1-벤조트리아졸릴옥시 잔기 또는 7-아자벤조트리아졸-1-일옥시 잔기이다. 한가지 실시양태에서, 아실화제는 화학식:
Figure pct00011
,
또는 이의 산 부가염으로 이루어져 있다. 또 다른 실시양태에서, 아실화제는 하기 화학식:
Figure pct00012
으로 이루어져 있고 산 부가염의 형태로 도입된다. 아실화제가 산 부가염의 형태로 도입될 때, 트리에틸아민 또는 디이소프로필에틸아민과 같은 염기는 염기를 유리시키는데 이용된다. 또 다른 실시양태에서, 아실화제는 하기 화학식:
Figure pct00013
으로 이루어져 있고 유리 염기의 형태로 도입된다.
상기 내용 중 어느 하나에 대하여, 한가지 실시양태는 데스아세틸빈블라스틴 하이드라자이드가 아세토니트릴을 포함한 용매에서 아실화제로 처리되는 방법이다.
상기 내용 중 어느 하나에 대하여, 한가지 실시양태는 데스아세틸빈블라스틴 하이드라자이드가 고순도 형태로 제공되는 방법이다. 하기 실시예에서 설명된 바와 같이, 데스아세틸빈블라스틴 하이드라자이드는 에틸 아세테이트 및 톨루엔으로부터 용해/침전 (결정화로 표시)을 수반하는 절차를 이용하여 고순도 고형으로서 얻을 수 있다.
상기 내용 중 어느 하나에 대하여, 한가지 실시양태는 EC119가 고순도 형태로 제공되는 방법이다. EC119는 Fmoc-기반 고형상 화학을 이용하여 합성된다. 첫번째 Fmoc-Cys(Trt)-OH는 디이소프로필에틸아민 (DIPEA)의 존재에서 2-클로로트리틸 클로라이드 수지로 에스터화를 통해 수지 상에 적하된다. 이후 수지-결합 Cys(Trt) 상의 Fmoc 보호기는 디메틸포름아미드 (DMF)내 0.1　M HOBt의 6% 피페라진으로 수지를 처리함으로써 제거된다. 수지는 DMF 및 메틸 t-부틸 에스터 (MTBE)로 세척된다. Fmoc-Asp(OtBu)-OH는 N, N'-디이소프로필카르보디이미드 (DIC) 및 N-하이드록시벤조트리아졸 (HOBt)로 수지에 결합된다. 커플링(coupling) 반응은 카이저(Kaiser) 시험에 의해 관찰된다. 탈보호(deprotection) 및 커플링은 Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH 및 Fmoc-Glu-OtBu로 반복된다. N10-TFA-Pte-OH의 커플링은 N10-TFA-Pte의 1.2 당량, PyBOP의 1.2 당량, HOBt의 1.2 당량 및 DIPEA의 2.4 당량을 이용한다. 트리플루오로아세틸기는 DMF내 2% 하이드라진으로 제거된다. 펩티드가 대략 85% 트리플루오로아세트산, 10% 에탄디티올, 2.5% 트리이소프로필실란, 및 2.5% 탈이온수를 포함한 절단 시약으로 수지로부터 절단된다. 또한 이 반응은 t-Bu, Pbf, 및 트리틸 보호기의 동시 제거를 야기한다. 미가공 산물은 MTBE로 침전되고 여과에 의해 단리된다. 미가공 EC119의 순도는 대략 90%이다. 침전물은 실시예에서 더 상세하게 설명된다.
상기 내용 중 어느 하나에 대하여, 한가지 실시양태는 아실화제로 데스아세틸빈블라스틴 하이드라자이드를 처리하여 하기 화학식:
Figure pct00014
의 화합물을 포함하는 반응 혼합물을 형성하는 단계 및 반응 혼합물로 EC119를 처리하는 단계가 동일한 용기에서 수행되는 방법이다.
상기 내용 중 어느 하나에 대하여, 한가지 실시양태는 EC145를 포함한 반응 혼합물이 시트레이트 완충된, 수성 소듐 클로라이드 용액으로 희석되고 정제를 위한 폴리스티렌-디비닐벤젠 고분자 수지 칼럼 또는 카트리지(cartridge) 상에 적하되는 단계를 추가로 포함하는 방법이다. 이 방법은 희석 및 적하 순서를 가능하게 해준다. 희석 및 적하 처리법은 완충 식염수 (희석된 용액에 대해 10% 아세토니트릴 함량을 표적하는)로 반응 혼합물을 희석하는 단계 및 이 용액을 크로마토그래피 칼럼 상에 적하하는 단계를 포함한다. 이는 1회 한외-여과 순서에 대한 필요성을 제거하고 공정 시간을 약 12 내지 24시간 절약한다. 또 다른 실시양태는 아세토니트릴 및 시트레이트 완충된, 수성 소듐 클로라이드를 포함한 이동상을 이용하여 칼럼 또는 카트리지로부터 EC145 산물을 용출시키는 단계를 추가로 포함한다. 완충 식염수 이동상의 이용은 크로마토그래피 방법을 여러 가지 방법으로 향상시킨다. 첫째, 완충 식염수 이동상의 증가된 이온 강도는 이동상 및 정지상 사이에서 산물의 분할(partitioning)에 영향을 미친다. 정지상에 대한 산물의 친화도는 미가공 EC145에 대해 칼럼의 수용력이 2배 이상이 되는 지점까지 증가된다. 또한 정지상의 증가된 친화도는 미가공 EC145를 칼럼 상에 적하하는 동안에 산물 누출(break-through)의 발생 (적하 작업 동안 칼럼을 통해 통과하는 산물의 일부)을 제거한다. 또한 더 높은 이온 강도는 크로마토그래피 방법의 동역학을 향상시키며, 이는 더 가우스형이고 분획물 컷 포인트(cut point)의 식별을 더 쉽게 하는 크로마토그래피 피크 형태를 제공한다. 또한 이동상에서 소듐 클로라이드의 포함은 재생가능한 보유 부피(retention volume) 및 산물 띠폭을 야기한다.
상기 내용 중 어느 하나에 대하여, 한가지 실시양태는 한외-여과를 이용하여 수성 용액에서 정제된 산물로서 EC145를 제공하는 단계를 추가로 포함하는 방법이다. 이 방법은 대규모 동결건조와 연관된 시간 및 산물 순도 손실 (약 1%)을 방지한다. 추가로, 0.2 마이크론 절대 여과기를 통한 여과의 추가적 실시양태에 적합한 조건에서의 수성 용액에서 정제된 산물을 제공하고, 이는 여과 없는 방법에 비하여 미생물 총계 및 내독소 수준을 감소시킨다.
본 명세서에서의 임의의 실시양태에서 설명된 바와 같은 방법에서 잠재적인 문제점은 산소에 의한 EC145의 분해라는 점이 확인되었다. 상기 내용 중 어느 하나에 대하여, 한가지 실시양태는 어느 단계에서나 이용된 물이 약 0.9 백만분율(parts per million, ppm)을 초과하지 않는 농도에서 용해된 산소를 포함하는 방법이다.
본 발명의 한 측면에서, 상기 설명된 방법에 의해 제조된 접합체 EC145가 한가지 실시양태로서 제공된다. 한가지 실시양태는 수성 완충액, 여기서 완충액은 5.9 내지 6.3의 pH를 갖는다;의 존재에서, 하기 화학식:
Figure pct00015
의 화합물, 여기서 X는 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아릴티오 또는 헤테로아릴티오이다;로 화학식 (EC119)의 화합물을 처리하는 단계를 포함한 방법에 의해 제조된 접합체 EC145이다:
Figure pct00016
(EC119).
상기 한가지 실시양태에서, X는 2-티오피리디닐이다. 상기 접합체의 추가적 실시양태에서, 방법은 화학식 Y-CO-O-(CH2)2-S-X의 아실화제, 또는 이의 산 부가염, 여기서 Y는 이탈기이다;으로 데스아세틸빈블라스틴 하이드라자이드를 처리하여, 하기 화학식:
Figure pct00017
의 화합물을 포함하는 반응 혼합물을 형성하는 단계; 및 하기 화학식:
Figure pct00018
의 화합물을 단리시키는 것 없이 반응 혼합물로 화학식 (EC119)의 화합물을 직접적으로 처리하는 단계를 추가로 포함한다:
Figure pct00019
(EC119).
상기 추가적 실시양태는 하기 화학식:
Figure pct00020
으로 이루어져 있고 유리 염기의 형태로 도입되는 아실화제인 접합체 24이다.
본 발명의 한 측면과 같이, 희석제, 부형제 또는 담체와 함께 임의의 상기 실시양태에서 설명된 바와 같은 접합체 EC145를 포함하는 제약학적 조성물이 한가지 실시양태로서 제공된다.
상세한 설명
본 발명의 실시양태는 다음의 열거된 조항에 의해 추가로 설명된다:
1. EC145를 제조하기 위한 방법에 있어서, pH 8 미만의 수성 완충액의 존재에서, 하기 화학식:
Figure pct00021
의 화합물, 여기서 X는 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아릴티오 또는 헤테로아릴티오이다;로 화학식 (EC119)의 화합물을 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
Figure pct00022
(EC119).
2. 제1항에 있어서, X는 2-티오피리디닐 또는 3-니트로-2-티오피리디닐인 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, X는 2-티오피리디닐인 것을 특징으로 하는 방법.
3.1 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 완충액은 약 7 미만의 pH를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
3.2 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 완충액은 6.5 미만의 pH를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 완충액은 5.9 내지 6.3의 pH를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제4항에 있어서, 완충액은 5.9 내지 6.1의 pH를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 완충액은 포스페이트 완충액인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제6항에 있어서, 완충액은 소듐 포스페이트 완충액인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제1항에 있어서, 5.9 내지 6.3의 pH를 갖는 소듐 포스페이트 완충액의 존재에서, 하기 화학식:
Figure pct00023
의 화합물로 화학식 (EC119)의 화합물을 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
Figure pct00024
(EC119).
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 처리는 아세토니트릴을 포함하는 액상 배지에서 일어나는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 Y-CO-O-(CH2)2-S-X의 아실화제, 또는 이의 산 부가염, 여기서 Y 는 이탈기이다;으로 데스아세틸빈블라스틴 하이드라자이드를 처리하여, 하기 화학식:
Figure pct00025
의 화합물을 포함하는 반응 혼합물을 형성하는 단계; 및 하기 화학식:
Figure pct00026
의 화합물을 단리시키는 것 없이 반응 혼합물로 화학식 (EC119)의 화합물을 직접적으로 처리하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
Figure pct00027
(EC119).
10.1 제10항에 있어서, Y는 카르복실산으로 또는 탄산의 모노에스터로 활성 에스터를 형성하는 알코올의 잔기인 것을 특징으로 하는 방법.
10.2 제10항에 있어서, Y는 4-니트로페녹시 잔기, 1-벤조트리아졸릴옥시 잔기 또는 7-아자벤조트리아졸-1-일옥시 잔기인 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제10항에 있어서, 아실화제는 하기 화학식:
Figure pct00028
,
또는 이의 산 부가염으로 이루어져 있는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제11항에 있어서, 아실화제는 하기 화학식:
Figure pct00029
으로 이루어져 있고 산 부가염의 형태로 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제11항에 있어서, 아실화제는 하기 화학식:
Figure pct00030
으로 이루어져 있고 유리 염기의 형태로 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 데스아세틸빈블라스틴 하이드라자이드는 아세토니트릴을 포함한 용매에서 아실화제로 처리되는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 데스아세틸빈블라스틴 하이드라자이드는 고순도 형태로 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 아실화제로 데스아세틸빈블라스틴 하이드라자이드를 처리하여 하기 화학식:
Figure pct00031
의 화합물을 포함하는 반응 혼합물을 형성하는 단계; 및 반응 혼합물로 EC119를 처리하는 단계는 동일한 용기에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, EC145를 포함한 반응 혼합물은 시트레이트 완충된, 수성 소듐 클로라이드 용액으로 희석되고 정제를 위한 폴리스티렌-디비닐벤젠 고분자 수지 칼럼 또는 카트리지(cartridge) 상에 적하되는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제17항에 있어서, 아세토니트릴 및 시트레이트 완충된, 수성 소듐 클로라이드 용액을 포함한 이동상을 이용하여 칼럼 또는 카트리지로부터 EC145 산물을 용출시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 수성 용액에서 정제된 산물로서 EC145를 제공하기 위해 한외-여과를 이용하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 어느 단계에서나 이용된 물은 약 0.9 백만분율(parts per million, ppm)을 초과하지 않는 농도에서 용해된 산소를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에서 설명된 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 접합체 EC145.
22. 수성 완충액, 여기서 완충액은 5.9 내지 6.3의 pH를 갖는다;의 존재에서, 하기 화학식:
Figure pct00032
의 화합물, 여기서 X는 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아릴티오 또는 헤테로아릴티오이다;로 화학식 (EC119)의 화합물을 처리하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 접합체 EC145:
Figure pct00033
(EC119).
23. 제22항에 있어서, X는 2-티오피리디닐인 것을 특징으로 하는 접합체.
24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 방법은 화학식 Y-CO-O-(CH2)2-S-X의 아실화제, 또는 이의 산 부가염,여기서 Y는 이탈기이다;으로 데스아세틸빈블라스틴 하이드라자이드를 처리하여, 하기 화학식:
Figure pct00034
의 화합물을 포함하는 반응 혼합물을 형성하는 단계; 및 하기 화학식:
Figure pct00035
의 화합물을 단리시키는 것 없이 반응 혼합물로 화학식 (EC119)의 화합물을 직접적으로 처리하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 접합체:
Figure pct00036
(EC119).
25. 제24항에 있어서, 아실화제는 하기 화학식:
Figure pct00037
으로 이루어져 있고 유리 염기의 형태로 도입되는 것을 특징으로 하는 접합체.
26. 희석제, 부형제 또는 담체와 함께 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에서 설명된 바와 같은 접합체 EC145를 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
본 명세서에서 이용된 바와 같은, 용어 "알킬"은 탄소 원자의 사슬을 포함하고, 이는 선택적으로 분지형 또는 환형이고, 헤테로알킬로서, 선택적으로 치환되거나 산소, 황 또는 질소 원자를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 알킬은 C1-C6, 및 C1-C4를 포함하여, 유리하게 제한된 길이로 이루어져 있다는 것으로 이해된다. 예시적인 알킬기는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, 삼차부틸, 사이클로헥실 등이지만 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 이용된 바와 같은, 용어 "아릴"은 단환상 및 다환상 방향족 탄화수소환기를 포함하고, 이들 각각은 선택적으로 치환될 수 있다. 본 명세서에서 설명된 예시적인 방향족 탄화수소환기는 페닐, 나프틸, 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 본 명세서에서 이용된 바와 같은, 용어 "헤테로아릴"은 방향족 헤테로환기를 포함하고, 이들 각각은 선택적으로 치환될 수 있다. 예시적인 방향족 헤테로환기는 2-피리디닐, 3-니트로-2피리디닐 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 이용된 바와 같은 용어 "선택적으로 치환된"은 선택적으로 치환되는 라디칼(radical) 상에 다른 작용기로 수소 원자의 교체를 포함한다. 이러한 다른 작용기는 할로, 니트로 등을 실례로 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 설명된 바와 같은 제약학적 조성물은 EC145의 비경구 투여용으로 개작된 제약학적 조성물을 의미한다.
실시예
다음 실시예는 본 발명의 특정 실시양태를 추가로 설명한다; 하지만, 다음의 예시적인 실시예는 본 발명에 한정하는 어떠한 방법으로 해석되어서는 안된다. 가령, 용매, 시약 및 보호 작용기에 대해 일반적으로 이용된 약어가 본 명세서에서 이용된다. CDSI는 카르바모일 디설파이드 중간체 (4) (carbamoyl disulfide intermediate (4))를 나타내는데 이용된다.
실시예에서 분획 및 샘플 평가를 위해 이용된 HPLC 방법은 다음을 포함한다:
EC145 - CMC - IP -0001
샘플 제조: 8 M 구아니딘 HCl로 물질을 대략 0.5mg/mL까지 희석함.
칼럼: XBridge BEH C18에 물을 공급, 3.5μm, 2.1 x 100mm.
이동상: A) 500mM 암모늄 바이카보네이트, pH 9.2; B) 75:25 아세토니트릴-메탄올.
주사량: 10μL
UV 검출: 280nm
칼럼 온도: 50℃
샘플 온도: 5℃
구배:
Figure pct00038
EC145 - CMC - AM -0001 (버전 2.3)
샘플 제조: 포스페이트 완충 식염수 또는 1:1 아세토니트릴-물 (v/v)로 물질을 대략 1mg/mL까지 희석함.
칼럼: Symmetry C18에 물을 공급, 3.5μm, 4.6 x 75mm.
이동상: A) 10mM 트리에틸암모늄 아세테이트, pH 7.5; B) 아세토니트릴.
주사량: 10μL
UV 검출: 280nm
칼럼 온도: 25℃
샘플 온도: 5℃
구배:
Figure pct00039
실시예 1
EC119 의 제조
Figure pct00040
(EC119)
EC119를 Fmoc-기반 고형상 화학을 이용하여 다음과 같이 합성하였다:
첫번째 커플링( Coupling )
펩티드 합성 용기에 2-클로로트리틸 클로라이드 수지를 첨가한다. DMF (10mL/g 수지)에 붓는다. DMF로 2회 세척한다 (10mL/g 수지). DCM/DMF내 Fmoc-Cys(Trt)-OH의 0.8 당량을 첨가한다. DIPEA의 2 당량을 첨가한다. 30분 동안 교반한다. 메탄올을 첨가하고 10분 동안 교반한다. DMF로 3회 세척한다. MTBE로 3회 세척한다. DMF로 3회 세척한다. DMF내 0.1M HOBt의 6% 피페라진을 첨가하고 10-20분 동안 교반한다. DMF내 0.1M HOBt의 6% 피페라진을 첨가하고 10-20분 동안 교반한다. DMF로 3회 세척한다. MTBE로 3회 세척한다. 카이저(Kaiser) 시험을 수행하여 커플링의 완료를 확인한다.
두번째 커플링
DMF로 3회 세척한다 (10mL/g 수지). DMF내 Fmoc-Asp(OtBu)-OH의 2 당량을 첨가한다. DMF내 HOBt의 2 당량을 첨가한다. DIC의 2 당량을 첨가한다. 1.5-3시간 동안 교반한다. 카이저 시험으로 커플링을 확인한다. MTBE로 2회 세척한다. DMF로 2회 세척한다. DMF내 0.1M HOBt의 6% 피페라진을 첨가하고 10-20분 동안 교반한다. DMF내 0.1M HOBt의 6% 피페라진을 첨가하고 10-20분 동안 교반한다. DMF로 3회 세척한다. MTBE로 3회 세척한다. 카이저 시험을 수행한다.
세번째 커플링
DMF로 3회 세척한다. DMF내 Fmoc-Asp(OtBu)-OH의 2 당량을 첨가한다. DMF내 HOBt의 2 당량을 첨가한다. DIC의 2 당량을 첨가한다. 1.5-3시간 동안 교반한다. 카이저 시험으로 커플링을 확인한다. MTBE로 2회 세척한다. DMF로 2회 세척한다. DMF내 0.1M HOBt의 6% 피페라진을 첨가하고 10-20분 동안 교반한다. DMF내 0.1M HOBt의 6% 피페라진을 첨가하고 10-20분 동안 교반한다. DMF로 3회 세척한다. MTBE로 3회 세척한다. 카이저 시험을 수행한다.
네번째 커플링
DMF로 세척한다. DMF내 Fmoc-Arg(Pbf)-OH의 2 당량을 첨가한다. DMF내 HOBt의 2 당량을 첨가한다. DIC의 2 당량을 첨가한다. 1.5-3시간 동안 교반한다. 카이저 시험으로 커플링을 확인한다. MTBE로 2회 세척한다. DMF로 2회 세척한다. DMF내 0.1M HOBt의 6% 피페라진을 첨가하고 10-20분 동안 교반한다. DMF내 0.1M HOBt의 6% 피페라진을 첨가하고 10-20분 동안 교반한다. DMF로 3회 세척한다. MTBE로 3회 세척한다. 카이저 시험을 수행한다.
다섯번째 커플링
DMF로 3회 세척한다. DMF내 Fmoc-Asp(OtBu)-OH의 2 당량을 첨가한다. DMF내 HOBt의 2 당량을 첨가한다. DIC의 2 당량을 첨가한다. 1.5-3시간 동안 교반한다. 카이저 시험으로 커플링을 확인한다. MTBE로 2회 세척한다. DMF로 2회 세척한다. DMF내 0.1M HOBt의 6% 피페라진을 첨가하고 10-20분 동안 교반한다. DMF내 0.1M HOBt의 6% 피페라진을 첨가하고 10-20분 동안 교반한다. DMF로 3회 세척한다. MTBE로 3회 세척한다. 카이저 시험을 수행한다.
여섯번째 커플링
DMF로 3회 세척한다. DMF내 Fmoc-Glu-OtBu의 2 당량을 첨가한다. DMF내 HOBt의 2 당량을 첨가한다. DIC의 2 당량을 첨가한다. 카이저 시험으로 커플링을 확인한다. MTBE로 2회 세척한다. DMF로 2회 세척한다. DMF내 0.1M HOBt의 6% 피페라진을 첨가하고 10-20분 동안 교반한다. DMF내 0.1M HOBt의 6% 피페라진을 첨가하고 10-20분 동안 교반한다. DMF로 3회 세척한다. MTBE로 3회 세척한다. 카이저 시험을 수행한다.
일곱번째 커플링
DMF로 3회 세척한다. 최소량의 DMSO내 N10-TFA-Pte-OH의 1.2 당량을 첨가한다. DMF내 HOBt의 1.2 당량을 첨가한다. DMF내 PyBOP의 1.2 당량을 첨가한다. DIPEA의 2.4 당량을 첨가한다. 3-5시간 동안 교반한다. 카이저 시험으로 커플링을 확인한다. DMF로 2회 세척한다. MTBE로 2회 세척한다.
탈보호 - 트리플루오로아세틸기의 제거
DMF로 2회 세척한다. DMF내 2% 하이드라진을 첨가하고 5분 동안 교반한다. DMF내 2% 하이드라진을 첨가하고 5분 동안 교반한다. DMF내 2% 하이드라진을 첨가하고 5분 동안 교반한다. DMF로 3회 세척한다. MTBE로 3회 세척한다. 상온에서 진공 하에 수지를 건조시킨다.
수지로부터 절단
플라스크에 85% TFA, 2.5% 트리이소프로필실란, 2.5% 물 및 10% 에탄디티올을 포함한 절단 시약 (10mL/g 수지)을 첨가한다. 얼음조(ice-bath)에서 혼합물을 냉각시킨다. 수지를 첨가하고 상온에서 2-3시간 동안 반응하도록 한다. 여과시키고 그 여과액을 수집한다. 차가운 MTBE (여과액 1mL 당 MTBE 10mL)에 여과액을 첨가한다. 30±10분 동안 0-5℃에서 교반한다. 중간 다공성 유리 여과기(medium porosity glass filter)를 통해 침전된 산물을 여과시킨다. 차가운 MTBE로 침전물을 3회 세척한다. 상온에서 진공 하에 산물을 건조시킨다. -20℃에서 질소 하에 저장한다.
정제
역상 C18 칼럼 (6-인치 칼럼, 2.8kg, 10μm, 100Å)을 이용한 분취용 HPLC로 미가공 EC119를 정제시킨다. 이동상은 0.5% NH4OAc (A) 및 0.5% NH4OAc/ACN(1:4) (B)이다. 40g의 미가공 EC119를 1-5% TFA에 용해시키고, 1μm 유리 섬유 여과기를 통해 여과시키고, 6-인치 칼럼 상에 적하한다. HPLC 분석을 위해 분획물을 수집하고 샘플화한다. 산물을 침전시키기 위해 질소 하에 50% AcOH를 이용한 수집 바로 직후에 분획물 각각의 pH를 3-4로 조정한다. 침전된 산물을 원심분리시키고, 0.1% AcOH로 세척하고 그리고 추가로 공정할 때까지 2-8℃에서 저장한다. 산화 가능성을 감소시키기 위해 컨테이너를 원심분리 작업 동안 질소로 공백화한다. 풀 기준(pool criteria)은 순도는 98% 이상, D-Arg4, D-Glu2 및 D-Asp3의 이성질체는 0.25% 이하, 다른 불순물은 0.5% 이하이다. D-Asp5, D-Asp6 및 D-Cys의 이성질체는 분취용-HPLC로 제거할 수 없고 합성 방법에서 억제시켜야 한다. 풀 기준을 만족시키는 물질을 가능한 빨리 동결건조시킨다 (EC119 용액 및 젖은 침전물은 안정하지 않다). 최종 산물의 순도는 98% 초과이다. 고형상 합성 및 정제를 포함한 순수한 EC119의 전체 산출량은 대략 40%이다. 산물은 질소 하에 호박색 유리병에 보관처리하고 -20℃에서 저장한다.
실시예 2
A. 빈블라스틴 설페이트에서 데스아세틸빈블라스틴 하이드라자이드로의 전형적인 전환
Figure pct00041
물질
빈블라스틴 설페이트: USP; FW = 909.05g/mol; 메탄올: 무수(anhydrous); 하이드라진: 무수; FW =32g/mol; 탈이온수(De-ionized water); 에틸 아세테이트: LC/GC 등급; 톨루엔: LC/GC 등급; 1염기 소듐 포스페이트: 99.0% 이상; FW = 120g/mol; 2염기 소듐 포스페이트: 99.0% 이상; FW = 142g/mol; 소듐 클로라이드: 시약 등급; FW = 58.4g/mol; 소듐 설페이트: 무수; 5-노보넨-2-카르복실산.
절차
반응, 추출 작업 및 단리를 질소 또는 아르곤 대기 하에 진행한다. 소듐 설페이트를 제거하기 위해 가압 여과기를 이용하고 산물을 포획한다. 퀀칭(quenching) 및 세척에서 이용된 소듐 클로라이드 용액을 용해된 산소 수준이 0.9ppm 이상이 되지 않을 때까지 질소 및 아르곤으로 스파징(sparging)한다.
빈블라스틴 설페이트 및 무수 메탄올을 아르곤 퍼징(purging)된 반응기에 충전한다. 5-노보넨-2-카르복실산 및 무수 하이드라진을 반응기에 첨가한다. 혼합물을 교반하고, 그리고 고형물이 녹은 후, 약 60℃까지 혼합물을 가열한다. HPLC 분석으로, 반응이 완료되면, 이를 냉각시키고, 퀀칭하고 그리고 에틸 아세테이트 내로 추출한다. 건조 후, 산물이 에틸 아세테이트 및 톨루엔으로부터 결정화된다. 고형물을 상온에서 하룻밤 동안 진공 하에 건조시킨다.
완충 NaCl은 10.0g NaCl, 7.10 - 7.30g NaH2PO4, 4.40 - 4.60g의 Na2HPO4 및 90mL의 물을 포함한다. 용액을 아르곤 또는 질소로 스파징한다 (용해된 산소 함량은 0.9ppm 미만이다).
전형적인 단리시킨 산출량은 이론적 최대량의 50-60%이다.
B. EC145 공정의 단계 2 및 3
Figure pct00042
단계2 및 단계 3 공정
물질
데스아세틸빈블라스틴 하이드라자이드: FW=768.9g/mol; 20.5g, 26.7mmol; 혼합된 카보네이트 (3): FW=384.9g/mol; 10.7g, 27.8mmol; 아세토니트릴: q.s.: 트리에틸아민: FW=101.2g/mol; 2.67g, 26.4mmol; Na2PO4·7 H2O: 47.84g; EC119: 29.9g, 28.6mmole; 0.5 N HCl: q.s.; WFI:　q.s.
절차
본 방법에서 이용된 모든 물은 주사용 증류수(water for injection, WFI)라는 점을 주목한다.
적절한 용기를 아르곤으로 퍼징한다. 20.5±0.3g의 데스아세틸-빈블라스틴 하이드라자이드를 충전한다;　상기 충전물은 농도 조정되며,　즉,　농도가 90.0%라면,　충전물은　22.8g일 것이다. 10.7±0.2g의 혼합된 카보네이트를 충전한다 (농도 조정됨). 800±30mL의 아세토니트릴 및 2.67±0.11g의 트리에틸아민을 충전한다. 20-28시간 동안 10-14℃에서 아르곤 하에 혼합한다. HPLC (EC145-CMC-AM-0001, 버전 2.3)를 위해 샘플을 채취한다. 예상되는 결과는 하이드라자이드에 대한 CDSI의 비(ratio)가 25:1 이상이다. 그렇지 않다면, 2-4시간 동안 10-14℃에서 아르곤 하에 혼합을 계속하고 샘플을 다시 채취한다.
용해된 산소 수준이 0.9ppm 미만이 될 때까지 780-820mL의 물을 아르곤으로 스파징한다; 용해된 산소 수준을 기록한다. 탈산소수(deoxygenated water)에서 47.8±0.5g의 소듐 포스페이트 2염기 7수화물을 용해시킨다. 적합한 컨테이너에, 29.8±0.5g의 EC119를 첨가한다; (충전물은 농도 조정된다). EC119에 소듐 포스페이트 용액을 첨가하고 아르곤 하에 혼합한다. 용액의 pH를 측정하고 필요한 경우 0.5 N HCl로 pH를 5.8-6.2로 조정한다.
완충 EC119 용액을 반응 혼합물에 첨가한다. 60-75분 동안 20-25℃에서 아르곤 하에 혼합한다. HPLC (EC145-CMC-AM-0001, 버전 2.3)를 위해 샘플을 채취한다. CDSI에 대한 EC145의 비가 25:1 이상이라면, 진행한다. 그렇지 않다면, 20-25℃에서 아르곤 하에 혼합을 계속하고 샘플을 다시 채취한다. CDSI에 대한 EC145의 비가 25:1 이상이라면, 진행한다. 그렇지 않다면, 추가적 1g의 EC119를 첨가하고 30분 동안 20-25℃에서 아르곤 하에 혼합하고 샘플을 다시 채취한다.
용해된 산소 수준이 0.9ppm 미만이 될 때까지 아르곤으로 스파징한 물로부터 생성된 6.9L-7.1L의 25mM 포스페이트 완충액, 185-195mM NaCl, pH 7.2-7.5를 제조한다. 이 완충액으로 반응 혼합물을 희석한다. 혼합물이 하나 이상의 희미한 아지랑이를 발생시킨다면, 산물 용액을 여과시킬 필요가 있다 (Whatman Polycap TC75 또는 TC150, 0.45 또는 1.0 마이크론); 이 여과는 산물을 Biotage 칼럼 상에 적하하는 동안 완료될 수 있다.
액체 크로마토그래프 정제
Biotage 150M, C18 카트리지를 이용한다. 이 크기의 카트리지는 현재 설명된 것의 두배 크기로 반응 혼합물을 수용할 수 있다.
칼럼 제조:
a. 다음의 것으로 칼럼을 씻어낸다:
i. 12-13L의 아세토니트릴
ii. 12-13L의 80% 아세토니트릴 및 20% 물(v/v)
iii. 12-13L의 50% 아세토니트릴 및 50% 물 (v/v)
iv. 12-13L의 10% 아세토니트릴 및 90% 물 (v/v)
정제:
25mM 포스페이트 완충액, (185-195mmol) NaCl, pH 7.3-7.5를 제조한다. 용해된 산소 함량이 0.9ppm 이하가 될 때까지 완충액을 아르곤으로 스파징한다.
제조: 완충 식염수내 41L의 10% 아세토니트릴 (v/v); 완충 식염수내 13L의 16% 아세토니트릴 (v/v), 완충 식염수내 52L의 27% 아세토니트릴 (v/v).
이동상 용액의 용해된 산소 함량을 확인한다. 용해된 산소 함량이 0.9ppm을 초과하면, 용해된 산소 수준이 0.9ppm 이하가 될 때까지 이동상을 아르곤 또는 질소로 스파징한다.
26-27L의 10% 아세토니트릴 이동상으로 칼럼을 씻어낸다.
칼럼 상에 산물 용액을 적하
다음 순서의 이동상을 이용하여 산물을 용출시킨다:
i. 13-14L의 10% 아세토니트릴 이동상.
ii. 13L의 16% 아세토니트릴 이동상.
iii. 51-52L의 27% 아세토니트릴 이동상.
주의: 일직선 UV 검출기가 유용하다; 산물은 8-13L의 띠폭(bandwidth)으로 15-19L의 27% 아세토니트릴 이동상에서 개시되어야한다.
분획물 평가
i. HPLC 방법 EC145-CMC-IP-0001
ii. 통과하는 분획물 = 97.0% 이상의 EC145 및 0.8% 이상의 불순물 없음(no impurity)
칼럼 처리 진행후:
칼럼은 한번 더 재이용할 수 있다. 칼럼이 두번째 진행을 위해 이용될 수 있다면, ii-iv를 수행한다.
i. 12-13L의 1:1 아세토니트릴-물로 칼럼을 씻어낸다.
ii. 20-22L의 아세토니트릴로 칼럼을 씻어낸다.
iii. 칼럼 제조 단계 ii-iv를 반복한다.
한외 -여과
용해된 산소 수준이 0.9ppm 미만이 될 때까지 q.s. 물을 아르곤 또는 질소로 스파징한다. 통과하는 크로마토그래피 분획물을 결합시키고 스파징한 물의 등가 용량으로 희석한다. 1000 (cat# CDUF002LA)의 명목상 MW 컷오프(cutoff)를 갖는 미공(Millipore) 재생 셀룰로오스 막을 이용하여 한외-여과 장치를 조립하고 9L의 탈산소수로 이를 헹군다. 산물 용액의 한외-여과를 개시한다. 30-50psi의 배압을 유지한다. 보유물(retentate) 용량이 2 내지 3L가 될 때까지 한외-여과를 계속 한다. 11 내지 12L의 탈산소수를 첨가한다. 보유물 용량이 2 내지 3L가 될 때까지 한외-여과를 계속 한다. 11 내지 12L의 탈산소수를 첨가한다. 보유물 용량이 2 내지 3L가 될 때까지 한외-여과를 계속 한다. 8 내지 10L의 탈산소수를 첨가한다. 보유물 용량이 2L가 될 때까지 한외-여과를 계속 한다. 한외-여과 종점을 GC 및 농도를 통해 보유물의 샘플을 분석함으로써 결정해야한다. 사양(specification)은 EC145 밀리그램 당 50 마이크로그램 이하의 아세토니트릴이다. 성취되지 않는다면, 한외-여과의 또 다른 주기를 수행한다.
API 용액의 농도를 조정하여 포장된 물질이 6 내지 12mg/mL이 되도록 해야한다. 한외-여과의 완료시, 장치를 1리터의 물로 헹굴 것이다. 따라서, 필요에 따라 한외-여과를 계속하거나 물을 첨가한다. 산물 용액이 한외-여과 장치를 일단 빠져나가면, 1L의 탈산소수로 한외-여과 장치를 헹구고 산물 용액과 결합시킨다.
세정액(rinse)을 산물 용액과 결합시킨 후, 이 용액을 0.2 마이크론 절대 여과기를 통해 여과시켜야하고, 그리고 이 여과물을 포장한다 (비활성 대기 하에 수행한다).
단리시킨 산물의 전형적인 산출량은 이론적 최대량의 50-60%이다.
실시예 3
EC145 공정의 단계 2 및 3
Figure pct00043
단계 2 및 단계 3 공정
물질
데스아세틸빈블라스틴 하이드라자이드: FW=768.9g/mol; 1.00g, 1.30mmol; 혼합된 카보네이트 (3): FW=348.4g/mol; 0.445g, 1.28mmol; 아세토니트릴: q.s.: Na2PO4 : 1.10g; EC119: 1.46g, 1.40mmole; 0.5 N HCl: q.s.; WFI: q.s.
절차
본 방법에서 이용된 모든 물은 주사용 WFI라는 점을 주목한다.
적절한 용기를 아르곤으로 퍼징한다. 1.00±0.02g의 데스아세틸빈블라스틴 하이드라자이드를 충전한다; 상기 충전물은 농도 조정되며, 즉, 농도가 90.0%라면, 충전물은 1.11g일 것이다. 0.445±0.005g의 혼합된 카보네이트를 충전한다 (농도 조정됨). 46±1mL의 아세토니트릴을 충전한다. 22-23시간 동안 10-20℃에서 아르곤 하에 혼합한다. HPLC (EC145-CMC-AM-0001, 버젼 2.3)를 위해 샘플을 채취한다. 예상되는 결과는 하이드라자이드에 대한 CDSI의 비가 20:1 이상이다. 그렇지 않다면, 2-3시간 동안 10-20℃에서 아르곤 하에 혼합을 계속하고 샘플을 다시 채취한다.
용해된 산소 수준이 0.9ppm 미만이 될 때까지 41mL의 물을 아르곤으로 스파징한다; 용해된 산소 수준을 기록한다. 탈산소수에서 1.10±0.07g의 2염기 소듐 포스페이트를 용해시킨다. 적합한 컨테이너에, 1.46±0.03g의 EC119를 첨가한다; (충전물은 농도 조정된다). EC119에 소듐 포스페이트 용액을 첨가하고 아르곤 하에 혼합한다. 용액의 pH를 측정하고 필요한 경우 0.5 N HCl로 pH를 5.9-6.3으로 조정한다.
완충 EC119 용액을 반응 혼합물에 첨가한다. 60-75분 동안 20-25℃에서 아르곤 하에 혼합한다. HPLC (EC145-CMC-AM-0001, 버전 2.3)를 위해 샘플을 채취한다. CDSI에 대한 EC145의 비가 20:1 이상이라면, 진행한다. 그렇지 않다면, 13-23℃에서 아르곤 하에 혼합을 계속하고 샘플을 다시 채취한다. CDSI에 대한 EC145의 비가 20:1 이상이라면, 진행한다. 그렇지 않다면, 추가적 1g의 EC119를 첨가하고 30분 동안 13-23℃에서 아르곤 하에 혼합하고 샘플을 다시 채취한다.
용해된 산소 수준이 0.9ppm 미만이 될 때까지 아르곤으로 스파징한 물로부터 생성된 399-401mL의 0.02mM 시트레이트 완충된, 수성 0.1M NaCl, pH 5.7-6.5를 제조한다. 이 완충액으로 반응 혼합물을 희석한다. 혼합물이 하나 이상의 희미한 아지랑이를 발생시킨다면, 산물 용액을 여과시킬 필요가 있다 (Whatman Polycap TC75 또는 TC150, 0.45 또는 1.0 마이크론); 이 여과는 산물을 Biotage 칼럼 상에 적하하는 동안 완료될 수 있다.
액체 크로마토그래프 정제
폴리스티렌-디비닐벤젠 고분자 수지로 보관처리된 Biotage 카트리지를 이용한다.
칼럼 제조:
b. 다음의 것으로 칼럼을 씻어낸다:
i. 아세토니트릴
ii. 50% 아세토니트릴 및 50% 물(v/v)
iii. 10% 아세토니트릴 및 90% 물 (v/v)
정제:
시트레이트 완충된, 수성 소듐 클로라이드 용액, pH 6.0-6.6을 제조한다.
용해된 산소 함량이 0.9ppm 이하가 될 때까지 완충액을 아르곤으로 스파징한다.
제조: 완충된, 수성 소듐 클로라이드내 12% 아세토니트릴 (v/v); 완충된, 수성 소듐 클로라이드내 16% 아세토니트릴 (v/v), 완충된, 수성 소듐 클로라이드내 22.5% 아세토니트릴 (v/v).
이동상 용액의 용해된 산소 함량을 확인한다. 용해된 산소 함량이 0.9ppm을 초과하면, 용해된 산소 수준이 0.9ppm 이하가 될 때까지 이동상을 아르곤 또는 질소로 스파징한다.
10% 아세토니트릴 이동상으로 칼럼을 씻어낸다.
칼럼 상에 산물 용액을 적하
다음 순서의 이동상을 이용하여 산물을 용출시킨다:
iv. 16% 아세토니트릴 이동상.
v. 22.5% 아세토니트릴 이동상.
분획물 평가
iii. HPLC 방법 EC145-CMC-IP-0001
iv. 통과하는 분획물 = 97.0% 이상의 EC145 및 0.8% 이상의 불순물 없음(no impurity)
한외 -여과
용해된 산소 수준이 0.7ppm 미만이 될 때까지 q.s. 물을 아르곤 또는 질소로 스파징한다. 통과하는 크로마토그래피 분획물을 결합시키고 스파징한 물의 등가 용량으로 희석한다. 1000의 명목상 MW 컷오프를 갖는 미공 재생 셀룰로오스 막을 이용하여 한외-여과 장치를 조립하고 탈산소수로 이를 헹군다. 산물 용액의 한외-여과를 개시한다. 30-50psi의 배압을 유지한다. 보유물 용량이 기존 용량의 대략 20%가 될 때까지 한외-여과를 계속 한다. 보유물에 탈산소수를 첨가한다. 보유물 용량이 기존 용량의 대략 20%가 될 때까지 한외-여과를 계속 한다. 보유물에 탈산소수를 첨가한다. 보유물 용량이 기존 용량의 대략 20%가 될 때까지 한외-여과를 계속 한다. 보유물에 탈산소수를 첨가한다. 보유물 용량이 기존 용량의 대략 20%가 될 때까지 한외-여과를 계속 한다. 한외-여과 종점을 GC 및 농도를 통해 보유물의 샘플을 분석함으로써 결정해야한다. 사양은 EC145 밀리그램 당 50 마이크로그램 이하의 아세토니트릴이다. 성취되지 않는다면, 한외-여과의 또 다른 주기를 수행한다.
API 용액의 농도를 조정하여 포장된 물질이 약 12mg/mL이 되도록 해야한다. 한외-여과의 완료시, 장치를 물로 헹굴 것이다. 따라서, 필요에 따라 한외-여과를 계속하거나 물을 첨가한다. 산물 용액이 한외-여과 장치를 일단 빠져나가면, 탈산소수로 한회-여과 장치를 헹구고 산물 용액과 결합시킨다.
세정액을 산물 용액과 결합시킨 후, 이 용액을 0.2 마이크론 절대 여과기를 통해 여과시켜야하고, 그리고 이 여과물을 포장한다 (비활성 대기 하에 수행한다).
단리시킨 산물의 전형적인 산출량은 이론적 최대량의 50-60%이다.

Claims (26)

  1. EC145를 제조하기 위한 방법에 있어서, pH 8 미만의 수성 완충액의 존재에서, 하기 화학식:
    Figure pct00044

    의 화합물, 여기서 X는 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아릴티오 또는 헤테로아릴티오이다;로 화학식 (EC119)의 화합물을 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, EC145를 제조하기 위한 방법:
    Figure pct00045

    (EC119).
  2. 청구항 1에 있어서, X는 2-티오피리디닐 또는 3-니트로-2-티오피리디닐인 것을 특징으로 하는, EC145를 제조하기 위한 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, X는 2-티오피리디닐인 것을 특징으로 하는, EC145를 제조하기 위한 방법.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, 완충액은 5.9 내지 6.3의 pH를 갖는 것을 특징으로 하는, EC145를 제조하기 위한 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 완충액은 5.9 내지 6.1의 pH를 갖는 것을 특징으로 하는, EC145를 제조하기 위한 방법.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서, 완충액은 포스페이트 완충액인 것을 특징으로 하는, EC145를 제조하기 위한 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 완충액은 소듐 포스페이트 완충액인 것을 특징으로 하는, EC145를 제조하기 위한 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 5.9 내지 6.3의 pH를 갖는 소듐 포스페이트 완충액의 존재에서, 하기 화학식:
    Figure pct00046

    의 화합물로 화학식 (EC119)의 화합물을 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, EC145를 제조하기 위한 방법:
    Figure pct00047

    (EC119).
  9. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서, 처리는 아세토니트릴을 포함하는 액상 배지에서 일어나는 것을 특징으로 하는, EC145를 제조하기 위한 방법.
  10. 청구항1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 Y-CO-O-(CH2)2-S-X의 아실화제, 또는 이의 산 부가염, 여기서 Y는 이탈기이다;으로 데스아세틸빈블라스틴 하이드라자이드(desacetylvinblastin hydrazide)를 처리하여, 하기 화학식:
    Figure pct00048

    의 화합물을 포함하는 반응 혼합물을 형성하는 단계; 및 하기 화학식:
    Figure pct00049

    의 화합물을 단리시키는 것 없이 반응 혼합물로 화학식 (EC119)의 화합물을 직접적으로 처리하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, EC145를 제조하기 위한 방법:
    Figure pct00050

    (EC119).
  11. 청구항 10에 있어서, 아실화제는 하기 화학식:
    Figure pct00051
    ,
    또는 이의 산 부가염으로 이루어져 있는 것을 특징으로 하는, EC145를 제조하기 위한 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 아실화제는 하기 화학식:
    Figure pct00052

    으로 이루어져 있고 산 부가염의 형태로 도입되는 것을 특징으로 하는, EC145를 제조하기 위한 방법.
  13. 청구항 11에 있어서, 아실화제는 하기 화학식:
    Figure pct00053

    으로 이루어져 있고 유리 염기의 형태로 도입되는 것을 특징으로 하는, EC145를 제조하기 위한 방법.
  14. 청구항 10 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 있어서, 데스아세틸빈블라스틴 하이드라자이드는 아세토니트릴을 포함한 용매에서 아실화제로 처리되는 것을 특징으로 하는, EC145를 제조하기 위한 방법.
  15. 청구항 10 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서, 데스아세틸빈블라스틴 하이드라자이드는 고순도 형태로 제공되는 것을 특징으로 하는, EC145를 제조하기 위한 방법.
  16. 청구항 10 내지 청구항 15 중 어느 한 항에 있어서, 아실화제로 데스아세틸빈블라스틴 하이드라자이드를 처리하여 하기 화학식:
    Figure pct00054

    의 화합물을 포함하는 반응 혼합물을 형성하는 단계; 및 반응 혼합물로 EC119를 처리하는 단계는 동일한 용기에서 수행되는 것을 특징으로 하는, EC145를 제조하기 위한 방법.
  17. 청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 있어서, EC145를 포함한 반응 혼합물은 시트레이트 완충된, 수성 소듐 클로라이드 용액으로 희석되고 정제를 위한 폴리스티렌-디비닐벤젠 고분자 수지 칼럼 또는 카트리지(cartridge) 상에 적하되는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, EC145를 제조하기 위한 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 아세토니트릴 및 시트레이트 완충된, 수성 소듐 클로라이드 용액을 포함한 이동상을 이용하여 칼럼 또는 카트리지로부터 EC145 산물을 용출시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, EC145를 제조하기 위한 방법.
  19. 청구항 1 내지 청구항 18 중 어느 한 항에 있어서, 수성 용액에서 정제된 산물로서 EC145를 제공하기 위해 한외-여과를 이용하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, EC145를 제조하기 위한 방법.
  20. 청구항 1 내지 청구항 19 중 어느 한 항에 있어서, 어느 단계에서나 이용된 물은 약 0.9 백만분율(parts per million, ppm)을 초과하지 않는 농도에서 용해된 산소를 포함하는 것을 특징으로 하는, EC145를 제조하기 위한 방법.
  21. 청구항 1 내지 청구항 20 중 어느 한 항에서 설명된 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 접합체 EC145.
  22. 수성 완충액, 여기서 완충액은 5.9 내지 6.3의 pH를 갖는다;의 존재에서, 하기 화학식:
    Figure pct00055

    의 화합물, 여기서 X는 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아릴티오 또는 헤테로아릴티오이다;로 화학식 (EC119)의 화합물을 처리하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 접합체 EC145:
    Figure pct00056

    (EC119).
  23. 청구항 22에 있어서, X는 2-티오피리디닐인 것을 특징으로 하는 접합체.
  24. 청구항 22 또는 청구항 23에 있어서, 방법은 화학식 Y-CO-O-(CH2)2-S-X의 아실화제, 또는 이의 산 부가염, 여기서 Y는 이탈기이다;으로 데스아세틸빈블라스틴 하이드라자이드를 처리하여, 하기 화학식:
    Figure pct00057

    의 화합물을 포함하는 반응 혼합물을 형성하는 단계; 및 하기 화학식:
    Figure pct00058

    의 화합물을 단리시키는 것 없이 반응 혼합물로 화학식 (EC119)의 화합물을 직접적으로 처리하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 접합체:
    Figure pct00059

    (EC119).
  25. 청구항 24에 있어서, 아실화제는 하기 화학식:
    Figure pct00060

    으로 이루어져 있고 유리 염기의 형태로 도입되는 것을 특징으로 하는 접합체.
  26. 희석제, 부형제 또는 담체와 함께 청구항 21 내지 청구항 25 중 어느 한 항에서 설명된 바와 같은 접합체 EC145를 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
KR1020127032401A 2010-05-19 2011-05-19 엽산-표적 작용제를 위한 향상된 방법 KR20130079431A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US34644410P 2010-05-19 2010-05-19
US61/346,444 2010-05-19
US35102210P 2010-06-03 2010-06-03
US61/351,022 2010-06-03
PCT/US2011/037134 WO2011146707A1 (en) 2010-05-19 2011-05-19 Improved process for a folate-targeted agent

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20130079431A true KR20130079431A (ko) 2013-07-10

Family

ID=44992057

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020127032401A KR20130079431A (ko) 2010-05-19 2011-05-19 엽산-표적 작용제를 위한 향상된 방법

Country Status (11)

Country Link
US (2) US20130065841A1 (ko)
JP (1) JP2013526577A (ko)
KR (1) KR20130079431A (ko)
CN (1) CN102984943B (ko)
BR (1) BR112012029458A2 (ko)
CA (1) CA2799391A1 (ko)
IL (1) IL222964A0 (ko)
MX (1) MX2012013250A (ko)
RU (1) RU2012154914A (ko)
SG (1) SG185592A1 (ko)
WO (1) WO2011146707A1 (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2979527A1 (en) 2015-03-13 2016-09-22 Endocyte, Inc. Conjugates of pyrrolobenzodiazepine (pbd) prodrugs for treating disease
WO2017172930A1 (en) * 2016-03-29 2017-10-05 Endocyte, Inc. Pbd conjugates for treating diseases
CA3092419A1 (en) 2018-04-11 2019-10-17 Radisurf Aps Compositions for forming polymer brushes

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100381177C (zh) * 2003-01-27 2008-04-16 恩多塞特公司 维生素受体结合递药缀合物
CN100423778C (zh) * 2003-11-25 2008-10-08 上海复旦张江生物医药股份有限公司 用于上载抗肿瘤药物的脂质体载体及其制备方法和应用
US20080280937A1 (en) * 2005-08-19 2008-11-13 Christopher Paul Leamon Ligand Conjugates of Vinca Alkaloids, Analogs, and Derivatives

Also Published As

Publication number Publication date
BR112012029458A2 (pt) 2015-10-20
US20130065841A1 (en) 2013-03-14
IL222964A0 (en) 2013-02-03
US20140066593A1 (en) 2014-03-06
SG185592A1 (en) 2012-12-28
CA2799391A1 (en) 2011-12-04
CN102984943A (zh) 2013-03-20
CN102984943B (zh) 2016-01-13
RU2012154914A (ru) 2014-06-27
WO2011146707A1 (en) 2011-11-24
JP2013526577A (ja) 2013-06-24
MX2012013250A (es) 2013-03-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3903825A1 (en) Bi-ligand drug conjugate and use thereof
CN104784699B (zh) 叶酸受体结合配体-药物偶联物
JP2014521319A5 (ko)
JP2021528433A (ja) ＥｐｈＡ２に結合するためのペプチドリガンド
JP2010503706A (ja) リジン系ポリマーリンカー
EP3735987A1 (en) Amanitin antibody conjugate
JP2021528430A (ja) Ｐｓｍａに結合するためのペプチドリガンド
CN111001012A (zh) 一种亲水碳酸酯型抗体偶联药物
Tai et al. A novel rapamycin-polymer conjugate based on a new poly (ethylene glycol) multiblock copolymer
JP2022515720A (ja) Ｉｌ－１７に特異的な二環式ペプチドリガンド
CN112585157A (zh) 用于结合整联蛋白αvβ3的肽配体
AU2020204250B2 (en) One-pot process for preparing intermediate of antibody-drug conjugate
KR20130079431A (ko) 엽산-표적 작용제를 위한 향상된 방법
WO2017152756A1 (zh) cRGD-厄洛替尼缀合物及其制备方法
Tripodi et al. Development of novel cyclic NGR peptide–daunomycin conjugates with dual targeting property
CN114053426A (zh) 一种双药链接组装单元及双药靶向接头-药物偶联物
EP3950700A1 (en) Peptide complex and production method therefor, and use of said peptide complex
CN112585155A (zh) 用于结合il-17的肽配体
EP2571362A1 (en) Improved process for a folate-targeted agent
CN111205350A (zh) 作为组蛋白脱乙酰酶抑制剂的大环硫代酸酯前体药物
CA3127903A1 (en) Bi-ligand drug conjugate and use thereof
EP4201429A1 (en) Antibody-drug conjugate intermediate comprising sn38 and preparation method therefor
EP4365184A1 (en) Analysis method for peptide bound to carrier for liquid phase peptide synthesis
RU2696096C2 (ru) Низкомолекулярные конъюгаты противоопухолевых агентов и высокоселективных лигандов асиалогликопротеинового рецептора для терапии онкологических патологий печени
RU2798981C2 (ru) Конъюгат антитела с аматоксином неприродного типа

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid