CN102984943B - 用于叶酸靶向剂的改进方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于制备叶酸靶向缀合物EC145的改进方法，用改进方法制备的缀合物EC145，和包含用改进方法制备的缀合物EC145的药物组合物。

Description

用于叶酸靶向剂的改进方法
相关申请交叉引用
本申请要求2010年5月19日提交的美国临时专利申请61/346,444和2010年6月3日提交的61/351,022的权益，各专利通过引用结合到本文中。
技术领域
本发明涉及用于制备叶酸靶向缀合物EC145的改进方法，用改进方法制备的缀合物EC145，和包含用改进方法制备的缀合物EC145的药物组合物。
发明背景和概述
叶酸靶向药物已开发并在临床试验中作为癌症治疗药试验。EC145包括高效长春花生物碱细胞毒性化合物，缀合到叶酸的去乙酰长春碱酰肼(DAVLBH)。EC145分子靶向在上皮瘤表面上发现的高水平叶酸受体，这些上皮瘤包括非小细胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌、子宫内膜癌和肾癌及其它癌，包括输卵管癌和原发性腹膜癌。相信EC145结合到表达叶酸受体的肿瘤，这种叶酸受体将长春花部分直接输送到癌细胞，同时避开正常细胞。因此，在结合后，EC145通过胞吞进入癌细胞，释放DAVLBH，并引起细胞死亡或抑制细胞功能。EC145具有下式：
，并已收录Chemical Abstracts Registry Number 742092-03-1。如本文所用，根据上下文，术语EC145意指所述化合物或其药学上可接受的盐，并且化合物可以离子化形式存在于固体、溶液或悬浮体，包括质子化形式。
EC145公开于美国专利7,601,332和WO 2007/022493，用于静脉内给药的特别用途和含水液体pH 7.4磷酸盐缓冲制剂公开于WO 2011/014821。
公开于美国专利7,601,332和WO 2007/022493的EC145的制备方法适用于以实验室规模制备EC145，例如，最多几十毫克，但在增大规模时可能出现问题。
在所公开的方法中，使用下式的硫醇
,
，也称为EC119，可通过与硫代磺酸或吡啶基二硫代活化长春碱中间体形成二硫键制备EC145。例如，在二氯甲烷(DCM)中制备下式的氨基甲酰基二硫化物中间体(CDSI)
并且按照硅胶层析法分离。然后使CDSI溶于四氢呋喃(THF)，并加到EC119的水溶液，其中用碳酸氢钠调节pH，以使EC119溶解。在反应完成后，关于小规模混合物(5-10mL)，可用旋转式蒸发器去除THF，然而，在真空下起泡可能太成问题，以至于在较大规模此操作不可行。因此，在反应完成后，将混合物用水稀释，冷冻，并冻干。然后使粗固体溶于水，并通过反相层析纯化。将具有大于90% EC145峰面积的层析级分合并，用水稀释，并冻干。一般纯化产率为在90-93%纯度30-40%的范围内。与冻干相关的体积使制备多于克量很难处理。
另外，在按比例放大时，已确定在反应混合物整理期间部分EC145由形成二硫键中释放的巯基吡啶分解。
已确定可抑制此分解，这提供本发明的一个方面。因此，作为一个实施方案，本发明提供一种制备EC145的方法，所述方法包括在pH小于8的含水缓冲剂存在下用下式的化合物
处理下式的化合物
其中X为烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳基硫基或杂芳基硫基。在方法的一个实施方案中，X为2-硫基吡啶基或3-硝基-2-硫基吡啶基。在方法的一个实施方案中，X为2-硫基吡啶基。
对于任何上述，在一个实施方案中，缓冲剂具有小于约7的pH。在另一个实施方案中，缓冲剂具有小于约6.5的pH。在另一个实施方案中，缓冲剂具有5.9至6.3的pH。在另一个实施方案中，缓冲剂具有5.9至6.1的pH。
对于任何上述，在一个实施方案中，缓冲剂为磷酸盐缓冲剂。在另一个实施方案中，缓冲剂为磷酸钠缓冲剂。使用本文公开的缓冲剂比使用碳酸氢钠更好地控制pH和降解问题。
以上方法的另一个实施方案包括在pH 5.9至6.3的磷酸钠缓冲剂存在下用下式的化合物
处理下式的化合物
。
对于任何上述，一个实施方案为其中处理在包含乙腈的液体介质中进行的方法。
对于任何上述，另一方面为一种方法，所述方法进一步包括用式Y-CO-O-(CH2)2-S-X的酰化剂或其酸加成盐处理去乙酰长春碱酰肼的步骤，其中Y为离去基团，以形成包含下式的化合物的反应混合物
并用反应混合物直接处理下式的化合物
而不用分离下式的化合物
。
离去基团Y可以为适用于酰肼酰化的任何个数离去基团。在一个实施方案中，Y为与羧酸或与碳酸的单酯形成活性酯的醇的残基，例如4-硝基苯氧基残基、1-苯并三唑基氧基残基或7-氮杂苯并三唑-1-基氧基残基。在一个实施方案中，酰化剂为下式的化合物
或其酸加成盐。在另一个实施方案中，酰化剂为下式的化合物
并且以酸加成盐的形式引入。在酰化剂以酸加成盐的形式引入时，用一种碱使所述碱游离，例如三乙胺或二异丙基乙基胺。在另一个实施方案中，酰化剂为下式的化合物
并且以游离碱的形式引入。
对于任何上述，一个实施方案为其中用酰化剂在包含乙腈的溶剂中处理去乙酰长春碱酰肼的方法。
对于任何上述，一个实施方案为其中以高纯化形式提供去乙酰长春碱酰肼的方法。如以下实施例中所述，使用包括从乙酸乙酯和甲苯溶解/沉淀(表示为结晶作用)的方法，可作为高纯化固体得到去乙酰长春碱酰肼。
对于任何上述，一个实施方案为其中以高纯化形式提供EC119的方法。用基于Fmoc的固相化学合成EC119。首先，利用2-氯三苯甲基氯树脂，在二异丙基乙基胺(DIPEA)存在下，通过酯化反应将Fmoc-Cys(Trt)-OH载到树脂上。然后，通过用二甲基甲酰胺(DMF)中0.1M HOBt中的6%哌嗪处理树脂，去除树脂结合的Cys(Trt)上的Fmoc保护基。树脂用DMF和甲基·叔丁基醚(MTBE)洗涤。Fmoc-Asp(OtBu)-OH用N,N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)和N-羟基苯并三唑(HOBt)偶联到树脂。偶联反应由Kaiser试验监测。用Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH和Fmoc-Glu-OtBu重复去保护和偶联。偶联N10-TFA-Pte-OH使用1.2当量N10-TFA-Pte、1.2当量PyBOP、1.2当量HOBt和2.4当量DIPEA。 用DMF中的2%肼去除三氟乙酰基。利用包含约85%三氟乙酸、10%乙二硫醇、2.5%三异丙基硅烷和2.5%去离子水的裂解剂使肽从树脂裂解。此反应也导致同时去除t-Bu、Pbf和三苯甲基保护基。粗产物用MTBE沉淀，并过滤分离。粗EC119的纯度为约90%。制备在以下实施例中更详细描述。
对于任何上述，一个实施方案为这样一种方法，其中用酰化剂处理去乙酰长春碱酰肼以生成包含下式化合物
的反应混合物的步骤和用反应混合物处理EC119的步骤在相同反应容器中进行。
对于任何上述，一个实施方案为进一步包括以下步骤的方法，其中将包含EC145的反应混合物用柠檬酸盐缓冲氯化钠水溶液稀释，并装到聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物树脂柱或柱体上纯化。此方法使稀释和装载次序成为可能。稀释和装载方法包括用缓冲盐水(对于经稀释溶液，目标为10%乙腈含量)稀释反应混合物，并将此溶液装载到层析柱上。这消除需要一个超滤序列，并节省约12至24小时处理时间。另一个实施方案进一步包括使用包含乙腈和柠檬酸盐缓冲氯化钠水溶液的流动相从柱或柱体洗脱EC145产物。使用缓冲盐水流动相增快层析过程数天。首先，缓冲盐水流动相的增加的离子强度影响产物在流动相和固定相之间分配。产物对于固定相的亲合力增加到对粗EC145的柱容量超过双倍的点。固定相的增加的亲合力也消除产物穿透的发生(在装载操作期间，部分产物通过柱)，同时将粗EC145装到柱上。较高的离子强度也改善层析过程的动力学，从而提供更类似高斯的层析峰形状，并使识别级分切点更容易。在流动相中包含氯化钠也产生可再现保留体积和产物带宽。
对于任何上述，一个实施方案为进一步包括用超滤提供EC145作为水溶液中的纯化产物的步骤的方法。此方法避免与大规模冻干相关的时间和产物纯度损失(约1%)。另外，在适合通过0.2微米绝对过滤器过滤的其它实施方案的条件，它在水溶液中提供纯化产物，这相对于没有过滤的过程减少微生物计数和内毒素水平。
已确定，在本文任何实施方案所述方法中的潜在问题是EC145被氧降解。对于任何上述，一个实施方案为其中在任何步骤使用的水包含不超过约0.9ppm浓度的溶解氧的方法。
作为本发明的一个方面，本发明提供通过上述方法制备的缀合物EC145作为一个实施方案。一个实施方案为通过一种方法制备的缀合物EC145，所述方法包括在其中缓冲剂具有5.9至6.3的pH的含水缓冲剂存在下用下式的化合物
处理下式的化合物
其中X为烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳基硫基或杂芳基硫基。在以上的一个实施方案中，X为2-硫基吡啶基。在以上缀合物的另一个实施方案中，所述方法进一步包括用式Y-CO-O-(CH2)2-S-X的酰化剂或其酸加成盐处理去乙酰长春碱酰肼的步骤，其中Y为离去基团，以形成包含下式的化合物的反应混合物
并用反应混合物直接处理下式的化合物
(EC119)
而不用分离下式的化合物
。
以上的另一个实施方案为缀合物24，其中酰化剂为下式的化合物
并且以游离碱的形式引入。
作为本发明的一个方面，本发明提供一种药物组合物作为一个实施方案，所述药物组合物包含任何以上实施方案所述的缀合物EC145与稀释剂、赋形剂或载体。
发明详述
本发明的实施方案进一步通过以下列举项描述：
1. 一种制备EC145的方法，所述方法包括在pH小于8的含水缓冲剂存在下用下式的化合物
处理下式的化合物的步骤
其中X为烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳基硫基或杂芳基硫基。
2. 第1项的方法，其中X为2-硫基吡啶基或3-硝基-2-硫基吡啶基。
3. 第1项的方法，其中X为2-硫基吡啶基。
3.1 第1至3项中任一项的方法，其中缓冲剂具有小于约7的pH。
3.2 第1至3项中任一项的方法，其中缓冲剂具有小于6.5的pH。
4. 第1至3项中任一项的方法，其中缓冲剂具有5.9至6.3的pH。
5. 第4项的方法，其中缓冲剂具有5.9至6.1的pH。
6. 第1至5项中任一项的方法，其中缓冲剂为磷酸盐缓冲剂。
7. 第6项的方法，其中缓冲剂为磷酸钠缓冲剂。
8. 第1项的方法，所述方法包括在具有5.9至6.3的pH的磷酸钠缓冲剂存在下用下式的化合物
处理下式的化合物的步骤
。
9. 第1至8项中任一项的方法，其中处理在包含乙腈的液体介质中进行。
10. 第1至9项中任一项的方法，所述方法进一步包括用式Y-CO-O-(CH2)2-S-X的酰化剂或其酸加成盐处理去乙酰长春碱酰肼的步骤，其中Y为离去基团，以形成包含下式的化合物的反应混合物
并用反应混合物直接处理下式的化合物
而不用分离下式的化合物
。
10.1 第10项的方法，其中Y为与羧酸或与碳酸的单酯形成活性酯的醇的残基。
10.2 第10项的方法，其中Y为4-硝基苯氧基残基、1-苯并三唑基氧基残基或7-氮杂苯并三唑-1-基氧基残基。
11. 第10项的方法，其中酰化剂为下式的化合物
，
或其酸加成盐。
12. 第11项的方法，其中酰化剂为下式的化合物
并且以酸加成盐的形式引入。
13. 第11项的方法，其中酰化剂为下式的化合物
并且以游离碱的形式引入。
14. 第10至13项中任一项的方法，其中去乙酰长春碱酰肼用酰化剂在包含乙腈的溶剂中处理。
15. 第10至14项中任一项的方法，其中去乙酰长春碱酰肼以高纯化形式提供。
16. 第10至15项中任一项的方法，其中用酰化剂处理去乙酰长春碱酰肼以生成包含下式化合物
;
的反应混合物的步骤和用反应混合物处理EC119的步骤在相同反应容器中进行。
17. 第1至16项中任一项的方法，所述方法进一步包括其中包含EC145的反应混合物用柠檬酸盐缓冲氯化钠水溶液稀释，并装到聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物树脂柱或柱体上纯化的步骤。
18. 第17项的方法，所述方法进一步包括使用包含乙腈和柠檬酸盐缓冲氯化钠水溶液的流动相从柱或柱体洗脱EC145产物。
19. 第1至18项中任一项的方法，所述方法进一步包括用超滤提供EC145作为水溶液中的纯化产物的步骤。
20. 第1至19项中任一项的方法，其中在任何步骤使用的水包含不超过约0.9ppm浓度的溶解氧。
21. 缀合物EC145，所述缀合物EC145通过第1至20项中任一项所述的方法制备。
22. 通过一种方法制备的缀合物EC145，所述方法包括在其中缓冲剂具有5.9至6.3的pH的含水缓冲剂存在下用下式的化合物
处理下式的化合物的步骤
其中X为烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳基硫基或杂芳基硫基。
23. 第22项的缀合物，其中X为2-硫基吡啶基。
24. 第22或23项的缀合物，其中所述方法进一步包括用式Y-CO-O-(CH2)2-S-X的酰化剂或其酸加成盐处理去乙酰长春碱酰肼的步骤，其中Y为离去基团，以形成包含下式的化合物的反应混合物
并用反应混合物直接处理下式的化合物
而不用分离下式的化合物
。
25. 第24项的缀合物，其中酰化剂为下式的化合物
并且以游离碱的形式引入。
26. 一种药物组合物，所述药物组合物包含第21至25项中任一项所述的缀合物EC145与稀释剂、赋形剂或载体。
本文所用术语“烷基”包括碳原子链，任选支化或为环状，并且任选经取代或者可包含氧、硫或氮原子作为杂烷基。应进一步了解，在某些实施方案中，烷基最好具有限制长度，包括C1-C6和C1-C4。说明性烷基为但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、环己基等。
本文所用术语“芳基”包括单环和多环芳族碳环基团，各基团可任选经取代。本文所述说明性芳族碳环基团包括但不限于苯基、萘基等。本文所用术语“杂芳基”包括芳族杂环基团，各基团可任选经取代。说明性芳族杂环基团包括但不限于2-吡啶基、3-硝基-2-吡啶基等。
本文所用术语“任选经取代”包括任选经取代的基团上用其它官能团代替氢原子。这些其它官能团说明性包括但不限于卤素、硝基等。
本文所述药物组合物是指适用于EC145胃肠外给药的药物组合物。
实施例
以下实施例进一步说明本发明的具体实施方案，然而，不应将以下说明性实施例解释为以任何方式限制本发明。在本文中使用用于例如溶剂、试剂和保护基的常用缩写。CDSI用于表示氨基甲酰基二硫化物中间体(4)。
在实施例中级分和样品评估使用的HPLC方法包括下列：
EC145-CMC-IP-0001
样品制备：用8M盐酸胍将物质稀释到约0.5mg/mL。
柱：Waters XBridge BEH C18，3.5µm，2.1×100mm。
流动相：A)500mM碳酸氢铵，pH 9.2；B)75:25乙腈-甲醇。
注入体积：10µL
UV检测：280nm
柱温度：50℃
样品温度：5℃
梯度： 时间(min) 流速(mL/min) %A %B
0.0 0.55 95 5
0.5 0.55 95 5
1.0 0.55 80 20
5.0 0.55 73.5 26.5
21.0 0.55 71.5 28.5
27.0 0.55 70 30
29.0 0.55 55 45
30.0 0.55 30 70
33.0 0.55 30 70
33.1 0.75 95 5
40.0 0.75 95 5
EC145-CMC-AM-0001( 版本 2.3)
样品制备：用磷酸盐缓冲盐水或1:1乙腈-水(v/v)将物质稀释到约1mg/mL。
柱：Waters Symmetry C18，3.5µm，4.6×75mm。
流动相：A)10mM乙酸三乙铵，pH 7.5；B)乙腈。
注入体积：10µL
UV检测：280nm
柱温度：25℃
样品温度：5℃
梯度： 时间(min) 流速(mL/min) %A %B
0.0 1.0 85 15
20.0 1.0 50 50
25.0 1.0 20 80
30.0 1.0 20 80
31.0 1.0 85 15
41.0 1.0 85 15
实施例 1
制备 EC119
如下用基于Fmoc的固相化学合成EC119：
第 1 偶联
将2-氯三苯甲基氯树脂加到肽合成容器。在DMF(10mL/g树脂)中溶胀。用DMF(10mL/g树脂)洗涤2次。加入DCM/DMF中的0.8当量Fmoc-Cys(Trt)-OH。加入2当量DIPEA。搅拌30分钟。加入甲醇(1mL/g树脂)，并搅拌10分钟。用DMF洗涤3次。用MTBE洗涤3次。用DMF洗涤3次。加入DMF中0.1M HOBt中的6%哌嗪，并搅拌10-20分钟。加入DMF中0.1M HOBt中的6%哌嗪，并搅拌10-20分钟。用DMF洗涤3次。用MTBE洗涤3次。进行Kaiser试验，以证明偶联完成。
第 2 偶联
用DMF(10mL/g树脂)洗涤3次。加入DMF中的2当量Fmoc-Asp(OtBu)-OH。加入DMF中的2当量HOBt。加入2当量DIC。搅拌1.5-3小时。用Kaiser试验证明偶联。用MTBE洗涤2次。用DMF洗涤2次。加入DMF中0.1M HOBt中的6%哌嗪，并搅拌10-20分钟。加入DMF中0.1M HOBt中的6%哌嗪，并搅拌10-20分钟。用DMF洗涤3次。用MTBE洗涤3次。进行Kaiser试验。
第 3 偶联
用DMF洗涤3次。加入DMF中的2当量Fmoc-Asp(OtBu)-OH。加入DMF中的2当量HOBt。加入2当量DIC。搅拌1.5-3小时。用Kaiser试验证明偶联。用MTBE洗涤2次。用DMF洗涤2次。加入DMF中0.1M HOBt中的6%哌嗪，并搅拌10-20分钟。加入DMF中0.1M HOBt中的6%哌嗪，并搅拌10-20分钟。用DMF洗涤3次。用MTBE洗涤3次。进行Kaiser试验。
第 4 偶联
用DMF洗涤。加入DMF中的2当量Fmoc-Arg(Pbf)-OH。加入DMF中的2当量HOBt。加入2当量DIC。搅拌1.5-3小时。用Kaiser试验证明偶联。用MTBE洗涤2次。用DMF洗涤2次。加入DMF中0.1M HOBt中的6%哌嗪，并搅拌10-20分钟。加入DMF中0.1M HOBt中的6%哌嗪，并搅拌10-20分钟。用DMF洗涤3次。用MTBE洗涤3次。进行Kaiser试验。
第 5 偶联
用DMF洗涤3次。加入DMF中的2当量Fmoc-Asp(OtBu)-OH。加入DMF中的2当量HOBt。加入2当量DIC。搅拌1.5-3小时。用Kaiser试验证明偶联。用MTBE洗涤2次。用DMF洗涤2次。加入DMF中0.1M HOBt中的6%哌嗪，并搅拌10-20分钟。加入DMF中0.1M HOBt中的6%哌嗪，并搅拌10-20分钟。用DMF洗涤3次。用MTBE洗涤3次。进行Kaiser试验。
第 6 偶联
用DMF洗涤3次。加入DMF中的2当量Fmoc-Glu-OtBu。加入DMF中的2当量HOBt。加入2当量DIC。用Kaiser试验证明偶联。用MTBE洗涤2次。用DMF洗涤2次。加入DMF中0.1M HOBt中的6%哌嗪，并搅拌10-20分钟。加入DMF中0.1M HOBt中的6%哌嗪，并搅拌10-20分钟。用DMF洗涤3次。用MTBE洗涤3次。进行Kaiser试验。
第 7 偶联
用DMF洗涤3次。加入最小量DMSO中的1.2当量N10-TFA-Pte-OH。加入DMF中的1.2当量HOBt。加入DMF中的1.2当量PyBOP。加入2.4当量DIPEA。搅拌3-5小时。用Kaiser试验证明偶联。用DMF洗涤2次。用MTBE洗涤2次。
去保护 - 去除三氟乙酰基
用DMF洗涤2次。加入DMF中的2%肼，并搅拌5分钟。加入DMF中的2%肼，并搅拌5分钟。加入DMF中的2%肼，并搅拌5分钟。用DMF洗涤3次。用MTBE洗涤3次。将树脂在室温在真空下干燥。
从树脂裂解
将包含85%TFA、2.5%三异丙基硅烷、2.5%水和10%乙二硫醇的裂解剂(10mL/g树脂)加入到烧瓶。使混合物在冰浴中冷却。加入树脂，并在室温反应2-3小时。过滤，并收集滤液。将滤液加到冷MTBE(10mL MTBE/1mL滤液)。在0-5℃搅拌30±10分钟。通过中孔隙率玻璃过滤器过滤经沉淀产物。用冷MTBE洗涤沉淀3次。将产物在室温在真空下干燥。在-20℃在氮下储存。
纯化
使用反相C18柱(6英寸柱，2.8kg，10μm，100Å)，通过制备HPLC纯化粗EC119。流动相为0.5% NH4OAc(A)和0.5% NH4OAc/ACN(1:4)(B)。将40g粗EC119溶于1-5% TFA，通过1µm玻璃纤维过滤器过滤，并装到6英寸柱上。收集级分，并采样用于HPLC分析。在氮下用50% AcOH收集后，随即将各级分的pH调节到3-4，以使产物沉淀。离心分离经沉淀产物，用0.1% AcOH洗涤，并在2-8℃储存，直到进一步处理。在离心操作期间用氮覆盖容器，以减小氧化的可能性。组合标准为纯度≥98%，异构体D-Arg4、D-Glu2和D-Asp3≤0.25%，其它杂质≤0.5%。异构体D-Asp5、D-Asp6和D-Cys不能通过Prep-HPLC去除，应在合成过程中阻止。一可能，就将满足组合标准的物质冻干(EC119溶液和湿沉淀不稳定)。最终产物的纯度大于98%。包括固相合成和纯化的纯EC119的总产率为约40%。将产物在氮下装在琥珀玻璃瓶中，并在-20℃储存。
实施例 2
A. 硫酸长春碱一般转化成去乙酰长春碱酰肼
材料
硫酸长春碱：USP；FW=909.05g/mol；甲醇：无水；肼：无水；FW=32g/mol；去离子水；乙酸乙酯：LC/GC级；甲苯：LC/GC级；磷酸二氢钠：≥99.0%；FW=120g/mol；磷酸氢二钠：≥99.0%；FW=142g/mol；氯化钠：试剂级；FW=58.4g/mol；硫酸钠：无水；5-降冰片烯-2-甲酸。
步骤
在氮气或氩气气氛下进行反应、萃取处理和分离。用压力过滤器去除硫酸钠，并收集产物。将猝灭反应使用的氯化钠溶液和洗液用氮或氩鼓泡，直到溶解氧量不大于0.9ppm。
将硫酸长春碱和无水甲醇加到氩吹洗的反应器。将5-降冰片烯-2-甲酸和无水肼加到反应器。搅拌混合物，并在固体溶解后将混合物加热到约60℃。通过HPLC分析，在反应完成时，使其冷却，猝灭反应，并萃取到乙酸乙酯中。在干燥后，使产物从乙酸乙酯和甲苯结晶。将固体在室温在真空下干燥过夜。
缓冲NaCl包含10.0g NaCl、7.10-7.30g NaH2PO4、4.40-4.60g Na2HPO4和90mL水。溶液用氩或氮鼓泡(溶解氧含量<0.9ppm)。
一般分离产率为理论最大值的50-60%。
B. EC145 方法的步骤 2 和 3
步骤 2 和步骤 3 方法
材料
去乙酰长春碱酰肼：FW=768.9g/mol；20.5g，26.7mmol；混合碳酸酯(3)：FW=384.9g/mol；10.7g，27.8mmol；乙腈：q.s.；三乙胺：FW=101.2g/mol；2.67g，26.4mmol；Na2PO4 .7H2O：47.84g；EC119：29.9g，28.6mmol；0.5N HCl：q.s.；WFI：q.s.
步骤
应注意到，在此方法中使用的所有水为注射用水(WFI)。
用氩吹洗适合的容器。加入20.5±0.3g去乙酰长春碱酰肼；加入根据效力调节，即，如果效力为90.0%，则加入为22.8g。加入10.7±0.2g混合碳酸酯(根据效力调节)。加入800±30mL乙腈和2.67±0.11g三乙胺。在氩下在10-14℃混合20-28小时。取样用于HPLC(EC145-CMC-AM-0001，版本2.3)。预期结果为CDSI:酰肼比>25:1。如果不是，则在氩下在10-14℃继续混合2-4小时，并再次取样。
用氩对780-820mL水鼓泡，直到溶解氧量小于0.9ppm，并记录溶解氧量。使47.8 ±0.5g七水磷酸氢二钠溶于脱氧水。向适合容器加入29.8±0.5g EC119(加入量根据效力调节)。将磷酸钠溶液加到EC119，并在氩下混合。检测溶液的pH，如果必要，用0.5N HCl将pH调节到5.8-6.2。
将EC119缓冲溶液加到反应混合物。在氩下在20-25℃混合60-75分钟。取样用于HPLC(EC145-CMC-AM-0001，版本2.3)。如果EC145:CDSI之比>25:1，则向下继续。如果不是，则在氩下在20-25℃继续混合，并再次取样。如果EC145:CDSI之比>25:1，则向下继续。如果不是，加入另外1g EC119，并在氩下在20-25℃混合30分钟，并再次取样。
从用氩鼓泡直到溶解氧量小于0.9ppm的水制备6.9L-7.1L 25mM磷酸盐缓冲剂，185-195mM NaCl，pH 7.2-7.5。用此缓冲剂稀释反应混合物。如果混合物显现超过微混，则需要过滤产物溶液(Whatman Polycap TC75或TC150，0.45或1.0微米)；在将产物装到Biotage柱上的同时，进行此过滤。
液相层析纯化
使用Biotage 150M，C18柱体。这种大小的柱体可适应所述大小两倍的反应混合物。
柱制备
a.　用下列冲洗柱：
i.　12-13L乙腈
ii.　12-13L 80%乙腈和20%水(v/v)
iii.　12-13L 50%乙腈和50%水(v/v)
iv.　12-13L 10%乙腈和90%水(v/v)
纯化：
制备25mM磷酸盐缓冲剂，(185-195mmol) NaCl，pH 7.3-7.5
缓冲剂用氩鼓泡，直到溶解氧含量≤0.9ppm。
制备：41L在缓冲盐水中的 10%乙腈(v/v)；13L在缓冲盐水中的16%乙腈(v/v)；52L在缓冲盐水中的27%乙腈(v/v)。
检查流动相溶液的溶解氧含量。如果溶解氧含量大于0.9ppm，则流动相用氩或氮鼓泡，直到溶解氧量≤0.9ppm。
用26-27L 10%乙腈流动相冲洗柱。
将产物溶液装到柱上
用以下流动相次序洗脱产物：
i.　13-14L 10%乙腈流动相
ii.　13L 16%乙腈流动相
iii.　51-52L 27%乙腈流动相
注意：在线uv检波器有帮助；产物出现开始在15-19L 27%乙腈流动相，带宽8-13L。
级分评价
i.　HPLC方法EC145-CMC-IP-0001
ii.　通过级分 = ≥97.0% EC145，没有杂质≥0.8%
试验后柱处理：
柱可再使用一次。如果柱要用于第二试验，则进行ii-iv。
i.　用12-13L 1:1乙腈-水冲洗柱
ii.　用20-22L 乙腈冲洗柱
iii.　重复柱制备步骤ii-iv。
超滤
将足量水用氩或氮鼓泡，直到溶解氧量小于0.9ppm。将通过层析级分合并，并用相当体积的经鼓泡水稀释。用具有名义截留MW 1000的Millipore再生纤维素膜(cat# CDUF002LA)装配超滤设备，并用9L脱氧水清洗。开始产物溶液超滤。保持30-50psi背压力。继续超滤，直到截留物质体积为2至3L。加11至12L脱氧水。继续超滤，直到截留物质体积为2至3L。加11至12L脱氧水。继续超滤，直到截留物质体积为2至3L。加8至10L脱氧水。继续超滤，直到截留物质体积为2L。超滤终点必须由通过GC和浓度分析截留物质样品来确定。规范为≤50微克乙腈/毫克EC145。如果达不到，就进行另外的超滤循环。
必须调节API溶液的浓度，以便使封装物质为6至12mg/mL。在超滤完成时，用1升水清洗设备。因此，在必要时继续超滤或加水。一旦产物溶液离开超滤设备，就用1L脱氧水清洗超滤设备，并与产物溶液合并。
在清洗液与产物溶液合并后，此溶液必须通过0.2微米绝对过滤器过滤，并将此滤液封装(在惰性气氛下进行)。
经分离产物的一般产率为理论最大值的50-60%。
实施例 3
EC145 方法的步骤 2 和 3
步骤2和步骤3方法
材料
去乙酰长春碱酰肼：FW=768.9g/mol；1.00g，1.30mmol；混合碳酸酯(3)：FW=348.4g/mol；0.445g，1.28mmol；乙腈：q.s.；Na2PO4：1.10g；EC119：1.46g
1.40mmol；0.5N HCl：q.s.；WFI：q.s.
步骤
应注意到，在此方法中使用的所有水为WFI。
用氩吹洗适合的容器。加入1.00±0.02g去乙酰长春碱酰肼；加入根据效力调节，即，如果效力为90.0%，则加入为1.11g。加入0.445±0.005g混合碳酸酯(根据效力调节)。加入46±1mL乙腈。在氩下在10-20℃混合22-23小时。取样用于HPLC(EC145-CMC-AM-0001，版本2.3)。预期结果为CDSI:酰肼比>20:1。如果不是，则在氩下在10-20℃继续混合2-3小时，并再次取样。
用氩对41mL水鼓泡，直到溶解氧量小于0.9ppm，记录溶解氧量。使1.10±0.0.07g磷酸氢二钠溶于脱氧水。向适合容器加入1.46±0.03g EC119(加入量根据效力调节)。将磷酸钠溶液加到EC119，并在氩下混合。检测溶液的pH，如果必要，用0.5N HCl将pH调节到5.9-6.3。
将EC119缓冲溶液加到反应混合物。在氩下在20-25℃混合60-75分钟。取样用于HPLC(EC145-CMC-AM-0001，版本2.3)。如果EC145:CDSI之比>20:1，则向下继续。如果不是，则在氩下在13-23℃继续混合，并再次取样。如果EC145:CDSI之比>20:1，则向下继续。如果不是，加入另外1g EC119，并在氩下在13-23℃混合30分钟，并再次取样。
从用氩鼓泡直到溶解氧量小于0.9ppm的水制备399-401mL 0.02mM柠檬酸盐缓冲0.1M NaCl水溶液，pH 5.7-6.5。用此缓冲剂稀释反应混合物。如果混合物显现超过微混，则需要过滤产物溶液(Whatman Polycap TC75或TC150，0.45或1.0微米)；在将产物装到Biotage柱上的同时，进行此过滤。
液相层析纯化
使用利用聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物树脂填充的Biotage柱体。
柱制备
b.　用下列冲洗柱：
i.　乙腈
ii.　50%乙腈和50%水(v/v)
iii.　10%乙腈和90%水(v/v)
纯化：
制备柠檬酸盐缓冲氯化钠水溶液，pH 6.0-6.6。
缓冲剂用氩鼓泡，直到溶解氧含量≤0.9ppm。
制备：在缓冲氯化钠水溶液中的12%乙腈(v/v)；在缓冲氯化钠水溶液中的16%乙腈(v/v)；在缓冲氯化钠水溶液中的22.5%乙腈(v/v)。
检查流动相溶液的溶解氧含量。如果溶解氧含量大于0.9ppm，则流动相用氩或氮鼓泡，直到溶解氧量≤0.9ppm。
用10%乙腈流动相冲洗柱。
将产物溶液装到柱上
用以下流动相次序洗脱产物：
iv.　16%乙腈流动相
v.　22.5%乙腈流动相。
级分评价
iii.　HPLC方法EC145-CMC-IP-0001
iv.　通过级分 = ≥97.0% EC145，没有杂质≥0.8%
超滤
将足量水用氩或氮鼓泡，直到溶解氧量小于0.7ppm。将通过层析级分合并，并用相当体积的经鼓泡水稀释。用具有名义截留MW 1000的Millipore再生纤维素膜装配超滤设备，并用脱氧水清洗。开始产物溶液超滤。保持30-50psi背压力。继续超滤，直到截留物质体积为初始体积的约20%。将脱氧水加到截留物质。继续超滤，直到截留物质体积为初始体积的约20%。将脱氧水加到截留物质。继续超滤，直到截留物质体积为初始体积的约20%。将脱氧水加到截留物质。继续超滤，直到截留物质体积为初始体积的约20%。超滤终点必须由通过GC和浓度分析截留物质样品来确定。规范为≤50微克乙腈/毫克EC145。如果达不到，就进行另外的超滤循环。
必须调节API溶液的浓度，以便使封装物质为约12mg/mL。在超滤完成时，用水清洗设备。因此，在必要时继续超滤或加水。一旦产物溶液离开超滤设备，就用脱氧水清洗超滤设备，并与产物溶液合并。
在清洗液与产物溶液合并后，此溶液必须通过0.2微米绝对过滤器过滤，并将此滤液封装(在惰性气氛下进行)。
经分离产物的一般产率为理论最大值的50-60%。

Claims (18)

1.一种制备EC145的方法，
所述方法包括在pH为5.9至6.3的含水缓冲剂存在下，其中所述缓冲剂为磷酸盐缓冲剂，用下式的化合物
处理式EC119的化合物的步骤
其中X为C1-6烷基磺酰基、苯基磺酰基、萘基磺酰基、苯基硫基、萘基硫基、吡啶-2-硫基或3-硝基-吡啶-2-硫基。
2.权利要求1的方法，其中X为吡啶-2-硫基或3-硝基-吡啶-2-硫基。
3.权利要求1的方法，其中X为吡啶-2-硫基。
4.权利要求1的方法，其中缓冲剂具有5.9至6.1的pH。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中缓冲剂为磷酸钠缓冲剂。
6.权利要求1的方法，所述方法包括在pH 5.9至6.3的磷酸钠缓冲剂存在下，用下式的化合物
处理式EC119的化合物的步骤
。
7.权利要求1至4中任一项的方法，其中处理在包含乙腈的液体介质中进行。
8.权利要求1至4中任一项的方法，所述方法进一步包括用式Y-CO-O-(CH2)2-S-X的酰化剂或其酸加成盐处理去乙酰长春碱酰肼的步骤，其中Y为离去基团，以形成包含下式的化合物的反应混合物
并用反应混合物直接处理式EC119的化合物
而不用分离下式的化合物
。
9.权利要求8的方法，其中酰化剂为下式的化合物
，
或其酸加成盐。
10.权利要求9的方法，其中酰化剂为下式的化合物
并且以酸加成盐的形式引入。
11.权利要求9的方法，其中酰化剂为下式的化合物
，
并且以游离碱的形式引入。
12.权利要求9的方法，其中去乙酰长春碱酰肼用酰化剂在包含乙腈的溶剂中处理。
13.权利要求9的方法，其中去乙酰长春碱酰肼以高纯化形式提供。
14.权利要求9的方法，其中用酰化剂处理去乙酰长春碱酰肼以生成包含下式化合物
的反应混合物的步骤和用反应混合物处理EC119的步骤在相同反应容器中进行。
15.权利要求1至4中任一项的方法，所述方法进一步包括其中包含EC145的反应混合物用柠檬酸盐缓冲氯化钠水溶液稀释，并装到聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物树脂柱或柱体上纯化的步骤。
16.权利要求15的方法，所述方法进一步包括使用包含乙腈和柠檬酸盐缓冲氯化钠水溶液的流动相从柱或柱体洗脱EC145产物。
17.权利要求1至4中任一项的方法，所述方法进一步包括用超滤提供EC145作为水溶液中的纯化产物的步骤。
18.权利要求1至4中任一项的方法，其中在任何步骤使用的水包含不超过0.9ppm浓度的溶解氧。
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