CN116217655A - 一种连接基药物偶联物的中间体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种连接基药物偶联物的中间体的制备方法，以及利用该中间体制备化合物LE的方法。本发明的制备方法包括如下步骤：在溶剂中，将式II化合物在脱保护剂的存在下进行脱保护反应得到式I化合物；以及式I化合物与式VIII化合物或其甲磺酸盐在缩合剂、碱以及溶剂存在下进行酰胺缩合反应得到化合物LE。本发明的制备方法具有如下一个或多个优点：式I化合物稳定，纯化过程中不会分解；能以较好的收率得到纯度高的式I化合物；式I化合物作为linker，直接与依喜替康缩合，不仅大大减少细胞毒性物质的暴露时间，而且提高了依喜替康的利用率、降低了生产成本；因此本发明的工艺路线合理，适合大规模的工业化生产。

Description

一种连接基药物偶联物的中间体的制备方法

技术领域

本发明涉及一种连接基药物偶联物的中间体的制备方法。

背景技术

抗体偶联药物(ADC)成为了近几年国内外医药企争相布局的药物管线，是近年来制药行业关注的热点之一。ADC药物由三大基本模块组成，包含抗体、连接子(linker)、效应分子(drug)。ADC药物正是利用抗体特异性的靶向作用，将效应分子传输到肿瘤部位进行富集，从而达到杀死肿瘤细胞的目的。linker作为ADC药物的桥梁，通过可切割或不可切割的结构形式将drug与抗体连接，利用抗体特异性的靶向作用，将效应分子传输到肿瘤部位进行富集，从而达到杀死肿瘤细胞的目的。因此linker需要有精妙的设计，其不但要在生理状态下稳定，在到达靶向的肿瘤部位前不被降解，又要在到达靶向的肿瘤部位后能够有效地被降解从而释放出效应分子。

专利申请WO2020259258A1公开了一种喜树碱衍生物DXd作为效应分子的ADC化合物，并提供了如路线1和路线2所示的连接基药物偶联物LE的制备方法；专利申请WO2022204947A1、CN115215921A也提供了改进的路线3和路线4。

路线1：

路线1的合成方法包括如下步骤：化合物1-1与4-氨基苄醇反应，所得化合物与二(对硝基苯)碳酸酯反应后再与取代的烷基胺反应得到化合物1-2，化合物1-2与多聚甲醛和三甲基氯硅烷反应得到化合物1-3，化合物1-3与羟基乙酸叔丁酯反应后在三氟乙酸作用下脱去叔丁基得到化合物1-4，化合物1-4与Exatecan甲磺酸盐反应得到化合物1-5，在DBU作用下脱去氨基上的Fmoc保护后再与6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯发生偶联反应得到目标化合物LE。

该路线中以中间体1-3作为原料制备中间体1-4的步骤中，由于原料和产物对酸碱性均不稳定，脱保护和纯化过程中会存在一定的分解风险，化合物1-4未经过纯化，使用粗品直接进行下一步反应，会造成1-5粗品中产生明显的杂质，这类杂质极性与产物接近，造成纯化困难，进而影响LE的产品质量。

路线2：

路线2的合成方法包括如下步骤：化合物2-1与多聚甲醛和三甲基氯硅烷反应，所得化合物再与羟基乙酸叔丁酯反应得到化合物2-2，化合物2-2在三氟乙酸作用下脱去叔丁基得到2-2a，再与Exatecan甲磺酸盐反应得到化合物2-3，化合物2-3在三乙基膦作用下将叠氮还原成氨基得到化合物2-4，化合物2-4与MC-V发生偶联反应得到目标化合物LE。

该路线中原料2-2和脱去叔丁基生成的羧酸中间体2-2a对酸碱性均不稳定，脱保护和纯化过程中存在一定的分解风险，化合物2-2a未经过纯化，使用粗品直接进行下一步反应，会造成2-3粗品中会产生明显的杂质，这类杂质极性与产物接近，造成纯化困难，进而影响LE的产品质量。

路线3：

路线3的合成方法包括如下步骤：化合物3-1与对硝基苯基氯甲酸酯反应得到化合物3-2，所得化合物再与相应的胺反应得到化合物3-3，再经脱保护得到3-4，进一步与氨基酸活性酯反应得到3-5，经过脱保护得到3-6，再与酰基叠氮试剂反应得到化合物3-7，随后通过氯甲基化反应得到化合物3-8，再与DXd或者DXd衍生物反应得到化合物3-9，再将3-9中的叠氮基团还原得到化合物3-10，最后接上马来酰亚胺接头得到终产物LE14。

按照路线3的方法，以化合物3-1为起始原料制备LE14的总收率为3.5％，以化合物3-7为起始原料制备LE14的总收率为10.7％。

该路线中用DXd或DXd衍生物作为payload的来源，售价较贵，大大增加了制备LE14的成本。

路线4：

路线4的合成方法包括如下步骤：化合物4-1与对硝基苯基氯甲酸酯反应得到化合物4-2，所得化合物再与相应的胺反应得到化合4-3，经脱保护得到4-4，进一步与氨基酸活性酯反应得4-5，经过脱保护得到4-6，再与酰基叠氮试剂反应得到化合物4-7，随后通过氯甲基化反应得到化合物4-8，再与DXd衍生物反应得到化合物4-9，再将4-9中的叠氮基团还原得到化合物4-10，再接上马来酰亚胺接头得到4-11，最后脱除羟基保护基得到终产物LE14。

按照路线4的方法，以化合物4-1为起始原料，以其中的Dxd-a为payload来源制备LE14的总收率为7.3％(4-1→Dxd-a→LE14)；以化合物4-1为起始原料，以其中的Dxd-b为payload来源制备LE14的总收率为12.9％(4-1→Dxd-b→LE14)。

该路线中用DXd衍生物Dxd-a(结构见路线4-a)或Dxd-b(结构见路线4-b)作为payload的来源，售价较贵，大大增加了制备LE14的成本。

为了避免购买价格昂贵的DXd衍生物，本公司开发了从依喜替康出发制备Dxd-a和Dxd-b的合成路线4-a和路线4-b。

依喜替康衍生化路线4-a：(依喜替康→Dxd-a)

按照路线4-a制备Dxd-a的合成方法包括：将依喜替康或其甲磺酸盐在三甲基氯硅烷及N,N-二异丙基乙胺的存在下与4-甲氧基氯化三苯甲烷反应制备得到氨基保护的中间体化合物17，化合物17在碱性条件下和乙酸酐反应得到乙酰化的中间体16a，中间体16a在三乙基硅烷的作用下脱去氨基的保护后得到的中间体15a进一步与羟基乙酸反应得到化合物Dxd-a,该以依喜替康为起始原料制备Dxd-a的总收率为38.3％(依喜替康→Dxd-a；以下称为路线4-a的收率)。

将以化合物4-1为起始原料按照路线4的合成方法制备得到化合物4-8和以依喜替康为起始原料按照路线4-a的合成方法制备得到的Dxd-a为payload来源按照路线4的方法制备LE14的整体收率为2.8％(4-1→Dxd-a→LE14的收率与依喜替康衍生化路线4-a的收率相乘，即7.3％×38.3％＝2.8％)。

在以化合物4-7作为起始原料和以依喜替康为起始原料按照路线4-a的合成方法制备得到的Dxd-a为payload来源按照路线4的方法制备LE14的整体收率为8.2％(4-7→Dxd-a→LE14的收率与依喜替康衍生化路线4-a的收率相乘，即21.3％×38.3％＝8.2％)。

依喜替康衍生化路线4-b：(依喜替康→Dxd-b)

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按照路线4-b制备Dxd-b的合成方法包括：将依喜替康或其甲磺酸盐在三甲基氯硅烷及N,N-二异丙基乙胺的存在下与4-甲氧基氯化三苯甲烷反应制备得到氨基保护的中间体化合物17，化合物17在碱性条件下和叔丁基二苯基氯硅烷反应得到叔丁基二苯基硅烷化的中间体16b，中间体16b在三乙基硅烷的作用下脱去氨基的保护后得到的中间体15b进一步与羟基乙酸反应得到化合物Dxd-b,该以依喜替康为起始原料制备Dxd-b的总收率为48.2％(依喜替康→Dxd-b；以下称为路线4-b的收率)。

将以化合物4-1为起始原料按照路线4的合成方法制备得到化合物4-8和以依喜替康为起始原料按照路线4-b的合成方法制备得到的Dxd-b为payload来源按照路线4的方法制备LE14的整体收率为6.2％(4-1→Dxd-b→LE14的收率与依喜替康衍生化路线4-b的收率相乘，即12.9％×48.2％＝6.2％)。

在以化合物4-7作为起始原料和以依喜替康为起始原料按照路线4-b的合成方法制备得到的Dxd-b为payload来源按照路线4的方法制备LE14的整体收率为18.0％(4-7→Dxd-b→LE14的收率与依喜替康衍生化路线4-b的收率相乘，即37.5％×48.2％＝18.0％)。

若将以依喜替康为起始原料，按照路线4-a和4-b的方法制备得到的Dxd-a和Dxd-b作为Dxd衍生物来源用于路线4，虽然避免了直接用比较昂贵的Dxd，但是增加了4步反应，增加了实验操作量,同时，依喜替康衍生化过程中，其损耗也是巨大的，反而增加了生产成本。

路线5：

路线5的合成方法包括如下步骤：化合物5-1与对硝基苯基氯甲酸酯反应得到化合物5-2，所得化合物再与相应的胺反应得到化合物5-3，经脱保护得到5-4，进一步与氨基酸活性酯反应得5-5，经过脱保护得到5-6，再与酰基叠氮试剂反应得到化合物5-7，随后通过羟甲基化反应得到化合物5-8，再与DXd衍生物反应得到化合物5-9，再将5-9中的叠氮基团还原得到化合物5-10，再接上马来酰亚胺接头得到5-11，最后脱除羟基保护基得到终产物LE14。

按照路线5的方法，以化合物5-1为起始原料，以其中的Dxd-a’(在原专利申请中编号为Dxd-a，结构见路线5-a，为了与路线4-a中的Dxd-a区分，本申请中重新编号为Dxd-a’)为payload来源制备LE14的总收率为6.9％；以化合物5-1为起始原料，以其中的Dxd-b’(在原专利申请中编号为Dxd-b，结构见路线5-b，为了与路线4-b中的Dxd-b区分，本申请中重新编号为Dxd-b’)为payload来源制备LE14的总收率为12.2％。

该路线中用DXd衍生物Dxd-a’或Dxd-b’作为payload的来源，售价较贵，大大增加了制备LE14的成本。

为了避免购买价格昂贵的DXd衍生物，本公司开发了从依喜替康出发制备Dxd-a’和Dxd-b’的合成路线5-a和路线5-b。

依喜替康衍生化路线5-a：(依喜替康→Dxd-a’)

按照路线5-a制备Dxd-a’的合成方法包括：将依喜替康或其甲磺酸盐在三甲基氯硅烷及N,N-二异丙基乙胺的存在下与4-甲氧基氯化三苯甲烷反应制备得到氨基保护的中间体化合物17，化合物17在碱性条件下和乙酸酐反应得到乙酰化的中间体16a，中间体16a在三乙基硅烷的作用下脱去氨基的保护后得到的中间体15a进一步与2-溴乙酸反应得到化合物Dxd-a’,该以依喜替康为起始原料制备Dxd-a’的总收率为27.6％(依喜替康→Dxd-a’，以下称为路线5-a的收率)。

将以化合物5-1为起始原料按照路线5的合成方法制备得到化合物5-8和以依喜替康为起始原料按照路线5-a的合成方法制备得到的Dxd-a’为payload来源按照路线5的方法制备LE14的整体收率为1.9％(5-1→Dxd-a’→LE14的收率与依喜替康衍生化路线5-a的收率相乘，即6.9％×27.6％＝1.9％)。

在以化合物5-7作为起始原料和以依喜替康为起始原料按照路线5-a的合成方法制备得到的Dxd-a’为payload来源按照路线5的方法制备LE14的整体收率为6.5％(5-7→Dxd-a’→LE14的收率与依喜替康衍生化路线5-a的收率相乘，即23.4％×27.6％＝6.5％)。

依喜替康衍生化路线5-b：(依喜替康→Dxd-b’)

按照路线5-b制备Dxd-b’的合成方法包括：将依喜替康或其甲磺酸盐在三甲基氯硅烷及N,N-二异丙基乙胺的存在下与4-甲氧基氯化三苯甲烷反应制备得到氨基保护的中间体化合物17，化合物17在碱性条件下和叔丁基二苯基氯硅烷反应得到叔丁基二苯基硅烷化的中间体16b，中间体16b在三乙基硅烷的作用下脱去氨基的保护后得到的中间体15b进一步与2-溴乙酸反应得到化合物Dxd-b’，该以依喜替康为起始原料制备Dxd-b’的总收率为44.5％(依喜替康→Dxd-b’，以下称为路线5-b的收率)。

将以化合物5-1为起始原料按照路线5的合成方法制备得到化合物5-8和以依喜替康为起始原料按照路线5-b的合成方法制备得到的Dxd-b’为payload来源按照路线5的方法制备LE14的整体收率为5.4％(5-1→Dxd-b’→LE14的收率与依喜替康衍生化路线5-b的收率相乘，即12.2％×44.5％＝5.4％)。

在以化合物5-7作为起始原料和以依喜替康为起始原料按照路线5-b的合成方法制备得到的Dxd-b’为payload来源按照路线5的方法制备LE14的整体收率为18.3％(5-7→Dxd-b’→LE14的收率与依喜替康衍生化路线5-b的收率相乘，即41.2％×44.5％＝18.3％)。

若将以依喜替康为起始原料，按照路线5-1和5-2的方法制备得到的Dxd-a’和Dxd-b’作为Dxd衍生物来源用于路线5，虽然避免了直接用比较昂贵的Dxd，但是增加了4步反应，增加了实验操作量，同时，依喜替康衍生化过程中，其损耗也是巨大的，反而增加了生产成本。

而在化合物LE14的改进合成路线中，我们首先合成了式I化合物，其作为ADC分子的linker部分，具有很好的稳定性，是整个化合物LE14连接基药物偶联物生产过程中的关键中间体，其纯度高低对终产物质量控制有着极其重要的影响。以式I化合物为后续工业化生产的起始物料，不仅可以避免使用昂贵的DXd或者DXd衍生物、而且可以将细胞毒payload后置从而避免细胞毒性物质的过度暴露，大大地降低生产人员的防护级别和环保压力。另外后续过程得到的化合物LE14需要与相应抗体偶联，因此获得高纯度的式I化合物对于降低整个抗体偶联药物带来潜在的安全毒性以及提高细胞毒payload的转化效率具有积极的意义。

式I化合物是一种具有羧酸结构的化合物，具有极性较大、水溶性高等特点。在改进路线中，合成式I化合物的步骤会伴生一些极性相近的杂质，这些极性相近的杂质较难去除，若不进一步进行纯化，直接进行后续反应制备化合物LE14，也会伴生一些与化合物LE14极性极为相近的杂质，难以去除，若再与抗体偶联，更无法去除，因此，对式I化合物进行进一步纯化，得到更高纯度的中间体，对于控制linker-drug分子和ADC分子的质量及杂质含量是极为必要的。

在探索发现改进路线的初期，采用常规柱层析方法纯化式I化合物，一直存在以下问题：1)式I化合物粗品为黑褐色粘稠状固体油状物，样品不易溶解，不利于湿法上样或者干法上样，2)样品在常规洗脱体系下极难被完全洗脱，影响式I化合物的收率，3)极性相近的杂质难以被分离除去，从而影响后续反应的后处理难度和整体收率。

常规柱层析纯化步骤如下：

步骤1：将按照改进路线反应得到的式I化合物反应液真空浓缩后得到油状粗品，用二氯甲烷在室温下超声溶解粗品油状物(二氯甲烷与粗品油状物的体积质量比为10mL/g)，然后向其中甲基叔丁基醚(甲基叔丁基醚与粗品油状物的体积质量比为30-50mL/g)，并在常温条件下搅拌2～5小时，静置后倒去上清液，下部油状物真空浓缩得预处理粗品，粗品用于后续的色谱层析纯化。

步骤2：对步骤1得到的式I粗品进行纯化，利用常规柱层析正相色谱硅胶作为填料固定相(正相色谱硅胶具体参数见表2)，采用柱层析法纯化式I化合物。具体操作为：将式I粗品用二氯甲烷：甲醇＝10:1(体积比)溶解后湿法上样注入层析柱(该过程因样品状态差而不能完全溶解澄清，有部分非均一样品存在)。室温下开始洗脱，洗脱剂为二氯甲烷和甲醇，洗脱梯度为60:1-10:1，通过调节洗脱剂梯度方式洗脱式I中间体，收集纯度大于80.0％的馏分。

步骤3：将步骤2得到的馏分减压浓缩，得到纯化后的式I化合物样品。

经过验证评估下来，发现以上纯化方法存在以下缺陷：样品回收率不高(回收率只有44.35％，此处回收率＝纯化后样品的重量/纯化前粗品的重量×100％)、纯化后的式I化合物样品中还存在较多杂质(纯度只有83.06％)，在增加后续反应后处理的难度的同时降低了收率。

发明内容

为了克服采用现有技术路线中连接基药物偶联物的羧酸中间体不稳定，杂质含量高，无法有效纯化，且细胞毒性物质暴露时间过长，本发明提供了一种新的连接基药物偶联物的羧酸中间体式I化合物及其制备方法。本发明的中间体稳定，纯化过程中不会分解，本发明的制备方法在以较好收率拿到高纯度的中间体式I化合物的基础上，将该中间体与依喜替康缩合可制备得到高纯度的化合物LE，一方面大大减少了细胞毒性物质的暴露时间，另一方面提高了依喜替康的利用率、降低了生产成本，本发明的工艺路线合理，更适合大规模的工业化生产。

本发明主要是通过以下技术方案解决上述技术问题的。

本发明提供了一种式I化合物；

本发明还提供了一种化合物LE的制备方法，其包括如下步骤：式I化合物与式VIII化合物或其甲磺酸盐在缩合剂、碱以及溶剂存在下进行酰胺缩合反应得到化合物LE，

其中，R²为C_1-6烷基；

R³为卤素。

在一些实施方案中，所述的化合物LE的制备方法中，反应物料为所述的式I化合物、所述的式VIII化合物或其甲磺酸盐、所述的缩合剂、所述的碱和所述的溶剂。

在一些实施方案中，所述的R²为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基，优选为甲基或乙基，进一步优选为甲基。

在一些实施方案中，所述的R³为氟、氯、溴或碘，优选为氟或氯，进一步优选为氟。

在一些实施方案中，所述的化合物LE的制备方法中，反应条件(例如溶剂用量、投料次序和加料方式、投料时间等)可以为本领域该类反应的常规条件，其可根据不同缩合剂的类型进行调整。例如可包括如下步骤：式I化合物溶于溶剂，加入缩合剂和碱，立刻或反应一段时间后加入式VIII化合物，优选地，酰胺缩合反应全程避光处理。

在一些实施方案中，所述的化合物LE的制备方法中，所述式VIII化合物与所述的式I化合物的摩尔比值可以为0.8-1.5，优选为0.9-1.2，进一步优选为1.0。

在一些实施方案中，所述的化合物LE的制备方法中，所述的缩合剂可以为氯化4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉(DMTMM)、氰代磷酸二乙酯(DECP)、叠氮磷酸二苯酯(DPPA)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)、1-羟基苯并三唑(HOBt)、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU)、2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)、2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TSTU)和2-(5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸季铵盐(TNTU)等中的一种或其中任意两种或两种以上的混合，优选地，所述的缩合剂可以为氯化4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉(DMTMM)。

在一些实施方案中，所述的化合物LE的制备方法中，所述的缩合剂与所述的式I化合物的摩尔比值可以为1-3，优选为1-1.5，进一步优选为1.5。

在一些实施方案中，所述的化合物LE的制备方法中，所述的碱可以为本领域此类反应常规的碱，可以为有机碱、无机碱或其混合，优选为有机碱；其中，所述的有机碱优选为N,N-二异丙基乙胺、三乙胺和吡啶中的一种或其中任意两种或两种以上的混合，进一步优选为N,N-二异丙基乙胺；所述的无机碱优选为碱金属氢氧化物、碱金属碳酸盐和碱金属磷酸盐中的一种或其中任意两种或两种以上的混合，进一步优选为碳酸氢钠、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、氢氧化钠和氢氧化钾中的一种或其中任意两种或两种以上的混合。

在一些实施方案中，所述的化合物LE的制备方法中，所述的碱与所述的式I化合物的摩尔比值可以为1-10，优选为1-5，进一步优选为1.2-3，最优选为1.5。

在一些实施方案中，所述的化合物LE的制备方法中，所述的溶剂可以为N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃和1,4-二氧六环中的一种或其中任意两种或两种以上的混合，优选为N,N-二甲基甲酰胺。

在一些实施方案中，所述的化合物LE的制备方法中，所述的酰胺缩合反应的温度可以为20℃-50℃，优选为20℃-30℃。

在一些实施方案中，所述的化合物LE的制备方法中，所述的酰胺缩合反应优选在惰性气体保护下进行，例如在氮气或氦气环境中进行。

在一些实施方案中，所述的化合物LE的制备方法中，所述的酰胺缩合反应进程的监测可采用本领域中的常规测试方法(例如TLC、GC、HPLC或NMR等)进行监控，一般以不再检测到所述的式VIII化合物作为反应终点。

在一些实施方案中，所述的化合物LE的制备方法中，所述的酰胺缩合反应时间可以为1-8小时，优选为1-5小时，进一步优选为1.5-3小时。

在一些实施方案中，所述的化合物LE的制备方法中，所述的酰胺缩合反应完成后，还可以进一步包括如下后处理步骤：将反应液浓缩后得到化合物LE粗品；优选地，通过将化合物LE粗品进行硅胶柱层析纯化得到化合物LE产品，进一步优选地，所述的硅胶柱层析的洗脱剂为氯仿和甲醇的混合，所述的氯仿和甲醇体积比为(100-10):1，进一步优选为10:1。

所述的化合物LE的制备方法还可以进一步包括式I化合物的制备方法，其可以包括如下步骤：在溶剂中，将式II化合物在脱保护剂的存在下进行脱保护反应得到式I化合物；

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其中，R为-Si(C₁～C₆)₃取代的C₁-C₆烷基。

在一些实施方案中，所述的式I化合物的制备方法中，所述的R可以为三甲基硅基乙基或叔丁基二甲基硅基乙基；优选地，所述的R为三甲基硅基乙基。

在一些实施方案中，所述的式I化合物的制备方法中，反应物料为所述的式II化合物、所述的脱保护剂和所述的溶剂。

在一些实施方案中，所述的式I化合物制备方法中的反应条件(例如溶剂用量、投料顺序、加料方式和投料时间等)可以为本领域该类反应的常规条件，其可根据不同脱保护剂的类型进行调整；例如可包括如下步骤：将所述的式II化合物溶于溶剂，加入所述的脱保护剂后加热开启反应；或者向将所述的脱保护剂溶于溶剂，加入所述的式II化合物后加热开启反应。

在一些实施方案中，所述的式I化合物的制备方法中，所述的脱保护剂可以为氟试剂，所述的氟试剂可以为四丁基氟化铵、四甲基氟化铵、四丁基氟化铵/醋酸、吡啶氟化氢络合物、叔丁基氟化铵、叔丁基氟化铵/醋酸、四乙基氟化铵，或者四甲基氟化铵/四氢呋喃溶液、四乙基氟化铵/四氢呋喃溶液或四丁基氟化铵/四氢呋喃溶液，或者为氟化钾、氟化钠、氟化锂和氟化铯中的一种或其中任意两种或两种以上的混合，优选为1M四丁基氟化铵/四氢呋喃溶液或氟化钾。

在一些实施方案中，所述的式I化合物的制备方法中，所述脱保护剂与所述的式II化合物的摩尔比值可以为1-5，优选为1-3，进一步优选为1.1-2.0，最优选为1.5。

在一些实施方案中，所述的式I化合物的制备方法中，所述的溶剂可以为N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃和1,4-二氧六环中的一种或其中任意两种或两种以上的混合，优选为N,N-二甲基甲酰胺或四氢呋喃，进一步优选为N,N-二甲基甲酰胺。

在一些实施方案中，所述的式I化合物的制备方法中，所述的脱保护反应的温度为20℃-80℃，优选为30℃-70℃，进一步优选为50℃-70℃，最优选为60℃。

在一些实施方案中，所述的式I化合物的制备方法中，所述的脱保护反应优选在惰性气体保护下进行，例如在氮气或氦气环境中进行。

在一些实施方案中，所述的式I化合物的制备方法中，所述的脱保护反应进程的监测可采用本领域中的常规测试方法(例如TLC、GC、HPLC或NMR等)进行监控，一般以不再检测到所述的式II化合物作为反应终点。

在一些实施方案中，所述的式I化合物的制备方法中，所述的脱保护反应时间可以为4-24小时，优选为5-16小时，进一步优选为5-8小时。

在一些实施方案中，所述的式I化合物的制备方法中，所述的脱保护反应完成后，还可以进一步包括后处理步骤：将式I化合物粗品在高压制备色谱条件下进行分离，得到式I化合物，所述的高压制备色谱条件如下：

色谱柱为动态轴向压缩柱；

色谱柱内径为50mm；

色谱柱长度为650mm；

固定相为未键合的硅羟基；

固定相的粒径为8-20μm；

固定相的孔径为

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流动相为卤代烷烃类溶剂与醇类溶剂的混合溶剂A；所述的卤代烷烃类溶剂和所述的醇类溶剂的体积比为96:4～90:10；

所述的式I化合物粗品中式I化合物纯度为70％-80％。

在一些实施方案中，所述的式I化合物的制备方法中，所述的固定相的粒径为8μm、10μm或20μm。

在一些实施方案中，所述的式I化合物的制备方法中，所述的高压制备还具体包括如下步骤：式I化合物粗品溶于混合溶剂B，在高压制备色谱条件下进行梯度洗脱，收集色谱含量大于95.0％的馏分，得式I化合物；所述的混合溶剂B为二氯甲烷和甲醇的混合溶剂；所述的甲醇与所述的混合溶剂B的体积比可以为10％-30％，优选为20％-30％，最优选为30％。

在一些实施方案中，所述的式I化合物的制备方法中，所述的固定相为

8-120或/>

10-120，优选为/>

10-120。

在一些实施方案中，所述的式I化合物的制备方法中，所述的梯度洗脱可采用下表1中4-9至4-13中的任一洗脱梯度，优选采用4-10至4-13任一的洗脱梯度，进一步优选采用4-10或4-13的洗脱梯度，最优选采用4-10的洗脱梯度；

表1.高压制备系统洗脱梯度

在一些实施方案中，所述的式I化合物的制备方法中，所述的梯度洗脱速度可以为25mL/min-45mL/min，优选为35mL/min～45mL/min，进一步优选为40mL/min～45mL/min。

在一些实施方案中，所述的式I化合物的制备方法中，所述的梯度洗脱的柱温可以为20℃-50℃,优选为25℃-40℃。

在一些实施方案中，所述的式I化合物的制备方法中，所述的高压制备的检测波长可以为254nm或220nm。

在一些实施方案中，所述的式I化合物的制备方法中，所述的制备方法还包括制备式I化合物粗品的方法，其包括如下步骤：

①将反应液浓缩得浓缩物，用二氯甲烷超声溶解浓缩物，然后加入甲基叔丁基醚，在常温下搅拌，静置后除去上清液，余下部分浓缩得预处理粗品。

②采用快速硅胶柱层析纯化预处理粗品，预处理粗品溶于少量混合溶剂C，湿法上样，流动相洗脱，收集合并馏分，浓缩得式I化合物粗品。

在一些实施方案中，步骤①中，所述的二氯甲烷与所述的浓缩物体积质量比可以为8-12mL/g，优选为9-11mL/g，进一步优选为10mL/g。

在一些实施方案中，步骤①中，所述的甲基叔丁基醚与所述的浓缩物的体积质量比可以为30-70mL/g，优选为40-70mL/g，进一步优选为40-60mL/g，再进一步优选为40-50mL/g，最优选为50mL/g。

在一些实施方案中，步骤①中，所述的搅拌的时长可以为2-10小时，优选为2-8小时，进一步优选为2-5小时。

在一些实施方案中，步骤②中，所述的混合溶剂C为二氯甲烷和甲醇的混合溶剂；所述的二氯甲烷和甲醇的体积比为10:1-5:1，优选为5:1。

在一些实施方案中，步骤②中，所述的快速硅胶柱层析所用的固定相为200-400目的正相色谱硅胶。

在一些实施方案中，步骤②中，所述的流动相为二氯甲烷和甲醇的混合；所述的二氯甲烷和甲醇的体积比可以为10:1-5:1，优选为5:1。

在一些实施方案中，所述的高压制备中，

所述的固定相为

8-120或/>

10-120；

所述的甲醇与所述的混合溶剂B的体积比可以为20％-30％，优选为30％；

所述的梯度洗脱速度可以为25mL/min-45mL/min，例如35mL/min、40mL/min或45mL/min；

所述的梯度洗脱的柱温可以为25℃-40℃；

所述的高压制备的检测波长可以为254nm或220nm；

所述的洗脱梯度可采用表1中的4-9、4-10、4-11、4-12或4-13。

在一些实施方案中，所述的高压制备中，

所述的固定相为

10-120；

所述的甲醇与所述的混合溶剂B的体积比为30％；

所述的梯度洗脱速度可以为40mL/min～45mL/min；

所述的梯度洗脱的柱温可以为25℃；

所述的高压制备的检测波长可以为254nm或220nm；

所述的洗脱梯度可采用表1中的4-10。

在一些实施方案中，所述的式I化合物的制备方法还包括式II化合物的制备方法，其包括如下步骤：将式Ⅲ化合物和6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯在溶剂中进行偶联反应得到相应的式Ⅱ化合物；

其中，R为-Si(C₁～C₆)₃取代的C₁～C₆烷基；

进一步地，所述的式II化合物的制备方法还包括式III化合物的制备方法，其包括如下步骤：将式IV化合物和还原剂在溶剂中和酸缓冲液存在下进行还原反应得到相应的式III化合物；

其中，R为-Si(C₁～C₆)₃取代的C₁～C₆烷基；

进一步地，所述的式III化合物的制备方法还包括式IV化合物的制备方法，其包括如下步骤：将式VI化合物与试剂V在溶剂中、在碱存在下进行醚化反应得到相应的式IV化合物；

其中，R为-Si(C₁～C₆)₃取代的C₁～C₆烷基；

进一步地，所述的式IV化合物的制备方法还包括式VI化合物的制备方法，其包括如下步骤：将式VII化合物与多聚甲醛和三甲基氯硅烷在溶剂中进行取代反应得到相应的式VI化合物；

在一些实施方案中，所述的式Ⅱ化合物的制备方法中，所述的R可以为三甲基硅基乙基或叔丁基二甲基硅基乙基；优选地，所述的R为三甲基硅基乙基。

在一些实施方案中，所述的式Ⅱ化合物的制备方法中，反应物料为所述的式Ⅲ化合物、所述的6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯和所述的溶剂。

在一些实施方案中，所述的式II化合物的制备方法中，所述的6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯与所述的式III化合物的摩尔比值为1-5，优选为1-3，进一步优选为1.2-2，最优选为1.5。

在一些实施方案中，所述的式II化合物的制备方法中，所述的溶剂可以为酰胺类溶剂、氯代烷烃类溶剂、醚类溶剂和腈类溶剂中的一种或其中任意两种或两种以上的混合；优选为氯代烷烃类溶剂，其中，所述氯代烷烃类溶剂优选为二氯甲烷，1,2-二氯乙烷和氯仿中的一种或其中任意两种或两种以上的混合，进一步优选为二氯甲烷。

在一些实施方案中，所述的式II化合物的制备方法中，所述的偶联反应温度为0℃-45℃，优选为25℃-40℃，进一步优选为30℃-35℃。

在一些实施方案中，所述的式II化合物的制备方法中，所述的偶联反应在惰性气体保护下进行，例如在氮气或氦气环境中进行。

在一些实施方案中，所述的式II化合物的制备方法中，所述的偶联反应进程的监测可采用本领域中的常规测试方法(例如TLC、GC、HPLC或NMR等)进行监控，一般以不再检测到式III化合物作为反应终点。

在一些实施方案中，所述的式II化合物的制备方法中，所述的偶联反应时间可以为3-24小时，优选为3-10小时，进一步优选为3-6小时。

在一些实施方案中，所述的式II化合物的制备方法中，所述的偶联反应结束后，还可以进一步包括如下的后处理步骤：将所得反应液减压浓缩，用二氯甲烷和水萃取，合并二氯甲烷有机相，浓缩得到式II化合物粗品，优选地，将式II化合物粗品进行硅胶柱层析纯化得到式II化合物产品；进一步优选地，所述的硅胶柱层析的洗脱剂为二氯甲烷和甲醇的混合，所述的二氯甲烷和甲醇体积比为(10-1):1。

在一些实施方案中，所述的式III化合物的制备方法中，所述的R可以为三甲基硅基乙基或叔丁基二甲基硅基乙基；优选地，所述的R为三甲基硅基乙基。

在一些实施方案中，所述的式III化合物的制备方法中，所述的式III化合物制备方法中的反应条件(例如溶剂用量、投料顺序、加料方式和投料时间等)可以为本领域该类反应的常规条件，其可根据不同还原剂的类型进行调整；例如可包括如下步骤：将还原剂溶于溶剂，再滴加至酸缓冲液中，所得反应体系置于惰性气体保护下，搅拌降温，随后将溶于溶剂的式IV化合物滴加至上述反应体系中，进行反应。

在一些实施方案中，所述的式III化合物的制备方法中，反应物料为所述的式IV化合物、所述的还原剂、所述的酸缓冲液和所述的溶剂。

在一些实施方案中，所述的式III化合物的制备方法中，所述的还原剂为三苯基膦、三叔丁基膦和三甲基膦中的一种或其中任意两种或两种以上的混合，或选择市售的三苯基膦/四氢呋喃溶液、三叔丁基膦/四氢呋喃溶液或三甲基膦/四氢呋喃溶液，优选为三甲基膦/四氢呋喃溶液，进一步优选为1M三甲基膦/四氢呋喃溶液。

在一些实施方案中，所述的式III化合物的制备方法中，所述的还原剂与所述的式IV化合物的摩尔比为1.0-3.0，优选为1.2-1.8，进一步优选为1.5。

在一些实施方案中，所述的式III化合物的制备方法中，所述的酸缓冲液与所述的式IV化合物的体积质量比可以为2-10mL/g，优选为3-5mL/g，最优选为4mL/g。

在一些实施方案中，所述的式III化合物的制备方法中，所述的溶剂为醚类溶剂，优选四氢呋喃、乙醚、1,4-二氧六环、苯甲醚和甲基叔丁基醚中的一种或其中任意两种或两种以上的混合，进一步优选为四氢呋喃。

在一些实施方案中，所述的式III化合物的制备方法中，所述的酸缓冲液为醋酸缓冲液或甲酸缓冲液，优选为醋酸缓冲液；所述的醋酸缓冲液为醋酸钠缓冲液。

在一些实施方案中，所述的式III化合物的制备方法中，所述酸缓冲液的pH为4.0-6.0，优选为4.5-5.5，进一步优选为5.0。

在一些实施方案中，所述的式III化合物的制备方法中，所述的还原反应的温度为0℃-20℃，优选为0℃-10℃，进一步优选为0℃-5℃。

在一些实施方案中，所述的式III化合物的制备方法中，所述的还原反应进程的监测可采用本领域中的常规测试方法(例如TLC、GC、HPLC或NMR等)进行监控，一般以不再检测到式IV化合物作为反应终点。

在一些实施方案中，所述的式III化合物的制备方法中，所述的还原反应时间可以为0.5-8小时，优选为0.5-2小时，进一步优选为0.5-1小时。

在一些实施方案中，所述的式III化合物的制备方法中，所述的还原反应结束后，还可以进一步包括如下的后处理步骤：反应液浓缩除去反应溶剂，加入二氯甲烷或乙酸乙酯进行萃取，合并有机相，浓缩后得式III化合物粗品，优选地，通过将式III化合物粗品进行硅胶柱层析纯化得到式III化合物产品；进一步优选地，所述的硅胶柱层析的洗脱剂为二氯甲烷和甲醇的混合溶剂，所述的二氯甲烷和所述的甲醇体积比为(10-1):1。

在一些实施方案中，所述的式IV化合物的制备方法中，所述的R可以为三甲基硅基乙基或叔丁基二甲基硅基乙基；优选地，所述的R为三甲基硅基乙基。

在一些实施方案中，所述的式IV化合物的制备方法中，反应物料为所述的式VI化合物、所述的试剂V、所述的碱和所述的溶剂。

在一些实施方案中，所述的式IV化合物的制备方法中，所述的试剂V与所述的式VI化合物的摩尔比值可以为1-5，优选为1-3，进一步优选为1.1-1.6。

在一些实施方案中，所述的式IV化合物的制备方法中，所述碱为有机碱、无机碱或其混合；优选为有机碱；其中，所述有机碱优选为叔丁醇钾、三乙胺、DMAP、吡啶和潘必啶中的一种或其中任意两种或两种以上的混合，进一步优选为潘必啶；所述无机碱优选为碱金属氢氧化物、碱金属碳酸盐和碱金属磷酸盐中的一种或其中任意两种或两种以上的混合，进一步优选为磷酸钾、碳酸钾、氢氧化钾和碳酸铯中的一种或其中任意两种或两种以上的混合。

在一些实施方案中，所述的式IV化合物的制备方法中，所述的碱与所述的式VI化合物的摩尔比值为1-5，优选为1.2-4，进一步优选为1.5-3。

在一些实施方案中，所述的式IV化合物的制备方法中，所述的溶剂为DMF、DMSO、四氢呋喃和1,4-二氧六环中的一种或其中任意两种或两种以上的混合，优选为1,4-二氧六环或四氢呋喃，进一步优选为四氢呋喃。

在一些实施方案中，所述的式IV化合物的制备方法中，所述的醚化反应的温度为0℃-80℃，优选为40℃-80℃，进一步优选为50℃-70℃。

在一些实施方案中，所述的式IV化合物的制备方法中，所述的醚化反应在惰性气体保护下进行，例如在氮气或氦气环境中进行。

在一些实施方案中，所述的式IV化合物的制备方法中，反应进程的监测可采用本领域中的常规测试方法(例如TLC、GC、HPLC或NMR等)进行监控，一般以不再检测到式VI化合物作为反应终点。

在一些实施方案中，所述的式IV化合物的制备方法中，反应时间可以为2-48小时，优选为3-12小时，进一步优选为4-8小时。

在一些实施方案中，所述的式IV化合物的制备方法中，所述的醚化反应结束后，还可以进一步包括如下后处理步骤：反应液进行浓缩，所得浓缩物加溶剂溶解后洗涤有机相，浓缩有机相，将所得残留物进行纯化；其中，所述溶剂可以为乙酸乙酯或二氯甲烷，优选为乙酸乙酯；所述洗涤所用的水相可以用酸的水溶液、水和/或饱和食盐水；优选地，用饱和食盐水对有机相进行洗涤；所述的纯化可采用本领域中的常规纯化方法，例如打浆、结晶、制备色谱或硅胶柱层析等，优选地选用硅胶柱层析的方法，所述的硅胶柱层析的洗脱剂优选为正庚烷和乙酸乙酯的混合，所述的正庚烷和所述的乙酸乙酯的体积比可以为(20-1):1，优选为(10-1):1。

在一些实施方案中，所述的式VI化合物的制备方法中，反应物料为所述的式VII化合物、所述的多聚甲醛、所述的三甲基氯硅烷和所述的溶剂。

在一些实施方案中，所述的式Ⅵ化合物的制备方法中，所述的多聚甲醛与所述的式Ⅶ化合物的摩尔比值可以为1-10，优选为1-5，进一步优选为1.3-3.0，最优选为1.3；

在一些实施方案中，所述的式Ⅵ化合物的制备方法中，所述三甲基氯硅烷与所述的式Ⅶ化合物的摩尔比值可以为1-5，优选为2-4，进一步优选为2-3，最优选为3。

在一些实施方案中，所述的式Ⅵ化合物的制备方法中，所述的溶剂可以为N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃和1,4-二氧六环中的一种或其中任意两种或两种以上的混合，优选为四氢呋喃或1,4-二氧六环，进一步优选为1,4-二氧六环。

在一些实施方案中，所述的式Ⅵ化合物的制备方法中，所述的取代反应温度可以为-10℃-50℃，优选为15℃-35℃，进一步优选为18-25℃；

在一些实施方案中，所述的式Ⅵ化合物的制备方法中，所述的取代反应在惰性气体保护下进行，例如在氮气或氦气环境中进行。

在一些实施方案中，所述的Ⅵ化合物的制备方法中，所述的取代反应进程的监测可采用本领域中的常规测试方法(例如TLC、GC、HPLC或NMR等)进行监控，一般以不再检测到式Ⅶ化合物(采用甲醇衍生化)作为反应终点。

在一些实施方案中，所述的取代反应时间可以为3-24小时，优选为6-18小时，进一步优选为8-16小时。

在一些实施方案中，所述的式Ⅵ化合物的制备方法中，取代反应结束后，还可以进一步包括后处理步骤：将反应液进行固液分离(有固体存在情况下)或者不进行固液分离，将有机相浓缩后得到式Ⅵ化合物；优选地，直接将浓缩后得到的式Ⅵ化合物粗品与所述的试剂V反应。

本发明还提供了一种式I化合物的制备方法，其包括如下步骤：在溶剂中，将式II化合物在脱保护剂的存在下进行脱保护反应得到式I化合物；

其中，R为-Si(C₁～C₆)₃取代的C₁-C₆烷基。

所述的式I化合物的制备方法，反应条件和操作均可以如前所述。

所述的式I化合物的制备方法还可以进一步包括本文所述的式II化合物的制备方法。

在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

1)本发明的式I化合物稳定，纯化过程中不会分解，利用式I化合物制备linker-drug分子(化合物LE)，不仅大大减少了细胞毒性物质的暴露时间，减少制备过程中对人体的危害，而且提高了依喜替康的利用率、降低了生产成本；

2)该方法能得到含量大于95.0％的连接基药物偶联物LE14中间体式I化合物，与低压柱层析纯化方法相比不仅纯度大幅提高，而且收率提高、杂质含量大大降低，便于下一步反应处理和收率提高；

3)该方法对馏分的处理，采用真空浓缩和萃取干燥浓缩，避免了反相分离操作的冷冻干燥的繁琐操作，仅通过简单操作就可得到样品粉末，产品状态良好，后处理操作简单易行；

4)该方法采用的高压制备系统填料固定相，简单易得，经济适用，并且可以重复使用，提高了使用效率，降低了生产成本。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

除非特别说明，以下实施例中所涉及的各物质配比均为体积比。

以下实施例中所使用的柱层析填充的固定相参数如表2。

表2.填充固定相参数

以下实施例中所使用的制备分离设备参数如表3。

表3.制备分离设备参数

以下实施例中，用于分析式I化合物含量的HPLC分析条件如下：

仪器为安捷伦187260，色谱柱为Agilent AdvanceBio Peptide Map，3.5μm,2.1×250mm，检测波长为254nm，采用如表2所示的流动相梯度设置，其中A相为0.01mol/L磷酸二氢钾水溶液(pH＝5.0)，B相为10％甲醇乙腈溶液，流速为1.0mL/min。

表4.HPLC分析条件

(柱温:40℃，流速：1.0mL/min，检测波长：254nm。)

实施例1：化合物LE14的制备

合成路线如下：

步骤1：式Ⅵ化合物的合成

将式Ⅶ化合物(25.00g，53.36mmol)与多聚甲醛(2.09g，69.37mmol)混合溶于250.0mL的无水1,4-二氧六环中，在搅拌条件下慢慢加入三甲基氯硅烷(17.39g，160.08mmol)，所得混合溶液保持温度在18-25℃范围内继续搅拌15h，通过TLC监控反应，待反应完毕后将反应液减压浓缩，即得到粗品式Ⅵ化合物(28.95g)(直接用于下一步反应)。

步骤2：式Ⅳa化合物的合成

将步骤1所得粗品式Ⅵ化合物(28.95g，按理论收率计算，53.37mmol)溶于250.0mL的无水四氢呋喃中，在搅拌条件下加入潘必啶(12.43g，80.05mmol)和Ⅴa(14.12g，80.05mmol)，所得混合物反应在氮气保护下加热至60℃，并在此条件下反应6.0h。通过TLC监控反应，待原料反应完毕，减压浓缩除去四氢呋喃，然后向浓缩物中加乙酸乙酯和饱和食盐水萃取，所得有机相经干燥后减压浓缩除去溶剂，所得粗品经硅胶柱层析(正庚烷：乙酸乙酯＝10:1～1:1(v/v))纯化得到式Ⅳa化合物(18.12g，纯度93.3％，步骤1和步骤2的合并收率51.7％)。

ESI-MS m/z：657.4(M+H)。

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.12(s,1H),8.49(d,J＝7.0Hz,1H),7.59(d,J＝8.6Hz,2H),7.42–7.21(m,2H),5.15–4.97(m,2H),4.85(s,2H),4.46(p,J＝7.0Hz,1H),4.12(dd,J＝29.5,10.7Hz,4H),3.68(dd,J＝8.7,6.0Hz,2H),3.49(d,J＝8.2Hz,1H),3.40(t,J＝7.3Hz,2H),2.97(d,J＝26.2Hz,3H),1.33(d,J＝7.1Hz,3H),1.29–1.18(m,2H),0.93(dd,J＝9.6,6.6Hz,6H),0.87–0.82(m,1H),0.15(s,9H).

步骤3：式Ⅲa化合物的合成

将32.0mL的1M的三甲基膦的四氢呋喃溶液与15.0mL THF混合后的混合液滴加到盛有60.0mL的醋酸钠缓冲液(pH＝5.0)中，所得反应体系在氮气保护下搅拌降温至0℃-5℃，随后将溶有式Ⅳa化合物(15.00g，21.20mmol)的45.0mL四氢呋喃缓慢滴加到上述反应体系中，所得反应体系保持0-5℃条件继续搅拌0.5～1.0h。通过TLC监控反应，待原料反应完毕，减压浓缩除去反应液中的四氢呋喃，然后向所得浓缩反应液中加二氯甲烷萃取，所得有机相经干燥后减压浓缩，所得粗品经硅胶柱层析(二氯甲烷：甲醇＝10:1～1:1(v/v))纯化得到式Ⅲa化合物(10.30g，纯度96.5％，收率76.9％)。

ESI-MS m/z：631.4(M+H)。

1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.10(s,1H),8.47(d,J＝7.2Hz,1H),7.56(d,J＝8.6Hz,2H),7.41–7.20(m,2H),5.16–4.99(m,2H),5.16(m,2H),4.86(s,2H),4.45(p,J＝7.4Hz,1H),4.10(dd，J＝29.3，10.5Hz，4H)，3.66(dd，J＝8.5，6.0Hz，2H)，3.47(d，J＝8.2Hz，1H)，3.42(t，J＝7.5Hz,2H),2.97(d,J＝26.2Hz,3H),1.35(d,J＝7.1Hz,3H),1.27–1.16(m,2H),0.95(dd,J＝9.6,6.6Hz,6H),0.85–0.80(m,1H),0.13(s,9H).

步骤4：式Ⅱa化合物的合成

将式Ⅲa化合物(10.00g，15.30mmol)溶于300.0mL的无水二氯甲烷中，搅拌条件下加入6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯(7.08g，22.95mmol)，所得反应体系在氮气保护下加热至35℃，并在此条件下继续搅拌3～6h。通过TLC监控反应，待原料反应完毕，将所得反应液减压浓缩，所得粗品用二氯甲烷和水洗涤，有机相经干燥后减压浓缩，所得浓缩物再经硅胶柱层析(二氯甲烷：甲醇＝10:1～1:1(v/v))纯化得到式Ⅱa化合物(9.80g，纯度97.31％，收率75.4％)。

ESI-MS m/z：824.5(M+H)。

1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.95(s,1H),8.14(d,J＝6.9Hz,1H),7.79(d,J＝8.6Hz,1H),7.59(d,J＝8.2Hz,2H),7.39–7.22(m,2H),6.99(s,2H),5.07–5.01(m,2H),4.85(s,2H),4.38(p,J＝7.0Hz,1H),4.16(dd,J＝8.6,6.9Hz,2H),4.08(d,J＝12.3Hz,2H),3.68(dd,J＝8.8,6.0Hz,2H),3.44–3.35(m,4H),3.07(s,1H),2.97(d,J＝27.4Hz,3H),2.14(tt,J＝14.1,6.9Hz,2H),1.95(h,J＝6.7Hz,1H),1.54–1.42(m,4H),1.29(d,J＝7.1Hz,3H),1.18(q,J＝7.7Hz,2H),0.98–0.91(m,2H),0.84(dd,J＝15.4,6.8Hz,6H),0.06(s,9H)。

步骤5：式I化合物的合成

方法1：使用氟化钾试剂脱保护

将式Ⅱa化合物(5.00g，6.07mmol)溶于30.0mL的无水DMF中，室温下加入研磨成粉末的氟化钾(0.53g，9.11mmol)，所得反应体系在氮气保护下搅拌加热至60℃，并在此条件下继续搅拌6h。通过TLC监控反应，待原料反应完毕，所得反应液经减压浓缩得到6.75g浓缩物，(纯度为50.06％)，该批(批次1)浓缩物用下述的纯化方法1进行纯化；

按照该方法再投一批料，所用物料用量为：式Ⅱa化合物(8.50g，10.04mmol)、氟化钾(0.88g，15.06mmol)及DMF(45.0mL)，投料及反应操作同批次1，得到另外一批浓缩物(批次2)，该批浓缩物按照下述的纯化方法2进行纯化：

纯化方法1：用高压制备色谱法对浓缩物进行纯化

所得浓缩物(批次1)经预处理后按照本发明实施例4中的高压制备色谱法(固定相：

10-120，二氯甲烷：甲醇＝96:4-90:10(v/v)，流速40.0mL/min)进行纯化得到式I化合物(2.90g，纯度96.5％，收率66.0％)。

纯化方法2：用常规柱层析对浓缩物进行纯化

所得浓缩物(批次2)经预处理后按照实施例3中的常规硅胶柱层析(二氯甲烷：甲醇＝10:1～1:1(v/v))纯化得到式I化合物(4.72g，纯度83.06％，收率65.0％；实际上含有的纯品式I化合物的量为3.92g,以得到纯品式I化合物的量计算收率为54.0％)。

ESI-MS m/z：722.3(M-H)；

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.57(d,J＝38.3Hz,1H),9.36(d,J＝94.5Hz,1H),7.61(d,J＝8.5Hz,2H),7.28(d,J＝7.2Hz,2H),5.01(d,J＝10.8Hz,2H),4.83(s,2H),4.38(s,1H),4.17(s,1H),3.71(s,2H),3.54(s,2H),3.48(d,J＝8.3Hz,1H),3.44(s,1H),3.14(s,2H),2.95(d,J＝22.9Hz,3H),1.32(d,J＝7.2Hz,3H),0.89(dd,J＝14.7,6.7Hz,6H).

方法2：使用氟化钠试剂脱保护

操作步骤同方法1，将氟化钾替换为氟化钠，按照纯化方法2进行纯化，得到式I化合物(3.44g，收率47.3％)。

方法3：使用氟化铯试剂脱保护

操作步骤同方法1，将氟化钾替换为氟化铯，按照纯化方法2进行纯化，得到式I化合物(3.02g，收率41.50％)。

方法4：使用四丁基氟化铵试剂脱保护

将式IIa化合物(8.50g，10.04mmol)溶于四氢呋喃(50.0mL)中，室温下加入1.0M的四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液(15.2mL，15.06mmol)，在氮气保护下缓慢升温至40℃，并在此条件下反应8.0h。减压浓缩除去溶剂，所得浓缩物用方法1中的纯化方法2进行纯化得到式I化合物(3.66g，收率50.3％)。

步骤6：化合物LE14的合成

方法1：用按照步骤5纯化方法1得到的式I化合物作为原料

将式I化合物(4.80g，纯度96.5％，6.40mmol)溶于15.0mL无水DMF中，加入4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)(2.65g,9.60mmol)，反应在室温下反应1.0h。然后向其中加入N，N-二异丙基乙胺(1.23g，9.60mmol)和式VIII化合物Exatecan甲磺酸盐(3.42，6.40mmol)并继续反应1.5～2.0h。待原料反应完毕，减压馏去溶剂，所得粗品经硅胶柱层析(氯仿：甲醇＝10:1(v/v))纯化得到式LE14化合物(5.24g，纯度99.17％，收率71.8％)。

方法2.用按照步骤5纯化方法2得到的式I化合物作为原料

将式I化合物(4.72g，纯度为83.06％，5.42mmol)溶于15mL无水DMF中，加入4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)(2.24g,8.13mmol)，反应在室温下反应1.0h。然后向其中加入N，N-二异丙基乙胺(1.04g,8.13mmol)和式VIII化合物Exatecan甲磺酸盐(2.89g,5.42mmol)并继续反应1.5～2.0h。通过TLC监控反应，待原料反应完毕，减压馏去溶剂，所得粗品经硅胶柱层析(氯仿：甲醇＝10:1(v/v))纯化得到化合物LE14(3.69g，纯度98.77％，收率59.6％)。

ESI-MS m/z：1141.7(M+H)；

¹H-NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ9.92(s,1H),8.47(s,1H),8.13(d,J＝6.9Hz,1H),7.75(d,J＝28.5Hz,2H),7.55(s,2H),7.29(s,3H),6.99(s,2H),6.47(s,1H),5.60(s,1H),5.49–5.33(m,2H),5.19(s,2H),5.05–4.80(m,4H),4.39(d,J＝7.5Hz,1H),4.22–4.15(m,1H),4.04(s,2H),3.69(d,J＝2.8Hz,2H),3.37(dt,J＝14.2,7.7Hz,4H),3.24–3.09(m,2H),2.93(d,J＝37.1Hz,3H),2.36(t,J＝1.70Hz,3H),2.23–2.08(m,4H),2.03–1.75(m,3H),1.53–1.43(m,4H),1.30(d,J＝7.2Hz,3H),1.15(d,J＝7.7Hz,2H),0.86(m,9H).

实施例2

将实施例1步骤5制备得到的反应液浓缩之后，所得浓缩物通过以下方法进行预处理：取浓缩物，在室温下用二氯甲烷超声溶解(所用的二氯甲烷的体积与浓缩物质量比值为10mL/g)，然后向其中加入甲基叔丁基醚(所用甲基叔丁基醚的体积与浓缩物的质量比值为20-70mL/g)，并在常温条件下搅拌2-5小时，静置后倒去上清液，下部油状物真空浓缩得预处理粗品，粗品用于后续的色谱层析纯化。

本实施例预处理所用的溶剂配比、预处理后样品的纯度和回收率见表5。从表5给出的结果看出：当二氯甲烷/浓缩物的体积质量比为10mL/g和甲基叔丁基醚/浓缩物的体积质量比为30-70mL/g时，能够以大于65％的回收率得到纯度大于56％的式I化合物预处理粗品；当二氯甲烷/浓缩物的体积质量比为10mL/g和甲基叔丁基醚/浓缩物的体积质量比为40-70mL/g时，能够以大于70％的回收率得到纯度大于56％的式I化合物预处理粗品；当二氯甲烷/浓缩物的体积质量比为10mL/g和甲基叔丁基醚/浓缩物的体积质量比为40-60mL/g时，能够以大于70％的回收率得到纯度大于58％的式I化合物预处理粗品；当二氯甲烷/浓缩物的体积质量比为10mL/g和甲基叔丁基醚/浓缩物的体积质量比为40-50mL/g时，能够以大于70％的回收率得到纯度大于60％的式I化合物预处理粗品；当二氯甲烷/浓缩物的体积质量比为10mL/g和甲基叔丁基醚/浓缩物的体积质量比为50mL/g时，能够以大于75％的回收率得到纯度大于60％的式I化合物预处理粗品。

表5.预处理步骤的溶剂配比对所得粗品纯度和回收率的影响

注：回收率＝处理后的样品重量/处理前的样品重量╳100％。

实施例3

本实施例通过常规柱层析对经过实施例2预处理后的式I化合物预处理粗品进行纯化，得到纯度(80.0％以上)式I化合物粗品。具体地，本实施例对式I化合物预处理粗品按照以下步骤进行纯化：

步骤1.利用常规正相色谱硅胶作为填料固定相，采用正相色谱法制备式I化合物。具体实施方法为：将式I化合物粗品用二氯甲烷：甲醇＝10:1(体积比)溶解后湿法上样注入常规玻璃层析型正相色谱柱，具体色谱柱参数见表2和表3，在25℃进行洗脱，洗脱剂为二氯甲烷和甲醇的混合，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇体积比为60:1-10:1，通过调节洗脱剂梯度方式洗脱式I化合物，收集目标馏分；

步骤2.合并馏分中色谱含量大于80.0％的馏分，将合并的馏分经过真空浓缩或者浓缩后萃取浓缩液或冻干，得到式I化合物成品。

本实施例所用的色谱分离方法、固定相种类、洗脱体系及纯化得到的样品的纯度和回收率如表6所示。从表6的结果可以看出：正相色谱分离方法能够获得纯度80.0％以上的产品，但是存在样品回收率低的缺点。

表6.色谱纯化方法及纯化样品的纯度及回收率

注：回收率＝处理后的样品重量/处理前的样品重量╳100％。

实施例4

步骤1.按照实施例2的方法对式I化合物粗品进行预处理。

步骤2.常规快速柱层析纯化式I化合物预处理粗品

本步骤通过常规快速柱层析对式I化合物预处理粗品进行初步纯化，得到初步纯化的式I化合物样品。具体地按照以下步骤进行纯化：利用常规正相色谱硅胶作为填料固定相，采用正相色谱法制备式I化合物。具体实施方法为：将经过步骤1预处理后的式I化合物预处理粗品超声溶于二氯甲烷和甲醇的混合溶液(两者体积比和洗脱剂比例相同,用尽量少的量溶解)注入常规玻璃层析型正相色谱柱，具体色谱柱参数见表2、表3，洗脱剂为二氯甲烷和甲醇的混合溶剂，在25℃进行洗脱，通过单一等梯度方式洗脱式I化合物预处理粗品，尽量多的收集目标馏分，将合并的馏分经过真空浓缩或者浓缩后萃取浓缩液或冻干，得到初步纯化的式I化合物粗品。

本实施例所用的色谱分离方法、固定相种类、洗脱体系及得到的初步纯化的式I化合物样品的纯度和回收率如表7所示。从表7的结果可以看出：以二氯甲烷：甲醇＝5:1的混合溶剂做为洗脱剂，采用本实施里的常规快速柱层析分离方法能够以大于90％的高回收率获得纯度为70-80％的式I化合物样品，方便后续进一步纯化。

表7.色谱纯化方法及纯化样品的纯度及回收率

/>

注：回收率＝处理后的样品重量/处理前的样品重量╳100％。

步骤3.高压制备色谱法纯化制备更高纯度(95.0％以上)式I化合物

将步骤2经过硅胶快速柱初步纯化的式I化合物样品(纯度介于70.0％～80.0％之间)溶于洗脱剂A和B体积比为7:3混合溶剂中，溶解后的样品上样至平衡好的高压制备色谱柱进行洗脱，利用等度或梯度洗脱方法，通过调节洗脱剂梯度方式洗脱式I化合物，收集纯度大于95.0％的馏分；合并馏分中色谱含量大于95.0％的馏分，将合并的馏分经过减压浓缩得到式I化合物成品。

本实施例先对洗脱梯度进行优化，研究了洗脱梯度的改变对纯化产品的纯度和回收率的影响，具体情况如表8所示，其中洗脱速度为40mL/min，洗脱剂中溶剂A为二氯甲烷，B为甲醇，固定相选用

8-120，柱温为25℃。从表8的结果可以看出：按照本实施例描述的纯化方法，在选用表8的4-9至4-13的洗脱梯度时，可以以大于74％的回收率得到纯度高于91％的式I化合物，在选用表8的4-10至4-13的洗脱梯度时，可以以大于74％的回收率得到纯度高于93％的式I化合物，在选用表8的4-10或4-13时，可以以大于74％的回收率得到纯度高于94％的式I化合物，在选用表8的4-10的洗脱梯度时，可以以大于74％的回收率得到纯度高于95％的式I化合物。

表8.高压制备系统洗脱梯度

/>

注：回收率＝处理后的样品重量/处理前的样品重量╳100％。

本实施例在如表8中的4-10所示的优选洗脱梯度及洗脱速度40mL/min下研究了固定相种类及洗脱剂种类对纯化产品的纯度和回收率的影响，具体情况如表9所示(编号4-22的洗脱剂用的是等梯度洗脱)，其中固定相为

8-120、/>

10-120或/>

20-120，洗脱剂中溶剂A为乙酸乙酯或二氯甲烷，B为甲醇或乙醇。从表9的结果可以看出：按照本实施例描述的纯化方法，在固定相选用/>

8-120或/>

10-120，洗脱剂体系(A:B)为二氯甲烷:甲醇时，可以以大于74％的回收率得到纯度高于95％的式I化合物，在固定相选用/>

10-120，洗脱剂体系(A:B)为二氯甲烷：甲醇时，可以以大于76％的收率得到纯度高于95％的式I化合物。

其中，柱温:25℃，流速：40.0mL/min，检测波长1：254nm，检测波长2：220nm。

表9.固定相和洗脱体系对纯化产品的纯度和回收率的影响

注：回收率＝处理后的样品重量/处理前的样品重量╳100％。

本实施例对洗脱速度对纯化产品的纯度和回收率的影响进行了研究，具体情况如表10所示，表10的固定相为

10-120，洗脱剂体系为二氯甲烷：甲醇，选用如表8中的4-10所示的洗脱梯度，从表10的数据可以得出：以25mL/min-45mL/min的洗脱速度可以得到纯度大于95％的式I化合物，以35mL/min～45mL/min的洗脱速度可以以大于70％的收率得到纯度大于95％的式I化合物，以40mL/min～45mL/min的洗脱速度可以以大于75％的收率得到纯度大于95％的式I化合物。

表10.洗脱速度对纯化产品的纯度和回收率的影响

编号	洗脱速度	纯度(％)	回收率(％)
				4-23	25.0mL/min	96.30％	58.41％
4-24	30.0mL/min	96.18％	59.29％
				4-25	35.0mL/min	96.24％	70.66％
4-26	40.0mL/min	96.29％	76.42％
				4-27	45.0mL/min	95.79％	79.25％
4-28	50.0mL/min	93.61％	81.63％
				4-29	55.0mL/min	92.49％	82.47％

注：回收率＝处理后的样品重量/处理前的样品重量╳100％。

采用本实施例的纯化方法，可获得更高纯度(95.0％以上)式I化合物产品，同时具有较好的样品回收率，适合商业规模生产。以高纯度的式I化合物作为关键中间体，可以控制lingker-drug分子(化合物LE14)和ADC分子的质量及杂质含量，在制备得到符合药品质量标准的ADC产品的同时尽量提高产品的质量，具体如下表11。

表11.终产物LE14化合物纯度对比数据

该方法相对于常规色谱纯化方法不仅可以提高样品纯度和收率，还具有操作简单、稳定性好等优势，而且使用的固相填充剂可以简单易得且可重复回收利用，节约生产成本和减少环境污染，适合于工业生产。

实施例5工艺路线综合对比

将按照路线1方法得到的羧酸中间体1-4的粗品用硅胶柱层析(氯仿：甲醇＝10:1(v/v))纯化，未拿到纯化的中间体1-4；将按照路线2的方法得到的羧酸中间体2-2a的粗品用硅胶柱层析(氯仿：甲醇＝10:1(v/v))纯化，未拿到纯化的中间体2-2a；而按照本发明的方法能以较好的收率拿到较好纯度的羧酸中间体I，三条合成路线制备羧酸中间体的纯化情况汇总对比见下表12。

将按照实施例1合成得到的LE14终产物与路线1、路线2、路线3、路线4和路线5得到的LE14终产物通过高效液相进行纯度对比，所得结果见下表13。

表12 几种工艺路线所得羧酸中间体(1-4，2-2a和I)比较

表13.不同工艺路线终产物LE14纯度对比数据

现有技术中，合成路线3、路线4和路线5都使用了与本发明相同的中间体(化合物5与化合物VII结构相同)，可以从相同的中间体出发制备得到终产物LE14，四条路线制备得到终产物LE14，其路线总收率及终产物的纯度归纳见表14。

表14.不同工艺路线终产物纯度和以同样的化合物5(VII)作为起始物料的总收率对比

在现有技术CN 115215921 A和CN115385926A的合成路线中，以依喜替康为起始物，路线4和路线5的路线总收率均低于本发明，见表15。

表15.不同工艺路线以以依喜替康投料计总收率对比

从表13、表14和表15可以看出，路线1和路线2制备得到的产品纯度远不及本发明，且不符合IND申报对本发明中产品的质量要求(总杂不大于3％，单杂不大于1％)；路线3使用了价格比依喜替康更加昂贵的DXd作为payload来源，虽然节省了反应步骤，但路线3的收率及Dxd的利用率却不高，而在路线4和路线5中，均需要对依喜替康进行衍生化，一方面工艺反应步骤较多，生产操作繁琐，另一方面在制备过程中损失也较多，导致昂贵物料依喜替康的利用率较低，不适合进行大规模工业化生产。

具体到本发明的合成路线，在最后式I化合物和依喜替康反应制备LE14的步骤中，方法1和方法2均能拿到符合产品质量标准的产品，在两条工艺方法中，依喜替康是整个工艺路线中成本占比最大的一个关键物料，也是主要的成本控制点。方法1中式I化合物经过高压柱层析方法纯化，一方面的确能够提升终产品LE14的产品质量，另一方面也能够通过精准投料，降低依喜替康的消耗，从而实现成本控制，而方法2对依喜替康的利用率远低于方法1，这可以从表15的数据对比(以依喜替康计算的收率，方法1：71.8％，方法2：59.6％)中可以看出。综合权衡比较之下，本申请提供的两条工艺路线中，方法1能够以更低的成本提供更高质量的LE14产品，从而成为更优选的生产工艺，更适合用于大规模的工业化生产。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该发明进行的同等修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种式I化合物；

2.一种化合物LE的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：式I化合物与式VIII化合物或其甲磺酸盐在缩合剂、碱以及溶剂存在下进行酰胺缩合反应得到化合物LE，

其中，R²为C_1-6烷基；

R³为卤素。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法满足下述条件中的一种或多种：

(1)所述的R²为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基，优选为甲基或乙基，进一步优选为甲基；

(2)所述的R³为氟、氯、溴或碘，优选为氟或氯，进一步优选为氟；

(3)所述的化合物LE的制备方法中，所述的酰胺缩合反应还具体包括如下步骤：所述的式I化合物溶于溶剂，加入缩合剂和碱，立刻或反应一段时间后加入式VIII化合物，优选地，所述的酰胺缩合反应全程避光处理；

(4)所述的化合物LE的制备方法中，所述式VIII化合物与所述的式I化合物的摩尔比值为0.8-1.5，优选为0.9-1.2，进一步优选为1.0；

(5)所述的化合物LE的制备方法中，所述的缩合剂为氯化4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉、氰代磷酸二乙酯、叠氮磷酸二苯酯、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯、2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯、2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯和2-(5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸季铵盐中的一种或其中任意两种或两种以上的混合，优选为氯化4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉；

(6)所述的化合物LE的制备方法中，所述的缩合剂与所述的式I化合物的摩尔比值为1-3，优选为1-1.5；

(7)所述的化合物LE的制备方法中，所述的碱为有机碱、无机碱或其混合，优选为有机碱；其中，所述的有机碱优选为N,N-二异丙基乙胺、三乙胺和吡啶中的一种或其中任意两种或两种以上的混合，进一步优选为N,N-二异丙基乙胺；所述的无机碱优选为碱金属氢氧化物、碱金属碳酸盐和碱金属磷酸盐中的一种或其中任意两种或两种以上的混合，进一步优选为碳酸氢钠、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、氢氧化钠和氢氧化钾中的一种或其中任意两种或两种以上的混合；

(8)所述的化合物LE的制备方法中，所述的碱与所述的式I化合物的摩尔比值为1-10，优选为1-5，进一步优选为1.2-3，最优选为1.5；

(9)所述的化合物LE的制备方法中，所述的溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃和1,4-二氧六环中的一种或其中任意两种或两种以上的混合，优选为N,N-二甲基甲酰胺；

(10)所述的化合物LE的制备方法中，所述的酰胺缩合反应的温度为20℃-50℃，优选为20℃-30℃；

(11)所述的化合物LE的制备方法中，所述的酰胺缩合反应优选在惰性气体保护下进行，例如在氮气或氦气环境中进行；

(12)所述的化合物LE的制备方法中，还包括如下后处理步骤：将反应液浓缩得到化合物LE粗品；优选地，将化合物LE粗品进行硅胶柱层析纯化得到化合物LE产品，进一步优选地，所述的硅胶柱层析的洗脱剂为氯仿和甲醇的混合，所述的氯仿和甲醇体积比为(100-10):1，优选为10:1。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的化合物LE的制备方法还进一步包括式I化合物的制备方法，其包括如下步骤：在溶剂中，将式II化合物在脱保护剂的存在下进行脱保护反应得到式I化合物；

其中，R为-Si(C₁～C₆)₃取代的C₁-C₆烷基。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法满足下述条件中的一种或多种：

(1)所述的式I化合物的制备方法中，所述的R为三甲基硅基乙基或叔丁基二甲基硅基乙基；优选地，所述的R为三甲基硅基乙基；

(2)所述的式I化合物的制备方法中，所述的脱保护反应还具体包括如下步骤：所述的式II化合物溶于溶剂，加入所述的脱保护剂后加热开启反应，或者所述的脱保护剂溶于溶剂，加入所述的式II化合物后加热开启反应；

(3)所述的式I化合物的制备方法中，所述的脱保护剂为氟试剂，所述的氟试剂为四丁基氟化铵、四甲基氟化铵、四丁基氟化铵/醋酸、吡啶氟化氢络合物、叔丁基氟化铵、叔丁基氟化铵/醋酸、四乙基氟化铵，或者四甲基氟化铵/四氢呋喃溶液、四乙基氟化铵/四氢呋喃溶液或四丁基氟化铵/四氢呋喃溶液，或者为氟化钾、氟化钠、氟化锂和氟化铯中的一种或其中任意两种或两种以上的混合，优选为1M四丁基氟化铵/四氢呋喃溶液或氟化钾；

(4)所述的式I化合物的制备方法中，所述脱保护剂与所述的式II化合物的摩尔比值为1-5，优选为1-3，进一步优选为1.1-2.0，最优选为1.5；

(5)所述的式I化合物的制备方法中，所述的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃和1,4-二氧六环中的一种或其中任意两种或两种以上的混合，优选为N,N-二甲基甲酰胺或四氢呋喃，进一步优选为N,N-二甲基甲酰胺；

(6)所述的式I化合物的制备方法中，所述的脱保护反应的温度为20℃-80℃，优选为30℃-70℃，进一步优选为50℃-70℃，最优选为60℃；

(7)所述的式I化合物的制备方法中，所述的脱保护反应在惰性气体保护下进行，例如在氮气或氦气环境中进行；

(8)所述的式I化合物的制备方法中，所述的脱保护反应完成后，还进一步包括后处理步骤：将式I化合物粗品在高压制备色谱条件下进行分离，得到式I化合物，所述的高压制备色谱条件如下：

色谱柱为动态轴向压缩柱；

色谱柱内径为50mm；

色谱柱长度为650mm；

固定相为未键合的硅羟基；

固定相的粒径为8-20μm；

固定相的孔径为

流动相为卤代烷烃类溶剂与醇类溶剂的混合溶剂A；所述的卤代烷烃类溶剂和所述的醇类溶剂的体积比为96:4～90:10；

所述的式I化合物粗品中式I化合物纯度为70％-80％。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法满足下述条件中的一种或多种：

(1)所述的式I化合物的制备方法中，所述的固定相的粒径为8μm、10μm或20μm；

(2)所述的式I化合物的制备方法中，所述的高压制备还具体包括如下步骤：式I化合物粗品溶于混合溶剂B，在高压制备色谱条件下进行梯度洗脱，收集色谱含量大于95.0％的馏分，得式I化合物；所述的混合溶剂B为二氯甲烷和甲醇的混合溶剂；所述的甲醇与所述的混合溶剂B的体积比为10％-30％，优选为20％-30％，最优选为30％；

(3)所述的式I化合物的制备方法中，所述的固定相为

8-120或/>

10-120，优选为/>

10-120；

(4)所述的式I化合物的制备方法中，所述的梯度洗脱采用下表1中4-9至4-13中的任一洗脱梯度，优选采用4-10至4-13任一的洗脱梯度，进一步优选采用4-10或4-13的洗脱梯度，最优选采用4-10的洗脱梯度；

表1.高压制备系统洗脱梯度

/>

(5)所述的式I化合物的制备方法中，所述的梯度洗脱速度为25mL/min-45mL/min，优选为35mL/min～45mL/min，进一步优选为40mL/min～45mL/min；

(6)所述的式I化合物的制备方法中，所述的梯度洗脱的柱温为20℃-50℃,优选为25℃-40℃；

(7)所述的式I化合物的制备方法中，所述的高压制备的检测波长为254nm或220nm；

(8)所述的式I化合物的制备方法中，所述的制备方法还包括制备式I化合物粗品的方法，其包括如下步骤：

①将反应液浓缩得浓缩物，用二氯甲烷超声溶解浓缩物，然后加入甲基叔丁基醚，在常温下搅拌，静置后除去上清液，余下部分浓缩得预处理粗品；

②采用快速硅胶柱层析纯化预处理粗品，预处理粗品溶于少量混合溶剂C，湿法上样，流动相洗脱，收集合并馏分，浓缩得式I化合物粗品。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法满足下述条件中的一种或多种：

(1)步骤①中，所述的二氯甲烷与所述的浓缩物体积质量比为8-12mL/g，优选为9-11mL/g，进一步优选为10mL/g；

(2)步骤①中，所述的甲基叔丁基醚与所述的浓缩物的体积质量比为30-70mL/g，优选为40-70mL/g，进一步优选为40-60mL/g，再进一步优选为40-50mL/g，最优选为50mL/g；

(3)步骤①中，所述的搅拌的时长为2-10小时，优选为2-8小时，进一步优选为2-5小时；

(4)步骤②中，所述的混合溶剂C为二氯甲烷和甲醇的混合溶剂；所述的二氯甲烷和甲醇的体积比为10:1-5:1，优选为5:1；

(5)步骤②中，所述的快速硅胶柱层析所用的固定相为200-400目的正相色谱硅胶；

(6)步骤②中，所述的流动相为二氯甲烷和甲醇的混合；所述的二氯甲烷和甲醇的体积比为10:1-5:1，优选为5:1；

(7)所述的高压制备中，所述的固定相为

8-120或/>

10-120；所述的甲醇与所述的混合溶剂B的体积比为20％-30％，优选为30％；所述的梯度洗脱速度为25mL/min-45mL/min，例如35mL/min、40mL/min或45mL/min；所述的梯度洗脱的柱温为25℃-40℃；所述的高压制备的检测波长为254nm或220nm；所述的洗脱梯度采用表1中的4-9、4-10、4-11、4-12或4-13；

(8)所述的高压制备中，所述的固定相为

10-120；所述的甲醇与所述的混合溶剂B的体积比为30％；所述的梯度洗脱速度为40mL/min～45mL/min；所述的梯度洗脱的柱温为25℃；所述的高压制备的检测波长为254nm或220nm；所述的洗脱梯度采用表1中的4-10。

8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的式I化合物的制备方法还进一步包括式II化合物的制备方法，其包括如下步骤：将式Ⅲ化合物和6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯在溶剂中进行偶联反应得到相应的式Ⅱ化合物；

其中，R为-Si(C₁～C₆)₃取代的C₁～C₆烷基；

进一步地，所述的式II化合物的制备方法还进一步包括式III化合物的制备方法，其包括如下步骤：将式IV化合物和还原剂在溶剂中和酸缓冲液存在下进行还原反应得到相应的式III化合物；

其中，R为-Si(C₁～C₆)₃取代的C₁～C₆烷基；

进一步地，所述的式III化合物的制备方法还包括式IV化合物的制备方法，其包括如下步骤：将式VI化合物与试剂V在溶剂中、在碱存在下进行醚化反应得到相应的式IV化合物；

其中，R为-Si(C₁～C₆)₃取代的C₁～C₆烷基；

进一步地，所述的式IV化合物的制备方法还包括式VI化合物的制备方法，其包括如下步骤：将式VII化合物与多聚甲醛和三甲基氯硅烷在溶剂中进行取代反应得到相应的式VI化合物；

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法满足下述条件中的一种或多种：

(1)所述的式Ⅱ化合物的制备方法中，所述的R为三甲基硅基乙基或叔丁基二甲基硅基乙基,优选为三甲基硅基乙基；

(2)所述的式II化合物的制备方法中，所述的6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯与所述的式III化合物的摩尔比值为1-5，优选为1-3，进一步优选为1.2-2，最优选为1.5；

(3)所述的式II化合物的制备方法中，所述的溶剂为酰胺类溶剂、氯代烷烃类溶剂、醚类溶剂和腈类溶剂中的一种或其中任意两种或两种以上的混合，优选为氯代烷烃类溶剂，其中，所述氯代烷烃类溶剂优选为二氯甲烷，1,2-二氯乙烷和氯仿中的一种或其中任意两种或两种以上的混合，进一步优选为二氯甲烷；

(4)所述的式II化合物的制备方法中，所述的偶联反应温度为0℃-45℃，优选为25℃-40℃，进一步优选为30℃-35℃；

(5)所述的式II化合物的制备方法中，所述的偶联反应在惰性气体保护下进行，例如在氮气或氦气保护下进行；

(6)所述的式II化合物的制备方法中，偶联反应结束后，还进一步包括如下的后处理步骤：将反应液浓缩，用二氯甲烷和水萃取，合并二氯甲烷有机相，浓缩得到式II化合物粗品，优选地，将式II化合物粗品进行硅胶柱层析纯化得到式II化合物产品，进一步优选地，所述的硅胶柱层析的洗脱剂为二氯甲烷和甲醇的混合溶剂，所述的二氯甲烷和所述的甲醇体积比为为(10-1):1；

(7)所述的式III化合物的制备方法中，所述的R为三甲基硅基乙基或叔丁基二甲基硅基乙基，优选为三甲基硅基乙基；

(8)所述的式III化合物的制备方法中，所述的还原反应还具体包括如下步骤：所述的还原剂溶于溶剂，再滴加至酸缓冲液中，所得反应体系置于惰性气体保护下，搅拌降温，随后将溶于溶剂的式IV化合物滴加至上述反应体系中，进行反应；

(9)所述的式III化合物的制备方法中，所述的还原剂为三苯基膦、三叔丁基膦和三甲基膦中的一种或其中任意两种或两种以上的混合，或三苯基膦/四氢呋喃溶液、三叔丁基膦/四氢呋喃溶液或三甲基膦/四氢呋喃溶液，优选为三甲基膦/四氢呋喃溶液，进一步优选为1M三甲基膦/四氢呋喃溶液；

(10)所述的式III化合物的制备方法中，所述的还原剂与所述的式IV化合物的摩尔比为1.0-3.0，优选为1.2-1.8，进一步优选为1.5；

(11)所述的式III化合物的制备方法中，所述的酸缓冲液与所述的式IV化合物的体积质量比为2-10mL/g，优选为3-5mL/g，进一步优选为4mL/g；

(12)所述的式III化合物的制备方法中，所述的溶剂为醚类溶剂，优选四氢呋喃、乙醚、1,4-二氧六环、苯甲醚和甲基叔丁基醚中的一种或其中任意两种或两种以上的混合，进一步优选为四氢呋喃；

(13)所述的式III化合物的制备方法中，所述的酸缓冲液为醋酸缓冲液或甲酸缓冲液，优选醋酸缓冲液，所述的醋酸缓冲液为醋酸钠缓冲液；

(14)所述的式III化合物的制备方法中，所述酸缓冲液的pH为4.0-6.0，优选为4.5-5.5，进一步优选为5.0；

(15)所述的式III化合物的制备方法中，所述的还原反应的温度为0℃-20℃，优选为0℃-10℃，进一步优选为0℃-5℃；

(16)所述的式III化合物的制备方法中，还原反应结束后，还进一步包括如下的后处理步骤：反应液浓缩除去溶剂，加入二氯甲烷或乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩后得式III化合物粗品，优选地，将式III化合物粗品进行硅胶柱层析纯化得到式III化合物产品，进一步优选地，所述的硅胶柱层析的洗脱剂为二氯甲烷和甲醇的混合溶剂，所述的二氯甲烷和所述的甲醇体积比为(10-1):1；

(17)所述的式IV化合物的制备方法中，所述的R为三甲基硅基乙基或叔丁基二甲基硅基乙基，优选为三甲基硅基乙基；

(18)所述的式IV化合物的制备方法中，所述的试剂V与所述的式VI化合物的摩尔比值为1-5，优选为1-3，进一步优选为1.1-1.6；

(19)所述的式IV化合物的制备方法中，所述的碱为有机碱、无机碱或其混合；优选为有机碱；其中，所述有机碱优选为叔丁醇钾、三乙胺、DMAP、吡啶和潘必啶中的一种或其中任意两种或两种以上的混合，进一步优选为潘必啶；所述无机碱优选为碱金属氢氧化物、碱金属碳酸盐和碱金属磷酸盐中的一种或其中任意两种或两种以上的混合，进一步优选为磷酸钾、碳酸钾、氢氧化钾和碳酸铯中的一种或其中任意两种或两种以上的混合；

(20)所述的式IV化合物的制备方法中，所述的碱与所述的式VI化合物的摩尔比值为1-5，优选为1.2-4，进一步优选为1.5-3；

(21)所述的式IV化合物的制备方法中，所述的溶剂为DMF、DMSO、四氢呋喃、1,4-二氧六环或其中任意两种或两种以上的混合，优选为1,4-二氧六环或四氢呋喃，进一步优选为四氢呋喃；

(22)所述的式IV化合物的制备方法中，所述的醚化反应的温度为0℃-80℃，优选为40℃-80℃，进一步优选为50℃-70℃；

(23)所述的式IV化合物的制备方法中，所述的醚化反应在惰性气体保护下进行，例如在氮气或氦气保护下进行；

(24)所述的式IV化合物的制备方法中，所述的醚化反应结束后，还进一步包括如下后处理步骤：反应液进行浓缩，所得浓缩物加有机溶剂溶解后洗涤有机相，浓缩有机相，将所得残留物进行纯化；其中，所述有机溶剂为乙酸乙酯或二氯甲烷，优选为乙酸乙酯；所述洗涤所用的水相为酸的水溶液、水和/或饱和食盐水；优选地，用饱和食盐水对有机相进行洗涤；优选地，所述的纯化采用打浆、结晶、制备色谱或硅胶柱层析，进一步优选地，所述的纯化采用硅胶柱层析的方法，所述的硅胶柱层析的洗脱剂为正庚烷和乙酸乙酯的混合溶剂，所述的正庚烷和所述的乙酸乙酯的体积比为(20-1):1，优选为(10-1):1；

(25)所述的式Ⅵ化合物的制备方法中，所述的多聚甲醛与所述的式VII化合物的摩尔比值为1-10，优选为1-5，进一步优选为1.3-3.0；

(26)所述的式Ⅵ化合物的制备方法中，所述的三甲基氯硅烷与所述的式VII化合物的摩尔比值为1-5，优选为2-4，进一步优选为2-3；

(27)所述的式Ⅵ化合物的制备方法中，所述的溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃和1,4-二氧六环中的一种或其中任意两种或两种以上的混合，优选为四氢呋喃或1,4-二氧六环，进一步优选为1,4-二氧六环；

(28)所述的式Ⅵ化合物的制备方法中，所述的取代反应温度为-10℃-50℃，优选为15℃-35℃，进一步优选为18℃-25℃；

(29)所述的式Ⅵ化合物的制备方法中，所述的取代反应在惰性气体保护下进行，例如在氮气或氦气保护下进行；

(30)所述的式Ⅵ化合物的制备方法中，取代反应结束后，还进一步包括如下后处理步骤：将反应液进行固液分离或者不进行固液分离，将有机相浓缩后得到式Ⅵ化合物，优选地，直接将浓缩后得到的式Ⅵ化合物粗品与所述的试剂V反应。

10.一种式I化合物的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：在溶剂中，将式II化合物在脱保护剂的存在下进行脱保护反应得到式I化合物，反应条件和操作步骤如权利要求4-9中任一项所述；

其中，R为-Si(C₁～C₆)₃取代的C₁-C₆烷基。