CN102361558B - 包含外消旋氨基蝶呤的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

公开了含有外消旋氨基蝶呤或其药学上可接受的盐的药物组合物。还公开了治疗患者疾病的方法，包括以治疗有效量的外消旋氨基蝶呤或其药学上可接受盐进行给药。更具体地，还公开了治疗至少由二氢叶酸还原酶活性调节的疾病的方法，例如癌症和炎症性疾病，其中该方法包括以治疗有效量的外消旋氨基蝶呤或其药学上可接受的盐来对有需要的患者进行给药。

Description

包含外消旋氨基蝶呤的药物组合物
技术领域
本发明提供包含外消旋氨基蝶呤或其药学上可接受的盐的药物组合物。本发明还提供治疗患者疾病的方法，包括以治疗有效量的外消旋氨基蝶呤或其药学上可接受的盐进行给药。更具体地，本发明提供治疗至少由二氢叶酸还原酶的活性调节的疾病的方法，例如癌症和炎症性疾病，其中该方法包括以治疗有效量的外消旋氨基蝶呤或其药学上可接受盐对有需要的患者进行给药。
本发明受政府资助，从国家卫生研究院获补助金1R43AI068282，3R43AI068282-01S1，3R43AI068282-S2，5R43AR056547。政府对本发明享有某些权利。
背景技术
对映体(对映异构体)是彼此互为镜像、不能重叠的两个立体异构体之一，如一个人的左手和右手互为镜像而不能重叠一样。对映体具有基本相同的物理(除它们对平面偏振光的旋转能力，等量但方向相反)和化学(除手性环境)性能。等量光学活性异构体与其对映体的混合物是外消旋体，对平面偏振光的净旋转为零。
很多药物分子都是手性的，其生产涉及的合成化学反应常生成外消旋体。然而，由于许多生物分子都是手性的，两种对映体对生物体(包括人类)上的外消旋体产生显著不同的效果。对外消旋体的对映体之间或单独的对映体与其外消旋组合之间在生物效应上的差异(如有的话)进行预测是极其困难的，可能包括无差异、不同的药代动力学、定量或定性不同药理学或毒理学效应。
例如，外消旋体的两种对映体具有相似的生物活性，包括：多巴酚丁胺的两种对映体都是正性肌力药；布洛芬的两种对映体都是消炎药；华法令阻凝剂和苯丙香豆醇的两种对映体都是抗凝血剂；布比卡因的对映体均可产生局部麻醉。
或者，外消旋体的一种对映体具有生物活性而另一种对映体不具有的生物活性，包括：喹诺酮类(例如，l-普萘洛尔是一种β-阻断剂，而d-普萘洛尔却不是)和β-内酰胺类抗生素的对映体。
在其它一些例子中，外消旋体中每个对映体具有完全不同的活性，包括：外消旋索他诺尔，其中d-索他诺尔是一种III型抗心律失常药，l-索他诺尔是一种β-阻断剂。这些例子中，还有对映体有毒，对外消旋体的理想活性不起作用的情况。例如，粒细胞减少症与左旋多巴的右旋体有关；呕吐由左旋咪唑的右旋体引起的；当去除外消旋肉碱中的右旋体后，将观察不到重症肌无力症状。
由于外消旋体中对映体对生物具有不同药理学效应，人们希望开发基本只生产单一对映体的药物制备方法。该方法的一个缺点是：与生产相同的外消旋体的方法相比，生产基本单一对映体的方法成本更高。
但是选择开发一种外消旋体药物，相对于生产外消旋体药物的基本以纯态存在的一种对映体，可减少批准后的制备成本，在前置审批阶段，该说法被与开发外消旋体药物增加的监管负担相关的更高的成本所反驳。外消旋体增加的监管负担来自额外的测试，制备控制中的开发要求，药理学和毒理学的评估，代谢与分布特征和临床的评估。
公开了“氨基蝶呤[54-62-6]氮-[4-[[(2，4-二氨基-6-蝶啶)甲基]氨基]苯甲酰]-左旋-谷氨酸”(The Merck Index，13th Edition，Merck & Co.，Inc.，Whitehouse Station，NJ 2001，83页)，并且在本领域中作为L对映体使用。根据默克索引(The Merck Index)，氨基蝶呤是“由2，4，5，6-四氨基嘧啶硫酸盐，2，3-二溴丙醛和对氨基苯甲酰谷氨酸(Seeger et al.，J.Am.Chem.Soc.69，2567(1947)制备；由6-溴甲基-2，4-二氨基蝶啶溴化氢(Piper，Montgomery，J.Heterocycl.Chem.11，279(1974))制备”。因此，本领域使用的术语“氨基蝶呤”指的是L对映体。
因此如果将药物作为外消旋体开发，同时避免许多额外的测试和与开发单一对映体有关的开发成本，将具有显著的优点。如果与对理想的生物效应起主要作用的对映体相比，外消旋体(即对映体的组合)具有额外有利的生物性能，这将是外消旋体的另一个优点。氨基蝶呤或氮-[4-[[(2，4-二氨基-6-蝶啶)甲基]氨基]苯甲酰]-左旋-谷氨酸，是一种对治疗人类和动物的各种疾病很有用的有效抗叶酸剂。它具有光学活性，具有单一的手性中心。
发明内容
本发明提供一种包含外消旋氨基蝶呤或其药学上可接受的盐的药物组合物。优选地，外消旋氨基蝶呤或其药学上可接受的盐含有D-氨基蝶呤和L-氨基蝶呤，其中外消旋氨基蝶呤中D-氨基蝶呤的含量为15％-85％。更优选地，外消旋氨基蝶呤或其药学上可接受的盐中D-氨基蝶呤的含量为25％-75％。更优选地，外消旋氨基蝶呤中D-氨基蝶呤的含量为35-65％。最优选地，外消旋氨基蝶呤或其药学上可接受的盐中D-氨基蝶呤的含量为45-55％。优选地，药物组合物适合口服。更优选地，药物组合物为片剂或胶囊剂型，还包括药物辅料。优选地，外消旋氨基蝶呤药学上可接受的盐为二钠盐。优选地，药物组合物中外消旋氨基蝶呤的含量为0.01-4mg。优选地，药物组合物还包含L-氨基蝶呤。
本发明还提供治疗至少由二氢叶酸还原酶的活性调节的疾病的方法，该方法包括以外消旋氨基蝶呤或其药学上可接受的盐的治疗上有效的量对有需要的患者进行给药。外消旋氨基蝶呤优选是口服。
优选地，至少由二氢叶酸还原酶活性调节的疾病选自癌症和炎症性疾病。更优选地，癌症选自白血病、淋巴瘤、乳腺癌、头部和颈部鳞状细胞瘤、绒毛膜癌和子宫内膜癌。更优选地，炎症性疾病选自哮喘、多发性硬化症、类风湿关节炎、幼年类风湿关节炎、再狭窄、牛皮癣、牛皮癣关节炎、关节炎、异位性皮炎、慢性阻塞性肺疾病、炎症性肠道疾病、肺纤维化、多囊肾病、支气管肺发育不良、尘肺病、系统性红斑狼疮、多肌炎、移植物抗宿主病、移植排异、牛急性肺炎巴氏杆菌病和犬异位性皮炎。
优选地，外消旋氨基蝶呤或其药学上可接受的盐包含D-氨基蝶呤和L-氨基蝶呤，其中外消旋氨基蝶呤中D-氨基蝶呤的含量为15％-85％。更优选地，外消旋氨基蝶呤或其药学上可接受的盐中D-氨基蝶呤的含量为25％-75％。更优选地，外消旋氨基蝶呤中D-氨基蝶呤的含量为35％-65％。最优选地，外消旋氨基蝶呤或其药学上可接受的盐中D-氨基蝶呤的含量为45％-55％。
本发明的外消旋氨基蝶呤药物组合物提供了其商业和生物优点，包括：(i)与对映体药物相比，具有较低的生产成本；(ii)与其它外消旋体药物相比，减少了监管负担；(iii)与仅含有左旋体的药物组合物相比，增加了活性左旋体的系统暴露量。
附图说明
图1为实施例4所述的10只比格犬口服L-氨基蝶呤后，左旋体的平均血浆浓度的图形描述。
图2为实施例4所述的10只比格犬口服D-氨基蝶呤后，右旋体的平均血浆浓度的图形描述。
图3为实施例4所述的10只比格犬口服外消旋氨基蝶呤后，左旋体和右旋体的平均血浆浓度的图形描述。
图4为实施例4所述的每组10只比格犬分别口服L-氨基蝶呤和外消旋氨基蝶呤后，Cmax，AUC(0-12hrs)和AUC∞值的图形描述。
图5为实施例5描述的每组6个人类受试者分别口服L-氨基蝶呤和外消旋氨基蝶呤后，Cmax，AUC(0-12hrs)和AUC∞值的图形描述。
具体实施方式
本发明提供包含外消旋氨基蝶呤及其药学上可接受的盐的药物组合物。人们意外的发现：口服外消旋氨基蝶呤的吸收，对左旋体具有选择性，在循环过程中基本未检测到右旋体。新发现的对左旋体的选择性避免了外消旋体很多额外的测试、开发成本和监管负担，因为不需要考虑右旋体的药理学和毒理学的评估、代谢与分布特征和临床评价。这代表显著的商业优点。人们还发现，相对于口服纯的左旋体，口服外消旋氨基蝶呤增加了左旋体的系统暴露量。
这里使用的‘L-氨基蝶呤’或‘左旋体’指的是氮-[4-[[(2，4-二氨基-6-蝶啶)甲基]氨基]苯甲酰]-L-谷氨酸的游离酸形式。左旋体引起平面偏振光的正旋转；[α]D 25＝+18°±2°(二钠盐水溶液中c＝0.1)。这里使用的‘D-氨基蝶呤’或‘右旋体’指的是氮-[4-[[(2，4-二氨基-6-蝶啶)甲基]氨基]苯甲酰]-D-谷氨酸的游离酸形式。右旋体引起平面偏振光的负旋转；[α]D 25＝-18°±2°(二钠盐水溶液中c＝0.1)。这里使用的‘外消旋氨基蝶呤’、‘氨基蝶呤外消旋体’、‘外消旋-氨基蝶呤’或‘L/D-氨基蝶呤’指的是L-氨基蝶呤和D-氨基蝶呤的量基本相等的混合物。外消旋氨基蝶呤不会引起平面偏振光的可测定的旋转。外消旋氨基蝶呤可与各种无机和有机酸以及碱形成盐，可用传统方法制备这种盐，优选地，盐为二钠盐。
外消旋-氨基蝶呤抑制酶参与嘌呤和嘧啶的代谢，外消旋-氨基蝶呤抑制酶含有二氢叶酸还原酶，可间接导致腺苷的细胞外释放。腺苷是一种强大的抗炎内分泌物，调节先天免疫(reviewed by Hasko and Cronstein，(2004)“Adenosine：an endogenous regulator of innateimmunity”Trends Immunol.，25/1：33-39)，还可减少抗原刺激细胞的活化、降低粘附分子的表达以及可能诱导T细胞的凋亡(Cronstein et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1991)，88：2441；Cronstein et al.，J.Clin.Invest.(1993)，92/6：2675；Genesteir et al.，J.Clin.Invest.(1998)，102：322-328；Morabito et al.，J.Clin.Invest.(1998)，101：295-300；Paillot et al.，Transplant Proc.(1998)，30/5：2348-50；and Johnston et al.，Clin.Immunol.(2005)，114/2：154-63)。
现在人们已经意识到腺苷在人体炎症性疾病中具有举足轻重的作用，如类风湿关节炎和牛皮癣。腺苷可通过收集类风湿关节炎患者的滑液直接测定(Ottonello et al.，Rheumatology(2002)41：1249-1260)。
这里使用的术语“通过调节二氢叶酸还原酶活性治疗的疾病”是指一种疾病、病害或病情，调节二氢叶酸还原酶活性是减轻疾病或减轻疾病的一个或多个生物表现的有效方式；或干扰导致疾病或对潜在的疾病起作用的生物级联中一点或多点；或缓解疾病的一个或多个症状。因此，受二氢叶酸还原酶活性调节的疾病，包括以下方面：
(a)二氢叶酸还原酶活性的不足是疾病或一个或多个生物表现的起因，而无论其活性改变因遗传、感染、刺激、内部刺激或其它原因引起的。
(b)通过降低二氢叶酸还原酶活性来减轻病害或疾病，或可观察到的表现，或病害或疾病的表现。二氢叶酸还原酶活性的存在与病害或疾病或其可观察到的表现没有因果关系。
(c)二氢叶酸还原酶的活性干扰导致病害或疾病或与病害或疾病有关的生化部分或细胞级联。在这方面，二氢叶酸还原酶的活性改变级联，从而控制病害、病情或疾病。
用外消旋-氨基蝶呤调节二氢叶酸还原酶活性来治疗的疾病包括癌症：例如，白血病、淋巴瘤、乳腺癌、头部和颈部鳞状细胞瘤、绒毛膜癌和子宫内膜癌；还包括炎症性疾病：例如，哮喘、多发性硬化症、类风湿关节炎、幼年类风湿关节炎、再狭窄，牛皮癣、牛皮癣关节炎、关节炎、异位性皮炎、慢性阻塞性肺疾病、炎症性肠道疾病、肺纤维化、多囊肾病、支气管肺发育不良，尘肺病、系统性红斑狼疮、多肌炎、移植物抗宿主病、移植排异、牛急性肺巴氏杆菌病和犬异位性皮炎。
在一个优选实施例中，本发明提供了一种通过至少调节二氢叶酸还原酶活性来治疗疾病的方法，该方法包括以外消旋氨基蝶呤或其药学上可接受盐的治疗上有效的量对有需要的患者进行给药。据说如果抑制剂的百分含量在5％-100％，患者体内的二氢叶酸还原酶会受到抑制。
术语“患者”指动物或人。术语“治疗上有效的量”指外消旋-氨基蝶呤的剂量(剂量或数量，次数)，直接或间接地杀死炎症性细胞、阻止炎症性细胞的累积，或减少炎症性细胞在患有炎症性疾病(如，不确定病因的关节炎、类风湿关节炎、幼年类风湿关节炎、异位性皮炎、支气管肺发育不良、炎症性肠道疾病、牛皮癣关节炎和牛皮癣或动物得的病，如犬异位性皮炎或牛急性肺炎巴氏杆菌病)的人或其它哺乳动物体内的累积。术语“治疗上有效的量”还指外消旋-氨基蝶呤的剂量，该剂量可直接或间接降低或增加由参与人或哺乳动物的炎症性疾病的炎症细胞或非炎症细胞分泌的分子的活性，从而抗叶酸剂的量阻止、减少或消除与炎症性疾病相关的病理炎症。通常，治疗上有效的量也将消除、减少或阻止一个或多个疾病表现的发展。有经验的临床医师会意识到，大多数情况下，外消旋-氨基蝶呤可能无法提供治疗，而仅能提供部分益处。此外，有经验的临床医师还意识到，因个别患者或疾病状态会有所不同，有的患者可得到一点益处，或根本得不到益处。上述外消旋氨基蝶呤“杀死”、“阻止”、“减少”或“消除”的剂量，在至少一部分患者中，被认为是治疗上有效的。在急性或慢性炎症性疾病给药中，外消旋氨基蝶呤治疗上有效的量的剂量大小，会因治疗的炎症性疾病的严重性与给药途径而不同。
外消旋-氨基蝶呤的剂量和剂量率取决于多种因素，如患者体重和计算的表面积，使用的具体药物组合物，治疗目的，即治疗或预防，治疗的疾病的性质，主治医师的判断和单个患者的反应。当有亚叶酸时，可能需要大剂量外消旋-氨基蝶呤。
通常，不存在亚叶酸时，外消旋-氨基蝶呤治疗上有效的量，即外消旋-氨基蝶呤剂量是0.001-0.5mg/kg、0.001-0.27mg/kg和0.005-0.06mg/kg，最优选地，用于炎症症状的剂量0.010-0.06mg/kg，用于肿瘤症状的剂量0.13-0.27mg/kg，作为单剂量或分剂量。
可对患者从低向高滴定至上面剂量范围，从而满意地控制疾病表现。一旦患者的病情有所改善，必要时，对患者以维持剂量的本发明组合物进行给药。随后，通过降低作为症状的函数的给药剂量和/或给药频率，来将剂量率降低至能够维持改善的病情的水平。当症状缓解至理想水平，医师可选择停止治疗。但是，一旦疾病症状复发或需要预防治疗计划，患者需要进行间歇性治疗。可在至少一种治疗上有效量的亚叶酸或叶酸给药之前、或同时、或之后，以治疗上有效的量进行的外消旋-氨基蝶呤的给药。
本发明还提供一种用外消旋氨基蝶呤剂量不间断的周期，治疗患者炎症性疾病的方法，其中剂量包括外消旋氨基蝶呤的治疗上的有效量。不间断意味着将外消旋氨基蝶呤剂量对患者进行至少4个周期、12个周期、24个周期的重复给药，优选大于52个周期，其中周期的周期数是不变的，一个周期的最后剂量和下个周期的第一剂量之间的最大持续时间不超过21天、14天，优选不超过7天。在这个定义中，“周期的周期数是不变的”指连续周期的相应剂量之间的持续时间是在12小时范围内的恒定值。例如，如果周期数是7天(即168小时)，那么“周期的周期数是不变的”将意味着连续周期相应剂量之间的持续时间在162-174小时之间变化。此外，在这个定义中，每个周期中外消旋氨基蝶呤剂量的数量范围为1-5，每个单个剂量可能会包括一个或多个剂型。
因此，如将外消旋氨基蝶呤每7天一剂对患者给药，至少4个周期，优选至少52个周期(即一年)。这种情况下，每周期的剂量数仅是单剂量，周期数为7天，一个周期的最后剂量与下个周期的第一剂量之间的最大持续时间为6天。在另一个实施例中，将外消旋氨基蝶呤在周一和周二各给药一剂，至少持续52个周期。这种情况下，每个周期的剂量数是2，周期数是7天，一个周期的最后剂量和下个周期的第一剂量之间的最大持续时间为5天(即周三到周日)。在另一个实施例中，将外消旋氨基蝶呤在早上给药一剂，另一剂在同一周的另某个晚上给药，每个剂量均为两个片剂，至少重复52个周期。在该实施例中，每个周期的剂量数是2，其中每个剂量包括2种剂型，周期数是7天，一个周期的最后剂量和下个周期的第一剂量之间的最大持续时间为6天(即一周内给药日之间)。可以理解其它治疗计划和实施例也在本发明的范围内。例如，在一个实施例中，分别在周一和周三将外消旋氨基蝶呤给药一剂，至少持续52个周期。这种情况下，每个周期的剂量数是2，周期数是7天，一个周期的最后剂量和下个周期的第一剂量之间的最大持续时间为4天(即周四至周日)。优选地，周期数为每周(即7天)。
在另一个实施例中，每周剂量包括外消旋氨基蝶呤的累积剂量，范围为0.001-0.14mg/kg，0.010-0.06mg/kg，最优选0.020-0.06mg/kg。例如，对0.25kg的患者(如老鼠)进行外消旋氨基蝶呤的给药的剂量范围为0.00025-0.035mg，为0.0025-0.015mg，为0.005-0.015mg；而对1.0kg的患者进行外消旋氨基蝶呤的给药的剂量范围为0.001-0.14mg，为0.010-0.06mg，为0.02-0.06mg；而对100kg的患者进行外消旋氨基蝶呤的给药的剂量范围为0.1-14.0mg，为1.0-6.0mg，为2.0-6.0mg。对于典型的60kg的成年人，每周剂量包括外消旋氨基蝶呤的累积剂量，范围为0.06-8.4mg，0.6-3.6mg，最优选1.2-3.6mg。
本发明还提供一种采用综合疗法治疗患者疾病的方法，其中包括以外消旋氨基蝶呤或其药学上可接受的盐的治疗上有效的量对患者给药，并且根据解决方法，还包含至少一种其他治疗剂的给药。至少一种其他的治疗剂可在外消旋氨基蝶呤或其药学上可接受的盐给药前、给药同时或给药后给药。至少一种其他治疗剂还包括含有外消旋氨基蝶呤和至少一种其他的治疗剂的单一剂型，和多剂型，其中外消旋氨基蝶呤和至少一种其他的治疗剂分开、但同时给药，或者对多剂型其中两种成分分开但顺序给药。
所述至少一种其他治疗药物可以是，如叶酸、L-氨基蝶呤、亚叶酸、右美沙芬、盐酸美金刚、强的松、cox-2抑制剂、非甾体抗炎药、长春新碱、地塞米松、天门冬酰胺酶、道诺霉素、疏基嘌呤、依托泊苷、阿糖胞苷、阿霉素、顺铂、异环磷酰胺、紫杉醇、5-氟尿嘧啶、卫康醇、他莫昔芬、哌嗪二酮、米托蒽醌、地吖醌、胺噻唑、甲胺蝶呤、替尼泊苷、长春新碱、棘霉素、6-疏基嘌呤、地塞米松、环磷酰胺、可溶性TNF受体、抗-TNF抗体和抗-TNF人源化抗体。在一个实施例中，外消旋氨基蝶呤与L-氨基蝶呤或其药学上可接受的盐同时给药，其中总氨基蝶呤中L-氨基蝶呤的质量含量约为10％-90％，20％-80％，更优选30％-70％。
在优选实施例中，外消旋氨基蝶呤的剂量是0.001-0.3mg/kg，0.010-0.06mg/kg，最优选0.020-0.06mg/kg，适用于综合疗法的治疗方案。优选地，通过以治疗方案中甲氨蝶呤剂量的约8-16％进行外消旋氨基蝶呤的给药，直接用外消旋氨基蝶呤代替使用甲胺蝶呤的治疗方案中的甲氨蝶呤。
在另一个优选实施例中，在使用另一种非甾体抗炎药的治疗方案中，通过以每周口服1-4mg剂量的外消旋氨基蝶呤代替每周给药7-25mg剂量的甲氨蝶呤，从而用外消旋氨基蝶呤代替甲氨蝶呤治疗成人类风湿关节炎。
在另一个实施例中，在使用另一种非甾体抗炎药的治疗方案中，通过以每周口服0.5-2.2mg/m2剂量的外消旋氨基蝶呤代替每周给药4-13mg/m2剂量的甲氨蝶呤，从而用外消旋氨基蝶呤代替甲氨蝶呤治疗幼年类风湿关节炎。在另一个实施例中，在治疗方案中，通过以每周口服1-4mg剂量的外消旋氨基蝶呤代替每周给药15-25mg剂量的甲氨蝶呤来治疗成人牛皮癣。
用叶酸开始制备外消旋氨基蝶呤及其二钠盐，最优选外消旋叶酸，如美国专利7,235,660描述的方法中使用的原料，该专利的公开通过参考纳入此处。或者，使用Piper和Montgomery的方法制备外消旋氨基蝶呤及其二钠盐，使用外消旋的N-(对氨基苯甲酰)-谷氨酸(Piper and Montgomery，J.Org.Chem.42：208，1977；U.S.Patents 4,077,957；4,079,056；and 4,224,446，这些公开通过参考纳入此处)。例如，由容易得到的原料，根据反应方程式1制备外消旋氨基蝶呤。
反应方程式1
如上所述，市售的2，4，5，6-四氨基嘧啶，化合物1，与β-溴代丙酮醛肟浓缩提供2，4-二氨基-6-(溴甲基)蝶啶，化合物2(Taghavi-Moghadam and Pfleiderer，Tet.Lett.38：6835，1997and Taylor and Portnoy，J.Org.Chem.38：806，1973)。或者，可通过化合物1与1，3-二羟基丙酮反应提供2，4-二氨基-6-蝶啶甲醇，化合物5(Baugh and Shaw，J.Org.Chem.29：3610，1964)。化合物5经纯化，并与溴化氢和二溴三苯基磷(Ph3PBr2)在二甲基乙酰胺中反应得到化合物2(Piper and Montgomery，J.Org.Chem.42：208，1977；Piper and Montgomery，J.Heterocycl.Chem.11：279，1974；Piper and Montgomery，U.S.Patent 4,077,957；and Piper andMontgomery，U.S.Patent 4,079,056)。在其他实施例中，可通过化合物1与1，1-二氯丙酮反应生成2，4-二氨基-6-(溴甲基)蝶啶，然后再与溴化物反应生成化合物2(Catalucci，U.S.Patent4,224,446)。
无论其合成路线，化合物2与N-(对氨基苯甲酰)-L/D-谷氨酸(即外消旋N-(对氨基苯甲酰)-谷氨酸)，化合物3浓缩，在二甲基乙酰胺中提供外消旋氨基蝶呤，化合物4(Piper and Montgomery，J.Org.Chem.42：208，1977；Piper and Montgomery，U.S.Patent4,077,957；Piper and Montgomery，U.S.Patent 4,079,056；and Catalucci，U.S.Patent4,224,446)。可用Hutchings等的方法合成化合物3(J.Biol.Chem.1947，pg.343)。简单地说，将对硝基苯甲酰氯在NaOH水溶液中与外消旋谷氨酸进行浓缩。产物对硝基苯甲酰-外消旋-谷氨酸经催化加氢(H2，钯活性炭)还原成化合物3。本领域的技术人员熟知很多将芳香硝基还原成胺的方法。
除了外消旋氨基蝶呤，本发明药物组合物可包含一种或多种药学上可接受的载体及其他可选治疗成分。根据传统的药物复合技术，通过将外消旋氨基蝶呤与一种或多种药物载体紧密混合，来制备药物组合物。外消旋氨基蝶呤通常只占药物组合物总量很小的比例。
药物载体可采取各种各样的形式，取决于用于如口服或肠外(包括静脉注射或注入)给药的所需药物组合物的形式(如“制剂”或“形式”)。在制备口服剂型药物组合物时，常用的任何药物载体均可使用。常用的药物载体包括：如在口服液体制剂(如悬浮液、溶液和酏剂)中包括：水、二醇类、油、酒精、调味剂、防腐剂、着色剂及其类似物；气溶胶；或在口服固体制剂(如粉剂、胶囊和片剂)中，载体包括如淀粉、糖(如乳糖)、微晶纤维素、稀释剂、造粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂及其类似物，相对口服液体制剂，通常优选口服固体制剂。然而，对儿科患者，首选口感宜人的口服液体制剂。
由于片剂和胶囊易于给药，在成人中是最有优势的口服剂型，这种情况下，使用固体药物载体。如有需要，可用标准水性或非水性技术对片剂包衣。肠外剂型可包含活性成分的无菌溶液，在生理缓冲液或无菌水中以其自由基或盐的形式存在。此外，肠外溶液中还可包含防腐剂如苯扎氯铵、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯和氯丁醇。本领域标准参考文献，雷明顿药物科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)中描述了合适的药物载体。
除了上述所列一般剂型，本发明药物组合物可通过控释手段和/或输送装置给药，如美国专利3,845,770；3,916,899；3,536,809；3,598,123；3,630,200；4,008,719；4,687,660和4,769,207中的描述，这些专利的公开通过参考纳入此处。
可选地，药物组合物还包括其它治疗成分。加入这些治疗成分可减轻某些副作用，特别是外消旋氨基蝶呤的副作用，或者可减少患者必须服用的剂型数从而方便患者。用于与药物组合物结合的合适的治疗成分包括，如叶酸、亚叶酸、强的松、cox-2抑制剂、非甾体抗炎药、长春新碱、地塞米松、天门冬酰胺酶、道诺霉素、疏基嘌呤、依托泊苷、阿糖胞苷、阿霉素、顺铂、异环磷酰胺、紫杉醇、5-氟尿嘧啶、卫康醇、他莫昔芬、哌嗪二酮、米托蒽醌、地吖醌、胺噻唑、甲胺蝶呤、替尼泊苷、长春新碱、棘霉素、6-疏基嘌呤、地塞米松、环磷酰胺、可溶性TNF受体、抗体和人源化抗体。
本发明方法和组合物使用的术语“药学上可接受的盐”指由药学上可接受的无毒酸或碱(包括无机酸和碱、有机酸和碱)制备的盐。氨基蝶呤的钠盐或二钠盐是外消旋氨基蝶呤药学上可接受的盐。
由于外消旋氨基蝶呤既有碱性又有酸性，可通过药学上可接受的无毒酸或碱(包括无机酸和有机酸或无机碱和有机碱)来制备其盐。这种盐可包含以下任何阴离子：醋酸根、苯磺酸根、苯甲酸根、樟脑磺酸根、柠檬酸根、富马酸根、葡萄糖酸根、氢溴酸根、盐酸根、乳酸根、马来酸根、扁桃酸根、粘酸根、硝酸根、扑酸根、磷酸根、琥珀酸根、硫酸根和酒石酸根等。这些盐也可包含以下阳离子：铝、钙、锂、镁、钾、钠、锌、苄星青霉素、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、甲葡胺和普鲁卡因。
可使用任何合适的给药途径为患者提供治疗上有效的量的外消旋氨基蝶呤或其药学上可接受的盐，例如，口腔、直肠、肠外、经过皮肤、皮下、肌肉及其它合适的途径。剂型包括片剂、包衣片剂、含片、分散液、悬浮液、溶液、囊片、胶囊和贴剂等。药物组合物包括这些适合口服、直肠给药和肠外(包括皮下、肌肉和静脉)给药的药物组合物，尽管在任何情况下，给药的最合适的途径取决于治疗的疾病的性质和严重程度。最优选的途径是口腔给药。药物组合物可以方便的以单位剂型存在，并按照制药领域任何已知的方法制备。
本发明适合口服的药物组合物可作为离散单元，如胶囊、扁囊剂、或片剂、或气溶胶喷雾剂，每种均包含预定量的药物活性成分，药物活性成分为粉末或颗粒，或溶液或水溶液中的悬浮液，非水液体，水包油型乳液，或油包水型乳液的形式。这些药物组合物可用任何制药方法制备，但所有方法均包含与活性药物成分一起引入至少一种药物载体的步骤。通常，可将活性药物成分与液态药物载体或细磨的固体药物载体，或两种药物载体一起均匀、密切的混合来制备药物组合物，必要时，可将产物塑性为想要的外观。
例如，片剂可选择一种或多种辅助成分，通过压缩或模压来制备。在合适的机器中，通过压缩自由流动形式(如粉末或颗粒)、可选择地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、表面活性剂和分散剂混合的活性药物成分，来制备压缩片剂。在合适的机器中，通过对用惰性稀释剂润湿的粉状化合物的混合物压膜来制备模压片剂。
理想上，每片片剂中含有约0.25-4mg的外消旋氨基蝶呤或其治疗上可接受的盐，每个扁囊剂或胶囊中含有约0.25-4mg外消旋氨基蝶呤或其治疗上可接受的盐。最优选地，片剂、扁囊剂或胶囊含有两种剂量中的一个，约0.25mg或约1mg的外消旋氨基蝶呤或其治疗上可接受的盐。
在其他优选实施例中，其他的剂型含有0.05mg、0.75mg、0.1mg、0.15mg、0.2mg、0.25mg、0.3mg、0.35mg、0.4mg、0.45mg、0.5mg、0.55mg、0.6mg、0.65mg、0.7mg、0.75mg、0.8mg、0.85mg、0.9mg、0.95mg或1.0mg的外消旋氨基蝶呤或其治疗上可接受盐。在其他实施例中剂型是片剂。在另一个实施例中，每周剂量包括口服1至3个任何剂量组合的剂型。上述外消旋氨基蝶呤累积的周剂量可通过特定时间一次给药或一天中多次给药，或多天给药。使用本发明方法，已经发现可向有炎症性疾病却无毒性表现的患者进行外消旋氨基蝶呤的给药，且在最优选实施例中进行不间断给药。在另一个优选实施例中，一种剂型中外消旋氨基蝶呤或其药学上可接受的盐的含量为0.00025-7.0mg，更优选0.00025-0.5mg，更优选0.00025-0.4mg，更优选0.00025-0.3mg，更优选0.00025-0.2mg，更优选0.00025-0.1mg。在优选实施例中，所述剂型为片剂。
实施例1
药物组合物
剂量强度为0.25mg(批号157I0907)和1.0mg(批号387I1100和116I0604)的光学纯、外消旋的、刻痕的、立即释放(IR)的片剂制剂，见表1。
表1
*在任何情况下，片剂中的药物均为二钠盐，所要求的片剂的剂量强度为左旋体或右旋体加左旋体的游离酸(即二酸)当量。
实施例2
片剂制剂中左旋体和右旋体的分析
利用带有手性流动相的等度反相高效液相色谱法确定左旋体片剂制剂(批号387I1100和116I0604)中对映体的纯度，并测定外消旋片剂制剂(批号157I0907)中左旋体与右旋体的相对含量。该方法包括以下步骤：
步骤1：用于高效液相色谱的分析的手性流动相。将L-脯氨酸(1.86g，16mmol，SigmaAldrich product P-0380)和水合硝酸铜(II)(1.86g，8mmol，Sigma Aldrich product 229636)溶解于1L经过滤和脱气的HPLC级水(J.T.Baker product 4218-03)中。使用pH计，用5N NaOH(接近2.5ml)将溶液的pH值调节至6.00。
步骤2：L-氨基蝶呤标准制剂。在二甲基乙酰胺中配制1.0mg/ml的L-氨基蝶呤溶液(Sigma Aldrich product A1784)。将100μl的该溶液加入至900μl的流动相(16mM的L-脯氨酸和8mM水合硝酸铜(II))中稀释10倍，得到用于分析的0.1mg/ml的L-氨基蝶呤标准制剂的溶液。
步骤3：D-氨基蝶呤标准制剂。在二甲基乙酰胺中配制1.0mg/ml的D-氨基蝶呤(实验室合成)溶液。将100μl的该溶液加入至900μl的流动相(16mM的L-脯氨酸和8mM水合硝酸铜(II))中稀释10倍，得到用于分析的0.1mg/ml的D-氨基蝶呤标准制剂的溶液。
步骤4：系统适应性制剂。将在上述流动相中步骤2和步骤3得到的0.1mg/ml的标准溶液各500μl混合，得到L-氨基蝶呤与D-氨基蝶呤50∶50的混合物，提供L-和D-氨基蝶呤的混合物，浓度均为0.05mg/ml。
步骤5：色谱系统。将配备有可变波长检测器(VWD)的液相色谱仪的检测波长设定为370nm，色谱柱为2.0mm x 50mm(即a Phenomenex Gemini，5μm，C18)。等度流动相条件是100％溶剂A(16mM的L-脯氨酸和8mM水合硝酸铜(II)，pH＝6.0)，流速为0.6ml/min。通过使用柱式加热炉，在分析过程中，将柱温保持在60℃。
步骤6：程序
6a：空白基线。向色谱仪进5μl样品稀释液(10％二甲基乙酰胺水溶液)，记录下色谱图和色谱峰的响应。将得到的峰定义为空白进样的峰，并记录峰面积。后续的计算中应扣除这些峰的面积。
6b：标准品和适应性制剂。准备5μl D-氨基蝶呤标准制剂，D-氨基蝶呤标准制剂和系统适应性溶液分别向色谱进样，记录色谱图和色谱峰的响应。记录下基线空白色谱图中不存在的色谱峰面积。以下情况能满足系统适应性：(1)彼此分开的L-氨基蝶呤和D-氨基蝶呤的色谱峰的分辨率R不小于1.5，(2)在纯的D-氨基蝶呤和L-氨基蝶呤标准制剂中没有可辨别的D-氨基蝶呤和L-氨基蝶呤色谱峰，(3)对于D-氨基蝶呤和L-氨基蝶呤50∶50的混合物，其6次重复进样的色谱峰面积的相对标准偏差不大于1.0％，6次进样L-氨基蝶呤与D-氨基蝶呤的平均峰面积比为0.98-1.02。
6c：样品。将片剂制剂浸泡在水中提供1mg/ml的溶液，接着用水将上述溶液稀释10倍作为试验样品。每次进样5μl重复进样3次。计算L-氨基蝶呤与D-氨基蝶呤的平均峰面积。可通过平均值计算各自的百分比。如果没有可辨别的L-氨基蝶呤或D-氨基蝶呤色谱峰，则报告其含量为0％。
表2
使用此程序，确定纯左旋体片剂制剂(批号387I1100和116I0604)中对映体的纯度，并测定外消旋片剂制剂(批号157I0907)中左旋体和右旋体的相对含量，见表2。
实施例3
片剂制剂中氨基蝶呤异构体总量的定量
采用反相高效液相色谱梯度法分析纯左旋体片剂制剂(批号387I1100和116I0604)中和外消旋片剂制剂(批号157I0907)中氨基蝶呤异构体的总量。该方法包括以下步骤：
步骤1：流动相制剂。将100ml 1.0M的三乙基醋酸铵缓冲溶液(1.0M TEAAC，Flukaproduct 90357)溶解于900ml HPLC级水中，配置成1L经过滤和脱气的0.1M的三乙基醋酸铵缓冲溶液，作为溶剂A。1L经过滤和脱气的乙腈用作溶剂B。
步骤2：L-氨基蝶呤标准品。称取一定量(50mg x 565.2/440.4)的L-氨基蝶呤标准品(二钠盐)(即等同于50mg游离酸的量)。将L-氨基蝶呤标准品转移至50ml容量瓶中，用溶剂A溶解至50ml，以提供1.0mg/ml的溶液(游离酸当量)。接着再将100μl该溶液加到900μl溶剂A中，将其稀释10倍，得到0.1mg/ml的溶液。
步骤3：色谱系统。将配备有可变波长检测器(VWD的液相色谱的波长设定为260nm，色谱柱为2.0mm x 50mm(即Phenomenex Gemini5μm，C18)。流动相条件为在超过30分钟的时间中从95％的溶剂A(0.1M TEAAC)：5％溶剂B(乙腈)变至5％溶剂A(0.1M TEAAC)：95％溶剂B，在95％溶剂B状态保持10分钟，并在95％溶剂A：5％溶剂B时重新平衡15分钟。流速为0.200ml/min。
步骤4：程序
4a：基线响应。向色谱仪中进5μl的溶剂A，记录色谱图和色谱峰的响应。获得的色谱峰定义为空白进样中的色谱峰，并记录其峰面积。后续的面积计算中应扣除这些峰的面积。
4b：标准品响应。向色谱仪中进5μl的L-氨基蝶呤标准品，重复进样三次，记录色谱图和平均峰面积响应。标准品在约7分钟的时间流出，并且在非手性方法中，左旋体和右旋体共同流出。
4c：样品响应。将片剂制剂按以下操作溶解在溶剂A中：批号157I0907，每5ml水溶解片剂10片(0.5mg/ml)；批号387I1100和116I0604，每20ml水溶解片剂5片(0.25mg/ml)。经离心后，取每个制剂的上清液，重复进样3次，每次5μl。计算每个片剂中氨基蝶呤的平均峰面积和标准偏差(SD)，再除以标准品的平均峰面积得到每个片剂中氨基蝶呤的含量。
使用此程序，对纯左旋体片剂制剂(批号387I1100和116I0604)和外消旋片剂制剂(批号157I0907)中总的氨基蝶呤进行定量，见表3。
表3
实施例4
药代动力学及在比格犬体内的吸收
对10只(N＝10)比格犬进行药代动力学研究，以测试1片纯左旋体片剂制剂(批号116I0604)，与99mg的微晶纤维素混合的1mg的右旋体，和4片外消旋片剂制剂(批号157I0907)的口服吸收。各制剂均装在硬胶囊中，通过直接的胃部给药。每个制剂的剂量给药由7天的清洗期隔开。10只犬的平均体重是11.3±1.7(SD)kg。
在每次给药前，以及每次给药后0.5h、1h、1.5h、2h、3h、6h、9h和12h，采集含有EDTA作为抗凝血剂的静脉血液样品，用作药代动力学分析。对样品进行离心，收集血浆并冻结用于分析。本研究中并未对尿液采样。采用非手性液相色谱/质谱法(LC/MS)分析(Advion Biosciences，Ithaca，New York)对血浆样品中的氨基蝶呤进行定量。该分析的定量低限(LLOQ)为0.5ng/ml或1.2nM。用手性LC/MS分析可测定动物服用外消旋体后，血浆样品中左旋体和右旋体的含量。
给药的每种剂型的每种对映体的平均血浆浓度(每种剂型N＝10)列于表4中，并在图1、图2、图3用图形方式展示出。这些数据表明：尽管右旋体的系统暴露量约为左旋体系统暴露量的30％(即AUC比)，当分别给药时，左旋体和右旋体均能被有效吸收。然而，当左旋体和右旋体作为外消旋组合同时给药，与左旋体吸收的立体选择性一致，右旋体并没有系统暴露量。
表4
从该研究中得到的含有左旋体的制剂的药代动力学参数(左旋体的给药量为标准剂量)列于表5中。Cmax、AUC(0-12hrs)和AUC∞的值绘制在图4中。意外地，数据表明：与仅含有左旋体的制剂中左旋体的吸收相比，外消旋制剂中的左旋体(三种药代动力学参数P＜0.05，配对t检验)的系统暴露量显著增强(如Cmax、AUC(0-12hrs)和AUC∞所测定的)。
表5
实施例5
药代动力学及在人体内的吸收
通过对21岁或以上，患有中度到重度牛皮癣的男性和女性受试者进行随机、单剂量和两期交叉研究，来对0.25mg外消旋氨基蝶呤片剂(D和L-氨基蝶呤，批号157I0907)与1.0mg参比L-氨基蝶呤片剂(批号387II100)的药代动力学和安全性进行比较。将受试者随机分配到两个平行的组(每组N＝6)中，使其分别摄取1.0mg单剂量的外消旋氨基蝶呤片剂(4×0.25mg片剂)或参比L-氨基蝶呤片剂(1×1.0mg片剂)，得到每个受试者10小时的血液样本。7天后，将两组受试者相互交换至该测试的另一组，分别口服1.0mg单剂量的另一种制剂，再次得到超过10小时的血液样本。
最终结果分析包括血浆中氨基蝶呤的AUC(0-12hrs)、AUC∞和Cmax分析。对血浆做进一步的手性分析，以测定左旋体和右旋体的不同吸收程度。可通过非手性LC/MS分析(Advion Biosciences，Ithaca，New York)对血浆样品中的氨基蝶呤定量。该分析的定量下限(LLOQ)为0.5ng/ml或1.2nM。使用手性LC/MS分析可测定服用外消旋体的动物血浆样品中的左旋体和右旋体的含量。
在犬科动物的例子中，两种制剂的血浆中仅检测到了左旋体，这与外消旋体肠道吸收对左旋体的立体选择性一致。从该研究得到的两种制剂的药代动力学参数列于表6。
表6
Cmax、AUC(0-12hrs)和AUC∞的值绘于图5。意外地，人体与犬体内一样，数据表明：与仅含有左旋体的制剂中左旋体的吸收相比，外消旋体制剂中左旋体的系统暴露量得到了增强(如Cmax、AUC(0-12hrs)和AUC∞所测定的)。
虽然本发明特别提到了某些实施例，但是可以理解在以下权利要求的范围和精神内，普通技术人员可做出修改和变更。

Claims (13)

1.含有占氨基蝶呤总质量的10-90wt％的L-氨基蝶呤或其药学上可接受的盐、以及占氨基蝶呤总质量的10-90wt％的D-氨基蝶呤或其药学上可接受的盐的组合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物为口服给药式药物。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述疾病选自：牛皮癣、关节炎、异位性皮炎、炎症性肠道疾病、支气管肺发育不良和犬异位性皮炎。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述关节炎选自：类风湿关节炎、牛皮癣关节炎。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述类风湿关节炎为幼年类风湿关节炎。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，还包括在综合疗法中使用第二药物。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，第二药物为叶酸。
8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，氨基蝶呤的治疗有效量为患者每千克体重使用小于0.3mg的氨基蝶呤。
9.含有占氨基蝶呤总质量的10-90wt％的L-氨基蝶呤或其药学上可接受的盐、以及占氨基蝶呤总质量的10-90wt％的D-氨基蝶呤或其药学上可接受的盐的组合物在制备用于治疗至少由二氢叶酸还原酶活性调节的疾病的的药物中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，药物的给药方式为口服给药。
11.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述疾病选自：白血病、淋巴瘤、乳腺癌、牛皮癣、关节炎、异位性皮炎、炎症性肠道疾病、支气管肺发育不良和犬异位性皮炎。
12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，所述关节炎选自：类风湿关节炎、牛皮癣关节炎。
13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，所述类风湿关节炎为幼年类风湿关节炎。
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