JP4933440B2 - 経皮デリバリーのための薬剤組成物 - Google Patents

Description

本発明は、メトトレキサート（methotrexate）とＰＴＤ（蛋白質運搬ドメイン(Protein Transduction Domain)）のコンジュゲートを含有する新規な経皮デリバリー薬剤組成物に関するものである。

一般にメトトレキサート（methotrexate）は、細胞内ＤＮＡ合成、細胞の成長及び分裂に必要な葉酸（folic acid）の代謝を阻害するものとして広く知られている。具体的にメトトレキサートは、葉酸の代謝に関係する酵素系中の一つであるジヒドロ葉酸還元酵素（Dihydrofolate reductase：ＤＨＦＲ）の酵素活性を阻害する。このようにメトトレキサートは、細胞増殖を抑制して多様な疾患に適用し得る薬物であって、リウマチ関節炎及び乾癬などのような自己免疫疾患に効果があり、投与後２週程度で症状が緩和されるほど、その薬効が非常に早い。しかし、メトトレキサートは、患者によって深刻な肝毒性、胃腸障害、腎臓及び造血器官の損傷を引き起こす副作用が続けて報告されていて、長期使用は避けられている。また、主に経口投与または注射剤として処方されているが、経口投与の場合、通常、一週間隔で有効薬物２．５ｍｇを１２時間ごとに３回服用しなければならないなど、非常に不便であった。このため、メトトレキサートの薬物伝達効率を増加させその投与量を減少させることにより、副作用を最小化するとともに、注射及び経口投与の不便さを解消できる新しい薬物伝達方法に対する開発の必要性が持続的に要望されてきた。

一方、ＰＴＤ（蛋白質運搬ドメイン）は、宿主細胞内に生理活性分子を浸透させるのに利用される低分子量のペプチドを称するものであり、１９９８年にＨＩＶウイルスの表面蛋白質から発見されたＴＡＴが最初に報告されたＰＴＤである。このＴＡＴ ＰＴＤは分子量１２０ｋＤａ以上の大型蛋白質を短時間内に効率よく細胞内に伝達するものと報告されている。ＴＡＴ ＰＴＤ以降、これと類似の機能を有する他のアミノ酸配列のＰＴＤペプチドが幾つか発見されて、これらを利用した新しい概念の新薬開発及びＤＤＳ研究の方向が提示されており、医薬及び薬学分野の先進国等は新しいＰＴＤの発見、及びこれを用いた新しい新薬開発を目指して多くの努力を注いできた。本発明者等もまた、かかるＰＴＤの開発のために不断の研究を行い、その結果、既に報告されたＰＴＤよりも、in vitro及びin vivoで蛋白質など巨大分子の細胞内伝達に随分優れた効果を示す新規なＰＴＤを開発した（ＰＣＴ／ＫＲ２００３／０００１２１及びＰＣＴ／ＫＲ２００３／０００１２２）。

よって、本発明者等はメトトレキサートの効果的な局所伝達のために、ＰＴＤとメトトレキサートのコンジュゲートを製造し、これを含有する新規な経皮デリバリー薬剤組成物を皮膚上に塗布して結果を観察した。その結果、メトトレキサートが表皮を通過し病巣部位に伝達されて薬理効果を示すという驚くべき事実を確認し、本発明を完成した。

［発明が解決しようとする課題］
本発明の目的は、メトトレキサートとＰＴＤのコンジュゲートを含有する新規な薬剤組成物を提供することにある。

本発明の他の目的は、メトトレキサートを経皮投与により局所伝達する方法を提供することにある。

［課題を解決するための手段］
上記目的を達成するために、本発明は、ペプチドであるＰＴＤ（蛋白質運搬ドメイン）と下記化学式Ｉのメトトレキサート（ＭＴＸ）とのコンジュゲートを提供する。本発明のコンジュゲートは、まずＰＴＤを固相合成法で合成した後、ＭＴＸの−ＣＯＯＨ基とＰＴＤのＮ末端とをペプチド結合で連結することによって収得できる（図１参照）。
式Ｉ

本発明によるＭＴＸ−ＰＴＤは、ＰＴＤの細胞内浸透及び伝達効果によって容易に表皮を通過して病巣部位の細胞内に伝えられ、細胞内に伝えられたコンジュゲートは細胞内の蛋白質分解酵素によって分解され、その結果、分離されたＭＴＸが薬理効果を示す。本発明で使われたＰＴＤは、蛋白質、ペプチド及び化学化合物などを皮膚、眼球または気道を通して体内に伝達する特性が非常に優秀なことから、ＭＴＸとのコンジュゲートとして提供される場合、多様な投与経路を通じて体内の局所部位に伝達されることができる。また、ＭＴＸ−ＰＴＤコンジュゲートは多様なリンカーで連結可能であり、特にリンカーを、特定の分解酵素によって特異的に分解される部位を含ませて構成すれば、ＭＴＸを、目的とする局所部位でより効果的に作用すべくデザインすることができる。リンカーは、治療の目的及び方向の設定によって色々が使用可能であり、局所部位での効果を極大化するためには細胞内で分解され易い−Ｏ−または−Ｓ−Ｓ−の結合を含むリンカーを用いることが望ましい。また、全身的な効果を目的とする場合には、ペプチド結合を含むスペーサー（spacer）概念のリンカーを導入することが望ましい。

本発明においてＰＴＤは本発明者等が開発して特許出願したもので、下記の配列番号１及び配列番号２のペプチドを固相合成法により製作して利用したが、目的の伝達部位及び使用するリンカーによって異なる種類のＰＴＤを利用したり、上記配列番号１及び配列番号２のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むペプチドを本発明の目的のために利用できるのは勿論である。ＰＴＤは、３〜３０個のアミノ酸で構成され、アミノ酸のうち少なくとも３０％以上はアルギニン（arginine）であることが望ましい。
Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg：（配列番号１）
Ala Lys Ala Ala Arg Gln Ala Ala Arg：（配列番号２）

皮膚を通しての薬物伝達には、皮膚の構造的・物理的特性上、色々な制限が伴う。特に、皮膚の最外殻層である角質層は、皮膚の主要構成細胞であるケラチノサイト（keratinocyte）が自然死して皮膚の最外殻層に緻密な構造をなしていて、外部物質の浸透及び水分の蒸発を抑制する。また、汗及び各種脂質によってｐＨ５付近の酸性領域にある。このような角質層を透過するためには分子量が１，０００以下に小さく、親脂質特性を有しなければならない。

本発明による組成物は、組成物の重量を基準に、０．０１％〜０．５％のＭＴＸ−ＰＴＤコンジュゲート、及び薬剤学的担体を含有し、望ましくは、組成物の重量を基準に、３％〜５％のエタノール、５％〜１０％の流動パラフィン、３０％〜４０％のワセリン、５％〜１０％のグリセリン、２０％〜３０％のポリエチレングリコール、及び０．０５％〜０．２％のＭＴＸ−ＰＴＤコンジュゲートを含む。

一具体例において、本発明は、本発明で使われるＰＴＤの細胞内浸透効果に対する測定結果を提示する。ＰＴＤにＦＩＴＣ蛍光物質を連結した複合体を用いて蛍光強度を測定した結果、ＰＴＤがＦＩＴＣを非常に効率よく細胞内に伝達することが確認された。

他の具体例において、本発明は、ＨｅＣａＴ細胞株（入手先：忠南大学皮膚科）を使用してＭＴＸ単独、ＭＴＸ−ＰＴＤコンジュゲート、及びＭＴＸ−ＡＣＡ−ＰＴＤコンジュゲートを用いて、それぞれの細胞増殖抑制効果を分析した。その結果、ＭＴＸ−ＡＣＡ−ＰＴＤが最も優秀な抑制効果を示し、次がＭＴＸ−ＰＴＤコンジュゲートで、ＭＴＸ単独のものは最も低い増殖抑制効果を示した。

また他の具体例において、本発明は、関節炎動物モデルにおけるＭＴＸ−ＡＣＡ−ＰＴＤの薬理効果を測定した。その結果、ＭＴＸ−ＡＣＡ−ＰＴＤの軟膏剤形群（Ｍ３）は、ＭＴＸ−ＡＣＡ−ＰＴＤのＩ．Ｐ．注射群（Ｍ２）及びＭＴＸ単独のＩ．Ｐ．注射群（Ｍ１）とほぼ同じ効果を示すことが確認された（図７、図８及び図９）。また、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α水準と関節炎因子（arthritis factor）に対する測定結果は、ＭＴＸ−ＡＣＡ−ＰＴＤが皮膚を透過して各種炎症細胞及び免疫細胞の活性を効果的に抑制することを示す。

本発明で用語「免疫細胞」とは、Ｔ細胞、Ｂ細胞を意味する。

本発明で用語「炎症細胞」とは、大食細胞（macrophage）、好酸球（eosinophil）、好中球（neutorphil）、好塩基球（basophil）を意味する。

本発明の薬学組成物は、多様な経口または非経口投与の形に剤形化できる。経口投与用剤形には、例えば、錠剤、丸剤、硬・軟質カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳化剤、シロップ剤、顆粒剤、エリキシル剤（elixir）などがあり、これら剤形は有効性分以外に希釈剤（ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース及び／又はグリシンなど）、滑沢剤（シリカ、タルク、ステアリン酸及びそのマグネシウム又はカルシウム塩、及び／又はポリエチレングリコールなど）を含有してもよい。錠剤はまた、マグネシウムアルミニウムシリケート、澱粉ペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及び／又はポリビニールピロリジンなどの結合剤を含有してもよく、場合によって澱粉、寒天、アルギン酸またはそのナトリウム塩のような崩解剤または沸騰混合物、及び／または吸収剤、着色剤、香味剤、及び甘味剤を含有してもよい。

また、トリプトレリックス（triptorelix）−１及びその類似体を有効成分として含有する薬学組成物は非経口投与が可能であり、非経口投与には、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射または胸部内注射などがある。この時、非経口投与用剤形に製剤化するために、上記トリプトレリックス−１及びその類似体を安定剤または緩衝剤とともに水で混合して溶液または懸濁液に調製し、アンプルまたはバイアルの単位投与形に製造することができる。

上記薬学組成物は、滅菌してもよく、及び／又は、防腐剤、安定化剤、水和剤または乳化促進剤、浸透圧調節のための塩及び／又は緩衝剤などの補助剤、及びその他治療的に有用な物質を含有してもよく、通常の方法である混合、顆粒化またはコーティングなどによって製剤化できる。

本発明のペプチドを細胞内に導入するために、蛋白質運搬ドメイン（ＰＴＤ：Protein Transduction Domain）を上記ペプチドと融合し融合蛋白質を生成して利用することができる。蛋白質運搬ドメイン（ＰＴＤ）は、従来知られている任意のＰＴＤが使用できる。

有効成分としてトリプトレリックス−１及びその類似体を、ヒトを含む哺乳動物に対して一日に０．０１〜５００ｍｇ／ｋｇ（体重）、望ましくは０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ（体重）の量で一日に１回または数回にわけて経口または非経口的経路を通じて投与することができる。投与量は、患者の年齢、性別、疾病の軽重によって適宜選択できる。

以下、実施例によって本発明をより詳細に説明する。ただ、下記の実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。

実施例１：ＰＴＤ−ＭＴＸの合成
ＰＴＤ−ＭＴＸを固相反応により合成した。ＰＴＤは、配列番号１（Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg）及び配列番号２（Ala Lys Ala Ala Arg Gln Ala Ala Arg）のペプチドを製造して実験に利用した。アミノ酸はＰＴＤ合成前に反応上で副反応を起こす可能性のある部分を保護（protection）した。Ａ（アラニン）、Ｖ（バリン）、Ｇ（グリシン）、Ｐ（プロリン）等の測鎖は反応性がないので、ＮＨ_２のみＦｍｏｃ（フルオレニルメトキシカルボニル(Fluorenylmethoxy carbonyl)）で保護された製品を使用し、Ｒ（アルギニン）とＹ（チロシン）、Ｋ（リシン）は測鎖反応性がないので、Ｐｍｃ（2,2,5,7,8-ペンタメチルクロマン-6-スルホニル）、ｔＢＵ（t-ブチル）を使用して各々保護した。ＮＨ_２は上記の他の製品と同様にＦｍｏｃ（フルオレニルメトキシカルボニル）で保護した。ＭＢＨＡ樹脂（入手先：Beadtech，cat. No.SHI-B16）（０．１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（ジメチルホルムアルデヒド）に１５分間スエリング（swelling）させた後、ピペリジン：ＤＭＦ（５０：５０）の溶液で１５分間２回にわたって処理しＦｍｏｃを除去した。保護されたアミノ酸０．１５ｍｍｏｌをＤＩＣ（1,3-ジイソプロピル-カルボジイミド(cabodiimide)）０．１５ｍｍｏｌ及びＨＯＢｔ（N-ヒドロキシベンゾトリアゾール）０．１５ｍｍｏｌとＤＭＦ溶液中に混合して３０分間活性化させた後、Ｆｍｏｃが除去されたＭＢＨＡ樹脂と共に混合した上で４時間程度反応させ、これを３回繰り返した。上記の反応を繰り返してＰＴＤ−樹脂のペプチドを合成した。次に、ＭＴＸ（０．１５ｍｍｏｌ）をＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス-ピロリジノ-ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(Benzotriazole-1-yl-oxy-tris-pyrrolidino-phophoniumhexafluorophosphate)）０．１５ｍｍｏｌ、ＨＯＢｔ（N-ヒドロキシベンゾトリアゾール）０．１５ｍｍｏｌとＤＭＦ溶液中に混合して３０分間活性化させた後、完成されたＰＴＤ−樹脂と混合して４時間反応させた。最終的に、ＴＦＡ：Ｈ２Ｏ：ＥＤＴ：チオアニソール（thioanisole）：フェノール（phenol）＝８．２５：０．５：０．２５：０．２５：０．７５の組成の溶液で２４時間反応させてそれぞれのアミノ酸保護基と樹脂を除去した後にＨＰＬＣで分離精製し質量測定した後、ＨＰＬＣ上で分離精製されたＭＴＸ−ＰＴＤコンジュゲートを凍結乾燥することで最終生成物を収得した。

一方、ＰＴＤは、ペプチドとしてα−ｈｅｌｉｘ構造をなしてＭＴＸと融合される場合、ペプチドの３次元的構造に基づいた立体障害効果（steric hindrance effect）によってＭＴＸがその薬効を示すことが非常に難しくなる。よって、本発明者は、ＰＴＤとＭＴＸとの間に、構造的に距離を維持できる直線形のリンカーを導入させてこの問題を解決した。本実験ではリンカーとして、アミノカプロン酸（amino caproic acid）を利用した。固相合成でＡＣＡ−ＰＴＤ−樹脂を同じ工程で合成し、ＰＴＤ−ＭＴＸコンジュゲート合成と同様の方法でＡＣＡ−ＰＴＤ−樹脂に反応させてＰＴＤ−ＡＣＡ−ＭＴＸコンジュゲートを合成した（図４及び図５、配列番号１のＰＴＤを使用したもののみを図示）。

実施例２：経皮デリバリー効果
ＰＴＤの経皮デリバリー効果を測定するために、ＰＴＤに蛍光物質であるＦＩＴＣを化学的に融合しこれを皮膚に伝達して伝達程度を測定した。ＰＴＤ−ＦＩＴＣは、アミノカプロン酸（amino caproic acid）をリンカーに用いて製造した。伝達皮膚には、ヒトの皮膚と表皮（epidermis）の厚さが類似する４日齢の豚の皮膚を使用した。経皮デリバリー実験のための組成物には、ＰＴＤ−ＦＩＴＣを１０ｍＭの濃度になるように（ワセリン：ポリエチレングリコール＝８：２）で構成されたクリーム状の組成物に混合して軟膏剤形に製造して利用した。

４日齢の豚の背中を一般のかみそり機を用いて除毛し、５ｃｍ程度の部位に軟膏剤形を均等に塗布してから２時間経過後に豚を犠牲にして、背中の皮膚を摘出し凍結切断（frozen section）した後、共焦点顕微鏡（confocal microscope）で観察することで皮膚伝達効率を分析した。観察結果、表皮だけでなく真皮（dermis）まで伝達され、この結果から、経皮デリバリーによる薬物伝達の可能性を確認した（図５、配列番号２のＰＴＤは図示省略）。

実施例３：in vitroでのＰＴＤ−ＭＴＸの効果
本実施例ではin vitroでＷＳＴ−１検定（Roche Biochemical）により細胞増殖抑制効果を観察した。

ＰＴＤ−ＭＴＸの細胞増殖抑制効果を分析するために、ＨｅＣａＴ細胞株（入手先：忠南大学皮膚科）を使用して細胞死滅を分析した。９６ウェルプレート上のＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ、抗生剤（GIBCO））培地に細胞（１×１０^６細胞／ウェル）を播種した後に一晩培養して、ＭＴＸ単独、実施例１のＰＴＤ−ＭＴＸコンジュゲート、及びＰＴＤ−ＡＣＡ−ＭＴＸをそれぞれ０．２、１．５、４．４、１３．３、４０μＭの濃度で添加し、２日経過後ＷＳＴ−１検定によって増殖抑制を分析した。

ＷＳＴ−１検定で、テトラゾリウム塩（Tetrazolium salt）は、ミトコンドリアの呼吸鎖に存在し、生存細胞にだけ活性があるコハク酸塩−テトラゾリウム−還元剤（succinate-tetrazolium-reductase）によりホルマザン（formazan）色素に分解され、生存細胞数が増加すれば試料中のミトコンドリア脱水素酵素全体の活性が増加することになり、この酵素活性の増加が、ホルマザン色素の生成増加を導くため、ホルマザン色素と培地中の代謝活性のある細胞の数とは直線的な相関を示すことになる。ＥＬＩＳＡリーダで色素溶液の吸光度を測定することにより、代謝活性のある細胞が作りだすホルマザン色素を定量し、細胞増殖能力や細胞生存能力を観察した。

実験結果、細胞増殖抑制効果は、ＭＴＸ単独＜ＰＴＤ−ＭＴＸ＜ＰＴＤ−ＡＣＡ−ＭＴＸの順に分析された。既存の酵素テストでＰＴＤ−ＭＴＸコンジュゲートがＭＴＸ単独に比べて低い効果を示したものと対比される上記の結果は、i）ＰＴＤによってＭＴＸの細胞内伝達効果が増進され、またii）ＰＴＤの細胞内代謝作用により、ＰＴＤによる立体障害効果が除去されたためであると思われる。また、本発明で製造したＭＴＸとＰＴＤのコンジュゲートは、ＭＴＸの活性部位を保存していることから、ＰＴＤによる障害効果は無視できるものと判断される（図６、配列番号２のＰＴＤは図示省略）。

実施例４：関節炎動物モデルにおけるＰＴＤ−ＡＣＡ−ＭＴＸの効果
ＰＴＤ−ＡＣＡ−ＭＴＸコンジュゲートによる薬理効果のin vivo検証のために、ＤＢＡ／１Ｊマウス（入手先：samtaco）にコラーゲンｅＩＩ型（入手処：sigma）を注射してリウマチ関節炎を誘発した。試験群は、実施例１に沿って製造したＰＴＤ−ＡＣＡ−ＭＴＸコンジュゲートＩ．Ｐ．注射群、実施例１で製造したＰＴＤ−ＡＣＡ−ＭＴＸコンジュゲートの経皮投与用組成物、ＭＴＸ単独のＩ．Ｐ．注射群に区分した。注射群はＭＴＸを基準に０．３ｍｇ／ｋｇの容量で４週間注射し、経皮投与用組成物は組成物重量を基準に、５％のエタノール、１５％の流動パラフィン、４０％のワセリン、０．１％のＰＴＤ−ＡＣＡ−ＭＴＸコンジュゲート、１０％のグリセリン、及び３０％のポリエチレングリコールで構成されたクリーム状の組成物を、リウマチが誘発された関節部位に週に４回塗布した。薬物処理後、関節炎指数（arthritis index）を週に１回モニターリングし、４週後動物を犠牲にして血液内ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよび関節炎因子（arthritis factor）水準を測定した（図７、図８及び図９、各図で配列番号２のＰＴＤを使用したものの結果は図示省略）。図７、図８及び図９において、Ｎは正常マウス、ＣＴはコラーゲンを注射してリウマチ関節炎を誘発させたマウス、Ｍ１はＭＴＸ単独のＩ．Ｐ．注射群、Ｍ２はＰＴＤ−ＡＣＡ−ＭＴＸのＩ．Ｐ．注射群、Ｍ３はＰＴＤ−ＡＣＡ−ＭＴＸの軟膏剤形群である。

その結果、最近リウマチ関節炎において最も重要視されているＴＮＦ−αのような炎症媒介サイトカイン（cytokine）の量は大幅減少し、組織（tissue）写真でも炎症部位に浸透した炎症細胞が薬物処理によって大きく減少したことが確認された。これは、ＰＴＤ−ＡＣＡ−ＭＴＸが皮膚を透過して各種炎症細胞及び免疫細胞の活性を効果的に抑制したことを示す（図８、配列番号２のＰＴＤを使用した結果は図示省略）。図８において、上段の写真はＨ＆Ｅ染色法、下段の写真はＭ−Ｔ染色法を使用しての染色後写真であり、Ｎｏｒｍａｌ ＤＢＡ／１Ｊはsamtacoから入手した正常のＤＢＡ／１Ｊマウス、ＣＩＡ ｃｏｎｔｒｏｌはコラーゲンｅＩＩ型を注射してリウマチ関節炎を誘発させたマウス、Ｍ１はＭＴＸ単独のＩ．Ｐ．注射群、Ｍ２はＰＴＤ−ＡＣＡ−ＭＴＸのＩ．Ｐ．注射群、Ｍ３はＰＴＤ−ＡＣＡ−ＭＴＸの軟膏剤形群である。

実施例５：炎症疾患モデルでのＰＴＤ−ＡＣＡ−ＭＴＸの効果
乾癬に対する治療効果を確認するために、実施例１で製造したＰＴＤ−ＡＣＡ−ＭＴＸコンジュゲートを使用して皮膚炎症に対する治療効果を分析した。ＩＣＲマウス（入手先：samtaco）の耳にＴＰＡ（12-O-テトラデカノイルホルボール-13-アセテート，Alexisbiochemical，San Diego）を３日間、毎日１回塗布して皮膚炎症を誘発した。実験開始５日後に耳の厚さを計器（マイクロメータースクリュー(micrometer screw)）測定し膨潤した厚さを計算して慢性浮腫（edema）の尺度として用い、耳をパンチングして炎症部位の炎症細胞を分析した。ＰＴＤ−ＡＣＡ−ＭＴＸ含有の経皮投与用組成物を皮膚に塗布した。経皮投与用組成物は上記の実施例と同様に製造し、１日に１回ずつ１０日間塗布した（図１１）。

実施例６：ラットを利用した単回皮下投与毒性試験
実施例１のＰＴＤ−ＡＣＡ−ＭＴＸの単回皮下投与による毒性を調べた。Sprague Dawley（ＳＤ、購入先：samtaco）系統の雌雄ラットに滅菌注射用水を投与した賦形剤対照群と、本発明のコンジュゲートを５、５０及び５００ｍｇ／ｋｇ投与した試験物質投与群を設定して試験した。各群別動物の数は１０匹（雌雄各５匹）とし、２週間の死亡率、一般症状、体重変化及び剖検所見を調べた。あらゆる試験方法は、韓国食品医薬品安全庁の毒性試験指針に沿って行い、その試験結果は次の通りである。
i）試験期間中、試験物質による死亡動物は観察されなかった。
ii）雌雄５００ｍｇ／ｋｇ投与群で、試験物質により投与１日目から鬱血が観察され、２日目から痂皮形成が観察された。雄５００ｍｇ／ｋｇ投与群では全身的な浮腫も観察された。また、投与後４日目から６日目まで散発的に下痢及び軟便が観察された。
iii）体重変化において、試験物質により雄５００ｍｇ／ｋｇ投与群で３日目、７日目及び１４日目に体重増加の抑制が観察された。
iv）剖検所見では、雌雄５００ｍｇ／ｋｇ投与群で試験物質により投与部位における痂皮形成及び赤い液体貯留が観察され、雌では脾臓の肥大が観察された。

以上の結果から、本試験条件の下で本発明によるコンジュゲートのラットへの皮下投与では、５００ｍｇ／ｋｇ投与群での最小致死量（MLD）が５００ｍｇ／ｋｇを上回ることと判断された。

実施例７：ビーグル犬（Beagle dog）を利用した単回皮下投与毒性試験
本発明のコンジュゲートの単回投与による毒性を調べた。雌雄のビーグル犬に本発明のコンジュゲートを各々４、２０及び１００ｍｇ／ｋｇずつ皮下投与した。各群別動物の数は４匹（雌雄各２匹）であり、２週間の死亡率、一般症状、体重変化及び剖検所見を調べた。あらゆる試験方法は韓国食品医薬品安全庁の毒性試験指針に沿って行い、試験結果は次の通りである。
i）試験期間中、試験物質による死亡動物は観察されなかった。
ii）雌雄２０ｍｇ／ｋｇ以上投与群の全体において、試験物質投与後１時間目から６時間目まで眼瞼の浮腫が観察され、１００ｍｇ／ｋｇ投与群では雌雄各１匹で投与後１時間目から自発運動減少が観察された。また、雄２０ｍｇ／ｋｇ投与群中の１匹の浮腫と、雌１００ｍｇ／ｋｇ投与群中の１匹の浮腫及び自発運動減少が、投与後２日目まで持続した。雄１００ｍｇ／ｋｇ投与群では、投与後２日目から４日目まで食欲不振があり、投与後３日目には下痢が観察された。
iii）体重変化において、試験物質により雌雄とも１００ｍｇ／ｋｇ投与群において、投与後３日目に一時的な体重増加の抑制が観察された。
iv）剖検所見で、異常所見は観察されなかった。

要するに、本試験条件の下で本発明によるコンジュゲートのビーグル犬への皮下投与では、雌雄２０ｍｇ／ｋｇ以上の投与群において眼瞼の浮腫が観察され、雄１００ｍｇ／ｋｇ投与群では自発運動減少、及び一時的な食欲低下と下痢が、雌１００ｍｇ／ｋｇ投与群では自発運動減少が、また雄１００ｍｇ／ｋｇ投与群では投与後３日目に一時的な体重減少が観察された。以上の結果から、皮下投与による最小致死量は、雌雄とも１００ｍｇ／ｋｇを上回ることが分かった。

実施例８：ウサギを利用した皮膚刺激試験
本発明のコンジュゲートによる皮膚刺激性を調べた。ニュージーランドホワイト系の白色ウサギの健常皮膚及び擦過皮膚に適用して、本発明のコンジュゲートを適用しなかった健常皮膚及び擦過皮膚と反応を比較評価した。
i）一般症状で、試験物質の適用による異常は観察されなかった。
ii）体重変化において、試験物質の適用による異常変化は観察されなかった。
iii）試験物質の適用後、観察期間中には正常部位及び擦過部位において如何なる異常も観察されなかった。
iv）皮膚刺激性の評価結果、本試験物質の皮膚刺激指数は０で非刺激性物質に該当した。対照物質の場合、皮膚刺激指数は０.１７で非刺激性物質に該当した。

本試験条件の下で本発明のコンジュゲートは、ニュージーランドホワイト系白色ウサギの皮膚に対しての皮膚刺激試験の結果、非刺激性物質に該当した。

上記した通り、本発明によるメトトレキサートとＰＴＤのコンジュゲートを含有する経皮デリバリー薬剤組成物は、この組成物を簡便に皮膚に塗布するだけで、副作用を最小化するとともにメトトレキサートを病巣部位に効果的に伝達することができる。

図１は、ペプチド結合によるメトトレキサート（ＭＴＸ；methotrexate）とＰＴＤ（蛋白質運搬ドメイン）のコンジュゲート（ＭＴＸ−ＰＴＤ）の製造を示す図面である。 図２は、本発明によるＭＴＸ−ＰＴＤコンジュゲートに対するＨＰＬＣ結果を示す図面である。 図３は、本発明で使われたＰＴＤの経皮デリバリーを表す共焦点顕微鏡写真である。 図４は、本発明で使われたＰＴＤの経皮デリバリーを表す共焦点顕微鏡写真である。 図５は、本発明によるＭＴＸ−ＰＴＤの細胞増殖抑制効果を示すグラフである。 図６は、本発明によるＭＴＸ−ＰＴＤの処理に伴う関節炎指数（arthritis index）の変化を示すグラフである。 図７は、本発明によるＭＴＸ−ＰＴＤの処理後の血液内ＩＬ−４及びＩＦＮ−γの含有量を示すグラフである。 図８は、本発明によるＭＴＸ−ＰＴＤの処理後の血液内ＩＬ−６及びＴＮＦ−αの含量を示すグラフである。 図９は、本発明によるＭＴＸ−ＰＴＤの処理後の血液内関節炎因子（RA factor）を示すグラフである。 図１０は、本発明によるＭＴＸ−ＰＴＤの処理後の炎症部位組織を表す写真である。 図１１は、ＴＰＡ誘発炎症動物モデルでのＭＴＸ−ＰＴＤの浮腫抑制効果を示すグラフである。

Claims (4)

1. ０．０１ｗｔ％〜０．５ｗｔ％のメトトレキサートと配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるＰＴＤ（蛋白質運搬ドメイン）とのコンジュゲート、及び賦形剤を含有する自己免疫疾患を治療するための経皮用医薬組成物であって、
   ここで、ＰＴＤとメトトレキサートが、直接的な共有結合、ペプチド結合またはアミノカプロン酸により互いに連結されている、経皮用医薬組成物。
2. 自己免疫疾患が乾癬またはリウマチ関節炎である、請求項１に記載の経皮用医薬組成物。
3. メトトレキサートの投与を必要とする患者の皮膚に医薬組成物を塗布することにより、メトトレキサートの経皮デリバリーを行うための、請求項１に記載の医薬組成物。
4. 経皮デリバリーにより免疫細胞及び炎症細胞の活性を抑制するための、メトトレキサートと配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるＰＴＤとのコンジュゲートであって、
   ここで、ＰＴＤとメトトレキサートが、直接的な共有結合、ペプチド結合またはアミノカプロン酸により互いに連結されている、コンジュゲート。

Images