JP6585099B2 - α−メラニン形成細胞刺激ホルモンのペプチド類似体 - Google Patents

Description

本発明はペプチド類似体に関する。具体的には、本発明は、メラノコルチン１受容体（ＭＣ１Ｒ）に対する選択性を有するネイティブα−メラニン形成細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）のペプチド類似体、その薬学的調製物、ならびに医学的および獣医学的状態の処置におけるこれらの類似体の使用に関する。

神経ペプチドとは、身体全体に広く分布しており、神経伝達物質から成長因子までの機能を有する小さな生物活性ペプチドである。多くの証拠により、神経ペプチドが抗炎症能力を有することが示されている。多くの神経ペプチドのうちには、メラノコルチン（ＭＣ）受容体と結合してそれを刺激するメラノコルチンペプチド（メラノコルチン）が存在する。メラノコルチンの例としては、主に末梢色素沈着を調節するその能力が知られているが、抗炎症能力および免疫調節能力を有することも知られている、α−メラニン形成細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）が挙げられる。α−ＭＳＨ神経ペプチドはいくつかの臓器中で検出されており、ニューロン、下垂体、腸、皮膚、および免疫細胞によって産生される。

α−ＭＳＨの免疫調節能力は、ハプテン特異的な寛容をα−ＭＳＨの注射によって誘導した接触過敏症のモデル、および細菌内毒素媒介性炎症の抑制において実証されている。また、α−ＭＳＨは、炎症性腸疾患、関節炎、および実験的心臓移植などの多くの動物疾患モデルにおいて治療活性を有することが示されている。脳炎症、腎傷害および肝炎症の他の動物モデルにより、この神経ペプチドの抗炎症性効果が実証されている。α−ＭＳＨは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、およびＩＬ−１などの炎症誘発性サイトカインの産生を抑制し、マクロファージおよび好中球の炎症部位への遊走を減少させるケモカインを阻害する。一酸化窒素（ＮＯ）は様々な形態の炎症の共通の媒介物質である。内毒素に刺激されたマクロファージおよび好中球によるＮＯ合成も、α−ＭＳＨによって阻害されることが示されている。サイトカイン産生に対するその効果に加えて、α−ＭＳＨは、抗原提示および同時刺激を生じさせる単球および樹状細胞上のＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８６およびＣＤ４０の発現をダウンレギュレートする。また、α−ＭＳＨは、免疫抑制効果の重要な構成要素であると考えられている、単球中でのインターロイキン１０（ＩＬ−１０）の形成を増加させることでも知られている。

α−ＭＳＨの免疫調節効果の分子機構は完全には理解されていないが、α−ＭＳＨの潜在的な作用機構は、細胞中での核因子−κＢの活性化を阻害するその能力である。ＮＦ−κＢの阻害は、マクロファージによる炎症誘発性サイトカインの産生および一酸化窒素の合成の抑制をもたらす。α−ＭＳＨは、７つの膜貫通ドメインを有するＧ−タンパク質−共役型受容体の群に属する特定の受容体と結合することによって機能する。これらの受容体には、マクロファージ上のメラノコルチン１およびメラノコルチン３受容体（ＭＣＲ−１およびＭＣＲ−３）が含まれ、それによってα−ＭＳＨの結合がＮＦ−κＢを阻害する。また、α−ＭＳＨの免疫調節効果の多くは、ｃＡＭＰの蓄積によっても媒介される。α−ＭＳＨのメラノコルチン受容体への結合はｃＡＭＰレベルを増加させ、これにより、ＩκＢの分解が抑制され得、したがってＮＦ−κＢの転位および一酸化窒素の産生が阻害され得る。

ＭＣ１受容体（α−ＭＳＨがこれに結合して刺激する）は、様々な抗炎症性および免疫調節性の応答に関連づけられている。５種類のメラノコルチン受容体、ＭＣ１〜ＭＣ５が同定されている。ＭＣ１受容体は、メラニン形成細胞、黒色腫細胞、マクロファージ、好中球、神経膠腫細胞、星状細胞、単球、内皮細胞、ならびに脳、精巣、および卵巣の特定の領域上に存在することが見出されている。ＭＣ１受容体を刺激し、有効な抗炎症性および免疫調節性の応答を生じさせる化合物および方法に関する興味が依然として存在する。

本明細書中では、メラノコルチン１受容体（ＭＣ１Ｒ）と選択的に結合する実質的に純粋な化合物または薬学的に許容されるその塩を提供し、前記化合物は、配列Ｈｉｓ Ｘａａ_１ Ａｒｇ Ｔｒｐ（配列番号１）もしくはＤ−Ｔｒｐ Ｄ−Ａｒｇ Ｘａａ_２ Ｄ−Ｈｉｓ（配列番号２）を有するコアテトラペプチドを含む［式中、Ｘａａ_１は、Ｄ−Ｃｈａ、Ｄ−ＰｈｅまたはＣｈａであり、Ｘａａ_２は、Ｄ−Ｃｈａ、Ｄ−ＰｈｅまたはＰｈｅである］。一部の実施形態では、Ｃ末端の配列は、Ｄ−Ｓｅｒ Ｄ−Ｉｌｅ Ｄ−Ｉｌｅ
Ｄ−Ｓｅｒ Ｄ−Ｓｅｒ（配列番号３）である。

本明細書中では、メラノコルチン１受容体（ＭＣ１Ｒ）と選択的に結合する実質的に純粋な化合物または薬学的に許容されるその塩をさらに提供し、前記化合物は、以下の配列を有するポリペプチドを含む：
Ｘａａ_１ Ｘａａ_２ Ｘａａ_３ Ｘａａ_４ Ｘａａ_５ Ｘａａ_６ Ｘａａ_７ Ｘａａ_８ Ｘａａ_９ Ｘａａ_１０ Ｘａａ_１１ Ｘａａ_１２ Ｘａａ_１３
［式中、Ｘａａ_１は、Ｄ−Ｖａｌ、Ｄ−ＡｌａまたはＤ−Ｌｙｓであり、
Ｘａａ_２は、Ｄ−Ｐｒｏ、Ｄ−ＡｌａまたはＤ−Ｌｙｓであり、
Ｘａａ_３は、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｏｒｎ、Ｄ−Ｎｌｅ、Ｄ−ＡｌａまたはＤ−Ｌｙｓであり、
Ｘａａ_４は、Ｇｌｙ、またはＤ−Ａｌａであり、
Ｘａａ_５は、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｔｒｐ、Ｄ−３−ベンゾチエニル−Ａｌａ、Ｄ−５−ヒドロキシ−Ｔｒｐ、Ｄ−５−メトキシ−Ｔｒｐ、Ｄ−Ｐｈｅ、またはＤ−Ａｌａであり、
Ｘａａ_６は、Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｈｉｓ、またはＤ−Ａｌａであり、
Ｘａａ_７は、Ｄ−Ｃｈａ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ、Ｄ−４−フルオロ−Ｐｈｇ、Ｄ−３−ピリジル−Ａｌａ、Ｄ−Ｔｈｉ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｄ−４−ニトロ−Ｐｈｅ、またはＤ−Ａｌａであり、
Ｘａａ_８は、Ｄ−Ｈｉｓ、Ｈｉｓ、Ｄ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ、またはＤ−Ａｌａであり、
Ｘａａ_９は、Ｄ−Ｇｌｕ、Ｄ−Ａｓｐ、Ｄ−シトルリン、Ｄ−Ｓｅｒ、またはＤ−Ａｌａであり、
Ｘａａ_１０は、Ｄ−Ｍｅｔ、Ｄ−ブチオニン、Ｄ−Ｉｌｅ、またはＤ−Ａｌａであり、
Ｘａａ_１１は、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｄ−ＩｌｅまたはＤ−Ａｌａであり、
Ｘａａ_１２は、Ｄ−Ｔｙｒ、Ｄ−Ｓｅｒ、またはＤ−Ａｌａであり、
Ｘａａ_１３は、Ｄ−ＳｅｒまたはＤ−Ａｌａであり、
Ｘａａ_１〜３がすべてＤ−Ａｌａである場合以外は、１個以下のＸａａ_１〜１３がＤ−Ａｌａであり、
１個以下のＸａａ_１〜１３がＬ−アミノ酸である］。

さらに別の態様では、本明細書中では、以下の配列を有するポリペプチドを含む実質的に純粋な化合物または薬学的に許容されるその塩を提供する：
Ｄ−Ｖａｌ Ｄ−Ｐｒｏ Ｄ−Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｄ−Ｔｒｐ Ｄ−Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｄ−Ｈｉｓ Ｄ−Ｓｅｒ Ｄ−Ｉｌｅ Ｄ−Ｉｌｅ Ｄ−Ｓｅｒ Ｄ−Ｓｅｒ（配列番号４）、
Ｄ−Ｖａｌ Ｄ−Ｐｒｏ Ｄ−Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｄ−Ｔｒｐ Ｄ−Ａｒｇ Ｄ−Ｃｈａ Ｄ−Ｈｉｓ Ｄ−Ｓｅｒ Ｄ−Ｉｌｅ Ｄ−Ｉｌｅ Ｄ−Ｓｅｒ Ｄ−Ｓｅｒ（配列番号５）、Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｃｈａ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｖａｌ（配列番号６）、または
Ｄ−Ｖａｌ Ｄ−Ｐｒｏ Ｄ−Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｄ−Ｔｒｐ Ｄ−Ａｒｇ Ｄ−Ｐｈｅ Ｄ−Ｈｉｓ Ｄ−Ｇｌｕ Ｄ−Ｍｅｔ Ｄ−Ｓｅｒ Ｄ−Ｔｙｒ Ｄ−Ｓｅｒ（配列番号７）。

一部の実施形態では、本明細書中で提供するポリペプチドはＰＥＧ化されている。

一部の実施形態では、本明細書中で提供する化合物は、生物活性部分とコンジュゲートさせることができる。

一部の実施形態では、本明細書中で提供する化合物はＭＣ１Ｒと選択的に結合する。一部の実施形態では、化合物は、以下の特性、すなわち、ＭＣ１Ｒを選択的に活性化する能力、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの血漿中における安定性、およびプロテアーゼ分解に対する耐性のうちの少なくとも１つを示す。

一態様では、本明細書中では、本明細書中で提供する実質的に純粋な化合物のうちの任意の１つと薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物を提供する。

別の態様では、本明細書中では、被験体に、薬学的に許容される賦形剤と治療上有効な量の本明細書中で提供する化合物とを含む薬学的組成物を投与することを含む、自己免疫疾患または状態を処置することを必要としている被験体における自己免疫疾患または状態を処置する方法を提供する。一部の実施形態では、自己免疫疾患または状態は、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、再生不良性貧血、グレーブス病、セリアック病、クローン病、ループス、関節炎、骨関節炎、自己免疫性ブドウ膜炎および重症筋無力症からなる群から選択される。

さらに別の態様では、本明細書中では、被験体に、薬学的に許容される賦形剤と治療上有効な量の本明細書中で提供する化合物とを含む薬学的組成物を投与することを含む、炎症を処置することを必要としている被験体における炎症を処置する方法を提供する。一部の実施形態では、炎症は、炎症性腸疾患、関節リウマチ、アレルギー、アテローム性動脈硬化症、乾癬、胃炎および虚血性心疾患からなる群から選択される疾患に関連している。

一態様では、本明細書中では、被験体に、薬学的に許容される賦形剤と治療上有効な量の本明細書中で提供する化合物とを含む薬学的組成物を投与することを含む、移植片拒絶を減少させるかまたは阻害することを必要としている被験体における移植片拒絶を減少させるかまたは阻害する方法を提供する。

別の態様では、本明細書中では、被験体に、薬学的に許容される賦形剤と治療上有効な量の本明細書中で提供する化合物とを含む医薬品を投与することを含む、黒色腫を処置することを必要としている被験体における黒色腫を処置する方法を提供する。

さらに別の態様では、本明細書中では、被験体に、薬学的に許容される賦形剤と、治療上有効な量の、抗腫瘍ペイロードとコンジュゲートさせた本明細書中で提供する化合物を含むコンジュゲートとを含む医薬品を投与することを含む、黒色腫を処置することを必要としている被験体における黒色腫を処置する方法を提供する。抗腫瘍ペイロードは、放射性核種、放射線増感剤、光増感剤、化学療法剤、または毒素であることができる。

さらなる態様では、本明細書中では、本明細書中で提供する化合物の薬学的組成物および任意選択で使用説明書を含むキットを提供する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
メラノコルチン１受容体（ＭＣ１Ｒ）と選択的に結合する実質的に純粋な化合物または薬学的に許容されるその塩であって、該化合物は、以下の配列：
Ｈｉｓ Ｘａａ_１ Ａｒｇ Ｔｒｐ（配列番号１）またはＤ−Ｔｒｐ Ｄ−Ａｒｇ Ｘａａ_２ Ｄ−Ｈｉｓ（配列番号２）
［式中、Ｘａａ_１は、Ｄ−Ｃｈａ、Ｄ−ＰｈｅまたはＣｈａであり、
Ｘａａ_２は、Ｄ−Ｃｈａ、Ｄ−ＰｈｅまたはＰｈｅである］
を有するコアテトラペプチドを含む、化合物または薬学的に許容されるその塩。
（項目２）
配列：Ｄ−Ｓｅｒ Ｄ−Ｉｌｅ Ｄ−Ｉｌｅ Ｄ−Ｓｅｒ Ｄ−Ｓｅｒ（配列番号３）を有するＣ末端ポリペプチドを含む、項目１に記載の化合物。
（項目３）
メラノコルチン１受容体（ＭＣ１Ｒ）と選択的に結合する実質的に純粋な化合物または薬学的に許容されるその塩であって、該化合物は、以下の配列：
Ｘａａ_１ Ｘａａ_２ Ｘａａ_３ Ｘａａ_４ Ｘａａ_５ Ｘａａ_６ Ｘａａ_７ Ｘａａ_８ Ｘａａ_９ Ｘａａ_１０ Ｘａａ_１１ Ｘａａ_１２ Ｘａａ_１３
［式中、Ｘａａ_１は、Ｄ−Ｖａｌ、Ｄ−ＡｌａまたはＤ−Ｌｙｓであり、
Ｘａａ_２は、Ｄ−Ｐｒｏ、Ｄ−ＡｌａまたはＤ−Ｌｙｓであり、
Ｘａａ_３は、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｏｒｎ、Ｄ−Ｎｌｅ、Ｄ−ＡｌａまたはＤ−Ｌｙｓであり、
Ｘａａ_４は、Ｇｌｙ、またはＤ−Ａｌａであり、
Ｘａａ_５は、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｔｒｐ、Ｄ−３−ベンゾチエニル−Ａｌａ、Ｄ−５−ヒドロキシ−Ｔｒｐ、Ｄ−５−メトキシ−Ｔｒｐ、Ｄ−Ｐｈｅ、またはＤ−Ａｌａであり、
Ｘａａ_６は、Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｈｉｓ、またはＤ−Ａｌａであり、
Ｘａａ_７は、Ｄ−Ｃｈａ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ、Ｄ−４−フルオロ−Ｐｈｇ、Ｄ−３−ピリジル−Ａｌａ、Ｄ−Ｔｈｉ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｄ−４−ニトロ−Ｐｈｅ、またはＤ−Ａｌａであり、
Ｘａａ_８は、Ｄ−Ｈｉｓ、Ｈｉｓ、Ｄ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ、またはＤ−Ａｌａであり、
Ｘａａ_９は、Ｄ−Ｇｌｕ、Ｄ−Ａｓｐ、Ｄ−シトルリン、Ｄ−Ｓｅｒ、またはＤ−Ａｌａであり、
Ｘａａ_１０は、Ｄ−Ｍｅｔ、Ｄ−ブチオニン、Ｄ−Ｉｌｅ、またはＤ−Ａｌａであり、
Ｘａａ_１１は、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｄ−ＩｌｅまたはＤ−Ａｌａであり、
Ｘａａ_１２は、Ｄ−Ｔｙｒ、Ｄ−Ｓｅｒ、またはＤ−Ａｌａであり、
Ｘａａ_１３は、Ｄ−ＳｅｒまたはＤ−Ａｌａであり、
Ｘａａ_１〜３がすべてＤ−Ａｌａである場合以外は、１個以下のＸａａ_１〜１３がＤ−Ａｌａであり、
１個以下のＸａａ_１〜１３がＬ−アミノ酸である］
を有するポリペプチドを含む、化合物または薬学的に許容されるその塩。
（項目４）
以下の配列を有するポリペプチドを含む項目３に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩：
Ｘａａ_１ Ｘａａ_２ Ｘａａ_３ Ｘａａ_４ Ｘａａ_５ Ｘａａ_６ Ｘａａ_７ Ｘａａ_８ Ｘａａ_９ Ｘａａ_１０ Ｘａａ_１１ Ｘａａ_１２ Ｘａａ_１３
［式中、Ｘａａ_１は、Ｄ−Ｖａｌであり、
Ｘａａ_２は、Ｄ−Ｐｒｏであり、
Ｘａａ_３は、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−ＯｒｎまたはＤ−Ｎｌｅであり、
Ｘａａ_４は、Ｇｌｙであり、
Ｘａａ_５は、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｔｒｐ、Ｄ−３−ベンゾチエニル−Ａｌａ、Ｄ−５−ヒドロキシ−Ｔｒｐ、Ｄ−５−メトキシ−Ｔｒｐ、またはＤ−Ｐｈｅであり、
Ｘａａ_６は、Ｄ−ＡｒｇまたはＤ−Ｈｉｓであり、
Ｘａａ_７は、Ｄ−Ｃｈａ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ、Ｄ−４−フルオロ−Ｐｈｇ、Ｄ−３−ピリジル−Ａｌａ、Ｄ−Ｔｈｉ、Ｄ−Ｔｒｐ、またはＤ−４−ニトロ−Ｐｈｅであり、
Ｘａａ_８は、Ｄ−Ｈｉｓ、Ｈｉｓ、Ｄ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ、またはＤ−Ａｌａであり、
Ｘａａ_９は、Ｄ−Ｇｌｕ、Ｄ−Ａｓｐ、Ｄ−シトルリンまたはＤ−Ｓｅｒであり、
Ｘａａ_１０は、Ｄ−Ｍｅｔ、Ｄ−ブチオニンまたはＤ−Ｉｌｅであり、
Ｘａａ_１１は、Ｄ−ＳｅｒまたはＤ−Ｉｌｅであり、
Ｘａａ_１２は、Ｄ−ＴｙｒまたはＤ−Ｓｅｒであり、
Ｘａａ_１３は、Ｄ−Ｓｅｒであり、
１個以下のＸａａ_１〜１３がＬ−アミノ酸である］。
（項目５）
以下の配列を有するポリペプチドを含む項目３に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩：Ｘａａ_１ Ｘａａ_２ Ｘａａ_３ Ｘａａ_４ Ｘａａ_５ Ｘａａ_６ Ｘａａ_７ Ｘａａ_８ Ｘａａ_９ Ｘａａ_１０ Ｘａａ_１１ Ｘａａ_１２ Ｘａａ_１３
［式中、Ｘａａ_１は、Ｄ−Ｖａｌであり、
Ｘａａ_２は、Ｄ−Ｐｒｏであり、
Ｘａａ_３は、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−ＯｒｎまたはＤ−Ｎｌｅであり、
Ｘａａ_４は、Ｇｌｙであり、
Ｘａａ_５は、Ｄ−ＴｒｐまたはＴｒｐであり、
Ｘａａ_６は、Ｄ−Ａｒｇであり、
Ｘａａ_７は、Ｄ−Ｃｈａ、Ｄ−Ｐｈｅ、ＰｈｅまたはＤ−Ｔｈｉであり、
Ｘａａ_８は、Ｄ−ＨｉｓまたはＨｉｓであり、
Ｘａａ_９は、Ｄ−ＧｌｕまたはＤ−Ｓｅｒであり、
Ｘａａ_１０は、Ｄ−Ｍｅｔ、Ｄ−ブチオニンまたはＤ−Ｉｌｅであり、
Ｘａａ_１１は、Ｄ−ＳｅｒまたはＤ−Ｉｌｅであり、
Ｘａａ_１２は、Ｄ−ＴｙｒまたはＤ−Ｓｅｒであり、
Ｘａａ_１３は、Ｄ−Ｓｅｒであり、
１個以下のＸａａ_１〜１３がＬ−アミノ酸である］。
（項目６）
以下の配列を有するポリペプチドを含む実質的に純粋な化合物または薬学的に許容されるその塩：
Ｄ−Ｖａｌ Ｄ−Ｐｒｏ Ｄ−Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｄ−Ｔｒｐ Ｄ−Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｄ−Ｈｉｓ Ｄ−Ｓｅｒ Ｄ−Ｉｌｅ Ｄ−Ｉｌｅ Ｄ−Ｓｅｒ Ｄ−Ｓｅｒ（配列番号４）、
Ｄ−Ｖａｌ Ｄ−Ｐｒｏ Ｄ−Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｄ−Ｔｒｐ Ｄ−Ａｒｇ Ｄ−Ｃｈａ
Ｄ−Ｈｉｓ Ｄ−Ｓｅｒ Ｄ−Ｉｌｅ Ｄ−Ｉｌｅ Ｄ−Ｓｅｒ Ｄ−Ｓｅｒ（配列番号５）、
Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｃｈａ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｇｌｙ
Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｖａｌ（配列番号６）、もしくは
Ｄ−Ｖａｌ Ｄ−Ｐｒｏ Ｄ−Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｄ−Ｔｒｐ Ｄ−Ａｒｇ Ｄ−Ｐｈｅ
Ｄ−Ｈｉｓ Ｄ−Ｇｌｕ Ｄ−Ｍｅｔ Ｄ−Ｓｅｒ Ｄ−Ｔｙｒ Ｄ−Ｓｅｒ（配列番号７）。
（項目７）
前記ポリペプチドがＰＥＧ化されている、項目１、３、４、５または６に記載の化合物。（項目８）
ＭＣ１Ｒと選択的に結合する、項目６に記載の化合物。
（項目９）
ＭＣ１Ｒを選択的に活性化する能力、
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの血漿中における安定性、または
プロテアーゼ分解に対する耐性
の特性うちの少なくとも１つを示す、項目１、３、４、５または６に記載の化合物。
（項目１０）
項目１、３、４、５または６に記載の化合物と薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物。
（項目１１）
生物活性部分とコンジュゲートしている、項目１、３、４、５または６に記載の化合物。（項目１２）
被験体に、薬学的に許容される賦形剤と治療上有効な量の項目１、３、４、５または６に記載の化合物とを含む薬学的組成物を投与する工程を含む、自己免疫疾患または状態の処置を必要としている該被験体における自己免疫疾患または状態を処置する方法。
（項目１３）
前記自己免疫疾患または状態が、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、再生不良性貧血、グレーブス病、セリアック病、クローン病、ループス、関節炎、骨関節炎、自己免疫性ブドウ膜炎および重症筋無力症からなる群から選択される、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
被験体に、薬学的に許容される賦形剤と治療上有効な量の項目１、３、４、５または６に記載の化合物とを含む薬学的組成物を投与する工程を含む、炎症の処置を必要としている該被験体における炎症を処置する方法。
（項目１５）
前記炎症が、炎症性腸疾患、関節リウマチ、アレルギー、アテローム性動脈硬化症、乾癬、胃炎および虚血性心疾患からなる群から選択される疾患に関連している、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
被験体に、薬学的に許容される賦形剤と治療上有効な量の項目１、３、４、５または６に記載の化合物とを含む薬学的組成物を投与する工程を含む、移植片拒絶を減少させるかまたは阻害することを必要としている該被験体において移植片拒絶を減少させるかまたは阻害する方法。
（項目１７）
被験体に、薬学的に許容される賦形剤と治療上有効な量の項目１、３、４、５または６に記載の化合物とを含む医薬品を投与する工程を含む、黒色腫の処置を必要としている該被験体における黒色腫を処置する方法。
（項目１８）
被験体に、薬学的に許容される賦形剤と、治療上有効な量の、抗腫瘍ペイロードとコンジュゲートさせた項目１、３、４、５または６に記載の化合物を含むコンジュゲートとを含む医薬品を投与する工程を含む、黒色腫の処置を必要としている該被験体における黒色腫を処置する方法。
（項目１９）
前記抗腫瘍ペイロードが放射性核種、放射線増感剤、光増感剤、化学療法剤、または毒素である、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
項目１０に記載の薬学的組成物と任意選択で使用説明書とを含むキット。

図１は、ネイティブα−ＭＳＨによるブドウ膜炎の減少を示す。図１Ａは、臨床スコアが２〜３となった場合にＢ１０．ＲＩＩＩマウスを１日１回のＩＶのネイティブα−ＭＳＨ（１００μｇ／マウス）で処置したデータを示す。ブドウ膜炎は無処置の対照と比較して有意に減少した（ｐ＜０．０１）。図１Ｂは、Ｂ１０．ＲＩＩＩマウスを臨床スコアが１〜２となった場合に１日１回のＩＰのネイティブα−ＭＳＨ（１００μｇ／マウス）またはＩＰのデキサメタゾン（０．２ｍｇ／ｋｇまたは２．０ｍｇ／ｋｇ）で処置したデータを示す（ｎ＝５）。網膜炎症は処置開始後に減少した（ｐ＜０．０５）。アスタリスクは対照からの有意差を示す。 図２は、ＲＩ α−ＭＳＨおよびネイティブα−ＭＳＨによる、後期疾患におけるブドウ膜炎の寛解を例示する。Ｂ１０．ＲＩＩＩマウスでＥＡＵを誘導し、マウスが後期疾患に達した（スコア３）１２日目に、１００μｇ／マウスのネイティブα−ＭＳＨ、ＲＩ α−ＭＳＨまたはＰＢＳを１日１回、ｉ．ｖ．で投与した。図２Ａは、ネイティブα−ＭＳＨまたはレトロ−ＲＩ α−ＭＳＨで処置したマウスが、ＰＢＳ対照マウスと比較してブドウ膜炎の疾患眼スコアの減少を示したデータを示す。図２Ｂは、ＥＡＵ誘導後の１６日目における、各群中のマウスの個々の最大眼スコアを示す（ｎ＝８）。アスタリスクは群間の有意差を示す（ｐ＜０．０５）。 図３は、α−ＭＳＨまたはＲＩ α−ＭＳＨで処置した動物からの網膜画像および個々の眼スコアを示す。Ｂ１０．ＲＩＩＩマウスでＥＡＵを誘導し、１００μｇ／マウスのネイティブα−ＭＳＨ、ＲＩ α−ＭＳＨまたはＰＢＳを用いた１日１回のｉ．ｖ．処置を、マウスが後期疾患に達した１３日目に開始した。１３日間の処置後における各群からの中央値眼スコアを表す網膜の眼底検査画像を示す（ｎ＝１１）。眼スコア３を有するＰＢＳで処置したマウスは、眼のいくつかの四分円における炎症性病変および視神経に近位の血管炎を示す（図３Ａ）。眼スコア１を有するα−ＭＳＨおよびＲＩ α−ＭＳＨで処置したマウスは、視神経の周りにのみ炎症を有し、ブドウ膜炎の回復を示す（それぞれ図３Ｂおよび３Ｃ）。網膜は、各群からの中央値眼スコアを表す。処置後の１３日目における各群中のマウスの個々の眼スコアをグラフに示す。アスタリスクは群間の有意差を示す（ｐ＜０．０１）。 図４は、ＥＡＵにおけるＲＩ α−ＭＳＨおよびネイティブα−ＭＳＨで処置したマウスの組織病理学を例示する。雌のＢ１０．ＲＩＩＩマウスにＩＲＢＰ＋ＣＦＡを注射してＥＡＵを誘導した。マウスは、マウスが眼スコア３に達した際に、１００μｇ／マウスのレトロ−インバーソα−ＭＳＨ、ネイティブα−ＭＳＨ、またはＰＢＳを用いて１日１回、ｉ．ｖ．で処置した。ＲＩ α−ＭＳＨまたはα−ＭＳＨで処置したマウスの群は、眼球炎症応答が寛解していた（ｐ＜０．０５）。写真は、ＰＢＳ（図４Ａ）、α−ＭＳＨ（図４Ｂ）およびＲＩ α−ＭＳＨ（図４Ｃ）で処置したマウスの群からの中央値眼スコアを表す、処置開始の１０日後の眼のヘマトキシリンおよびエオシン染色を示す。拡大率は１００×である。 図５は、スクランブルペプチド対照と比較した、ブドウ膜炎に対するレトロ−インバーソα−ＭＳＨの１日１回の腹腔内投薬の効果を示す。Ｂ１０．ＲＩＩＩマウスを、疾患誘導後の１１日目に、１００μｇのＲＩ α−ＭＳＨまたはスクランブルＤアミノ酸ペプチド対照を用いて１日１回の腹腔内注射によって処置した。データは、ＲＩ α−ＭＳＨ（ｎ＝４）およびスクランブル対照ペプチド（ｎ＝５）で処置したマウスの群の臨床的平均眼スコアを示す。マウスは合計１３日間処置した。データは２つの実験の代表的なものである。アスタリスクは群間の有意差を示す（ｐ＜０．０４）。 図６は、網膜炎症の処置におけるＲＩ α−ＭＳＨの有効性を例示する。Ｂ１０ＲＩＩＩマウスを、臨床スコアが４となった際に、ＲＩ α−ＭＳＨ（３、１０、または１００μｇ／マウス）を用いて１日１回ＩＰ注射によって処置した。スクランブルペプチド対照は、１００μｇ／マウスで１日１回注射した。グラフは経時的な臨床スコアを示す。１００または１０μｇ／マウスを用いた処置開始後に網膜炎症の減少が観察された。より低い用量のＲＩ α−ＭＳＨ（３μｇ／マウス）またはＰＢＳもしくは対照スクランブルペプチドで処置したマウスでは、限られた有益な臨床応答が観察された（ｎ＝４）。アスタリスクは群間の有意差を示す（ｐ＜０．０５）。 図７は、ネズミ黒色腫細胞におけるｃＡＭＰ産生に対するＲＩ α−ＭＳＨの効果を示す。０．０１ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌの濃度のネイティブα−ＭＳＨ、レトロ−インバーソα−ＭＳＨまたはスクランブル対照ペプチドを用いて細胞を処置した後に、ｃＡＭＰをＢ１６−Ｆ１黒色腫細胞で測定した。図７Ａは、ネイティブα−ＭＳＨおよびＲＩ α−ＭＳＨがどちらもｃＡＭＰレベルを有意に増加させたことを示す。ｃＡＭＰを測定するために使用した対照には、１００μＭの濃度のフォルスコリンが含まれていた。図７Ｂはアラニン走査データを示す。ネズミＢ１６−Ｆ１黒色腫細胞系において、１μｇ／ｍｌのＲＩ α−ＭＳＨのアラニン置換ペプチドをｃＡＭＰレベルの増加について試験した。データは２つの実験の代表的なものである。配列のリストは表１に示す。アスタリスクは群間の有意差を示す（ｐ＜０．０１）。 図８は、ＭＯＧで誘導したＥＡＥの疾患の過程を例示する。ＭＯＧ３５−５５ペプチド（２００μｇ／マウス）およびＣＦＡの乳剤を注射することによって、Ｃ５７ＢＬ／６マウスでＥＡＥを誘導した。百日咳毒素を０日目および２日目に注射した。１００μｇ／マウスのα−ＭＳＨ、ＲＩ α−ＭＳＨ、またはＰＢＳを用いた１日１回のｉ．ｐ．処置を１０日目に開始した。図８Ａは、１日１回記録した臨床的疾患スコアを示す。図８Ｂは、疾患誘導後の２０日目の各群中の個々の疾患スコアを示す。 図９は、ＲＩ α−ＭＳＨによる平均ＥＡＥ疾患スコアの減少を示す。ＭＯＧ３５−５５ペプチド（２００μｇ／マウス）およびＣＦＡの乳剤を注射することによって、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＥＡＥを誘導した。百日咳毒素を０日目および２日目に注射した。１００μｇもしくは３０μｇ／マウスのα−ＭＳＨもしくはＲＩ α−ＭＳＨ、２ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾン、またはＰＢＳを用いた１日１回のｉ．ｐ．処置を、１０日目に開始した。臨床的疾患スコアを１日１回記録した。 図１０は、ＲＩ α−ＭＳＨで処置したマウスの脊髄組織学を例示する。ＭＯＧ３５−５５ペプチド（２００μｇ／マウス）およびＣＦＡの乳剤を注射することによって、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＥＡＥを誘導した。百日咳毒素を０日目および２日目に注射した。１００μｇ／マウスのＲＩ α−ＭＳＨを用いた１日１回のｉ．ｐ．処置を１０日目に開始した。脊髄を疾患誘導後の２４日目に収集した。各群から２匹の代表的なマウス、すなわち、ＰＢＳで処置したマウス（図１０ａおよび１０ｃ）ならびにＲＩ α−ＭＳＨで処置したマウス（図１０ｂおよび１０ｄ）を示す。矢印は炎症細胞の浸潤の部位を示す。 図１１は、ＥＡＥの疾患期中のＭＯＧペプチドで初回抗原刺激したマウスの脾臓中の、ＴＮＦαおよびＩＬ−１０のｍＲＮＡの量を示す。０日目にマウスを２００μｇのＭＯＧペプチドで初回抗原刺激し、１０〜１５日目にＰＢＳ、α−ＭＳＨ（１００μｇ）またはＲＩ α−ＭＳＨ（１００μｇ）を用いて１日１回処置した。脾臓を処置開始後の１日目（図１１ａおよび１１ｂ）、４日目（図１１ｃおよび１１ｄ）ならびに７日目（図１１ｅおよび１１ｆ）に採取し、定量的ＰＣＲによって、ＴＮＦαおよびＩＬ−１０のｍＲＮＡの発現について分析した。データは各処置群中の４匹のマウスの平均を示す。ＲＮＡレベルはβ−アクチンに対して正規化した。 図１２は、ＭＯＧ３５−５５ペプチドに対する復活応答を例示する。０日目にマウスを２００μｇのＭＯＧ３５−５５ペプチドで初回抗原刺激した。２〜８日目に、マウスにＰＢＳ、１００μｇのα−ＭＳＨまたは１００μｇのＲＩ α−ＭＳＨをｉ．ｐ．注射した（ｎ＝５）。９日目に、脾臓（図１２ａ）およびリンパ節（図１２ｂ）の細胞を採取し、２５μｇ／ｍｌのＭＯＧ３５−５５ペプチドまたはＯＶＡペプチドを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激した。培養の３日目に、細胞に［３Ｈ］チミジンをパルスした。データは平均±ＳＤを示す。ＭＯＧペプチドで刺激した脾臓細胞培養物から２４時間後に上清を収集し、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮγ（図１２ｃ）ならびにＭＣＰ−１（図１２ｄ）のサイトカインレベルをフローサイトメトリーによって分析した。データは平均±ＳＤを示す。ナイーブマウスはＭＯＧペプチドで初回抗原刺激しなかった。 図１３は、ＭＯＧで初回抗原刺激したマウスにおけるＲＩ α−ＭＳＨ処置後の血清および脾臓のサイトカインプロフィールを例示する。０日目にマウスを２００μｇのＭＯＧ３５−５５ペプチドで初回抗原刺激した。２〜８日目に、マウスにＰＢＳ、１００μｇのα−ＭＳＨまたは１００μｇのＲＩ α−ＭＳＨをｉ．ｐ．注射した（ｎ＝５）。９日目に脾臓および血清を収集した。図１３ａおよび１３ｂは、リアルタイムＰＣＲによって定量した、それぞれ脾臓中のＴＮＦ−αおよびＩＬ−１０のｍＲＮＡレベルを示す。データは各処置群中の４匹のマウスの平均を示す。ＲＮＡレベルはβ−アクチンに対して正規化した。また、血清はフローサイトメトリーによってサイトカインレベルについても分析した。図１３ｃは、ＴＮＦ−α、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６の血清レベルを示し、図１３ｄはＩＬ−１０およびＩＬ−１２の血清レベルを示す。ナイーブマウスはＭＯＧペプチドで初回抗原刺激しなかった。データは平均±ＳＤを示す。 図１４は、マクロファージマーカーに対するα−ＭＳＨおよびＲＩ α−ＭＳＨの効果を示す。マウスを、ｉｎ ｖｉｖｏでＭＯＧペプチドを用いて初回抗原刺激し、１〜７日目にα−ＭＳＨまたはＲＩ α−ＭＳＨ（１００μｇ／マウス）で１日１回処置した。脾臓マクロファージをＣＤ１４、ＣＤ４０およびＣＤ８６の発現レベルについてフローサイトメトリーによって分析した。細胞をＣＤ１１ｂ^＋（図１４ａ）またはＦ４／８０^＋（図１４ｂ）のマクロファージ細胞集団のどちらかについてゲートした。データは、ゲートされたマクロファージ集団の両方の平均陽性率を示す（ｎ＝５）。 図１５は、腹膜マクロファージ（図１５ａ）および脾臓（図１５ｂ）の両方における、ＬＰＳで誘導したｍＭＣ１ＲのｍＲＮＡレベルの増加を例示する。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝４）にＬＰＳ（１μｇ／マウス）をｉ．ｐ．注射した。腹膜マクロファージおよび脾臓を０．５時間、１時間、および２４時間に採取した。ｍＭＣ１ＲのｍＲＮＡレベルをリアルタイムＰＣＲによって定量した。ＲＮＡレベルは１８ｓに対して正規化した。 図１６は、ｉｎ ｖｉｖｏ ＬＰＳ炎症モデルにおけるＭＳＨの効果を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１μｇのＬＰＳをｉ．ｐ．注射した。３０分後、マウスを、デキサメタゾン（２ｍｇ／ｋｇ）およびα−ＭＳＨ（図１６ａ〜１６ｃ）またはＲＩ α−ＭＳＨ類似体８９１（図１６ｄ〜１６ｆ）でｉ．ｐ．処置した。ＬＰＳ免疫誘発の２時間後に血清を収集した。ＴＮＦ−α（図１６ａおよび１６ｄ）、ＭＣＰ−１（図１６ｂおよび１６ｅ）、ならびにＩＬ−１０（図１６ｃおよび１６ｆ）のレベルを、フローサイトメトリーによる細胞数測定ビーズアッセイによって分析した。データは、個々のサイトカインの測定および各群の平均を示す（ｎ＝６）。 図１６は、ｉｎ ｖｉｖｏ ＬＰＳ炎症モデルにおけるＭＳＨの効果を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１μｇのＬＰＳをｉ．ｐ．注射した。３０分後、マウスを、デキサメタゾン（２ｍｇ／ｋｇ）およびα−ＭＳＨ（図１６ａ〜１６ｃ）またはＲＩ α−ＭＳＨ類似体８９１（図１６ｄ〜１６ｆ）でｉ．ｐ．処置した。ＬＰＳ免疫誘発の２時間後に血清を収集した。ＴＮＦ−α（図１６ａおよび１６ｄ）、ＭＣＰ−１（図１６ｂおよび１６ｅ）、ならびにＩＬ−１０（図１６ｃおよび１６ｆ）のレベルを、フローサイトメトリーによる細胞数測定ビーズアッセイによって分析した。データは、個々のサイトカインの測定および各群の平均を示す（ｎ＝６）。 図１７は、血漿および血清中におけるＲＩ−α−ＭＳＨおよびα−ＭＳＨの安定性を例示する。図１７Ａは、血漿およびＰＢＳ中、３７℃でのＲＩ−α−ＭＳＨおよびα−ＭＳＨペプチドの安定性を示す。図１７Ｂは、単回の静脈内注射後のＲＩ−α−ＭＳＨおよびα−ＭＳＨペプチドの血清半減期を示す。 図１８は、ＭＳＨ（図１８Ａ）およびＲＩ−ＭＳＨ（図１８Ｂ）とメラノコルチン受容体１、３、４および５との結合研究の結果を示す。 図１９は、コアテトラペプチドＨｆＲＷおよびレトロインバーソＭＳＨの反転を示す。 図２０は、ＲＩ−ＭＳＨの様々な位置における非天然アミノ酸残基の置換を例示する。 図２０は、ＲＩ−ＭＳＨの様々な位置における非天然アミノ酸残基の置換を例示する。 図２０は、ＲＩ−ＭＳＨの様々な位置における非天然アミノ酸残基の置換を例示する。 図２１は、ＭＣ１ＲにおけるＲＩ−ＭＳＨの代表的な競合的結合アッセイおよびその変形を例示する。 図２２は、Ｂ１６ Ｆ１ネズミ黒色腫細胞におけるｃＡＭＰレベルに対するＲＩ α−ＭＳＨ類似体の効果を例示する。図２２Ａ：類似体８９０、８９１および８９２、図２２Ｂ：類似体８９３、８９４および８９５、図２２Ｃ：類似体８８０、８８６および８７８、ならびに図２２Ｄ：類似体８７２、８７８および８６９。 図２２は、Ｂ１６ Ｆ１ネズミ黒色腫細胞におけるｃＡＭＰレベルに対するＲＩ α−ＭＳＨ類似体の効果を例示する。図２２Ａ：類似体８９０、８９１および８９２、図２２Ｂ：類似体８９３、８９４および８９５、図２２Ｃ：類似体８８０、８８６および８７８、ならびに図２２Ｄ：類似体８７２、８７８および８６９。

定義
本方法のα−ＭＳＨおよびＭＣ１Ｒタンパク質および核酸は、特定の供給源または種に限定されない。したがって、タンパク質および核酸は、単離したものまたは組換えであることができる。

α−メラニン形成細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）とは、配列Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ
Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｖａｌ（配列番号８）（ＳＹＳＭＥＨＦＲＷＧＫＰＶ）を含むポリペプチドである。α−ＭＳＨは抗炎症能力および免疫調節能力について最近検討されている。α−ＭＳＨは、プロオピオメラノコルチンホルモン（ＰＯＭＣ）の細胞内タンパク質分解的切断から生じる。α−ＭＳＨ神経ペプチドはいくつかの臓器中で検出されており、ニューロン、下垂体、腸、皮膚、および免疫細胞によって産生される。α−ＭＳＨは、エフェクターＴ細胞機能を抑制する、調節性Ｔ細胞を誘導する、ならびに自己免疫および移植モデルにおいて有益な効果を有することが報告されている。

「コンジュゲート」または「コンジュゲート」には、付着、接続、カップリング、複合体形成または他の様式で互いに会合している、２つ以上のメンバーが含まれる。メンバーは、共有結合、イオン結合、静電気、水素結合、ファンデルワールス相互作用または物理的手段によって互いに接続していてよい。

「生物活性」部分には、生理的応答を誘発または調節する分子または化合物が含まれる。一態様では、生物活性化合物はメラノコルチン受容体、好ましくはＭＣ１受容体を刺激する。

「調節する」および「調節」とは、発現、レベル、または活性が、モジュレーターの非存在下で観察されるものよりも高いまたは低いように、１つまたは複数のタンパク質またはタンパク質サブユニットの活性をアップレギュレートまたはダウンレギュレートすることを意味する。たとえば、用語「調節する」とは、「阻害する」または「刺激する」ことを意味することができる。

「Ｃ末端配列」には、必ずではないが典型的にはカルボキシル基によって終わる、アミノ酸鎖の末端への言及が含まれる。ペプチド配列を記載する慣習は、Ｃ末端を右側に置き、配列をＮ末端からＣ末端へと記載することである。Ｃ末端配列は、１〜１００個のアミノ酸、好ましくは２〜１５個のアミノ酸、さらにより好ましくは３〜１０個のアミノ酸を含み得る。Ｃ末端配列はカルボキシル基で終わってもよく、または、末端は、機能的メンバー（たとえば、標的化基、保留シグナル、脂質、およびアンカー）を含むように当分野で周知の方法によって修飾し得る。

本発明は「実質的に純粋な化合物」を提供する。本明細書中で使用する用語「実質的に純粋な化合物」とは、それが天然で会合している他のタンパク質、脂質、炭水化物、核酸、および他の生体物質を実質的に含まない、ポリペプチド（たとえば、ＭＣ１Ｒと結合するポリペプチド、またはその断片）などの分子を記載するために使用される。たとえば、実質的に純粋なポリペプチドなどの分子は、乾重量で目的分子の少なくとも６０％である場合がある。ポリペプチドの純度は、たとえば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（たとえばＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、カラムクロマトグラフィー（たとえば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））、およびアミノ末端アミノ酸配列分析を含めた標準的な方法を用いて決定することができる。

一実施形態では、語句「選択的に結合する」とは、本発明で作製または使用する化合物またはポリペプチドが、２つ以上の受容体（たとえば、メラノコルチン受容体、ＭＣ１、ＭＣ２、ＭＣ３、ＭＣ４、ＭＣ５受容体）の混合物の存在下にある場合に、１種類の受容体に別の種類の受容体よりも優先的に結合することを意味する。

「アミノ酸」または「アミノ酸配列」には、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質配列、またはこれらのうちの任意のものの断片、一部分、もしくはサブユニット、および天然に存在するまたは合成の分子が含まれる。用語「ポリペプチド」および「タンパク質」には、ペプチド結合または修飾ペプチド結合によって互いに接続したアミノ酸、すなわちペプチドアイソスターが含まれ、２０種の遺伝子によってコードされるアミノ酸以外の修飾アミノ酸が含有され得る。また、用語「ポリペプチド」には、ペプチドおよびポリペプチド断片、モチーフなども含まれる。アミノ酸の大文字の一文字の略記は天然のＬ−異性体を指す。アミノ酸の小文字の一文字の略記はＤ−異性体を示す。

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、互換性があるように使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。ペプチドおよびポリペプチドは、アミノ酸の合成の非天然類似体から完全に構成されるか、または、一部が天然のペプチドアミノ酸で一部がアミノ酸の非天然類似体のキメラ分子であることができる。一態様では、ポリペプチドを本発明の組成物、細胞系またはプロセス（たとえば、本発明の少なくとも１つの酵素を発現するプラスミドを有する宿主細胞）において使用する。さらに、ポリペプチドは、別の官能基（たとえば、可溶化基、標的化基、ＰＥＧ、非アミノ酸基、または他の治療剤）と共有結合したアミノ酸のポリマーを含む化合物をいうことができる。

アミノ酸は括弧内の以下の記号を用いて略し得る：プロリン（Ｐｒｏ）、バリン（Ｖａｌ）、リシン（Ｌｙｓ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、グリシン（Ｇｌｙ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、アラニン（Ａｌａ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、セリン（Ｓｅｒ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、４−フルオロ−Ｄ−フェニルグリシン（４−フルオロ−Ｄ−Ｐｈｇ）、２−チエニル−Ｄ−アラニン（Ｄ−Ｔｈｉ）。

本明細書中で使用する「処置」、「処置すること」、「処置する」または「療法（治療）」とは、哺乳動物に、個体において予防的、治癒的または他の有益な効果を誘発することができる薬剤を投与することをいう。処置は、被験体において疾患または疾患の症状を減弱または寛解させることをさらにもたらし得る。

別段に指示しない限りは、本明細書中で使用する単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には複数形の言及が含まれる。たとえば、「１つの（ａ）」標的細胞には１つまたは複数の標的細胞が含まれる。

本発明のポリペプチド組成物は、非天然構造的構成要素の任意の組合せを含有することができる。個々のペプチド残基は、たとえば、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、二官能性マレイミド、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）またはＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）などの、ペプチド結合、他の化学結合またはカップリング手段によって接続していてよい。伝統的なアミド結合（「ペプチド結合」）の連結の代替となることができる連結基には、たとえば、ケトメチレン（たとえば、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−には−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ_２−）、アミノメチレン（ＣＨ_２−ＮＨ）、エチレン、オレフィン（ＣＨ＝ＣＨ）、エーテル（ＣＨ_２−Ｏ）、チオエーテル（ＣＨ_２−Ｓ）、テトラゾール、チアゾール、レトロアミド、チオアミド、またはエステルが含まれる（たとえば、本明細書中に参考として組み込まれているＳｐａｔｏｌａ（１９８３）、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、第７巻、２６７−３５７ページ、「Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹを参照）。

本発明の方法を実施するために使用するポリペプチドは、翻訳後プロセッシング（たとえば、リン酸化、アシル化など）等の天然のプロセスによって、または化学修飾技術によって修飾することができ、生じる修飾されたポリペプチド。修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端を含めた、ポリペプチド中の任意の箇所で起こり得る。同じ種類の修飾が、同じまたは異なる度合で、所定のポリペプチド中のいくつかの部位に存在することを理解されたい。また、所定のポリペプチドは多種類の修飾を有し得る。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋結合環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋結合の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ＰＥＧ化、タンパク質分解性プロセッシング、リン酸化、プレニル化、セレノイル化、硫酸化、およびアルギニル化などの転移ＲＮＡに媒介されるタンパク質へのアミノ酸の付加が含まれる。たとえば、本明細書中に参考として組み込まれている、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、第２版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、ニューヨーク（１９９３）、Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１−１２ページ（１９８３）を参照されたい。

化合物のさらなる実施形態
一部の実施形態では、本明細書中で提供する発明は、メラノコルチン１受容体（ＭＣ１Ｒ）と選択的に結合する実質的に純粋な化合物または薬学的に許容されるその塩であり、前記化合物は、以下の配列を有するポリペプチドを含む：
Ｘａａ_１ Ｘａａ_２ Ｘａａ_３ Ｘａａ_４ Ｘａａ_５ Ｘａａ_６ Ｘａａ_７ Ｘａａ_８ Ｘａａ_９ Ｘａａ_１０ Ｘａａ_１１ Ｘａａ_１２ Ｘａａ_１３
［式中、Ｘａａ_１は、Ｄ−Ｖａｌ、Ｄ−ＡｌａまたはＤ−Ｌｙｓであり、
Ｘａａ_２は、Ｄ−Ｐｒｏ、Ｄ−ＡｌａまたはＤ−Ｌｙｓであり、
Ｘａａ_３は、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｏｒｎ、Ｄ−Ｎｌｅ、Ｄ−ＡｌａまたはＤ−Ｌｙｓであり、
Ｘａａ_４は、Ｇｌｙ、またはＤ−Ａｌａであり、
Ｘａａ_５は、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｔｒｐ、Ｄ−３−ベンゾチエニル−Ａｌａ、Ｄ−５−ヒドロキシ−Ｔｒｐ、Ｄ−５−メトキシ−Ｔｒｐ、Ｄ−Ｐｈｅ、またはＤ−Ａｌａであり、
Ｘａａ_６は、Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｈｉｓ、またはＤ−Ａｌａであり、
Ｘａａ_７は、Ｄ−Ｃｈａ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ、Ｄ−４−フルオロ−Ｐｈｇ、Ｄ−３−ピリジル−Ａｌａ、Ｄ−Ｔｈｉ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｄ−４−ニトロ−Ｐｈｅ、またはＤ−Ａｌａであり、
Ｘａａ_８は、Ｄ−Ｈｉｓ、Ｈｉｓ、Ｄ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ、またはＤ−Ａｌａであり、
Ｘａａ_９は、Ｄ−Ｇｌｕ、Ｄ−Ａｓｐ、Ｄ−シトルリン、Ｄ−Ｓｅｒ、またはＤ−Ａｌａであり、
Ｘａａ_１０は、Ｄ−Ｍｅｔ、Ｄ−ブチオニン、Ｄ−Ｉｌｅ、またはＤ−Ａｌａであり、
Ｘａａ_１１は、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｄ−ＩｌｅまたはＤ−Ａｌａであり、
Ｘａａ_１２は、Ｄ−Ｔｙｒ、Ｄ−Ｓｅｒ、またはＤ−Ａｌａであり、
Ｘａａ_１３は、Ｄ−ＳｅｒまたはＤ−Ａｌａである］。

一部の実施形態では、本明細書中で提供するペプチド類似体はＭＣ１Ｒと選択的に結合し、配列：Ｘａａ_１ Ｘａａ_２ Ｘａａ_３ Ｘａａ_４ Ｘａａ_５ Ｘａａ_６ Ｘａａ_７ Ｘａａ_８ Ｘａａ_９ Ｘａａ_１０ Ｘａａ_１１ Ｘａａ_１２ Ｘａａ_１３を有するポリペプチドまたは薬学的に許容されるその塩を含む［式中、Ｘａａ_１は、Ｄ−Ｖａｌであり、Ｘａａ_２は、Ｄ−Ｐｒｏであり、Ｘａａ_３は、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−ＯｒｎまたはＤ−Ｎｌｅであり、Ｘａａ_４は、Ｇｌｙであり、Ｘａａ_５は、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｔｒｐ、Ｄ−３−ベンゾチエニル−Ａｌａ、Ｄ−５−ヒドロキシ−Ｔｒｐ、Ｄ−５−メトキシ−Ｔｒｐ、またはＤ−Ｐｈｅであり、Ｘａａ_６は、Ｄ−ＡｒｇまたはＤ−Ｈｉｓであり、Ｘａａ_７は、Ｄ−Ｃｈａ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ、Ｄ−４−フルオロ−Ｐｈｇ、Ｄ−３−ピリジル−Ａｌａ、Ｄ−Ｔｈｉ、Ｄ−Ｔｒｐ、またはＤ−４−ニトロ−Ｐｈｅであり、Ｘａａ_８は、Ｄ−Ｈｉｓ、Ｈｉｓ、Ｄ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ、またはＤ−Ａｌａであり、Ｘａａ_９は、Ｄ−Ｇｌｕ、Ｄ−Ａｓｐ、Ｄ−シトルリンまたはＤ−Ｓｅｒであり、Ｘａａ_１０は、Ｄ−Ｍｅｔ、Ｄ−ブチオニンまたはＤ−Ｉｌｅであり、Ｘａａ_１１は、Ｄ−ＳｅｒまたはＤ−Ｉｌｅであり、Ｘａａ_１２は、Ｄ−ＴｙｒまたはＤ−Ｓｅｒであり、Ｘａａ_１３は、Ｄ−Ｓｅｒであり、１個以下のＸａａ_１〜１３がＬ−アミノ酸である］。

他の実施形態では、本明細書中で提供するペプチド類似体は、配列：Ｘａａ_１ Ｘａａ_２ Ｘａａ_３ Ｘａａ_４ Ｘａａ_５ Ｘａａ_６ Ｘａａ_７ Ｘａａ_８ Ｘａａ_９ Ｘａａ_１０ Ｘａａ_１１ Ｘａａ_１２ Ｘａａ_１３を有するポリペプチドまたは薬学的に許容されるその塩を含む［式中、Ｘａａ_１は、Ｄ−Ｖａｌであり、Ｘａａ_２は、Ｄ−Ｐｒｏであり、Ｘａａ_３は、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−ＯｒｎまたはＤ−Ｎｌｅであり、Ｘａａ_４は、Ｇｌｙであり、Ｘａａ_５は、Ｄ−ＴｒｐまたはＴｒｐであり、Ｘａａ_６は、Ｄ−Ａｒｇであり、Ｘａａ_７は、Ｄ−Ｃｈａ、Ｄ−Ｐｈｅ、ＰｈｅまたはＤ−Ｔｈｉであり、Ｘａａ_８は、Ｄ−ＨｉｓまたはＨｉｓであり、Ｘａａ_９は、Ｄ−ＧｌｕまたはＤ−Ｓｅｒであり、Ｘａａ_１０は、Ｄ−Ｍｅｔ、Ｄ−ブチオニンまたはＤ−Ｉｌｅであり、Ｘａａ_１１は、Ｄ−ＳｅｒまたはＤ−Ｉｌｅであり、Ｘａａ_１２は、Ｄ−ＴｙｒまたはＤ−Ｓｅｒであり、Ｘａａ_１３は、Ｄ−Ｓｅｒであり、１個以下のＸａａ_１〜１３がＬ−アミノ酸である］。

本明細書中で提供する化合物は、α−メラノコルチン模倣ホルモン（α−ＭＳＨ）のペプチド類似体を含む。

１つの代替実施形態では、ペプチド類似体はＤ−アミノ酸からなる。他の実施形態では、ペプチドは、Ｄアミノ酸、Ｌアミノ酸またはＤおよびＬアミノ酸の混合物を含む。他の実施形態では、ペプチドは、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％のＤアミノ酸からなる。また、本発明の化合物は、以下の非標準のアミノ酸の非限定的な例を組み込んでいてもよい：Ｄ−オルニチン、Ｄ−ノルロイシン、３−ベンゾチエニル−Ｄ−アラニン、５−ヒドロキシ−Ｄ−Ｔｒｐ、５−メトキシ−Ｄ−Ｔｒｐ、４−フルオロ−Ｄ−フェニルグリシン（４−フルオロ−Ｄ−Ｐｈｇ）、３−ピリジル−Ｄ−アラニン、２−チエニル−Ｄ−アラニン（Ｄ−Ｔｈｉ）、Ｄ−シクロヘキシルアラニン（Ｄ−Ｃｈａ）、４−ニトロ−Ｄ−Ｐｈｅ、Ｄ−シトルリン、α−メチル−Ｄ−Ｍｅｔ、およびＤ−ブチオニン。

一部の実施形態では、コアテトラペプチドは、好ましくはＤ−アミノ酸立体配置の、アミノ酸配列Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ａｒｇ ＴｒｐまたはＴｒｐ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｈｉｓからなる。別の実施形態では、コアテトラペプチドは、好ましくはＤ−アミノ酸立体配置の、アミノ酸配列Ｈｉｓ Ｄ−Ｃｈａ Ａｒｇ ＴｒｐまたはＴｒｐ Ａｒｇ Ｄ−Ｃｈａ Ｈｉｓからなる。一部の実施形態では、コアテトラペプチドは４個のＤ−アミノ酸からなる。他の実施形態では、コアテトラペプチドは少なくとも１つの非標準のアミノ酸を有する。

本明細書中で提供する化合物は、合成または組換えであることができる。本発明の化合物は、当分野で知られている慣用の化学技術によって製造し得る。固相合成方法は、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｅ．Ａｔｈｅｒｔｏｎら、１９８９）などの公表文献に記載されている。また、本発明の化合物は、当分野で知られている慣用の分子生物技術によっても製造し得る。本出願内では、別段に記述しない限りは、用語の定義および本出願の技術の例示は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．編、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９１）、「Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、Ｄｅｕｔｓｈｃｅｒ，Ｍ．Ｐ．編、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９８９）、Ｉｎｎｉｓら、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９０）、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第２版、Ａｌａｎ Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク州ニューヨーク（１９８７）、Ｍｕｒｒａｙ，Ｅ．Ｊ．編、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、１０９−１２８ページ、Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ＣｌｉｆｔｏｎおよびＬｅｗｉｎ，Ｂ．、Ｇｅｎｅｓ ＶＩ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９９７）などのいくつかの周知の参考文献のうちの任意のものの中に見つけ得る。引用した参考文献はすべて、完全に本明細書中に参考として組み込まれている。

一部の実施形態では、本明細書中で提供するペプチド類似体は、メラノコルチン１受容体（ＭＣ１Ｒ）と選択的に結合するか、それを選択的に活性化する。任意の適切なアッセイを用いて、ＭＣ１Ｒの結合または活性化を測定することができる。たとえば、ｉｎ ｖｉｔｒｏのｃＡＭＰ誘導を用いてＭＣ１Ｒの活性化を評価することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ評価は、ｉｎ ｖｉｖｏの活性化を示すことができる。本発明のさらなる実施形態は、ＭＣ１受容体に選択的な任意のポリペプチドを含む。選択的なＭＣ１受容体化合物の同定は、適切なスクリーニングアッセイによって決定し得る。ＭＣ１受容体結合アッセイの非限定的な例を実施例４に開示する。一部の実施形態では、好ましいＭＣ１受容体は、ヒト由来のメラノコルチン１受容体を含む（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＰ＿００２３７７）。

本発明のさらなる実施形態は、ｃＡＭＰ、一酸化窒素（ＮＯ）、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−αのｍＲＮＡ、ＩＬ−１０のｍＲＮＡ、ＩＬ−１０、ＩＦＮγ、ＩＬ−６、ＩＬ−１２および／またはＭＣＰ−１のレベルを調節する化合物に向けられている。一部の実施形態では、化合物はｃＡＭＰレベルを増加させる。他の実施形態では、化合物は、一酸化窒素（ＮＯ）、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−αのｍＲＮＡ、ＩＬ−１０のｍＲＮＡ、ＩＬ−１０、ＩＦＮγ、ＩＬ−６、ＩＬ−１２および／またはＭＣＰ−１のレベルの低下または阻害に向けられている。上述のレベルを調節する化合物が何であるかは、スクリーニングアッセイによって決定し得る。当分野で知られている許容されるアッセイを用いて、上述のレベルを測定することができる。これらのレベルの望ましい調節を示す化合物を同定するアッセイの非限定的な例は、実施例中に開示されている。

一部の実施形態では、本発明の化合物は代替作用機構によって免疫応答および炎症を調節する場合があり、本明細書中に開示した機構に限定されない。

一部の実施形態では、本明細書中で提供するペプチドは、血漿安定性およびプロテアーゼ分解に対する耐性が改善している。血漿安定性およびプロテアーゼ分解に対する耐性は、任意の適切な方法によって評価することができる。非限定的な例は実施例１９に開示されている。ｉｎ ｖｉｔｒｏ評価により、性能、耐性の改善およびより長いｉｎ ｖｉｖｏ半減期が示される場合がある。

本明細書中で提供する方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで実施することができる。

ＰＥＧ化ペプチド
一部の実施形態では、ペプチドは、ペプチドの半減期が増強されるように修飾されている。一部の実施形態では、ペプチドはＰＥＧ化されている。一部の実施形態では、ＰＥＧ化ペプチドは、１つまたは複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー鎖と共有結合またはコンジュゲートしたペプチドに向けられている。ＰＥＧポリマー鎖には、修飾、官能化または他の様式で誘導体化したＰＥＧ鎖が含まれ得る。別の実施形態では、ＰＥＧポリマー鎖は少なくとも１つまたは複数の分枝点を有し得る。一部の好ましい実施形態では、ＰＥＧポリマー鎖および対応するＰＥＧ化ペプチドは水溶性であり、溶液中で移動性が高く、毒性および免疫原性を欠き、身体からのクリアランスが容易で、変更された体内分布を有し得る。一部の好ましい実施形態では、ＰＥＧ化ペプチドの薬物動態学的性質は、ＰＥＧ鎖の種類によって調節される。ＰＥＧ化ペプチドを調製するための方策および方法は、当分野で知られている方法によって実施される（本明細書中に参考として組み込まれているＧ．ＰａｓｕｔａおよびＦ．Ｍ．Ｖｅｒｏｎｅｓｅ（２００７）「Ｐｏｌｙｍｅｒ−ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ，ｒｅｃｅｎｔ ａｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｌ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ」、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２（８−９）：９３３−９６１）。タンパク質の第一および第二世代のＰＥＧ化のプロセスは、当分野で見つけ得る。

ＰＥＧ化の非限定的な例は、一方または両方の末端においてＰＥＧポリマーを適切に官能化する第１のステップを含む（直鎖状ＰＥＧの場合）。それぞれの末端を同じ反応性部分で活性化されたＰＥＧは「ホモ二官能性」として知られ、存在する官能基が異なる場合は、ＰＥＧ誘導体は「ヘテロ二官能性」または「ヘテロ官能性」と呼ばれる。ＰＥＧポリマーの化学的に活性のあるまたは活性化された誘導体を調製して、ＰＥＧを所望の分子に付着させる。ＰＥＧ誘導体のための適切な官能基の選択は、ＰＥＧとカップリングさせる分子上の利用可能な反応基の種類に基づく。反応性アミノ酸の非限定的な例としては、リシン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニンおよびチロシンが挙げられる。Ｎ末端アミノ基およびＣ末端カルボン酸を使用することもできる。

コンジュゲーション用の他のヘテロ二官能性ＰＥＧ：これらのヘテロ二官能性ＰＥＧはは２つの実体を連結するために非常に有用であり、親水性で、柔軟かつ生体適合性のあるスペーサーが必要である。ヘテロ二官能性ＰＥＧの好ましい末端基は、マレイミド、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、アミン、カルボン酸およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルである。

本発明の一部の実施形態では、ＰＥＧ化ペプチドは、０．２ｋＤａ〜１００ｋＤａの分子量範囲を有し得る。本発明の一部の好ましい実施形態では、ＰＥＧ化ペプチドは、０．２ｋＤａ〜４０ｋＤａの分子量範囲を有し得る。本発明の一部の好ましい実施形態では、ＰＥＧ化ペプチドは、０．２ｋＤａ〜１５ｋＤａの分子量範囲を有し得る。他の実施形態では、市販のＰＥＧの好ましい平均分子量（Ｄａで示し、サイズ排除クロマトグラフィーによって決定）は、＜１ｋ、２ｋ、３．５ｋ、５ｋ、１０ｋ、２０ｋ、３０ｋ、４０ｋ、およびそれより高いものから選択することができるが、所望の薬物動態学に応じて任意の分子量であることができる。たとえば、より低い分子量のヘテロ二官能性ＰＥＧをリンカーとして使用してよく、より低い分子量のＰＥＧを用いてペプチドの溶解度を改善させ得る。また、ＰＥＧは、多重アーム、叉状、または分枝状であることもできる。

一部の実施形態では、ペプチドは標的化分子とコンジュゲートしているか、または標的化分子として機能し、標的化分子は所望の受容体と優先的に会合する。本発明の一部の好ましい実施形態では、ペプチドを細胞毒性剤とコンジュゲートさせる。用語「細胞毒性剤」とは、細胞の発現活性、細胞の機能を阻害もしくは防止する、および／または細胞の破壊を引き起こす物質をいう。この用語には、その断片および／または変異体を含めた、放射活性同位元素、化学療法剤、および小分子毒素などの毒素、または細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素活性のある毒素を含むことを意図する。細胞毒性剤の非限定的な例には、メイタンシン、ドラスタチンならびにタシドチン（ｔａｓｉｄｏｔｉｎ）およびアウリスタチンを含めたその類似体が含まれる。本発明の他の実施形態では、細胞毒性剤の非限定的な例には、それだけには限定されないが、メイタンシノイド、イットリウム、ビスマス、リシン、リシンＡ鎖、サポリン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、臭化エチジウム、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシン、ジフテリア毒素サブユニットＡ、切断緑膿菌外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、ゲロニン、ミトゲリン、リストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、クリシン（ｃｕｒｉｃｉｎ）、クロチン、カリチアマイシン、サパオナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、糖質コルチコイドおよび他の化学療法剤、ならびにＡｔ^２１１、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８、Ｓｍ^１５３、Ｂｉ^２１２、Ｐ^３２などの放射性同位体およびＬｕの放射活性同位元素が含まれる。また、抗体は、プロドラッグをその活性型に変換することができる抗癌プロドラッグ活性化酵素とコンジュゲートさせてもよい。

ペプチドは、当分野で現在知られている任意の方法によって、細胞毒性剤または標的化剤と直接または間接的に連結させ得る。本発明の一部の好ましい実施形態では、リンカーの包含がペプチドまたはコンジュゲートした薬剤の機能、結合、毒性または包含を実質的に妨害しない限りは、ペプチドは、１つまたは複数のリンカーによって細胞毒性剤または標的化剤と繋留されてコンジュゲートを形成する。

リンカーの非限定的な例には、イオン結合および共有結合ならびに任意の他の十分に安定な会合が含まれ、標的薬剤は、コンジュゲートしたものが標的とする細胞によって内部移行される。リンカー部分は、所望の特性に応じて選択される。リンカー選択の考慮事項には、コンジュゲートした要素が近接することによって引き起こされる立体障害の緩和もしくは低下、コンジュゲートの特異性、毒性、溶解度、血清安定性および／もしくは細胞内利用能などのコンジュゲートの他の特性の変更、ならびに／または連結の柔軟性を増加させることが含まれ得る。リンカーは任意の種類の連結であってよく、その例は、どちらも完全に本明細書中に参考として組み込まれている米国特許第７，１６６，７０２号および第５，１９４，４２５号に記載されている。

化学連結したコンジュゲートに適したリンカーおよび連結には、それだけには限定されないが、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、ヒンダードジスルフィド結合、およびアミンなどの遊離反応基とチオール基との間の共有結合が含まれる。これらの結合は、ヘテロ二官能性試薬を用いてポリペプチドの一方または両方上に反応性チオール基を生じさせ、その後、一方のポリペプチド上のチオール基を、反応性マレイミド基またはチオール基が付着することができる他方のポリペプチド上の反応性チオール基またはアミン基と反応させることによって生成する。他のリンカーには、より酸性の細胞内区画で切断される、ビスマレイミドエトキシプロパン、酸に不安定なトランスフェリンコンジュゲートおよびアジピン酸ジヒドラジドなどの酸切断可能リンカー、ＵＶまたは可視光に露光された際に切断される架橋結合剤、ならびにヒトＩｇＧ１の定常領域のＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３などの様々なドメイン等のリンカーが含まれる（本明細書中に参考として組み込まれているＢａｔｒａら（１９９３）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３０：３７９−３８６を参照）。

化学リンカーおよびペプチドリンカーは、リンカーをペプチドおよび標的化剤または細胞毒性剤と共有的カップリングさせることによって挿入し得る。以下に記載のヘテロ二官能性剤を用いて、そのような共有的カップリングを行ない得る。

ヘテロ二官能性架橋結合試薬
アミノ基とチオール基との間に共有結合を形成し、チオール基をタンパク質内に導入するために使用されている数々のヘテロ二官能性架橋結合試薬が、当業者に知られている（たとえば、そのような試薬の調製および使用を記載し、そのような試薬の商業的供給源を提供する、ＰＩＥＲＣＥ ＣＡＴＡＬＯＧ、Ｉｍｍｕｎｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃａｔａｌｏｇ ＆ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１９９２−１９９３を参照、また、Ｃｕｍｂｅｒら（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、３’：３９７−４０１、Ｔｈｏｒｐｅら（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４７：５９２４−５９３１、Ｇｏｒｄｏｎら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：３０８−３１２、Ｗａｌｄｅｎら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２：１９１−１９７、Ｃａｒｌｓｓｏｎら（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１７３：７２３−７３７、Ｍａｈａｎら（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１６２：１６３−１７０、Ｗａｗｒｙｚｎａｃｚａｋら（１９９２）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、６６：３６１−３６６、Ｆａｔｔｏｍら（１９９２）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ＆ Ｉｍｍｕｎ．、６０：５８４−５８９も参照）。引用した参考文献はすべて、完全に本明細書中に参考として組み込まれている。これらの試薬は、標的化剤、ケモカイン、および標的薬剤の間に共有結合を形成するために使用し得る。これらの試薬には、それだけには限定されないが：Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジイジチオ（ｐｙｒｉｄｙｉｄｉｔｈｉｏ））プロピオネート（ＳＰＤＰ、ジスルフィドリンカー）、スルホスクシンイミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ）、スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチルベンジルチオスルフェート（ＳＭＢＴ、ヒンダードジスルフェートリンカー）、スクシンイミジル６−［３−（２−ピリジイジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）、スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）ブチレート（ＳＰＤＢ、ヒンダードジスルフィド結合リンカー）、スルホスクシンイミジル２−（７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセトアミド）エチル−１，３−ジチオプロピオネート（ＳＡＥＤ）、スルホ−スクシンイミジル７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセテート（ＳＡＭＣＡ）、スルホスクシンイミジル６−［α−メチル−α−（２−ピリジイジチオ）トルアミド］ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ）、１，４−ジ−［３’−（２’−ピリジイジチオ）プロピオンアミド］ブタン（ＤＰＤＰＢ）、４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルチオ）トルエン（ＳＭＰＴ、ヒンダードジスルフェートリンカー）、スルホスクシンイミジル６［α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＭＢＳ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ、チオエーテルリンカー）、スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（スルホ−ＳＩＡＢ）、スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）、スルホスクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（スルホ−ＳＭＰＢ）、アジドベンゾイルヒドラジド（ＡＢＨ）が含まれる。

他のヘテロ二官能性切断可能な架橋結合剤には、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）−アミノベンゾエート、スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）−アミノベンゾエート、４−スクシンイミジル−オキシカルボニル−ａ−（２−ピリジルジチオ）−トルエン、スルホスクシンイミジル−６−［ａ−メチル−ａ−（ピリジルジチオール）−トルアミド］ヘキサノエート、Ｎ−スクシンイミジル−３−（−２−ピリジイジチオ）−プロプリオネート（ｐｒｏｐｒｉｏｎａｔｅ）、スクシンイミジル６［３（−（−２−ピリジルジチオ）−プロプリオンアミド（ｐｒｏｐｒｉｏｎａｍｉｄｏ）］ヘキサノエート、スルホスクシンイミジル６［３（−（−２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート、３−（２−ピリジイジチオ）−プロピオニルヒドラジド、エルマン試薬、ジクロロトリアジン酸、Ｓ−（２−チオピリジル）−Ｌ−システインが含まれる。さらなる例示的な二官能性連結化合物は、すべて完全に本明細書中に参考として組み込まれている、米国特許第５，３４９，０６６号、第５，６１８，５２８号、第４，５６９，７８９号、第４，９５２，３９４号および第５，１３７，８７７号に開示されている。

酸切断可能で、光切断可能で感熱性のリンカー
特に、反応でより利用しやすくすることを可能にするために、標的薬剤を切断することが必要であり得る場合に、酸切断可能リンカー、光切断可能および感熱性のリンカーも使用し得る。酸切断可能リンカーには、それだけには限定されないが、ビスマレイミドエトキシプロパン、ならびにアジピン酸ジヒドラジドリンカー（たとえば、本明細書中に参考として組み込まれているＦａｔｔｏｍら（１９９２）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ＆ Ｉｍｍｕｎ．、６０：５８４−５８９を参照）および細胞内トランスフェリン循環経路内への流入を可能にするためにトランスフェリンの十分な部分を含有する、酸に不安定なトランスフェリンコンジュゲート（たとえば、本明細書中に参考として組み込まれているＷｅｌｈｏｅｎｅｒら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６：４３０９−４３１４を参照）が含まれる。

光切断可能リンカーとは、露光された際に切断され（たとえば、そのリンカーが本明細書中に参考として組み込まれているＧｏｌｄｍａｃｈｅｒら（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．、３：１０４−１０７を参照）、それによって露光された際に標的薬剤が放出されるリンカーである。露光された際に切断され、それによって露光された際に標的薬剤が放出される、光切断可能リンカーが知られている（たとえば、ニトロベンジル基をシステインの光切断可能保護基として使用することを記載している、Ｈａｚｕｍら（１９８１）、Ｐｅｐｔ．，Ｐｒｏｃ．Ｅｕｒ．Ｐｅｐｔ．Ｓｙｍｐ．，１６ｔｈ、Ｂｒｕｎｆｅｌｄｔ，Ｋ（編）、１０５−１１０ページ、ヒドロキシプロピルメタクリルアミドコポリマー、グリシンコポリマー、フルオレセインコポリマーおよびメチルローダミンコポリマーを含めた水溶性光切断可能コポリマーを記載している、Ｙｅｎら（１９８９）Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９０：６９−８２、近ＵＶ光（３５０ｎｍ）に露光した際に光分解を受ける架橋結合剤および試薬を記載している、Ｇｏｌｄｍａｃｈｅｒら（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．、３：１０４−１０７、ならびに、光切断可能な連結を生じる塩化ニトロベンジルオキシカルボニル架橋結合試薬を記載している、Ｓｅｎｔｅｒら（１９８５）Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．、４２：２３１−２３７を参照）。引用した参考文献はすべて、完全に本明細書中に参考として組み込まれている。そのようなリンカーは、光ファイバーを用いて露光することができる皮膚または眼の状態の処置において、特定の用途を有する。コンジュゲートを投与した後、眼もしくは皮膚または他の身体部分を露光し、コンジュゲートからの標的部分の放出がもたらされる。そのような光切断可能リンカーは、動物の身体からの迅速なクリアランスを可能にするために標的化剤を除去することが望ましい、診断プロトコルに関連して有用である。

化学コンジュゲーション用の他のリンカー
他のリンカーには、トリチルリンカー、特に、様々な度合の酸度またはアルカリ度で治療剤の放出をもたらすコンジュゲートの部類を生じるための誘導体化トリチル基が含まれる。治療剤が放出されるｐＨ範囲を事前に選択する能力によってこうして得られる柔軟性により、治療剤の送達を必要とする組織間の既知の生理的差異に基づいてリンカーを選択することが可能となる（たとえば、本明細書中に参考として組み込まれている米国特許第５，６１２，４７４号を参照）。たとえば、腫瘍組織の酸度は正常組織の酸度よりも低いと考えられている。

ペプチドリンカー
リンカー部分はペプチドであることができる。ペプチドリンカーをコンジュゲート中で用いることができる。ペプチドリンカーは、典型的には、約２〜約６０個のアミノ酸残基、たとえば約５〜約４０、または約１０〜約３０個のアミノ酸残基を有する。選択される長さは、リンカーを含める使用などの要素に依存する。

リンカー部分は、単鎖抗体研究において知られているものなどの、柔軟なスペーサーアミノ酸配列であることができる。そのような知られているリンカー部分の例には、それだけには限定されないが、ＧＧＧＧＳ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、ＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳ、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＳＧＳＴＫＧ、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＥＦ、ＳＲＳＳＧ、ＳＧＳＳＣが含まれる。配列ＡＭＧＲＳＧＧＧＣＡＧＮＲＶＧＳＳＬＳＣＧＧＬＮＬＱＡＭを有するジフテリア毒素トリプシン感受性リンカーも有用である。

さらなる連結部分は、たとえば、すべて本明細書中に参考として組み込まれている出版物である、Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５：５８７９−５８８３、１９８８、Ｗｈｉｔｌｏｗ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎ．、６：９８９−９９５、１９９３、Ｎｅｗｔｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３５：５４５−５５３、１９９６、Ａ．Ｊ．Ｃｕｍｂｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．、３：３９７−４０１、１９９２、Ｌａｄｕｒｎｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２７３：３３０−３３７、１９９７、および米国特許第４，８９４，４４３号に記載されている。

他のリンカーには、それだけには限定されないが、カテプシンＢ基質、カテプシンＤ基質、トリプシン基質、トロンビン基質、サブチリシン基質、第Ｘａ因子基質、およびエンテロキナーゼ基質などの酵素基質が含まれ、溶解度、柔軟性、および／または細胞内切断性を増加させるリンカーには、（ｇｌｙｍｓｅｒ）ｎおよび（ｓｅｒｍｇｌｙ）ｎなどのリンカーが含まれる（たとえば、コンジュゲート中で使用するための例示的なリンカーを提供する、本明細書中に参考として組み込まれているＰＣＴ公開ＷＯ９６／０６６４１号を参照）。一部の実施形態では、それぞれのリンカーの所望の特性を利用するために、いくつかのリンカーを含め得る。

コンジュゲートの調製
連結した標的薬剤とのコンジュゲートは、化学コンジュゲーション、組換えＤＮＡ技術、または組換え発現と化学コンジュゲーションとの組合せのいずれかによって調製することができる。本発明のペプチおよび細胞毒性剤または標的化剤は任意の配向で連結してよく、複数の標的化剤および／または標的薬剤がコンジュゲート中に存在し得る。

本発明の一部の好ましい実施形態では、細胞毒性剤は、短いアルキル鎖、ポリシアル酸もしくはヒアルロン酸、ポリペプチドまたはＰＥＧを含めた、親水性かつ生体適合性のあるスペーサーポリマーによってペプチドと繋留されている。本発明の一部の好ましい実施形態では、細胞毒性剤は、切断可能リンカー、たとえば、ジスルフィド連結またはカテプシンなどのリソソームプロテアーゼによって切断可能な配列を含有するペプチドを介してコンジュゲートしている。本発明の一部の好ましい実施形態では、スペーサーは、ペプチドのＮまたはＣ末端のどちらかに付着している。

配合物
これらの配合物または組成物を調製する方法には、本発明の化合物を、担体、および任意選択で１つまたは複数の副成分と会合させるステップが含まれる。一般に、配合物は、本発明の化合物を、液体担体もしくは微粉固体担体またはその両方と均一かつ密接に会合させ、その後、必要な場合は生成物を成形することによって調製する。

製薬配合物は、医薬品を製造するために当分野で知られている任意の方法に従って調製することができる。そのような配合物は、甘味剤、香味剤、着色剤および保存剤を含有することができる。配合物は、製造に適した無毒性の薬学的に許容される賦形剤と混合することができる。そのような「賦形剤」とは、一般に、無毒性であり、組成物の他の構成要素と有害な様式で相互作用しない、実質的に不活性な材料をいう。薬学的に許容される賦形剤には、それだけには限定されないが、水、緩衝生理食塩水、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、グリセロールおよびエタノールなどの液体が含まれる。薬学的に許容される塩、たとえば、トリフルオロ酢酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩、および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸の塩等をその中に含めることができる。

治療剤は、送達に適した医薬品または薬学的組成物中で投与し得る。配合物は１つまたは複数の希釈剤、乳化剤、保存剤、緩衝液、賦形剤などを含んでいてよく、凍結乾燥粉末、スプレー、クリーム、ローション、ゲル、パッチ上、移植片中などの形態で提供してよい。経口投与用の製薬配合物は、当分野で周知の薬学的に許容される担体を用いて、適正かつ適切な用量で配合することができる。そのような担体は、医薬品を、患者による摂取に適した、錠剤、丸薬、散剤、糖衣錠、カプセル、液剤、ロゼンジ、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などの単位剤形で配合することを可能にする。経口使用用の薬学的調製物は、固体賦形剤として配合し、任意選択で粉砕して混合物をもたらし、所望する場合は適切な追加の化合物を加えた後に顆粒の混合物を加工して、錠剤またはドラジェのコアを得ることができる。適切な固体賦形剤は炭水化物またはタンパク質充填剤であり、たとえば、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含めた糖、トウモロコシ、コムギ、コメ、ジャガイモ、または他の植物由来のデンプン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース、アラビアおよびトラガカントを含めたガム、ならびにタンパク質、たとえば、ゼラチンおよびコラーゲンが含まれる。崩壊剤または可溶化剤、たとえば、架橋結合ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはアルギン酸ナトリウムなどのその塩を加えてもよい。

水性懸濁液は、活性剤（たとえば本発明のキメラポリペプチドまたはペプチド模倣体）を、水性懸濁液の製造に適した賦形剤と混合して含有することができる。そのような賦形剤には、懸濁剤、たとえば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガムおよびアカシアガム、ならびに分散剤または湿潤剤、たとえば、天然に存在するホスファチド（たとえばレシチン）、酸化アルキレンと脂肪酸との縮合生成物（たとえばステアリン酸ポリオキシエチレン）、酸化エチレンと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物（たとえば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、酸化エチレンと脂肪酸およびヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合生成物（たとえば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート）、または酸化エチレンと脂肪酸およびヘキシトール酸無水物に由来する部分エステルとの縮合生成物（たとえば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）が含まれる。また、水性懸濁液は、１つまたは複数の保存剤、たとえばｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルまたはｎ−プロピル、１つまたは複数の着色剤、１つまたは複数の香味剤および１つまたは複数の甘味剤、たとえばスクロース、アスパルテームまたはサッカリンも含有することができる。配合物は、浸透圧について調節することができる。

本発明の疎水性活性剤の投与には油性の医薬品が有用である。油性の懸濁液は、活性剤（たとえば本発明のキメラ組成物）をラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油もしくはヤシ油などの植物油、または流動パラフィンなどの鉱物油、あるいはこれらの混合物に懸濁させることによって配合することができる。たとえば、経口投与した疎水性の製薬化合物の生体利用度を増加させ、個体間および個体内のばらつきを減少させるための、精油または精油構成要素の使用を記載している、本明細書中に参考として組み込まれている米国特許第５，７１６，９２８号を参照されたい（本明細書中に参考として組み込まれている米国特許第５，８５８，４０１号も参照）。油性懸濁液は、蜜蝋、固体パラフィンまたはセチルアルコールなどの増粘剤を含有することができる。味のよい経口調製物を提供するためにグリセロール、ソルビトールまたはスクロースなどの甘味剤を添加することができる。これらの配合物は、アスコルビン酸などの抗酸化剤を添加することによって保存することができる。注射用油性ビヒクルの例として、本明細書中に参考として組み込まれているＭｉｎｔｏ（１９９７）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、２８１：９３−１０２を参照されたい。また、本発明の製薬配合物は、水中油乳剤の形態であることもできる。油性相は、上述のように植物油もしくは鉱物油であるか、またはこれらの混合物であることができる。適切な乳化剤には、天然に存在するガム、たとえばアカシアガムおよびトラガカントガム、天然に存在するホスファチド、たとえばダイズレシチン、脂肪酸とヘキシトール酸無水物とに由来するエステルまたは部分エステル、たとえばソルビタンモノオレエート、ならびにこれらの部分エステルと酸化エチレンとの縮合生成物、たとえばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートが含まれる。また、乳剤は、シロップおよびエリキシルの配合におけるように、甘味剤および香味剤を含有することもできる。また、そのような配合物は粘滑剤、保存剤、または着色剤も含有することができる。

また、治療剤を含む組成物または医薬品が、特にペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドまたは他の同様の薬剤用の安定化剤として役割を果たす、薬学的に許容される担体を含有できることも企図される。ペプチドの安定化剤としても作用する適切な担体の例には、それだけには限定されないが、製薬グレードのデキストロース、スクロース、ラクトース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストランなどが含まれる。他の適切な担体には、やはりそれだけには限定されないが、デンプン、セルロース、リン酸ナトリウムまたはカルシウム、クエン酸、酒石酸、グリシン、高分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびその組合せが含まれる。荷電脂質および／または洗剤を用いることも有用であり得る。適切な荷電脂質には、それだけには限定されないが、ホスファチジルコリン（レシチン）などが含まれる。洗剤は、典型的には非イオン性、陰イオン性、陽イオン性または両性の界面活性剤である。適切な界面活性剤の例には、たとえば、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）およびＴｒｉｔｏｎ（登録商標）界面活性剤（Ｕｎｉｏｎ Ｃａｒｂｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｔｉｃｓ、コネチカット州Ｄａｎｂｕｒｙ）、ポリオキシエチレンソルビタン、たとえばＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤（Ａｔｌａｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、デラウェア州Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ）、ポリオキシエチレンエーテル、たとえばＢｒｉｊ、薬学的に許容される脂肪酸エステル、たとえばラウリル硫酸およびその塩（ＳＤＳ）、ならびに同様の材料が含まれる。薬学的に許容される賦形剤、担体、安定化剤および他の補助物質の完全な記述は、本明細書中に参考として組み込まれているＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．、ニュージャージー州、１９９１）から入手可能である。

非経口投与に適した本発明の薬学的組成物は、本発明の１つまたは複数の化合物を、糖、アルコール、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、配合物を意図するレシピエントの血液と等張にする溶質、または懸濁剤もしくは増粘剤を含有し得る、１つまたは複数の薬学的に許容される無菌の等張の水性もしくは非水性溶液、分散液、懸濁液または乳剤、あるいは使用直前に無菌の注射用液剤または分散液へと再構成し得る無菌の散剤と組み合わせて含む。

本発明の薬学的組成物中で用い得る適切な水性および非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびその適切な混合物、オリーブ油などの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが含まれる。たとえば、レシチンなどのコーティング材料を使用することによって、分散液の場合は所要の粒子径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって、適切な流動性を維持することができる。

また、これらの組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントも含有し得る。本発明の化合物に対する微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などを包含することによって確実にし得る。また、糖、塩化ナトリウム、リン酸緩衝生理食塩水などの等張化剤を組成物内に含めることが望ましい場合もある。さらに、注射用製薬形態の持続吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤を包含することによって達成し得る。

一部の例では、薬物の効果を持続させるためには、皮下または筋肉内注射からの薬物の吸収を遅延させることが望ましい。これは、水溶性が乏しい結晶性または非晶質材料の液体懸濁液を使用することによって達成し得る。したがって、薬物の吸収速度はその溶解速度に依存し、立ち代ってこれは結晶の大きさおよび結晶形に依存し得る。あるいは、非経口投与した薬物形態の遅延吸収は、薬物を油性ビヒクルに溶解または懸濁させることによって達成する。

本発明の方法では、製薬化合物は体内での徐放のためにミクロスフェアとして送達することもできる。たとえば、ミクロスフェアは、皮下でゆっくりと放出される薬物の皮内注射を介して（Ｒａｏ（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍ．Ｅｄ．、７：６２３−６４５を参照）、生分解性の注射用ゲル配合物として（たとえばＧａｏ（１９９５）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．、１２：８５７−８６３（１９９５））、または経口投与用のミクロスフェアとして（たとえばＥｙｌｅｓ（１９９７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、４９：６６９−６７４を参照）投与することができる。引用した参考文献はすべて、完全に本明細書中に参考として組み込まれている。

注射用デポー形態は、ポリ乳酸−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中の、本発明の化合物のマイクロカプセルマトリックスを形成することによって作製する。薬物対ポリマーの比および用いる特定のポリマーの性質次第で、薬物放出速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例には、ポリ（オルトエステル）およびポリ（酸無水物）が含まれる。また、デポー注射用配合物は、薬物を体組織に適合性のあるリポソームまたはマイクロエマルジョン中に封入することによっても調製される。

ポリペプチドは、それ自体で、または別の治療化合物と組み合わせて投与し得る。特に、ポリペプチドは、哺乳動物において黒色腫、炎症または自己免疫疾患を処置するために使用する治療化合物と併せて投与し得る。ポリペプチドおよび追加の治療化合物は、同一または異なる組成物中で配合し得る。ポリペプチドは、追加の治療化合物と同時に、連続的またはそれとは別々に投与し得る。

用量
本発明の薬学的組成物中の活性成分の実際の用量レベルは、特定の患者、組成物、および投与様式において患者に毒性とならずに所望の治療反応を達成するために有効な活性成分の量を得るために、変動させ得る。本発明の化合物を医薬品としてヒトおよび動物に投与する場合、それ自体で、または、たとえば０．１〜９９％の活性成分、より好ましくは１０〜３０％を、薬学的に許容される担体と組み合わせて含有する薬学的組成物として与えることができる。

選択された用量レベルは、用いた本発明の特定の化合物の活性、投与経路、投与時間、用いた特定の化合物の排泄または代謝の速度、吸収の速度および程度、処置の持続期間、用いた特定の化合物と組み合わせて使用した他の薬物、化合物および／または材料、処置する患者の年齢、性別、体重、状態、全体的な健康および以前の病歴、ならびに医学分野で周知の同様の要素を含めた、様々な要素に依存する。

当分野の通常の技量を有する医師または獣医師は、必要な薬学的組成物の有効量を容易に決定および処方することができる。たとえば、医師または獣医師は、所望の治療効果を達成するために必要なレベルよりも低いレベルで、薬学的組成物中に用いる本発明の化合物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増加することができる。

一般に、本発明の化合物の適切な１日用量は、治療効果を生じるために有効な最低の用量である、化合物の量となる。そのような有効用量は、一般に上述の要素に依存する。一般に、示した効果のために使用した場合、患者における本発明の化合物の経口、静脈内、脳室内および皮下用量は、約１ｍｃｇ〜約５ｍｇ／体重１キログラム／時の非限定的な範囲を有する。他の実施形態では、用量は約５ｍｃｇ〜約２．５ｍｇ／体重１キログラム／時の非限定的な範囲を有する。さらなる実施形態では、用量は約５ｍｃｇ〜約１ｍｇ／体重１キログラム／時の非限定的な範囲を有する。

所望する場合は、活性化合物の有効な１日用量は、１日にわたって適切な間隔で別々に投与する２、３、４、５、６回またはそれより多くの部分用量として、任意選択で単位剤形で投与し得る。一実施形態では、化合物は１日１回の用量で投与する。さらなる実施形態では、化合物は、静脈内または他の経路などを通して連続的に投与する。他の実施形態では、化合物は、週１回またはそれ未満などの、１日１回よりも少ない頻度で投与する。

本発明の化合物を単独で投与することは可能であるが、化合物を製薬配合物（組成物）として投与することが好ましい。

この処置を受ける被験体は、霊長類、特にヒト、ならびに他の哺乳動物、たとえば、ウサギ、ウマ科動物、ウシなどの畜牛、ブタ、ヤギおよびヒツジ、家禽およびペット全般を含めた、必要としている任意の動物である。

本発明の化合物は、それ自体で、または薬学的に許容される担体と混合して投与することができ、また、ペニシリン、セファロスポリン、アミノグリコシドおよび糖ペプチドなどの抗微生物剤と併せて投与することもできる。したがって、併用療法には、最初に投与したものの治療効果が、後続を投与した際に完全に消失しない様式で、活性化合物を連続的、同時および別々に投与することが含まれる。

開示した化合物の可能な投与経路
これらの化合物は、任意の適切な投与経路による治療のためにヒトおよび他の動物に投与し得る。本明細書中で使用する用語、投与の「経路」には、それだけには限定されないが、皮下注射、静脈内注射、眼内注射、皮内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、気管内投与、脂肪内投与、関節内投与、くも膜下腔内投与、硬膜外投与、吸入、鼻腔内投与、経口投与、舌下投与、頬側投与、直腸投与、経膣投与、嚢内投与、経皮投与および外用投与、または局所送達による投与（たとえばカテーテルもしくはステントによる）が含まれることを意図する。また、化合物は徐放剤形中で投与または同時投与してもよい。

本発明の方法では、製薬化合物は、坐薬、ガス注入、散剤およびエアロゾル配合物を含めた、鼻腔内、眼内、眼周囲および膣内の経路によって投与することもできる（ステロイド吸入剤の例には、本明細書中に参考として組み込まれている、Ｒｏｈａｔａｇｉ（１９９５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、３５：１１８７−１１９３、Ｔｊｗａ（１９９５）Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｓｔｈｍａ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７５：１０７−１１１を参照）。坐薬配合物は、薬物を、通常温度では固体であるが、体温では液体であり、したがって体内で溶融して薬物を放出する適切な非刺激性賦形剤と混合することによって、調製することができる。そのような材料は、カカオ脂およびポリエチレングリコールである。

本発明の方法では、製薬化合物は、経皮的に、外用経路によって、塗布スティック、液剤、懸濁液、乳剤、ゲル、クリーム、軟膏、ペースト、ジェリー、散剤、およびエアロゾルとして配合して、送達することができる。

本発明の方法では、製薬化合物は、静脈内（ＩＶ）投与または体腔（たとえば滑膜腔）もしくは臓器の管腔内への投与などによって、非経口投与することができる。これらの配合物は、薬学的に許容される担体に溶解した活性剤の溶液を含むことができる。用いることができる許容されるビヒクルおよび溶媒は、水およびリンゲル液、等張塩化ナトリウムである。さらに、無菌の不揮発性油を溶媒または懸濁媒として用いることができる。この目的には、合成のモノまたはジグリセリドを含めた任意の刺激の少ない不揮発性油を用いることができる。

本明細書中に記載のように、本発明の方法は、単独で、または自己免疫疾患もしくは本明細書中に記載の他の状態を処置するための他の手法と組み合わせて使用し得る。

組合せレジメンで用いるための治療（治療剤または手順）の特定の組合せには、所望の治療剤および／または手順の適合性ならびに達成する所望の治療効果を考慮する。また、用いた治療は、同じ障害で所望の効果を達成し得るか（たとえば、本発明の化合物は、同じ障害を処置するために使用する別の薬剤と同時に投与し得る）、または、これらは異なる効果（たとえば任意の有害作用の制御）を達成し得ることを理解されたい。本明細書中で使用する、特定の疾患または状態を処置または予防するために通常投与する追加の治療剤は、「処置する疾患または状態に適切」として知られる。

本明細書中で定義する本発明の組合せ処置は、前記処置の個々の構成要素の同時、連続的または別々の投与によって達成し得る。

治療的応用
本明細書中に記載のポリヌクレオチドまたは変調化合物（本明細書中で以下「治療剤」）の投与は、予防的または治療的な目的のどちらかであり得る。予防的に提供する場合、治療剤はいずれの症状にも先立って提供する。治療剤の予防的投与は、いずれの症状をも予防または減弱させる役割を果たす。治療的に提供する場合、治療剤は疾患または障害の症状が発症した時点（またはその直後）に提供する。治療剤の治療的投与は、症状のいずれの実際の増悪をも減弱させる役割を果たす。

処置する個体は任意の哺乳動物であり得る。一態様では、哺乳動物はヒトである。別の態様では、ヒトは自己免疫疾患または状態に罹患している。他の態様では、自己免疫疾患または状態は、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、再生不良性貧血、グレーブス病、セリアック病、クローン病、ループス、関節炎、骨関節炎、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性脳脊髄炎、および重症筋無力症からなる群から選択される、またはそれに関連する。

他の態様では、ヒトは炎症疾患または状態に罹患している。別の態様では、炎症疾患または状態は、炎症性腸疾患、関節リウマチ、アレルギー、アテローム性動脈硬化症、乾癬、胃炎および虚血性心疾患からなる群から選択される、またはそれに関連する。別の態様では、炎症は、脳死、好ましくは循環内在α−ＭＳＨまたは脳組織中のα−ＭＳＨのレベルが減少している状態に関連している。さらに別の態様では、治療剤を用いて、α−ＭＳＨまたはＭＣ１受容体に媒介される障害または疾患に罹患している被験体を処置する。

別の態様では、本発明は、黒色腫を有する被験体の処置に向けられている。一態様では、本発明は、被験体において黒色腫を減弱または寛解させる。さらに別の態様では、本発明の化合物は、黒色腫を検出またはイメージングするためのアッセイで使用する。

開示した化合物を含むキット
本発明は、本発明の治療レジメンを実施するためのキットも提供する。そのようなキットは、治療上有効な量の、ＭＣ１Ｒモジュレーターとしての特異的活性を有する薬学的に許容される形態のペプチドを、単独で、または薬学的に許容される形態の他の薬剤と組み合わせて含む。好ましい製薬形態には、無菌生理食塩水、デキストロース溶液、緩衝溶液、または他の薬学的に許容される無菌流体と組み合わせたペプチドが含まれる。あるいは、組成物を凍結乾燥または乾燥させ得る。この例では、キットは、薬学的に許容される、好ましくは無菌の溶液をさらに含んで、注射目的のための液剤を形成する。別の実施形態では、キットは、組成物を注射するための、好ましくは無菌形態で包装された針またはシリンジをさらに含み得る。他の実施形態では、キットは、組成物を被験体に投与するための指示手段をさらに含む。指示手段は、書面の挿入物、録音記録、音声映像記録、または被験体への組成物の投与を指示するための任意の他の手段であることができる。一実施形態では、キットは、（ｉ）ＭＣ１Ｒに特異的な変調活性を有するペプチドを含有する第１の容器と、（ｉｉ）使用の指示手段とを含む。

処置方法のさらなる実施形態
一部の実施形態では、本発明は、被験体に、薬学的に許容される賦形剤と、有効量の本明細書中で提供するペプチド化合物のうちの少なくとも１つとを含む薬学的組成物を投与することを含む、移植片拒絶を減少させるかまたは阻害することを必要としている被験体における移植片拒絶を減少させるかまたは阻害する方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、移植した組織、細胞または臓器によって誘発される、被験体の免疫応答を減少または阻害する方法を提供する。移植した組織の非限定的な例は、実験的心臓移植における同種移植片および膵島細胞である。

実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルにおける免疫抑制活性
α−ＭＳＨの新規Ｄ−アミノ酸ペプチド類似体を作製し、実験的自己免疫性ブドウ膜炎（ＥＡＵ）および実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）のモデル、ならびにリポ多糖（ＬＰＳ）サロゲート炎症性疾患モデルにおいて免疫調節効果を評価した。ＲＩ α−ＭＳＨ類似体を用いた処置により、ＥＡＵモデルおよびＭＯＧで誘導したＥＡＥマウスモデルにおいて疾患の臨床的疾患スコアおよび発生率が減少した。さらに、ＭＯＧで初回抗原刺激したマウスの脾臓およびリンパ節におけるＴＮＦ−αおよびＩＬ−１０のｍＲＮＡ発現レベルが、処置したマウスで低下していた。ＬＰＳで誘導した全身性炎症モデルでは、α−ＭＳＨおよび類似体の処置により、血清サイトカインレベルが低下した。これらのデータは、これらの新規α−ＭＳＨ類似体が炎症および自己免疫疾患において治療的用途の潜在性を有することを示している。

材料および方法
ペプチド。α−ＭＳＨ（ＳＹＳＭＥＨＦＲＷＧＫＰＶ）をＢａｃｈｅｍ（ペンシルバニア州Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ）から購入した。Ｄ−アミノ酸ＲＩ α−ＭＳＨ類似体（ｖｐｋｇｗｒｆｈｅｍｓｙｓ）、ＲＩ α−ＭＳＨのアラニン置換ペプチド、（ステアリル）ＨｆＲＷ（８２０）、（Ｐｈ（ＣＨ_２）_３ＣＯ）ＨｆＲＷ（８１９）、およびＲＩ α−ＭＳＨ類似体８９１［ｖｐｋＧｗｒ（Ｄ−Ｃｈａ）ｈｓｉｉｓｓ］は、Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐａｔｉｏｎによって標準の固相技術を用いて合成され、逆相ＨＰＬＣによって精製された。スクランブルＤアミノ酸対照ペプチド（ｋｓｒｓｍｇｖｆｐｅｙｈ）はＧｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐａｔｉｏｎによって合成された。非関連のＤアミノ酸対照ペプチド（ｐｌｙｋｋｉｉｋｋｌｌｅｓ）はＧｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐａｔｉｏｎによって合成された。

動物。５〜６週齢の雌のＢ１０．ＲＩＩＩ−Ｈ２ｒマウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（メイン州Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ）から購入した。

６〜８週齢の雌または雄のＣ５７ＢＬ／６マウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（メイン州Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ）から購入した。動物研究のすべてのプロトコルは、Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐａｔｉｏｎの施設内動物飼育使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ、ＩＡＣＵＣ）の承認を満たしていた。

ＥＡＵ誘導。雌のＢ１０．ＲＩＩＩを、それぞれ結核菌Ｈ３７Ｒａ（Ｄｉｆｃｏ、ミシガン州Ｄｅｔｒｏｉｔ）を含む２ｍｇ／ｍｌの完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）中の合計２００μｇの光受容体間結合タンパク質ペプチド（ＩＲＢＰ）１６１−１８０（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ、マサチューセッツ州Ｆｉｔｃｈｂｕｒｇ）を用いて、２つの部位（肩甲骨と骨盤領域との間）に皮下注射した。

眼の採点。マウスの眼を、１または２滴のＭｙｄｒｉａｃｙｌ１％（Ａｌｃｏｎ、プエルトリコＨｕｍａｃａｏ）を用いて散大させ、暗室内で約５分間休ませた。マウスを手動で抑制し、７８ジオプターのレンズを備えた倒像検眼鏡を用いて両眼の網膜を可視化した。０〜５の進行性採点システムを用いて、眼を炎症について採点した。スコア０：正常な網膜。スコア１：視神経に近位の血管炎症。スコア２：眼の１つの四分円に限定された５未満の炎症性病変。スコア３：眼の１を超える四分円中に５を超える炎症性病変。スコア４：炎症性病変が連続的である。スコア５：網膜剥離。マウスから全眼を採取し、ＰＢＳ中に入れた。凍結固定用に眼をＯＣＴ培地に包埋した。５μｍの切片を乳頭−視神経の平面を通って切断し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。

メラノコルチン受容体との結合研究。α−ＭＳＨ、ＲＩ α−ＭＳＨ、およびスクランブルペプチドの結合プロフィールをメラノコルチン受容体１、３、４、および５に対して測定した。結合は、（Ｎｌｅ４，Ｄ−Ｐｈｅ７）α−ＭＳＨ（Ｂａｃｈｅｍ）との競合的結合アッセイを用いて行なった。結合分析は、コード化された試料を用いてＣｅｒｅｐ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（フランスＰａｒｉｓ）によって行なった。

また、ペプチドの結合に続いて、ＨＥＫ２９３細胞系由来の膜調製物を用いて、メラノコルチン受容体１、３、４、および５の結合における^１２５Ｉ−ＮＤＰ−ＭＳＨとの競合を行なった。Ｖ字底の９６ウェルプレート内、結合緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７、１．５ｍＭのＣａＣｌ_２、１ｍＭのＭｇＳＯ_４、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．２％のＢＳＡ）中でペプチドを^１２５Ｉ−（Ｎｌｅ４，Ｄ−Ｐｈｅ７）−α−ＭＳＨ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、マサチューセッツ州Ｂｏｓｔｏｎ）と混合し、１〜１０ｆｍｏｌの受容体を含有するＨＥＫ２９３形質移入細胞系由来の膜調製物（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、マサチューセッツ州Ｂｏｓｔｏｎ）と共に、１時間２５℃で混合した。３μＭの（Ｎｌｅ４，Ｄ−Ｐｈｅ７）−ＮＤＰ−ＭＳＨ（Ｂａｃｈｅｍ）を陽性対照として使用した。混合物を９６ウェルのＧＦＣフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ）を通して濾過し、ＢＳＡを含まない結合緩衝液で３回洗浄し、乾燥させ、計数した。

ｃＡＭＰの測定。アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ））からのＢ１６−Ｆ１（黒色腫細胞系）細胞を、平底の９６ウェルプレートに５×１０^４／ウェルで播種し、終夜、２ｍＭのグルタミン、抗生物質（１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシン）および１０％の熱失活させたウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ニューヨーク州Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ）を補充したＤＭＥＭ（Ｃａｍｂｒｅｘ、メリーランド州Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ）中で培養した。その後、細胞をネイティブα−ＭＳＨ（０．０１〜１０００ｎｇ／ｍｌ）、レトロ−インバーソα−ＭＳＨ（０．０１〜１０００ｎｇ／ｍｌ）、またはスクランブルＤアミノ酸対照ペプチド（０．０１〜１０００ｎｇ／ｍｌ）で３０分間処理た。細胞を溶解し、細胞内ｃＡＭＰレベルを酵素免疫アッセイキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）によって測定した。１００μＭのフォルスコリン（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）が陽性対照として役割を果たした。

ＥＡＥの誘導および採点。雌のＣ５７ＢＬ／６マウスを、０．６ｍｇの結核菌（Ｄｉｆｃｏ、ミシガン州Ｄｅｔｒｏｉｔ）を含有する完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）中のＭＯＧ３５−５５ペプチド（２００μｇ／マウス、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ、マサチューセッツ州Ｆｉｔｃｈｂｕｒｇ）の乳剤で免疫化した。乳剤は、０．２ｍｌ／マウスの体積で、２つの部位への皮下注射によって送達した。ＰＢＳ中の百日咳菌（ＰＴＸ、Ｓｉｇｍａ）はｉ．ｐ．投与経路を介して４００ｎｇ／動物の用量で使用し、０日目および３日目に投与した。マウスを１日１回、ＥＡＥの麻痺症状について監視した。０〜５の進行性採点システムを用いて、マウスを臨床症状について採点した。スコア０：疾患なし、スコア１：弛緩した尾部、スコア２；後肢の脱力、スコア３：後肢の麻痺、スコア４：前足の脱力／部分麻痺、スコア５；死亡。脊髄および脳を採取し、ヘマトキシリンおよびエオシン染色用にパラフィンに包埋した。

増殖アッセイ。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾細胞およびリンパ節細胞を９６ウェルプレート中、５×１０５個の細胞／ウェルで培養した。ＭＯＧ３５−５５またはＯＶＡ２５７−２６４ペプチドを２５μｇ／ｍｌの濃度でウェルに加えた。ＭＯＧペプチド刺激の４８時間後に上清を収集した。３日間培養した後、細胞に［３Ｈ］チミジンを１μＣｉ／ウェルで８時間パルスした。チミジンの取り込みはｃｐｍによって測定した。

サイトカインＲＮＡ分析−ＲＴ−ＱＰＣＲ。ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を用いて、全ＲＮＡを組織から抽出した。１μｇの全ＲＮＡを逆転写し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）からの試薬を用いたＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎの取り込みをＡＢＩ ７９００で使用することによる、定量的ＰＣＲで使用した。ｃＤＮＡ標準をサイトカイン標的用のそれぞれのＰＣＲで流し、メッセージの濃度はマウスβ−アクチンに対して正規化した。これらのデータを得るために使用したプライマーは以下のとおりであった：マウスＴＮＦα順方向−ｇｇｃａｇｇｔｃｔａｃｔｔｔｇｇａｇｔｃａｔｔｇｃおよび逆方向−ａｃａｔｔｃｇａｇｇｃｔｃｃａｇｔｇａａｔｔｃｇｇ（１）。本発明者らは、マウスＩＬ−１０順方向：ｔｇｃｔａｔｇｃｔｇｃｃｔｇｃｔｃｔｔａおよび逆方向：ｔｃａｔｔｔｃｃｇａｔａａｇｇｃｔｔｇｇ（２）を使用した。マウスβ−アクチンの配列は、順方向ｇｔｇｇｇｃｃｇｃｔｃｔａｇｇｃａｃｃａａおよび逆方向ｃｔｃｔｔｔｇａｔｇｔｃａｃｇｃａｃｇａｔｔｔｃ（３）である。

ＣＢＡ分析。マウス血清または細胞上清の炎症性サイトカインプロフィールのフローサイトメトリー測定分析は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（カリフォルニア州Ｓａｎ Ｊｏｓｅ）によって作製された細胞数測定ビーズ・アレイ・キット（ＣＢＡ）を用いて測定した。試料は製造者のプロトコルに従って処理した。

ｍＭＣ１ＲのＲＮＡ分析−ＲＴ−ＱＰＣＲ。ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を用いて、全ＲＮＡを組織から抽出した。１μｇの全ＲＮＡを逆転写し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）からの試薬を用いたＴａｑｍａｎキットをＡＢＩ ７９００で使用することによる、定量的ＰＣＲで使用した。ｃＤＮＡ標準をｍＭＣ１Ｒ用のそれぞれのＰＣＲで流し、メッセージの濃度は真核１８Ｓ内在性コントロール（ＶＩＣ／ＭＧＢプローブ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、パート＃４３１９４１３Ｅ）に対して正規化した。ｍＭＣ１Ｒのプライマーは以下のとおりであった：順方向ＣＴＣＴＧＣＣＴＣＧＴＣＡＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＡおよび逆方向ＡＡＣＡＴＧＴＧＧＧＣＡＴＡＣＡＧＡＡＴＣＧならびにプローブＣＣＡＴＧＣＴＧＧＣＡＣＴＣＡ。これらは、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ ３．０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）を用いて設計した。

ＬＰＳモデル。雄のＣ５７ＢＬ／６マウスを、ＬＰＳ（１μｇ／マウス）、ｉ．ｐ．を用いて免疫誘発した。３０分後、マウスをデキサメタゾン（２ｍｇ／ｋｇ、Ｓｉｇｍａ）、ＲＩ−α−ＭＳＨ類似体８９１、またはＲＩ−α−ＭＳＨで処置した。ＬＰＳ免疫誘発後の２時間の時点で、マウスを血清のために出血させた。サイトカイン分析は細胞数測定ビーズ・アレイ・キット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたフローサイトメトリーによって測定した。

統計分析。結果は平均±ＳＤとして表した。それぞれの実験を少なくとも２回繰り返した。結果を分析するために、一方向ＡＮＯＶＡおよびチューキー多重比較試験を用いた。

以下の実施例は、本発明を例示するために提供するが、それを限定するものではない。

実施例１
実験的自己免疫性ブドウ膜炎（ＥＡＵ）モデルにおける免疫抑制活性
自己免疫性ブドウ膜炎とは、疼痛および失明をもたらす場合がある眼の炎症性障害である。ステロイドおよび免疫抑制薬のみがブドウ膜炎の現在の治療剤であり、重篤な眼球および全身性の毒性をしばしば有する。したがって、より安全な代替の治療剤が所望される。

ＥＡＵとは、米国において２３０万人を患わせるヒトブドウ膜炎の動物モデルである。光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）もしくはそのペプチド断片または網膜Ｓ抗原（Ｓ−Ａｇ）をアジュバントと共に用いた免疫化により、感受性系統のげっ歯類において疾患を誘導することができる。この疾患は、自発性の再発がない自然の回復を伴う、眼の網膜における炎症細胞の浸潤および光受容体の損傷を含む。同系のげっ歯類レシピエントへのブドウ膜炎誘発性のＴ細胞の養子移植により、ブドウ膜炎が、多発性硬化症、１型糖尿病および関節リウマチなどの多くの他の類似の自己免疫疾患と同様に、臓器特異的なＴ細胞に媒介される自己免疫疾患であることが示唆される。

眼球微小環境は、局所炎症を予防するために免疫抑制を維持するための機構が配置されている免疫特権部位である。眼球組織中のニューロンによって発現されるいくつかの神経ペプチドは、眼中の免疫特権を持続させることを支援する。これらの神経ペプチドのうちの１つは、３０ｐｇ／ｍｌの生理的濃度で眼球微小環境中において構成的に発現される、α−ＭＳＨである。

ラットにおける内毒素で誘導したブドウ膜炎を誘導中のネイティブα−ＭＳＨの全身投与により、眼房水中の浸潤細胞の数ならびにＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−２、および一酸化窒素のレベルを用量依存的な様式で阻害された。マウスＥＡＵモデルでは、網膜炎症のピーク時にα−ＭＳＨを投与することで、疾患の重篤度が抑制された。α−ＭＳＨは、Ｔ細胞上のメラノコルチン５受容体（ＭＣＲ−５）を介してＴ調節細胞を誘導し、ＥＡＵを抑制することができる。

ネズミ後部ブドウ膜炎モデルにおけるネイティブα−ＭＳＨ処置の有効性を評価した。ＩＲＢＰ１６１−１８０およびＣＦＡの注射を用いてＢ１０．ＲＩＩＩマウスでブドウ膜炎を誘導した。疾患の発症は抗原刺激後の約１０日目に起こった。１３日目に眼スコアが２〜３に達した際に、マウスにネイティブα−ＭＳＨを連続する７日間、２００μｇ／マウスでｉ．ｖ．投与したか、または未処置のままにした。予防的処置は、エフェクター相ではなく疾患の初回抗原刺激相における活性を標的とし得るため、処置は活性な網膜炎症が観察された後に開始した。さらに、この処置戦略は臨床応用をより良好に要約する。α−ＭＳＨで処置したマウスは、未処置のマウスと比較して、７日間の処置過程全体にわたって平均臨床的眼スコアの減少を示した（図１ａ）。１５日目に最大平均眼スコア３．６７±０．５２に達した未処置のマウスの群と比較して、α−ＭＳＨで処置したマウスは１３日目に最大平均眼スコア２．８３±０．３９を示した。

実施例２
Ｂ１０．ＲＩＩＩ実験的自己免疫性ブドウ膜炎モデルにおけるネイティブα−ＭＳＨとデキサメタゾンとの比較
ブドウ膜炎の現在の治療形態には、コルチコステロイドおよび免疫抑制剤が含まれる。ネイティブα−ＭＳＨの有効性を既知のコルチコステロイド治療であるデキサメタゾンと比較した。ＩＲＢＰ１６１−１８０およびＣＦＡの注射を用いてＢ１０．ＲＩＩＩマウスでブドウ膜炎を誘導した。マウスが臨床的眼スコア１に達した疾患発症時に、マウスにネイティブα−ＭＳＨ（１００μｇ／マウス）、０．２ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾン、または２．０ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾンの１日１回の腹腔内注射を投与した。マウスを１日１回、２１日間処置した。ＰＢＳ対照マウスと比較して、ネイティブα−ＭＳＨで処置したマウスは処置過程の全体にわたって平均臨床的眼スコアの有意な減少を示した（図１Ｂ）。データから、ネイティブα−ＭＳＨの１日１回のｉ．ｐ．投与により、０．２ｍｇ／ｋｇまたは２．０ｍｇ／ｋｇのどちらの用量のデキサメタゾン処置よりも高い度合でブドウ膜炎が抑制されたことが示される。

実施例３
ＭＣＲ−１と特異的に結合する新規レトロ−インバーソα−ＭＳＨ類似体
ネイティブα−ＭＳＨの新規の安定なＤ−アミノ酸ペプチド類似体を合成し（ＲＩ α−ＭＳＨ）、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび実験的自己免疫性ブドウ膜炎（ＥＡＵ）モデルにおける免疫調節能力を評価した。結合研究により、ネイティブα−ＭＳＨとは異なり、ＲＩ
α−ＭＳＨは抗炎症性α−ＭＳＨ受容体（ＭＣＲ−１）と特異的に結合するが、他のどのα−ＭＳＨ受容体（ＭＣＲ−３、４、または５）とも結合しないことが示された。

ＲＩ α−ＭＳＨ類似体とメラノコルチン受容体（ＭＣＲ）との結合を分析した。ＭＣＲ１、３、４、および５を含めたＭＣＲパネルを用いた競合的結合アッセイを行なった。ペプチドの結合に続いて、以前に記載した^１２５Ｉ−ＮＤＰ−ＭＳＨとの競合を行なった。ネイティブα−ＭＳＨはＭＣＲ１、３、４、および５と結合した。しかし、ネイティブα−ＭＳＨとは異なり、ＲＩ α−ＭＳＨは炎症反応を調節するＭＣＲ−１とのみ結合することが見い出された（表１）。スクランブルＤアミノ酸対照ペプチドはメラノコルチン受容体のいずれとも結合しなかった。ＭＣＲ−１と特異的結合し、ＭＣＲ−３およびＭＣＲ−４結合を排除するα−ＭＳＨ類似体の開発により、ネイティブα−ＭＳＨがこれらの受容体の結合を介して生じる潜在的な副作用を低下させることができる。

ペプチドの結合に続いて、ＨＥＫ２９３細胞系由来の膜調製物を用いて、メラノコルチン受容体１、３、４、および５の結合における^１２５Ｉ−ＮＤＰ−ＭＳＨとの競合を行なった。図１８に示すように、ＲＩ α−ＭＳＨはＭＣ１Ｒに対する非常に強力な選択性を示し、Ｋｉ値はＭＣ３、４および５Ｒのいずれでも３０μＭを超えている一方で、α−ＭＳＨは４つの受容体すべてと有意な結合を示し、ＭＣ３Ｒと比較してＭＣ１Ｒに対する選択性は１００倍未満であった。

実施例４
レトロ−インバーソα−ＭＳＨ類似体を用いた処置により、ＥＡＵにおける疾患が寛解される
新規レトロ−インバーソα−ＭＳＨペプチド類似体の免疫調節効果を実験的自己免疫性ブドウ膜炎マウス（ＥＡＵ）モデルにおいて観察し、結果をネイティブα−ＭＳＨペプチドと比較した。疾患の発症時または疾患の後期段階中にＲＩ α−ＭＳＨを全身性送達することで、ブドウ膜炎が劇的かつ再現可能に寛解された。さらに、新規ＲＩ α−ＭＳＨペプチド類似体を用いた処置により、ブドウ膜炎がネイティブα−ＭＳＨペプチドと同様の規模まで抑制された。これらのデータは、新規ＲＩ α−ＭＳＨ類似体が抗炎症活性を示し、ブドウ膜炎ならびに他の自己免疫疾患および炎症において治療的用途を有することを示している。

ＩＲＢＰ１６１−１８０を用いて雌のＢ１０．ＲＩＩＩマウスでＥＡＵを誘導した。ＲＩ α−ＭＳＨおよびネイティブα−ＭＳＨの、予防的ではなく治療的処置としての有効性を調査した。マウスが中等度のブドウ膜炎の疾患段階（眼スコア２）に達した時点に開始して、マウスを、１００μｇ／マウスのＲＩ α−ＭＳＨ、１００μｇ／マウスのネイティブα−ＭＳＨ、またはＰＢＳを用いた１日１回の静脈内注射によって処置した。図２Ａに見られるように、対照のＰＢＳで処置したマウスは、１６日目に平均眼スコア２．７５±０．６８の最大眼スコアに達した。しかし、ＰＢＳ対照マウスと比較して、ＲＩ α−ＭＳＨ類似体またはネイティブα−ＭＳＨで１日１回処置したマウスは、処置過程全体にわたって平均臨床的眼スコアの有意な減少を示した。１６日目、処置開始の４日後に、ＰＢＳで処置した群中の８匹のマウスのうちの５匹が３以上の最大眼スコアを有していた一方で、ネイティブα−ＭＳＨで処置した８匹のマウスのうちの１匹のみおよびＲＩ α−ＭＳＨで処置した８匹のマウスのうちの０匹が３以上の最大眼スコアを有していた（図２Ｂ）。

実施例５
ＲＩ α−ＭＳＨで処置した被験体の網膜画像および組織学調査は、ＥＡＵモデルにおける疾患の抑制を示す
後期段階のブドウ膜炎で開始して、ＲＩ α−ＭＳＨまたはネイティブα−ＭＳＨで１日１回処置したマウスからの網膜画像は、ＰＢＳ対照マウスと比較した疾患の抑制を示す。眼底検査画像は、処置開始後の１３日目に得た（図３）。ＰＢＳで処置した群における疾患は安定化または進行し、眼全体にわたる重篤な血管炎および炎症性病変を伴う中央値眼スコア３を有していた（図３Ａ）。しかし、ＲＩ α−ＭＳＨおよびネイティブα−ＭＳＨペプチドで処置したマウスのどちらにおいても疾患は迅速に回復した。網膜画像により、視神経のみで炎症を有する眼スコア１が示された（図３Ｂおよび３Ｃ）。各群中の個々のマウスの最大眼スコアを図３Ｄに示す。ＰＢＳで処置した群では、１１匹のマウスのうちの７匹が３以上の眼スコアを有していた。しかし、ネイティブα−ＭＳＨおよびＲＩ
α−ＭＳＨ中の１１匹のマウスのうちの２匹のみが３以上の眼スコアを有していた。

１日１回の処置を開始した１０日後の眼の組織学調査により、ＲＩ α−ＭＳＨおよびネイティブα−ＭＳＨがどちらも、眼における病理を減少させたことが示された（図４）。ネイティブα−ＭＳＨおよびＲＩ α−ＭＳＨで処置したマウスは、視神経領域中に軽微な炎症を有する正常な網膜構造を示す（図４Ｂおよび４Ｃ）。対照的に、ＰＢＳで処置したマウスは眼球炎症および組織損傷を示す。光受容体の損傷を伴った炎症が網膜および視神経領域中で見られる（図４Ａ）。

実施例６
ＥＡＵにおけるレトロ−インバーソα−ＭＳＨとスクランブル対照ペプチドとの腹腔内投与の比較
ＩＲＢＰ１６１−１８０およびＣＦＡの注射を用いてＢ１０．ＲＩＩＩマウスでブドウ膜炎を誘導した。本発明者らは、後期疾患（眼スコア２〜３）中にＲＩ α−ＭＳＨを用いた１日１回の腹腔内注射によって処置を開始することを評価し、有効性を対照スクランブルＤアミノ酸ペプチドと比較した。マウスを１日１回、ｉ．ｐ．で、１３日間、１００μｇ／マウスのＲＩ α−ＭＳＨまたはスクランブルペプチドを用いて処置した。スクランブルペプチド対照マウスと比較して、ＲＩ α−ＭＳＨで処置したマウスは、疾患の過程の１５、２１および２３日目に平均臨床的眼スコアの有意な減少を示した（ｐ＜０．０４）（図５）。疾患誘導後の２３日目の個々の最大眼スコアにより、１以下のスコアを有する対照スクランブルペプチド群中のマウスは存在しなかったことと比較して、ＲＩ α−ＭＳＨにおいて７５％のマウスが１以下のスコアを有することが示された。疾患の過程の全体にわたる４つの時点でマウスの個々の体重を記録した。ＲＩ α−ＭＳＨで処置した群およびスクランブルペプチドで処置した群のどちらのマウスも、すべてその体重を維持したか、または正常な体重増加を示した（データ示さず）。ペプチドを用いた１日１回の腹腔内投薬は体重減少をもたらさなかった。さらに、１００μｇ／マウスのネイティブα−ＭＳＨまたはＲＩ α−ＭＳＨの腹腔内投与経路は、疾患の発症時、マウスが臨床的眼スコア１に達した際に処置を投与した場合に、ブドウ膜炎において有効性を有していた（データ示さず）。したがって、ＲＩ α−ＭＳＨの腹腔内投与経路は、スクランブル対照ペプチドと比較して疾患スコアの有意な減少を示した。

実施例７
ＥＡＵモデルへの様々な用量のＲＩ α−ＭＳＨの投与
また、本発明者らは、後期の重篤なブドウ膜炎中のレトロ−インバーソα−ＭＳＨ処置の有効性および最適な投薬も調査した。Ｂ１０．ＲＩＩＩマウスにＩＲＢＰ１６１−１８０およびＣＦＡを注射してブドウ膜炎を誘導した。マウスを、１００μｇ、１０μｇまたは３μｇ／マウスのＰＢＳ、対照スクランブルペプチド（１００μｇ／マウス）、またはＲＩ α−ＭＳＨを用いて１日１回、ｉ．ｐ．で処置した。マウスが、眼の後区全体にわたる炎症性病変および起こり得る出血が含まれる眼スコア４に達した疾患のピーク時に、処置を開始した。ＰＢＳおよびスクランブルペプチド対照群の疾患は重篤なままであった（図６）。対照的に、１００μｇまたは１０μｇ／マウスのＲＩ α−ＭＳＨを用いた処置により、ブドウ膜炎が迅速に寛解された（ｐ≦０．０５）。さらに、１０および１００μｇ／マウスの用量は同等に有効であった。３μｇ／マウスのＲＩ α−ＭＳＨの用量は疾患を減少も阻害もしなかった。

実施例８
ｃＡＭＰレベルに対するレトロ−インバーソα−ＭＳＨの効果
ネイティブα−ＭＳＨ、ＲＩ α−ＭＳＨ、またはスクランブル対照ペプチドで処理した後のＢ１６−Ｆ１黒色腫細胞中のｃＡＭＰレベルを調査した。Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫細胞系は、１００〜２００個の受容体／細胞のみを発現するマクロファージ細胞系と比較して、高い数のＭＣＲ１受容体（３０００〜４０００個の受容体／細胞）を発現する。したがって、本発明者らは、黒色腫細胞系に対するＲＩ α−ＭＳＨ処理の効果を調査することを選択した。ネズミ黒色腫Ｂ１６−Ｆ１細胞を、１ｐｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌの濃度のネイティブα−ＭＳＨ、ＲＩ α−ＭＳＨ、または対照スクランブルペプチドで処理した。３０分後、細胞を溶解し、酵素免疫アッセイによって細胞内ｃＡＭＰを測定した。細胞の、一般的にｃＡＭＰレベルを高めるために使用するフォルスコリン対照（１００μＭ）処理により、ｃＡＭＰの増加が示された（３４５５．３９±４０６．６ＳＤ）。未処理の細胞と比較して、ネイティブα−ＭＳＨで処理した細胞においてｃＡＭＰレベルが用量依存的な様式で有意に上昇した（図７Ａ）。また、ＲＩ α−ＭＳＨ類似体も、未処理またはスクランブルペプチド対照と比較して、用量依存的な様式でｃＡＭＰレベルを有意に増加させた。しかし、１０ｐｇ／ｍｌの濃度でｃＡＭＰを増加させたネイティブα−ＭＳＨと比較してｃＡＭＰを増加させるためには、より高濃度のＲＩ α−ＭＳＨ（１００ｎｇ／ｍｌ）が必要であった。ｃＡＭＰレベルを増加させるために必要なこのペプチド濃度の差異は、ＭＣＲ１受容体に対する結合親和性の結果であり得る。

実施例９
配列変動ならびにｃＡＭＰレベルおよび結合ＭＣ１Ｒに対する効果
ＭＳＨはＭＣ１Ｒ、ＭＣ３Ｒ、ＭＣ４Ｒ、およびＭＣ５Ｒと結合し、ＭＣ１Ｒは免疫媒介性疾患の所望の標的の１つである。レトロ−インバーソＭＳＨ（ＲＩ−ＭＳＨ）は増強された血漿安定性（図１７）およびＭＣ１Ｒ選択性を有するように操作されているが、ＭＣ１Ｒに対するその親和性はネイティブＭＳＨペプチドよりも１１倍低い（表１）。ＭＣ１Ｒの親和性を修復するために、本発明者らは、ＭＳＨのＭＣ１Ｒ親和性を改善させることが知られている修飾をＲＩ−ＭＳＨ内に移植した。ＭＳＨのＭＣ１Ｒ親和性を増強させるＮ末端ＳＹＳＭＥ配列の３つの置換（脂肪酸アシル、フェニル酪酸、およびＳＳＩＩＳ配列）のうち、最後のみがＲＩ−ＭＳＨの有意な改善をもたらした。ＲＩ−ＭＳＨのＤ−アラニン走査アナロギング（ａｎａｌｏｇｉｎｇ）によりＭＳＨのアラニン走査アナロギングと同様の構造活性関係が示されたが、コアの４残基ＭＣ１Ｒ結合領域の立体化学反転走査ではＭＳＨとＲＩ−ＭＳＨとの間に有意な差異が示唆される。さらに、主要なフェニルアラニン残基でのシクロヘキシルアラニン置換により、ＭＣ１ＲとのＲＩ−ＭＳＨの結合は改善されたが、ＭＳＨ結合は改善されなかった。安定性の改善およびＲＩ−ＭＳＨの高いＭＣ１Ｒ選択性に重要なレトロ−反転立体配置を保持しながら、シクロヘキシルアラニンおよびＳＳＩＩＳ置換を組み合わせることでＭＣ１Ｒに対するＭＳＨ親和性の完全な修復がもたらされた。

一組のレトロ−インバーソＭＳＨ（ＲＩ−ＭＳＨ）のアラニン走査類似体（ペプチド８０４〜８１６）を調製し、Ｂ１６／Ｆ１ネズミおよびＭ６２４ヒト黒色腫細胞においてｃＡＭＰ誘導について試験した。その後、ｃＡＭＰの結果に基づいたサブセットをＭＣ１Ｒの結合について試験した。ＭＣ１Ｒを結合する観察されたＫｉ値を表１に示す。

ネズミ黒色腫Ｂ１６−Ｆ１細胞を１μｇ／ｍｌのネイティブα−ＭＳＨ、ＲＩ α−ＭＳＨ、スクランブルペプチド対照、ＫＰＶ、またはＲＩ α−ＭＳＨのアラニン置換ペプチドで処理した（図７Ｂ）。細胞のフォルスコリン対照（１００μＭ）処理はｃＡＭＰの増加を示した（３２９４．８２±５４．５３）。ｃＡＭＰレベルは、未処理、スクランブルペプチド、またはＫＰＶで処理した細胞と比較して、ネイティブα−ＭＳＨおよびＲＩ
α−ＭＳＨで処理した細胞で有意に上昇していた。８１０、８１１、および８１２と命名したアラニン置換ペプチドはｃＡＭＰ活性の増加を示さず、未処理、スクランブルペプチドまたはＫＰＶで処理した細胞と同等のｃＡＭＰレベルを示した。８１０、８１１、および８１２と命名したペプチドは中心コアテトラペプチド配列（Ｄ−Ｔｒｐ Ｄ−Ａｒｇ
Ｄ−Ｐｈｅ Ｄ−Ｈｉｓ領域、アミノ酸５〜８）中にアラニン置換を有し、これはネイティブα−ＭＳＨとメラノコルチン受容体およびその生物活性との結合に関与していると提案されている。ＲＩ α−ＭＳＨペプチドのＮ末端またはＣ末端領域でのアラニン置換は、黒色腫細胞中のｃＡＭＰ蓄積に影響を与えなかった。メチオニンおよびヒスチジンアミノ酸中のアラニン置換（８０７および８０９）もｃＡＭＰ蓄積の減少を示したが、コアテトラペプチド配列中（８１０、８１１または８１２）で見られたものほど大きくなかった。コアテトラペプチド中の残基（ｗｒｆｈ）、およびより低い程度でＲＩ−ＭＳＨのメチオニン４は、ＭＣ１Ｒとの結合に重要である。

ＭＣ１Ｒに対するＭＳＨの親和性を増加させることが示されている別の手段が、ＭＳＨ変異体配列のファージディスプレイに基づいた選択を用いて実証されている。続いて、高度にＭＣ１Ｒ選択的な配列（ＭＳ０５）がファージディスプレイで選択したペプチドと親ＭＳＨ配列の一部分との組換えによって見つかり、これにより、ＭＣ１Ｒに対するナノモーラー以下の親和性が得られた。ＭＳ０５は、ＭＣ１Ｒに対する親和性がＭＳＨよりもわずかに低いと報告されていたにもかかわらず（Ｋｉは０．８６５ｎＭ ｖｓ． ＭＳＨで０．５５７ｎＭ）、予想外に、この配列のレトロ−インバーソ型によって、ＭＣ１Ｒに対する親和性（１ｎＭ、表１のペプチド８８６）はＲＩ−ＭＳＨ（４ｎＭ）よりも高かったことが示された。

ＲＩ−ＭＳＨのそれぞれの位置での荷電および構造のわずかな相違を取り込ませた、いくつかの非天然アミノ酸残基の置換により、ＭＣ１Ｒは高度に保存された変化のみを許容することが示された。３つ以外のすべてが、より低いまたは同等の結合を示した。２つの変化がＭＣ１Ｒに対する親和性の有意な増加をもたらした：Ｄ−フェニルアラニンのＤ−シクロヘキシルアラニンによる置換（Ｄ−Ｃｈａ、ペプチド８６９、２．２ｎＭのＫｉ）およびＤ−メチオニンのＤ−ブチオニンによる置換（ペプチド８７８、２．３ｎＭのＫｉ）。Ｌ−シクロヘキシルアラニンを用いた置換を行い、ＭＣ１Ｒとの結合をわずかに阻害することが見い出された（ペプチド８９２、Ｋｉは０．５１ｎＭ ｖｓ． ＭＳＨで０．４１ｎＭ）。予想外に、ブチオニンおよびシクロヘキシルアラニン置換の組合せは、ＭＣ１Ｒに対する親和性のさらなる有意な増加を生じることができなかった（ペプチド８９０、１．９ｎＭのＫｉ）。しかし、ＲＩ−ＭＳＨにおいてＭＳ０５のレトロ−インバーソＮ末端配列（ｓｉｉｓｓ）をＣ末端配列（ｅｍｓｙｓ）で置換し、およびＤ−シクロヘキシルアラニンをＤ−Ｐｈｅで置換することを含む変化の組合せにより、それぞれの変化単独よりも大きな結合の増強が生じ、これは、効果が相乗的であることを示している。生じるペプチド（８９１）は、ＭＳＨとは明白に異なるＭＣ１Ｒに対するＫｉを示した。この変化および他の変化により他のＭＣＲに対する親和性の増加も生じたが、Ｋｉ値は依然としてマイクロモルの範囲内にあり、ＲＩ−ＭＳＨの選択性の大部分が保存されたことを示している。変化を図２０に例示する。代表的な競合的結合アッセイを図２１に示す。観察されたＫｉ値には表１を参照されたい。

実施例１０
ＲＩ α−ＭＳＨを用いた処置はＥＡＥにおいて臨床的疾患スコアを減少させる
慢性の進行性ＥＡＥマウスモデルにおける、ネイティブα−ＭＳＨおよびＲＩ α−ＭＳＨ類似体の投与の効果を評価した。雌のＣ５７ＢＬ／６マウスを、２００μｇのＣＦＡで乳化したＭＯＧ３５−５５ペプチドで免疫化した。百日咳毒素を０および２日目に投与した。臨床症状の兆候および重量減少についてマウスを１日１回監視した。８日目に開始してマウスを麻痺の症状について評価し、０〜５の評点システムで採点した。麻痺の臨床症状の出現は、ほとんどのマウスで約９〜１１日目に現れた（図８Ａ）。１００μｇ／マウスのα−ＭＳＨまたはＲＩ α−ＭＳＨペプチドまたはＰＢＳ対照を用いた１日１回の腹腔内（ｉ．ｐ．）処置を１０日目に開始した。ＰＢＳ対照と比較して、１００μｇのＲＩ α−ＭＳＨで処置したマウスは平均臨床的疾患スコアの有意な減少を示した（図８Ａ）。ＰＢＳビヒクル対照と比較して、ＲＩ α−ＭＳＨでｐ≦０．０５の有意性は１４〜２２日目に達した。しかし、ネイティブα−ＭＳＨペプチド処置は疾患の誘導または進行に効果がなかった。ＰＢＳ（８０％）またはネイティブα−ＭＳＨで処置した（７５％）マウスの群と比較して、ＲＩ α−ＭＳＨで処置したマウスの群における疾患の最大％発生率（２０％）も減少した。

実施例１１
ＥＡＥにおけるＲＩ α−ＭＳＨの用量変動
ＲＩ α−ＭＳＨの治療効果は１００μｇ／マウスの用量で明らかであった。１００μｇ／マウスおよび３０μｇ／マウスのα−ＭＳＨまたはＲＩ α−ＭＳＨペプチドを用いた処置をＭＯＧ ＥＡＥマウスモデルで試験した。１日１回のｉ．ｐ．処置をＭＯＧ免疫化後の１０日目に開始した。１日１回のデキサメタゾン（２ｍｇ／ｋｇ）処置を対照治療剤として加えた。１００μｇのＲＩ α−ＭＳＨで処置したマウスは、ＰＢＳ対照と比較した平均臨床的疾患スコアの減少を繰り返し示した（図９）。しかし、３０μｇ／マウスのＲＩ α−ＭＳＨの用量は、平均臨床スコアの減少に有意な効果を有さなかった。デキサメタゾン処置も疾患の過程全体にわたって疾患スコアの減少を示した。ネイティブα−ＭＳＨで処置したマウスはＰＢＳよりも低い平均臨床スコアを有していたが、α−ＭＳＨで処置したマウスはＲＩ α−ＭＳＨまたはデキサメタゾンで処置したマウスと同様の有効性を示さなかった。７５％の疾患の最大発生率を示したＰＢＳで処置したマウスと比較して、ＲＩ α−ＭＳＨで処置した群における疾患の％発生率は最大３５％に達し、デキサメタゾンは４０％に達した（図９）。これらのデータは、ＥＡＥにおけるＲＩ α−ＭＳＨペプチド類似体を用いた処置は、疾患の平均臨床的疾患スコアおよび発生率を有意に低下させることを示している。

実施例１２
ＣＮＳ組織学
ＰＢＳおよびＲＩ α−ＭＳＨで処置したマウスにおいて脊髄を疾患誘導後の２４日目に採取した。脊髄切片のヘマトキシリンおよびエオシン染色を用いて、炎症の度合および病変の数を評価した。ＥＡＥの病理により、炎症細胞の浸潤および脱髄の病巣領域が示された。脊髄の組織病理学的評価により、ＭＯＧ ＥＡＥモデルにおけるＲＩ α−ＭＳＨ処置の有効性が実証された。各処置群の平均臨床スコアの代表的なマウスからの切片を図１０ａ〜１０ｄに示す。データは、炎症の病巣領域を欠くＲＩ α−ＭＳＨで処置したマウスと比較した、ＰＢＳで処置したマウスの群における大規模な炎症性浸潤を示す。

実施例１３
疾患進行中の脾臓中のＴＮＦ−αおよびＩＬ−１０の測定
ＥＡＥにおけるＲＩ α−ＭＳＨ処置の効果の作用機構を調査した。ネイティブα−ＭＳＨは、ＴＮＦ−αレベルを低下させ、ＩＬ−１０を増加させることによって、単球／マクロファージに効果を有することが報告されている。ＲＩ α−ＭＳＨまたはネイティブα−ＭＳＨで処置した、ＭＯＧで初回抗原刺激したマウスの脾臓中のＴＮＦ−αおよびＩＬ−１０のｍＲＮＡレベルを定量的ＰＣＲによって評価した。マウスをＭＯＧ ｐ３５−５５で免疫化し、ＲＩ α−ＭＳＨまたはネイティブα−ＭＳＨを用いた１日１回の処置を１０日目に開始した。１日１回の処置の開始後の１、４および７日目に脾臓試料をマウスから採取した。データは、７日間の１日１回の処置後のＰＢＳ対照と比較して、ＲＩ α−ＭＳＨおよびα−ＭＳＨを用いた処置がＴＮＦ−αを有意に低下させたことを示す（ｐ≦０．００１）（図１１ｅ）。しかし、それ以前の時点ではＴＮＦ−αレベルの有意な変化はなかった（１日目および４日目、図１１ａおよび１１ｃ）。また、ＰＢＳ対照と比較して、ＲＩ α−ＭＳＨおよびαＭＳＨの処置群のどちらでも、７日目の時点でＩＬ−１０のｍＲＮＡレベルが減少された（図１１ｆ）。しかし、それよりも前の時点でＩＬ−１０のｍＲＮＡレベルの差異は検出されなかった（図１１ｂおよび１１ｄ）。ネイティブα−ＭＳＨ処置は疾患の平均臨床的疾患スコアまたは％発生率を減少させなかったが、本研究では、α−ＭＳＨ処置は、ＰＢＳ対照と比較して疾患進行の１７日目までに脾臓中のＴＮＦ−αおよびＩＬ−１０のｍＲＮＡレベルをどちらも減少させた。ＲＩ α−ＭＳＨ類似体は、１日１回の処置後に脾臓中のＴＮＦ−αのｍＲＮＡレベルを減少させることができる。

実施例１４
ＭＯＧペプチドに対する復活応答に対する、ＲＩ α−ＭＳＨの効果
ＭＯＧ３５−５５ペプチドに対する復活応答に対する、α−ＭＳＨまたはＲＩ α−ＭＳＨを用いてｉｎ ｖｉｖｏでマウスを処置することの効果を評価した。マウスをＭＯＧ３５−５５ペプチドで初回抗原刺激し、２〜８日目に、マウスをＰＢＳ、１００μｇのα−ＭＳＨまたは１００μｇのＲＩ α−ＭＳＨのいずれかで処置した。９日目に脾臓および流入領域リンパ節を採取し、ＭＯＧ３５−５５ペプチドに対する復活応答について、［３Ｈ］チミジンの取り込みによってｉｎ ｖｉｔｒｏで分析した。データは、ＰＢＳで処置した群と比較した、α−ＭＳＨマウスの群におけるＭＯＧ３５−５５ペプチドの脾臓細胞の増殖応答の有意な低下を示す（図１２ａ）。ＲＩ α−ＭＳＨで処置した群は、ＭＯＧ３５−５５ペプチドに対する復活応答のわずかな減少を示した。しかし、リンパ節細胞集団におけるＭＯＧペプチドに対する復活応答では、ＰＢＳ、α−ＭＳＨ、およびＲＩ α−ＭＳＨで処置した群の間で応答性の有意な差異が示されなかった（図１２ｂ）。

ｉｎ ｖｉｖｏ各処置群（ナイーブ、ＰＢＳ、α−ＭＳＨ、ＲＩ α−ＭＳＨ）由来の、ＭＯＧ３５−５５ペプチドを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激した脾臓細胞から細胞上清を収集した。フローサイトメトリーによる細胞数測定ビーズアレイによってサイトカインレベルを評価した。データは、ＰＢＳで処置した群と比較して、α−ＭＳＨおよびＲＩ α−ＭＳＨで処置した群のどちらにおいてもＴＮＦ−α、ＩＦＮγ、ＩＬ−６およびＭＣＰ−１のレベルの低下を示す（図１２ｃおよび１２ｄ）。α−ＭＳＨおよびＲＩ α−ＭＳＨで処置した群のどちらの脾臓細胞の上清のサイトカインレベルも、初回抗原刺激していないマウスの脾臓細胞からのサイトカインレベルと同様であった。

したがって、ＲＩ α−ＭＳＨペプチド処置はＭＯＧペプチドに対するサイトカイン復活応答に効果を有していたが、Ｔ細胞増殖応答に影響を与えなかった。

実施例１５
ＥＡＥの初回抗原刺激相中にマウスをα−ＭＳＨまたはＲＩ α−ＭＳＨで処置することの効果
マウスをＭＯＧ３５−５５ペプチドで免疫化し、２〜８日目に、ＰＢＳビヒクル対照、α−ＭＳＨ、またはＲＩ α−ＭＳＨで１日１回処置した。個々のマウスからの脾臓を９日目に採取し、ｍＲＮＡサイトカインの発現を、リアルタイムＰＣＲを用いて定量した。図１３は、疾患の初回抗原刺激相におけるＰＢＳ、α−ＭＳＨまたはＲＩ α−ＭＳＨで処置したマウスの脾臓中のＴＮＦ−αおよびＩＬ−１０のｍＲＮＡ発現レベルを示す。ＭＯＧペプチドで免疫化しなかったナイーブマウスを用いてＴＮＦ−αおよびＩＬ−１０のベースラインｍＲＮＡレベルを定量した。ＰＢＳビヒクル対照と比較して、α−ＭＳＨまたはＲＩ α−ＭＳＨのいずれかを用いた処置は、ＩＬ−１０およびＴＮＦ−αのｍＲＮＡのレベルを低下させた。

また、血清試料も研究の９日目に収集し、サイトカインレベル：ＴＮＦ−α、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１０、およびＩＬ−６について評価した（図１３ｃおよび１３ｄ）。データは、ＰＢＳ対照群と比較した、α−ＭＳＨおよびＲＩ α−ＭＳＨで処置した群のどちらにもおけるＭＣＰ−１およびＩＬ−６の低下を示す。ＰＢＳ対照と比較して、ＭＣＰ−１はＲＩ α−ＭＳＨで処置した群で有意に低下していた（ｐ＜０．０１）。さらに、ＲＩ α−ＭＳＨで処置した群は、ＰＢＳ群と比較してＴＮＦ−αおよびＩＬ−１２の低下を示した。３つの処置群間で血清ＩＬ−１０レベルの差異はなかった。

実施例１６
ＲＩ α−ＭＳＨはマクロファージマーカーに対する効果を有さない
ＭＯＧ３５−５５で免疫化したマウスにおいて、α−ＭＳＨまたはＲＩ α−ＭＳＨを用いた７日間の１日１回の投薬後に、脾臓ＣＤ１１ｂ^＋およびＦ４／８０^＋マクロファージをＣＤ８６、ＣＤ４０、およびＣＤ１４の表面発現レベルについてフローサイトメトリーによって調査した。データは、α−ＭＳＨまたはＲＩ α−ＭＳＨで処置したマウス中の脾臓ＣＤ１１ｂ^＋またはＦ４／８０^＋マクロファージ細胞集団におけるＣＤ８６、ＣＤ４０またはＣＤ１４の発現レベルに差異がないことを示す（図１４）。結果は、血中単球をＣＤ８６、ＣＤ４０、およびＣＤ１４の発現レベルについて調査した際と同様の発見を示した（データ示さず）。

実施例１７
ＬＰＳ炎症マウスモデルにおける効果
ネイティブα−ＭＳＨは、メラノコルチン受容体（ＭＣＲ）、特にメラノコルチン１受容体の刺激を介してＴＮＦ−α産生をダウンレギュレーションすることによって炎症を阻害することが報告されている。ＬＰＳはＴＮＦ−α、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６およびＩＦＮγなどの炎症伝達物質を刺激し、急性炎症モデルとして使用されている。α−ＭＳＨ類似体がＬＰＳマウス炎症モデルにおいて炎症性サイトカインを抑制できるかどうかを調査した。ＬＰＳ投与後の脾臓および腹膜マクロファージにおけるＭＣ１Ｒの発現レベルを決定した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＬＰＳをｉ．ｐ．注射し、ＬＰＳ注射後のいくつかの時点で、脾臓および腹膜マクロファージを分析用に採取した。データは、腹膜マクロファージのどの時点間でもＭＣ１ＲのｍＲＮＡ発現のレベルの識別可能な差異を示さない（図１５ａ）。しかし、ＬＰＳ投与は、ＭＣ１ＲのｍＲＮＡレベルを、ＬＰＳ免疫誘発を受けなかったナイーブマウスを超えて増加させなかった。脾臓中では、ＭＣ１ＲのｍＲＮＡのレベルはＬＰＳ注射の３０分後は上昇しており、その後、注射後１時間には低下した（図１５ｂ）。ＬＰＳは、同様にナイーブマウスにおいて脾臓中のＭＣ１ＲのｍＲＮＡレベルをベースラインレベルを超えて増加させた。

脾臓および腹膜マクロファージにおけるＭＣ１ＲのｍＲＮＡ発現を実証するデータにより、ＬＰＳ免疫誘発の３０分後がα−ＭＳＨまたはＲＩ α−ＭＳＨ類似体の処置に最適な時点であり得ることが示された。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＬＰＳをｉ．ｐ．注射し、３０分後、ネイティブα−ＭＳＨまたはＲＩ α−ＭＳＨ類似体８９１を５ｍｇ／ｋｇ〜０．１５６ｍｇ／ｋｇの範囲の用量でｉ．ｐ．投与した。ＲＩ α−ＭＳＨ類似体８９１とは、ｄ−Ｃｈａおよびｈｓｉｉｓｓ Ｄ−アミノ酸をコアペプチド配列に付加したＲＩ α−ＭＳＨの類似体である。ＲＩ α−ＭＳＨ類似体８９１は、マウスＭＣ１Ｒに対する結合親和性が増加しており、ｃＡＭＰを刺激する効力が増加していることが示されている（データ示さず）。結果により、ＰＢＳビヒクル対照と比較して、ネイティブα−ＭＳＨで処置した群におけるＴＮＦ−αおよびＩＬ−１０のレベルの有意な減少が示された（図１６ａおよび１６ｃ）。ＭＣＰ−１はネイティブα−ＭＳＨ処置によって影響を受けなかった（図１６ｂ）。ＲＩ α−ＭＳＨ類似体８９１を用いたＬＰＳで免疫誘発したマウスの処置により同様の結果が示され、ビヒクル対照と比較して、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１０が有意な低下しており、ＭＣＰ−１レベルに影響を与えなかった（図１６ｄ〜１６ｆ）。ネイティブα−ＭＳＨおよびＲＩ α−ＭＳＨ類似体８９１のどちらのより低い用量も炎症性サイトカインの最大抑制を示した。デキサメタゾン陽性対照はＴＮＦ−αおよびＭＣＰ−１のレベルの抑制を一貫して示した。

実施例１８
血漿中のペプチドの安定性
ネイティブα−ＭＳＨの血清半減期は約１０分間であると推定されている。この制限された半減期にもかかわらず、ペプチドはそれでも強力な抗炎症活性を誘発することができる。しかし、抗炎症活性の効力を増加させ、さらに治療剤として開発するためには、より安定なα−ＭＳＨ類似体が必要である。ネイティブα−ＭＳＨのＤ−アミノ酸類似体（レトロ−インバーソα−ＭＳＨまたはＲＩ α−ＭＳＨと呼ぶ）が合成され、これはネイティブα−ＭＳＨよりも安定である。ペプチドのＤ−アミノ酸型はペプチドのＬ−アミノ酸型よりもタンパク質分解に耐性があり、遅い速度で代謝される。

ＲＩ−α−ＭＳＨの安定性は、血漿またはＰＢＳ中、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、３７℃で２４時間インキュベーションすることによって決定した。アリコートを取り出し、タンパク質を２倍体積のアセトニトリルで沈殿させた。α−ＭＳＨを対照として使用し、ブラジキニンを内部標準として使用した。遠心分離後、Ｃ１８カラム分離および陽性エレクトロスプレーイオン化モードを用いたＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（ＭＲＭ）分析を行なうまで試料を−８０℃で凍結した。図１７ａに示すように、ＭＳＨは血漿中で約３時間の半減期を示したが、ＰＢＳ中では安定であった。しかし、ＲＩ−α−ＭＳＨはＰＢＳおよび血漿のどちらでも安定しており、２４時間にわたって検出可能な分解は示されなかった。

α−ＭＳＨおよびＲＩ−α−ＭＳＨの薬物動態学（ＰＫ）プロフィールにより、ＲＩ−α−ＭＳＨがネイティブα−ＭＳＨよりも長い血清半減期を有することが示唆される（図１７ｂ）。単一用量の１００μｇのＲＩ−α−ＭＳＨまたはα−ＭＳＨで処置したマウスは、２４時間後に測定可能な血清レベルのＲＩ−α−ＭＳＨを有していたが、処置の１２０分後にα−ＭＳＨは検出可能なレベルで存在しなかった（ｎ＝５）。

実施例１９
レトロ−インバーソペプチドの結合効果。

Ｄ−Ｐｈｅ（ＨｆＲＷ）を含有するコアＭＳＨテトラペプチドは、ＭＣ１Ｒとの有意な結合を生じるために十分である（２０〜５０ｎＭのＫｉ）。しかし、同じテトラペプチドのレトロ−インバーソ型では非常にわずかな結合が観察され（ｗｒＦｈ、８８３、Ｋｉ＞３０μＭ、表１）、これは、レトロ−インバーソペプチドはＨｆＲＷと同じ様式で受容体と完全に接触することができないことを示している。脂肪酸アシル基をＨｆＲＷのＮ末端に付加することで、ＭＣ１Ｒとのその結合が選択的に改善され、ＭＳＨに匹敵する親和性が得られる。これは、ＭＣ１Ｒでステアリル−ＨｆＲＷペプチドに観察される（１．３ｎＭ、ペプチド８２０）。ジアミノヘキサンステアリル基をレトロ−インバーソｗｒＦｈに付加することで（ペプチド８８２）、ＭＣ１Ｒとの結合が改善され（１２０ｎＭ、＞２５０倍）、ＨｆＲＷのＮ末端へのステアリン酸付加と匹敵する程度までになるが（８０倍）、ＲＩ−ＭＳＨで見られる親和性に達さず（４．１ｎＭ）、ここでも、ＲＩ−ＭＳＨ中の他の残基が、ＭＳＨよりもＲＩ−ＭＳＨとＭＣ１Ｒとの結合においてより大きな役割を果たすことが示される。

実施例２０
レトロ−インバーソペプチドの結合に対する立体化学効果。

コアレトロ−インバーソテトラペプチド中の残基の立体化学は、ＭＣ１Ｒとの結合に対してＬ型のＭＳＨよりも有意に異なる効果を有する。図１９に示すように、ＲＩ−ＭＳＨ中のコアテトラペプチド残基がＬ型に反転させることで（ペプチド８８４、８９３〜８９５）、ＭＣ１Ｒに対するペプチドの親和性がすべて減少した。驚くべきかつ予想外に、ＲＩ配列中のＤ−ＰｈｅからＬ−Ｐｈｅへの反転は結合の２０倍の減少を引き起こした一方で、ＨＦＲＷ中の対応する変化（Ｌ−ＰｈｅからＤ−Ｐｈｅ）は、結合を４００倍も改善させることが報告されている。他の残基については、立体化学の反転はコアＨｆＲＷペプチドよりもＲＩ−ＭＳＨに対して低い効果を有することが見い出され、ここでも、コアテトラペプチド中のそれぞれの残基の相対的な重要性がＨｆＲＷテトラペプチドよりもＲＩ−ＭＳＨで低いことが示される。

実施例２１
レトロ−インバーソＭＳＨの末端キャップ化の効果。

ＭＣ１Ｒに対するより高い親和性を達成するための別の可能な経路は、ＨｆＲＷペプチドをフェニル酪酸で末端キャップ化することにより、ＭＣ１Ｒに対するＨｆＲＷの親和性が選択的かつ強力に増加されるという観察に基づく（Ｋｉ＝６ｐＭ）。しかし、切断したＣ末端フェニルプロピルアミドを保有するＲＩ−ＭＳＨ（ペプチド８４７）の親和性の増加は観察されず、ヒスチジン残基で切断されたペプチド（ペプチド８４７ｉｎｔ）およびそのアミノプロピル−フェニル付加物（ペプチド８４７、表１）のどちらでも１５０ｎＭのＫｉが観察され、これにより、ＲＩ−ＭＳＨでは、結合がテトラペプチド配列の同時相互作用を許可しない様式で変更されることが実証され、ＭＣ１Ｒ中のヒスチジン結合要素の付近に芳香族相互作用部位が想定された。

実施例２２
レトロインバーソＭＳＨの毒素コンジュゲートの合成。

システインをＮ末端に付加したペプチド８９１（表１）の改変型は、Ｆｍｏｃ化学によって作製する。プロテアーゼ感受性バリン−シトルリンリンカーを含有するモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）と、チオールとのカップリングのマレイミド−カプロイル部分とのコンジュゲートを、本明細書中に参考として組み込まれているＤｏｒｏｎｉｎａら（２００３）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２１：７７８−７８４に従って合成する。ペプチドおよびＭＭＡＥコンジュゲートを、２５ｍＭのリン酸Ｎａ、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７の溶液中、１４時間２５℃でインキュベーションし、生成物をＣ１８逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって精製した。

実施例２３
ネズミ黒色腫細胞系におけるｃＡＭＰに対するＲＩ α−ＭＳＨ類似体の効果
ネイティブα−ＭＳＨおよびＲＩ α−ＭＳＨはどちらもネズミ黒色腫細胞においてｃＡＭＰレベルを増加させる。ＲＩ α−ＭＳＨペプチド類似体を作製し、ＲＩ α−ＭＳＨペプチドのコア配列への改変が、ＲＩ α−ＭＳＨペプチドと比較してｃＡＭＰレベルを上昇させるかどうかを決定した。ネズミＢ１６−Ｆ１黒色腫細胞を用いたｃＡＭＰアッセイにおいて、作製したＲＩ α−ＭＳＨ類似体の用量応答実験を実施した。

Ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物：Ｂ１６−Ｆ１ネズミ黒色腫細胞を、９６ウェルプレート内、５×１０^４個の細胞／ウェルで終夜、Ｌ−グルタミンおよびｐｅｎ／ｓｔｒｅｐおよびＦＢＳを含む培地中で培養した。培地を除去し、ＩＢＭＸを含む新しい培地を細胞に１時間加えた。その後、細胞をＲＩ α−ＭＳＨまたはＲＩ α−ＭＳＨペプチド類似体（８９０、８９１、８９２、８９３、８９４もしくは８９５）で処理した。３０分後にｃＡＭＰアッセイキットを用いて細胞を溶解し、上清をアッセイに使用した。１０μＭのフォルスコリンを陽性対照として用いた。

ｃＡＭＰレベル：ｃＡＭＰ競合アッセイキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて細胞内ｃＡＭＰを測定した。すべての細胞溶解液試料は分析用に１：１００に希釈した。

ペプチド：
８６９ ｖｐｋＧｗｒ（ｄ−Ｃｈａ）ｈｅｍｓｙｓ
８７２ ｖｐｋＧｗｒｆｒｅｍｓｙｓ
８８０ ｖｐｋＧｗｒＦｈｓｉｉｓｓ
８７８ ｖｐｋＧｗｒｆｈｅ（ｄ−ブチオニン）ｓｙｓ
８８６ ＲＩ−ＭＳ０５ ｖｐｋｇｗｒｆｈｓｉｉｓｓ
８９０ ｖｐｋＧｗｒ（ｄ−Ｃｈａ）ｈｅ（ｄ−ブチオニン）ｓｙｓ
８９１ ｖｐｋＧｗｒ（ｄ−Ｃｈａ）ｈｓｉｉｓｓ
８９２ ＳＹＳＭＥＨ（Ｃｈａ）ＲＷＧＫＰＶ
８９３ ｖｐｋＧＷｒｆｈｅｍｓｙｓ
８９４ ｖｐｋＧｗＲｆｈｅｍｓｙｓ
８９５ ｖｐｋＧｗｒｆＨｅｍｓｙｓ。

結果：ネズミ黒色腫Ｂ１６−Ｆ１細胞を１０^−４〜１０^−１１Ｍの濃度範囲のＲＩ α−ＭＳＨまたはＲＩ α−ＭＳＨ類似体（８６９、８７２、８８０、８７８、８８６および８９０〜８９５）で処理した。ＲＩ α−ＭＳＨまたはＲＩ α−ＭＳＨ類似体で処理した細胞からのｃＡＭＰレベル。類似体８９４を例外として、ＲＩ α−ＭＳＨ類似体の大多数はＲＩ α−ＭＳＨと比較して改善されたＥＣ_５０値を示した。類似体８９１、８９２および８８６は、ｃＡＭＰアッセイにおいてＲＩ α−ＭＳＨペプチドと比較してＥＣ_５０値の最大の改善を示した。要約すると、ＲＩ α−ＭＳＨ類似体はＲＩ α−ＭＳＨペプチドと比較して改善された用量応答およびＥＣ_５０値を示した。グラフデータには図２２およびＥＣ_５０データには表２を参照されたい。

Claims (19)

1. 以下の配列：
   Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Xaa₆ Xaa₇ Xaa₈ Xaa₉ Xaa₁₀ Xaa₁₁ Xaa₁₂ Xaa₁₃
   ［式中、Xaa₁は、D-Valであり；
   Xaa₂は、D-Proであり；
   Xaa₃は、D-Lys、D-OrnまたはD-Nleであり；
   Xaa₄は、Glyであり；
   Xaa₅は、Trp、D-3-ベンゾチエニル-Ala、D-5-ヒドロキシ-Trp、D-5-メトキシ-TrpまたはD-Pheであり；
   Xaa₆は、D-ArgまたはD-Hisであり；
   Xaa₇は、D-Cha、D-Phe、Phe、D-4-フルオロ-Phg、D-3-ピリジル-Ala、D-Thi、D-TrpまたはD-4-ニトロ-Pheであり；
   Xaa₈は、D-His、His、D-ArgまたはPheであり；
   Xaa₉は、D-Serであり；
   Xaa₁₀は、D-Ileであり；
   Xaa₁₁は、D-Ileであり；
   Xaa₁₂は、D-Serであり;そして
   Xaa₁₃は、D-Serである］
   を有するポリペプチドを含む、メラノコルチン１受容体（ＭＣ１Ｒ）と選択的に結合するポリペプチド、または、薬学的に許容されるその塩であって、ここで、１個以下のXaa_1〜13がＬ−アミノ酸である、ポリペプチド、または、薬学的に許容されるその塩。
2. 以下の配列：
   Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Xaa₆ Xaa₇ Xaa₈ Xaa₉ Xaa₁₀ Xaa₁₁ Xaa₁₂ Xaa₁₃
   ［式中、Xaa₁は、D-Valであり；
   Xaa₂は、D-Proであり；
   Xaa₃は、D-Lys、D-OrnまたはD-Nleであり；
   Xaa₄は、Glyであり；
   Xaa₅は、Trp、D-3-ベンゾチエニル-Ala、D-5-ヒドロキシ-Trp、D-5-メトキシ-TrpまたはD-Pheであり；
   Xaa₆は、D-Argであり；
   Xaa₇は、D-Cha、D-Phe、Phe、D-4-フルオロ-Phg、D-3-ピリジル-Ala、D-Thi、D-TrpまたはD-4-ニトロ-Pheであり；
   Xaa₈は、D-His、His、D-ArgまたはPheであり；
   Xaa₉は、D-Serであり；
   Xaa₁₀は、D-Ileであり；
   Xaa₁₁は、D-Ileであり；
   Xaa₁₂は、D-Serであり;そして
   Xaa₁₃は、D-Serである］
   を有するポリペプチドを含む、請求項１に記載のポリペプチド、または、薬学的に許容されるその塩であって、ここで、１個以下のXaa_1〜13がＬ−アミノ酸である、ポリペプチド、または、薬学的に許容されるその塩。
3. 以下の配列：
   Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Xaa₆ Xaa₇ Xaa₈ Xaa₉ Xaa₁₀ Xaa₁₁ Xaa₁₂ Xaa₁₃
   ［式中、Xaa₁は、D-Valであり；
   Xaa₂は、D-Proであり；
   Xaa₃は、D-Lysであり；
   Xaa₄は、Glyであり；
   Xaa₅は、Trp、D-3-ベンゾチエニル-Ala、D-5-ヒドロキシ-TrpまたはD-5-メトキシ-Trpであり；
   Xaa₆は、D-Argであり；
   Xaa₇は、D-Cha、D-Phe、PheまたはD-Thiであり；
   Xaa₈は、D-His、HisまたはD-Argであり；
   Xaa₉は、D-Serであり；
   Xaa₁₀は、D-Ileであり；
   Xaa₁₁は、D-Ileであり；
   Xaa₁₂は、D-Serであり；そして
   Xaa₁₃は、D-Serである］
   を有するポリペプチドを含む、請求項２に記載のポリペプチド、または、薬学的に許容されるその塩であって、ここで、１個以下のXaa_1〜13がＬ−アミノ酸である、ポリペプチド、または、薬学的に許容されるその塩。
4. ＰＥＧ化されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
5. 前記ポリペプチドが、以下の特性のうち少なくとも１つ：
   ＭＣ１Ｒを選択的に活性化する能力；
   ｉｎ ｖｉｔｒｏでの血漿中における安定性；または
   プロテアーゼ分解に対する耐性
   を示す、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド、または、薬学的に許容されるその塩。
6. 被験体における免疫抑制活性を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
7. 被験体の細胞におけるｃＡＭＰレベルを増加させ、および／または、該被験体における炎症誘発性サイトカインの産生を抑制する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
8. 前記炎症誘発性サイトカインが、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０、ＩＦＮγ、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、および、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）−１からなる群より選択される、請求項７に記載のポリペプチド。
9. 生物学活性部分とコンジュゲートさせられる、請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド、または、薬学的に許容されるその塩。
10. 請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド、または、薬学的に許容されるその塩と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的組成物。
11. 自己免疫疾患または状態の処置を必要としている被験体における自己免疫疾患または状態を処置するための組成物であって、治療上有効な量の、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド、または、薬学的に許容されるその塩と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、組成物。
12. 前記自己免疫疾患または状態が、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、再生不良性貧血、グレーブス病、セリアック病、クローン病、ループス、関節炎、骨関節炎、自己免疫性ブドウ膜炎および重症筋無力症からなる群より選択される、請求項１１に記載の組成物。
13. 炎症の処置を必要としている被験体における炎症を処置するための組成物であって、治療上有効な量の、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド、または、薬学的に許容されるその塩と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、組成物。
14. 前記炎症が、炎症性腸疾患、関節リウマチ、アレルギー、アテローム性動脈硬化症、乾癬、胃炎および虚血性心疾患からなる群より選択される疾患に関連している、請求項１３に記載の組成物。
15. 移植片拒絶の減少または阻害を必要としている被験体における移植片拒絶を減少させるかまたは阻害するための組成物であって、治療上有効な量の、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド、または、薬学的に許容されるその塩と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、組成物。
16. 黒色腫の処置を必要としている被験体における黒色腫を処置するための組成物であって、治療上有効な量の、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド、または、薬学的に許容されるその塩と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、組成物。
17. 黒色腫の処置を必要としている被験体における黒色腫を処置するための組成物であって、治療上有効な量の、細胞毒性剤とコンジュゲートさせた請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド、または、薬学的に許容されるその塩を含むコンジュゲートと、薬学的に許容される賦形剤とを含む、組成物。
18. 前記細胞毒性剤が、放射性核種、放射線増感剤、光増感剤、化学療法剤、または毒素である、請求項１７に記載の組成物。
19. 請求項１０に記載の薬学的組成物および任意選択で使用説明書を含むキット。