CN107098957A - α‑促黑素细胞激素的肽类似物 - Google Patents

Abstract

本文提供对黑皮质素1受体(MC1R)具有选择性的天然α‑促黑素细胞激素(α‑MSH)的稳定的肽类似物。本文还提供这种α‑MSH肽类似物的药物制剂以及用这些类似物治疗涉及MC1R的医学和兽医学疾病的方法。

Description

α-促黑素细胞激素的肽类似物

技术领域

本发明涉及肽类似物。具体地说，本发明涉及对黑皮质素1受体(MC1R)具有选择性的天然α-促黑素细胞激素(α-MSH)的肽类似物，其药物制剂以及这些类似物在治疗医学和兽医学疾病中的应用。

背景技术

神经肽是广泛分布于机体中的生物学活性小肽，具有从神经递质到生长因子的功能。许多证据表明神经肽具有抗炎性能。在许多神经肽中，黑皮质素肽(黑皮质素)能结合并刺激黑皮质素(MC)受体。黑皮质素的一个例子包括α-促黑素细胞激素(α-MSH)，主要知道它能调节外周色素沉着，但也知道它有抗炎和免疫调节性能。已在几种器官中检测到α-MSH神经肽，由神经元、垂体、肠、皮肤和免疫细胞产生。

注射α-MSH诱导半抗原特异性耐受的接触过敏模型和抑制细菌内毒素-介导的炎症业已证明α-MSH具有这种免疫调节性能。在许多动物疾病模型，例如炎性肠病、关节炎和实验性心脏移植中α-MSH也显示具有治疗活性。大脑炎症、肾脏损伤和肝炎的其它动物模型证明了该神经肽有抗炎作用。α-MSH能抑制促炎细胞因子，例如TNF-α、IL-6和IL-1的产生，并抑制趋化因子而减少巨噬细胞和嗜中性白细胞迁移至炎性部位。一氧化氮(NO)是各种形式炎症的共同介质。也显示α-MSH能抑制受内毒素刺激的巨噬细胞和嗜中性白细胞合成NO。除了对细胞因子产生的作用外，α-MSH能下调单核细胞和树突状细胞的I类MHC、CD86和CD40表达而影响抗原呈递和协同刺激。还知道α-MSH能增加单核细胞中的白介素10(IL-10)形成，据信IL-10是免疫抑制作用的重要组分。

虽然α-MSH免疫调节作用的分子机制尚未完全知晓，但α-MSH作用的潜在机制是它能抑制细胞中核因子-κB的激活。抑制NF-κB抑制了巨噬细胞产生促炎细胞因子和合成一氧化氮。α-MSH通过结合属于含7个跨膜结构域的G-蛋白偶联受体组的特异性受体而起作用。这些受体包括巨噬细胞的黑皮质素1和黑皮质素3受体(MCR-1和MCR-3)，α-MSH通过与之结合抑制NF-κB。α-MSH的许多免疫调节作用也通过累积cAMP而介导。α-MSH与黑皮质素受体结合提高了cAMP水平，从而可抑制IκB降解，因而抑制NF-κB转位和一氧化氮产生。

与α-MSH结合并受其刺激的MC1受体参与各种抗炎和免疫调节应答。已鉴定到五类黑皮质素受体，MC1-MC5。已发现MC-1受体存在于黑素细胞、黑色素瘤细胞、巨噬细胞、嗜中性白细胞、神经胶质瘤细胞、星形细胞、单核细胞、内皮细胞上，存在于脑、睾丸和卵巢的某些区域中。本领域对刺激MC-1受体并产生有效抗炎和免疫调节应答的化合物和方法一直有兴趣。

发明概述

本文提供能选择性结合黑皮质素1受体(MC1R)的基本纯的化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物包含具有序列His Xaa₁ Arg Trp(SEQ ID NO:1)或D-Trp D-Arg Xaa₂D-His(SEQ ID NO:2)的核心四肽；其中Xaa₁是D-Cha、D-Phe或Cha，Xaa₂是D-Cha、D-Phe或Phe。在一些实施方式中，其C-末端序列是D-Ser D-Ile D-Ile D-Ser D-Ser(SEQ ID NO:3)。

本文还提供能选择性结合黑皮质素1受体(MCR1)的基本纯的化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物包含具有以下序列的多肽：

Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Xaa₆ Xaa₇ Xaa₈ Xaa₉ Xaa₁₀ Xaa₁₁ Xaa₁₂ Xaa₁₃，

其中Xaa₁是D-Val、D-Ala或D-Lys；

Xaa₂是D-Pro、D-Ala或D-Lys；

Xaa₃是D-Lys、D-Orn、D-Nle、D-Ala或D-Lys；

Xaa₄是Gly或D-Ala；

Xaa₅是D-Trp、Trp、D-3-苯并噻吩基-Ala、D-5-羟基-Trp、D-5-甲氧基-Trp、D-Phe或D-Ala；

Xaa₆是D-Arg、D-His或D-Ala；

Xaa₇是D-Cha、D-Phe、Phe、D-4-氟-Phg、D-3-吡啶基-Ala、D-Thi、D-Trp、D-4-硝基-Phe或D-Ala；

Xaa₈是D-His、His、D-Arg、Phe或D-Ala；

Xaa₉是D-Glu、D-Asp、D-瓜氨酸、D-Ser或D-Ala；

Xaa₁₀是D-Met、D-丁硫氨酸(buthionine)、D-Ile或D-Ala；

Xaa₁₁是D-Ser、D-Ile或D-Ala；

Xaa₁₂是D-Tyr、D-Ser或D-Ala；

Xaa₁₃是D-Ser或D-Ala；

其中除非当Xaa_1-3均是D-Ala时，不多于一个的Xaa_1-13是D-Ala和不多于一个的Xaa_1-13是L-氨基酸。

在还有另一方面，本文提供包含具有以下序列多肽的基本纯的化合物或其药学上可接受的盐：

D-Val D-Pro D-Lys Gly D-Trp D-Arg Phe D-His D-Ser D-Ile D-Ile D-SerD-Ser(SEQ ID NO:4)；

D-Val D-Pro D-Lys Gly D-Trp D-Arg D-Cha D-His D-Ser D-Ile D-Ile D-SerD-Ser(SEQ ID NO:5)；

Ser Tyr Ser Met Glu His Cha Arg Trp Gly Lys Pro Val(SEQ ID NO:6)；或

D-Val D-Pro D-Lys Gly D-Trp D-Arg D-Phe D-His D-Glu D-Met D-Ser D-TyrD-Ser(SEQ ID NO:7)。

在一些实施方式中，本文提供的多肽经PEG化。

在一些实施方式中，本文提供的化合物可偶联于生物学活性部分。

在一些实施方式中，本文提供的化合物选择性结合MC1R。在一些实施方式中，所述化合物表现出以下特性的至少一种：能选择性激活MC1R，在体外血浆中稳定和耐受蛋白酶降解。

在一方面，本文提供包含本文提供的任何一种基本纯的化合物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。

在另一方面，本文提供治疗有需要的对象的自身免疫疾病或病症的方法，包括给予所述对象包含药学上可接受的赋形剂和治疗有效量的本文提供的化合物的药物组合物。在一些实施方式中，所述自身免疫疾病或病症选自：多发性硬化症、I型糖尿病、再生障碍性贫血、格雷夫斯病、腹部疾病、克罗恩病、红斑狼疮、关节炎、骨关节炎、自身免疫葡萄膜炎和重症肌无力。

在还有另一方面，本文提供治疗有需要的对象的炎症的方法，包括给予所述对象包含药学上可接受的赋形剂和治疗有效量的本文提供的化合物的药物组合物。在一些实施方式中，所述炎症与选自下组的疾病相关：炎性肠病、类风湿性关节炎、过敏、动脉粥样硬化、银屑病、胃炎和缺血性心脏病。

在一方面，本文提供降低或抑制有需要的对象的移植物排异的方法，包括给予所述对象包含药学上可接受的赋形剂和治疗有效量的本文提供的化合物的药物组合物。

在另一方面，本文提供治疗有需要的对象的黑色素瘤的方法，包括给予所述对象包含药学上可接受的赋形剂和治疗有效量的本文提供的化合物的药物。

在还有另一方面，本文提供治疗有需要的对象的黑色素瘤的方法，包括给予所述对象包含药学上可接受的赋形剂和治疗有效量偶联物的药物，所述偶联物包含与抗肿瘤负载物偶联的本文提供的化合物。该抗肿瘤负载物可以是放射性核素、辐照致敏剂、光敏剂、化疗剂或毒素。

在还有一方面，本文提供装有本文提供化合物的药物组合物和任选的使用说明书的试剂盒。

附图简述

图1显示天然α-MSH减轻了葡萄膜炎。图1A显示每日用天然α-MSH(100微克/小鼠)静脉内注射治疗B10.RIII小鼠的数据，临床评分为2-3。与未治疗对照相比葡萄膜炎显著减轻(p<0.01)。图1B显示每日腹膜内注射天然α-MSH(100微克/小鼠)或腹膜内注射地塞米松(0.2mg/kg或2.0mg/kg)治疗B10.RIII小鼠的数据，临床评分为1-2(n＝5)。治疗开始后，视网膜炎症减轻(p<0.05)。星号表示与对照相比有显著差异。

图2说明RIα-MSH和天然α-MSH缓解了晚期葡萄膜炎。在B10.RIII小鼠中诱导EAU，小鼠于第12天达到疾病晚期(评分为3)，静脉内注射每日给予100微克/小鼠天然α-MSH、RIα-MSH或PBS。图2A显示用天然α-MSH或逆(retro)-RIα-MSH治疗小鼠的数据，与PBS对照小鼠相比，显示葡萄膜炎眼评分降低。图2B显示EAU诱导后第16天，各组中小鼠各眼的最高评分(n＝8)。星号表示各组之间有显著差异(p<0.05)。

图3显示用α-MSH或RIα-MSH治疗的小鼠的视网膜图像和各眼评分。在B10.RIII小鼠中诱导EAU，小鼠于第13天达到疾病晚期，此时开始每日用100微克/小鼠天然α-MSH、RIα-MSH或PBS静脉内注射治疗。显示了治疗13天后提供各组眼评分中值的视网膜眼底检查(Fundoscopic)图像(n＝11)。PBS治疗小鼠的眼评分为3，显示在眼睛的数个象限中有炎性病损和邻近视神经有血管炎(图3A)。α-MSH和RIα-MSH治疗小鼠的眼评分为1，显示葡萄膜炎消退，仅在视神经周围有炎症(图3B和3C)。视网膜代表各组的眼评分中值。治疗后第13天各组小鼠的各眼评分示于图中。星号表示各组之间有显著差异(p<0.01)。

图4显示RIα-MSH和天然α-MSH治疗EAU小鼠的组织病理学。给雌性B10.RIII小鼠注射IRBP+CFA诱导EAU。当小鼠达到眼评分为3时，每日静脉内注射100微克/小鼠的逆-倒位(retro-inverso)α-MSH、天然α-MSH或PBS治疗小鼠。RIα-MSH或α-MSH治疗组小鼠的炎性应答缓解(p<0.05)。照片显示治疗开始后10天眼睛的苏木精和曙红染色，代表了PBS(图4A)、α-MSH(图4B)和RIα-MSH(图4C)治疗组小鼠的眼评分中值。放大100X。

图5显示与混杂肽对照相比，每日腹膜内给予逆-倒位α-MSH对葡萄膜炎的影响。诱生疾病后第11天开始每日腹膜内注射100微克RIα-MSH或对照混杂D氨基酸肽治疗B10.RIII小鼠。数据显示RIα-MSH(n＝4)和对照混杂肽(n＝5)治疗组小鼠的临床平均眼评分。小鼠总共治疗13天。数据代表两次实验。星号表示各组之间有显著差异(p<0.04)。

图6.RIα-MSH治疗视网膜炎症的效果。当临床评分为4时，每日腹膜内注射RIα-MSH(3、10或100微克/小鼠)治疗B10RIII小鼠。每日注射对照混杂肽100微克/小鼠。该图描绘了随时间推移的临床评分。用100或10微克/小鼠开始治疗后观察到视网膜炎症减轻。用较低剂量的RIα-MSH(3微克/小鼠)或PBS或对照混杂肽(n＝4)治疗的小鼠，观察到有限的有益临床应答。星号表示各组之间有显著差异(p<0.05)。

图7显示RIα-MSH对鼠黑色素瘤细胞产生cAMP的影响。用0.01ng/ml–1000ng/ml浓度的天然α-MSH、逆-倒位α-MSH或对照混杂肽处理B16-F1黑色素瘤细胞后检测细胞中的cAMP。图7A显示天然α-MSH和RIα-MSH显著提高了cAMP水平。检测cAMP所用的对照包括100μM浓度的毛喉素。图7B显示丙氨酸扫描数据。检验1μg/ml RIα-MSH的丙氨酸取代肽是否能提高鼠B16-F1黑色素瘤细胞系的cAMP水平。数据代表两次实验。序列表见表1。星号表示各组之间有显著差异(p<0.01)。

图8显示MOG诱导的EAE的疾病进程。注射MOG35-55肽(200微克/小鼠)和CFA乳液诱导C57BL/6小鼠产生EAE。在第0天和第2天注射百日咳毒素。第10天开始每日腹膜内注射100微克/小鼠α-MSH、RIα-MSH或PBS进行治疗。图8A显示每日记录的临床疾病评分。图8B显示诱导疾病后第20天各组的各疾病评分。

图9显示RIα-MSH导致EAE疾病平均评分降低。注射MOG35-55肽(200微克/小鼠)和CFA诱导C57BL/6小鼠产生EAE。在第0天和第2天注射百日咳毒素。第10天开始每日腹膜内注射100微克或30微克/小鼠的α-MSH或RIα-MSH、2mg/kg的地塞米松或PBS进行治疗。每日记录临床疾病评分。

图10显示用RIα-MSH治疗小鼠的脊髓组织学。注射MOG35-55肽(200微克/小鼠)和CFA乳液诱导C57BL/6小鼠产生EAE。在第0天和第2天注射百日咳毒素。第10天开始每日腹膜内注射100微克/小鼠的RIα-MSH进行治疗。收集疾病诱导后第24天的脊髓。各组显示两只代表性小鼠的PBS治疗(图10a和10c)和RIα-MSH治疗(图10b和10d)。箭头显示炎症细胞浸润部位。

图11显示EAE疾病阶段中，MOG肽免疫小鼠脾脏中的TNFα和IL-10mRNA含量。在第0天用200μg MOG肽免疫小鼠，第10-15天每日用PBS、α-MSH(100μg)或RIα-MSH(100μg)治疗。治疗开始后第1(图11a和11b)、第4(图11c和11d)和第7天(图11e和11f)收集脾脏，用定量PCR分析TNFα和IL-10mRNA表达。数据显示各治疗组4只小鼠的平均值。根据β-肌动蛋白标准化RNA水平。

图12显示对MOG 35-55肽的回忆应答。在第0天用200μg MOG肽免疫小鼠。第2-8天小鼠腹膜内注射PBS、100μgα-MSH或100μg RIα-MSH(n＝5)。第9天收集脾脏(图12a)和淋巴结(图12b)细胞，用25μg/ml MOG35-55肽或OVA肽体外刺激。培养第三天用[3H]胸苷脉冲细胞。数据显示为平均值±SD。24小时后，收集用MOG肽刺激的脾脏细胞培养上清液，用流式细胞术分析细胞因子TNF-α和IFNγ(图12c)及MCP-1(图12d)的水平。数据显示为平均值±SD。原初小鼠未用MOG肽免疫。

图13显示RIα-MSH治疗后，MOG免疫小鼠的血清和脾脏中的细胞因子概况。在第0天用200μg MOG 35-55肽免疫小鼠。第2-8天给小鼠腹膜内注射PBS、100μgα-MSH或100μg RIα-MSH(n＝5)。第9天收集脾脏和血清。图13a和13b显示实时PCR定量测定的脾脏TNF-α和IL-10分别的mRNA水平。数据显示各治疗组4只小鼠的平均值。根据β-肌动蛋白标准化RNA水平。用流式细胞术分析血清的细胞因子水平。图13c显示TNF-α、MCP-1、IL-6的血清水平，图13d显示IL-10和IL-12的血清水平。原初小鼠未用MOG肽免疫。数据显示为平均值±SD。

图14显示α-MSH和RIα-MSH对巨噬细胞标记的影响。在第1-7天，用MOG肽体内免疫小鼠，每日用α-MSH或RIα-MSH(100微克/小鼠)治疗。用流式细胞术分析脾脏巨噬细胞的CD14、CD40和CD86表达水平。根据CD11b+(图14a)或F4/80⁺(图14b)巨噬细胞群门控(分离)细胞。数据显示为门控(分离的)巨噬细胞群的平均阳性百分比(n＝5)。

图15显示LPS-诱导了腹腔巨噬细胞(图15a)和脾脏(图15b)中mMC1R mRNA水平增加。给C57BL/6小鼠(n＝4)腹膜内注射LPS(1微克/小鼠)。在0.5小时、1小时和24小时收集腹腔巨噬细胞和脾脏。用实时PCR定量测定mMC1R mRNA水平。根据18s标准化RNA水平。

图16显示MSH对体内LPS炎症模型的作用。给C57BL/6小鼠腹膜内注射1微克LPS。30分钟后，腹膜内注射地塞米松(2mg/kg)和α-MSH(图16a-16c)或RIα-MSH类似物891(图16d-16f)治疗小鼠。LPS攻击后2小时收集血清。通过流式细胞术，采用细胞计数珠试验分析TNF-α(图16a和16d)、MCP-1(图16b和16e)和IL-10(图16c和16f)水平。数据显示各细胞因子检测值和各组的平均值(n＝6)。

图17显示RI-α-MSH和α-MSH在血浆和血清中的稳定性。图17A显示37℃，RI-α-MSH和α-MSH在血浆和PBS中的稳定性。图17B显示单次静脉内注射后，RI-α-MSH和α-MSH肽的血清半衰期。

图18显示MSH(图18A)和RI-MSH(图18B)与黑皮质素受体1、3、4和5的结合研究结果。

图19显示核心四肽HfRW和逆-倒位MSH的翻转。

图20显示RI-MHS不同位置的非天然氨基酸残基取代。

图21显示RI-MHS与其变体的代表性竞争结合MC1R的试验。

图22显示RIα-MSH类似物对B16F1鼠黑色素瘤细胞cAMP水平的影响。图22A：类似物890、891和892；图22B：类似物893、894和895；图22C：类似物880、886和878；和图22D：类似物872、878和869。

发明详述

定义

本发明方法的α-MSH和MC1R蛋白及核酸不限于其具体来源或物种。因此，可以是分离的或重组(产生)的蛋白质和核酸。

α-促黑素细胞激素(α-MSH)是包含序列Ser Tyr Ser Met Glu His Phe Arg TrpGly Lys Pro Val(SEQ ID NO:8)(SYSMEHFRWGKPV)的多肽。近年来检验到α-MSH具有抗炎和免疫调节性能。α-MSH源自阿黑皮素原(POMC)的胞内蛋白水解切割。已在几种器官中检测到α-MSH神经肽，系由神经元、垂体、肠、皮肤和免疫细胞所产生。已有报道α-MSH能抑制效应T细胞的功能、诱导调节性T细胞，在自身免疫和移植模型中具有有益作用。

“偶联物”包括粘附、连接、偶联、形成复合体或以其它方式彼此结合的两个或更多个成员。这些成员可通过共价键、离子键、静电作用、氢键、范德华力或物理方式彼此连接。

“生物学活性”分子包括能引发或调节生理学应答的分子或化合物。在一方面，生物学活性化合物能刺激黑皮质素受体，优选MC1-受体。

“调节”表示上调或下调一种或多种蛋白质和蛋白质亚单位的活性，例如其表达、水平或活性高于或低于不存在该调节剂时观察到的活性。例如，术语“调节”可表示“抑制”或“刺激”。

“C-末端序列”包括通常(但不一定)指羧基末端的氨基酸链。书写肽序列的习惯是将C-末端置于右侧，从N-末端向C-末端书写序列。C-末端序列可包含1-100个氨基酸，优选2-15个氨基酸。甚至更优选3-10个氨基酸。C-末端可以羧基为末端，或者可用本领熟知的方法修饰该末端而包含功能成员(例如，靶向基团、保留信号、脂质和锚定(基团))。

本发明提供“基本纯的化合物”。本文用术语“基本纯的化合物”描述基本上不含与其天然结合的其它蛋白质、脂质、碳水化合物、核酸和其它生物学材料的分子，例如多肽(如结合MC1R的多肽或其片段)。例如，基本纯的分子，如多肽可以是至少60干重％的感兴趣分子。可采用常规方法，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳(如，SDS-PAGE)、柱层析(如，高效液相层析(HPLC))和氨基末端的氨基酸序列分析来测定多肽的纯度。

在一个实施方式中，短语“选择性结合”表示当存在两种或多种受体(例如，黑皮质素受体MC1、MC2、MC3、MC4、MC5受体)的混合物时，本发明制备或所用的化合物或多肽优先结合一类受体胜过另一类受体。

“氨基酸”或“氨基酸序列”包括寡肽、肽、多肽或蛋白质序列，或它们的任何片段、部分或亚单位，及其天然或合成的分子。术语“多肽”和“蛋白质”包括通过肽键或修饰的肽键(即肽等构物)彼此连接的氨基酸，包括除20种基因编码的氨基酸外的修饰氨基酸。术语“多肽”还包括肽和多肽片段、基序等。氨基酸的大写单字母缩写指其天然L-异构体。氨基酸的小写单字母缩写表示其D-异构体。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，指任何长度的氨基酸聚合物。肽和多肽可完全由合成的、非天然氨基酸类似物构成，或是部分天然肽的氨基酸和部分非天然氨基酸的类似物构成的嵌合分子。在一方面，多肽用于本发明的组合物、细胞体系或方法中(例如，含有表达至少一种本发明酶的质粒的宿主细胞)。此外，多肽指由共价连接于另一功能基团(例如，增溶基团、靶向基团、PEG、非氨基酸基团或其它治疗剂)的氨基酸聚合物构成的化合物。

可用以下括号内的名称简写氨基酸：脯氨酸(Pro)、缬氨酸(Val)、赖氨酸(Lys)、鸟氨酸(Orn)、正亮氨酸(Nle)、甘氨酸(Gly)、色氨酸(Trp)、丙氨酸(Ala)、苯丙氨酸(Phe)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、丝氨酸(Ser)、甲硫氨酸(Met)、异亮氨酸(Ile)、酪氨酸(Tyr)、环己基丙氨酸(Cha)、4-氟-D-苯基甘氨酸(4-氟-D-Phg)、2-噻吩基-D-丙氨酸(D-Thi)。

本文所用的“治疗”指给予哺乳动物能引发个体产生预防性、治愈性或其它有益作用的制剂。治疗也可导致减弱或缓解对象的疾病或疾病症状。

除非另有表述，本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数形式。例如，“一种”靶细胞包括一个或多个靶细胞。

本发明的多肽组合物可含有非天然结构组分的任何组合。各个肽残基可通过肽键、其它化学键或偶联剂，例如戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯、双功能马来酰亚胺、N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)或N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)相连接。能替代传统酰胺键(“肽键”)连接的连接基团包括，例如酮基亚甲基(如-C(＝O)-CH₂-替代-C(＝O)-NH-)、氨基亚甲基(CH₂-NH)、亚乙基、烯烃(CH＝CH)、醚(CH₂-O)、硫醚(CH₂-S)、四唑、噻唑、逆酰胺(retroamide)、硫代酰胺或酯(参见，例如Spatola(1983)刊于Chemistry and Biochemistry of Amino Acids,Peptides and Proteins(氨基酸、肽和蛋白质的化学和生物活性),第7卷,第267-357页,“Peptide Backbone Modifications”(肽骨架修饰)MD(Marcel Dekker)公司,纽约,通过引用纳入本文)。

可通过天然加工，例如翻译后加工(如磷酸化、酰化等)，或通过化学修饰技术，修饰用于实施本发明方法的多肽，而得到修饰的多肽。修饰可发生在多肽中的任何地方，包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。应该知道，给定多肽的数个位点中可存在程度相同或不同的同一类修饰。给定多肽也可含有多种类型的修饰。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、共价连接于核黄素、共价连接于血红素分子、共价连接于核苷酸或核苷酸衍生物、共价连接于脂质或脂质衍生物、共价连接于磷脂酰肌醇、交联环化、形成二硫键、脱甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸盐、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚定形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、PEG化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、硒化、硫酸化和转运-NA介导的蛋白质添加氨基酸，例如精氨酸化。参见，例如通过引用纳入本文的Creighton,T.E.,Proteins–Structure and Molecular Properties(蛋白质-结构和分子特性)第2版.,WFC公司(W.H.Freeman and Company),纽约(1993)；PosttranslationalCovalent Modification of Proteins(蛋白质的翻译后共价修饰),B.C.Johnson编.,学术出版社(Academic Press),纽约,第1-12页(1983)。

化合物的其它实施方式

在一些实施方式中，本发明提供能选择性结合黑皮质素1受体(MCR1)的基本纯的化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物包括具有以下序列的多肽：

Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Xaa₆ Xaa₇ Xaa₈ Xaa₉ Xaa₁₀ Xaa₁₁ Xaa₁₂ Xaa₁₃，

其中Xaa₁是D-Val、D-Ala或D-Lys；

Xaa₂是D-Pro、D-Ala或D-Lys；

Xaa₃是D-Lys、D-Orn、D-Nle、D-Ala或D-Lys；

Xaa₄是Gly或D-Ala；

Xaa₅是D-Trp、Trp、D-3-苯并噻吩基-Ala、D-5-羟基-Trp、D-5-甲氧基-Trp、D-Phe或D-Ala；

Xaa₆是D-Arg、D-His或D-Ala；

Xaa₇是D-Cha、D-Phe、Phe、D-4-氟-Phg、D-3-吡啶基-Ala、D-Thi、D-Trp、D-4-硝基-Phe或D-Ala；

Xaa₈是D-His、His、D-Arg、Phe或D-Ala；

Xaa₉是D-Glu、D-Asp、D-瓜氨酸、D-Ser或D-Ala；

Xaa₁₀是D-Met、D-丁硫氨酸、D-Ile或D-Ala；

Xaa₁₁是D-Ser、D-Ile或D-Ala；

Xaa₁₂是D-Tyr、D-Ser或D-Ala；

Xaa₁₃是D-Ser或D-Ala。

在一些实施方式中，本文提供能选择性结合MC1R的肽类似物或其药学上可接受的盐，包括具有以下序列的多肽：Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Xaa₆ Xaa₇ Xaa₈ Xaa₉ Xaa₁₀Xaa₁₁ Xaa₁₂ Xaa₁₃，其中Xaa₁是D-Val；Xaa₂是D-Pro；Xaa₃是D-Lys、D-Orn或D-Nle；Xaa₄是Gly；Xaa₅是D-Trp、Trp、D-3-苯并噻吩基-Ala、D-5-羟基-Trp、D-5-甲氧基-Trp或D-Phe；Xaa₆是D-Arg或D-His；Xaa₇是D-Cha、D-Phe、Phe、D-4-氟-Phg、D-3-吡啶基-Ala、D-Thi、D-Trp或D-4-硝基-Phe；Xaa₈是D-His、His、D-Arg、Phe或D-Ala；Xaa₉是D-Glu、D-Asp、D-瓜氨酸或D-Ser；Xaa₁₀是D-Met、D-丁硫氨酸或D-Ile；Xaa₁₁是D-Ser或D-Ile；Xaa₁₂是D-Tyr或D-Ser；Xaa₁₃是D-Ser；其中不多于一个的Xaa_1-13是L-氨基酸。

在其它实施方式中，本文提供的肽类似物或其药学上可接受的盐包含具有以下序列的多肽：Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Xaa₆ Xaa₇ Xaa₈ Xaa₉ Xaa₁₀ Xaa₁₁ Xaa₁₂ Xaa₁₃，其中Xaa₁是D-Val；Xaa₂是D-Pro；Xaa₃是D-Lys、D-Orn或D-Nle；Xaa₄是Gly；Xaa₅是D-Trp或Trp；Xaa₆是D-Arg；Xaa₇是D-Cha、D-Phe、Phe或D-Thi；Xaa₈是D-His或His；Xaa₉是D-Glu或D-Ser；Xaa₁₀是D-Met、D-丁硫氨酸或D-Ile；Xaa₁₁是D-Ser或D-Ile；Xaa₁₂是D-Tyr或D-Ser；Xaa₁₃是D-Ser；其中不多于一个的Xaa_1-13是L-氨基酸。

本文提供的化合物包括α-促黑素细胞激素(α-MSH)的肽类似物。

在一个替代实施方式中，所述肽类似物由D-氨基酸构成。在其它实施方式中，所述肽包含D氨基酸、L氨基酸或D和L氨基酸的混合物。在其它实施方式中，所述肽由至少40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的D氨基酸构成。本发明的化合物也可掺入以下非限制性例子的非标准氨基酸：D-鸟氨酸、D-正亮氨酸、3-苯并噻吩基-D-丙氨酸、5-羟基-D-Trp、5-甲氧基-D-Trp、4-氟-D-苯基甘氨酸(4-氟-D-Phg)、3-吡啶基-D-丙氨酸、2-噻吩基-D-丙氨酸(D-Thi)、D-环己基丙氨酸(D-Cha)、4-硝基-D-Phe、D-瓜氨酸、α-甲基-D-Met和D-丁硫氨酸。

在一些实施方式中，所述核心四肽由氨基酸序列His Phe Arg Trp或Trp Arg PheHis构成，优选D-氨基酸构型。在另一实施方式中，所述核心四肽由氨基酸序列His D-ChaArg Trp或Trp Arg D-Cha His构成，优选D-氨基酸构型。在一些实施方式中，所述核心四肽由4个D-氨基酸构成。在其它实施方式中，所述核心四肽含有至少一个非标准氨基酸。

本文提供的化合物可以是天然或重组的化合物。可用本领域已知的常规化学技术制备本发明的化合物。出版的文献解释了固相合成方法，例如Solid Phase Peptide Synthesis:A Practical Approach(固相肽合成：实用方法)(E.Atherton等,1989)。也可用本领域已知的常规分子生物学技术制备本发明的化合物。除非另有表述，本申请的术语定义和技术说明见于多种熟知的参考文献中，例如：Sambrook,J等.,Molecular Cloning: ALaboratory Manual(分子克隆：实验室手册),Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港出版社)(1989)；Goeddel,D编.,Gene Expression Technology,Methods in Enzymology(基因表达技术，酶学方法),185,Academic Press(学术出版社),圣迭戈,加利福尼亚州(1991)；“Guide to Protein Purification(蛋白质纯化指南)”Deutshcer,M.P编.,Methods in Enzymology(酶学方法),Academic Press(学术出版社),圣迭戈,加利福尼亚州(1989)；Innis等.,PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(PCR方案：方法和应用指导),学术出版社,圣迭戈,加利福尼亚州(1990)；Freshney,R.I.,Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique(动物细胞培养：基础技术手册),第二版,Alan Liss,Inc(AL公司).纽约,纽约州(1987)；Murray,E.J编.,Gene Transfer and Expression Protocols(基因转移和表达方案),第109-128页,The Humana Press Inc.(休玛娜出版公司),克利夫顿,新泽西州和Lewin,B.,Genes VI(基因VI),牛津大学出版社,纽约(1997)。所有引述的参考文献通过引用全部纳入本文。

在一些实施方式中，本文提供的肽类似物能选择性结合或活化黑皮质素1受体(MC1R)。可采用任何合适的试验来检测MC1R的结合或活化。例如，可采用体外诱导cAMP来评估MC1R活化。体外评估可表明体内活化。本发明的其它实施方式包括MC1-受体的任何选择性多肽。可用合适的筛选试验鉴定选择性MC1-受体化合物。实施例4公开了MC-1受体结合试验的非限制性例子。在一些实施方式中，优选的MC1-受体包括智人(homo sapiens)的黑皮质素1受体(GenBank登录号:NP_002377)。

本发明的其它实施方式涉及调节cAMP、一氧化氮(NO)、TNF-α、TNF-αmRNA、IL-10mRNA、IL-10、IFNγ、IL-6、IL-12和/或MCP-1水平的化合物。在一些实施方式中，所述化合物能提高cAMP水平。在其它实施方式中，所述化合物涉及降低或抑制一氧化氮(NO)、TNF-α、TNF-αmRNA、IL-10mRNA、IL-10、IFNγ、IL-6、IL-12和/或MCP-1的水平。可通过筛选试验测定调节上述水平的化合物的身份。可用本领域已知的可接受试验检测上述水平。实施例中公开了显示能理想地调节这些水平的化合物的鉴定试验的非限制性例子。

在一些实施方式中，本发明化合物可通过其它作用机制调节免疫应答和炎症，而不限于本文公开的机制。

在一些实施方式中，本文提供血浆稳定性和对蛋白酶降解耐受性改善的肽。可用任何合适的方法评估血浆稳定性和对蛋白酶降解的耐受性。实施例19公开了一个非限制性例子。体外评估可表明体内的性能、改善的耐受性和较长的半衰期。

本文提供可在体内、离体或体外实施的方法。

PEG化的肽

在一些实施方式中，修饰所述肽延长其半衰期。在一些实施方式中，PEG化所述肽。在一些实施方式中，PEG化的肽指共价连接或偶联于一条或多条聚乙二醇(PEG)聚合物链的肽。PEG聚合物链可包括经修饰、功能化或衍生的PEG链。在另一实施方式中，PEG聚合物链可含有至少一个或多个分支点。在一些优选的实施方式中，PEG聚合物链和相应的PEG化肽为水溶性，可在溶液中高度流动，无毒性和无免疫原性，不难从体内清除，其体内分布可改变。在一些优选的实施方式中，通过(改变)PEG链类型来调节PEG化肽的药代动力学性质。制备PEG化肽的策略和方法可采用本领域已知的方法(G.Pasuta和F.M.Veronese(2007)“Polymer–drug conjugation,recent achievements and general strategies(聚合物-药物偶联，最近的成果和通用策略)”Progress in Polymer Science 32(8-9):933-961，通过引用纳入本文)。本领域已知制备第一和第二代PEG化蛋白质的方法。

PEG化的非限制性例子包括第一步适当功能化PEG聚合物的一个或两个末端(对于线形PEG)。用相同的反应活性分子活化各末端的PEG称为“同质双功能化”，而如果提供不同的官能团，称该PEG衍生物为“异质双功能化”或“异质功能化”。制备PEG聚合物的化学活性或活化衍生物而使PEG连接于所需分子。根据要偶联于PEG的分子中可利用的反应活性基团的类型选择PEG衍生化的合适官能团。反应活性氨基酸的非限制性例子包括赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。也可利用N-末端氨基和C-末端羧酸。

用于偶联的其它异质双功能PEG：这些异质双功能PEG在两种实体需要亲水性、屈曲性和生物相容性间隔臂的连接中非常有用。异质双功能PEG的优选末端基团是马来酰亚胺、乙烯基砜、吡啶基二硫化物、胺、羧酸和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯基团。

在本发明的一些实施方式中，PEG化肽的分子量范围为0.2kDa-100kDa。在本发明的一些优选实施方式中，PEG化肽的分子量范围为0.2kDa-40kDa。在本发明的一些优选实施方式中，PEG化肽的分子量范围为0.2kDa-15kDa。在其它实施方式中，可商品化购得的PEG的优选平均分子量(以Da计；通过尺寸排阻层析测定)可选自<1k、2k、3.5k、5k、10k、20k、30k、40k和以上，但根据所需的药代动力学可以是任何分子量。例如，可采用较低分子量的异质双功能PEG作为接头和采用较低分子量的PEG来提高肽的溶解性。PEG还可以是多臂、分叉或分支PEG。

在一些实施方式中，将所述肽偶联于靶向分子或起着靶向分子的作用，其中所述靶向分子优选结合于所需受体。在本发明的一些优选实施方式中，将所述肽偶联于细胞毒制剂。术语“细胞毒制剂”指能抑制或阻止细胞的表达活性、细胞的功能和/或导致细胞破坏的物质。该术语应包括放射性同位素化疗剂，和毒素，例如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，包括它们的片段和/或变体。细胞毒制剂的非限制性例子包括美登素、多拉司他汀及其类似物，包括塔斯托定(tasidotin)和奥利斯它汀(auristatin)。在本发明的其它实施方式中，细胞毒制剂的非限制性例子包括但不限于：美登素类(maytansinoids)、钇、铋、蓖麻毒蛋白、蓖麻毒蛋白A-链、皂草素、阿霉素、柔红霉素、紫杉醇、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊苷、鬼臼噻吩甙(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙素、二羟基炭疽杆菌素二酮、放线菌素、白喉毒素亚单位A、截短的假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒蛋白、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌素、白树毒素、米托洁林、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素、麻疯树逆境蛋白(curicin)、巴豆毒蛋白、刺孢霉素、石碱草(sapaonaria officinalis)抑制剂、糖皮质激素和其它化疗剂、以及放射性同位素，例如At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²和Lu的放射性同位素。还可将抗体偶联于能将前药转化为其活性形式的抗癌前药活化酶。

可用本领域目前已知的任何方法将肽直接或间接连接于细胞毒性或靶向制剂。在本发明的一些优选实施方式中，经一个或多个接头使所述肽连接于细胞毒制剂或靶向试剂而形成偶联物，只要包含的接头不会实质性阻碍该肽或所偶联制剂的功能、结合、毒性或摄入。

接头的非限制性例子包括离子键和共价键及任何其它足够稳定的结合键，从而使该偶联物所靶向的细胞可内化所述靶向制剂。根据所需特性选择接头分子。接头选择要考虑的包括减轻或降低偶联元件相靠近所导致的空间位阻，偶联物的其它性能，例如特异性、毒性、溶解性的变化，偶联物的血清稳定性和/或胞内利用度和/或提高连接键的可屈曲性。接头可以是任何类型的连接键，例子描述参见通过引用全文纳入本文的美国专利号7,166,702和5,194,425。

适合于化学连接的偶联物的接头和连接键包括但不限于：游离的反应活性基团，例如胺基与硫醇基之间的二硫键、硫醚键、位阻二硫键和共价键。可采用异质双功能试剂产生这些键，在一个或两个多肽上产生反应活性硫醇基，然后使一个多肽的硫醇基与另一个多肽的反应活性马来酰亚胺基或反应活性硫醇基或胺基反应。其它接头包括可在更具酸性的细胞内腔室中被切割的酸可切割接头，例如双马来酰亚胺乙氧基丙烷(bismaleimidoethoxy propane)，酸不稳定转铁蛋白偶联物与己二酸二酰肼接头；暴露于紫外光或可见光时可被切割的交联接头和例如各种结构域，如人IgG1的恒定区CH1、CH2和CH3(参见通过引用纳入本文的Batra等.,(1993)Mol.Immunol.30:379–386)。

可共价偶联接头而将化学接头和肽接头插入所述肽和靶向制剂或细胞毒制剂中。可用下述异质双功能试剂来实现此类共价偶联。

异质双功能交联试剂

本领域技术人员已知用于在氨基与硫醇基之间形成共价键和将硫醇基引入蛋白质中的许多异质双功能交联剂(参见，例如描述此类试剂的制备和应用并提供此类试剂的商品化来源的PIERCE CATALOG(皮尔斯公司目录),Immuno Technology Catalog&Handbook(免疫技术目录和手册),1992–1993；也参见Cumber等.,(1992)Bioconjugate Chem.3′:397–401；Thorpe等.,(1987)Cancer Res.47:5924–5931；Gordon等.,(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:308–312；Walden等.,(1986)J.Mol.Cell Immunol.2:191–197；Carlsson等.,(1978)Biochem.J.173:723–737；Mahan等.,(1987)Anal.Biochem.162:163–170；Wawryznaczak等.,(1992)Br.J.Cancer66:361–366；Fattom等.,(1992)Infection&Immun.60:584–589)。引述的所有参考文献通过引用全文纳入本文。可利用这些试剂在靶向剂、趋化因子与要靶向(输送)的物质之间形成共价键。这些试剂包括但不限于：N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP；二硫键接头)；6-[3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基]己酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-LC-SPDP)；琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基苄基硫代硫酸酯(SMBT，阻碍二硫键接头)；6-[3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基]己酸琥珀酰亚胺酯(LC-SPDP)；4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-SMCC)；3-(2-吡啶基二硫代)丁酸琥珀酰亚胺酯(SPDB；位阻二硫键接头)；2-(7-叠氮基-4-甲基香豆素-3-乙酰胺)乙基-1,3-二硫代丙酸磺基琥珀酰亚胺酯(SAED)；7-叠氮基-4-甲基香豆素-3-乙酸磺基琥珀酰亚胺酯(SAMCA)；6-[α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)甲苯酰胺基]己酸琥珀酰亚胺酯(磺基-LC-SMPT)；1,4-二-[3′-(2′-吡啶基二硫代)丙酰胺基]丁烷(DPDPB)；4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基硫代)甲苯(SMPT，位阻焦硫酸酯接头)；6[α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)甲苯酰胺基]己酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-LC-SMPT)；间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)；间-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-MBS)；N-琥珀酰亚胺(4-碘代乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB；硫醚接头)；(4-碘代乙酰基)氨基苯甲酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-SIAB)；琥珀酰亚胺基-4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(SMPB)；磺基琥珀酰亚胺基-4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(磺基-SMPB)；叠氮基苯甲酰基酰肼(ABH)。

其它异质双功能可切割交联接头包括N-琥珀酰亚胺基(4-碘代乙酰基)-氨基苯甲酸酯；(4-碘代乙酰基)-氨基苯甲酸磺基琥珀酰亚胺酯；4-琥珀酰亚胺基-氧基羰基-α-(2-吡啶基二硫代)-甲苯；磺基琥珀酰亚胺基-6-[α-甲基-α-(吡啶基二硫醇)-甲苯酰胺基]己酸酯；N-琥珀酰亚胺基-3-(-2-吡啶基二硫代)-丙酸酯；6[3(-(-2-吡啶基二硫代)-丙酰胺基]己酸琥珀酰亚胺酯；6[3(-(-2-吡啶基二硫代)-丙酰胺基]己酸磺基琥珀酰亚胺酯；3-(2-吡啶基二硫代)-丙酰肼、埃尔曼试剂、二氯三嗪酸(dichlorotriazinic acid)、S-(2-硫代吡啶基)-L-半胱氨酸。其它示范性双功能连接化合物公开于美国专利号5,349,066、5,618,528、4,569,789、4,952,394和5,137,877，它们均通过引用全文纳入本文。

酸可切割、光可切割和热敏感的接头

也可采用酸可切割、光可切割和热敏感的接头，特别是在需要切割要靶向(输送)的物质使之更易于接触反应的情况时。酸可切割的接头包括但不限于：双马来酰亚胺基乙氧基丙烷接头；和己二酸二酰肼接头(参见，例如通过引用纳入本文的Fattom等.,(1992)Infection&Immun.60:584–589)，和含有转铁蛋白充足部分能进入胞内转铁蛋白循环途径的酸不稳定转铁蛋白偶联物(参见，例如通过引用纳入本文的等.,(1991)J.Biol.Chem.266:4309–4314)。

光可切割的接头是暴光时可被切割的接头(参见，例如Goldmacher等.,(1992)Bioconj.Chem.3:104–107，这些接头通过引用纳入本文)，从而在暴光后可释放要靶向(输送)的的物质。已知有暴光时可被切割的光可切割接头(参见，例如Hazum等.,(1981)刊于Pept.,Proc.Eur.Pept.Symp.,第16届,Brunfeldt,K(编),第105–110页，其描述了采用硝基苄基作为半胱氨酸的光可切割保护基团；Yen等.,(1989)Makromol.Chem.190:69–82，其描述了水溶性光可切割共聚物，包括羟丙基甲基丙烯酰胺共聚物、甘氨酸共聚物、荧光素共聚物和甲基罗丹明共聚物；Goldmacher等.,(1992)Bioconj.Chem.3:104–107，其描述了暴露于近紫外光(350nm)时可发生光解降解的交联接头和试剂；和Senter等.,(1985)Photochem.Photobiol.42:231–237，其描述了可产生光可切割连接键的硝基苄氧基羰基氯交联剂)，从而在暴光后可释放要靶向(输送)的的物质。引述的所有参考文献通过引用全文纳入本文。此类接头在采用光纤暴光治疗皮肤病或眼病中特别有用。给予所述偶联物后，使眼睛或皮肤或其它身体部分暴光，导致释放偶联物中要靶向(输送)的物质。此类光可切割的接头可与需要除去靶向试剂使之从动物体内快速清除的诊断方案联用。

用于化学偶联的其它接头

其它接头包括三苯甲基接头，特别是衍生的三苯甲基可产生在不同酸度或碱度下释放治疗剂的一类偶联物。因此，若能预先选择使治疗剂释放的pH范围所赋予的灵活性，就能够根据需要递送的治疗剂在组织之间(分配)的已知生理学差异来选择接头(参见，例如通过引用纳入本文的美国专利号5,612,474)。例如，肿瘤组织的酸度看来低于正常组织。

肽接头

接头分子可以是肽。偶联物中可采用肽接头。这种肽接头通常含有约2个-60个氨基酸残基，例如约5-40个，或约10-30个氨基酸残基。长度的选择取决于例如所包含接头的用途等因素。

接头分子可以是可屈曲的间隔臂氨基酸序列，例如单链抗体研究中已知的那些序列。此类已知的接头分子的例子包括但不限于：GGGGS,(GGGGS)n、GKSSGSGSESKS、GSTSGSGKSSEGKG、GSTSGSGKSSEGSGSTKG、GSTSGSGKSSEGKG、GSTSGSGKPGSGEGSTKG、EGKSSGSGSESKEF、SRSSG、SGSSC。也可采用具有以下序列的白喉毒素胰蛋白酶敏感性接头：AMGRSGGGCAGNRVGSSLSCGGLNLQAM。

其它接头分子的描述参见，例如Huston等.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:5879-5883，1988；Whitlow,M等.,Protein Engin.6:989-995，1993；Newton等.,Biochemistry 35:545-553，1996；A.J.Cumber等.,Bioconj.Chem.3:397-401，1992；Ladurner等.,J.Mol.Biol.273:330-337，1997；和美国专利号4,894,443，所有出版物通过引用纳入本文。

其它接头包括但不限于：酶底物，例如组织蛋白酶B底物、组织蛋白酶D底物、胰蛋白酶底物、凝血酶底物、枯草杆菌蛋白酶底物、因子Xa底物、和肠激酶底物；能提高溶解性、可屈曲性和/或胞内可切割性的接头包括例如(glymser)n和(sermgly)n等接头，(参见，例如通过引用纳入本文的PCT公布号WO 96/06641，其提供了偶联物所用的示例性接头)。在一些实施方式中，可包含几种接头以利用各接头的所需特性。

制备偶联物

可用化学偶联、重组DNA技术或重组表达与化学偶联相结合，来制备含连接靶向物质的偶联物。可以任何取向连接本发明肽与细胞毒制剂或靶向制剂，偶联物中可存在一种以上的靶向制剂和/或要靶向(输送)的物质。

在本发明的一些优选实施方式中，通过亲水性和生物相容性间隔臂聚合物，包括烷基短链、聚唾液酸或透明质酸、多肽或PEG将细胞毒制剂连接于所述肽。在本发明的一些优选实施方式中，细胞毒制剂通过可切割接头，例如二硫键或含有可被溶酶体蛋白酶(如组织蛋白酶)切割序列的肽偶联。在本发明的一些优选实施方式中，这种间隔臂连接于所述肽的N-或C-末端。

制剂

制备这些制剂或组合物的方法包括使本发明化合物与运载体和任选的一种或多种辅助成分相结合的步骤。一般通过使本发明的化合物均匀紧密地结合液体运载体，或精细分级的固体运载体，或二者，然后如果需要的话使产物成形来制备这种制剂。

可按照本领域已知的制备药物的任何方法制备药物制剂。此类制剂可含有甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂。可将制剂与适合制造的药学上可接受的无毒赋形剂混合。此类“赋形剂”通常指无毒性不会以有害方式与该组合物中其它组分相互作用的基本上惰性的物质。药学上可接受的赋形剂包括但不限于：液体，例如水、缓冲盐水、聚乙二醇、透明质酸、甘油和乙醇。其中包括药学上可接受的盐，例如无机酸盐，如三氟乙酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；和有机酸盐，例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。

以适合递送的药物或药物组合物形式给予所述治疗剂。制剂可包含一种或多种稀释剂、乳化剂、防腐剂、缓冲剂、赋形剂等，可提供例如冻干粉末、喷雾剂、乳膏、洗液、凝胶、贴剂、植入物等剂型。可用本领域熟知的药学上可接受的运载体将口服给予的药物制剂配制成相应的合适剂型。此类运载体能将药物配制成适合患者吞服的单位剂型，例如片剂、丸剂、粉末、锭剂(dragee)、胶囊、液体、糖锭(lozenge)、凝胶、糖浆、糊剂、混悬液等。加入合适的添加化合物后(如果需要的话)，可将口服应用的药物制品配制成固体赋形剂，任选研磨所得的混合物和加工颗粒混合物，从而获得片剂或锭剂的芯。合适的固体赋形剂有碳水化合物或蛋白质填充剂，包括，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨醇；玉米、小麦、大米、马铃薯或其它植物的淀粉；纤维素，例如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素钠；和树胶，包括阿拉伯胶和黄蓍胶；和蛋白质，例如明胶和胶原。可加入崩解剂或增溶剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或其盐，例如海藻酸钠。

水性悬浮液可含有活性药物(例如，本发明的嵌合多肽或肽模拟物)和与之混合的适合制备水性悬浮液的赋形剂。此类赋形剂包括悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯胶，和分散剂或润湿剂，例如天然磷脂(如卵磷脂)、环氧乙烷与脂肪酸的缩合产物(例如，聚氧乙烯硬脂酸酯)、环氧乙烷与长链脂肪醇(例如，十七烷乙烯氧基十六醇(Heptadecaethylene oxycetanol))的缩合产物、环氧乙烷与脂肪酸和己糖醇衍生偏酯的缩合产物(例如，聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯)、或环氧乙烷与脂肪酸和己糖醇衍生偏酯的缩合产物(例如，聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯)。水性悬浮液还可包含一种或多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或正丙酯；一种或多种着色剂；一种或多种调味剂和一种或多种甜味剂，例如蔗糖、阿斯巴甜或糖精。可调节制剂的克分子渗透压浓度。

可采用基于油的药物给予本发明的疏水性活性制剂。可通过将活性制剂(例如，本发明的嵌合组合物)悬浮在植物油，例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰油，或矿物油，例如液体石蜡；或这些油的混合物中，配制基于油的悬浮液。参见，例如通过引用纳入本文的美国专利号5,716,928描述了采用精油或精油组分提高口服给予的疏水性药学化合物的生物利用度和降低个体间和个体内差异(也参见通过引用纳入本文的美国专利号5,858,401)。这种油性悬浮液可含有增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可加入甜味剂以提供可口的口服制品，例如甘油、山梨醇或蔗糖。可加入抗氧化剂，例如抗坏血酸使这些制剂防腐。可注射油性载体的例子参见通过引用纳入本文的Minto(1997)J.Pharmacol.Exp.Ther.281:93-102。本发明的药物制剂也可以是水包油乳液形式。油相可以是上述植物油或矿物油，或这些油的混合物。合适的乳化剂包括天然树胶，例如阿拉伯胶和黄蓍胶，天然磷脂，例如大豆卵磷脂，衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯，例如失水山梨糖醇单油酸酯，和这些偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯。这种乳液也可包含甜味剂和调味剂，例如配制糖浆和酏剂。此类制剂还可含湿润剂、防腐剂或着色剂。

也考虑包含治疗剂的组合物或药物可以含有药学上可接受的运载体，将其用作肽、蛋白质、多核苷酸等物质的稳定剂。可起作肽的稳定剂作用的合适运载体的例子包括但不限于：药物级的葡萄糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、葡聚糖等。其它合适的运载体包括但不限于：淀粉、纤维素、磷酸钠或钙、柠檬酸、酒石酸、甘氨酸、高分子量聚乙二醇(PEG)和它们的组合。还可采用荷电脂质和/或洗涤剂。合适的荷电脂质包括但不限于：磷脂酰胆碱(卵磷脂)等。洗涤剂通常是非离子型、阴离子型、阳离子型或两性型表面活性剂。合适的表面活性剂的例子包括，例如和表面活性剂(康涅狄格州丹伯里的联合碳化物化学和塑料公司(Union Carbide Chemicals and Plastics,Danbury,CT))；聚氧乙烯山梨聚糖，例如表面活性剂(特拉华州威尔明顿的ACI公司(Atlas Chemical Industries,Wilmington,DE))；聚氧乙烯醚，例如Brij；药学上可接受的脂肪酸酯，例如硫酸月桂酯及其盐(SDS)等材料。药学上可接受的赋形剂、运载体、稳定剂和其它辅助物质的详细讨论可参见通过引用纳入本文的Remington’s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)(Mack Pub.Co.(马克出版公司),新泽西州,1991)。

适合胃肠外给予的本发明药物组合物组合包含一种或多种本发明化合物与一种或多种药学上可接受的无菌等渗水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液，或可在使用前重建成无菌可注射液或分散液的无菌粉末，它们可含有糖、醇、抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、赋予该制剂与接受者血液等渗的溶质、或悬浮剂或增稠剂。

可用于本发明药物组合物中的合适水性和非水性运载体的例子包括：水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、聚乙二醇等)和它们的合适混合液；植物油，例如橄榄油；和可注射的有机酯，例如油酸乙酯。例如，以分散液为例，可采用包衣物质，例如卵磷脂来维持所需粒径和采用表面活性剂来维持合适的流动性。

这些组合物也可含有辅佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可通过包含各种抗细菌和抗真菌制剂，例如对羟基苯甲酸酯(paraben)、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸等，来确保防止微生物对本发明化合物的作用。该组合物中还需要包含等渗剂，例如糖、氯化钠、磷酸缓冲盐水等。此外，可通过包含能延迟吸收的制剂，例如单硬脂酸铝和明胶来延缓注射药物的吸收。

在一些情况中，为延长药物的作用，需要减缓皮下或肌肉内注射药物的吸收。可采用水溶性差的晶体或无定形材料的液体悬浮液实现此目的。药物的吸收速度取决于其溶解速度，进而取决于晶体大小和晶形。或者，可将药物溶解或悬浮于油性载体中实现胃肠外给予药物的延迟吸收。

在本发明方法中，也可将所述药物化合物作为微球递送以减缓体内释放。例如，可通过皮内注射给予微球使药物缓慢地皮下释放；参见Rao(1995)J.BiomaterSci.Polym.Ed.7:623-645；生物可降解和可注射的凝胶制剂，参见，例如Gao(1995)Pharm.Res.12:857-863(1995)；或口服给予的微球，参见，例如Eyles(1997)J.Pharm.Pharmacol.49:669-674。引述的所有参考文献通过引用全文纳入本文。

通过在生物可降解聚合物，例如聚丙交酯-聚乙交酯中形成微囊基质来制备本发明化合物的可注射贮存剂型。可根据药物与聚合物的比例和所用具体聚合物的性质来控制药物释放的速度。其它生物可降解的聚合物的例子包括聚(原酸酯)和聚(酐)。也可将药物包裹在与机体组织相容的脂质体或微乳剂中来制备可注射的贮存制剂。

可给予所述多肽本身或与另一种治疗性化合物联合给予。具体地说，可与治疗哺乳动物黑色素瘤、炎症或自身免疫疾病的治疗性化合物一起给予所述多肽。可将所述多肽和其它治疗性化合物配制在同一或不同组合物中。可与其它治疗性化合物同时、依次或分别给予所述多肽。

剂量

可改变本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以获得具体患者、组合物和给药方式所需的治疗反应而对患者无毒的有效活性成分用量。当将本发明化合物作为药物给予人和动物时，可将它们本身给予或作为药物组合物给予，所述药物组合物含有，例如与药学上可接受的运载体相组合的0.1-99％、更优选10-30％活性成分。

选择的剂量水平取决于各种因素，包括所用的本发明特定化合物的活性，给药途径、给药时间、所用特定化合物的分泌和代谢速度、吸收速度和程度、治疗持续时间、与所用特定化合物联用的其它药物、化合物和/或材料、所治疗患者的年龄、性别、体重、全身健康状况、和既往医疗史等医学领域熟知的因素。

具备本领域普通技术的医师或兽医不难确定所需药物组合物的有效量和开出处方。例如，医师或兽医在药物组合物中采用本发明化合物的开始剂量可低于实现所需治疗效果的水平，再逐渐增加剂量直至实现所需效果。

本发明化合物的合适日剂量通常是产生治疗效果最低有效剂量的化合物用量。此类有效剂量通常取决于上述各种因素。用于所示作用时，用于患者本发明化合物的口服、静脉内、脑室内和皮下剂量的非限制性范围通常为约1mg-5mg/公斤体重/小时。在其它实施方式中，该剂量的非限制性范围为约5mg-2.5mg/公斤体重/小时。在进一步的实施方式中，该剂量的非限制性范围为约5mg-1mg/公斤体重/小时。

如果需要，可将所述活性化合物的有效日剂量分成2、3、4、5、6或更多份亚剂量，任选以单位剂型在全天经过合适的时间间隔给予。在一个实施方式中，所述化合物以每日一次剂量给予。在进一步的实施方式中，连续给予所述化合物，例如通过静脉内或其它途径。在其它实施方式中，给予所述化合物的频率低于每日一次，例如每周一次或更少。

虽然可以单独给予本发明化合物，但优选将该化合物作为药物制剂(组合物)给予。

接受这种治疗的对象是有需要的任何动物，包括灵长类，特别是人，和其它哺乳动物，例如家兔、马、牛，如奶牛、猪、山羊和绵羊；和通常的禽类及宠物。

可将本发明化合物给予或与药学上可接受的运载体混合给予，也可与抗微生物制剂，例如青霉素、头孢菌素类、氨基糖苷类和糖肽类一起给予。因此，联合治疗包括依次、同时和分别给予所述活性化合物，使后续给药时前次给予的化合物的疗效尚未完全消失。

给予所述化合物的可能途径

可通过任何合适的给药途径将这些化合物给予人和其它动物进行治疗。本文所用的术语给药“途径”包括但不限于：皮下注射、静脉内注射、眼内注射、真皮内注射、肌肉内注射、腹膜内注射、气管内给药、脂肪内给药(intraadiposal administration)、关节内给药、鞘内给药、硬膜外给药、吸入、鼻内给药、口服给药、舌下给药、口腔含化给药、直肠给药、阴道给药、脑池内给药、透皮给药和局部给药、或经局部递送给药(例如通过导管或支架)。也可给予缓释剂型或共同给予所述化合物。

在本发明方法中，还可通过鼻内、眼内、眼周和阴道内途径给予所述药学化合物，包括栓剂、吹入剂、粉末和气溶胶制剂(例如类固醇吸入剂，参见通过引用纳入本文的Rohatagi(1995)J.Clin.Pharmacol.35:1187-1193；Tjwa(1995)Ann.Allergy AsthmaImmunol.75:107-111)。可通过混合药物与合适的无刺激赋形剂来制备栓剂，所述赋形剂在平常温度下是固体，但在体温下是液体，因此会在体内融化而释放药物。此类材料是可可脂和聚乙二醇。

在本发明的方法中，可配制成涂布棒、溶液、悬浮液、乳液、凝胶、乳膏、软膏、糊剂、凝胶剂、粉末和气溶胶，通过局部途径经皮递送所述药学化合物。

在本发明的方法中，可胃肠外给予所述药学化合物，例如静脉内(IV)给药或体腔(例如，滑液空间)或器官内腔中给药。这些制剂可包含溶解于药学上可接受的运载体中的活性药物溶液。可采用的可接受载体和溶剂是水和林格液，一种等渗氯化钠(溶液)。此外，可采用无菌的不挥发油作为溶剂或悬浮介质。为此目的，可采用任何温和的不挥发油，包括合成单甘油酯或甘油二酯。

本文所述的本发明方法可单独使用或与其它方法联用以治疗自身免疫疾病或本文所述的其它疾病。

联合方案所采用的具体联合治疗(疗法或过程)要考虑所需疗法和/或过程是否与要实现的所需治疗效果相容。还应知道，所用疗法对同一疾病能否实现所需效果(例如，本发明化合物可与用于治疗同一疾病的另一种药物同时给予)，或者它们可实现不同效果(例如，控制任何不良作用)。通常给予以治疗或预防特定疾病或病症的本文所用的其它治疗剂称为“适合于所治疗疾病或病症的”治疗剂。

可同时、依次或分别给予所述治疗剂的各个组分来实现本文定义的本发明联合治疗。

治疗应用

为预防或治疗目的可给予本文所述的多核苷酸或调节性化合物(下文称为“治疗剂”)。当预防性提供时，在出现任何症状前提供所述治疗剂。所述治疗剂的预防性给药的作用是防止或减轻任何症状。当治疗性提供时，在发生疾病或病症症状时(或其后不久)提供治疗剂。治疗性给予所述治疗剂的作用是减轻实际症状的任何恶化。

所治疗的个体可以是任何哺乳动物。一方面，所述哺乳动物是人。另一方面，此人患有自身免疫疾病或病症。在其它方面，所述自身免疫疾病或病症与以下疾病相关或选自以下疾病：多发性硬化症、I型糖尿病、再生障碍性贫血、格雷夫斯病、腹部疾病、克罗恩病、红斑狼疮、关节炎、骨关节炎、自身免疫葡萄膜炎和重症肌无力。

在其它方面，此人患有炎性疾病或病症。在另一方面，所述炎性疾病或病症与以下疾病相关或选自以下疾病：炎性肠病、类风湿性关节炎、过敏、动脉粥样硬化、银屑病、胃炎和缺血性心脏病。在另一方面，所述炎症与脑死亡相关，优选脑组织中内源性循环α-MSH或α-MSH的水平降低。在还有另一方面，用所述治疗剂治疗患有α-MSH或MC1-受体介导病症或疾病的对象。

在另一方面，本发明涉及治疗患有黑色素瘤的对象。在一方面，本发明减轻或缓解对象中的黑色素瘤。在还有另一方面，在黑色素瘤检测或成像试验中采用本发明化合物。

装有所述化合物的药盒

本发明还提供实施本发明治疗方案的药盒。此类药盒单独或联合装有治疗有效量的药学上可接受形式的肽和药学上可接受形式的其它药物，该肽具有MC1R调节剂的特定活性。优选的药物剂型包括肽与无菌盐水、葡萄糖溶液、缓冲液或其它药学上可接受的无菌液体的组合。或者，可冻干或干燥所述组合物。在此例中，药盒也可装有药学上可接受的溶液(优选无菌)以形成注射溶液。在另一实施方式中，药盒还可装有针头或注射器，优选包装成无菌形式以供注射所述组合物。在其它实施方式中，所述药盒还装有将该组合物给予对象的用法说明材料。说明材料可以是书写的插页、音频记录、视频记录或指导给予对象该组合物的任何其它手段。在一个实施方式中，所述药盒装有(i)含有肽的第一容器，所述肽具有MC1R-特异性调节活性；和(ii)用法说明材料。

治疗方法的其它实施方式

在一些实施方式中，本发明向有需要的对象提供能减轻或抑制其移植物排异的方法，包括给予所述对象包含药学上可接受的赋形剂和有效量的至少一种本文提供的肽化合物的药物组合物。在一些实施方式中，本发明提供减轻或抑制移植的组织、细胞或器官引发对象产生免疫应答的方法。移植组织的非限制性例子是实验性心脏移植中的同种异体移植物和胰岛细胞。

在实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)模型中的免疫抑制活性

产生了α-MSH的新型D-氨基酸肽类似物并在实验性自身免疫葡萄膜炎(EAU)和实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)模型以及脂多糖(LPS)替代性炎症疾病模型中评估其免疫调节作用。在EAU模型和MOG诱导的EAE小鼠模型中，用RIα-MSH类似物治疗降低了临床疾病评分和疾病发生率。此外，治疗小鼠中，MOG免疫小鼠的脾脏和淋巴结中TNF-α和IL-10mRNA表达水平降低。在LPS诱导的全身炎症模型中，α-MSH和类似物治疗降低了血清细胞因子水平。这些数据表明这些新型α-MSH类似物具有用于治疗炎症和自身免疫疾病的潜能。

材料和方法

肽.α-MSH(SYSMEHFRWGKPV)购自宾夕法尼亚州金戈夫普鲁西亚的巴卡姆公司(Bachem,King of Prussia,PA)。D-氨基酸RIα-MSH类似物(vpkgwrfhemsys)、RIα-MSH的丙氨酸取代肽、(硬脂酰基)HfRW(820)、(Ph(CH₂)₃CO)HfRW(819)和RIα-MSH类似物891[vpkGwr(D-Cha)hsiiss]由健赞公司(Genzyme Corporation)用标准固相方法合成，通过反相HPLC纯化。混杂的D氨基酸对照肽(ksrsmgvfpeyh)由健赞公司合成。无关的D氨基酸对照肽(plykkiikklles)由健赞公司合成。

动物.5-6周龄雌性B10.RIII-H2r小鼠购自缅因州巴港的杰克逊实验室(JacksonLaboratories,Bar Harbor,ME)。

6-8周龄雌性或雄性C57BL/6小鼠购自缅因州巴港的杰克逊实验室。动物研究的所有方案得到健赞股份有限公司的公共动物照料和使用委员会(Institutional AnimalCare and use Committee)(IACUC)批准。

EAU诱导.在两个部位(肩胛骨之间和骨盆区)给雌性B10.RIII分别皮下注射总共200μg马萨诸塞州费奇伯格新英格兰肽公司(New England Peptide；Fitchburg,MA)的光感受器间结合蛋白肽(interphotoreceptor binding protein peptide)(IRBP)161-180，该肽用含结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)H37Ra(密歇根州底特律迪菲科公司(Difco,Detroit,MI))的2mg/ml完全弗氏佐剂(CFA；密苏里州圣路易斯西格玛公司(Sigma,St.Louis,MO))配制。

眼评分.用1或2滴1％托吡卡胺(波多黎各胡玛考的阿尔康公司(Alcon；Humacao,Puerto Rico))和暗室中静置约5分钟扩张小鼠眼睛的(瞳孔)。用手捉住小鼠，用带78号屈光镜的间接眼底镜观察双眼视网膜。采用0-5之间的渐进评分系统给眼睛的炎症评分。评分0：正常视网膜。评分1：邻近视神经有血管炎症。评分2：<5个炎性病损局限于眼睛的一个象限。评分3：在眼睛的一个以上象限中有>5个炎性病损。评分4：炎性病损汇合。评分5：视网膜剥脱。收集小鼠的完整眼睛置于PBS中。将眼睛包埋在OCT介质中冷冻固定。通过乳头-视神经平面切割成5-μm的切片，用苏木精和曙红染色。

与黑皮质素受体的结合研究.检测了α-MSH、RIα-MSH和混杂肽与黑皮质素受体：1、3、4和5的结合概况。采用竞争性结合试验与(Nle4,D-Phe7)α-MSH(巴卡姆公司)进行结合研究。由法国巴黎的克莱普实验室(Cerep laboratories)用编码样品进行结合分析。

所述肽结合后，还用HEK293细胞系膜制品进行与¹²⁵I-NDP-MSH竞争结合黑皮质素受体1、3、4和5的研究。25℃，将与¹²⁵I-(Nle4,D-Phe7)-α-MSH混合的诸肽在V-底96孔板的结合缓冲液(25mM HEPES pH7,1.5mM CaCl₂,1mM MgSO₄,100mM NaCl,0.2％BSA)中与含1-10fmol受体的HEK293转染细胞系(马萨诸塞州波士顿的帕金埃尔默公司(Perkin Elmer,Boston MA))的膜制品混合1小时。用3μM的(Nle4,D-Phe7)-NDP-MSH(巴卡姆公司)作为阳性对照。使混合液通过96-孔GFC过滤器(马萨诸塞州比尔里卡米利波尔公司(Millipore,Billerica,MA))过滤，用不含BSA的结合缓冲液洗涤3次，干燥并计数。

cAMP检测.将弗吉尼亚州马纳萨斯美国模式培养物保藏所(American TypeCulture Collection,Manassas,VA)的B16-F1(黑色素瘤细胞系)细胞以5x10⁴/孔接种平底96孔板，用补加了2mM谷氨酰胺、抗生素(100U/ml青霉素和100U/ml链霉素)和10％热灭活胎牛血清(纽约州格兰德岛市英杰公司(Invitrogen,Grand Island,NY))的DMEM(马里兰州沃克斯维尔市坎布莱克斯公司(Cambrex,Walkersville,MD))培养过夜。然后用天然α-MSH(0.01-1000ng/ml)、逆-倒位α-MSH(0.01-1000ng/ml)或混杂D氨基酸对照肽(0.01-1000ng/ml)处理细胞30分钟。裂解细胞，用新泽西州皮斯卡塔韦AB公司(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)的酶免疫测定试剂盒检测胞内cAMP水平。用密苏里州圣路易斯西格玛公司的100μM毛喉素作为阳性对照。

EAE诱导和评分.用含0.6mg结核分枝杆菌(密歇根州底特律迪菲科公司)的完全弗氏佐剂(CFA；密苏里州圣路易斯西格玛公司)乳化的MOG35-55肽(200微克/小鼠；马萨诸塞州费奇伯格新英格兰肽公司)免疫雌性C57BL/6小鼠。每只小鼠皮下二点注射递送0.2ml体积的乳液。腹膜内给药途径采用400纳克/动物剂量的PBS配制的百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)毒素(PTX；西格玛公司)，在第0天和第3天给予。每日监测小鼠的EAE麻痹症状。采用0-5之间的渐进评分系统给小鼠的临床症状评分。评分0：无疾病；评分1：尾巴松弛；评分2：后肢虚弱；评分3：后肢瘫痪；评分4：前肢虚弱/部分瘫痪；评分5：死亡。收集脊髓和脑包埋在石蜡中以供苏木精和曙红染色。

增殖试验.在96孔板中以5x10⁵个细胞/孔培养C57BL/6小鼠脾细胞和淋巴结细胞。取MOG35-55或OVA 257-264肽以25μg/ml的浓度加入各孔。收集MOG肽刺激后48小时的上清液。培养3天后，用1μCi/孔的[3H]胸苷脉冲细胞8小时。通过cpm检测胸苷掺入。

细胞因子RNA分析-RT-QPCR.用加利福尼亚州卡尔斯巴德英杰公司(Invitrogen,Carlsbad,CA)的TRIzol提取组织的总RNA。采用SYBR绿(荧光)掺入和加利福尼亚州福斯特城应用生物系统公司(Applied Biosystems,Foster City,CA)的试剂，在ABI 7900仪上逆转录1μg总RNA，用定量PCR检测。对于靶细胞因子检测，在每次PCR中运作cDNA标准品并按小鼠β-肌动蛋白标准化所得信使(RNA)的浓度。用于获得这些数据的引物如下：小鼠TNFα正向-ggcaggtctactttggagtcattgc和反向-acattcgaggctccagtgaattcgg(1)。我们采用的小鼠IL-10正向:tgctatgctgcctgctctta和反向:tcatttccgataaggcttgg(2)。小鼠β-肌动蛋白的序列是：正向gtgggccgctctaggcaccaa和反向ctctttgatgtcacgcacgattt c(3)。

CBA分析.利用加利福尼亚州圣何塞BD生物科学公司(BD Biosciences,San Jose,CA)制造的细胞计数珠试验试剂盒(CBA)对小鼠血清或细胞上清液作炎性细胞因子概况的流式细胞术分析。按照生产商的方案加工样品。

mMC1R RNA分析-RT-QPCR.用加利福尼亚州卡尔斯巴德英杰公司的TRIzol提取组织的总RNA。用Taqman试剂盒和加利福尼亚州福斯特城应用生物系统公司的试剂，在ABI7900仪上逆转录1μg总RNA，用定量PCR检测。对于mMC1R检测，在每次PCR中运作cDNA标准品，按真核18S内源性对照(VIC/MGB探针,应用生物系统公司部分#4319413E)标准化所得信使(RNA)的浓度。mMC1R的引物如下：正向CTCTGCCTCGTCACTTTCTTTCTA和反向AACATGTGGGCATACAGAATCG及探针CCATGCTGGCACTCA。这些引物的设计采用了加利福尼亚州福斯特城应用生物系统公司的引物表达3.0软件。

LPS模型.用LPS(1微克/小鼠)腹膜内注射攻击雄性C57BL/6小鼠。30分钟后，用地塞米松(2mg/kg；西格玛公司)、RI-α-MSH类似物891或RI-α-MSH治疗小鼠。LPS攻击后2小时，给小鼠放血获取血清。用细胞计数珠试验试剂盒(BD生物科学公司)作流式细胞术分析细胞因子。

统计学分析.结果表示为平均值±SD。各实验重复至少两次。为分析结果，采用单向ANOVA和Tukey多重比较检验。

提供以下实施例是为了说明而非限制本发明。

实施例1

在实验性自身免疫葡萄膜炎(EAU)模型中的免疫抑制活性

自身免疫葡萄膜炎是一种可导致疼痛和视力丧失的眼睛炎性疾病。类固醇和免疫抑制药物是目前葡萄膜炎的唯一治疗剂，常具有严重的眼睛和全身毒性。因此，需要安全的替代治疗剂。

EAU是一种影响美国两百三十万人葡萄膜炎的动物模型。用光感受器间类视黄醇结合蛋白(IRBP)或其肽片段或视网膜S-抗原(S-Ag)加佐剂免疫接种可诱导易感啮齿类动物品系产生该疾病。该疾病涉及眼睛视网膜中炎性细胞浸润和光感受器损坏，可自然恢复且无自发性复发。在同系啮齿动物受者中可过继性转移致葡萄膜炎性T细胞(uveitogenicT cell)，提示葡萄膜炎是器官特异性T细胞介导的自身免疫疾病，如同许多其它类似的自身免疫疾病，例如多发性硬化症、1型糖尿病和类风湿性关节炎。

眼睛的微环境是免疫赦免部位，其中维持免疫抑制的机制适当地阻止了局部发生炎症。眼组织中神经元表达的几种神经肽有助于维持眼睛的免疫赦免。这些神经肽之一是α-MSH，它在眼睛微环境中以30pg/ml的生理浓度持续表达。

在大鼠内毒素-诱导的葡萄膜炎期间全身性给予天然α-MSH，以剂量依赖性方式抑制了眼房水中的浸润细胞数和IL-6、TNF-α、MCP-1、MIP-2及一氧化氮水平。在小鼠EAU模型中，当视网膜炎症达到高峰时给予α-MSH抑制了该病的严重程度。α-MSH可通过T细胞上的黑皮质素5受体(MCR-5)诱导T调节细胞而抑制EAU。

评估了天然α-MSH在小鼠后色素层葡萄膜炎模型中的治疗效果。给B10.RIII小鼠注射IRBP 161-180和CFA诱导葡萄膜炎。免疫后约10天疾病发作。第13天眼评分达到2-3，连续7天静脉内注射给予小鼠(200微克/小鼠)天然α–MSH，或不治疗。由于预防性治疗系靶向疾病引发阶段而非效应阶段的活动性炎症，故当观察到活动性视网膜炎症时开始治疗。此外，该治疗方案着重于临床应用。与未治疗的小鼠相比，用α-MSH治疗的小鼠在7天治疗期间显示临床平均眼评分降低(图1a)。与未治疗组小鼠第15天达到最高眼平均评分3.67±0.52相比，α-MSH治疗小鼠第13天显示的最高眼平均评分为2.83±0.39。

实施例2

在B10.RIII实验性自身免疫葡萄膜炎模型中比较天然α-MSH与地塞米松

葡萄膜炎目前的治疗方式包括皮质激素和免疫抑制剂。将天然α-MSH的效果与已知的皮质激素治疗剂地塞米松相比。注射IRBP161-180和CFA诱导B10.RIII小鼠发生葡萄膜炎。疾病发作即小鼠的眼临床评分达到1时，每日腹膜内注射给予小鼠天然α-MSH(100微克/小鼠)、0.2mg/kg地塞米松或2.0mg/kg地塞米松。每日治疗小鼠21天。与PBS对照小鼠相比，在治疗期间用天然α-MSH治疗的小鼠显示临床平均眼评分显著降低(图1B)。数据显示每日腹膜内注射给予天然α-MSH抑制葡萄膜炎的程度高于0.2mg/kg或2.0mg/kg剂量的地塞米松治疗。

实施例3

新型逆-倒位α-MSH类似物可特异性结合MCR-1

合成了天然α-MSH的新型、稳定的D-氨基酸肽类似物(RIα-MSH)并在体外和实验性自身免疫葡萄膜炎(EAU)模型中评估了其免疫调节性能。结合研究表明与天然α-MSH不同，RIα-MSH能特异性结合抗-炎性α-MSH受体(MCR-1)，但不结合其它α-MSH受体(MCR-3、4或5)。

分析了RIα-MSH类似物与黑皮质素受体(MCR)的结合。采用包括MCR 1、3、4和5在内的一组MCR进行竞争性结合试验。如前所述，所述肽的结合与¹²⁵I-NDP-MSH竞争。天然α-MSH能结合MCR 1、3、4和5。然而，与天然α-MSH不同，发现RIα-MSH只结合调节炎性应答的MCR-1(表1)。混杂D氨基酸对照肽不结合任何黑皮质素受体。开发的能特异性结合MCR-1而不结合MCR-3和MCR-4的α-MSH类似物，可降低天然α-MSH通过结合这些受体可能产生的副作用。

表1

小写字母代表氨基酸的D-异构体；黑体字代表RIα-MSH的变化。

所述肽结合后与¹²⁵I-NDP-MSH竞争结合黑皮质素受体1、3、4和5，采用了HEK293细胞系的膜制品。如图18所示，RIα-MSH对MC1R显示了非常强的选择性，MC 3、4和5R的Ki值超过30μM，而α-MSH显示能与所有四种受体显著结合，对MC1R的选择性比MC3R低100-倍。

实施例4

用逆-倒位α-MSH类似物治疗缓解EAU疾病

在实验性葡萄膜炎小鼠(EAU)模型中观察到这种新型逆-倒位α-MSH肽类似物的免疫调节作用，将其与用天然α-MSH肽得到的结果相比。在疾病发作时或疾病晚期全身性递送RIα-MSH显著地且可重复地缓解葡萄膜炎。此外，用新型RIα-MSH肽类似物治疗抑制葡萄膜炎的幅度与天然α-MSH肽类似。这些数据表明新型RIα-MSH类似物具有抗炎活性，可用于治疗葡萄膜炎和其它自身免疫疾病及炎症。

用IRBP 161-180诱导雌性B10.RIII小鼠产生EAU。检测RIα-MSH和天然α-MSH用作治疗而非预防时的治疗效果。当小鼠达到葡萄膜炎病程中期时(眼评分为2)，每日静脉内注射100微克/小鼠RIα-MSH、100微克/小鼠天然α-MSH或PBS治疗小鼠。如图2A所示，对照PBS-治疗小鼠第16天时达到最高眼评分，平均眼评分为2.75±0.68。然而，在治疗期间与PBS对照小鼠相比，用RIα-MSH类似物或天然α-MSH每日治疗的小鼠显示临床平均眼评分显著降低。第16天(治疗开始后的第4天)，PBS治疗组8只小鼠中的5只最高眼评分为3或更高；而天然α-MSH治疗的8只小鼠中只有1只，RIα-MSH治疗的8只小鼠中无一只最高眼评分为3或更高(图2B)。

实施例5

视网膜成像和组织学检查用RIα-MSH治疗的对象显示EAU模型疾病受到抑制

与PBS对照小鼠相比，在晚期葡萄膜炎开始时每日用RIα-MSH或天然α-MSH治疗的小鼠视网膜成像显示疾病受到抑制。治疗开始后第13天获取眼底检查图像(图3)。PBS治疗组的疾病稳定或发展，眼评分中值为3，整个眼睛中有严重的血管炎和炎性病损(图3A)。然而，RIα-MSH和天然α-MSH肽治疗小鼠的疾病快速消退。视网膜图像显示眼评分为1，仅视神经有炎症(图3B和3C)。各组各只小鼠的最高眼评分见图3D。PBS治疗组11只小鼠中的7只眼评分为3或更高。然而，天然α-MSH和RIα-MSH(组)11只小鼠中只有2只眼评分为3或更高。

每日治疗开始后10天的眼睛组织学检查显示RIα-MSH和天然α-MSH均减轻了眼睛的病理学状况(图4)。天然α-MSH和RIα-MSH治疗小鼠显示正常的视网膜构造，视神经区有轻度炎症(图4B和4C)。相反，PBS治疗小鼠显示眼睛炎症和组织破坏。视网膜和视神经区有可见炎症及光传感器破坏(图4A)。

实施例6

在EAU中腹膜内给予逆-倒位α-MSH与混杂对照肽的比较

给B10.RIII小鼠注射IRBP 161-180和CFA诱导葡萄膜炎。我们评估了疾病晚期(眼睛评分为2-3)每日腹膜内注射RIα-MSH初始治疗的效果并与混杂D氨基酸肽对照作比较。在13日期间，每日用100微克/小鼠的RIα-MSH或混杂肽腹膜内治疗小鼠。与混杂肽对照小鼠相比，疾病进程第15、21和23天用RIα-MSH治疗的小鼠显示临床平均眼评分显著降低(p<0.04)(图5)。诱导疾病后第23天显示RIα-MSH(组)75％的小鼠最高眼评分<1，与之相比混杂肽对照组小鼠无一评分<1。记录了疾病进程中4个时间点各小鼠的体重。RIα-MSH治疗和混杂肽治疗组的所有小鼠维持了它们的体重或显示为正常增重(数据未显示)。每日腹膜内给予所述肽未导致体重丧失。此外，当疾病发作(此时小鼠达到眼临床评分为1)给予治疗时，经腹膜内途径给予100微克/小鼠的天然α-MSH或RIα-MSH对葡萄膜炎具有效力(数据未显示)。因此，与混杂肽对照相比，腹膜内途径给予RIα-MSH显示疾病评分显著降低。

实施例7

给予EAU模型不同剂量的RIα-MSH

我们还检查了逆-倒位α-MSH治疗晚期严重葡萄膜炎的效力和最佳剂量。给B10.RIII小鼠注射IRBP 161-180和CFA诱导葡萄膜炎。每日腹膜内注射给予小鼠100微克、10微克或3微克/小鼠的PBS、对照混杂肽(100微克/小鼠)或RIα-MSH进行治疗。当疾病达到高峰小鼠眼评分为4，包括整个眼房水区域发生炎性病损和可能出血时开始治疗。PBS和混杂肽对照组的疾病依然严重(图6)。相反，用100微克或10微克/小鼠的RIα-MSH治疗快速缓解了葡萄膜炎(p≤0.05)。此外，10和100微克/小鼠的剂量效果相当。3微克/小鼠剂量的RIα-MSH不能减轻或抑制疾病。

实施例8

逆-倒位α-MSH对cAMP水平的作用

检测了用天然α-MSH、RIα-MSH或混杂对照肽治疗后B16-F1黑色素瘤细胞中的cAMP水平。与仅表达100-200个受体/细胞的巨噬细胞细胞系相比，B16-F10黑色素瘤细胞系表达了大量MCR1受体(3000-4000个受体/细胞)。因此，我们选择其来检测RIα-MSH治疗对黑色素瘤细胞系的作用。用1pg/ml-1μg/ml浓度的天然α-MSH、RIα-MSH或对照混杂肽处理鼠黑色素瘤B16-F1细胞。30分钟后，裂解细胞，用酶免疫试验检测胞内cAMP。常用于升高cAMP水平的毛喉素对照(100μM)处理的细胞显示cAMP增加(3455.39±406.6SD)。与未处理细胞相比，用天然α-MSH处理的细胞cAMP水平以剂量依赖性方式显著升高(图7A)。与未处理或混杂肽对照相比，RIα-MSH类似物也以剂量依赖性方式显著提高了cAMP水平。然而，与10pg/ml浓度天然α-MSH所提高的cAMP相比，RIα-MSH需要更高浓度(100ng/ml)才能提高cAMP。提高cAMP水平所需的这种浓度差异可能是对MCR1受体的结合亲和力所致。

实施例9

序列改变和对cAMP水平及结合MC1R的影响

MSH能结合MC1R、MC3R、MC4R和MC5R，其中MC1R是免疫介导疾病所需的一种靶标。逆-倒位MSH(RI-MSH)经工程改造而具有增强的血浆稳定性(图17)和MC1R选择性，但其对MC1R的亲和力比天然MSH肽低11-倍(表1)。为恢复MC1R亲和力，我们嫁接入已知能改善MC1R对MSH亲和力的RI-MSH修饰。在为增强MC1R对MSH亲和力的N-末端SYSME序列-脂肪酰基、苯基丁酸和SSIIS序列三种取代中，只有最后一种RI-MSH能导致显著增强。RI-MSH的D-丙氨酸扫描模拟(analoging)显示与MSH的丙氨酸扫描模拟有相似的构效关系，但核心4-残基MC1R结合区的立体化学倒置扫描(stereochemistry inversion scanning)提示MSH与RI-MSH之间有显著不同。此外，关键苯基丙氨酸残基的环己基丙氨酸取代改善了RI-MSH而非MSH与MC1R结合。联合环己基丙氨酸和SSIIS取代导致完全恢复MSH对MC1R的亲和力，同时保留了对RI-MSH的改进稳定性和MC1R高选择性至关重要的逆-倒位构型。

制备了逆-倒位MSH(RI-MSH)的一组丙氨酸扫描类似物(肽804-816)，检验其对B16/F1鼠和M624人黑色素瘤细胞的cAMP诱导。然后检验依据cAMP结果的亚组是否结合MC1R。其结合MC1R观察到的Ki值见表1。

用1μg/ml的天然α-MSH、RIα-MSH、混杂肽对照、KPV或RIα-MSH的丙氨酸取代肽处理鼠黑色素瘤B16-F1细胞(图7B)。毛喉素对照(100μM)处理的细胞显示cAMP增加(3294.82±54.53)。与未处理的、混杂肽或KPV处理的细胞相比，用天然α-MSH和RIα-MSH处理的细胞cAMP水平显著升高。命名为810、811和812的丙氨酸取代肽显示cAMP活性不增加，显示的cAMP水平与未处理的、混杂肽或KPV处理的细胞相当。命名为810、811和812的肽的中央核心四肽序列(D-Trp D-Arg D-Phe D-His区域；AA 5-8)含有丙氨酸取代，已提出该序列涉及天然α-MSH与黑皮质素受体的结合及其生物学活性。RIα-MSH肽N末端或C末端区域的丙氨酸取代不影响黑色素瘤细胞中的cAMP累积。甲硫氨酸和组氨酸(807和809)的丙氨酸取代还显示cAMP累积减少，虽然其程度不及核心四肽序列(810、811或812)观察到的那样。核心四肽的残基(wrfh)和RI-MSH的甲硫氨酸4(程度稍低)对于结合MC1R至关重要。

另一种方法显示依据MSH变体序列的噬菌体展示进行选择，证明能提高MSH对MC1R亲和力。随后通过重组噬菌体展示选择的肽和亲代MSH序列的一部分，发现了MC1R-高选择性序列(MS05)，其对MC1R的亲和力为亚纳摩尔(subnanomolar)级。该序列的逆-倒位形式出乎意料地显示对于MC1R的亲和力(1nM，表1肽886)高于RI-MSH(4nM)，即使据报道MS08对MC1R的亲和力略低于MSH(Ki为0.865nM；MSH为0.557nM)。

大量非天然氨基酸残基的取代导致RI-MSH各位置电荷和结构发生轻微改变，但显示MC1R耐受只有高度保守性改变。除3个以外所有(改变)显示较低或相等的结合。两种改变显著增加对MC1R的亲和力：D-环己基丙氨酸取代D-苯基丙氨酸(D-Cha，肽869；2.2nM Ki)和D-丁硫氨酸取代D-甲硫氨酸(肽878,2.3nM Ki)。发现L-环己基丙氨酸取代轻微抑制了与MC1R结合(肽892,Ki 0.51nM；对MSH为0.41nM)。丁硫氨酸与环己基丙氨酸联合取代出乎意料地未能进一步显著提高对MC1R的亲和力(肽890,1.9nM Ki)。然而，包含MS05的逆-倒位N-末端序列(siiss)取代C-末端序列(emsys)和D-环己基丙氨酸取代RI-MSH的D-Phe的联合改变，对结合的增强高于单独的各自改变，表明有协同作用。得到的肽(891)显示对MC1R的Ki不同于MSH。虽然该改变和其它改变也提高了对其它MCR的亲和力，但其Ki值仍在微摩尔范围，表明RI-MSH的选择性极为保守。图20显示了这种改变。代表性的竞争性结合试验示于图21。观察到的Ki值见表1。

实施例10

用RIα-MSH治疗降低EAE的临床疾病评分

评价了慢性渐进性EAE小鼠模型中给予天然α-MSH和RIα-MSH类似物的效果。用CFA乳化的200μg MOG 35-55肽免疫雌性C57BL/6小鼠。在第0和2天给予百日咳毒素。每日监测小鼠的临床症状迹象和体重丧失。第8天开始评估小鼠的麻痹症状，评分等级系统为0-5分。大多数小鼠约在第9-11天出现麻痹临床症状(图8A)。第10天开始用100微克/小鼠的α-MSH或RIα-MSH肽或PBS对照每日腹膜内注射治疗。与PBS对照相比，用100μg RIα-MSH治疗的小鼠显示临床疾病平均评分显著降低(图8A)。与PBS载体对照相比，RIα-MSH(组)第14-22天达到p≤0.05的显著性。然而，天然α-MSH肽治疗对疾病诱导或进展无作用。与PBS(80％)或天然α-MSH治疗(75％)小鼠组相比，RIα-MSH治疗组小鼠疾病最高发病率百分比(20％)降低。

实施例11

EAE中RIα-MSH的剂量变化

RIα-MSH在100微克/小鼠的剂量时疗效明显。在MOG EAE小鼠模型中检验用100微克/小鼠和30微克/小鼠的α-MSH或RIα-MSH肽治疗效果。MOG免疫后第10天开始每日腹膜内注射治疗。增加每日地塞米松(2mg/kg)治疗作为对照治疗。与PBS对照相比，100μg RIα-MSH治疗小鼠反复显示临床疾病平均评分降低(图9)。然而，30微克/小鼠剂量的RIα-MSH对降低临床平均评分无显著作用。整个疾病进程中地塞米松治疗也显示能降低疾病评分。虽然用天然α-MSH治疗的小鼠的临床平均评分低于PBS，但用α-MSH治疗的小鼠未显示与RIα-MSH或地塞米松治疗小鼠相似的效果。与PBS治疗小鼠显示的疾病发病率最高为75％相比，RIα-MSH治疗组疾病发病率百分比最高达到35％，地塞米松组为40％(图9)。这些数据表明用RIα-MSH肽类似物治疗EAE显著降低了临床疾病平均评分和疾病的发病率。

实施例12

CNS组织学

诱导疾病后第24天收集PBS和RIα-MSH治疗小鼠的脊髓。用苏木精和曙红染色脊髓切片评估炎症程度和病损数目。EAE的病理学检查显示了有炎性细胞浸润和脱髓鞘的病灶区(focal area)。脊髓的组织病理学评估显示RIα-MSH治疗MOG EAE模型有效。各治疗组代表性小鼠切片的临床平均评分见图10a-10d。数据显示与RIα-MSH治疗小鼠显示缺乏炎症病灶区域相比，PBS治疗组小鼠有广泛的炎性浸润。

实施例13

检测疾病进展期间脾脏的TNF-α和IL-10

检查了RIα-MSH治疗EAE效果的作用机制。据报道天然α-MSH通过降低TNF-α水平和提高IL-10而作用于单核细胞/巨噬细胞。用定量PCR评价了RIα-MSH或天然α-MSH治疗MOG免疫小鼠脾脏的TNF-α和IL-10mRNA水平。用MOG p35-55免疫小鼠，第10天开始每天用RIα-MSH或天然α-MSH治疗。开始每日治疗后的第1、4和7天收集小鼠脾脏样品。数据显示每日治疗7天后，与PBS对照相比，用RIα-MSH和α-MSH治疗显著降低了TNF-α水平(p≤0.001)(图11e)。然而，之前时间点(第1天和4天；图11a和11c)的TNF-α水平没有显著变化。与PBS对照相比，第7天时间点时，RIα-MSH和αMSH治疗组的IL-10mRNA水平也降低(图11f)。然而，在较早的时间点未检测到IL-10mRNA水平差异(图11b和11d)。虽然天然α-MSH治疗不降低临床疾病平均评分或疾病发病率百分比，但在该项研究中，与PBS对照相比，在疾病进展的第17天α-MSH治疗降低了脾脏的TNF-α和IL-10mRNA水平。每日治疗后，RIα-MSH类似物能降低脾脏的TNF-αmRNA水平。

实施例14

RIα-MSH对MOG肽回忆应答的影响

评估了用α-MSH或RIα-MSH体内治疗小鼠对MOG 35-55肽回忆应答的影响。用MOG35-55肽免疫小鼠后第2-8天，用PBS、100μgα-MSH或100μg RIα-MSH治疗小鼠。第9天，收集脾脏和引流淋巴结，用[3H[胸苷掺入体外分析MOG35-55肽的回忆应答。数据显示与PBS治疗组相比，α-MSH组小鼠脾细胞对MOG35-55肽的增殖应答显著降低(图12a)。RIα-MSH治疗组显示对MOG35-55肽的回忆应答略微降低。然而，在PBS、α-MSH与RIα-MSH治疗组之间，淋巴结细胞群对MOG肽的回忆应答显示应答性无显著差异(图12b)。

收集体内治疗组(原初、PBS、α-MSH、RIα-MSH)各自用MOG35-55肽体外刺激脾细胞的细胞上清液。通过流式细胞术用细胞计数珠试验评估细胞因子水平。数据显示与PBS治疗组相比，α-MSH和RIα-MSH治疗组的TNF-α、IFNγ、IL-6和MCP-1水平均降低(图12c和12d)。α-MSH和RIα-MSH治疗组脾细胞上清液的细胞因子水平类似于未免疫小鼠脾细胞的细胞因子水平。

因此，RIα-MSH肽治疗可影响MOG肽的细胞因子回忆应答，但不影响T细胞增殖应答。

实施例15

EAE引发阶段α-MSH或RIα-MSH治疗小鼠的影响

用MOG 35-55肽免疫小鼠后第2-8天用PBS载体对照、α-MSH或RIα-MSH每日治疗。第9天收集各鼠脾脏，用实时PCR定量测定细胞因子的mRNA表达。图13显示疾病引发阶段，PBS、α-MSH或RIα-MSH治疗小鼠脾脏的TNF-α和IL-10mRNA表达水平。未用MOG肽免疫的原初小鼠用作定量测定TNF-α和IL-10的基线mRNA水平。与PBS载体对照相比，α-MSH或RIα-MSH治疗降低了IL-10和TNF-αmRNA水平。

在该研究的第9天还收集血液血清样品评估细胞因子：TNF-α、MCP-1、IL-12、IL-10和IL-6的水平(图13c和13d)。数据显示与PBS对照组相比，α-MSH和RIα-MSH治疗组的MCP-1和IL-6减少。与PBS对照相比，RIα-MSH治疗组的MCP-1显著减少(p<0.01)。此外，与PBS组相比，RIα-MSH治疗组显示TNF-α和IL-12减少。血清IL-10水平在三个治疗组之间没有差异。

实施例16

RIα-MSH不影响巨噬细胞标记

每日给予MOG 35-55免疫小鼠α-MSH或RIα-MSH 7天后，用流式细胞术检测脾CD11b⁺和F4/80⁺巨噬细胞表面的CD86、CD40和CD14表达水平。数据显示用α-MSH或RIα-MSH治疗小鼠的脾CD11b⁺或F4/80⁺巨噬细胞群的CD86、CD40或CD14表达水平没有差异(图14)。检测血液单核细胞的CD86、CD40和CD14表达水平得到相似结果(数据未显示)。

实施例17

在LPS炎症小鼠模型中的作用

据报道天然α-MSH通过刺激黑皮质素受体(MCR)，特别是黑皮质素1受体而下调TNF-α的产生从而抑制炎症。LPS能刺激炎性介质，例如TNF-α、MCP-1、IL-6和IFNγ产生，已用作急性炎症模型。在LPS小鼠炎症模型中检测了α-MSH类似物能否抑制炎性细胞因子产生。给予LPS后测定了脾脏和腹腔巨噬细胞的MC1R表达水平。给C57BL/6小鼠腹膜内注射LPS，在LPS注射后的数个时间点收集脾脏和腹腔巨噬细胞进行分析。数据显示在任何时间点，腹腔巨噬细胞的MC1R mRNA表达水平没有可辨别的差异(图15a)。然而，给予LPS不提高MC1R的mRNA水平超过未接受LPS攻击的原初小鼠。注射LPS后30分钟脾脏的MC1R mRNA水平升高，然后在注射后1小时降低(图15b)。在原初小鼠中，LPS同样提高了脾脏的MC1R mRNA水平超过基线水平。

数据所显示的脾脏和腹腔巨噬细胞MC1R mRNA表达，表明LPS攻击后30分钟可能是α-MSH或RIα-MSH类似物治疗的最佳时间点。给C57BL/6小鼠腹膜内注射LPS，30分钟后，腹膜内注射给予剂量范围5mg/kg到0.156mg/kg的天然α-MSH或RIα-MSH类似物891。RIα-MSH类似物891是其中d-Cha和hsiiss D-氨基酸加入到核心肽序列中的RIα-MSH的类似物。此RIα-MSH类似物891显示对小鼠MC1R的结合亲和力增加，刺激cAMP的效力增加(数据未显示)。结果显示与PBS载体对照相比，天然α-MSH治疗组的TNF-α和IL-10水平显著降低(图16a和16c)。天然α-MSH治疗不影响MCP-1(图16b)。用RIα-MSH类似物891治疗受LPS攻击的小鼠显示了相似的结果，与载体对照相比，TNF-α和IL-10显著降低而不影响MCP-1水平(图16d-16f)。较低剂量的天然α-MSH和RIα-MSH类似物891显示最大程度抑制炎性细胞因子。地塞米松阳性对照一贯显示抑制TNF-α和MCP-1水平。

实施例18

肽在血浆中的稳定性

估计天然α-MSH的血清半衰期大约为10分钟。虽然该半衰期有限，但该肽仍能引发强效抗炎活性。然而，需要更稳定的α-MSH类似物来提高抗炎活性的效力和进一步开发成为治疗剂。合成的天然α-MSH的D-氨基酸类似物(称为逆-倒位α-MSH或RIα-MSH)比天然α-MSH更稳定。肽的D-氨基酸形式比肽的L-氨基酸形式更耐受蛋白水解且代谢降解速率较低。

37℃，在血清或PBS中体外培育24小时测定RI-α-MSH的稳定性。取等份样品用2倍体积乙腈沉淀蛋白质。用α-MSH作为对照，缓激肽作为内标。离心后，将样品-80℃冻存直至用C18柱分离和正电喷射离子化模式进行LC/MS/MS(MRM)分析。如图17a所示，MSH显示的血浆半衰期约为3小时，但在PBS中稳定。然而，RI-α-MSH在PBS和血浆中均稳定，24小时期间显示没有可检测的降解。

α-MSH和RI-α-MSH的药代动力学(PK)概况提示，RI-α-MSH的血清半衰期长于天然α-MSH(图17b)。用单剂量的100μg RI-α-MSH或α-MSH治疗的小鼠24小时后有可检测到的血浆RI-α-MSH水平，但治疗后120分钟没有可检测水平的α-MSH(n＝5)。

实施例19

逆-倒位肽的结合效果

含有D-Phe的核心MSH四肽(HfRW)足以显著结合MC1R(20-50nM Ki)。然而，用同一四肽的逆-倒位形式(wrFh,883,Ki>30uM,表1)几乎观察不到结合，显示该逆-倒位肽不能以HfRW的相同方式完全接触该受体。在HfRW的N-末端加入脂肪酰基选择性增强了其与MC1R结合，产生了与MSH相当的亲和力。此点见于MC1R的硬脂酰-HfRW肽(1.3nM,肽820)。将二氨基己烷硬脂酰基加入该逆-倒位wrFh(肽882)中增强了与MC1R的结合(120nM,>250-倍)，其程度与将硬脂酸加入HfRW的N-末端相当(80-倍)，但未达到RI-MSH所见的亲和力(4.1nM)，再次表明RI-MSH中的其它残基在RI-MSH结合MC1R中起的作用高于MSH。

实施例20

立体化学性质对逆-倒位肽结合的影响

核心逆-倒位四肽中残基的立体化学性质对结合MC1R的影响明显不同于L-形MSH。如图19所示，将RI-MSH的核心四肽残基转变为L-形(肽884、893-895)均降低了该肽对MC1R的亲和力。令人吃惊和出乎意料的是，将RI序列的D-Phe转变为L-Phe导致结合降低20-倍，而据报道HFRW中的相应改变(L-Phe转变为D-Phe)增强了结合多达400-倍。对于其它残基，发现立体化学转变对RI-MSH的影响小于核心HfRW肽，再次表明RI-MSH核心四肽各残基的相对重要性低于HfRW四肽。

实施例21

逆-倒位MSH末端-加帽的影响

获得对MC1R较高亲和力的另一种可能的途径是根据观察到用苯基丁酸对HfRW肽末端加帽后，选择性和强烈地提高了HfRW对MC1R的亲和力(Ki＝6pM)。然而，观察到携带C-末端苯基丙酰胺的截短RI-MSH(肽847)的亲和力不提高，观察到在组氨酸残基处截短的肽(肽847int)及其氨基丙基-苯基加成物(肽847，表1)二者的Ki均为150nM，证明RI-MSH的结合方式改变因而不允许该四肽序列与MC1R中组氨酸结合元件附近的假定芳族相互作用位点同时相互作用。

实施例22

合成逆倒位MSH的毒素偶联物

通过Fmoc化学方法产生半胱氨酸附加于N-末端的修饰肽891(表1)。按照通过引用纳入本文的Doronina等.(2003)Nature Biotechnol.21:778-784所述，为偶联硫醇，合成了含有蛋白酶敏感性缬氨酸-瓜氨酸接头的单甲基奥利斯它汀E(MMAE)与马来酰亚胺基-己酰基部分的偶联物。25℃，将该肽与MMAE的偶联物在25mM磷酸钠、2mM EDTA pH7的溶液中培育14小时，通过C18反相HPLC(RP-HPLC)纯化产物。

实施例23

RIα-MSH类似物对鼠黑色素瘤细胞系cAMP产生的作用

天然α-MSH和RIα-MSH均能提高鼠黑色素瘤细胞的cAMP水平。制备RIα-MSH类似物以测定修饰RIα-MSH肽的核心序列是否会提高cAMP水平，并与RIα-MSH作比较。采用鼠B16-F1黑色素瘤细胞，在cAMP试验中对产生的RIα-MSH类似物进行剂量反应实验。

体外细胞培养：在96孔板中，利用含L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素及FBS的培养基培养B16-F1鼠黑色素瘤细胞过夜，5x10⁴个细胞/孔。除去培养基，细胞中加入含IBMX的新鲜培养基，培养1小时。然后用RIα-MSH或RIα-MSH肽类似物(890、891、892、893、894或895)处理细胞。30分钟后，用cAMP试验试剂盒裂解细胞，取上清液用于该试验。用10μM毛喉素作为阳性对照。

cAMP水平：用cAMP竞争试验试剂盒(AB公司)检测胞内cAMP。所有细胞裂解液样品作1:100稀释以供分析。

肽：

结果：用浓度范围10^-4-10^-11M的RIα-MSH或RIα-MSH类似物(869、872、880、878、886和890-895)处理鼠黑色素瘤B16-F1细胞。检测用RIα-MSH或RIα-MSH类似物处理的细胞的cAMP水平。与RIα-MSH相比，除类似物894以外，大多数RIα-MSH类似物显示EC₅₀值提高。与RIα-MSH肽相比，类似物891、892和886在cAMP试验中显示EC₅₀值提高最多。总之，与RIα-MSH肽相比，RIα-MSH类似物显示剂量反应和EC₅₀值改善。参见图22中的数据，EC₅₀数据参见表2。

表2

序列表

<110> 健赞股份有限公司(GENZYME CORPORATION)

M.A.佩里科内(PERRICONE, Michael A.)

J.L.德祖里斯(DZURIS, John Lyle)

T.E.威登(WEEDEN, Timothy E.)

J.E.斯蒂法诺(STEFANO, James E.)

C.Q.潘(PAN, Clark Q.)

A.E.埃德林(EDLING, Andrea E.)

<120> α-促黑素细胞激素的肽类似物

<130> 159792008140

<140> PCT/US2009/037809

<141> 2009-03-20

<150> US 61/056,373

<151> 2008-05-27

<160> 33

<170> FastSEQ Windows 4.0版本

<210> 1

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建的四肽

<220>

<221> SITE

<222> 2

<223> Xaa = D-Cha, D-Phe或Cha

<400> 1

His Xaa Arg Trp

1

<210> 2

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建的四肽

<220>

<221> SITE

<222> 1, 2, 4

<223> D-异构体形式

<220>

<221> SITE

<222> 3

<223> Xaa = D-Cha, D-Phe或Phe

<400> 2

Trp Arg Xaa His

1

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建物

<220>

<221> SITE

<222> (1)...(5)

<223> D-异构体形式

<400> 3

Ser Ile Ile Ser Ser

1 5

<210> 4

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建的多肽

<220>

<221> SITE

<222> 1-3, 5-6, 8-13

<223> D-异构体形式

<400> 4

Val Pro Lys Gly Trp Arg Phe His Ser Ile Ile Ser Ser

1 5 10

<210> 5

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建的多肽

<220>

<221> SITE

<222> 1-3, 5-6, 8-13

<223> D-异构体形式

<220>

<221> SITE

<222> 7

<223> Xaa = D-Cha

<400> 5

Val Pro Lys Gly Trp Arg Xaa His Ser Ile Ile Ser Ser

1 5 10

<210> 6

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建的多肽

<220>

<221> SITE

<222> 7

<223> Xaa = L-Cha

<400> 6

Ser Tyr Ser Met Glu His Xaa Arg Trp Gly Lys Pro Val

1 5 10

<210> 7

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建的多肽

<220>

<221> SITE

<222> 1-3, 5-13

<223> D-异构体形式

<400> 7

Val Pro Lys Gly Trp Arg Phe His Glu Met Ser Tyr Ser

1 5 10

<210> 8

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建的多肽

<220>

<221> DOMAIN

<222> (1)...(13)

<223> α-促黑素细胞激素

<400> 8

Ser Tyr Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val

1 5 10

<210> 9

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建的多肽

<220>

<221> SITE

<222> 1

<223> Xaa = D-Val, D-Ala, or D-Lys

<220>

<221> SITE

<222> 2

<223> Xaa = D-Pro, D-Ala或D-Lys

<220>

<221> SITE

<222> 3

<223> Xaa = D-Lys, D-Orn, D-Nle, D-Ala或D-Lys

<220>

<221> SITE

<222> 4

<223> Xaa = Gly或D-Ala

<220>

<221> SITE

<222> 5

<223> Xaa = D-Trp, Trp, D-3-苯并噻吩基-Ala, D-5-羟基-Trp, D-5-甲氧基-Trp,D-Phe或D-Ala

<220>

<221> SITE

<222> 6

<223> Xaa = D-Arg, D-His或D-Ala

<220>

<221> SITE

<222> 7

<223> Xaa = D-Cha, D-Phe, Phe, D-4-氟-Phg, D-3-吡啶基-Ala, D-Thi (2-噻吩基-D-丙氨酸), D-Trp, D-4-硝基-Phe或D-Ala

<220>

<221> SITE

<222> 8

<223> Xaa = D-His, His, D-Arg, Phe或D-Ala

<220>

<221> SITE

<222> 9

<223> Xaa = D-Glu, D-Asp, D-瓜氨酸, D-Ser或D-Ala

<220>

<221> SITE

<222> 10

<223> Xaa = D-Met, D-丁硫氨酸, D-Ile或D-Ala

<220>

<221> SITE

<222> 11

<223> Xaa = D-Ser, D-Ile或D-Ala

<220>

<221> SITE

<222> 12

<223> Xaa = D-Tyr, D-Ser或D-Ala

<220>

<221> SITE

<222> 13

<223> Xaa = D-Ser或D-Ala

<220>

<221> SITE

<222> (1)...(13)

<223> D-Ala可仅存在于1位，除了同时存在于1-3位

<220>

<221> SITE

<222> (1)...(13)

<223> L-氨基酸可仅存在于1位

<400> 9

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10

<210> 10

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建的多肽

<220>

<221> SITE

<222> 1

<223> Xaa = D-Val, D-Ala或D-Lys

<220>

<221> SITE

<222> 2

<223> Xaa = D-Pro, D-Ala或D-Lys

<220>

<221> SITE

<222> 3

<223> Xaa = D-Lys, D-Orn, D-Nle, D-Ala或D-Lys

<220>

<221> SITE

<222> 4

<223> Xaa = Gly或D-Ala

<220>

<221> SITE

<222> 5

<223> Xaa = D-Trp, Trp, D-3-苯并噻吩基-Ala, D-5-羟基-Trp, D-5-甲氧基-Trp,D-Phe或D-Ala

<220>

<221> SITE

<222> 6

<223> Xaa = D-Arg, D-His或D-Ala

<220>

<221> SITE

<222> 7

<223> Xaa = D-Cha, D-Phe, Phe, D-4-氟-Phg, D-3-吡啶基-Ala, D-Thi (2-噻吩基-D-丙氨酸), D-Trp, D 4-硝基-Phe或D Ala

<220>

<221> SITE

<222> 8

<223> Xaa = D-His, His, D-Arg, Phe或D-Ala

<220>

<221> SITE

<222> 9

<223> Xaa = D-Glu, D-Asp, D-瓜氨酸, D-Ser或D-Ala

<220>

<221> SITE

<222> 10

<223> Xaa = D-Met, D-丁硫氨酸, D-Ile或D-Ala

<220>

<221> SITE

<222> 11

<223> Xaa = D-Ser, D-Ile或D-Ala

<220>

<221> SITE

<222> 12

<223> Xaa = D-Tyr, D-Ser或D-Ala

<220>

<221> SITE

<222> 13

<223> Xaa = D-Ser或D-Ala

<400> 10

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10

<210> 11

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建的多肽

<220>

<221> SITE

<222> 1

<223> Xaa = D-Val

<220>

<221> SITE

<222> 2

<223> Xaa = D-Pro

<220>

<221> SITE

<222> 3

<223> Xaa = D-Lys, D-Orn或D-Nle

<220>

<221> SITE

<222> 4

<223> Xaa = Gly

<220>

<221> SITE

<222> 5

<223> Xaa = D-Trp, Trp, D-3-苯并噻吩基-Ala, D-5-羟基-Trp, D-5-甲氧基-Trp或D-Phe

<220>

<221> SITE

<222> 6

<223> Xaa = D-Arg或D-His

<220>

<221> SITE

<222> 7

<223> Xaa = D-Cha, D-Phe, Phe, D-4-氟-Phg, D-3-吡啶基-Ala, D-Thi (2-噻吩基-D-丙氨酸), D-Trp或D 4-硝基-Phe

<220>

<221> SITE

<222> 8

<223> Xaa = D-His, His, D-Arg, Phe或D-Ala

<220>

<221> SITE

<222> 9

<223> Xaa = D-Glu, D-Asp, D-瓜氨酸或D-Ser

<220>

<221> SITE

<222> 10

<223> Xaa = D-Met, D-丁硫氨酸或D-Ile

<220>

<221> SITE

<222> 11

<223> Xaa = D-Ser或D-Ile

<220>

<221> SITE

<222> 12

<223> Xaa = D-Tyr或D-Ser

<220>

<221> SITE

<222> 13

<223> Xaa = D-Ser

<220>

<221> SITE

<222> (1)...(13)

<223> L-氨基酸可仅存在于1位

<400> 11

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10

<210> 12

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建的多肽

<220>

<221> SITE

<222> 1

<223> Xaa = D-Val

<220>

<221> SITE

<222> 2

<223> Xaa = D-Pro

<220>

<221> SITE

<222> 3

<223> Xaa = D-Lys, D-Orn或D-Nle

<220>

<221> SITE

<222> 4

<223> Xaa = Gly

<220>

<221> SITE

<222> 5

<223> Xaa = D-Trp或Trp

<220>

<221> SITE

<222> 6

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> SITE

<222> 7

<223> Xaa = D-Cha, D-Phe, Phe或D-Thi (2-噻吩基-D-丙氨酸)

<220>

<221> SITE

<222> 8

<223> Xaa = D-His或His

<220>

<221> SITE

<222> 9

<223> Xaa = D-Glu或D-Ser

<220>

<221> SITE

<222> 10

<223> Xaa = D-Met, D-丁硫氨酸或D-Ile

<220>

<221> SITE

<222> 11

<223> Xaa = D-Ser或D-Ile

<220>

<221> SITE

<222> 12

<223> Xaa = D-Tyr或D-Ser

<220>

<221> SITE

<222> 13

<223> Xaa = D-Ser

<220>

<221> SITE

<222> (1)...(13)

<223> L-氨基酸可仅存在于1位

<400> 12

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10

<210> 13

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建的肽接头

<400> 13

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 14

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建的肽接头

<400> 14

Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser

1 5 10

<210> 15

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建的肽接头

<400> 15

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly

1 5 10

<210> 16

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建的肽接头

<400> 16

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Ser Gly Ser Thr

1 5 10 15

Lys Gly

<210> 17

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建的肽接头

<400> 17

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly

1 5 10

<210> 18

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建的肽接头

<400> 18

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr

1 5 10 15

Lys Gly

<210> 19

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建的肽接头

<400> 19

Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Glu Phe

1 5 10

<210> 20

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建的肽接头

<400> 20

Ser Arg Ser Ser Gly

1 5

<210> 21

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建的肽接头

<400> 21

Ser Gly Ser Ser Cys

1 5

<210> 22

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建物

<220>

<221> SITE

<222> (1)...(28)

<223> 白喉毒素胰蛋白酶敏感性接头

<400> 22

Ala Met Gly Arg Ser Gly Gly Gly Cys Ala Gly Asn Arg Val Gly Ser

1 5 10 15

Ser Leu Ser Cys Gly Gly Leu Asn Leu Gln Ala Met

20 25

<210> 23

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建物

<220>

<221> DOMAIN

<222> (1)...(13)

<223> α-MSH肽

<400> 23

Ser Tyr Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val

1 5 10

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物

<400> 24

ctctgcctcg tcactttctt tcta 24

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

<400> 25

aacatgtggg catacagaat cg 22

<210> 26

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 26

ccatgctggc actca 15

<210> 27

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠TNF α正向引物

<400> 27

ggcaggtcta ctttggagtc attgc 25

<210> 28

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠TNF α反向引物

<400> 28

acattcgagg ctccagtgaa ttcgg 25

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠IL-10正向引物

<400> 29

tgctatgctg cctgctctta 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠IL-10反向引物

<400> 30

tcatttccga taaggcttgg 20

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠β-肌动蛋白正向引物

<400> 31

gtgggccgct ctaggcacca a 21

<210> 32

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠β-肌动蛋白反向引物

<400> 32

ctctttgatg tcacgcacga tttc 24

<210> 33

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建的四肽

<400> 33

His Phe Arg Trp

1

Claims (20)

1.一种基本纯的化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物能选择性结合黑皮质素1受体(MC1R)，所述化合物包含的核心四肽具有以下序列：

His Xaa₁ Arg Trp(SEQ ID NO:1)

或D-Trp D-Arg Xaa₂ D-His(SEQ ID NO:2)；

其中Xaa₁是D-Cha、D-Phe或Cha，和

Xaa₂是D-Cha、D-Phe或Phe。

2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物包含的C-末端多肽具有以下序列：D-Ser D-Ile D-Ile D-Ser D-Ser(SEQ ID NO:3)。

3.一种基本纯的化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物选择性结合黑皮质素1受体(MC1R)，所述化合物包含具有以下序列的多肽：

Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Xaa₆ Xaa₇ Xaa₈ Xaa₉ Xaa₁₀ Xaa₁₁ Xaa₁₂ Xaa₁₃，

其中Xaa₁是D-Val、D-Ala或D-Lys；

Xaa₂是D-Pro、D-Ala或D-Lys；

Xaa₃是D-Lys、D-Orn、D-Nle、D-Ala或D-Lys；

Xaa₄是Gly或D-Ala；

Xaa₅是D-Trp、Trp、D-3-苯并噻吩基-Ala、D-5-羟基-Trp、D-5-甲氧基-Trp、D-Phe或D-Ala；

Xaa₆是D-Arg、D-His或D-Ala；

Xaa₇是D-Cha、D-Phe、Phe、D-4-氟-Phg、D-3-吡啶基-Ala、D-Thi、D-Trp、D-4-硝基-Phe或D-Ala；

Xaa₈是D-His、His、D-Arg、Phe或D-Ala；

Xaa₉是D-Glu、D-Asp、D-瓜氨酸、D-Ser或D-Ala；

Xaa₁₀是D-Met、D-丁硫氨酸、D-Ile或D-Ala；

Xaa₁₁是D-Ser、D-Ile或D-Ala；

Xaa₁₂是D-Tyr、D-Ser或D-Ala；

Xaa₁₃是D-Ser或D-Ala；

其中除非当Xaa_1-3均是D-Ala时，不多于一个的Xaa_1-13是D-Ala和不多于一个的Xaa_1-13是L-氨基酸。

4.如权利要求3所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述化合物包含具有以下序列的多肽：

Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Xaa₆ Xaa₇ Xaa₈ Xaa₉ Xaa₁₀ Xaa₁₁ Xaa₁₂ Xaa₁₃，

其中Xaa₁是D-Val；

Xaa₂是D-Pro；

Xaa₃是D-Lys、D-Orn或D-Nle；

Xaa₄是Gly；

Xaa₅是D-Trp、Trp、D-3-苯并噻吩基-Ala、D-5-羟基-Trp、D-5-甲氧基-Trp或D-Phe；

Xaa₆是D-Arg或D-His；

Xaa₇是D-Cha、D-Phe、Phe、D-4-氟-Phg、D-3-吡啶基-Ala、D-Thi、D-Trp或D-4-硝基-Phe；

Xaa₈是D-His、His、D-Arg、Phe或D-Ala；

Xaa₉是D-Glu、D-Asp、D-瓜氨酸或D-Ser；

Xaa₁₀是D-Met、D-丁硫氨酸或D-Ile；

Xaa₁₁是D-Ser或D-Ile；

Xaa₁₂是D-Tyr或D-Ser；和

Xaa₁₃是D-Ser；

其中不多于一个的Xaa_1-13是L-氨基酸。

5.如权利要求3所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述化合物包含具有以下序列的多肽：

Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Xaa₆ Xaa₇ Xaa₈ Xaa₉ Xaa₁₀ Xaa₁₁ Xaa₁₂ Xaa₁₃，

其中Xaa₁是D-Val；

Xaa₂是D-Pro；

Xaa₃是D-Lys、D-Orn或D-Nle；

Xaa₄是Gly；Xaa₅是D-Trp或Trp；

Xaa₆是D-Arg；

Xaa₇是D-Cha、D-Phe、Phe或D-Thi；

Xaa₈是D-His或His；

Xaa₉是D-Glu或D-Ser；

Xaa₁₀是D-Met、D-丁硫氨酸或D-Ile；

Xaa₁₁是D-Ser或D-Ile；

Xaa₁₂是D-Tyr或D-Ser；和

Xaa₁₃是D-Ser；

其中不多于一个的Xaa_1-13是L-氨基酸。

6.一种基本纯的化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物包含具有以下序列的多肽：

D-Val D-Pro D-Lys Gly D-Trp D-Arg Phe D-His D-Ser D-Ile D-Ile D-Ser D-Ser(SEQ ID NO:4)；

D-Val D-Pro D-Lys Gly D-Trp D-Arg D-Cha D-His D-Ser D-Ile D-Ile D-Ser D-Ser(SEQ ID NO:5)；

Ser Tyr Ser Met Glu His Cha Arg Trp Gly Lys Pro Val(SEQ ID NO:6)；或

D-Val D-Pro D-Lys Gly D-Trp D-Arg D-Phe D-His D-Glu D-Met D-Ser D-Tyr D-Ser(SEQ ID NO:7)。

7.如权利要求1、3、4、5或6所述的化合物，其特征在于，所述多肽经PEG化。

8.如权利要求6所述的化合物，其特征在于，所述化合物能选择性结合MC1R。

9.如权利要求1、3、4、5或6所述的化合物，其特征在于，所述化合物显示出至少一种以下特性：

选择性激活MC1R的能力；

在体外血浆中的稳定性；或

对蛋白酶降解的耐受性。

10.一种药物组合物，其包含权利要求1、3、4、5或6所述的化合物和药学上可接受的赋形剂。

11.如权利要求1、3、4、5或6所述的化合物，其特征在于，所述化合物偶联于生物学活性部分。

12.一种治疗有需要的对象中自身免疫疾病或病症的方法，包括给予所述对象包含药学上可接受的赋形剂和治疗有效量的权利要求1、3、4、5或6所述化合物的药物组合物。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述自身免疫疾病或病症选自：多发性硬化症、I型糖尿病、再生障碍性贫血、格雷夫斯病、腹部疾病、克罗恩病、红斑狼疮、关节炎、骨关节炎、自身免疫葡萄膜炎和重症肌无力。

14.一种治疗有需要的对象中炎症的方法，包括给予所述对象包含药学上可接受的赋形剂和治疗有效量的权利要求1、3、4、5或6所述化合物的药物组合物。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述炎症与选自下组的疾病相关：炎性肠病、类风湿性关节炎、过敏、动脉粥样硬化、银屑病、胃炎和缺血性心脏病。

16.一种降低或抑制有需要对象中移植物排异的方法，包括给予所述对象包含药学上可接受的赋形剂和治疗有效量的权利要求1、3、4、5或6所述化合物的药物组合物。

17.一种治疗有需要的对象中黑色素瘤的方法，包括给予所述对象包含药学上可接受的赋形剂和治疗有效量的权利要求1、3、4、5或6所述化合物的药物组合物。

18.一种治疗有需要的对象中黑色素瘤的方法，包括给予所述对象包含药学上可接受的赋形剂和治疗有效量的偶联物的药物组合物，所述偶联物包含偶联于抗肿瘤负载物的权利要求1、3、4、5或6所述化合物。

19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述抗肿瘤负载物是放射性核素、辐射致敏剂、光敏剂、化疗剂或毒素。

20.一种试剂盒，其装有权利要求10所述的药物组合物和任选的使用说明书。