ES2715329T3 - Análogos peptídicos de hormonas estimulantes de alfa melanocitos - Google Patents

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John Lyle Dzuris
Timothy E Weeden
James E Stefano
Clark Q Pan
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Abstract

Un compuesto que se une selectivamente al receptor de melanocortina 1 (MC1R), dicho compuesto comprende un polipéptido que tiene la secuencia: Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Xaa13, en donde Xaa1 es D-Val; Xaa2 es D-Pro; Xaa3 es D-Lys, D-Orn o D-Nle; Xaa4 es Gly; Xaa5 es D-Trp, D-3-benzotienil-Ala, D-5-hidroxi-Trp, D-5-metoxi-Trp o D-Phe; Xaa6 es D-Arg; Xaa7 es D-Cha, D-Phe, D-4-fluoro-Phg, D-3-piridil-Ala, D-Thi, D-Trp o D-4-nitro-Phe; Xaa8 es D-His; Xaa9 es D-Glu, D-Asp, D-citrulina o D-Ser; Xaa10 es D-Met, D-butionina o D-Ile; Xaa11 es D-Ser o D-Ile; Xaa12 es D-Tyr o D-Ser; y Xaa13 es D-Ser; o una sal farmacéuticamente aceptable de este.

Description

DESCRIPCION
Analogos peptidicos de hormonas estimulantes de alfa melanocitos
Campo tecnico
La invencion se refiere a analogos peptfdicos segun se definen en las reivindicaciones. En particular, la invencion se refiere a analogos peptfdicos de hormona estimulante de alfa-melanocitos natural (a-MSH, por sus siglas en ingles) que tienen selectividad para el receptor de melanocortina 1 (MC1R, por sus siglas en ingles), preparaciones farmaceuticas de estos, asf como el uso de estos analogos en el tratamiento de afecciones medicas y veterinarias. Tecnica anterior
Los neuropeptidos son pequenos peptidos biologicamente activos que estan ampliamente distribuidos en todo el cuerpo y tienen funciones de neurotransmisor a factor de crecimiento. Mucha evidencia ha indicado que los neuropeptidos tienen capacidades antiinflamatorias. Entre los muchos neuropeptidos estan los peptidos melanocorticos (melanocortinas), que se unen a y estimulan los receptores de melanocortina (MC). Un ejemplo de una melanocortina incluye una hormona estimulante de a-melanocitos (a-MSH), principalmente conocida por su capacidad para regular la pigmentacion periferica, pero que tambien se conoce por tener capacidades antiinflamatorias e inmunomoduladoras. El neuropeptido de a-MSH se ha detectado en diversos organos y lo producen las neuronas, glandula pituitaria, intestino, piel y celulas inmunitarias.
Las capacidades inmunomoduladoras de a-MSH se han demostrado en modelos de hipersensibilidad de contacto donde la tolerancia espedfica para el hapteno se indujo mediante inyeccion con a-MSH y en la supresion de la inflamacion mediada por endotoxina bacteriana. Ademas, se ha mostrado que a-MSH tiene actividad terapeutica en muchos modelos de enfermedades en animales tales como enfermedad intestinal inflamatoria, artritis y trasplante de corazon experimental. Otros modelos en animales de inflamacion cerebral, lesion renal e inflamacion hepatica han demostrado efectos antiinflamatorios con este neuropeptido. a-MSH suprime la produccion de citocinas proinflamatorias tales como TNF-a, IL-6 e IL-1 e inhibe las quimiocinas lo que reduce la migracion de macrofagos y neutrofilos a los sitios inflamatorios. El oxido nftrico (NO, por sus siglas en ingles) es un mediador comun para diversas formas de inflamacion. Tambien se ha demostrado que a-MSH inhibe la smtesis de NO por macrofagos y neutrofilos estimulados por la endotoxina. Ademas de sus efectos sobre la produccion de citocina, a-MSH disminuye la expresion de MHC clase I, CD86 y CD40 en monocitos y celulas dendrfticas lo que provoca la presentacion del antfgeno y la coestimulacion. a-MSH tambien se conoce por aumentar la formacion de interleucina 10 (IL-10) en monocitos, que se cree que es un componente importante en efectos inmunosupresores.
Aunque los mecanismos moleculares de los efectos inmunomoduladores de a-MSH no se entienden completamente, un posible mecanismo de accion de a-MSH es su capacidad de inhibir la activacion de factor nuclear-KB en celulas. La inhibicion de NF-kB resulta en una supresion de la produccion de citocina proinflamatoria y de la smtesis del oxido nftrico por macrofagos. La a-MSH funciona al unirse a receptores espedficos que pertenecen a un grupo de receptores acoplados a la protema G con siete dominios transmembranarios. Estos receptores incluyen los receptores de melanocortina 1 y melanocortina 3 (MCR-1 y MCR-3) en macrofagos por medio de los cuales la union a a-MSH inhibe NF-kB. Muchos de los efectos inmunomoduladores de a-MSH tambien estan mediados por la acumulacion de cAMP. La union de a-MSH a receptores de melanocortina aumenta los niveles de cAMP que pueden suprimir la degradacion de IkB y, por lo tanto, inhibir la circulacion de NF-kB y la produccion de oxido nftrico.
Los receptores de MC1, a los que se une y estimula a-MSH se han relacionado con diversas respuestas antiinflamatorias e inmunomoduladoras. Se han identificado cinco tipos de receptores de melanocortina, MC1-MC5. Se hallo que los receptores de MC1 estan presentes en melanocitos, celulas de melanoma, macrofagos, neutrofilos, celulas de glioma, astrocitos, monocitos, celulas endoteliales, en ciertas areas del cerebro, testmulos y ovario. Persiste el interes continuo en compuestos y metodos para estimular los receptores de MC1 y para producir respuestas antiinflamatorias e inmunomoduladores eficaces.
El documento WO2005120588 A2 describe el peptido VPKGWRFHE,S-K(DOTA)S en donde los aminoácidos estan todos en forma D. Sin embargo, dicho peptido difiere en los residuos aminoaddicos del extremo C con respecto a los peptidos reivindicados en la presente solicitud.
Compendio de la invencion
La presente invencion se define mediante las reivindicaciones. Todo objeto que no este dentro del alcance de las reivindicaciones se proporciona solo como informacion.
Cualesquiera referencias en la descripcion a metodos de tratamiento se refieren a los compuestos, composiciones farmaceuticas y medicamentos de la presente invencion para su uso en un metodo de tratamiento del cuerpo humano o animal por terapia.
En la presente memoria se proporciona un compuesto sustancialmente puro que se une selectivamente al receptor de melanocortina 1 (MC1R), dicho compuesto comprende un tetrapeptido principal que tiene la secuencia His Xaai Arg Trp (SEQ ID NO:1) o D-Trp D-Arg Xaa2 D-His (SeQ ID NO:2); en donde Xaa1 es D-Cha, D-Phe o Cha, y Xaa2 es D-Cha, D-Phe o Phe; o una sal farmaceuticamente aceptable de este. En algunas realizaciones, la secuencia del extremo C es D-Ser D-Ile D-Ile D-Ser D-Ser (SEQ ID NO:3).
Ademas, en la presente memoria se proporciona un compuesto sustancialmente puro que se une selectivamente al receptor de melanocortina 1 (MC1R), dicho compuesto comprende un polipeptido que tiene la secuencia:
Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaag Xaaio Xaan Xaai2 Xaai 3 ,
en donde Xaai es D-Val, D-Ala o D-Lys;
Xaa2 es D-Pro, D-Ala o D-Lys;
Xaa3 es D-Lys, D-Orn, D-Nle, D-Ala o D-Lys;
Xaa4 es Gly o D-Ala;
Xaa5 es D-Trp, Trp, D-3-benzotienil-Ala, D-5-hidroxi-Trp, D-5-metoxi-Trp, D-Phe, o D-Ala;
Xaa6 es D-Arg, D-His o D-Ala;
Xaa7 es D-Cha, D-Phe, Phe, D-4-fluoro-Phg, D-3-piridil-Ala, D-Thi, D-Trp, D-4-nitro-Phe o D-Ala;
Xaa8 es D-His, His, D-Arg, Phe o D-Ala;
Xaag es D-Glu, D-Asp, D-citrulline, D-Ser o D-Ala;
Xaaio es D-Met, D-butionina, D-Ile o D-Ala;
Xaai i es D-Ser, D-Ile o D-Ala;
Xaai2 es D-Tyr, D-Ser o D-Ala;
Xaai3 es D-Ser o D-Ala;
en donde no mas de un Xaai - i 3 es D-Ala excepto cuando Xaai-3 son todos D-Ala,
y no mas de un Xaai - i 3 es un aminoácido L; o una sal farmaceuticamente aceptable de este.
En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona un compuesto sustancialmente puro que comprende un polipeptido que tiene la secuencia:
D-Val D-Pro D-Lys Gly D-Trp D-Arg Phe D-His D-Ser D-Ile D-Ile D-Ser D-Ser (SEQ ID NO:4);
D-Val D-Pro D-Lys Gly D-Trp D-Arg D-Cha D-His D-Ser D-Tle D-Tle D-Ser
D-Ser (SEQ ID NO:5);
Ser Tyr Ser Met Glu His Cha Arg Trp Gly Lys Pro Val (SEQ ID NO:6); o
D-Val D-Pro D-Lys Gly D-Trp D-Arg D-Phe D-His D-Glu D-Met D-Ser D-Tyr D-Ser (SEQ ID NO:7); o una sal farmaceuticamente aceptable de este.
En algunas realizaciones, los polipeptidos proporcionados en la presente memoria estan PEGilados.
En algunas realizaciones, los compuestos proporcionados en la presente memoria se pueden conjugar con un resto biologicamente activo.
En algunas realizaciones, los compuestos proporcionados en la presente memoria se unen selectivamente a MCiR. En algunas realizaciones, los compuestos exhiben al menos una de las siguientes propiedades: capacidad para activar selectivamente MCiR, estabilidad en plasma in vitro y resistencia a degradacion por proteasa.
En un aspecto, se proporciona en la presente memoria una composicion farmaceutica que comprende uno cualquiera de los compuestos sustancialmente puros proporcionados en la presente memoria y un excipiente farmaceuticamente aceptable.
En otro aspecto, se proporciona en la presente memoria un metodo para tratar una enfermedad o afeccion autoinmunitaria en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar a dicho sujeto una composicion farmaceutica que comprende un excipiente farmaceuticamente aceptable y una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto proporcionado en la presente memoria. En algunas realizaciones, la enfermedad o afeccion autoinmunitaria se selecciona del grupo que consiste en esclerosis multiple, diabetes tipo I, anemia aplasica, enfermedad de Grave, enfermedad ceftaca, enfermedad de Crohn, lupus, artritis, osteoartritis, uveftis autoinmunitaria y miastenia gravis.
En otro aspecto adicional, se proporciona en la presente memoria un metodo para tratar la inflamacion en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar a dicho sujeto una composicion farmaceutica que comprende un excipiente farmaceuticamente aceptable y una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto proporcionado en la presente memoria. En algunas realizaciones, la inflamacion se asocia con una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en enfermedad intestinal inflamatoria, artritis reumatoide, alergia, ateroesclerosis, psoriasis, gastritis y cardiopatfa isquemica.
En un aspecto se proporciona en la presente memoria un metodo para reducir o inhibir el rechazo del trasplante en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar a dicho sujeto una composicion farmaceutica que comprende un excipiente farmaceuticamente aceptable y una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto proporcionado en la presente memoria.
En otro aspecto, se proporciona en la presente memoria un metodo para tratar el melanoma en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar a dicho sujeto un producto farmaceutico que comprende un excipiente farmaceuticamente aceptable y una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto proporcionado en la presente memoria.
En otro aspecto adicional, se proporciona en la presente memoria un metodo para tratar el melanoma en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar a dicho sujeto un producto farmaceutico que comprende un excipiente farmaceuticamente aceptable y una cantidad terapeuticamente eficaz de un conjugado que comprende el compuesto proporcionado en la presente memoria que esta conjugado con una carga eficaz antitumoral. La carga eficaz antitumoral puede ser un radionuclido, un radiosensibilizador, un fotosensibilizador, un agente quimioterapeutico o una toxina.
En un aspecto adicional, se proporciona en la presente memoria un kit que comprende la composicion farmaceutica de un compuesto proporcionado en la presente memoria y opcionalmente instrucciones de uso.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 muestra la reduccion de la uveftis mediante a-MSH natural. La Figura 1A muestra datos de ratones B10.RIII tratados con a-MSH natural (100 pg/raton) IV a diario cuando las puntuaciones clmicas eran 2-3. La uveftis se redujo significativamente en comparacion con el testigo no tratado (p<0,01). La Figura 1B muestra datos de ratones B10.RIII tratados con a-MSH natural (100 pg/raton) IP o dexametasona IP (0,2 mg/kg o 2,0 mg/kg) a diario cuando las puntuaciones clmicas eran 1-2 (n=5). La inflamacion retinal se redujo despues del inicio del tratamiento (p<0,05). El asterisco denota diferencias significativas con respecto al testigo.
La Figura 2 ilustra la mejora de la uveftis en la enfermedad en etapa avanzada mediante a-MSH RI y a-MSH natural. Se indujo EAU en ratones B10.RIII y se administraron diariamente 100 pg/raton de a-MSH natural, a-MSH RI o PBS, i.v., el dfa 12 cuando los ratones alcanzaron la enfermedad en etapa avanzada (puntuaciones de 3). La Figura 2A muestra datos de ratones tratados con a-MSH natural o a-MSH retro-RI que exhibieron reduccion en las puntuaciones oculares de la enfermedad uveftis en comparacion con ratones testigo tratados con PBS. La Figura 2B muestra puntuaciones oculares maximas individuales de ratones en cada grupo el dfa 16 despues de la induccion de EAU (n=8). El asterisco denota diferencias significativas entre los grupos (p<0,05).
La Figura 3 muestra imagenes de la retina y puntuaciones oculares individuales de animales tratados con a-MSH o a-MSH RI. Se indujo EAU en ratones B10.RIII y se inicio el tratamiento diario por i.v. con 100 pg/raton de a-MSH natural, a-MSH RI o PBS el dfa 13 cuando los ratones alcanzaron la enfermedad en etapa avanzada. Se muestran las imagenes fundoscopicas de las retinas que representan las medianas de puntuaciones oculares de cada grupo despues de 13 dfas de tratamiento (n=11). El raton tratado con PBS con una puntuacion ocular de 3 exhibe lesiones inflamatorias en diversos cuadrantes del ojo y vasculitis proximal al nervio optico (Figura 3A). Los ratones tratados con a-MSH y a-MSH RI con puntuaciones oculares de 1 exhiben resolucion de la uveftis con inflamacion solo alrededor del nervio optico (Figuras 3B y 3C, respectivamente). Las retinas representan la mediana de puntuacion ocular de cada grupo. Las puntuaciones oculares individuales de ratones en cada grupo el dfa 13 despues del tratamiento se muestra en el grafico. El asterisco denota diferencias significativas entre los grupos (p<0,01).
La Figura 4 ilustra la histopatologfa de ratones tratados con a-MSH RI y a-MSH natural en EAU. Se inyectaron IRBP CFA a ratones B10.RIII hembra para inducir EAU. Los ratones se trataron diariamente por i.v. con 100 pg/raton de a-MSH retroinversa, a-MSH natural o PBS cuando los ratones alcanzaron puntuaciones oculares de 3. El grupo de ratones tratados con a-MSH RI o a-MSH mejoro la respuesta inflamatoria ocular (p<0,05). Las fotograffas muestran una tincion con hematoxilina y eosina de los ojos 10 dfas despues del inicio del tratamiento que representan las puntuaciones oculares medias de los grupos de ratones tratados con PBS (Figura 4A), a-MSH (Figura 4B) y a-MSH RI (Figura 4C). Ampliacion de 100X.
La Figura 5 muestra el efecto de la dosificacion diaria intraperitoneal de a-MSH retroinversa en la uveftis en comparacion con un testigo con peptido aleatorizado. Los ratones B10.RJIII se trataron a diario con inyecciones intraperitoneales con 100 |jg de a-MSH RI o un testigo de peptido de aminoácido D aleatorizado el dfa 11 despues de la induccion de la enfermedad. Los datos muestran las puntuaciones oculares medias clmicas de los grupos de ratones tratados con a-MSH RI (n=4) y peptido testigo aleatorizado (n=5). Los ratones se trataron un total de 13 dfas. Los datos son representativos de dos experimentos. El asterisco denota diferencias significativas entre los grupos (p<0,04).
La Figura 6 ilustra la eficacia de a-MSH RI en el tratamiento de la inflamacion retinal. Los ratones B10RIII se trataron con a-MSH RI (3, 10 o 100 jg/raton) a diario mediante inyecciones IP cuando las puntuaciones clmicas eran de 4. El testigo de peptido aleatorizado se inyecto a 100 jg/raton diariamente. El grafico representa las puntuaciones clmicas en el tiempo. Se observo inflamacion retinal reducida despues del inicio del tratamiento con 100 o 10 jg/raton. Se observaron respuestas clmicas beneficiosas limitadas en ratones tratados con una dosis mas baja de a-MSH RI (3 jg/raton) o con PBS o el peptido aleatorizado testigo (n=4). El asterisco denota diferencias significativas entre los grupos (p<0,05).
La Figura 7 muestra el efecto de a-MSH RI en la produccion de cAMP en celulas de melanoma murinas. Se midio cAMP en celulas de melanoma B16-F1 despues del tratamiento de las celulas con a-MSH natural, a-MSH retroinversa o peptido testigo aleatorizado a las concentraciones 0,01 ng/ml - 1000 ng/ml. La Figura 7A muestra que a-MSH natural y a-MSH RI aumentaron significativamente los niveles de cAMP. Los testigos usados para medir cAMP incluyen forskolina a una concentracion de 100 jM . La Figura 7B muestra los datos de barrido de alanina. Se sometieron a prueba los peptidos sustituidos con alanina de a-MSH RI a 1 jg/ml para determinar el aumento en los niveles de cAMP en la lmea celular de melanoma B16-F1 murino. Los datos son representativos de dos experimentos. La lista de secuencias se puede encontrar en la Tabla 1. El asterisco denota diferencias significativas entre los grupos (p<0,01).
La Figura 8 ilustra la evolucion de la enfermedad de EAE inducido por MOG. Se indujo EAE en ratones C57BL/6 mediante inyeccion de una emulsion de peptido MOG35-55 (200 jg/raton) y CFA. Se inyecto de toxina Pertussis el dfa 0 y el dfa 2. Se inicio el tratamiento diario por i.p. con 100 jg/raton de a-MSH, a-MSH RI o PBS el dfa 10. La Figura 8A muestra las puntuaciones de enfermedad clmica diarias. La Figura 8B muestra puntuaciones de enfermedad individuales en cada grupo el dfa 20 despues de la induccion de la enfermedad.
La Figura 9 muestra la reduccion de las puntuaciones de enfermedad EAE medias mediante a-MSH RI. Se indujo EAE en ratones C57BL/6 mediante inyecciones con una emulsion de peptido MOG35-55 (200 jg/raton) y CFA. Se inyecto de toxina Pertussis el dfa 0 y el dfa 2. Se inicio el tratamiento diario por i.p. con 100 jg/raton o 30 jg/raton de a-MSH o a-MSH RI, 2 mg/kg de dexametasona o PBS el dfa 10. Las puntuaciones de enfermedad clmica se registraron a diario.
La Figura 10 ilustra la histologfa de la medula espinal de ratones tratados con a-MSH RI. Se indujo EAE en ratones C57BL/6 mediante inyeccion de una emulsion de peptido MOG35-55 (200 jg/raton) y CFA. Se inyecto de toxina Pertussis el dfa 0 y el dfa 2. Se inicio el tratamiento diario por i.p. con 100 jg/raton de a-MSH RI el dfa 10. La medula espinal se recogio el dfa 24 despues de la induccion de la enfermedad. Se muestran dos ratones representativos de cada grupo: Tratados con PBS (Figuras 10a y 10c) y tratados con a-MSH RI (Figuras 10b y 10d). Las flechas muestran sitios de infiltracion de celula inflamatoria.
La Figura 11 muestra la cantidad de ARNm de TNFa y IL-10 en el bazo de ratones sensibilizados con peptido MOG durante la fase de enfermedad de EAE. Los ratones se sensibilizaron con 200 jg de peptido MOG el dfa 0 y se trataron con PBS, a-MSH (100 jg ) o a-MSH RI (100 jg ) a diario los dfas 10-15. Los bazos se recogieron en los dfas 1 (Figuras 11a y 11b), 4 (Figuras 11c y 11d) y 7 (Figuras 11e y 11f) despues del inicio del tratamiento y se analizaron para determinar la expresion del ARNm de TNFa y IL-10 mediante PCR cuantitativa. Los datos muestran la media de 4 ratones en cada grupo de tratamiento. Los niveles de ARN se normalizan con respecto a p-actina.
La Figura 12 ilustra la respuesta de memoria al peptido MOG 35-55. Los ratones se sensibilizaron con 200 jg de peptido MOG35-55 el dfa 0. En los dfas 2-8, los ratones recibieron inyecciones i.p. con PBS, 100 jg de a-MSH o 100 jg de a-MSH RI (n=5). El dfa 9 se recogieron celulas del bazo (Figura 12a) y ganglios linfaticos (Figura 12b) y se estimularon con 25 jg/ml de peptido MOG35-55 o peptido OVA in vitro. Las celulas se lavaron con [3H] timidina el dfa 3 en cultivo. Los datos muestran la media ± DT. Se recogio el sobrenadante de los cultivos de celulas del bazo estimuladas con peptido MOG despues de 24 h y se analizaron los niveles de citocina de TNF-a y IFNy (Figura 12c) y MCP-1 (Figura 12d) mediante citometna de flujo. Los datos muestran la media ± DT. Los ratones no expuestos no se sensibilizaron con el peptido MOG.
La Figura 13 ilustra los perfiles de citocina en suero y bazo despues del tratamiento con a-MSH RI en ratones sensibilizados con MOG. Los ratones se sensibilizaron con 200 |jg de peptido MOG35-55 el d^ a 0. En los dfas 2-8, los ratones recibieron inyecciones i.p. con PBS, 100 jg de a-MSH o 100 jg de a-MSH RI (n=5). El dfa 9 se recogieron el bazo y suero. Las Figuras 13a y 13b muestran los niveles de ARNm de TNF-a y IL-10 en el bazo, respectivamente, cuantificados mediante PCR en tiempo real. Los datos muestran la media de 4 ratones en cada grupo de tratamiento. Los niveles de ARN se normalizan con respecto a p-actina. El suero tambien se analizo para determinar los niveles de citocina mediante citometna de flujo. La Figura 13c muestra los niveles en suero de TNF-a, MCP-1, IL-6 y la Figura 13d muestra los niveles en suero de IL-10 y IL-12. Los ratones no expuestos no se sensibilizaron con el peptido MOG. Los datos muestran la media ± DT.
La Figura 14 muestra el efecto de a-MSH y a-MSH RI en marcadores de macrofagos. Los ratones se sensibilizaron con peptido MOG in vivo y se trataron a diario con a-MSH o a-MSH RI (100 jg/raton) los dfas 1-7. Los macrofagos esplenicos se analizaron mediante citometna de flujo para determinar los niveles de expresion de CD14, CD40 y c D86. Las celulas se agruparon en la poblacion de macrofagos CD11b+ (Figura 14a) o F4/80+ (Figura 14b). Los datos muestran el porcentaje medio positivo de la poblacion de macrofagos agrupados (n=5).
La Figura 15 ilustra un aumento de los niveles de ARNm de mMC1R inducido por LPS en los macrofagos peritoneales (Figura 15a) y bazo (Figura 15b). Los ratones C57BL/6 (n=4) recibieron inyecciones i.p. con LPS (1 jg/raton). Los macrofagos peritoneales y bazo se cosecharon a 0,5 h, 1 h y 24 h. Los niveles de ARNm de mMC1R se cuantificaron mediante PCR en tiempo real. Los niveles de ARN se normalizaron hasta 18s.
La Figura 16 muestra el efecto de MSH es un modelo de inflamacion por LPS in vivo. Los ratones C57BL/6 recibieron inyecciones con 1 jg de LPS, i.p. Despues de 30 min, los ratones se trataron con dexametasona (2 mg/kg) y a-MSH (Figuras 16a-16c) o analogo de a-MSH RI 891 (Figuras 16d-16f), i.p. El suero se recogio 2 horas despues de la exposicion a LPS. Los niveles de TNF-a (Figuras 16a y 16d), MCP-1 (Figuras 16b y 16e) y IL-10 (Figuras 16c y 16f) se analizaron mediante ensayo con perla citometrica mediante citometna de flujo. Los datos muestran mediciones de citocina individuales y la media de cada grupo (n=6).
La Figura 17 ilustra la estabilidad de a-MSH RI y a-MSH en plasma y suero. La Figura 17A muestra la estabilidad del peptido de a-MSH RI y a-MSH en plasma y PBS a 37 °C. La Figura 17B muestra la semivida en suero del peptido de a-MSH RI y a-MSH despues de una unica inyeccion intravenosa.
La Figura 18 muestra los resultados de estudios de union de MSH (Figura 18A) y MSH RI (Figura 18B) a receptores de melanocortina 1, 3, 4 y 5.
La Figura 19 muestra la inversion del tetrapeptido principal HfRW y MSH retroinversa.
La Figura 20 ilustra la sustitucion de residuos aminoaddicos no naturales en posiciones variables de MSH RI.
La Figura 21 ilustra un ensayo de union competitiva representativo de MSH RI y variaciones de esta en MC1R.
La Figura 22 ilustra el efecto de analogos de a-MSH RI en los niveles de cAMP en celulas de melanoma murinas B16 F1. En la Figura 22A: Analogos 890, 891 y 892; en la Figura 22B: Analogos 893, 894 y 895; en la Figura 22C: Analogos 880, 886 y 878; y en la Figura 22D: Analogos 872, 878 y 869.
Descripcion detallada de la invencion
Definiciones
Las protemas y ácidos nucleicos de a-MSH y MC1R de los presentes metodos no estan limitados a una fuente o especie espedfica. Por lo tanto, las protemas y ácidos nucleicos pueden estar aisladas o ser recombinantes.
La hormona estimulante de a-melanocitos (a -MSH) es un polipeptido que comprende la secuencia Ser Tyr Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val (SEQ ID NO:8) (SYSMEHFRWGKPV). La a-MSH se ha examinado recientemente para determinar sus capacidades antiinflamatorias e inmunomoduladoras. La a-MSH se origina a partir de la escision proteolftica intracelular de la hormona proopiomelanocortina (POMC). El neuropeptido de a-MSH se ha detectado en diversos organos y lo producen las neuronas, glandula pituitaria, intestino, piel y celulas inmunitarias. Se ha divulgado que la a-MSH suprime la funcion de los linfocitos T efectores, induce los linfocitos T reguladores y tiene efectos beneficiosos en modelos autoinmunitarios y de trasplante.
“Conjugar” o “conjugado” incluye dos o mas miembros que se enlazan, unen, acoplan, forman complejo o de cualquier otra manera se asocian entre sf. Los miembros se pueden unir entre sf a traves de enlaces covalentes, enlaces ionicos, electrostatica, uniones de hidrogeno, interacciones de van der Waals o medios ffsicos.
Restos “biologicamente activos” incluye una molecula o compuesto que desencadena o modula una respuesta fisiologica. En un aspecto, un compuesto biologicamente activo estimula los receptores de melanocortina, preferiblemente, los receptores de MC1.
Por “modular” y “modulacion” se entiende que se aumenta o disminuye la actividad de una o mas protemas o subunidades proteicas, de manera que la expresion, nivel o actividad es mayor o menor que la observada en la ausencia del modulador. Por ejemplo, el termino “modular” puede significar “inhibir” o “estimular”.
“Secuencia del extremo C” incluye la referencia al extremo de la cadena de aminoácidos que termina tipicamente, pero no necesariamente, con un grupo carboxilo. La convencion para escribir las secuencias de peptidos es poner el extremo C a la derecha y escribir la secuencia del extremo N al C. La secuencia del extremo C puede comprender 1 a 100 aminoácidos, preferiblemente, 2 a 15 aminoácidos e, incluso mas preferiblemente, 3 a 10 aminoácidos. La secuencia del extremo C puede terminar con un grupo carboxilo o el extremo puede modificarse mediante metodos conocidos en la tecnica para que comprenda un miembro funcional (p. ej., un grupo de direccionamiento, una senal de retencion, lfpido o anclaje).
La presente invencion proporciona un “compuesto sustancialmente puro”. El termino “compuesto sustancialmente puro” se usa en la presente memoria para describir una molecula, tal como un polipeptido (p. ej., un polipeptido que se une a MC1R o un fragmento de este) que esta sustancialmente libre de otras protemas, lfpidos, carbohidratos, ácidos nucleicos y otros materiales biologicos con los que esta naturalmente asociado. Por ejemplo, una molecula sustancialmente pura, tal como un polipeptido, puede ser al menos el 60 %, en peso seco, de la molecula de interes. La pureza de los polipeptidos se puede determinar mediante el uso de metodos estandares que incluyen, p. ej., electroforesis en gel de poliacrilamida (p. ej., SDS-PAGE), cromatograffa en columna (p. ej., cromatograffa lfquida de alto rendimiento (HPLC, por sus siglas en ingles)) y analisis de secuencia aminoaddica del extremo ammico.
En una realización, la frase “se une selectivamente” significa que un compuesto o polipeptido producido o usado en la presente invencion se une preferiblemente a un tipo de receptor con respecto a otro tipo de receptor cuando esta en presencia de una mezcla de dos o mas receptores (p. ej., receptores de melanocortina, los receptores MC1, MC2, MC3, MC4, MC5).
“Aminoácido” o “secuencia aminoaddica” incluye un oligopeptido, peptido, polipeptido o secuencia proteica, o un fragmento, porcion o subunidad de cualquiera de estos, y a moleculas de origen natural o sinteticas. Los terminos “polipeptido” y “protema” incluyen aminoácidos unidos entre sf mediante enlaces pepffdicos o enlaces pepffdicos modificados, es dear, isoesteres pepffdicos, y pueden contener aminoácidos modificados distintos de los 20 aminoácidos codificados por el gen. El termino “polipeptido” tambien incluye peptidos y fragmentos de polipeptidos, motivos y similares. Las abreviaturas de una sola letra en mayusculas de los aminoácidos se refieren al isomero L natural. Las abreviaturas de una sola letra en minusculas de los aminoácidos indican el isomero D.
Los terminos “polipeptido”, “peptido” y “protema” se usan de manera intercambiable para hacer referencia a polfmeros de aminoácidos de cualquier longitud. Los peptidos y polipeptidos pueden estar completamente compuestos por analogos de aminoácidos sinteticos, no naturales, o ser una molecula quimerica de aminoácidos pepffdicos parcialmente naturales o analogos de aminoácidos parcialmente no naturales. En un aspecto, se usa un polipeptido en una composicion, sistema celular o proceso de la invencion (p. ej., una celula hospedante que tiene un plasmido que expresa al menos una enzima de la invencion). Ademas, el polipeptido puede hacer referencia a compuestos que estan comprendidos por polfmeros de aminoácidos enlazados covalentemente a otro grupo funcional (p. ej., grupo solubilizante, un grupo de direccionamiento, PEG, grupo no aminoaddico u otro agente terapeutico).
Los aminoácidos se pueden abreviar usando la siguiente designacion entre parentesis: Prolina (Pro), Valina (Val), Lisina (Lys), Ornitina (Orn), Norleucina (Nle), Glicina (Gly), Triptofano (Trp), Alanina (Ala), Fenilalanina (Phe), Arginina (Arg), Histidina (His), Acido glutamico (Glu), Acido aspartico (Asp), Serina (Ser), Metionina (Met), Isoleucina (Ile), Tirosina (Tyr), Ciclohexilalanina (Cha), 4-fluoro-D-fenilglicina (4-fluoro-D-Phg), 2-tienil-D-alanina (D-Thi).
“Tratamiento”, “tratando”, “tratar” o “terapia”, segun se usan en la presente memoria, hacen referencia a administrar a un mairnfero agentes que son capaces de desencadenar un efecto profilactico, curativo u otro beneficioso en el individuo. El tratamiento puede resultar, adicionalmente, en la atenuacion o mejora de una enfermedad o smtomas de una enfermedad en un sujeto.
Segun se usan en la presente memoria, las formas singulares “un”, “una” y “el/la” incluyen tambien las referencias plurales, a menos que se indique lo contrario. Por ejemplo, “una” celula diana incluye una o mas celulas diana.
Las composiciones polipepffdicas de la invencion pueden contener cualquier combinacion de componentes estructurales no naturales. Los residuos pepffdicos individuales se pueden unir mediante enlaces pepffdicos, otros enlaces qdmicos o medios de acoplamiento, tales como, p. ej., glutaraldehfdo, esteres de N-hidroxisuccinimida, maleimidas bifuncionales, N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC) o N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC). Los grupos enlazadores que pueden ser una alternativa a las ligaduras de enlace amida tradicionales (“enlace pepffdico”) incluyen, p. ej., cetometileno (p. ej., -C(=O)-CH2- por -C(=O)-NH-), aminometileno (CH2-NH), etileno, olefina (CH=CH), eter (CH2-O), tioeter (CH2-S), tetrazol, tiazol, retroamida, tioamida o ester (vease, p. ej., Spatola (1983) en Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, tomo 7, pags. 267-357, “Peptide Backbone Modifications”, Marcel Dekker, NY, incorporado en la presente memoria por referencia).
Los polipeptidos usados para poner en practica el metodo de la invencion se pueden modificar mediante procesos naturales, tales como procesamiento postraduccion (p. ej., fosforilacion, acilacion, etc.), o mediante tecnicas de modificacion qmmica, y los polipeptidos modificados resultantes. Las modificaciones se pueden producir en cualquier parte del polipeptido, incluida la estructura peptfdica, las cadenas laterales aminoaddicas y los extremos ammico o carbox^lico. Se apreciara que el mismo tipo de modificacion puede estar presente en el mismo o en grados variables en diversos sitios en un polipeptido dado. Ademas, un polipeptido dado puede tener muchos tipos de modificaciones. Las modificaciones incluyen acetilacion, acilacion, ADP-ribosilacion, amidacion, acoplamiento covalente de flavina, acoplamiento covalente de un resto heme, acoplamiento covalente de un nucleotido o derivado nucleotidico, acoplamiento covalente de un lfpido o derivado lipfdico, acoplamiento covalente de un fosfatidilinositol, ciclizacion reticulante, formacion de enlace disulfuro, desmetilacion, formacion de reticulaciones covalentes, formacion de cistema, formacion de piroglutamato, formilacion, gamma-carboxilacion, glucosilacion, formacion de anclaje de GPI, hidroxilacion, yodacion, metilacion, miristoilacion, oxidacion, PEGilacion, procesamiento proteolftico, fosforilacion, prenilacion, selenoilacion, sulfacion y adicion de aminoácidos mediada por ARN de transferencia a la protema tal como arginilacion. Vease, p. ej., Creighton, T.E., Proteins - Structure and Molecular Properties 2a Ed., W.H. Freeman and Company, Nueva York (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, Nueva York, pags. 1-12 (1983), incorporados en la presente memoria por referencia.
Realizaciones adicionales de compuestos
En algunas realizaciones, la invencion que se proporciona en la presente memoria es un compuesto sustancialmente puro que se une selectivamente al receptor de melanocortina 1 (MC1R), dicho compuesto comprende un polipeptido que tiene la secuencia:
Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaas Xaag Xaa-io Xaan Xaa-i2 Xaa-i3,
en donde Xaa1 es D-Val, D-Ala o D-Lys;
Xaa2 es D-Pro, D-Ala o D-Lys;
Xaa3 es D-Lys, D-Orn, D-Nle, D-Ala o D-Lys;
Xaa4 es Gly o D-Ala;
Xaa5 es D-Trp, Trp, D-3-benzotienil-Ala, D-5-hidroxi-Trp, D-5-metoxi-Trp, D-Phe, o D-Ala;
Xaa6 es D-Arg, D-His o D-Ala;
Xaa7 es D-Cha, D-Phe, Phe, D-4-fluoro-Phg, D-3-piridil-Ala, D-Thi, D-Trp, D-4-nitro-Phe o D-Ala;
Xaas es D-His, His, D-Arg, Phe o D-Ala;
Xaag es D-Glu, D-Asp, D-citrulline, D-Ser o D-Ala;
Xaa-io es D-Met, D-butionina, D-Ile o D-Ala;
Xaan es D-Ser, D-Ile o D-Ala;
Xaa-12 es D-Tyr, D-Ser o D-Ala;
Xaa-13 es D-Ser o D-Ala;
o una sal farmaceuticamente aceptable de este.
En algunas realizaciones, los analogos peptfdicos proporcionados en la presente memoria se unen selectivamente a MC1R y comprenden un polipeptido que tiene la secuencia: Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaas Xaag Xaa1o Xaan Xaa-12 Xaa-i3, en donde Xaa1 es D-Val; Xaa2 es D-Pro; Xaa3 es D-Lys, D-Orn o D-Nle; Xaa4 es Gly; Xaa5 es D-Trp, Trp, D-3-benzotienil-Ala, D-5-hidroxi-Trp, D-5-metoxi-Trp o D-Phe; Xaa6 es D-Arg o D-His; Xaa7 es D-Cha, D-Phe, Phe, D-4-fluoro-Phg, D-3-pyridyl-Ala, D-Thi, D-Trp o D-4-nitro-Phe; Xaas es D-His, His, D-Arg, Phe o D-Ala; Xaag es D-Glu, D-Asp, D-citrulina o D-Ser; Xaa-i0 es D-Met, D-butionina o D-Ile; Xaan es D-Ser o D-Ile; Xaa-i2 es D-Tyr o D-Ser; Xaa-i3 es D-Ser; en donde no mas de un Xaa-M 3 es un aminoácido L, o una sal farmaceuticamente aceptable de este.
En otras realizaciones, los analogos peptfdicos proporcionados en la presente memoria comprenden un polipeptido que tiene la secuencia: Xaa-i Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaas Xaag Xaa-i0 Xaan Xaa-i2 Xaa13, en donde Xaa-i es D-Val; Xaa2 es D-Pro; Xaa3 es D-Lys, D-Orn o D-Nle; Xaa4 es Gly; Xaa5 es D-Trp o Trp; Xaa6 es D-Arg; Xaa7 es D-Cha, D-Phe, Phe o D-Thi; Xaas es D-His o His; Xaag es D-Glu o D-Ser; Xaa-i0 es D-Met, D-butionina o D-Ile; Xaan es D-Ser o D-Ile; Xaa-i2 es D-Tyr o D-Ser; Xaa-i3 es D-Ser; en donde no mas de un Xaa-M 3 es un aminoácido L, o una sal farmaceuticamente aceptable de este.
s
Los compuestos proporcionados en la presente memoria comprenden analogos peptfdicos de la hormona estimulante de a-melanocortina (a -MSH).
En una realizacion alternativa, los analogos peptfdicos consisten en aminoácidos D. En otras realizaciones, los peptidos comprenden aminoácidos D, aminoácidos L o una mezcla de aminoácidos D y L. En otras realizaciones, los peptidos estan comprendidos por al menos 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 % de aminoácidos D. Los compuestos de la invencion tambien pueden incorporar los siguientes ejemplos no limitantes de aminoácidos no estandares: D-ornitina, D-norleucina, 3-benzotienil-D-alanina, 5-hidroxi-D-Trp, 5-metoxi-D-Trp, 4-fluoro-D-fenilglicina (4-fluoro-D-Phg), 3-piridil-D-alanina, 2-tienil-D-alanina (D-Thi), D-ciclohexilalanina (D-Cha), 4-nitro-D-Phe, D-citrulina, a-metil-D-Met y D-butionina.
En algunas realizaciones, el tetrapeptido principal esta comprendido por la secuencia aminoaddica His Phe Arg Trp o Trp Arg Phe His, preferiblemente, en la configuracion de aminoácido D. En otra realización, el tetrapeptido principal esta comprendido por la secuencia aminoaddica His D-Cha Arg Trp o Trp Arg D-Cha His, preferiblemente, en la configuracion de aminoácido D. En algunas realizaciones, el tetrapeptido principal esta comprendido por 4 aminoácidos D. En otras realizaciones, el tetrapeptido principal tiene al menos un aminoácido no estandar.
Los compuestos proporcionados en la presente memoria se pueden ser sinteticos o recombinantes. Los compuestos de la invencion se pueden producir mediante tecnicas qmmicas convencionales conocidas en la tecnica. Los metodos de smtesis en fase solida se explican en la literatura publicada, tal como, Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (E. Atherton, et al. 1989). Los compuestos de la invencion tambien se pueden producir mediante tecnicas de biologfa molecular convencionales conocidas en la tecnica. Dentro de la presente solicitud, a menos que se indique lo contrario, las definiciones de los terminos y la ilustracion de las tecnicas de la presente solicitud se pueden encontrar en cualquiera de varias referencias conocidas tales como: Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Goeddel, D., ed., Gene Expression Technology, Methods in Enzymology, 185, Academic Press, San Diego, CA (1991); “Guide to Protein Purification” en Deutshcer, M.P., ed., Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1989); Innis, et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, CA (1990); Freshney, R.I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2a Ed., Alan Liss, Inc. Nueva York, NY (1987); Murray, E.J., ed., Gene Transfer and Expression Protocols, pags. 109-128, The Humana Press Inc., Clifton, NJ y Lewin, B., Genes VI, Oxford University Press, Nueva York (1997). Todas las referencias citadas se incorporan en su totalidad en la presente memoria por referencia. En algunas realizaciones, los analogos peptfdicos proporcionados en la presente memoria se unen selectivamente o activan el receptor de melanocortina 1 (MC1R). Se puede emplear cualquier ensayo adecuado para medir la union o activacion de MC1R. Por ejemplo, la induccion de cAMP in vitro se puede usar para evaluar la activacion de MC1R. La evaluacion in vitro puede indicar la activacion in vivo. Realizaciones adicionales de la presente invencion comprenden cualquier polipeptido selectivo para los receptores de MC1. La identificacion de un compuesto selectivo para el receptor de MC1 se puede determinar mediante un ensayo de barrido adecuado. Un ejemplo no limitante de ensayo de union al receptor de MC1 se describe en el Ejemplo 4. En algunas realizaciones, los receptores de MC1 preferibles comprenden un receptor de melanocortina 1 de homo sapiens (n.° de acceso a GenBank: Np_002377). Realizaciones adicionales de la invencion se dirigen a compuestos que modulan los niveles de cAMP, oxido mtrico (NO), TNF-a, ARNm de TNF-a, ARNm de IL-10, IL-10, IFNy, IL-6, IL-12 y/o MCP-1. En algunas realizaciones, los compuestos aumentan los niveles de cAMP. En otras realizaciones, los compuestos se dirigen a la disminucion o inhibicion de los niveles de oxido nftrico (NO), TNF-a, ARNm de TNF-a, ARNm de IL-10, IL-10, IFNy, IL-6, IL-12 y/o MCP-1. La identidad de los compuestos que modulan los niveles mencionados anteriormente se puede determinar a traves de ensayos de barrido. Se pueden usar ensayos aceptables conocidos en la tecnica para medir los niveles mencionados anteriormente. Los ejemplos no limitantes de ensayos para identificar compuestos que exhiben la modulacion deseable de estos niveles se describen en los ejemplos.
En algunas realizaciones, los compuestos de la presente invencion pueden modular la respuesta inmunitaria y la inflamacion mediante un mecanismo de accion alternativo y no se limita a los mecanismos descritos en la presente memoria.
En algunas realizaciones, los peptidos proporcionados en la presente memoria tienen estabilidad en plasma y resistencia a la degradacion por proteasa mejoradas. La estabilidad en plasma y la resistencia a la degradacion por proteasa pueden evaluarse mediante cualquier metodo adecuado. Un ejemplo no limitante se ha descrito en el Ejemplo 19. La evaluacion in vitro puede indicar el desempeno, la resistencia mejorada y una semivida in vivo mas prolongada.
Los metodos proporcionados en la presente memoria se pueden poner en practica in vivo, ex vivo o in vitro.
Peptidos PEGilados
En algunas realizaciones, los peptidos se modifican para mejorar la semivida del peptido. En algunas realizaciones, el peptido esta PEGilado. En algunas realizaciones, peptidos PEGilados se refiere a peptidos enlazados covalentemente o conjugados a una o mas cadenas polimericas de polietilenglicol (PEG). Las cadenas polimericas de PEG pueden incluir cadenas de PEG modificadas, funcionalizadas o de otra manera derivadas. En otra realización, la cadena polimerica de PEG puede tener al menos uno o mas puntos de ramificacion. En algunas realizaciones preferidas, las cadenas polimericas de PEG y el peptido PEGilado correspondiente son solubles en agua, muy moviles en disolucion, carecen de toxicidad e inmunogenicidad, se depuran facilmente del cuerpo y pueden tener una disolucion alterada en el cuerpo. En algunas realizaciones preferidas, la naturaleza farmacocinetica del peptido PEGilado se modula por el tipo de cadena de PEG. Las estrategias y metodos para la preparacion de los peptidos PEGilados se llevan a cabo mediante metodos conocidos en la tecnica (G. Pasuta and F.M.Veronese (2007) “Polymer-drug conjugation, recent achievements and general strategies” Progress in Polymer Science 32(8-9): 933-961, incorporado en la presente memoria por referencia). Se pueden encontrar procesos de PEGilacion de protemas de primera y segunda generacion en la tecnica.
Un ejemplo no limitante de PEGilacion comprende la primera etapa de funcionalizacion adecuada del polfmero PEG en uno o ambos extremos (para PEG lineales). Los PEG que se activan en cada extremo con el mismo resto reactivo se conocen como “homobifuncionales”, mientras que, si los grupos funcionales presentes son diferentes, el derivado de PEG se denomina “heterobifuncional” o “heterofuncional”. Los derivados qmmicamente activos o activados del polfmero PEG se preparan para enlazar el PEG a la molecula deseada. La eleccion del grupo funcional adecuado para el derivado de PEG se basa en el tipo de grupo reactivo disponible en la molecula que se acoplara al PEG. Los ejemplos no limitantes de aminoácidos reactivos incluyen lisina, cistema, histidina, arginina, ácido aspartico, ácido glutamico, serina, treonina y tirosina. Tambien se pueden usar el grupo amino del extremo N y el ácido carboxflico del extremo C.
Otros PEG heterobifuncionales para la conjugacion: Estos PEG heterobifuncionales son muy utiles para ligar dos entidades, donde se necesita un separador hidrofilo, flexible y biocompatible. Los grupos terminales preferidos para PEG heterobifuncionales son maleimida, sulfonas vimlicas, disulfuro de piridilo, amina, ácidos carboxflicos y esteres de N-hidroxisuccinimida (NHS)
En algunas realizaciones de la invencion, el peptido PEGilado puede tener un intervalo de peso molecular entre 0,2 kDa-100 kDa. En algunas realizaciones preferidas de la invencion, el peptido PEGilado puede tener un intervalo de peso molecular entre 0,2 kDa-40 kDa. En algunas realizaciones preferidas de la invencion, el peptido PEGilado puede tener un intervalo de peso molecular entre 0,2 kDa-15 kDa. En otras realizaciones, el peso molecular promedio preferido (en Da; segun se determina mediante cromatograffa de exclusion por tamano) para PEG disponibles comercialmente, se puede seleccionar de <1k, 2k, 3,5k, 5k, 10k, 20k, 30k, 40k y mayor, pero puede ser cualquier MW dependiendo de la farmacocinetica deseada. Por ejemplo, los PEG heterobifuncionales de peso molecular mas bajo que se pueden usar como enlazadores y los PEG de peso molecular mas bajo se pueden usar para mejorar la solubilidad del peptido. El PEG tambien puede tener multiples brazos, ser horquillado o ramificado.
En algunas realizaciones, el peptido se conjuga con moleculas de direccionamiento o funciona como una molecula de direccionamiento, en donde la molecula de direccionamiento preferiblemente se asocia con un receptor deseado. En algunas realizaciones preferidas de la invencion el peptido se conjuga con un agente citotoxico. El termino “agente citotoxico” se refiere a una sustancia que inhibe o previene la actividad de expresion de celulas, la funcion de celulas y/o provoca la destruccion de celulas. Se pretende que el termino incluya agentes quimioterapeuticos de isotopos radioactivos y toxinas tales como toxinas de molecula pequena o toxinas enzimaticamente activas de origen bacteriano, fungico, vegetal o animal, incluidos fragmentos y/o variantes de estas. Los ejemplos no limitantes del agente citotoxico incluyen maitansina, dolastatina y sus analogos que incluyen tasidotina y auristatina. En otras realizaciones de la invencion, los ejemplos no limitantes de agentes citotoxicos incluyen, pero no se limitan a, maitansinoides, itrio, bismuto, ricino, cadena A de ricino, saporina, doxorrubicina, daunorrubicina, taxol, bromuro de etidio, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colquicina, dihidroxi antracin diona, actinomicina, subunidad A de toxina difterica, exotoxina de Pseudomonas truncada (PE) A, PE40, abrina, cadena A de abrina, cadena A de modecina, alfa-sarcina, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, curicina, crotina, caliquiamicina, inhibidor de sapaonaria officinalis y glucocorticoide y otros agentes quimioterapeuticos, asf como radioisotopos tales como At211, I131, I125, Y90, R e , Re188, Sm153, Bi212, P32 e isotopos radioactivos de Lu. Los anticuerpos tambien se pueden conjugar con una enzima activante profarmaco anticancerosa capaz de convertir el profarmaco en su forma activa.
El peptido puede enlazarse directa o indirectamente con el agente citotoxico o de direccionamiento mediante cualquier metodo conocido actualmente en la tecnica. En algunas realizaciones preferidas de la invencion, el peptido se ancla al agente citotoxico o agente de direccionamiento mediante uno o mas enlazadores para formar un conjugado, siempre que la inclusion del enlazador no impida sustancialmente la funcion, union, toxicidad o inclusion del peptido o agente conjugado.
Los ejemplos no limitantes de enlazadores incluyen enlaces ionicos y covalentes y cualquier otra asociacion suficientemente estable, por la cual el agente diana sera internalizado por una celula a la cual esta dirigido el conjugado. El resto enlazador se selecciona dependiendo de las propiedades deseadas. Las consideraciones para la seleccion del enlazador pueden incluir el alivio o disminucion del impedimento esterico causado por la proximidad de los elementos conjugados, la alteracion de otras propiedades del conjugado, tales como la especificidad, toxicidad, solubilidad, estabilidad en suero y/o disponibilidad intracelular del conjugado y/o el aumento de la flexibilidad de la ligadura. El enlazador puede ser cualquier tipo de ligadura y se describen ejemplos en las patentes estadounidenses nums. 7.166.702 y 5.194.425, las cuales se incorporan ambas en su totalidad en la presente memoria por referencia.
Los enlazadores y ligaduras que son adecuados para conjugados enlazados qmmicamente incluyen, pero no se limitan a, enlaces disulfuro, enlaces tioeter, enlaces disulfuro impedidos y enlaces covalentes entre grupos reactivos libres, tales como grupos amina y tiol. Estos enlaces se producen usando reactivos heterobifuncionales para producir grupos tiol reactivos en uno o ambos de los polipeptidos y despues hacer reaccionar los grupos tiol en un polipeptido con grupos tiol o grupos amina reactivos a los cuales grupos maleimido o grupos tiol reactivos se pueden acoplar en el otro. Otros enlazadores incluyen enlazadores escindibles por ácido, tales como bismaleimidoetoxi propano, conjugados de transferrina sensibles a ácido y dihidrazida de ácido adfpico, que se escindinan en compartimentos intracelulares mas ácidos; reticuladores que se escinden tras la exposicion a luz UV o visible y enlazadores, tales como los diversos dominios, tales como CH1, CH2 y CH3 de la region constante de la IgGl humana (vease Batra et al. (1993) Mol. Immunol. 30:379-386, incorporado en la presente memoria por referencia). Los enlazadores qmmicos y enlazadores peptfdicos se pueden insertar al acoplar covalentemente el enlazador al peptido y el agente de direccionamiento o citotoxico. Los agentes heterobifuncionales, descritos mas adelante, se pueden usar para producir dicho acoplamiento covalente.
Reactivos de reticulacion heterobifuncionales
Los expertos en la tecnica conocen numerosos reactivos de reticulacion que se usan para formar enlaces covalentes entre grupos amino y grupos tiol y para introducir grupos tiol en protemas (vease, p. ej., the PIERCE CATALOG, Immuno Technology Catalog & Handbook, 1992-1993, que describe la preparacion y el uso de dichos reactivos y proporciona una fuente comercial para dichos reactivos; veanse tambien Cumber et al. (1992) Bioconjugate Chem.
3':397-401; Thorpe et al. (1987) Cancer Res. 47:5924-5931; Gordon et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:308­ 312; Walden et al. (1986) J. Mol. Cell Immunol. 2:191-197; Carlsson et al. (1978) Biochem. J. 173: 723-737; Mahan et al. (1987) Anal. Biochem. 162:163-170; Wawryznaczak et al. (1992) Br. J. Cancer 66:361-366; Fattom et al. (1992) Infection & Immun. 60:584-589). Todas las referencias citadas se incorporan en su totalidad en la presente memoria por referencia. Estos reactivos se pueden usar para formar enlaces covalentes entre el agente de direccionamiento, la quimiocina y el agente diana. Estos reactivos incluyen, pero no se limitan a: N-succinimidil-3-(2-piridiiditio)propionato (SPDP; enlazador disulfuro); sulfosuccinimidil 6-[3-(2-piridilditio)propionamido]hexanoato (sulfo-LC-SPDP); succinimidiloxicarbonil-a-metil bencil tiosulfato (SMBT, enlazador disulfato impedido); succinimidil 6-[3-(2-piridiiditio)propionamido]hexanoato (LC-SPDP); sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC); succinimidil 3-(2-piridilditio)butirato (SPDB; enlazador de enlace disulfuro impedido); sulfosuccinimidil 2-(7-azido-4-metilcoumarin-3-acetamida) etil-1,3-ditiopropionato (SAED); sulfosuccinimidil 7-azido-4-metilcoumarin-3-acetato (SAMCA); sulfosuccinimidil 6-[alfa-metil-alfa-(2-piridiiditio)toluamido]hexanoato (sulfo-LC-SMPT); 1,4-di-[3'-(2'-piridiiditio)propionamido]butano (DPDPB); 4-succinimidiloxicarbonil-a-metil-a-(2-piridiltio)tolueno (SMPT, enlazador disulfato impedido); sulfosuccinimidil6[a-metil-a-(2-piridilditio)toluamido]hexanoato (sulfo-LC-SMPT); ester de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS); ester de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-MBS); N-succinimidil(4-yodoacetil)aminobenzoato (SIAB; enlazador tioeter); sulfosuccinimidil(4-yodoacetil)amino benzoato (sulfo-SIAB); succinimidil-4-(p-maleimidofenil)butirato (SMPB); sulfosuccinimidil-4-(pmaleimidofenil)butirato (sulfo-SMPB); hidrazida de azidobenzoilo (ABH).
Otros reticuladores escindibles heterobifuncionales incluyen, N-succinimidil (4-yodoacetil)-aminobenzoato; sulfosuccinimidil (4-yodoacetil)-aminobenzoato; 4-succinimidil-oxicarbonil-a-(2-piridilditio)-tolueno; sulfosuccinimidil-6-[a-metil-a-(piridilditiol)-toluamido]hexanoato; N-succinimidil-3-(-2-piridiiditio)-proprionato; succinimidil 6[3(-(-2-piridilditio)-proprionamido]hexanoato; sulfosuccinimidil 6[3(-(-2-piridilditio)-propionamido]hexanoato; hidrazida de 3-(2-piridiiditio)-propionilo, reactivo de Ellman, ácido diclorotriazmico, S-(2-tiopiridil)-L-cistema. Se describen compuestos enlazadores bifuncionales de ejemplo adicionales en las patentes estadounidenses nums. 5.349.066, 5.618.528, 4.569.789, 4.952.394 y 5.137.877, las cuales se incorporan todas en su totalidad en la presente memoria por referencia.
Enlazadores escindibles por ácido, fotoescindibles y termolabiles
Tambien pueden usarse enlazadores escindibles por ácido, fotoescindibles y termolabiles, particularmente, donde puede ser necesario escindir el agente diana para permitir que este mas accesible para reaccion. Los enlazadores escindibles por ácido incluyen, pero no se limitan a, bismaleimidoetoxi propano; y enlazador de dihidrazida de ácido adfpico (vease, p. ej., Fattom et al. (1992) Infection & Immun. 60:584-589, incorporado en la presente memoria por referencia) y conjugados de transferrina sensibles a ácido que contienen una porcion suficiente de transferrina para permitir el ingreso a la via de circulacion de transferrina intracelular (vease, p. ej., Welhoner et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:4309-4314, incorporado en la presente memoria por referencia).
Los enlazadores fotoescindibles son enlazadores que se escinden tras la exposicion a la luz (vease, p. ej., Goldmacher et al. (1992) Bioconj. Chem. 3:104-107, cuyos enlazadores se incorporan en la presente memoria por referencia), y liberan asf el agente diana tras la exposicion a la luz. Los enlazadores fotoescindibles que se escinden tras la exposicion a la luz son conocidos (vease, p. ej., Hazum et al. (1981) en Pept., Proc. Eur. Pept. Symp., 16th, Brunfeldt, K (Ed), pags. 105-110, que describe el uso de un grupo nitrobencilo como grupo protector fotoescindible para la cistema; Yen et al. (1989) Makromol. Chem. 190:69-82, que describe copolfmeros fotoescindibles solubles en agua, que incluyen copolfmero de hidroxipropilmetacrilamida, copolfmero de glicina, copolfmero de fluorescema y copolfmero de metilrodamina; Goldmacher et al. (1992) Bioconj. Chem. 3:104-107, que describe un reticulador y reactivo que sufre degradacion fotolftica tras la exposicion a la luz UV cercana (350 nm); y Senter et al. (1985) Photochem. Photobiol. 42:231-237, que describe reactivos de reticulacion de cloruro de nitrobenciloxicarbonilo que producen ligaduras fotoescindibles), y liberan asf el agente diana tras la exposicion a la luz. Todas las referencias citadas se incorporan en su totalidad en la presente memoria por referencia. Dichos enlazadores tendnan uso espedfico en el tratamiento de afecciones dermatologicas y oftalmologicas que se pueden exponer a luz usando optica de fibras. Despues de la administracion del conjugado, el ojo o piel u otra parte del cuerpo se puede exponer a la luz y esto resulta en la liberacion del resto diana desde el conjugado. Dichos enlazadores fotoescindibles son utiles en relacion con protocolos de diagnostico en los que es deseable retirar el agente de direccionamiento para permitir la rapida depuracion desde el cuerpo del animal.
Otros enlazadores para conjugacion qmmica
Otros enlazadores incluyen enlazadores de tritilo, grupos tritilo derivados para generar un genero de conjugados que proporcionan la liberacion de agentes terapeuticos a diversos grados de acidez o alcalinidad. Por lo tanto, la flexibilidad que otorga la capacidad de preseleccionar el intervalo de pH en el que se liberara el agente terapeutico permite la seleccion de un enlazador en funcion de las diferencias fisiologicas conocidas entre tejidos que necesitan el suministro de un agente terapeutico (vease, p. ej., la patente estadounidense n.° 5.612.474, incorporada en la presente memoria por referencia). Por ejemplo, la acidez de tejidos tumorales parece ser mas que la de tejidos normales.
Enlazadores peptfdicos
Los restos enlazadores pueden ser peptidos. Se pueden emplear enlazadores peptfdicos en el conjugado. El enlazador peptfdico tfpicamente tiene de aproximadamente 2 a aproximadamente 60 residuos aminoaddicos, por ejemplo, de aproximadamente 5 a aproximadamente 40, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 residuos aminoaddicos. La longitud seleccionada dependera de factores tales como el uso para el cual se incluye el enlazador.
El resto enlazador puede ser una secuencia aminoaddica separadora flexible, tal como las conocidas en la investigacion de anticuerpos de cadena simple. Los ejemplos de dichos restos enlazadores conocidos incluyen, pero no se limitan a, GGGGS, (GGGGS)n, GKSSGSGSESKS, GSTSGSGKSSEGKG, GSTSGSGKSSEGSGSTKG, GSTSGSGKSSEGKG, GSTSGSGKPGSGEGSTKG, EGKSSGSGSESKEF, SRSSG, SGSSC. Tambien es util un enlazador sensible a tripsina de toxina difterica que tiene la secuencia AMGRSGGGCAGNRVGSSLSCGGLNLQAM. Se describen restos enlazadores adicionales, por ejemplo, en Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879­ 5883, 1988; Whitlow, M., et al., Protein Engin. 6:989-995, 1993; Newton et al., Biochemistry 35:545-553, 1996; A. J. Cumber et al., Bioconj. Chem. 3:397-401, 1992; Ladurner et al., J. Mol. Biol. 273:330-337, 1997; y la patente estadounidense n.° 4.894.443, cuyas publicaciones se incorporan todas en la presente memoria por referencia. Otros enlazadores incluyen, pero no se limitan a: sustratos enzimaticos, tales como sustrato de catepsina B, sustrato de catepsina D, sustrato de tripsina, sustrato de trombina, sustrato de subtilisina, sustrato de Factor Xa y sustrato de enterocinasa; enlazadores que aumentan la solubilidad, flexibilidad y/o escindibilidad intracelular incluyen enlazadores tales como (glymser)n y (sermgly)n, (vease, p. ej., la pub. PCT n.° WO 96/06641, incorporada en la presente memoria por referencia, que proporciona enlazadores ejemplares para su uso en conjugados). En algunas realizaciones, se pueden incluir diversos enlazadores para aprovechar las propiedades deseadas de cada enlazador. Preparacion de conjugados
Los conjugado con agentes diana enlazados se pueden preparar mediante conjugacion qmmica, tecnologfa de ADN recombinante o combinaciones de expresion recombinante y conjugacion qmmica. El peptido de la invencion y el agente citotoxico o de direccionamiento se pueden enlazar en cualquier orientacion y mas de un agente de direccionamiento y/o agente diana puede estar presente en el conjugado.
En algunas realizaciones preferidas de la invencion, el agente citotoxico se ancla al peptido por medio de un polfmero separador hidrofilo y biocompatible, que incluye una cadena alquilo corta, ácido polisialico o hialuronico, un polipeptido o un PEG. En algunas realizaciones preferidas de la invencion, el agente citotoxico se conjuga a traves de un enlazador escindible, p. ej., una ligadura disulfuro o peptido que contiene una secuencia escindible mediante proteasas lisosomicas tales como catepsinas. En algunas realizaciones preferidas de la invencion, el separador se acopla al extremo N o C del peptido.
Fórmulaciones
Los metodos para preparar estas formulaciones o composiciones incluyen la etapa de asociar un compuesto de la presente invencion con el portador y, opcionalmente, uno o mas ingredientes auxiliares. En general, las formulaciones se preparan al asociar de manera uniforme y estrecha un compuesto de la presente invencion con portadores lfquidos, o portadores solidos finamente divididos, o ambos, y despues, si es necesario, dar forma al producto.
Las formulaciones farmaceuticas se pueden preparar segun cualquier metodo conocido en la tecnica para la elaboracion de productos farmaceuticos. Dichas formulaciones pueden contener agentes edulcorantes, agentes saborizantes, agentes colorantes y agentes conservantes. Una formulacion se puede mezclar con excipientes farmaceuticamente aceptables no toxicos que son adecuados para la elaboracion. Tal “excipiente” generalmente se refiere a un material sustancialmente inerte que es no toxico y no interactua con otros componentes de la composicion de manera nociva. Los excipientes farmaceuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, lfquidos tales como agua, disolucion salina tamponada, polietilenglicol, hialuronica, glicerol y etanol. Las sales farmaceuticamente aceptables pueden incluirse en estos, por ejemplo, sales de ácido mineral tales como trifluoroacetato, clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos y similares; y las sales de ácidos organicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares.
El agente terapeutico se puede administrar en un medicamento o composicion farmaceutica adecuada para suministro. Las formulaciones pueden comprender uno o mas diluyentes, emulsionantes, conservantes, tampones, excipientes, etc., y se pueden proporcionar en formas tales como polvos liofilizados, rodos, cremas, lociones, genes, sobre parches, en implantes, etc. Las formulaciones farmaceuticas para administracion oral se pueden formular usando portadores farmaceuticamente aceptables conocidos en la tecnica en dosificaciones apropiadas y adecuadas. Dichos portadores permiten que los productos farmaceuticos se formulen en formas de dosificacion unitarias tales como comprimidos, pastillas, polvo, grageas, capsulas, lfquidos, pfldoras, geles, jarabes, lechadas, suspensiones, etc., adecuadas para la ingesta por parte del paciente. Las preparaciones farmaceuticas para uso oral se pueden formular como un excipiente solido, opcionalmente al triturar la mezcla resultante y procesar la mezcla de granulos, despues de agregar compuestos adicionales adecuados, si se desea, para obtener nucleos de comprimidos o grageas. Los excipientes solidos adecuados son cargas de carbohidrato o protema que incluyen, p. ej., azucares, incluidas lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; almidon de mafz, trigo, arroz, patata u otras plantas; celulosa tal como metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa o carboximetilcelulosa sodica; y gomas incluida arabiga y tragacanto; y protemas, p. ej., gelatina y colageno. Se pueden agregar agentes desintegrantes o solubilizantes, tales como la polivinilpirrolidona reticulada, agar, ácido algmico o una sal de estos, tal como alginato de sodio.
Las suspensiones acuosas pueden contener un agente activo (p. ej., un polipeptido quimerico o peptidomimetico de la invencion) en mezcla con excipientes adecuados para la elaboracion de suspensiones acuosas. Dichos excipientes incluyen un agente de suspension, tal como carboximetilcelulosa sodica, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma tragacanto y goma arabiga, y agentes dispersantes o humectantes tal como una fosfatida de origen natural (p. ej., lecitina), un producto de condensacion de un oxido de alquileno con un ácido graso (p. ej., estearato de polioxietileno), un producto de condensacion de oxido de etileno con un alcohol alifatico de cadena larga (p. ej., heptadecaetileno oxicetanol), un producto de condensacion producto de oxido de etileno con un ester parcial derivado de un ácido graso y un hexitol (p. ej., monooleato de polioxietileno sorbitol), o un producto de condensacion de oxido de etileno con un ester parcial derivado de ácido graso y un anddrido de hexitol (p. ej., mono-oleato de polioxietileno sorbitan). La suspension acuosa tambien puede contener uno o mas conservantes tales como etil o n-propil p-hidroxibenzoato, uno o mas agentes colorantes, uno o mas agentes saborizantes y uno o mas agentes edulcorantes, tales como sacarosa, aspartamo o sacarina. La formulacion se puede ajustar para osmolaridad.
Los productos farmaceuticos basados en aceite son utiles para administracion de agentes activos hidrofobos de la invencion. Las suspensiones basadas en aceite se pueden formular al suspender un agente activo (p. ej., una composicion quimerica de la invencion) en un aceite vegetal, tal como aceite de cacahuate, aceite de oliva, de aceite de sesamo o aceite de coco, o en un aceite mineral tal como parafina lfquida; o una mezcla de estos. Vease, p. ej., la patente estadounidense n.° 5.716.928, incorporada en la presente memoria por referencia, que describe el uso de aceites esenciales o componentes de aceites esenciales para aumentar la biodisponibilidad y reducir la inter e intravariabilidad individual de compuestos farmaceuticos hidrofobos administrados oralmente (vease tambien la patente estadounidense n.° 5.858.401). Las suspensiones de aceite pueden contener un agente espesante, tal como cera de abejas, parafina dura o alcohol cetflico. Los agentes edulcorantes se pueden agregar para proporcionar una preparacion oral sabrosa, tal como glicerol, sorbitol o sacarosa. Estas formulaciones se pueden conservar mediante la adicion de un antioxidante tal como ácido ascorbico. Como ejemplo de un veldculo de aceite inyectable, vease Minto (1997) J. Pharmacol. Exp. Ther. 281:93-102, incorporado en la presente memoria por referencia. Las formulaciones farmaceuticas de la invencion tambien pueden estar en forma de emulsiones de aceite en agua. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal o un aceite mineral, descrito anteriormente, o una mezcla de estos. Los agentes emulsionantes adecuados incluyen gomas de origen natural, tal como goma arabiga y goma tragacanto, fosfatidas de origen natural, tal como lecitina de semilla de soja, esteres o esteres parciales derivados de ácidos grasos y antudridos de hexitol, tales como mono-oleato de sorbitan, y productos de condensacion de estos esteres parciales con oxido de etileno, tales como mono-oleato de polioxietileno sorbitan. La emulsion tambien puede contener agentes edulcorantes y agentes saborizantes, tal como en la formulacion de jarabes y elixires. Dichas formulaciones tambien pueden contener un emoliente, un conservante o un agente colorante.
Tambien se contempla que una composicion o medicamento que comprende el agente terapeutico puede contener un portador farmaceuticamente aceptable que sirve como un estabilizador, particularmente para el peptido, protema, polinucleotido u otros agentes similares. Los ejemplos de portadores adecuados que tambien actuan como estabilizadores para peptidos incluyen, sin limitacion, grados farmaceuticos de dextrosa, sacarosa, lactosa, trehalosa, manitol, sorbitol, inositol, dextrano y similares. Otros portadores adecuados incluyen, nuevamente sin limitacion, almidon, celulosa, fosfatos de sodio o calcio, ácido cftrico, ácido tartarico, glicina, polietilenglicol de peso molecular alto (PEG) y combinacion de estos. Tambien puede ser util emplear un lfpido cargado y/o detergente. Los lfpidos cargados adecuados incluyen, sin limitacion, fosfatidilcolinas (lecitina) y similares. Los detergentes tfpicamente seran un tensioactivo no ionico, anionico, cationico o anfotero. Los ejemplos de tensioactivos adecuados incluyen, por ejemplo, los tensioactivos Tergitol® y Triton® (Union Carbide Chemicals and Plastics, Danbury, CT), polioxietilenosorbitanos, por ejemplo, tensioactivos TWEEN® (Atlas Chemical Industries, Wilmington, DE), eteres de polioxietileno, por ejemplo, Brij, esteres de ácido graso farmaceuticamente aceptables, por ejemplo, lauril sulfato y sales de estos (SDS), y materiales similares. Se encuentra una descripcion exhaustiva de excipientes, portadores, estabilizadores y otras sustancias auxiliares farmaceuticamente aceptables en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N. J.1991), incorporado en la presente memoria por referencia.
Las composiciones farmaceuticas de la presente invencion adecuadas para administracion parenteral comprenden uno o mas compuestos de la invencion en combinacion con una o mas disoluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas, isotonicas esteriles farmaceuticamente aceptables, o polvos esteriles que se pueden reconstituir en disoluciones o dispersiones esteriles inyectables poco antes del uso, que pueden contener azucares, alcoholes, antioxidantes, tampones, bacteriostaticos, solutos que hacen que la formulacion sea isotonica con la sangre del receptor previsto o agentes de suspension o espesantes.
Los ejemplos de portadores adecuados acuosos y no acuosos que se pueden emplear en las composiciones farmaceuticas de la invencion incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares), y mezclas adecuadas de estos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y esteres organicos inyectables, tales como oleato de etilo. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina, que mantienen el tamano de partfcula necesario en el caso de dispersiones, y mediante el uso de tensioactivos.
Estas composiciones tambien pueden contener adyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevencion de la accion de microorganismos en los compuestos de la presente invencion se puede asegurar mediante la inclusion de diversos agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sorbico y similares. Tambien puede ser deseable incluir agentes isotonicos, tales como azucares, cloruro de sodio, disolucion salina tamponada con fosfato y similares en las composiciones. Ademas, se puede lograr la absorcion prolongada de la forma farmaceutica inyectable mediante la inclusion de agentes que retardan la absorcion, tal como monoestearato de aluminio y gelatina.
En algunos casos, para prolongar el efecto de un farmaco, es deseable enlentecer la absorcion del farmaco de inyeccion subcutanea o intramuscular. Esto se puede lograr mediante el uso de una suspension lfquida de material cristalino o amorfo que tiene poca solubilidad en agua. La velocidad de absorcion del farmaco depende, por lo tanto, de su velocidad de disolucion que, a su vez, puede depender del tamano del cristal y la forma cristalina. Alternativamente, la absorcion retardada de una forma farmaceutica administrada parenteralmente se logra al disolver o suspender el farmaco en un vetuculo oleoso.
En los metodos de la invencion, los compuestos farmaceuticos tambien se pueden administrar como microesferas para una liberacion lenta en el cuerpo. Por ejemplo, se pueden administrar microesferas a traves de inyeccion intradermica del farmaco que se libera de manera lenta subcutaneamente; vease Rao (1995) J. Biomater Sci. Polym. Ed. 7:623-645; como formulaciones de gel biodegradables e inyectables, vease, p. ej., Gao (1995) Pharm. Res.
12:857-863 (1995); o, como microesferas para administracion oral, vease, p. ej., Eyles (1997) J. Pharm. Pharmacol.
49:669-674. Todas las referencias citadas se incorporan en su totalidad en la presente memoria por referencia. Las formas de depositos inyectables se producen al formar matrices de microcapsulas de los compuestos de la presente invencion en polfmeros biodegradables tales como polilactido-poliglicolido. Dependiendo de la relacion entre el farmaco y el polfmero, y la naturaleza del polfmero espedfico empleado, se puede controlar la velocidad de liberacion del farmaco. Los ejemplos de otros polfmeros biodegradables incluyen poli(ortoesteres) y poli(antndridos).
Las formulaciones inyectables de depositos tambien se preparan al encerrar el farmaco en liposomas o microemulsiones que son compatibles con el tejido corporal.
El polipeptido se puede administrar solo o en combinacion con otro compuesto terapeutico. En particular, el polipeptido se puede administrar junto con un compuesto terapeutico usado para tratar el melanoma, la inflamacion o una enfermedad autoinmunitaria en el mairnfero. El polipeptido y el compuesto terapeutico adicional se pueden formular en la misma o en diferentes composiciones. El polipeptido se puede administrar de simultanea, secuencial o por separado del compuesto terapeutico adicional.
Dosificacion
Los niveles de dosificacion reales de los ingredientes activos en las composiciones farmaceuticas de la presente invencion se pueden variar para obtener una cantidad del ingrediente activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapeutica deseada para un paciente, composicion y modo de administracion espedficos, sin que sea toxica para el paciente. Cuando los compuestos de la presente invencion se administran como productos farmaceuticos, a humanos y animales, se pueden proporcionar como tal o como una composicion farmaceutica que contiene, por ejemplo, 0,1 a 99 % de ingrediente activo, mas preferiblemente, 10 a 30 %, en combinacion con un portador farmaceuticamente aceptable.
El nivel de dosificacion seleccionado dependera de una variedad de factores que incluyen la actividad del compuesto espedfico de la presente invencion empleado, la via de administracion, el tiempo de administracion, la velocidad de excrecion o metabolismo del compuesto espedfico que se emplea, la velocidad o extension de la absorcion, la duracion del tratamiento, otros farmacos, compuestos y/o materiales usados en combinacion con el compuesto espedfico empleado, la edad, sexo, peso, condicion, salud general y antecedentes medico del paciente que se trata, y factores similares conocidos en la tecnica medica.
Un medico o veterinario con experiencia habitual en la tecnica puede determinar y recetar sin inconvenientes la cantidad eficaz de composicion farmaceutica necesaria. Por ejemplo, el medico o veterinario podna comenzar con dosis de los compuestos de la invencion empleados en la composicion farmaceutica a niveles mas bajos que los necesarios para lograr el efecto terapeutico deseado y aumentar gradualmente la dosificacion hasta lograr el efecto deseado.
En general, una dosis diaria adecuada de un compuesto de la invencion sera la cantidad del compuesto que es la dosis eficaz mas baja para producir un efecto terapeutico. Dicha dosis eficaz generalmente dependera de los factores descritos anteriormente. En general, las dosis orales, intravenosas, intracerebroventriculares y subcutaneas de los compuestos de la presente invencion para un paciente, cuando se usan para los efectos indicados, tendran un intervalo no limitante de aproximadamente 1 mcg a aproximadamente 5 mg por kilogramo de peso corporal por hora. En otras realizaciones, la dosis tendra un intervalo no limitante de aproximadamente 5 mcg a aproximadamente 2,5 mg por kilogramo de peso corporal por hora. En realizaciones adicionales, la dosis tendra un intervalo no limitante de aproximadamente 5 mcg a aproximadamente 1 mg por kilogramo de peso corporal por hora. Si se desea, la dosis diaria eficaz del compuesto activo se puede administrar como dos, tres, cuatro, cinco, seis o mas subdosis administradas por separado a intervalos adecuados a lo largo del dfa, opcionalmente, en formas de dosificacion unitarias. En una realización, el compuesto se administra como una dosis por dfa. En realizaciones adicionales, el compuesto se administra de manera continua, como a traves de via intravenosa u otras vfas. En otras realizaciones, el compuesto se administra menos frecuentemente que a diario, tal como semanalmente o menos. Aunque es posible administrar un compuesto de la presente invencion solo, es preferible administrar el compuesto como una formulacion farmaceutica (composicion).
El sujeto que recibe este tratamiento es cualquier animal que lo necesita, incluidos primates, en particular humanos, y otros mamfferos tales como conejos, equinos, ganado tal como bovinos, porcinos, caprinos y ovinos; y aves y mascotas en general.
El compuesto de la invencion se puede administrar como tal o en mezclas con portadores farmaceuticamente aceptables y tambien se puede administrar junto con agentes antimicrobianos tales como penicilinas, cefalosporinas, aminoglucosidos y glucopeptidos. Por lo tanto, la politerapia incluye administracion secuencial, simultanea o por separado de un compuesto activo de manera que los efectos terapeuticos del primero administrado no desaparezcan completamente cuando se administra el siguiente.
Posibles vfas de administracion para los compuestos descritos
Estos compuestos se pueden administrar a humanos y otros animales para terapia mediante cualquier via de administracion adecuada. Segun se usa en la presente memoria, se pretende que el termino “via” de administracion incluya, pero no se limite a, inyeccion subcutanea, inyeccion intravenosa, inyeccion intraocular, inyeccion intradermica, inyeccion intramuscular, inyeccion intraperitoneal, administracion endotraqueal, administracion intraadiposal, administracion intraarticular, administracion intratecal, administracion epidural, inhalacion, administracion intranasal, administracion oral, administracion sublingual, administracion bucal, administracion rectal, administracion vaginal, administracion, intracisternal, administracion transdermica y administracion topica, o administracion a traves de suministro local (por ejemplo, mediante cateter o endoprotesis). Los compuestos tambien se pueden administrar o coadministrar en formas de dosificacion de liberacion lenta.
En los metodos de la invencion, los compuestos farmaceuticos tambien se pueden administrar por las vfas intranasal, intraocular, periocular e intravaginal que incluyen supositorios, insuflacion, polvos y formulaciones en aerosol (por ejemplo, de inhaladores de esteroides, veanse Rohatagi (1995) J. Clin. Pharmacol. 35:1187-1193; Tjwa (1995) Ann. Allergy Asthma Immunol. 75:107-111, incorporados en la presente memoria por referencia). Las formulaciones para supositorios se pueden preparar al mezclar el farmaco con un excipiente no irritante adecuado que es solido a temperaturas habituales, pero es lfquido a temperaturas corporales y, por lo tanto, se fundira en el cuerpo para liberar el farmaco. Dichos materiales son manteca de cacao y polietilenglicoles.
En los metodos de la invencion, los compuestos farmaceuticos se pueden suministrar transdermicamente, a traves de una via topica, formulada como barras aplicadoras, disoluciones, suspensiones, emulsiones, geles, cremas, unguentos, pastas, jaleas, polvos y aerosoles.
En los metodos de la invencion, los compuestos farmaceuticos se pueden administrar parenteralmente, tal como mediante administracion intravenosa (IV) o administracion en una cavidad corporal (p. ej., el espacio sinovial) o lumen de un organo. Estas formulaciones pueden comprender una disolucion de agente activo disuelta en un portador farmaceuticamente aceptable. Los vehmulos y disolventes adecuados que se pueden emplear son agua y disolucion de Ringer, un cloruro de sodio isotonico. Ademas, se pueden emplear aceites fijos esteriles como disolvente o medio de suspension. Con este fin, se puede emplear cualquier aceite fijo ligero, incluidos mono o digliceridos sinteticos.
Segun se describen en la presente memoria, los metodos de la presente invencion se pueden usar solos o en combinacion con otras estrategias para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria o las otras afecciones descritas en la presente memoria.
La combinacion espedfica de las terapias (agentes terapeuticos o procedimientos) a empelar en un regimen de combinacion tendra en cuenta la compatibilidad de los agentes terapeuticos y/o procedimientos deseados y el efecto terapeutico deseado que se va a lograr. Tambien se apreciara que las terapias empleadas pueden lograr un efecto deseado para el mismo trastorno (por ejemplo, un compuesto de la invencion se puede administrar concomitantemente con otro agente usado para tratar el mismo trastorno), o puede lograr efectos diferentes (p. ej., el control de cualesquiera efectos adversos). Segun se usan en la presente memoria, los agentes terapeuticos adicionales que se administran normalmente para tratar o prevenir una enfermedad o afeccion espedfica se conocen como “adecuados para la enfermedad o afeccion que se esta tratando”.
Una politerapia de la presente invencion, segun se define en la presente memoria, se puede lograr por medio de la administracion simultanea, secuencial o por separado de componentes individuales de dicho tratamiento.
Aplicaciones terapeuticas
La administracion del polinucleotido o un compuesto modulador (de aqu en adelante en la presente memoria “agente terapeutico”), segun se describio en la presente memoria, puede ser con fines preventivos o terapeuticos. Cuando se proporciona preventivamente, el agente terapeutico se proporciona antes de la aparicion de cualquier smtoma. La administracion preventiva del agente terapeutico sirve para prevenir o atenuar cualquier smtoma. Cuando se proporciona terapeuticamente, el agente terapeutico se proporciona en el momento (o poco despues) de la aparicion de un smtoma de la enfermedad o trastorno. La administracion terapeutica del agente terapeutico sirve para atenuar cualquier exacerbacion real de los smtomas.
El individuo tratado puede ser cualquier mairnfero. En un aspecto, el mairnfero es un humano. En otro aspecto, el humano tiene una enfermedad o afeccion autoinmunitaria. En otros aspectos, la enfermedad o afeccion autoinmunitaria se asocia con o selecciona del grupo que consiste en esclerosis multiple, diabetes tipo I, anemia aplasica, enfermedad de Grave, enfermedad celfaca, enfermedad de Crohn, lupus, artritis, osteoartritis, uveitis autoinmunitaria, encefalomielitis autoinmunitaria y miastenia gravis.
En otros aspectos, el humano tiene una enfermedad o afeccion inflamatoria. En otro aspecto, la enfermedad o afeccion inflamatoria se asocia con o selecciona del grupo que consiste en enfermedad intestinal inflamatoria, artritis reumatoide, alergia, ateroesclerosis, psoriasis, gastritis y cardiopatfa isquemica. En otro aspecto, la inflamacion se asocia con muerte cerebral, preferiblemente en donde se reducen los niveles en circulacion de a-MSH endogena o a-MSH en el tejido cerebral. En otro aspecto adicional, el agente terapeutico se usa para tratar a un sujeto con un trastorno o enfermedad mediado por a-MSH o el receptor de MC1.
En otro aspecto, la presente invencion se dirige al tratamiento de un sujeto con melanoma. En un aspecto, la presente invencion atenua o mejora el melanoma en sujetos. En otro aspecto adicional, los compuestos de la presente invencion se usan en ensayos para la deteccion o generacion de imagenes del melanoma.
Kits que comprenden los compuestos descritos
La invencion tambien proporciona kits para llevar a cabo los regfmenes terapeuticos de la invencion. Dichos kits comprenden cantidades terapeuticamente eficaces de un peptido que tiene actividad espedfica como moduladores de MC1R, en forma farmaceuticamente aceptable, solo o en combinacion con otros agentes, en forma farmaceuticamente aceptable. Las formas farmaceuticas preferidas incluyen peptidos en combinacion con disolucion salina esteril, disolucion de dextrosa, disolucion tamponada u otro fluido esteril farmaceuticamente aceptable.
Alternativamente, la composicion se puede liofilizar o disecar. En este caso, el kit puede comprender, ademas, una disolucion farmaceuticamente aceptable, preferiblemente esteril, para formar una disolucion con el fin de usarla como inyeccion. En otra realización, el kit puede comprender, ademas, una aguja o jeringa, preferiblemente envasada en forma esteril, para inyectar la composicion. En otras realizaciones, el kit comprende, ademas, un medio de instruccion para administrar la composicion a un sujeto. El medio de instruccion puede ser un prospecto escrito, una grabacion de audio, una grabacion audiovisual o cualquier otro medio para instruir sobre la administracion de la composicion a un sujeto. En una realización, el kit comprende (i) un primer contenedor que contiene un peptido que tiene actividad moduladora espedfica para MC1R; y (ii) un medio de instruccion para su uso.
Realizaciones adicionales del metodo de tratamiento
En algunas realizaciones, la invencion proporciona un metodo para reducir o inhibir el rechazo del trasplante en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar a dicho sujeto una composicion farmaceutica que comprende un excipiente farmaceuticamente aceptable y una cantidad eficaz de al menos uno de los compuestos peptfdicos proporcionados en la presente memoria. En algunas realizaciones, la invencion proporciona un metodo para reducir o inhibir una respuesta inmunitaria del sujeto desencadenada por tejido, celulas u organo trasplantados. Los ejemplos de un tejido trasplantado son un aloinjerto en trasplante cardfaco experimental y celulas de islote pancreatico.
Actividad inmunosupresora en modelo de encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE)
Se generaron nuevos analogos peptfdicos de aminoácido D de a-MSH y se evaluaron para determinar sus efectos inmunomoduladores en modelos de uveftis autoinmunitaria experimental (EAU, por sus siglas en ingles) y encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE), asf como en un modelo de enfermedad inflamatoria de sustituto de lipopolisacarido (LPS). El tratamiento con el analogo a-MSH RI redujo las puntuaciones de enfermedad clmica y la incidencia de la enfermedad en el modelo de EAU y en un modelo de EAE de raton inducida por MOG. Ademas, los niveles de expresion del ARNm de TNF-a y IL-l0 en el bazo y ganglio linfatico de ratones sensibilizados con MOG se redujeron en ratones tratados. En un modelo de inflamacion sistemica inducida LPS, el tratamiento con a-MSH y analogo disminuyo los niveles de citocina en suero. Estos datos indican que estos nuevos analogos de a-MSH tienen potencial para uso terapeutico en la inflamacion y enfermedades autoinmunitarias.
La descripcion incluye los siguientes aspectos definidos en las siguientes oraciones que forman parte de la presente descripcion, que, sin embargo, no representan las reivindicaciones, de conformidad con la decision J15/88 de la Comision de apelacion legal de la Oficina de Patentes Europea:
(1) Un compuesto sustancialmente puro que se une selectivamente al receptor de melanocortina 1 (MC1R), dicho compuesto comprende un tetrapeptido principal que tiene la secuencia:
His Xaai Arg Trp (SEQ ID NO:1) o D-Trp D-Arg Xaa2 D-His (SEQ ID NO:2),
en donde Xaai es D-Cha, D-Phe o Cha, y
Xaa2 es D-Cha, D-Phe o Phe;
o una sal farmaceuticamente aceptable de este.
(2) El compuesto de la oracion 1, dicho compuesto comprende un polipeptido del extremo C que tiene la secuencia: D-Ser D-Ile D-Ile D-Ser D-Ser (SEQ ID NO:3).
(3) Un compuesto sustancialmente puro que se une selectivamente al receptor de melanocortina 1 (MC1R), dicho compuesto comprende un polipeptido que tiene la secuencia:
Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaas Xaag Xaa10 Xaan Xaa12 Xaa13,
en donde Xaa1 es D-Val, D-Ala o D-Lys;
Xaa2 es D-Pro, D-Ala o D-Lys;
Xaa3 es D-Lys, D-Orn, D-Nle, D-Ala o D-Lys;
Xaa4 es Gly o D-Ala;
Xaa5 es D-Trp, Trp, D-3-benzotienil-Ala, D-5-hidroxi-Trp, D-5-metoxi-Trp, D-Phe, o D-Ala;
Xaa6 es D-Arg, D-His o D-Ala;
Xaa7 es D-Cha, D-Phe, Phe, D-4-fluoro-Phg, D-3-piridil-Ala, D-Thi, D-Trp, D-4-nitro-Phe o D-Ala;
Xaa8 es D-His, His, D-Arg, Phe o D-Ala;
Xaag es D-Glu, D-Asp, D-citrulline, D-Ser o D-Ala;
Xaa10 es D-Met, D-butionina, D-Ile o D-Ala;
Xaa-n es D-Ser, D-Ile o D-Ala;
Xaai2 es D-Tyr, D-Ser o D-Ala; y
Xaai3 es D-Ser o D-Ala;
en donde no mas de un Xaai - i 3 es D-Ala excepto cuando todos los Xaai-3 son D-Ala, y no mas de un Xaai - i 3 es un aminoácido L;
o una sal farmaceuticamente aceptable de este.
(4) El compuesto de la oracion 3, dicho compuesto comprende un polipeptido que tiene la secuencia:
Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaag Xaaio Xaai i Xaai2 Xaai 3 ,
en donde Xaai es D-Val;
Xaa2 es D-Pro;
Xaa3 es D-Lys, D-Orn o D-Nle;
Xaa4 es Gly;
Xaa5 es D-Trp, Trp, D-3-benzotienil-Ala, D-5-hidroxi-Trp, D-5-metoxi-Trp o D-Phe;
Xaa6 es D-Arg o D-His;
Xaa7 es D-Cha, D-Phe, Phe, D-4-fluoro-Phg, D-3-piridil-Ala, D-Thi, D-Trp o D-4-nitro-Phe;
Xaa8 es D-His, His, D-Arg, Phe o D-Ala;
Xaag es D-Glu, D-Asp, D-citrulina o D-Ser;
Xaaio es D-Met, D-butionina o D-Ile;
Xaai i es D-Ser o D-Ile;
Xaai2 es D-Tyr o D-Ser; y
Xaai3 es D-Ser;
en donde no mas de un Xaai - i 3 es un aminoácido L;
o una sal farmaceuticamente aceptable de este.
(5) El compuesto de la oracion 3, dicho compuesto comprende un polipeptido que tiene la secuencia:
Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaag Xaaio Xaai i Xaai2 Xaai 3 ,
en donde Xaai es D-Val;
Xaa2 es D-Pro;
i8
Xaa3 es D-Lys, D-Orn o D-Nle;
Xaa4 es Gly;
Xaa5 es D-Trp o Trp;
Xaa6 es D-Arg;
Xaa7 es D-Cha, D-Phe, Phe o D-Thi;
Xaa8 es D-His o His;
Xaag es D-Glu o D-Ser;
Xaa10 es D-Met, D-butionina o D-Ile;
Xaa-n es D-Ser o D-Ile;
Xaa12 es D-Tyr o D-Ser; y
Xaai3 es D-Ser;
en donde no mas de un Xaai-13 es un aminoácido L;
o una sal farmaceuticamente aceptable de este.
(6) Un compuesto sustancialmente puro que comprende un polipeptido que tiene la secuencia:
D-Val D-Pro D-Lys Gly D-Trp D-Arg Phe D-His D-Ser D-Ile D-Ile D-Ser D-Ser (SEQ ID NO:4);
D-Val D-Pro D-Lys Gly D-Trp D-Arg D-Cha D-His D-Ser D-Ile D-Ile D-Ser D-Ser (SEQ ID NO:5);
Ser Tyr Ser Met Glu His Cha Arg Trp Gly Lys Pro Val (SEQ ID NO:6); o
D-Val D-Pro D-Lys Gly D-Trp D-Arg D-Phe D-His D-Glu D-Met D-Ser D-Tyr D-Ser (SEQ ID NO:7); o una sal farmaceuticamente aceptable de este.
(7) El compuesto de las oraciones 1, 3, 4, 5 o 6, en donde dicho polipeptido esta PEGilado.
(8) El compuesto de la oracion 6, en donde dicho compuesto se une selectivamente a MC1R.
(9) El compuesto de la oracion 1, 3, 4, 5 o 6, en donde dicho compuesto exhibe al menos una de las siguientes propiedades:
capacidad para activar selectivamente MC1R;
estabilidad en plasma in vitro; o
resistencia a la degradacion por proteasa.
(10) Una composicion farmaceutica que comprende el compuesto de la oracion 1, 3, 4, 5 o 6 y un excipiente farmaceuticamente aceptable.
(11) El compuesto de la oracion 1, 3, 4, 5 o 6, en donde dicho compuesto se conjuga con un resto biologicamente activo.
(12) Un metodo para tratar una enfermedad o afeccion autoinmunitaria en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar a dicho sujeto una composicion farmaceutica que comprende un excipiente farmaceuticamente aceptable y una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto segun la oracion 1, 3, 4, 5 o 6.
(13) El metodo de la oracion 12, en donde dicha enfermedad o afeccion autoinmunitaria se selecciona del grupo que consiste en esclerosis multiple, diabetes tipo I, anemia aplasica, enfermedad de Grave, enfermedad celfaca, enfermedad de Crohn, lupus, artritis, osteoartritis, uveftis autoinmunitaria y miastenia gravis.
(14) Un metodo para tratar la inflamacion en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar a dicho sujeto una composicion farmaceutica que comprende un excipiente farmaceuticamente aceptable y una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto segun la oracion 1, 3, 4, 5 o 6.
(15) El metodo de la oracion 14, en donde dicha inflamacion se asocia con una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en enfermedad intestinal inflamatoria, artritis reumatoide, alergia, ateroesclerosis, psoriasis, gastritis y cardiopatia isquemica.
(16) Un metodo para reducir o inhibir el rechazo del trasplante en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar a dicho sujeto una composicion farmaceutica que comprende un excipiente farmaceuticamente aceptable y una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto segun la oracion 1, 3, 4, 5 o 6.
(17) Un metodo para tratar el melanoma en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar a dicho sujeto un producto farmaceutico que comprende un excipiente farmaceuticamente aceptable y una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto segun la oracion 1, 3, 4, 5 o 6.
(18) Un metodo para tratar el melanoma en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar a dicho sujeto un producto farmaceutico que comprende un excipiente farmaceuticamente aceptable y una cantidad terapeuticamente eficaz de un conjugado que comprende un compuesto segun la oracion 1, 3, 4, 5 o 6 conjugado con una carga eficaz antitumoral.
(19) El metodo de la oracion 18, en donde dicha carga eficaz antitumoral es un radionuclido, un radiosensibilizador, un fotosensibilizador, un agente quimioterapeutico o una toxina.
(20) Un kit que comprende la composicion farmaceutica de la oracion 10 y, opcionalmente, instrucciones de uso. Materiales y metodos
Peptidos. Se adquirio a-MSH (SYSMEHFRWGKPV) a Bachem (King of Prussia, PA). Genzyme Corporation sintetizo un analogo de a-MSH RI de aminoácido D (vpkgwrfhemsys), peptido sustituido por alanina de a-MSH RI, (Estearilo) HfRW (820), (Ph(CH2)3CO) HfRW (819) y el analogo de a-MSH RI 891 [vpkGwr(D-Cha)hsiiss] con una metodologfa de fase solida estandar y se purificaron mediante HPLC de fase inversa. Genzyme Corporation sintetizo un peptido testigo de aminoácido D aleatorizado (ksrsmgvfpeyh). Genzyme Corporation sintetizo un peptido testigo de aminoácido D irrelevante (plykkiikklles).
Animales. Se adquirieron ratones B10.RIII-H2r hembra de cinco a seis semanas a Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME).
Se adquirieron ratones C57BL/6 hembra o macho de seis a ocho semanas a Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Todos los protocolos para los estudios con animales recibieron la aprobacion del Institutional Animal Care and use Committee (IACUC) en Genzyme Corporation.
Induccion de EAU. Se inyectaron subcutaneamente B10.RIII hembra en dos sitios (entre los omoplatos y en la region pelvica) con un total de 200 |jg de peptido de protema de union a interfotorreceptor (IRBP) 161-180 (New England Peptide; Fitchburg, MA), respectivamente en 2 mg/ml de adyuvante de Freund completo (CFA; Sigma, St. Louis, MO) con mycobacterium tuberculosis H37Ra (Difco, Detroit, MI).
Puntuacion ocular. Se dilatan los ojos de los ratones usando una o dos gotas de Mydriacyl al 1 % (Alcon; Humacao, Puerto Rico) y se dejan reposar en una habitacion oscurecida durante aproximadamente 5 min. Se sujeta a los ratones manualmente y se visualizan las retinas de ambos ojos usando un oftalmoscopio indirecto con una lente de 78 dioptnas. Se puntua la inflamacion de los ojos usando un sistema de puntuacion progresiva entre 0-5. Puntuacion 0: Retina normal. Puntuacion 1: Inflamacion vascular proximal del nervio optico. Puntuacion 2: <5 lesiones inflamatorias confinadas a un cuadrante del ojo. Puntuacion 3: >5 lesiones inflamatorios es mas de un cuadrante del ojo. Puntuacion 4: Lesiones inflamatorias contiguas. Puntuacion 5: Desprendimiento de retina. Se recogieron los ojos enteros de los ratones y se colocaron en PBS. Los ojos se embebieron en medios OCT para la fijacion con congelamiento. Se cortaron secciones de 5 jm a traves del plano papilar-nervio optico y se tineron con hematoxilina y eosina.
Estudios de union a receptores de melanocortina. Se midieron los perfiles de union de a-MSH, a-MSH RI y el peptido aleatorizado a los receptores de melanocortina: 1, 3, 4 y 5. La union se llevo a cabo mediante un ensayo de union competitiva con (Nle4,D-Phe7) a-MSH (Bachem) . El analisis de la union se llevo a cabo en Cerep laboratories (Paris, Francia) con muestras codificadas.
Tras la union de los peptidos tambien se procedio a una competencia con 125I-NDP-MSH para la union a los receptores de melanocortina 1, 3, 4 y 5 usando preparaciones de membrana de las lmeas celulares HEK293. Los peptidos se mezclaron con 125I-(Nle4,D-Phe7)-a-MSH (PerkinElmer, Boston MA) en placas de 96 pocillos con fondo en V en tampon de union (25 mM de HEPeS pH 7, 1,5 mM de CaCh, 1 mM de MgSO4, 100 mM de NaCl, BSA al 0,2 %) y se mezclaron con las preparaciones de membrana de las lmeas celulares transfectadas HEK293 (Perkin Elmer, Boston MA) que conteman 1-10 fmol de receptor durante 1 h a 25 °C. Se usaron 3 jM de (Nle4,D-Phe7)-NDP-MSH (Bachem) como testigo positivo. Las mezclas se filtraron a traves de filtros GFC de 96 pocillos (Millipore, Billerica, MA), se lavaron 3 veces con tampon de union sin BSA, se secaron y se contaron.
Medicion de cAMP. Se sembraron celulas B16-F1 (lmea celular de melanoma) de la American Type Culture Collection (Manassas, VA) en placas de 96 pocillos de fondo plano a 5x104/pocillo y se cultivaron durante toda la noche en DMEM (Cambrex, Walkersville, m D) complementadas con 2 mM de glutamina, antibioticos (100 U/ml de penicilina y 100 U/ml de estreptomicina) y suero fetal bovino inactivado por calor al 10 % (Invitrogen, Grand Island, NY). A continuacion, las celulas se trataron con a-MSH natural (0,01-1000 ng/ml), a-MsH retroinversa (0,01-1000 ng/ml) o un peptido testigo de aminoácido D aleatorizado (0,01-1000 ng/ml) durante 30 min. Las celulas se lisaron y se midieron los niveles de cAMP intracelular mediante un kit de enzimoinmunoanalisis (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). 100 pM de Forskolina (Sigma, St. Louis, MO) sirvieron como testigos positivos.
Induccion de EAE y puntuacion. Se inmunizaron ratones C57BL/6 hembra con una emulsion de peptido MOG35-55 (200 pg/raton; New England Peptide; Fitchburg, MA) en adyuvante de Freund completo (CFA; Sigma, St. Louis, MO) que contema 0,6 mg de Mycobacterium tuberculosis (Difco; Detroit, MI). La emulsion se suministro en un volumen de 0,2 ml por raton mediante inyeccion subcutanea en dos sitios. Se uso la toxina de Bordetella pertussis (PTX; Sigma) en PBS a una dosis de 400 ng/animal a traves de una via de administracion i.p. y se administro el dfa 0 y el dfa 3. Los ratones se monitorizaron a diario para detectar los smtomas paraltticos de EAE. Se puntuaron los smtomas clmicos de los ratones usando un sistema de puntuacion progresiva entre 0-5. Puntuacion 0: sin enfermedad; Puntuacion 1: cola flacida; Puntuacion 2; debilidad en la extremidad posterior; Puntuacion 3: paralisis de la extremidad posterior; Puntuacion 4: debilidad en la extremidad anterior/paralisis parcial; Puntuacion 5: muerte. Se recogen la medula espinal y el cerebro y se embeben en parafina para la tincion con hematoxilina y eosina.
Ensayo de proliferacion. Se cultivaron esplenocitos y celulas de ganglio linfatico de raton C57BL/6 en placas de 96 pocillos a 5x105 celulas/pocillo. Se agrego peptido MOG35-55 u OVA 257-264 a los pocillos a una concentracion de 25 pg/ml. Se recogio el sobrenadante 48 h despues de la estimulacion con peptido MOG. Despues de 3 dfas en cultivo, las celulas se lavaron con [3H] timidina a 1 pCi/pocillo durante 8 h. La incorporacion de timidina se midio mediante cpm.
Analisis de ARN de citocina-RT-QPCR. Se extrajo el ARN total de los tejidos con TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se transcribio de forma inversa 1 pg del ARN total y se uso en la PCR cuantitativa usando la incorporacion de verde SYBR con reactivos de Applied Biosystems (Foster City, CA) en un ABI 7900. Se uso en patron de ADNc en cada PCR para las dianas de citocina y se normalizaron las concentraciones del mensajero segun p-actina de raton. Los cebadores usados para obtener estos datos fueron los siguientes: TNFa de raton directo-ggcaggtctactttggagtcattgc e inverso- acattcgaggctccagtgaattcgg (1). Usamos IL-10 de raton directo: tgctatgctgcctgctctta e inverso: tcatttccgataaggcttgg (2). Las secuencias para p-actina de raton son: directo gtgggccgctctaggcaccaa e inverso ctctttgatgtcacgcacgatttc (3).
Analisis CBA. Se midieron por analisis de citometna de flujo los perfiles de citocina inflamatoria de suero de raton o sobrenadante celular usando el Cytometric Bead Array Kit (CBA) producido por BD Biosciences (San Jose, CA). Las muestras se procesaron segun el protocolo del fabricante.
Analisis de ARN de mMC1R-RT-QPCR. Se extrajo el ARN total de los tejidos con TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se transcribio de forma inversa 1 pg del ARN total y se uso en la pCr cuantitativa usando un kit Taqman con reactivos de Applied Biosystems (Foster City, CA) en un ABI 7900. Se uso en patron de ADNc en cada PCR para mMC1R y se normalizaron las concentraciones del mensajero segun el testigo endogeno Eukaryotic 18S (sonda VIC/MGB, n.° de parte Applied Biosystems 4319413E). Los cebadores para mMC1R fueron los siguientes: directo CTCTGCCTCGTCACTTTCTTTCTA e inverso AACATGTGGGCATACAGAATCG y sonda CCATGCTGGCACTCA. Estos se disenaron usando Primer Express 3.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Modelo LPS. Se expusieron ratones C57BL/6 macho a LPS (1ug/raton), i.p. Despues de 30 min, los ratones se trataron con dexametasona (2 mg/kg; Sigma), analogo de a-MSH RI 891 o a-MSH RI. Despues de 2 h de la exposicion a LPS, se extrajo sangre de los ratones para obtener el suero. El analisis de citocina se midio mediante citometna de flujo con un kit de matriz de perlas citometricas (BD Biosciences).
Analisis estadfstico. Los resultados se expresan como la media ± DT. Cada experimento se repitio al menos dos veces. Para analizar los resultados se uso un ANOVA de una via y la prueba de comparacion multiple Tukey.
Se ofrecen los siguientes ejemplos para ilustrar la invencion.
Ejemplo de referencia 1
Actividad inmunosupresora en modelo de uveitis autoinmunitaria experimental (EAU)
La uveitis autoinmunitaria es un trastorno inflamatorio del ojo que puede causar dolor y perdida de la vision. Los esteroides y los farmacos inmunosupresores son actualmente los unicos agentes terapeuticos para la uveitis y a menudo causan graves toxicidades a nivel ocular y sistemico. Por lo tanto, se desean agentes terapeuticos alternativos mas seguros.
La EAU es un modelo animal de uveftis humana que afecta a 2,3 millones de individuos en los Estados Unidos. La inmunizacion con la protema de union al retinoide interfotorreceptor (IRBP, por sus siglas en ingles) o sus fragmented peptidicos o S-antigeno retinal (S-Ag) con adyuvante puede inducir la enfermedad en cepas de roedores susceptibles. La enfermedad implica la infiltracion de celulas inflamatorias en la retina del ojo y el dano fotorreceptor con recuperacion natural sin recidiva espontanea. La transferencia adoptiva de linfocitos T uveitogenicos en receptores roedores singeneicos sugiere que la uveftis es una enfermedad autoinmunitaria mediada por linfocito T espedficos del organo como muchas otras enfermedades autoinmunitarias similares como la esclerosis multiple, la diabetes tipo 1 y la artritis reumatoide.
El microambiente ocular es un sitio con privilegio inmunitario en el que existen mecanismos para mantener la inmunosupresion para prevenir la inflamacion local. Diversos neuropeptidos expresados por neuronas en el tejido ocular ayudan a mantener el privilegio inmunitario en el ojo. Uno de estos neuropeptidos es a-MSH que se expresa constitutivamente en el microambiente ocular a una concentracion fisiologica de 30 pg/ml.
La administracion sistemica de a-MSH natural durante la induccion de la uveftis inducida por endotoxina en ratas inhibio la cantidad de celulas infiltrantes y los niveles de IL-6, TNF- a, MCP-1, MIP-2 y oxido nftrico en el humor acuoso de manera dependiente de la dosis. En un modelo de EAU en raton, la administracion de a-MSH en el momento pico de inflamacion suprimio la gravedad de la enfermedad. a-MSH puede inducir los linfocitos T reguladores a traves del receptor de melanocortina 5 (MCR-5) en los linfocitos T y suprimir la EAU.
Se evaluo la eficacia del tratamiento con a-MSH natural en el modelo de uveftis posterior murino. Se indujo la uveftis en ratones B10.RIII con una inyeccion de IRBP 161-180 y CFA. La aparicion de la enfermedad se produjo alrededor del dfa 10 despues de la sensibilizacion. Cuando se alcanzaron las puntuaciones oculares de 2-3 el dfa 13, se administro a los ratones a-MSH natural a 200 pg/raton, i.v. durante 7 dfas consecutivos o no se trataron. Dado que el tratamiento profilactico puede dirigirse a actividades en la fase de sensibilizacion de la enfermedad en lugar de en la fase efectora, el tratamiento se inicio cuando se observo la inflamacion retinal activa. Ademas, esta estrategia de tratamiento recapitula mejor la aplicacion clrnica. Los ratones tratados con a-MSH exhibieron una reduccion de las puntuaciones oculares clrnicas medias a lo largo del ciclo de tratamiento de 7 dfas en comparacion con los ratones no tratados (Figura 1a). Los ratones tratados con a-MSH exhibieron una puntuacion ocular media maxima de 2,83 ± 0,39 el dfa 13 en comparacion con el grupo de ratones no tratados que alcanzaron una puntuacion ocular media maxima de 3,67 ± 0,52 el dfa 15.
Ejemplo de referencia 2
Comparacion de a-MSH natural con dexametasona en el modelo de uveftis autoinmunitaria experimental en B10.RIII Las formas actuales de terapia para la uveftis incluyen corticoesteroides y agentes inmunosupresores. La eficacia de a-MSH natural se comparo con una terapia con corticoesteroides conocida, dexametasona. Se indujo la uveftis en ratones B10.RIII con inyecciones de IRBP161-180 y CFA. En el momento de la aparicion de la enfermedad, cuando los ratones alcanzaron una puntuacion ocular clrnica de 1, se administro a los ratones a diario inyecciones intraperitoneales de a-MSH natural (100 pg/raton), 0,2 mg/kg de dexametasona, o 2,0 mg/kg de dexametasona. Los ratones se trataron diariamente durante 21 dfas. Los ratones tratados con a-MSH natural exhibieron una reduccion significativa de las puntuaciones oculares clrnicas medias a lo largo del ciclo de tratamiento en comparacion con los ratones testigo que recibieron PBS (Figura 1B). Los datos muestran que la administracion i.p. diaria de a-MSH natural suprimio la uveftis hasta un grado mayor que el tratamiento con dexametasona con cualquiera de las dosis de 0,2 mg/kg o 2,0 mg/kg.
Ejemplo 3
Un nuevo analogo de a-MSH retroinversa que se une espedficamente a MCR-1
Se sintetizo un nuevo analogo peptfdico de aminoácido D estable de a-MSH natural (a-MSH RI) y se evaluo para determinar las capacidades inmunomoduladoras in vitro y en el modelo de uveftis autoinmunitaria experimental (EAU). Los estudios de union indicaron que a diferencia de a-MSH natural, la a-MSH RI se une espedficamente al receptor de a-MSH antiinflamatoria (MCR-1), pero a ningun otro de los receptores de a-MSH (MCR-3, 4 o 5).
Se analizo la union del analogo de a-MSH RI a los receptores de melanocortina (MCR). Se llevo a cabo un ensayo de union competitivo usando un panel de MCR que inclrna MCR 1, 3, 4 y 5. Tras la union de los peptidos se procedio a una competencia con 125I-NDP-MSH segun se describio anteriormente. La a-MSH natural se unio a MCR 1, 3, 4 y 5. Sin embargo, a diferencia de la a-MSH natural, se hallo que la a-MSH RI se une solamente a MCR-1 que regula las respuestas inflamatorias (Tabla 1). Un peptido testigo de aminoácido D aleatorizado no se unio a ningun receptor de melanocortina. El desarrollo de un analogo de a-MSH con union espedfica a MCR-1, y la exclusion de la union a MCR-3 y MCR-4, puede reducir los posibles efectos secundarios que produce la a-MSH natural a traves de la union a estos receptores.
Tabla 1
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Las letras en minusculas representan los aminoácidos de isomero D; los caracteres en negrita representan los cambios con respecto a a-MSH RI.
Tras la union de los peptidos se procedio a una competencia con 125I-NDP-MSH para la union a los receptores de melanocortina 1, 3, 4 y 5 usando preparaciones de membrana de las lmeas celulares HEK293. Como se muestra en la Figura 18, la a-MSH RI exhibio una selectividad muy intensa por MC1R, con valores de Ki que superaron los 30 |jM en MC 3, 4 y 5R, mientras que a-MSH exhibio union significativa a los cuatro receptores, con una selectividad menor que 100 veces para MC1R con respecto a MC3R.
Ejemplo 4
El tratamiento con analogo de a-MSH retroinversa mejora la enfermedad en EAU
Se observaron los efectos inmunomoduladores del nuevo analogo peptidico de a-MSH retroinversa en el modelo de uveftis autoinmunitaria en raton experimental (EAU) y los resultados se compararon con el peptido de a-MSH natural. El suministro sistemico de a-MSH RI cuando aparece la enfermedad o durante una etapa avanzada de la enfermedad mejoro de manera radical y reproducible la uveftis. Ademas, el tratamiento con el nuevo analogo peptidico de a-MSH RI suprimio la uveftis con una magnitud similar a la del peptido de a-MSH natural. Estos datos indican que el nuevo analogo de a-MSH RI muestra actividades antiinflamatorias y tiene uso terapeutico en la uveftis y otras enfermedades autoinmunitarias y la inflamacion.
Se indujo la EAU en ratones B10.RIII hembra con IRBP 161-180. Se examino la eficacia de a-MSH RI y a-MSH natural como agente terapeutico, en lugar de como tratamiento profilactico. Los ratones se trataron diariamente mediante inyeccion intravenosa con 100 jg/raton de a-MSH RI, 100jg/raton de a-MSH natural o PBS que se inicio que cuando los ratones alcanzaron una etapa moderada de la enfermedad uveftis (puntuaciones oculares de 2). Como se ve en la Figura 2A, los ratones tratados con PBS testigo alcanzar las puntuaciones oculares maximas el dfa 16 con una puntuacion ocular media de 2,75 ± 0,68. Sin embargo, los ratones tratados diariamente con el analogo de a-MSH RI o a-MSH natural exhibieron una reduccion significativa de las puntuaciones oculares clrnicas medias a lo largo del ciclo de tratamiento en comparacion con los ratones testigo que recibieron PBS. El dfa 16, cuatro dfas despues del inicio del tratamiento, 5 de los 8 ratones en el grupo tratado con PBS teman una puntuacion ocular maxima de 3 o mayor, mientras que solo 1 de los 8 ratones tratados con a-MSH natural y 0 de los 8 ratones tratados con a-MSH RI tema una puntuacion ocular maxima de 3 o mayor (Figura 2B).
Ejemplo 5
Las imagenes retinales y el examen histologico de los sujetos tratados con a-MSH RI muestran la supresion de la enfermedad en modelos de EAU
Las imagenes retinales de ratones tratados diariamente con a-MSH RI o a-MSH natural iniciado en una etapa avanzada de la uveftis muestran supresion de la enfermedad en comparacion con los ratones testigos que recibieron PBS. Las imagenes fundoscopicas se adquirieron el dfa 13 despues del inicio del tratamiento (Figura 3). La enfermedad en el grupo tratado con PBS se estabilizo o avanzo y tuvo una puntuacion ocular media de 3 vasculitis grave y lesiones inflamatorias en todo el ojo (Figura 3A). Sin embargo, la enfermedad se resolvio en los ratones tratados con el peptido de a-MSH RI y a-MSH natural. Las imagenes retinales exhibieron puntuaciones oculares de 1 con inflamacion solo en el nervio optico (Figuras 3B y 3C). Las puntuaciones oculares maximas para ratones individuales en cada grupo se muestran en la Figura 3D. En el grupo tratado con PBS, 7 de los 11 ratones teman puntuaciones oculares de 3 o mayor. Sin embargo, solo 2 de los 11 ratones en los tratados con a-MSH natural y a-MSH RI teman puntuaciones oculares de 3 o mayor.
El examen histologico de los ojos 10 dfas despues del inicio del tratamiento diario mostro que la a-MSH RI y la a-MSH natural redudan la patologfa en el ojo (Figura 4). Los ratones tratados con a-MSH natural y a-MSH RI exhibieron arquitectura retinal normal con ligera inflamacion en la region del nervio optico (Figuras 4B y 4C). En cambio, los ratones tratados con PBS exhibieron inflamacion ocular y dano tisular. La inflamacion se observa en las regiones de la retina y nervio optico con dano fotorreceptor (Figura 4A).
Ejemplo 6
Comparacion de administraciones intraperitoneales de a-MSH retroinversa con un peptido testigo aleatorizado en EAU
Se indujo la uveftis en ratones B10.RIII con inyecciones de IRBP161-180 y CFA. Evaluamos iniciar el tratamiento durante la enfermedad en etapa avanzada (puntuaciones oculares de 2-3) con inyecciones intraperitoneales de a-MSH RI diarias y comparar la eficacia con un peptido de aminoácido D testigo aleatorizado. Los ratones se trataron diariamente, i.p., durante 13 dfas con a-MSH RI o peptido aleatorizado a 100 jg/raton. Los ratones tratados con a-MSH RI exhibieron una reduccion significativa (p<0,04) en las puntuaciones oculares clrnicas medias en los dfas 15, 21 y 23 del transcurso de la enfermedad en comparacion con ratones testigo que recibieron el peptido aleatorizado (Figura 5). Las puntuaciones oculares maximas individuales el dfa 23 despues de la induccion de la enfermedad mostraron un 75 % de ratones con puntuaciones <1 entre los que recibieron a-MSH RI en comparacion con ninguno de los ratones en el grupo con peptido aleatorizado testigo con puntuaciones <1. Los pesos individuales de los ratones se registraron en 4 puntos de tiempo a lo largo del transcurso de la enfermedad. Todos los ratones en los grupos tratados con a-MSH RI y peptido aleatorizado mantuvieron su peso o exhibieron aumento de peso normal (no se muestran los datos). La dosificacion intraperitoneal diaria con los peptidos no resulto en perdida de peso. Ademas, la via de administracion intraperitoneal de a-MSH natural o a-MSH RI a 100 pg/raton tuvo eficacia en uveftis cuando el tratamiento se administro en el momento de la aparicion de la enfermedad, cuando los ratones alcanzaron una puntuacion ocular clmica de 1 (no se muestran los datos). Por lo tanto, la via de administracion intraperitoneal de a-MSH RI exhibio una reduccion significativa en las puntuaciones de la enfermedad en comparacion con un peptido testigo aleatorizado.
Ejemplo 7
Administracion de a-MSH RI en diversas dosificaciones al modelo de EAU
Tambien examinamos la eficacia y dosificacion optima del tratamiento con a-MSH retroinversa en la uveftis grave en etapa avanzada. Se inyectaron IRBP161-180 y CFA a ratones B10.RIII para inducir la uveftis. Los ratones se trataron diariamente, i.p., con PBS, peptido testigo aleatorizado (100 pg/raton) o a-MSH RI con 100 pg, 10 pg o 3 pg/raton. El tratamiento se inicio en el momento pico de la enfermedad cuando los ratones alcanzaron puntuaciones oculares de 4 que inclrnan lesiones inflamatorias a lo largo del segmento posterior del ojo y posible hemorragia. La enfermedad los grupos que recibieron PBS y peptido testigo aleatorizado continuo siendo grave (Figura 6). En cambio, el tratamiento con a-MSH RI con 100 pg o 10 pg/raton rapidamente mejoro la uveftis (p <0,05). Ademas, las dosis de 10 y 100 pg/raton tuvieron la misma eficacia. La dosis de 3 pg/raton de a-MSH RI no redujo ni inhibio la enfermedad.
Ejemplo 8
Efecto de a-MSH retroinversa en los niveles de cAMP
Se examinaron los niveles de cAMP en celulas de melanoma B16-F1 despues del tratamiento con a-MSH natural, a-MSH RI o peptido testigo aleatorizado. La lrnea celular de melanoma B16-F10 expresa una gran cantidad de receptores MCR1 (3000-4000 receptores/celula) en comparacion con las lrneas celulares de macrofagos que expresan solo 100-200 receptores/celula. Por lo tanto, seleccionamos examinar el efecto del tratamiento con a-MSH RI en la lrnea celular de melanoma. Las celulas de melanoma B16-F1 murino se trataron con a-MSH natural, a-MSH RI o peptido aleatorizado testigo con concentraciones 1 pg/ml-1 pg/ml. Despues de 30 min, las celulas se lisaron y se midieron los niveles de cAMP intracelular mediante un enzimoinmunoanalisis. El tratamiento testigo con forskolina (100 pM), comunmente usada para elevar los niveles de cAMP, de las celulas exhibio un aumento en cAMP (3455,39 ± 406,6 DT). Los niveles de cAMP se elevaron significativamente de manera dependiente de la dosis en celulas tratadas con a-MSH natural en comparacion con celulas no tratadas (Figura 7A). El analogo de a-MSH RI tambien aumento significativamente el nivel de cAMP de manera dependiente de la dosis en comparacion con las no tratadas o con peptido testigo aleatorizado. Sin embargo, fue necesaria una concentracion de a-MSH RI (100 ng/ml) mas alta para aumentar el cAMP en comparacion con a-MSH natural que aumento el cAMP con una concentracion de 10 pg/ml. Esta diferencia en la concentracion del peptido necesaria para aumentar los niveles de cAMP puede resultar de la afinidad de union por el receptor MCR1.
Ejemplo 9
Variacion de secuencia y efectos sobre los niveles de cAMP y la union a MC1R
La MSH se une a MC1R, MC3R, MC4R y MC5R, MC1R es una de las dianas deseadas para las enfermedades mediadas por la inmunidad. La MSH retroinversa (MSH RI) se ha genomanipulado para potenciar la estabilidad en plasma (Figura 17) y la selectividad por MC1R, pero su afinidad por MC1R es 11 veces mas baja que la del peptido de MSH natural (Tabla 1). Para restaurar la afinidad por MC1R, injertamos modificaciones en MSH RI para mejorar la afinidad por MC1R de MSH. De los tres reemplazos de la secuencia SYSME en el extremo N, acilo graso, ácido fenil butftico y la secuencia SSIIS, que aumentan la afinidad por MC1R de MSH, solo el ultimo condujo a mejoras significativas en MSH RI. La formacion de analogos por barrido de D-alanina de RI-MSH exhibio una relacion de actividad de estructura similar a la formacion de analogos por barrido de alanina de MSH, pero el barrido de inversion estereoqmmica de la region de union a MC1R de 4 residuos principal sugiere diferencias significativas entre MSH y RI-MSH. Ademas, la sustitucion de ciclohexilalanina en el residuo fenilalanina clave mejoro la MSH RI, pero no la union de MSH a MC1R. La combinacion de las sustituciones de ciclohexilalanina y SSIIS condujo a la restauracion completa de la afinidad de MSH por MC1R, mientras se conservo la configuracion retroinversa fundamental para la estabilidad mejorada y la mayor selectividad por MC1R de RI-MSH.
Se preparo un conjunto de analogos de barrido de alanina (peptidos 804-816) de MSH retroinversa (MSH RI) y se sometio a prueba para determinar la induccion de cAMP en celulas de melanoma murino B16/F1 y humano M624. A continuacion, un subconjunto basado en los resultados de cAMP se sometio a prueba para determinar la union a MC1R. Los valores de Ki observados para la union a MC1R se muestran en la Tabla 1.
Las celulas de melanoma B16-F1 murino se trataron con a-MSH natural, a-MSH RI, peptido aleatorizado testigo, KPV o peptidos sustituidos con alanina de a-MSH RI con 1 pg/ml (Figura 7B). El tratamiento testigo con forskolina de las celulas (100 pM) exhibio un aumento en cAMP (3294,82 ± 54,53). Los niveles de cAMP se elevaron significativamente en celulas tratadas con a-MSH natural y a-MSH RI en comparacion con celulas no tratadas, tratadas con peptido aleatorizado o KVP. Los peptidos sustituidos con alanina designados 810, 811 y 812 no exhibieron aumento en la actividad de cAMP y exhibieron niveles de cAMP equivalentes a los de las celulas no tratadas, tratadas con aleatorizado peptido o KPV. Los peptidos designados 810, 811 y 812 tienen sustituciones de alanina en la secuencia de tetrapeptido principal central (region D-Trp D-Arg D-Phe D-His; AA 5-8) que se sugirio que estaba implicada en la union de a-MSH natural al receptor de melanocortina y su actividad biologica. Las sustituciones de alanina en las regiones del extremo N o C del peptido de a-MSH RI no afectaron la acumulacion de cAMP en las celulas de melanoma. Las sustituciones de alanina en los aminoácidos metionina e histidina (807 y 809) tambien exhibieron una reduccion en la acumulacion de cAMP, aunque no tan grande como la observada en la secuencia del tetrapeptido principal (810, 811 o 812). Los residuos en el tetrapeptido principal (wrfh) y en menor medida, la metionina 4 de MSH RI son esenciales para la union a MC1R.
Otro medio que se mostro que aumenta la afinidad de MSH por MC1R se ha demostrado usando selecciones basadas en visualizacion en fagos de las secuencias variantes de MSH. A continuacion, se hallo una secuencia altamente selectiva para MC1R (MS05) mediante recombinacion del peptido seleccionado por visualizacion en fagos y una porcion de la secuencia MSH genitora, que proporciono una afinidad subnanomolar por MC1R. De manera inesperada, la version retroinversa de esta secuencia exhibio una afinidad mas alta por MC1R (1 nM, Tabla 1 peptido 886) que MSH RI (4 nM), aunque se informo que MS05 tiene una afinidad ligeramente mas baja por MC1R que MSH (Ki 0,865nM frente a 0,557 nM para MSH).
La sustitucion de varios residuos aminoaddicos no naturales que incorpora diferencias ligeras en la carga y estructura de cada uno en las posiciones de MSH RI mostro que MC1R tolera solo cambios altamente conservadores. Todos menos 3 exhibieron una union menor o equivalente. Dos cambios proporcionaron un aumento significativo en la afinidad por MC1R: la sustitucion de la D-fenilalanina por D-ciclohexilalanina (D-Cha, peptido 869; 2,2 nM Ki) y la sustitucion de la D-metionina por D-butionina (peptido 878, 2,3 nM Ki). Se llevo a cabo una sustitucion con L-ciclohexilalanina y se hallo que inhibe ligeramente la union a MC1R (peptido 892, Ki de 0,51 nM frente a 0,41 nM para MSH). De manera inesperada, la combinacion de las sustituciones de butionina y ciclohexilalanina no logro producir un aumento mas significativo en la afinidad por MC1R (peptido 890, 1,9 nM Ki). Sin embargo, la combinacion del cambio que comprende la sustitucion de la secuencia de extremo N retroinversa de MS05 (siiss) por la secuencia del extremo C (emsys) y D-ciclohexilalanina por D-Phe en MSH RI produjo una mejora mayor de la union que cada uno de los cambios solo, los que indica que los efectos son sinergicos. El peptido resultante (891) exhibio un Ki para MC1R que fue indistinguible con respecto a MSH. Aunque este y los otros cambios tambien produjeron aumentos en la afinidad para los otros MCR, los valores de Ki estaban todavfa en el intervalo micromolar, lo que indica que la selectividad de MSH RI se conservo en gran medid. Los cambios se ilustran en la Figura 20. Un ensayo de union competitiva representativo se muestra en la Figura 21. Vease la Tabla 1 para obtener los valores de Ki observados.
Ejemplo 10
El tratamiento con a-MSH RI reduce las puntuaciones de enfermedad clmicas en EAE
Se evaluo el efecto de la administracion de a-MSH natural y el analogo de a-MSH RI en un modelo de EAE progresiva cronica en raton. Se inmunizaron ratones C57BL/6 hembra con 200 |jg de peptido MOG 35-55 emulsionado con CFA. La toxina de Pertussis se administro el dfa 0 y 2. Los ratones se monitorizaron diariamente para detectar signos de smtomas clmicos y perdida de peso. Los ratones se evaluaron para detectar smtomas de paralisis a partir del dfa 8 y se puntuaron con un sistema de calificacion de 0-5. La aparicion de los smtomas clmicos de paralisis se manifesto alrededor del dfa 9-11 en la mayona de los ratones (Figura 8A). Se inicio el tratamiento diario intraperitoneal (i.p.) con 100 jg/raton de peptido de a-MSH o a-MSH RI o testigo PBS el dfa 10. Los ratones tratados con 100 jg de a-MSH RI exhibieron una reduccion significativa en la puntuacion de enfermedad clmica media en comparacion con el testigo PBS (Figura 8A). La significacion de p<0,05 se alcanzo en los dfas 14-22 en a-MSH RI en comparacion con el testigo con vehmulo PBS. Sin embargo, el tratamiento con el peptido de a-MSH natural no tuvo un efecto sobre la induccion ni progresion de la enfermedad. El porcentaje de incidencia maximo de la enfermedad en el grupo tratado con a-MSH RI de ratones (20 %) tambien se redujo en comparacion con los grupos de ratones tratados con PBS (80 %) o a-MSH natural (75 %).
Ejemplo 11
Variacion de la dosificacion de a-MSH RI en EAE
El efecto terapeutico de a-MSH RI fue manifiesto con la dosis de 100 jg/raton. Se sometio a prueba el tratamiento con 100 jg/raton y 30 jg/raton de peptido de a-MSH o a-MSH RI en el modelo de MOG EAE en raton. Se inicio el tratamiento diario por i.p. el dfa 10 despues de la inmunizacion con MOG. Se agrego tratamiento diario con dexametasona (2 mg/kg) como testigo terapeutico. Los ratones que se trataron con 100 jg de a-MSH RI exhibieron de manera repetida una reduccion en la puntuacion de enfermedad clmica media en comparacion con el testigo PBS (Figura 9). Sin embargo, la dosis de 30 jg/raton de a-MSH RI no tuvo un efecto significativo en la reduccion de las puntuaciones clmicas medias. El tratamiento con dexametasona tambien exhibio reduccion en las puntuaciones de la enfermedad a lo largo de todo el transcurso de la enfermedad. Aunque los ratones tratados con a-MSH natural tuvieron una puntuacion clmica media mas baja que el PBS, los ratones tratados con a-MSH no exhibieron una eficacia similar que los ratones tratados con a-MSH RI o dexametasona. El porcentaje de incidencia de la enfermedad en el grupo tratado con a-MSH RI alcanzo un maximo de 35 % y el con dexametasona de 40 % en comparacion con los ratones tratados con PBS que exhibieron una incidencia maxima de 75 % de la enfermedad (Figura 9). Estos datos indican que el tratamiento con el analogo peptfdico de a-MSH RI en EAE disminuye significativamente las puntuaciones de enfermedad clmica medias y la incidencia de la enfermedad.
Ejemplo 12
Histologfa del SNC
Se recogieron las medulas espinales el dfa 24 despues de la induccion de la enfermedad en ratones tratados con PBS y a-MSH RI. Se usaron las tinciones con hematoxilina y eosina de secciones de medula espinal para evaluar el grado de inflamacion y la cantidad de lesiones. La patologfa de EAE muestra areas focales de infiltracion de celulas inflamatorias y desmielinacion. La evaluacion histopatologica de la medula espinal demostro la eficacia del tratamiento con a-MSH RI en el modelo de MOG EAE. Se muestra trozos de ratones representativos de la puntuacion clmica media de cada grupo de tratamiento en las Figuras 10a-10d. Los datos muestran infiltrados inflamatorios extensos en el grupo de ratones tratados con PBS en comparacion con ratones tratados con a-MSH RI que caredan de area focal de inflamacion.
Ejemplo 13
Medicion de TNF-a y IL-10 en el bazo durante la progresion de la enfermedad
Se examino el mecanismo de accion de los efectos del tratamiento con a-MSH RI en EAE. Se ha informado que la a-MSH natural tiene un efecto sobre los monocitos/macrofagos al reducir los niveles de TNF-a y aumentar la IL-10. Se evaluaron los niveles de ARNm de TNF-a y IL-10 en el bazo de ratones sensibilizados con m Og tratados con a-MSH RI o a-MSH natural mediante PCR cuantitativa. Los ratones se inmunizaron con MOG p35-55 y se inicio el tratamiento diario con a-MSH RI o a-MSH natural el dfa 10. Se recogieron muestras de bazo de los ratones los dfas 1, 4 y 7 despues del inicio del tratamiento diario. Los datos muestran que el tratamiento con a-MSH RI y a-MSH disminuyo significativamente (p< 0,001) TNF-a en comparacion con el testigo PBS despues de 7 dfas de tratamiento diario (Figura 11e). Sin embargo, no hubo cambio significativo en el nivel de TNF-a en puntos de tiempo previos (Dfa 1 y Dfa 4; Figuras 11a y 11c). Los niveles de ARNm de IL-10 tambien se habfan reducido en el punto de tiempo de Dfa 7 en los grupos de tratamiento con a-MSH RI y aMSH en comparacion con el testigo PBS (Figura 11f). Sin embargo, no se detecto ninguna diferencia en los niveles de ARNm de IL-10 en puntos de tiempo anteriores (Figuras 11b y 11d). Aunque el tratamiento con a-MSH natural no redujo las puntuaciones de enfermedad clmica media ni el porcentaje de incidencia de la enfermedad, en este estudio el tratamiento con a-MSH redujo los niveles de ARNm de TNF-a y IL-10 en el bazo en comparacion con el testigo PBS el Dfa 17 de la progresion de la enfermedad. El analogo de a-MSH RI es capaz de reducir los niveles de ARNm de TNF-a en el bazo despues del tratamiento diario.
Ejemplo 14
Efecto de a-MSH RI en la respuesta de memoria al peptido MOG
Se evaluaron los efectos de tratar a los ratones con a-MSH o a-MSH RI in vivo en las respuestas de memoria al peptido MOG 35-55. Se sensibilizo a los ratones con peptido MOG35-55 y en los dfas 2-8 los ratones se trataron con PBS, 100 |jg de a-MSH o 100 |jg de a-MSH RI. El dfa 9, se recogieron el bazo y los ganglios linfaticos drenantes y se analizaron para determinar las respuestas de memoria al peptido MOG35-55 in vitro mediante la incorporacion de [3H] timidina. Los datos muestran una disminucion significativa en las respuestas proliferativas de las celulas del bazo al peptido MOG35-55 en el grupo de ratones con a-MSH en comparacion con el grupo tratado con PBS (Figura 12a). El grupo tratado con a-MSH RI exhibio una reduccion ligera en las respuestas de memoria al peptido MOG35-55. Sin embargo, las respuestas de memoria al peptido MOG en la poblacion de celulas de ganglio linfatico no exhibieron una diferencia significativa en la reactividad entre los grupos tratados con PBS, a-MSH y a-MSH RI (Figura 12b).
Se recogio el sobrenadante celular de las celulas del bazo que se estimularon con el peptido MOG35-55 in vitro de cada uno de los grupos de tratamiento in vivo (no expuestos, PBS, a-MSH, a-MSH RI). Los niveles de citocina se evaluaron a traves de una matriz de perlas citometricas mediante citometna de flujo. Los datos muestran una disminucion en los niveles de TNF-a, IFNy, IL-6 y MCP-1 en los grupos tratados con a-MSH y a-MSH RI en comparacion con el grupo tratado con PBS (Figuras 12c y 12d). Los niveles de citocina del sobrenadante de celulas del bazo en los grupos tratados con a-MSH y a-MSH RI fueron similares a los niveles de citocina de celulas del bazo de ratones no sensibilizados.
Por lo tanto, el tratamiento con el peptido a-MSH RI tuvo un efecto en las respuestas de memoria de citocina al peptido MOG, pero no afecto las respuestas de proliferacion de linfocito T.
Ejemplo 15
Efectos de tratar a los ratones con a-MSH o a-MSH RI durante la fase de sensibilizacion de EAE
Los ratones se inmunizaron con peptido MOG 35-55 y en los dfas 2-8 se trataron a diario con testigo de vetnculo PBS, a-MSH o a-MSH RI. Se recogieron los bazos de ratones individuales el dfa 9 y se cuantifico la expresion de ARNm citocina usando PCR en tiempo real. La Figura 13 muestra los niveles de expresion de ARNm de TNF-a y IL-10 en el bazo de ratones tratados con PBS, a-MSH o a-MSH RI en la fase de sensibilizacion de la enfermedad. Los ratones no expuestos que no se inmunizaron con el peptido MOG se usaron para cuantificaron los niveles iniciales de ARNm de TNF-a y iL-10. El tratamiento con a-MSH o a-MSH RI disminuyo los niveles de ARNm de IL-10 y TNF-a en comparacion con el testigo de vetnculo PBS.
Tambien se recogieron muestras de suero sangumeo el dfa 9 del estudio y se evaluaron los niveles de citocina: TNF-a, MCP-1, IL-12, IL-10 y IL-6 (Figuras 13c y 13d). Los datos muestran una disminucion en MCP-1 y IL-6 en los grupos tratados con a-MSH y a-MSH RI en comparacion con el grupo con testigo PBS. Se disminuyo significativamente el MCP-1 (p<0,01) en el grupo tratado con a-MSH RI en comparacion con el testigo PBS. Ademas, el grupo tratado con a-MSH Ri exhibio una disminucion en TNF-a y IL-12 en comparacion con el grupo con PBS. No hubo diferencia en los niveles de IL-10 en suero entre los tres grupos tratados.
Ejemplo 16
La a-MSH RI no tiene efecto sobre los marcadores de macrofagos
Se examinaron macrofagos esplenicos CD11b+ y F4/80+ para determinar los niveles de expresion de CD86, CD40 y CD14 mediante citometna de flujo despues de 7 dfas de dosificacion diaria con a-MSH o a-MSH RI en ratones inmunizados con MOG 35-55. Los datos no muestran ninguna diferencia en los niveles de expresion de CD86, CD40 ni CD14 en la poblacion de macrofagos esplenicos CD11b+ o F4/80+ en ratones tratados con a-MSH o a-MSH RI (Figura 14). Los resultados mostraron un hallazgo similar cuando se examinaron monocitos sangumeos para determinar los niveles de expresion de CD86, CD40 y CD14 (no se muestran los datos).
Ejemplo 17
Efectos en el modelo de inflamacion por LPS en raton
Se ha informado que la a-MSH natural inhibe la inflamacion al reducir la produccion de TNF-a a traves de la estimulacion de los receptores de melanocortina (MCR), en particular, el receptor de melanocortina 1. La LPS estimula los mediadores inflamatorios tales como TNF-a, MCP-1, IL-6 e IFNy y se ha usado como un modelo de inflamacion aguda. Se examino si un analogo de a-MSH puede suprimir las citocinas inflamatorias en un modelo de inflamacion por LPS de raton. Se determinaron los niveles de expresion de MC1R en el bazo y macrofagos peritoneales despues de la administracion de LPS. Se inyecto LPS a ratones C57BL/6 i.p. y en varios puntos de tiempo posteriores a la inyeccion con LPS se recogieron el bazo y macrofagos peritoneales para analisis. Los datos no muestran ninguna diferencia discernible en los niveles de expresion de ARNm de MC1R entre cualesquiera de los puntos de tiempo en macrofagos peritoneales (Figura 15a). Sin embargo, la administracion de LPS aumento los niveles de ARNm de MC1R por encima del de los ratones no expuestos que no recibieron exposicion a LPS. En el bazo, los niveles de ARNm de MC1R se elevaron 30 minutos despues de la inyeccion con LPS y despues disminuyeron una hora despues de la inyeccion (Figura 15b). El LPS, de manera similar, aumento los niveles de ARNm de MC1R en el bazo por encima de los niveles iniciales en ratones no expuestos.
Los datos que demuestran la expresion de ARNm de MC1R en el bazo y macrofagos peritoneales indicaron que 30 minutos despues de la exposicion a LPS podna ser el punto de tiempo optimo para el tratamiento con a-MSH o el analogo de a-MSH RI. Se inyecto i.p. LPS a ratones C57BL/6 y 30 minutos despues se administro i.p. a-MSH natural o el analogo de a-MSH RI 891 a dosis que variaban de 5 mg/kg a 0,156 mg/kg. El analogo de a-MSH RI 891 es un analogo de a-MSH RI en el que se agregaron los aminoácidos D d-Cha y hsiiss a la secuencia peptfdica principal. Se mostrado que el analogo de a-MSH RI 891 tiene una afinidad de union aumentada por MC1R de raton y potencia aumentada para estimular cAMP (no se muestran los datos). Los resultados mostraron una reduccion significativa en los niveles de TNF-a y IL-10 en los grupos tratados con a-MSH natural en comparacion con testigo de vetnculo PBS (Figuras 16a y 16c). El MCP-1 no fue afectado por el tratamiento con a-MSH natural (Figura 16b). El tratamiento de ratones expuestos a LPS con el analogo de a-MSH RI 891 exhibio resultados similares con una disminucion significativa en TNF-a y IL-10 sin ningun efecto sobre los niveles de MCP-1 en comparacion con el testigo de vetnculo (Figuras 16d-16f). Las dosis mas bajas de a-MSH natural y analogo de a-MSH RI 891 exhibieron la mayor supresion de las citocinas inflamatorias. El testigo positivo de dexametasona exhibio de manera constante supresion de los niveles de TNF-a y MCP-1.
Ejemplo 18
Estabilidad de peptidos en plasma
Se ha estimado que la semivida en suero de a-MSH natural es de aproximadamente 10 minutes. A pesar de esta semivida limitada, el peptido todav^a es capaz de desencadenar actividades antiinflamatorias potentes. Sin embargo, se necesitan analogos de a-MSH mas estables para aumentar la potencia de las actividades antiinflamatorias y para desarrollarlos adicionalmente como agente terapeutico. Se sintetizo un analogo de aminoácido D de a-MSH natural (denominado a-MSH retroinversa o a-MSH RI) y es mas estable que la a-MSH natural. La forma de aminoácido D de los peptidos es mas resistente a la proteolisis y se metaboliza a menor velocidad que las formas de aminoácido L de los peptidos.
Se determino la estabilidad de a-MSH RI mediante incubacion en plasma o PBS in vitro a 37 °C durante 24 horas. Se tomaron alteuotas y las protemas se precipitaron con 2 volumenes de acetonitrilo. La a-MSH se uso como testigo y bradicinina como patron interno. Despues de la centrifugacion, las muestras se congelaron a -80 °C hasta el analisis LC/MS/MS (MRM) usando una separacion por columna C18 y modo de ionizacion por electropulverizacion positiva. Segun se muestra en la Figura 17a, la MSH exhibio una semivida de aproximadamente 3 horas en plasma, pero fue estable en PBS. Sin embargo, la a-MSH RI fue estable en PBS y plasma, sin degradacion detectable durante 24 horas.
Los perfiles farmacocineticos (PK, por sus siglas en ingles) de a-MSH y a-MSH RI sugieren que a-MSH RI tiene una semivida en suero mas extensa que la a-MSH natural (Figura 17b). Los ratones tratados con una unica dosis de 100 |jg de a-MSH RI o a-MSH teman niveles medibles en suero de a-MSH RI despues de 24 h, pero no habfa niveles detectables de a-MSH 120 minutos despues del tratamiento (n=5).
Ejemplo 19
Efectos de union de peptidos retroinversos.
Un tetrapeptido de MSH principal que contiene D-Phe (HfRW) es suficiente para producir union significativa a MC1R (20-50 nM Ki). Sin embargo, se observa muy escasa union con la version retroinversa del mismo tetrapeptido (wrFh, 883, Ki>30uM, Tabla 1), lo que muestra que la retroinversion del peptido no lograr hacer contacto completo con el receptor de la misma forma que HfRW. La adicion de grupos acilo grasos en el extremo N de HfRW mejora selectivamente su union a MC1r , proporcionando una afinidad comparable a la de MSH. Esto se observo para el peptido estearil-HfRW en MC1R (1,3 nM, peptido 820). La adicion de un grupo diaminohexano estearilo al wrFh retroinverso (peptido 882) mejora la union a MC1R (120 nM, >250 veces) y hasta una medida comparable con la adicion de ácido estearico al extremo N de HfRW (80 veces), pero no logra la afinidad observada para MSH RI (4,1 nM), lo que indica nuevamente que otros residuos en MSH RI tienen un papel mas importante en la union de MSH RI a Mc 1r que con MSH.
Ejemplo 20
Efectos estereoqmmicos en la union de peptidos retroinversos.
La estereoqmmica de los residuos en el tetrapeptido retroinverso principal tiene un efecto significativamente diferente en la union a MC1R que en MSH de forma L. Segun se muestra en la Figura 19, la inversion de los residuos del tetrapeptido principal en MSH RI a la forma L (peptidos 884, 893-895) redujeron todos la afinidad del peptido por MC1R. De manera sorprendente e inesperada, la inversion de D-Phe a L-Phe en la secuencia RI causo una reduccion de 20 veces en la union, mientras que se ha informado que el cambio correspondiente en HFRW (L-Phe a D-Phe) mejora la union tanto como 400 veces. Para los otros residuos, se hallo que la inversion estereoqmmica tiene un efecto menor en MSH RI que en el peptido HfRW principal, lo que indica nuevamente que la importancia relativa de cada residuo en el tetrapeptido principal es menor en MSH RI que en el tetrapeptido HfRW.
Ejemplo 21
Efectos de MSH retroinversa con cubierta de extremo.
Otra posible via para lograr mayor afinidad por MC1R se basa en la observacion de que cubrir el extremo del peptido HfRW con ácido fenil butmco aumenta de manera selectiva y potente la afinidad de HfRW por MC1R (Ki=6 pM). Sin embargo, no se observo aumento en la afinidad de MSH RI truncada que lleva una fenilpropilamida en el extremo C (peptido 847), con un Ki de 150 nM observado para el peptido truncado en el residuo histidina (peptido 847int) y su aducto con aminopropil-fenilo (peptido 847, Tabla 1), lo que demuestra que con MSH RI la union se altera que deshabilita la interaccion simultanea de la secuencia del tetrapeptido y el sitio de interaccion aromatico postulado cerca del elemento de union a histidina en MC1R.
Ejemplo 22
Smtesis de un conjugado de toxina de MSH retroinversa.
Se genera una version modificada del peptido 891 (Tabla 1) en el que se anexa una cistema al extremo N mediante qmmica de Fmoc. Se sintetiza un conjugado de monometil auristatina E (MMAE) que contiene un enlazador de valina-citrulina sensible a proteasa con resto maleimido-caproilo para el acoplamiento a tioles segun Doronina et al. (2003) Nature Biotechnol. 21:778-784, incorporado en la presente memoria por referencia. El conjugado de peptido y MMAE se incuba en una disolucion de 25mM Na fosfato, 2mM EDTA pH 7 durante 14 h a 25 °C y el producto se purifica mediante HPLC de fase inversa C18 (RP-HPLC).
Ejemplo 23
Efecto de analogos de a-MSH RI en cAMP en celulas de melanoma murinas
Tanto a-MSH natural como a-MSH RI aumentan los niveles de cAMP en celulas de melanoma murinas. Se generaron analogos peptfdicos de a-MSH RI para determinar si las modificaciones en la secuencia principal del peptido de a-MSH RI elevanan los niveles de cAMP en comparacion con el peptido de a-MSH RI. Se llevo a cabo un experimento de respuesta a dosis para los analogos de a-MSH RI generados en el ensayo de cAMP usando celulas de melanoma B16-F1 murinas.
Cultivos celulares in vitro: Se cultivaron celulas de melanoma B16-F1 murinas en placas de 96 pocillos con 5x104 celulas/pocillo durante toda la noche en medios con L-glutamina y pen/estrep y FBS. Los medios se retiraron y se agregaron nuevos medios con IBMX a las celulas durante 1 h. A continuacion, las celulas se trataron con a-MSH RI o analogos peptfdicos de a-MSH RI (890, 891, 892, 893, 894 o 895). Las celulas se lisaron despues de 30 min usando un kit de ensayo de cAMP y el sobrenadante se uso en el ensayo. 10 pM de Forskolina sirvieron como testigos positivos.
Niveles de cAMP: Se midio el cAMP intracelular usando un kit de ensayo de competencia con cAMP (Amersham Biosciences). Todas las muestras de lisado celular se diluyeron 1:100 para el analisis.
Peptidos:
869 vpkGwr(d-Cha)hemsys
872 vpkGwrfremsys
880 vpkGwrFhsiiss
878 vpkGwrfhe(d-butionina)sys
886 RI-MS05 vpkgwrfhsiiss
890 vpkGwr(d-Cha)he(d-Butionina)sys
891 vpkGwr(d-Cha)hsiiss
892 SYSMEH(Cha)RWGKPV
893 vpkGWrfhemsys
894 vpkGwRfhemsys
895 vpkGwrfHemsys
Resultados: Las celulas B16-F1 de melanoma murino se trataron con a-MSH RI o analogos de a-MSH RI (869, 872, 880, 878, 886 y 890-895) en un intervalo de concentracion de 10' 4-10' 11 M. Niveles de cAMP de celulas tratadas con a-MSH RI o analogos de a-MSH RI. La mayon a de los analogos de a-MSH RI exhibieron valores de CE50 mejorados en comparacion con a-MSH RI, con la excepcion del analogo 894. Los analogos 891, 892 y 886 exhibieron la mayor mejora en los valores CE50 en el ensayo de cAMP en comparacion con el peptido de a-MSH RI. En resumen, los analogos de a-MSH RI exhibieron una respuesta a dosis y valores de CE50 mejorados en comparacion con el peptido de a-MSH RI. Vease la Figura 22 para obtener datos graficos y la Tabla 2 para obtener los datos de CE50. Tabla 2
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto que se une selectivamente al receptor de melanocortina 1 (MC1R), dicho compuesto comprende un polipeptido que tiene la secuencia:
Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaag Xaai o Xaan Xaai 2 Xaai 3,
en donde
Xaai es D-Val;
Xaa2 es D-Pro;
Xaa3 es D-Lys, D-Orn o D-Nle;
Xaa4 es Gly;
Xaa5 es D-Trp, D-3-benzotienil-Ala, D-5-hidroxi-Trp, D-5-metoxi-Trp o D-Phe;
Xaa6 es D-Arg;
Xaa7 es D-Cha, D-Phe, D-4-fluoro-Phg, D-3-piridil-Ala, D-Thi, D-Trp o D-4-nitro-Phe;
Xaa8 es D-His;
Xaag es D-Glu, D-Asp, D-citrulina o D-Ser;
Xaai o es D-Met, D-butionina o D-Ile;
Xaai i es D-Ser o D-Ile;
Xaai 2 es D-Tyr o D-Ser; y
Xaai 3 es D-Ser;
o una sal farmaceuticamente aceptable de este.
2. El compuesto de la reivindicacion i, dicho compuesto comprende un polipeptido que tiene la secuencia:
Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaag Xaai o Xaai i Xaai 2 Xaai 3,
en donde
Xaai es D-Val;
Xaa2 es D-Pro;
Xaa3 es D-Lys, D-Orn o D-Nle;
Xaa4 es Gly;
Xaa5 es D-Trp;
Xaa6 es D-Arg;
Xaa7 es D-Cha, D-Phe o D-Thi;
Xaa8 es D-His;
Xaag es D-Glu o D-Ser;
Xaai o es D-Met, D-butionina o D-Ile;
Xaai i es D-Ser o D-Ile;
Xaai 2 es D-Tyr o D-Ser; y
Xaai 3 es D-Ser;
o una sal farmaceuticamente aceptable de este.
3. El compuesto de la reivindicacion 1 o 2, dicho compuesto comprende un tetrapeptido principal que tiene la secuencia:
D-Trp D-Arg Xaa D-His (SEQ ID NO: 2),
en donde
Xaa es D-Cha o D-Phe;
o una sal farmaceuticamente aceptable de este.
4. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, dicho compuesto comprende un polipeptido de extremo C que tiene la secuencia:
D-Ser D-Ile D-Ile D-Ser D-Ser (SEQ ID NO: 3); o una sal farmaceuticamente aceptable de este.
5. Un compuesto que se une selectivamente al receptor de melanocortina 1 (MC1R), dicho compuesto comprende un polipeptido que tiene la secuencia:
D-Val D-Pro D-Lys Gly D-Trp D-Arg D-Cha D-His D-Glu D-Met D-Ser D-Tyr D-Ser;
D-Val D-Pro D-Lys Gly D-Trp D-Arg D-Phe D-Arg D-Glu D-Met D-Ser D-Tyr D-Ser;
D-Val D-Pro D-Lys Gly D-Trp D-Arg D-Phe D-His D-Glu D-buthionine D-Ser D-Tyr D-Ser;
D-Val D-Pro D-Lys D-Gly D-Trp D-Arg D-Phe D-His D-Ser D-Ile D-Ile D-Ser D-Ser;
D-Val D-Pro D-Lys Gly D-Trp D-Arg D-Cha D-His D-Glu D-buthionine D-Ser D-Tyr D-Ser;
D-Val D-Pro D-Lys Gly Trp D-Arg D-Phe D-His D-GIu D-Met D-Ser D-Tyr D-Ser; or
D-Val D-Pro D-Lys Gly D-Trp D-Arg D-Phe His D-Glu D-Met D-Ser D-Tyr D-Ser;
o una sal farmaceuticamente aceptable de este.
6. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde dicho polipeptido esta PEGilado.
7. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde dicho compuesto exhibe al menos una de las siguientes propiedades:
capacidad para activar selectivamente MC1R;
estabilidad en plasma in vitro; o
resistencia a la degradacion por proteasa.
8. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde dicho compuesto se une selectivamente a MC1R, pero no a MC3R, MC4R ni MC5R.
9. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para su uso como un medicamento.
10. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde dicho compuesto esta conjugado con un resto biologicamente activo.
11. Una composicion farmaceutica que comprende el compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 y un excipiente farmaceuticamente aceptable.
12. La composicion farmaceutica segun se reivindica en la reivindicacion 11 o el compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, para su uso en el tratamiento de una afeccion seleccionada del grupo que consiste en inflamacion, enfermedad autoinmunitaria, melanoma, reduccion de rechazo de trasplante e inhibicion de rechazo de trasplante.
13. La composicion farmaceutica o el compuesto para su uso segun la reivindicacion 12, en donde dicha enfermedad o afeccion autoinmunitaria se selecciona del grupo que consiste en, o se asociada con uno de las siguientes: esclerosis multiple, diabetes tipo I, anemia aplasica, enfermedad de Grave, enfermedad celfaca, enfermedad de Crohn, lupus, artritis, osteoartritis, uveftis autoinmunitaria, miastenia gravis, enfermedad intestinal inflamatoria, artritis reumatoide, alergia, ateroesclerosis, psoriasis, gastritis y cardiopatfa isquemica.
14. Una composicion farmaceutica que comprende un excipiente farmaceuticamente aceptable y una cantidad terapeuticamente eficaz de un conjugado que comprende el compuesto segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 conjugado con una carga eficaz antitumoral, para su uso en el tratamiento del melanoma.
15. La composicion farmaceutica para su uso segun la reivindicacion 14, en donde dicha carga eficaz antitumoral es un radionuclido, un radiosensibilizador, un fotosensibilizador, un agente quimioterapeutico o una toxina.
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