ES2327986T3 - Liberacion intranuclear de compuestos dirigida por la proteina de choque termico de 70 kd. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento in vitro para administrar un compuesto seleccionado entre el grupo constituido por una proteína, un péptido, un polinucleótido o un agente terapéutico al interior de un núcleo de una célula o células, comprendiendo dicho procedimiento juntar dicho compuesto con Hsp70, o un fragmento de Hsp70 que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC DE ID Nº: 2 o la SEC DE ID Nº: 3, para formar un complejo de Hsp70, y proporcionar dicho complejo de Hsp70 de forma exógena a dicha célula o al entorno que rodea dicha célula de manera que el complejo de Hsp70 se importa al interior de dicho núcleo de una célula o células.
Description
Liberación intranuclear de compuestos dirigida
por la proteína de choque térmico de 70 kD.
La presente invención se refiere a la liberación
intracelular, preferiblemente la liberación intranuclear, de
compuestos usando la proteína de choque térmico Hsp70
Las proteínas de choque térmico ("Hsp") son
una familia de proteínas moleculares de la chaperona de las que se
sabe desde hace mucho tiempo que juegan papeles esenciales en una
multitud de procesos intra e intercelulares, que incluyen la
síntesis y plegamiento de las proteínas, el tráfico vesicular, y el
procesamiento y presentación de antígenos. Las Hsp están entre las
proteínas más conservadas conocidas, y transportan muchas de sus
actividades reguladoras mediante las interacciones
proteína-proteína. Hsp70 es un miembro de la familia
de las proteínas de choque térmico (Milner, C.M. y Campbell, R.D.
Immunogenetics 32: 242-251 (1990); Nº de Acceso del
Genbank M59828). Una de las funciones mejor caracterizadas de Hsp70
es ayudar en las translocaciones de las proteínas a través de las
membranas intracelulares en diferentes compartimentos de la
célula.
Se ha informado de la actividad de transporte
intracelular de las proteínas víricas tales como la proteína
estructural VP22 de VHS-1 (Elliott, y col., (1997)
Cell 88: 223-233) y la proteína Tat de VIH (Vives, y
col., (1997) J. Biol. Chem. 272: 16010-16017), así
como de las secuencias de péptidos derivadas del factor de
crecimiento de los fibroblastos del homeodominio de Antennapedia
(Hawiger, (1997) Curr. Opin. Immun. 9: 189-194), y
más recientemente del neuropéptido galanina (Pooga, y. col., (1998)
FASEB J. 12: 67-77). Se ha demostrado también la
liberación de los sustratos de las proteínas de alguno de estos
péptidos de transporte (Phelan, y col., (1998) Nature Biotechnology
16: 440-443; Fawell, y col., (1994) Proc. Natl.
Acad. Sci. 91: 664-668; Rojas, y col., (1998) Nature
Biotechnology 16: 370-375).
Las Hsp sirven también numerosas funciones clave
en la respuesta inmune, y en los últimos años ha aumentado el
interés en la caracterización de la naturaleza de las Hsp en la
generación de la inmunidad protectora. Una serie de estudios
recientes (Roman, y col., (1996) Immunology 88:
487-492; Suzue, y col., (1996) J. Immunol. 156:
873-879) demostró que la Hsp70 podría actuar como
una proteína vehículo para permitir la unión al péptido o al
sustrato de la proteína para entrar en el compartimiento endosómico
y acceder posteriormente a la ruta de procesamiento de MHC de tipo
II por los antígenos exógenos. Dicho tratamiento con los complejos
Hp70-péptido o las proteínas de fusión Hsp 70
podría estimular las respuestas de las células T proliferativas
cargo-específicas. Sin embargo, otros experimentos
que usaron Hsp70 derivada de células cancerosas dieron como
resultado respuestas CTL antitumorales específicas (Udono, y col.,
(1993) J. Exp. Med. 178: 1391-1396) sugirieron que
las Hsp usaron la ruta de procesamiento de MHC de tipo I. estos
datos implican que Hsp70 era capaz de cruzar la membrana plasmática
y entrar en el compartimiento citoplásmico de las células intactas.
Estudios anteriores (Hightower, y col. (1989) J. Cell Physiol. 138:
257-266) informaron de la liberación de Hsp de las
células axonales mediante un mecanismo no dependiente de choque
térmico, lo que apoya la observación de que algunos miembros de la
familia Hsp pueden cruzar las membranas plasmáticas de algunas
células.
Aunque los anteriores estudios implican una
capacidad de translocación de la membrana plasmática para Hsp70,
dicha actividad no se ha demostrado directamente. No se ha
demostrado si Hsp70 podría utilizarse o no para liberar las
proteínas a través de las membranas plasmáticas y nucleares. Hay una
necesidad de liberar compuestos, tales como proteínas o ADN, en los
núcleos celulares para modular la actividad celular.
Los solicitantes han demostrado que la proteína
de choque térmico de 70 KD humana puede translocarse a través de
las membranas celulares para alcanzar rápidamente la entrada
citoplásmica y nuclear. Además, las proteínas quiméricas compuestas
por péptidos Hsp70 fusionados con los aminoácidos
37-409 de la subunidad p50 de
NF-\kappaB (Meyer, R., y col., PNAS 88:
966-970 (1991), Nº de Acceso del Genbank M58603)
presentan también esta propiedad de translocación. Aunque se ha
informado de la actividad celular importante de diversos péptidos,
el transporte intranuclear requiere generalmente la presencia de
secuencias de localización nuclear específicas ("NLS"). Aunque
se sabe que el choque térmico induce un aumento de la síntesis y la
translocación nuclear de la proteína de choque térmico endógena
tras la activación del factor de choque térmico, los solicitantes
demuestran que la localización nuclear de la proteína de choque
térmico exógena puede aparecer sin choque térmico previo. Los
solicitantes han demostrado también que las propiedades de
transporte y localización nuclear de Hsp70 están retenidas en el
interior de un fragmento C terminal de 90 aminoácidos, se ha
demostrado el transporte intranuclear satisfactorio utilizando un
fragmento C terminal así como fragmentos mayores que abarcan más de
una región de unión con el péptido. El presente documento es la
primera evidencia que establece la capacidad de las proteínas de
fusión Hsp70 exógenas para cruzar la membrana celular, alcanzar la
entrada nuclear y ejercer una función biológica.
Por tanto, un objeto de la presente invención es
proporcionar un vehículo para la liberación de moléculas con
función biológica en los compartimentos celular y nuclear. Una
realización preferida de la presente invención utiliza Hsp70, o un
fragmento de Hsp70 tal como se describe en el presente documento,
como vehículo para dirigir la liberación de moléculas no invasivas,
tales como proteínas o ADN, que pueden modular la expresión
génica.
La proteína de choque térmico de 70 KDF (Hsp70)
es una proteína ubicua muy conservada implicada en el chaperonado
de las proteínas en diversos orgánulos celulares. Los solicitantes
demuestran en el presente documento que cuando se añade
exógenamente a las células, Hsp70 se importa fácilmente al interior
de ambos compartimentos citoplásmico y nuclear. Los solicitantes
han demostrado Hsp70 se puede usar para chaperonar compuestos al
interior de una célula o células. Hps70 se usó para liberar
NF-\kappaB, un regulador transcripcional clave de
las respuestas inflamatorias, al compartimiento nuclear. Los
solicitantes demuestran en el presente documento que una proteína
de fusión compuesta por un péptido C terminal de Hsp70 y los
aminoácidos 37-409 de la subunidad p50 de
NF-\kappaB dirigida al núcleo de células, se
uniría al ADN específicamente, y activaría la expresión de la Ig
kappa y la producción de TNF\alpha. La invención de los
solicitantes abarca el uso de Hsp70 como vehículo para la
liberación intracitoplásmica e intranuclear de proteínas o ADN para
modular la expresión génica y controlar de esta manera las
respuestas inmunes.
la fig. 1 muestra diversos tipos de células que
presentan actividad de recaptación de Hsp70 diferencial. Se
trataron diversas células con 10 \mug/ml de
Hsp70-FITC añadidos a los medios de cultivo. Se
tiñeron células de la sangre periférica humana con
anti-CD 14-PE a 37º como marcador de
células monocíticas, anti-CD19-PE
de células B, o anti-CD3-PE de
células T. Tras una hora de incubación a 37ºC, se lavaron las
células en PBS, se fijaron en parformaldehído al 2%, se lavaron de
nuevo y se volvieron a suspender en PBS para la visualización por
microscopía de barrido de láser confocal. Se usaron cantidades
equimoleculares de BSA-FITC en experimentos
paralelos como control. La fig. 1A muestra células 70Z/3 +
Hsp70-FITC, la fig. 1B muestra células 70z73 +
BSA-FITC; la fig. 1C muestra las PBL teñidas con
anti-CD14-PE +
Hsp70-FITC, la figura 1D muestra las PBL teñidas
con anti-CD14-PE +
BSA-FITC; la fig. 1E muestra las PBL teñidas con
anti-CD 19-PE +
Hsp70-FITC; y las fig. 1F muestra las células T de
la sangre periférica teñidas con
anti-CD3-PE + Hsp70;
la fig. 2 muestra la cinética de la recaptación
de Hsp70. La fig. 2a muestra la cinética de recaptación de
Hsp70-FITC por las células 70Z/3. Las células se
incubaron a 37ºC varias veces con Hsp70-FITC 1
\muM en RPMI completo. Las células se lavaron una vez en PBS para
separar la Hsp70-FITC libre, a continuación se
volvieron a suspender en PBS y se analizaron mediante fluorímetro.
Los puntos fueron experimentales y la curva se ajustó mediante un
programa de regresión modificado (XlLfit). La fig. 2B muestra la
dosis efecto en la recaptación de Hsp70 por las células 70Z/3. Se
incubaron las células durante una hora a 37ºC con diversas
concentraciones de Hsp70-FITC, a continuación se
lavaron y analizaron como en (A);
la fig. 3 muestra que la recaptación de
Hsp70-FITC no se vio afectada por azida pero se
inhibió a 4ºC. Las células 70Z/3 fueron tanto no tratadas (figura
3A) como pretratadas durante 30 minutos con azida de sodio al 0,05%
(figura 3B) antes de la incubación con Hsp70-FITC a
37ºC, o se preincubaron a 4ºC durante 30 minutos antes de la
adición de Hsp70-FITC y una hora más de incubación a
4ºC (figura 3C). Se añadió BSA-FITC a las células
durante 1 hora a 37ºC como control (figura 3D). La
Hsp70-FITC internalizada no se localiza
simultáneamente con transferrinas. Se trataron las células con
Hsp70-FITC y transferrina conjugada con Rojo Texas,
durante una hora a 37ºC (figura 3E);
la fig. 4 muestra el transporte de las proteínas
de fusión en el citoplasma y el núcleo. Las proteínas de fusión
marcadas con FITC están constituidas por cualquiera de los
aminoácidos C terminales 244 (Hsp 70/28-p50) ó 92
(Hsp70/10-p50) de Hsp70, fusionados con los
aminoácidos 37-409 de la subunidad p50 de
NF-\kappaB, se transportaron en las células
70Z/3. Las células 70Z/3 se trataron con Hsp70-FITC
(figura 4A), Hsp70/28-p50-FITC
(figura 4B), Hsp70/10-p50-FITC
(figura 4C) de longitud completa o BSA-FITC como
control (figura 4D) durante 1 hora a 37ºC según se describe. Se
visualizó la localización intracelular de las proteínas de fusión
mediante microscopía de barrido de láser confocal.
la fig. 5. demuestra que la Hsp70 o la
Hsp70-p50 intracelular internalizada permanecieron
estables durante hasta 24 horas. Las células se trataron con
cualquiera de Hsp70-FITC (figura 5A) o
Hsp70/28-p50-FITC (figura 5B) de
longitud completa, durante una hora antes el lavado y la incubación
adicional a 37ºC en tiempos crecientes. Se cosecharon las células
en los puntos temporales indicados, se lisaron en tampón de muestra
Laemmli, y las proteínas del lisado celular completo se separaron
mediante SDS-PAGE. Se sometieron los geles a
análisis con fluorimager. Hileras 1: células no tratadas; hilera 2:
sin rastreo; hilera 3. 1 hora de rastreo; hilera 4: 2 horas de
rastreo; hilera 5: 6 horas de rastreo; hilera 6: 24 horas de
rastreo; hilera 7: 4 días de rastreo.
la fig. 6. muestra que las proteínas de fusión
Hsp70-p50 internalizadas presentaron actividad de
unión con el ADN. Se trataron células 70Z/3 tal como se ha indicado
durante una hora antes de la lisis y la generación de extractos
nucleares. Se llevó a cabo el EMSA y se identificaron los complejos
de unión con el ADN específicos mediante el ensayo de
superdesplazamiento con los anticuerpos indicados. Fig. 6A, hilera
1: células control no estimuladas; hilera 2: tratadas con LPS;
hilera 3: tratadas con Hsp70-p50; hilera 4:
extractos tratados con Hsp70-p50 competidos con
oligo NF-\kappaB sin marcar, hilera 5, lo mismo
que la hilera 4 pero competido con oligooctámero sin marcar. Fig.
6B, hilera 1; tratadas con LPS; hilera 2 tratadas con LPS y
superdesplazadas con anti-p50; hilera 3:
anti-p65; hilera 4:
anti-c-rel; hilera 5:
anti-Hsp70; Hileras 6-10, lo mismo
que en las hileras 1-5 pero usando extractos
tratados con Hsp70-p50.
\newpage
la fig. 7 muestra que las células tratadas con
Hsp70 quedaron activadas para expresar la Ig kappa superficial y
producir TNF\alpha. (Figura 7A) se trataron células 70Z/3 con 10
ng/ml de LPS o 30 \mug/ml de Hsp70/10-p50 durante
la noche antes de lavar y teñir con
anti-kappa-FITC y análisis FACS.
(Fig. 7B) linfocitos de sangre periférica humana se trataron con 5
ng/ml de LPS o 40 \mug/ml de
Hsp70710-p-50 o
Hsp70/28-p50 durante 6 horas, y los sobrenadantes
se cosecharon y analizaron para los niveles de TNF\alpha mediante
ELISA.
La presente invención desvela un procedimiento
in vitro para liberar un compuesto seleccionado entre el
grupo constituido por una proteína, un péptido, un polinucleótido o
un agente terapéutico en el interior del núcleo de una célula o
células, comprendiendo dicho procedimiento unir dicho compuesto con
Hsp70, o un fragmento de Hsp70 que comprende una secuencia de
aminoácidos según se muestra en la SEC DE ID Nº. 2 o la SEC DE ID
Nº: 3 para formar un complejo Hsp70, y proporcionar de manera
exógena dicho complejo Hsp70 a dicha célula o al entorno que rodea
dicha célula de tal manera que el complejo Hsp70 se importa al
núcleo de dicha célula o células.
Se desvela el uso de un complejo Hsp70 para la
preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento del
rechazo al trasplante, una enfermedad autoinmune, una enfermedad
inflamatoria, cáncer, o una enfermedad vascular en un paciente, en
el que un compuesto se une covalentemente con Hsp70, o un fragmento
de Hsp70 que comprende una secuencia de aminoácidos según se
muestra en la SEC DE ID Nº: 2 o la SEC DE ID Nº: 3, para formar el
complejo Hsp70 y en el que dicho complejo se va a importar en el
núcleo de una célula o células.
La presente invención proporciona además una
composición farmacéutica que comprende un complejo Hsp70,
comprendiendo dicho complejo Hsp70 una primera porción y una
segunda porción, comprendiendo dicha primera porción la proteína
Hsp70, o un fragmento de Hsp70 que comprende una secuencia de
aminoácidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 2 o la SEC DE ID Nº:
3; y comprendiendo dicha segunda porción una proteína nuclear,
péptido nuclear, o polinucleótido.
La presente invención demuestra que la proteína
de choque térmico Hsp70 es internalizada por las células en el
citoplasma y el núcleo de una manera específica del tipo celular.
Aunque el mecanismo de recaptación es desconocido, los datos
sugieren que la unión y la internalización de Hsp70 son dependientes
de la energía e implica un receptor de alta capacidad.
La observación de que existen formas de Hsp70
asociadas a la superficie celular y segregadas (Multhoff, y col.,
(1996) Cell Stress & Chaperones 1: 167-176)
sugiere que esta proteína puede funcionar en la comunicación
célula-célula, quizás como un medio de transferir
una protección celular a los estresores ambientales regulando la
trascripción. De hecho, algunos informes recientes han descrito una
interacción física de Hsp70 con los dominios de transactivación de
varios factores de trascripción en el interior del núcleo. Por
ejemplo, la Hsp70 se pude unir directamente a los dominios de
transactivación de ambas HSF (factor de choque térmico) (Shi, y
col., (1998) Genes Dev. 12: 654-666), dando como
resultado la inhibición de la trascripción génica, y el supresor
del tumor de Wilm (Maheswaran, y col., (1998) Genes Dev. 12:
1108-1120), que da como resultado la supresión de
la proliferación celular. Estos datos y otros implican un papel de
Hsp70 en la regulación de los factores de trascripción y
posiblemente de otras proteínas nucleares. Estos datos complementan
otros que han demostrado que Hsp70 como chaperona citoplásmica
puede interactuar con factores de trascripción tales como el propio
NF.\kappaB así como una miríada de cofactores tales como Hip, Hop,
Hsp40, Hsp90, BAG-1 y otros (Demand, y col., (1998)
Mol. Cell. Biol. 18: 2023-2028). Así, se ha
informado de la liberación y transferencia intercelular de la Hsp70
exportada en células gliales y axonales (Hightower, y col., (1989)
J. Cell Physiol. 138: 257-266); y se ha demostrado
la acumulación de Hsp70 en una variedad de líneas celulares humanas
tanto mediante choque térmico como mediante transferencia de
liposomas para aumentar la supervivencia celular y proteger de
muerte celular apoptótica (Lasunskaia, y col., (1997) Apoptosis 2:
156-163). La liberación de proteínas de choque
térmico de las células bajo condiciones duras o de daño puede ser un
mecanismo homeostático para la transferencia de una respuesta
protectora frente al estrés a las células vecinas que sean incapaces
de establecer dicha respuesta. Además, informes recientes que
describen la capacidad de las moléculas de Hsp70 unidas a péptidos
de inducir actividad antitumoral o antivírica así como el desarrollo
de memoria de los CTL apoyan la noción de que estas proteínas
pueden funcionar para trasportar una respuesta inmune protectora
proporcionando una función de presentación del antígeno (Blachere,
y col., (1997) J. Exp. Med. 186: 1315-1322; Ciupitu,
y coll., (1998) J. Exp. Med. 187: 685-691). Los
solicitantes sugieren que la(s) Hsp70 endógena(s) (y
asociada(s) a péptidos o proteínas) se
libera(n)
al entorno mediante células infectadas o apoptóticas. Estos complejos de proteínas Hsp70 quedarían disponibles posteriormente para las células adyacentes que pueden tener comprometida su capacidad inmune, y actúan como un estímulo para espolear o reforzar la respuesta inmune.
al entorno mediante células infectadas o apoptóticas. Estos complejos de proteínas Hsp70 quedarían disponibles posteriormente para las células adyacentes que pueden tener comprometida su capacidad inmune, y actúan como un estímulo para espolear o reforzar la respuesta inmune.
Los solicitantes han demostrado la recaptación
celular y nuclear eficaz así como la estabilidad intracelular a
largo plazo de las proteínas de fusión Hsp70 suministradas de manera
exógena por una variedad de tipos celulares. Esta actividad de
transporte rápida y estable tiene implicaciones importantes para la
utilidad de los péptidos derivados de Hsp70 como vehículos de
liberación de agentes terapéuticos en el citoplasma y el núcleo en
los que pueden permanecer localizados durante largos períodos de
tiempo. Como la manipulación del proceso de importación en
particular se vuelve un objetivo cada vez más interesante para el
control regulado de la expresión génica (Fujihara, y col., (1998)
Biochem. Pharm. 56: 157-161), se cree que el énfasis
futuro se situará en el desarrollo de medios más potentes de
liberación intracelular dirigida. El uso de Hsp70 como sistema de
liberación tiene numerosas ventajas sobre otras proteínas
candidatas anteriormente descritas, que incluyen el hecho de que la
proteína es de origen humano y por tanto no contiene material
extraño (es decir, vírico o de insectos) y potencialmente
inmunogénico. El uso de fragmentos solubles de Hsp70 reducirá
potencialmente la inmunogenicidad todavía más. Ya que Hsp70 es una
proteína abundante muy expresada, sería probablemente bien tolerada
en los seres humanos, y de hecho, juega ya un papel en la respuesta
inmune. Además, se observó que la especificidad por el tipo celular
permitiría el direccionamiento de los compuestos a células
específicas del sistema inmune para un control regulador más
efectivo. Y finalmente, la liberación nuclear dirigida de larga vida
y preferente de los sustratos de las proteínas puede proporcionar
protección de la proteolisis citoplásmica, los datos de los
inventores apoyan el uso potencial de las secuencias de Hsp70 como
herramientas novedosas para liberar moléculas que modulan la
expresión génica y proporcionar posteriormente control
inmunosupresor o inmunoestimulador.
Los solicitantes desvelan en una realización de
la presente invención una proteína de fusión que comprende un
fragmento de Hsp70 unido a los aminoácidos 37-409 de
las subunidad p50 de NF-\kappaB (las proteínas de
fusión se denominan en el presente documento como
Hsp70-p50, Hsp70/28-p50, o
Hsp70-10-p50). Aunque se cree
normalmente que los homodímeros p50 de NF-\kappaB
actúan como represores transcripcionales de
NF-\kappaB en la mayor parte de tipos de células
debido a la ausencia de un dominio de activación C terminal, los
solicitantes observaron que los episodios biológicos adelantados no
reflejan un efecto dominante negativo de la proteína de fusión
sobre la activación transcripcional. Existen numerosas explicaciones
posibles para la transactivación inducida por
Hsp70-p50 observada. En primer lugar, la secuencia
de la proteína de choque térmico, específicamente el dominio EEVD,
puede contener por sí mismo la actividad de transactivación. Se sabe
que Hsp70 se une al factor de choque térmico en el núcleo e
interfiere con su actividad de transactivación mediante el dominio
EEVD. Puesto que la secuencia de Hsp70 en los ejemplos siguientes se
clonó respecto de los aminoácidos C terminales
37-409 de la secuencia p50 de
NF-\kappaB (SEC DE ID Nº: 1, el dominio EEVD está
potencialmente disponible para proporcionar la transactivación, o
incluso para interactuar con otros cofactores celulares o nucleares.
El análisis más estrecho del complejo nuclear puede dar como
resultado indicaciones de otros posibles componentes con
actividades transcripcionales. En segundo lugar, los homodímeros p50
pueden simplemente presentar actividad de transactivación en
circunstancias concretas. Fujita, y col. ((1992) Genes Dev. 6:
775-787) ensayaron diversos homo y heterodímeros de
subunidades NF-\kappaB para la activación
transcripcional in vitro y determinaron que la adición de
p50 solo en algunas mezclas de trascripción dio como resultado una
estimulación transcripcional significativa. Atribuyen esta
activación a las diferencias en la estructura fina de la secuencia
de nucleótidos en el interior de los motivos \kappaB. de manera
interesante, este grupo observó una estimulación de la trascripción
por los homodímeros p50 cuatro veces mayor que la del control usando
el motivo de la secuencia Ig\kappa. Estos datos corresponderían a
la activación que los autores observaron en estudios que analizaban
la expresión de la Ig kappa superficial. En tercer lugar las
subunidades Hsp70-p50 pueden reclutar otros factores
de transactivación en el complejo de unión con el ADN que no se
detectaron aún.
Por tanto, la presente invención abarca el uso
de Hsp70, o un fragmento de Hsp70 que comprende una secuencia de
aminoácidos que se muestra en la SEC DE ID Nº 2 o la SEC DE ID Nº 3;
para modular la actividad celular, preferiblemente, modular la
actividad nuclear en una célula o células, por ejemplo, la actividad
de los factores de trascripción. El término "actividad
nuclear" abarca la trascripción de moléculas de ácido nucleico en
la célula. El término "modular" abarca la potenciación,
disminución, activación o inactivación de la actividad celular. La
proteína Hsp70 o un fragmento de la misma como se define
anteriormente se puede usar sola para modular la actividad celular
mediante la transferencia en el citoplasma y/o el núcleo de una
célula, para tratar los trastornos asociados con Hsp70. Los
"trastornos asociados con Hsp70"se refieren a cualquier
trastorno o estado de enfermedad en el que Hsp70 juega un papel
regulador en la ruta metabólica de este trastorno o enfermedad.
Según se usa en el presente documento, el término "tratamiento"
se refiere al alivio de los síntomas de un trastorno concreto en un
paciente, la mejora de una medida verificable asociada con un
trastorno concreto, o la prevención de una respuesta inmune
concreta (tal como el rechazo al trasplante). El término
"paciente" se refiere a un mamífero, preferiblemente un ser
humano.
Adicionalmente, la presente invención abarca el
uso de Hsp70, o un fragmento de Hsp70 según se define anteriormente,
como una chaperona para transportar uno o más compuestos al
interior de una célula. Hsp70 o un fragmento de la misma se une a
un compuesto para formar un complejo (denominado en el presente
documento como "complejo Hsp70" que incluye Hsp70 o el
fragmento de la misma según se define anteriormente, o cualquier
compuesto asociado con o unido con la proteína o fragmento de Hsp70
según la definición anterior de la misma). El complejo Hsp70 se
proporciona a continuación a una célula o células o al entorno que
rodea una célula o células, de tal manera que el complejo Hsp70 se
transporta al interior del citoplasma y/o al núcleo de la célula o
células. Los compuestos que se pueden unir con la proteína o un
fragmento de Hsp70 según se define anteriormente incluyen, pero no
se limitan a, proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, y pequeñas
moléculas. "Ácidos nucleicos" o "polinucleótidos"
incluyen nucleótidos individuales así como secuencias de ADN y ARB o
fragmentos de las mismas.
Los estados de enfermedad que se pueden tratar
mediante los fragmentos de Hsp70 según la definición anterior de la
misma, y/o los complejos Hsp70 de la presente invención incluyen el
rechazo al trasplante y las enfermedades autoinmunes, tales como
artritis reumatoide, esclerosis múltiple, diabetes juvenil, asma, y
enfermedad inflamatoria del intestino, así como las enfermedades
inflamatorias, cáncer, enfermedades de replicación vírica y
enfermedades vasculares.
Por ejemplo, los complejos Hsp70 y las
composiciones farmacéuticas de la presente invención son útiles en
el tratamiento del rechazo al trasplante (por ejemplo, riñón,
hígado, corazón, pulmón, páncreas (células de islotes), médula
ósea, córnea, intestino delgado e injertos de piel, y xenoinjertos
de válvulas cardiacas) y enfermedades autoinmunes, tales como
artritis reumatoide, esclerosis múltiple, diabetes juvenil, asma,
enfermedad inflamatoria del intestino (enfermedad de Crohn, colitis
ulcerosa), lupus, diabetes, miastenia grave, psoriasis, dermatitis,
eczema, seborrea, inflamación pulmonar, uveítis de los ojos,
hepatitis, enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, síndrome
de Behcet o Sjorgen (ojos /boca secos), anemia perniciosa o
inmunohemolítica, insuficiencia adrenal idiopática, síndrome
autoinmune poliglandular, glomerulonefritis, escleroderma, líquen
plano, vitéligo (despigmentación de la piel), tiroiditis
autoinmune, y alveolitis, enfermedades inflamatorias tales como
osteoartritis, pancreatitis aguda, pancreatitis crónica, asma,
síndrome de estrés respiratorio en adultos, así como en el
tratamiento de cáncer y tumores, tales como tumores sólidos,
linfomas y leucemia, y enfermedades vasculares tales como
restenosis, estenosis y arterosclerosis.
También, comprendidas dentro del alcance de la
presente invención están comprendidas las composiciones
farmacéuticas que comprenden al menos un complejo Hsp70 que
comprende un compuesto que se va a liberar en el citoplasma y o el
núcleo de una célula o células. El complejo Hsp70 se puede
administrar sólo o con al menos un compuesto activo adicional, y
cualquier vehículo, adyuvante o medio. Los "compuestos activos
adicionales" abarcan un agente o agentes seleccionados entre el
grupo constituido por un inmunosupresor, un agente anticanceroso,
un agente antivírico, un agente antiinflamatorio, un agente
antifúngico, un antibiótico, o un compuesto de hiperproliferación
antivascular.
El término "vehículo, adyuvante o medio
farmacéuticamente aceptable" se refiere a un vehículo, adyuvante
o medio que se puede administrar a un sujeto, conjuntamente con un
complejo Hspo70 de la presente invención, y que no destruye la
actividad farmacológica de la misma. Los vehículos, adyuvantes y
medios farmacéuticamente aceptables que se pueden usar en las
composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen los
siguientes; intercambiadores iónicos, alúmina, estearato de
aluminio, lecitina, sistemas de liberación de fármacos
autoemulsionantes ("SEEDS") tales como succinato de
d\alphatocoferol polietilenglicol 1000, tensioactivos usados en
las formas de dosificación farmacéuticas tales como Tween® u otras
matrices de liberación polimérica similares, proteínas de suero
tales como albúmina de suero humano, sustancias tampón tales como
fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas
parciales de glicéridos de ácidos grasos vegetales saturados, agua,
sales o electrolitos tales como sulfato de protamina,
hidrogenofosfato de sodio, hidrogeno fosfato de potasio, cloruro de
sodio, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio,
polivinilpirrolidona, sustancias basadas en celulosa,
polietilenglicol, carboximetilcelulosa de sodio, poliacrilatos,
ceras, polímeros en bloque de
polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y
grasa de lana. Ciclodextrinas tales como \alpha, p y
\gamma-ciclodextrina, o derivados químicamente
modificados tales como hidroxialquilciclodextrinas, que incluyen 2 y
3-hidroxipropil-\beta-ciclodextrinas,
u otros derivados solubilizados se pueden usar para potenciar la
liberación de los compuestos de la presente invención.
Las composiciones de la presente invención
pueden contener otros agentes terapéuticos según se describe a
continuación, y pueden formularse, por ejemplo, empleando vehículos
o diluyentes sólidos o líquidos adicionales, así como aditivos
farmacéuticos de un tipo apropiado para el modo de administración
deseado (por ejemplo, excipientes, ligantes, conservantes,
estabilizantes, aromas, etc.) según técnicas tales como las bien
conocidas en la técnica de la formulación farmacéutica.
Se pueden administrar las composiciones
farmacéuticas que comprenden al menos un complejo Hsp70 de la
presente invención mediante cualquier medio adecuado, tal como en
forma de comprimidos, cápsulas, gránulos o polvos; por vía
sublingual, bucal, parenteral, tal como mediante inyección
subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraesternal o técnicas de
infusión (por ejemplo, tal como disoluciones o suspensiones acuosas
o no acuosas inyectables estériles) por vía nasal tal como mediante
inhalación por pulverización, por vía tópica, tal como en forma de
crema o pomada, o por vía rectal tal como en forma de supositorios,
en formulaciones de dosificación unitarias que contienen vehículos
o diluyentes no tóxicos farmacéuticamente aceptables. Las
composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden, por
ejemplo, administrarse en una forma adecuada para la liberación
inmediata o la liberación mantenida. Se puede conseguir la
liberación inmediata o la liberación mantenida mediante el uso de
composiciones farmacéuticas adecuadas que comprenden los presentes
compuestos, o, particularmente en el caso de la liberación
mantenida, mediante el uso de dispositivos tales como implantes
subcutáneos o bombas osmóticas. Los presentes compuestos Hsp70 se
pueden administrar también liposómicamente.
Las composiciones a modo de ejemplo para la
administración oral incluyen suspensiones que pueden contener, por
ejemplo, celulosa microcristalina para impartir volumen, ácido
algínico o alginato de sodio como agente suspensor, metilcelulosa
como potenciador de la viscosidad, y agentes endulzantes o
aromatizantes tales como los conocidos en la técnica, y comprimidos
de liberación inmediata que pueden contener, por ejemplo, celulosa
microcristalina, fosfato dicálcico, almidón, estearato de magnesio
y/o lactosa y/u otros excipientes, ligantes, extensores,
desintegrantes, diluyentes y lubricantes tales como los conocidos en
la técnica. Los presentes compuestos se pueden liberar también a
través de la cavidad oral mediante administración sublingual y/o
bucal. Comprimidos moldeados, comprimidos comprimidos o comprimidos
criongelados son las formas a modo de ejemplo que se pueden usar.
Las composiciones a modo de ejemplo incluyen aquellas que formulan
los presentes complejos de Hsp70 con disolventes que se disuelven
rápidamente tales como manitol, lactosa, sacarosa y/o
ciclodextrinas. Incluidos también en dichas formulaciones pueden
estar excipientes de elevado peso molecular tales como celulosa
(Avicel®) o polietilenglicoles (PEG). Dichas formulaciones pueden
incluir también un excipiente para ayudar a la adhesión mucosal tal
como hidroxipropilcelulosa (HPC) hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC),
carboximetilcelulosa de sodio (SCMC), copolímero de anhídrido
maleico (por ejemplo, Gantrez®), y agentes para controlar la
liberación, tales como copolímero poliacrílico (por ejemplo,
Carbopol® 934). Se pueden añadir también agentes lubricantes, de
deslizamiento, aromatizantes y estabilizantes para facilitar la
fabricación y el uso.
Las composiciones a modo de ejemplo para la
administración en aerosol o inhalación nasal incluyen disoluciones
en disolución salina que pueden contener, por ejemplo, alcohol
bencílico u otros conservantes adecuados, promotores de la
absorción para potenciar la biodisponibilidad y/u otros agentes
solubilizantes o dispersantes tales como los conocidos en la
técnica.
Las composiciones a modo de ejemplo para la
administración parenteral incluyen disoluciones o suspensiones
inyectables que pueden contener, por ejemplo, diluyentes o
disolventes no tóxicos parenteralmente aceptables, tales como
manitol, 1,3-butanodiol, agua, disolución de Ringer,
una disolución de cloruro de sodio isotónica, u otros agentes
dispersantes o humectantes y suspensores adecuados, que incluyen
mono o diglicéridos, y ácidos grasos, que incluyen ácido oleico. El
término "parenteral" según se usa en el presente documento
incluye inyección subcutánea, intracutánea, intravenosa,
intramuscular, intraarticular, intraarterial, intrasinovial,
intraesternal, intratecal, intralesional e intracranial o técnicas
de infusión.
Las composiciones a modo de ejemplo para la
administración rectal incluyen supositorios que pueden contener,
por ejemplo, por ejemplo, un excipiente no irritante adecuado, tal
como manteca de cacao, ésteres de glicérido o polietilenglicoles
sintéticos, que son sólidos a temperaturas ordinarias, pero licuan y
o se disuelven en la cavidad rectal para liberar el fármaco.
Las composiciones a modo de ejemplo para la
administración tópica incluyen un vehículo tópico tal como
Plastibase^{TM} (aceite mineral gelificado con polietileno).
Plastibase^{TM} (aceite mineral gelificado con polietileno).
Una persona normalmente experta en la técnica
puede determinar una cantidad "terapéuticamente eficaz" de un
complejo Hsp70 de la presente invención, e incluye a modo de ejemplo
cantidades de dosificación para un adulto humano de entre
aproximadamente 0,1 a 100 mg/kg de peso corporal de compuesto activo
por día, que se puede administrar en un dosis única o en forma de
dosis divididas individualmente, tales como entre 1 a 3 veces por
día. Se entenderá que se puede variar el nivel de dosis y frecuencia
específicos de dosificación para cualquier sujeto concreto y
dependerá de una variedad de factores que incluyen la actividad del
compuesto específico empleado, la estabilidad metabólica y la
longitud de la acción de este compuesto, la especie, edad, peso
corporal, salud general, sexo y dieta del sujeto, el modo y tiempo
de administración, la velocidad de excreción, la combinación del
fármaco y la gravedad de la dolencia concreta, Los sujetos que se
van a tratar pueden incluir especies de animales, o mamíferos tales
como los seres humanos.
Por "terapéuticamente eficaz" se entiende
una cantidad necesaria para conseguir un resultado deseado, por
ejemplo, el alivio de los síntomas de un trastorno concreto en un
paciente, la mejora de una medida verificable asociada con un
trastorno concreto, o la prevención de una respuesta inmune
concreta, Se entenderá que se puede variar el nivel de dosis y la
frecuencia de la dosificación específicos para cualquier sujeto
concreto y dependerán de una variedad de factores que incluyen la
actividad del compuesto específico empleado, la estabilidad
metabólica y la longitud de la acción de este compuesto, la
especies, edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del
sujeto, el modo y tiempo de administración, la velocidad de
excreción, la combinación del fármaco, y la gravedad de la dolencia
concreta. Los sujetos que se van a tratar pueden incluir especies
animales, o mamíferos tales como los seres humanos.
Los complejos Hsp70 de la presente invención se
pueden emplear solos o en combinación entre sí y/u otros agentes
terapéuticos adecuados, tales como agentes antiinflamatorios,
antiproliferativos, quimioterapéuticos, e inmunosupresores.
Se entiende que los siguientes ejemplos son
ilustrativos de una forma de realización de la presente invención y
no limitan el alcance de la invención en ningún modo.
Se usó el siguiente procedimiento para preparar
Hsp70 recombinante. Se generaron las proteínas de fusión Hsp70 por
amplificación mediante la PCR de las secuencias de ADN de Hsp70
usando cebadores que correspondían a la secuencia publicada y que
incluían los emplazamientos de la endonucleasa de restricción para
permitir la clonación dirigida en un vector de expresión
procariota, (Life Technologies, Inc.). Se generaron las secuencias
p50 de NF-\kappaB de la misma manera, usando
cebadores que correspondían a la secuencia p50 publicada y se
clonaron en la dirección 5' (de 5' a) de las secuencias Hsp70 en el
mismo vector de expresión. El vector de clonación incluyó una
etiqueta His 6x para uso en la purificación de la proteína expresada
sobre una columna de metal. Se transformó el ADN en un huésped
bacteriano y se indujo la expresión de la proteína usando IPTG. Se
purificó la proteína soluble expresada usando las técnicas de
purificación por afinidad convencionales y se usó posteriormente en
los siguientes experi-
mentos.
mentos.
Para investigar la localización intracelular de
Hsp70 añadida de manera exógena, los inventores marcaron con
fluorescencia la proteína Hsp70 de longitud completa y ensayaron su
capacidad para quedar internalizada en diversos tipos de células.
Se trataron las células con una concentración final de 10 \mug/ml
de Hsp70-FITC (o BSA-FITC como
control) durante 1 hora, a continuación se lavaron y fijaron antes
del microscopía de barrido de láser confocal. El volumen de
Hsp70-FITC intracelular se localizó uniformemente en
el núcleo y el citoplasma de células pre-B 70Z/3 de
murino, mientras que la importación de BSA-FITC fue
despreciable (fig. 1A y 1B). Los inventores observaron recaptación
significativa de Hsp70-FITC por los monocitos de la
sangre periférica humana, pero no por las células T (figs
1C-1F). De manera interesante, mientras que el
modelo de tinción en monocitos de sangre periférica fue a menudo
uniforme a través del citoplasma y el núcleo, los inventores
señalaron que esto se caracterizó algunas veces mediante tinción
puntuada, implicando localización vesicular en el interior del
citoplasma. Los solicitantes encontraron que el modelo de tinción
específico de los PBL varió según el donante, sugiriendo que el
estado de activación celular puede jugar un papel en la eficiencia
de la recaptación o la localización intracelular de la Hsp70
exógena. Consistente con esta hipótesis, los inventores encontraron
que mientras las células B de la sangre periférica que quedaban eran
resistentes a la recaptación, se podrían inducir para transportar
la proteína después de 48 horas de activación in vitro con
anticuerpos anti-CD40 más anti-Ig.
Se sabe que este procedimiento de activación de las células B da
como resultado la expresión de diversos genes asociados con la
diferenciación y proliferación. Por el contrario, la activación de
las células T de la sangre periférica por anticuerpos
anti-CD3 y anti-CD28 no afecta al
transporte de Hsp70. No se observó recaptación intracelular por la
línea de células T de Jurkat o la línea celular de fibroblastos
HeLa, pero los inventores observaron recaptación eficaz por dos
líneas de células B maduras, RAJI y BJAB. Además, los inventores
observaron recaptación citoplásmica limitada por dos líneas de
células monocíticas, THP-1 y U937, pero sólo
después de incubación extendida (6 a 24 horas) con elevadas
concentraciones (100 ug/ml) de Hsp70-FITC. Los
inventores describen que la actividad de transporte de Hsp70
específica de células B y monocitos es consistente con los informes
que proponen un papel para los miembros de la familia de choque
térmico Hsp70 en la presentación del antígeno (Manara, y col.,
(1993) Blood 82: 2865-2871; Vanbuskirk, y col.,
(1989) J. Exp. Med. 170: 1799-1809) puesto que se
considera generalmente que estas células funcionan como células
presentadoras de antígenos. La especificidad y la inducibilidad del
tipo celular de la recaptación celular de Hsp70 pueden reflejar la
expresión diferencial de una superficie requerida o receptor nuclear
para la proteína Hsp70. Están actualmente en progreso estudios para
investigar las proteínas superficiales que pueden estar implicadas
en la unión e internalización de la Hsp70 extracelular.
Los inventores investigaron a continuación el
curso temporal y el efecto de la dosis de la recaptación de Hsp70
por las células 70Z/3. Se incubaron 5 x 10^{5} células a 37ºC con
1 \mug/ml de Hsp70-FITC durante periodos
crecientes de tiempo entre 10 minutos y 48 horas. Una vez que la
Hsp70-FITC no incorporada fue eliminada por lavado
con PBS, se cuantificó la fluorescencia intracelular y asociada a
célula mediante análisis fluorimétrico. A partir de estos estudios
los inventores determinaron que el proceso de internalización parece
ser lento, puesto que no se consigue la internalización máxima
hasta entre 6-8 horas (figura 2A), tras dicho tiempo
la velocidad de recaptación parece caer ligeramente y permanecer
constante durante hasta 2 días de incubación.
Para el estudio del intervalo de dosis los
investigadores seleccionaron un tiempo de incubación de una hora y
se trataron las células con cantidades variables de
Hsp70-FITC. El análisis de los inventores demostró
que la intensidad de fluorescencia intracelular aumentó con el
aumento de las concentraciones de Hsp70 extracelular, hasta 100
\mug/ml (1,4 \muM), y fue detectable incluso cuando se trataron
las células con niveles tan bajos como 0,1 \mug/ml (1,4 \muM,
fig. 2B). Los inventores determinaron que el tratamiento de las
células con una concentración extracelular de 1 \muM de
Hsp70-FITC dio como resultado tras una hora de
incubación una concentración intracelular de 700 nM, que suponía un
volumen de 1 pl/célula. Esta eficiencia de recaptación es
comparable a la informada para otras secuencias de péptidos (Phelan,
y col., (1998) Nature Biotechnology 16: 440-443).
La recaptación de Hsp70-FITC no fue saturable en el
intervalo de concentraciones que usaron los inventores (35
nM-1\muM), indicativo de una alta capacidad del
mecanismo de recaptación mediando por el receptor. Además, la
internalización podría no bloquearse mediante preincubación con un
exceso de 10 veces de Hsp70 no marcada
Para investigar el mecanismo de trasporte, los
inventores examinaron la importación de Hsp70 bajo diferentes
condiciones. Aunque la proteína Hsp70 de longitud completa fue
transportada por los PBL en presencia de azida de sodio al 0,05%,
esta actividad de transporte fue completamente erradicada cuando las
células se incubaron a 4ºC (fig. 3A-3D), sugiriendo
que se trataba de un componente dependiente de la energía del
transporte mediado por Hsp70. Estos datos se acoplaron con los
estudios de internalización simultánea usando transferrina, que
revelaron que la acumulación de transferrina y Hsp70 se producían en
compartimientos intracelulares diferenciados tanto en células 70Z/3
(fig. 3E) como en PBL humanos, sugiriendo que este mecanismo no
implica la clásica endocitosis.
Se generaron dos proteínas de fusión diferentes
compuestas bien de un polipéptido Hsp70 C-terminal
de 244 (SEC DE ID Nº:2) o 92 (SEC DE ID Nº:3) aminoácidos con la
subunidad p50 del factor de trascripción
NF-\kappaB para examinar la capacidad de la
secuencia del péptido Hsp70 para dirigir otros sustratos de proteína
al interior de la célula. El polipéptido de 244 aminoácidos tiene
la siguiente secuencia:
\vskip1.000000\baselineskip
El polipéptido de 92 aminoácidos tiene la
siguiente secuencia:
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando se añaden exógenamente a las células,
ambas proteínas de fusión conjugadas con FITC penetraron en el
citoplasma y núcleos de las células 70Z/3 (fig. 4) y PBL (datos no
mostrados) con cinética y especificidad similar a la del péptido
Hsp70 solo. Este trasporte fue estable, no saturable y se produjo
sin degradación proteica significativa. La recaptación máxima de
FITC-Hsp70 permaneció estable tras un pulso de 30
minutos durante 24 horas las la eliminación por lavado de la
proteína no incorporada e incubación a 37ºC, según se determinó
mediante microscopía confocal y análisis SDS-PAGE.
Para evaluar la estabilidad de las proteínas, las células se
pulsaron bien con 10 \mug/ml de Hsp70 de longitud completa
conjugada con FITC o Hsp70/28-p50 durante 1 hora
antes de lavado y rastreo a 37ºC durante hasta 96 horas. Se
generaron extractos completos por lisis en tampón de muestra de
Laemmli, y las proteínas se separaron mediante SDSPAGE. Los geles se
sometieron a análisis mediante fluorimager, y los resultados
demostraron la presencia tanto de la proteína de fusión de \sim75
kD como el propio Hsp70 de longitud completa (distinguible del Hsp70
endógeno por su marca fluorescente) en extractos de células
completas tras hasta 24 horas de incubación sin cambios mensurables
en el tamaño o apariencia de productos de degradación de menor peso
molecular (fig. 5). Estos datos sugieren que la Hsp70 intracelular
dirigida quedó retenida por la célula sin degradación significativa
con una semivida superior a 48 horas.
Para resolver si las proteínas de fusión
internalizadas retienen la actividad funcional, los inventores
ensayaron extractos nucleares de células tratadas con la proteína
de fusión Hsp70-p50 para su capacidad para enlazar
una secuencia específica de ADN kappa. Los inventores pudieron
demostrar que las proteínas de fusión eran capaces enlazar ADN
kappa (datos no mostrados), sugiriendo que las subunidades de p50 no
se desequilibraban conformacionalmente por la presencia de las
secuencias de Hsp70. Una vez tratadas las células 70Z/3 con 100
ng/ml de LPS, 10 \mug/ml de Hsp70/10-p50 o de
Hsp70/28-p50 durante 1 hora, se prepararon los
extractos nucleares y se llevaron a cabo los ensayos de
desplazamiento en gel. Los inventores encontraron que la actividad
de enlace del ADN se retenía por la proteína de fusión tras la
recaptación nuclear por las células, indicando que el proceso de
importación no dio como resultado una degradación o pérdida de
actividad significativas (fig. 6A). Esta actividad de enlace del
ADN era específica, ya que el complejo estaba completado con un
exceso de secuencia NF-\kappaB no marcada pero no
con secuencia de octámero (fig. 6A). Los inventores vieron distintos
complejos formados por extractos nucleares procedentes de células
tratadas con diferentes proteínas de fusión; además, se
diferenciaban del complejo formado por NF-\kappaB
endógeno inducido por LPS. En los experimentos de
superdesplazamiento, los inventores observaron que los anticuerpos
anti-p50 eran capaces de desplazarse por el
complejo de enlace del ADN casi completo desde las células tratadas
con proteína de fusión según lo esperado, confirmando que la
proteína de fusión estaba posiblemente ligada con el ADN
principalmente en forma de homodímero (fig. 6B). Los inventores
también observaron una disminución detectable en el complejo
específico tras la incubación con ambos anticuerpos
anti-p65 y anti-Hsp70 (dirigidos
contra los cuatro aminoácidos carboxiterminales EEVD), indicando la
presencia de subunidades p65 endógenas además de las subunidades
Hsp70-p50 recombinantes. Por el contrario, los
extractos nucleares procedentes de células control tratadas con LPS
formaron un complejo que contenía ambas subunidades p50 y p65, y
los modelos de superdesplazamiento diferían de los de las células
tratadas con la proteína de fusión. Estos datos indican la formación
de complejos proteína/ADN diferentes, y sugieren que las proteínas
de fusión se enlazaban directamente con el ADN y no simplemente
activan el NF-\kappaB endógeno.
Puesto que el tratamiento de las células con las
proteínas de fusión Hsp70-p50 podría potencialmente
dar como resultado la formación de complejos que interactúan con
los emplazamientos de unión del ADN de NF-\kappaB,
los inventores decidieron evaluar los eventos biológicos más
adelantados en la ruta de NF-\kappaB. Los
inventores observaron que el tratamiento de diferentes células con
las proteínas de fusión Hsp70-p50 dio como resultado
la activación de varias respuestas inflamatorias e inmunológicas
normalmente reguladas por NF-\kappaB. El
tratamiento de células pre-B 70Z/3 de ratón con la
proteína de fusión Hsp70/10-p50 se demostró tan
eficaz como LPS en la inducción de elevados niveles de cadena
ligera de Ig kappa en la superficie (fig. 7A). Además, a diferencia
de la activación inducida por LPS, la expresión kappa superficial
inducida por la proteína de fusión quedó abolida a los 30 minutos
de una desnaturalización térmica a 65ºC de la proteína previa al
tratamiento de las células, confirmando que la proteína intacta era
necesaria para la activación. Se obtuvieron resultados similares
con Hsp70/28-p50 (datos no mostrados). La producción
de TNF\alpha es otro ejemplo de una respuesta inflamatoria
también ampliamente regulada por NF-\kappaB. Los
inventores observaron que la proteína de fusión internalizada era
también capaz de inducir la producción de TNF\alpha por los
linfocitos de la sangre periférica (fig. 7B). Células PBL
recientemente aisladas se incubaron con LPS o
Hsp70-p50 durante 6 horas, tras dicho tiempo se
recogieron los sobrenadantes y se ensayaron para los niveles de
citoquina mediante ELISA. De nuevo, los inventores encontraron que
las proteínas de fusión eran tan eficaces como LPS en la inducción
de la producción de TNF\alpha, y establecieron que la proteína
intacta era la responsable de la activación demostrando que la
desnaturalización térmica de la proteína de fusión abolía el
efecto.
Se usaron en los ejemplos anteriores los
siguientes procedimientos experimentales:
Expresión y purificación de las proteínas de
fusión Hsp70-p50. Se construyeron dos proteínas
de fusión p50 usando la secuencia de nucleótidos correspondiente a
los aminoácidos 1-406 de la subunidad p105 de la
proteína NF-\kappaB. Esta secuencia incluye el
dominio de enlace del ADN así como el dominio de homología rel. Las
dos proteínas de fusión variaron en la longitud del fragmento Hsp70
usado. Las dos secuencias Hsp70 se derivaron del término C,
incluyendo tanto los nucleótidos terminales 276 ó 735 que
corresponden a un fragmento de proteína de 10 kD (el polipéptido de
92 aminoácidos anteriormente descrito) y uno de 28 kD (el
polipéptido de 244 aminoácidos anteriormente descrito). La
proteína Hsp70 tanto de 10 kD como de 28 kD se fusioné en el término
C con la proteína p50, y las proteínas de fusión resultantes se
denominaron Hsp70/10-p50 o
Hsp70/28-p50; respectivamente. El vector de
expresión procariótico ProEX HT^{TM} (Life Technologies,
Gaithersburg, MD) se usó para la clonación, expresión y
purificación, siguiendo las recomendaciones del fabricante.
Microscopía de barrido con láser
confocal. Las células se trataron típicamente con 10 \mug/ml
de proteínas conjugadas con FITC o como se indica en el texto
durante una hora a 37ºC seguido por un lavado en PBS, fijación en
paraformaldehido al 2%, un lavado adicional en PBS y posterior
análisis visual mediante microscopía confocal
(Bio-Rad, Hercules, CA) usando un programa
informático Molecular Dynamics LaserSharp y Adobe® Photoshop®.
Análisis por transferencia Western de las
proteínas de fusión Hsp70-p50 importadas. Las
células se trataron con proteínas conjugadas con durante una hora a
37ºC, se lavaron en PBS y se usaron para la preparación de
extractos nucleares, se separaron cantidades iguales de proteína
mediante SDS-PAGE. El gel se fijó en ácido acético
y se sometió a análisis de fluorescencia mediante fluorimager y
programa informático ImageQuant.
Ensayo de desplazamiento de movilidad
electroforética. Se prepararon extractos nucleares de células
70Z/3 usando una modificación de los protocolos establecidos
(Tepper, y col., (1995) J. Immunol. 155:2427-2436).
Se determinaron las concentraciones de proteínas usando el ensayo de
Bradford, y los oligonucleótidos (Promega, Madison, WI)
NF-\kappaB
(5'GATCCGAGGGGACTTTCCGCTGGGGACTTTCCAGG3' (SEC DE ID Nº: 4)) u
octámero (5'TGTCGAATG
CAAATCACTAGAA3' (SEC DE ID Nº: 5)) se marcaron al final con [\gamma-^{32}P)ATP y T4 quinasa. Las condiciones de las reacciones de enlace con las sondas de oligonucleótidos fueron las anteriormente descritas. Los ensayos de superdesplazamiento se realizaron con los anticuerpos policlonales p50, p65 y c-Rel de NF-\kappaB (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) y el anticuerpo Hsp70 preincubando los extractos nucleares con 3 ul del anticuerpo en el tampón de reacción durante 30 minutos y continuando con el ensayo de retraso en gel según los procedimientos estándar. Se realizaron ensayos de competición usando los oligonucleótidos no marcados NF-\kappaB y octámero. Las muestras se analizaron sobre geles nativos de poliacrilamida al 6% y se autorradiografiaron.
CAAATCACTAGAA3' (SEC DE ID Nº: 5)) se marcaron al final con [\gamma-^{32}P)ATP y T4 quinasa. Las condiciones de las reacciones de enlace con las sondas de oligonucleótidos fueron las anteriormente descritas. Los ensayos de superdesplazamiento se realizaron con los anticuerpos policlonales p50, p65 y c-Rel de NF-\kappaB (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) y el anticuerpo Hsp70 preincubando los extractos nucleares con 3 ul del anticuerpo en el tampón de reacción durante 30 minutos y continuando con el ensayo de retraso en gel según los procedimientos estándar. Se realizaron ensayos de competición usando los oligonucleótidos no marcados NF-\kappaB y octámero. Las muestras se analizaron sobre geles nativos de poliacrilamida al 6% y se autorradiografiaron.
Ensayo de inmunofluorescencia (FACS).
Células 70Z/3 se trataron bien con 30 \mug/ml de
Hsp70/10-p50 de la proteína de fusión o 100 ng/ml
de LPS y se incubaron toda la noche a 37ºC. A continuación las
células se lavaron PBS y se fijaron en paraformaldehído al 2% antes
de teñir con el anticuerpo anti-kappa conjugado con
FITC. Tras un lavado adicional con PBS, las células se sometieron a
toma de imagen y análisis en el FACSTAR^{TM}.
Ensayo TNF\alpha. Linfocitos de sangre
humana periférica se aislaron como se ha indicado y se trataron con
40 \mug/ml de la proteína de fusión Hsp70 o LPS durante 6 horas.
Se recogieron los sobrenadantes y se analizaron para TNF\alpha
mediante ELISA (Genzyme, Cambridge, MA).
Claims (20)
1. Un procedimiento in vitro para
administrar un compuesto seleccionado entre el grupo constituido por
una proteína, un péptido, un polinucleótido o un agente terapéutico
al interior de un núcleo de una célula o células, comprendiendo
dicho procedimiento juntar dicho compuesto con Hsp70, o un fragmento
de Hsp70 que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra
en la SEC DE ID Nº: 2 o la SEC DE ID Nº: 3, para formar un complejo
de Hsp70, y proporcionar dicho complejo de Hsp70 de forma exógena a
dicha célula o al entorno que rodea dicha célula de manera que el
complejo de Hsp70 se importa al interior de dicho núcleo de una
célula o células.
2. Uso de un complejo de Hsp70 para la
preparación de una composición farmacéutica para tratar el rechazo
por trasplante, una enfermedad autoinmune, una enfermedad
inflamatoria, cáncer, o una enfermedad vascular en un paciente, en
el que un compuesto se une covalentemente con Hsp70, o un fragmento
de Hsp70 que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra
en la SEC DE ID Nº: 2 o la SEC DE ID Nº: 3, para formar el complejo
de Hsp70 y en el que dicho complejo se va a importar al interior de
dicho núcleo de una célula o células
3. El uso de la reivindicación 2 en el que dicho
complejo de Hsp70 comprende un compuesto seleccionado entre el
grupo constituido por una proteína, un péptido, un polinucleótido y
un agente terapéutico.
4. El procedimiento in vitro de la
reivindicación 1 para administrar una proteína o un péptido al
compartimiento nuclear de una célula o células, comprendiendo dicho
procedimiento juntar dicha proteína o péptido con Hsp70 o un
fragmento de Hsp70 que comprende de una secuencia de aminoácidos
como se muestra en la SEC DE ID Nº: 2 o la SEC DE ID Nº: 3 para
formar un complejo de Hsp70, proporcionar dicho complejo a dicha
célula o células de manera que dicho complejo se transporta al
interior del compartimiento nuclear de dicha célula o células.
5. El uso de la reivindicación 2, en el que una
proteína nuclear o un péptido nuclear se une con Hsp70, o un
fragmento de Hsp70 que comprende una secuencia de aminoácidos como
se muestra en la SEC DE ID Nº: 2 o la SEC DE ID Nº: 3 para formar
el complejo de Hsp70.
6. El procedimiento de la reivindicación 4 o el
uso de la reivindicación 5, en el que dicho fragmento de Hsp70
comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC DE
ID Nº: 2 o la SEC DE ID Nº: 3.
7. El procedimiento de las reivindicaciones 4 ó
6, o el uso de la reivindicaciones 3 ó 5 en el que dicha proteína o
péptido comprende la subunidad p50 del factor de trascripción
NF-\kappaB.
8. Una composición farmacéutica que comprende un
complejo de Hsp70, dicho complejo de Hsp70 comprendiendo una
primera porción y una segunda porción, comprendiendo dicha primera
porción proteína Hsp70, o un fragmento de Hsp70 que comprende una
secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC DE ID Nº: 2 o la
SEC DE ID Nº: 3; y dicha segunda porción que comprende una proteína
nuclear, péptido nuclear, o polinucleótido.
9. La composición farmacéutica de la
reivindicación 8, en la que el complejo de Hsp70 comprende una
proteína Hsp70 de origen humano.
10. La composición farmacéutica de la
reivindicación 8 ó 9, en la que dicha proteína o péptido comprende
la subunidad p50 del factor de trascripción
NF-\kappaB.
11. El procedimiento o el uso de la
reivindicación 6, en el que dicho fragmento de Hsp70 está
constituido por la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC DE ID
Nº 2: o en la SEC DE ID Nº: 3.
12. La composición farmacéutica de la
reivindicación 8 ó 9 que comprende además al menos un compuesto
activo seleccionado entre el grupo constituido por un
inmunosupresor, un agente anticanceroso, un agente antiviral, un
agente antiinflamatorio, un agente antifúngico, un antibiótico y un
compuesto hiperproliferativo antivascular.
13. La composición farmacéutica de la
reivindicación 8 ó 9 o el procedimiento de la reivindicación 4 que
comprende una proteína nuclear o un péptido nuclear covalentemente
unido a dicha proteína Hsp70 o un fragmento de Hsp70 que comprende
una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC DE ID Nº: 2 o
la SEC DE ID Nº: 3.
14. La composición farmacéutica de la
reivindicación 8, 9 ó 13, en la que dicha Hsp70 o fragmento de Hsp70
comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC DE
ID Nº: 2 o la SEC DE ID Nº: 3.
15. La composición farmacéutica de la
reivindicación 13 ó 14, en la que dicha Hsp70 o un fragmento de
Hsp70 que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en
la SEC DE ID Nº 2: o la SEC DE ID Nº: 3 es
C-terminal respecto de dicha proteína o
péptido.
16. La composición farmacéutica de la
reivindicación 10, en la que dicha proteína o péptido comprende los
restos 37-409 de la subunidad p50 del factor de
trascripción NF-\kappaB.
\newpage
17. La composición farmacéutica de una
cualquiera de la reivindicaciones 8, 9, 12, 13 ó 14 para tratar
rechazo por trasplante, una enfermedad autoinmune o una enfermedad
inflamatoria en un paciente.
18. El procedimiento de la reivindicación 13, el
uso de la reivindicación 5, o la composición farmacéutica de la
reivindicaciones 8 ó 13, en la que dicha proteína nuclear o péptido
nuclear es capaz de modular la expresión génica en dicho
compartimiento nuclear.
19. El procedimiento, uso, o composición
farmacéutica de la reivindicación 18, en la que dicha modulación de
la expresión génica proporciona un control inmunosupresor o
inmunoestimulante.
20. El procedimiento, uso, o composición
farmacéutica de la reivindicación 18, en la que dicha proteína
nuclear o péptido nuclear es un factor de trascripción.
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