ES2217331T3 - Proteina quimerica fcepsilon-pe para el tratamiento dirigido de respuestas alergicas, un procedimiento para su elaboracion y composiciones farmaceuticas que la contienen. - Google Patents

Proteina quimerica fcepsilon-pe para el tratamiento dirigido de respuestas alergicas, un procedimiento para su elaboracion y composiciones farmaceuticas que la contienen.

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ES2217331T3 ES96940708T ES96940708T ES2217331T3 ES 2217331 T3 ES2217331 T3 ES 2217331T3 ES 96940708 T ES96940708 T ES 96940708T ES 96940708 T ES96940708 T ES 96940708T ES 2217331 T3 ES2217331 T3 ES 2217331T3
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Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE EN GENERAL A UNA NUEVA APROXIMACION PARA LA TERAPIA DE LAS RESPUESTAS ALERGICAS, BASADA EN LA ELIMINACION DIRIGIDA DE CELULAS QUE EXPRESAN EL RECEPTOR DE FC EP RI MEDIANTE UNA CITOTOXINA QUIMERICA FC 2''-3 PE40 . UNA SECUENCIA QUE CODIFICA LOS AMINOACIDOS 301-437 DE LA REGION FC DE LA MOLECULA DE IGE DE RATON SE FUSIONO GENETICAMENTE A PE 40 - UNA FORMA TRUNCADA DE PE QUE CARECE DEL DOMINIO DE UNION A CELULAS. LA PROTEINA QUIMERICA, PRODUCIDA EN E. COLI, MATA DE FORMA ESPECIFICA Y EFICIENTE LINEAS CELULARES DE MASTOCITOS DE RATON QUE EXPRESAN EL RECEPTOR FC EP RI, ASI COMO LOS MASTOCITOS PRIMARIOS DERIVADOS DE MEDULA OSEA. LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA UNA PROTEINA QUIMERICA PARA LA ELIMINACION DIRIGIDA DE CELULAS QUE EXPRESEN FC EP RI ESPECIALMENTE UTIL PARA LA TERAPIA DE LAS RESPUESTAS ALERGICAS. LA DICHA PROTEINA QUIMERICA ESTA FORMADA POR UNA PORCION QUE LA DIRIGE A CELULAS QUE EXPRESAN FC EP RI Y UNA PORCION PARA CAUSAR LA MUERTE CELULAR. LA PORCIONQUE CAUSA LA MUERTE CELULAR PREFERIDA ES LA TOXINA BACTERIANA EXOTOXINA DE PSEUDOMONAS (PE). ESTA EXOTOXINA DE PSEUDOMONAS ES UN PRODUCTO DE LA PSEUDOMONAS AERUGINOSA. LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A UN METODO PARA LA PREPARACION DE DICHA PROTEINA. ESTA PROTEINA QUIMERICA SE PREPARA MEDIANTE LA FUSION GENETICA DE LA REGION FC DE LA MOLECULA DE IGE DE RATON CON PE 40 , UNA FORMA TRUNCADA DE LA PE QUE CARECE DEL DOMINIO DE UNION A CELULA. LA PRESENTE INVENCION TAMBIEN PROPORCIONA COMPOSICIONES FARMACEUTICAS PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES ALERGICAS Y PARA EL TRATAMIENTO DE HIPERPLASIAS Y TUMORES MALIGNOS, QUE COMPRENDEN COMO UN INGREDIENTE ACTIVO LA PROTEINA QUIMERICA CITADA ANTERIORMENTE Y UN PRODUCTO COADYUVANTE CONVENCIONAL.

Description

Proteína quimérica Fc\varepsilon-PE para el tratamiento dirigido de respuestas alérgicas, un procedimiento para su elaboración y composiciones farmacéuticas que la contienen.
Campo de la invención
La presente invención trata generalmente de un nuevo enfoque para el tratamiento de respuestas alérgicas. Más específicamente, la presente invención trata de una proteína quimérica Fc\varepsilon-PE para la eliminación dirigida de células que expresan Fc\varepsilonRI, un procedimiento para su elaboración y composiciones farmacéuticas que la contienen. Esta proteína quimérica está compuesta por marcadores celulares, que es una parte de la molécula de IgE unida a las fracciones citolíticas celulares para el reconocimiento y destrucción de células que sobreexpresan el receptor específico. La fracción citolítica usada en la proteína quimérica de la presente invención es la toxina bacteriana exotoxina de Pseudomonas (PE) (un producto de Pseudomonas aeruginosa).
Antecedentes de la invención
Aproximadamente el veinte por ciento de la población mundial padece diversas patologías alérgicas tales como asma, rinitis alérgica, alergias alimentarias, dermatitis atópica y anafilaxia. El alarmante aumento en la prevalencia de patologías alérgicas durante la pasada década ha provocado una clara necesidad de tratamientos más efectivos.
La interacción entre la IgE y los mastocitos o basófilos es la vía efectora primaria de las respuestas alérgicas. La IgE se une a receptores de alta afinidad (Fc\varepsilonRI) por su región constante, que se encuentra casi exclusivamente en la superficie de éstas células. La propia unión, a pesar de la baja tasa de disociación, no produce una estimulación de la célula. Sin embargo, el entrecruzamiento de la IgE unida a la superficie celular con antígenos multivalentes provoca la agregación del receptor, desencadenando una granulación celular explosiva mediante la cual se liberan mediadores alérgicos tales como histamina y serotonina.
El hecho de que la distribución del receptor Fc\varepsilonRI se restrinja a las células que participan en una respuesta alérgica lo hace un atractivo candidato para la inmunoterapia dirigida mediante citotoxinas quiméricas. Las citotoxinas quiméricas son una nueva clase de moléculas marcadas creadas mediante técnicas de fusión génica. Estas moléculas estas compuestas por fracciones marcadoras celulares y de citólisis, permitiéndoles reconocer y destruir células que sobreexpresen receptores específicos.
La toxina bacteriana exotoxina de Pseudomonas (PE) usada en la creación de la proteína quimérica, es un producto de Pseudomonas aeruginosa. Una vez que ha accedido al citoplasma, la PE inhibe la síntesis proteica mediante su actividad ADP-ribosilación, causando así la muerte celular (Middlebrook, J. I., y Dorland, R. B., 1984. Bacterial toxins: cellular mechanisms of action. Microbiol. Rev. 48, 199). Las citotoxinas quiméricas efectivas se han creado mediante fusión de ADNc que codifican para diversos factores de crecimiento o anticuerpos de cadena simple con derivados de PE sin capacidad intrínseca de unión celular. Se mostró que una de estas proteínas quiméricas, denominada
IL_{2}-PE_{40}, creada para marcar como objetivo y eliminar selectivamente linfocitos T activados que sobreexpresan receptores de IL_{2}, proporcionaba una inmunosupresión efectiva y selectiva en diversos modelos de desórdenes autoinmunes, rechazo al injerto y cáncer (Lorberboum-Galski, H., 1994. Interleukin 2-Pseudomonas exotoxin A (IL2-PE40) chimeric protein for targeted immunoterapia and the study of immune responses. J. Toxicol. - Toxin Reviews, 13 (1),
105).
La región constante recombinante completa de la IgE (Fc\varepsilon) expresada en la bacteria tiene una afinidad por el receptor Fc\varepsilonRI comparable a la de la IgE natural, así como la capacidad de sensibilizar a los basófilos para que liberen de histamina inducida por anti-IgE. Cuando fragmentos recombinados de Fc\varepsilon humana expresados en la bacteria se ensayan para comprobar la unión a receptor, se encontró que un péptido correspondiente a los residuos 301-376 en las uniones de los dominios 2 y 3 de la región constante era suficiente para una unión de alta afinidad con el receptor. También se informó de que no se requería la dimerización de la cadena \varepsilon para la unión al receptor (Helm, B., Marsc, P., Vercelli, D., Padlan. E., Gould, H. Y Geha, R. 1998. The mast cell binding site on human immunoglobin E. Nature 331, 180).
El documento US-A-5.082.927 describe una proteína quimérica IL4-PE_{40} que citoliza selectivamente las células portadoras de receptores de IL-4. También se describen composiciones farmacéuticas que comprenden esta proteína de fusión, así como su uso para el tratamiento de ciertos tumores.
El documento WO-A-90/12592 trata de una proteína de fusión que comprende PE_{40} como fracción citolítica y un anticuerpo como fracción marcadora. No se ha descrito ninguna fracción específica Fc\varepsilonRI marcadora ni tampoco ninguna proteína de fusión para el tratamiento de respuestas alérgicas, hiperplasia y patologías alérgicas.
Es por tanto un objeto de la invención proporcionar una proteína quimérica de fusión adicional útil como principio activo en composiciones farmacéuticas. Este objeto se ha conseguido mediante una proteína como la reivindicada en la reivindicación 1. Las composiciones farmacéuticas y los usos de estas proteínas se describen en las reivindicaciones dependientes.
La presente invención trata generalmente de un nuevo enfoque para el tratamiento de respuestas alérgicas. Actualmente, los principales grupos conocidos de fármacos usados en el tratamiento del asma y desórdenes alérgicos son:
1.
Agonistas \beta2 - producen una dilatación de las vías respiratorias mediante la estimulación de los receptores \beta2-adrenérgicos.
2.
Metilxantinas - son leves relajantes musculares, producen brondilatación.
3.
Glucocorticoides - reducen la inflamación.
4.
Cromoglicato sódico - evita la desgranulación de los mastocitos.
5.
Antihistamínicos - evitan la acción de la histamina sobre sus células destinatarias.
Aunque se usan ampliamente, todos estos fármacos tienen notables desventajas respecto a:
1.
Especificidad: la acción de todos estos fármacos (excepto el gromoglicato sódico) no es específica sobre los mastocitos. Por lo tanto, no pueden evitar la liberación de mediadores alérgicos, sino que más bien revierten o bloquean los efectos causados por su acción. El tratamiento con estos fármacos es sintomático, sólo puede comenzarse tras el establecimiento de la reacción alérgica, y por tanto no puede usarse de forma profiláctica.
2.
Toxicidad: al no ser específicas, estos fármacos ejercen su acción sobre diversos tejidos y órganos, causando importantes efectos secundarios. El principal efecto secundario de los agonistas \beta2 son los temblores, pero también puede provocar arritmias cardíacas; las metilxantinas estimulan el sistema nervioso central provocando nerviosismo, náuseas, vómitos, anorexia dolor de cabeza y taquicardia causada por el músculo cardiaco. Con altos niveles plasmáticos existe el riesgo de convulsiones y arritmias. Los antihistamínicos afectan al sistema nervioso central provocando sedación. Los esteroides son más dañinos, provocando la supresión de la función pituitaria-adrenal, alteraciones en fluidos y electrolitos, hipertensión, hiperglucemia, aumento de la susceptibilidad ante infecciones, osteoporosis y detención del crecimiento en niños.
3.
Duración del efecto: los agonistas \beta-adrenérgicos, las aminoxantinas y los antihistamínicos son fundamentalmente fármacos de acción corta, y como tales deben ser administrados con frecuencia. Los esteroides, que son fármacos de acción prolongada, también tienen un largo periodo de inducción y son de poco valor en las urgencias.
El único fármaco existente específico para los mastocitos es el cromoglicato sódico. Este fármaco puede usarse de forma profiláctica, esencialmente sin efectos secundarios. Sin embargo, tiene una vida media muy corta, un periodo de inducción muy largo, sólo puede aplicarse localmente y sólo algunos pacientes responden a el. Todo esto hace que el uso del cromoglicato sódico sea muy limitado.
En años recientes se ha informado de numerosos intentos de interferir en la interacción entre la IgE y su receptor de alta afinidad, como base para el tratamiento antialérgico. Se han investigado péptidos recombinantes que comprenden elementos estructurales de la IgE (Helm, B., Kebo, D., Vercelli,. D., Glovsky, M. M., Gould, H., Ishizaka, K., Geha, R., y Ishizaka, T., 1989. Blocking the passive sensitization of human mast cells and basophil granolocytes with IgE antibodies by a recombinant human \varepsilon-chain fragment of 76 amino acids. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU 86, 9465) o de la Fc\varepsilonRI (Ra, C., Kuromitsu, S., Hirose, T., Yasuda, S., Furuichi, K. Y Okumura, K., 1993. Soluble human high affinity receptor for IgE abrogates the IgE-mediated allergic reaction. Int. Immunol. 5, 47; Haak-Frendscho, M., Ridgway, J., Shields, R., Robbins, K., Gorman, C y Jardieu, P., 1993. Human IgE receptor a-chain IgG chimera blocks passive cutaneous anaphylaxis reaction in vivo. J. Immunol. 151, 351) como inhibidores competitivos de la interacción IgE-Fc\varepsilonRI. También se han ensayado los anticuerpos monoclonales generados contra la IgE (Baniyash, M. y Eshhar, Z., 1984. Inhibition of IgE binding to mast cells and basophils by monoclonal antibodies to murine IgE. Eur. J. Immunol. 14, 799) o la Fc\varepsilonRI (Kitani, S., Kraft, D., Fischler, C., Mergenhagen, S. E. y Siraganian, R. P. 1988. Inhibition of allergic reactions with monoclonal antibody to the high affinity IgE receptor. J. Immunol. 140, 2585), capaces de bloquear la unión de la IgE al receptor sin provocar la desgranulación de los mastocitos. Sin embargo, la afinidad de la IgE por el Fc\varepsilonRI es muy alta (K_{M}=10^{-10} M), de forma que una vez que se ha unido a su receptor, la molécula de IgE permanece unida a la membrana celular durante varias semanas. Además, el mastocito puede ser activado con una baja ocupación del receptor: el entrecruzamiento de tan solo el 5% de los receptores es suficiente para provocar la desgranulación del mastocito. Estas dos propiedades del sistema impiden la inhibición mediante agentes competitivos, limitando así su valor clínico. Nuestra molécula antialérgica depende en un grado mucho menor de la capacidad para competir con la IgE. Una vez que ha entrado en la célula destinataria a través de un receptor de IgE no ocupado, la proteína quimérica afecta a la célula destinataria. Además, la expresión temprana del receptor en el transcurso de la maduración de los mastocitos debería permitir la eliminación de las células destinatarias inmaduras antes de que sean capaces de liberar al mediador. Como el receptor no se expresa en las células madre, por lo general no se espera que haya daño en la médula ósea.
El sistema de la IgE es bastante complejo y variado. Las interacciones entre la IgE y sus estructuras de unión tienen muchas funciones aparte de la respuesta alérgica, algunas de las cuales sólo están comenzando a surgir. Los anticuerpos monoclonales contra la IL-4, el receptor de la IL-4 o el receptor de baja afinidad de la IgE eliminan la expresión de la IgE en ratones, pero tienen efectos inmunosupresores más generales. La ventaja de la presente invención, en la que se marca como objetivo el receptor de la IgE y no el sistema global de la IgE es, por tanto, evidente.
Resumen de la invención
La presente invención trata generalmente de un nuevo enfoque para el tratamiento de respuestas alérgicas basada en la eliminación dirigida de las células que expresan el receptor Fc\varepsilonRI mediante una citotoxina quimérica Fc_{2'-3}-PE_{40}. Se fusionó genéticamente una secuencia que codifica para los aminoácidos 301-437 de la región Fc de la molécula de IgE de ratón con PE_{40} - una forma truncada de PE sin el dominio de unión celular. La proteína quimérica, producida en E. coli, citoliza específica y eficazmente líneas celulares de mastocitos de ratón que expresan el receptor Fc\varepsilonRI, así como mastocitos primarios derivados de la médula ósea.
La presente invención proporciona una proteína quimérica para la eliminación dirigida de células que expresan Fc\varepsilonRI especialmente útil en el tratamiento de respuestas alérgicas. Dicha proteína quimérica está comprendida por una fracción marcadora celular para las células que expresan el Fc\varepsilonRI y una fracción citolítica. La fracción citolítica preferible es la toxina bacteriana exotoxina de Pseudomonas (PE). Esta exotoxina de Pseudomonas es un producto de Psedomonas aeruginosa.
La presente invención también trata de un procedimiento para preparar dicha proteína. Esta proteína quimérica se prepara mediante fusión genética de la región Fc de la molécula de IgE de ratón con PE_{40}, una forma truncada de la PE sin el dominio de unión celular.
La presente invención también proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento de patologías alérgicas y para el tratamiento de hiperplasias y tumores, comprendiendo como principio activo la proteína quimérica mencionada anteriormente y producto coadyuvante convencional.
La presente invención trata además de un procedimiento para la preparación de estas composiciones farmacéuticas que comprenden la región Fc de la molécula de IgE de ratón fusionada genéticamente con PE_{40}, y la adición, si fuera necesario, de un producto coadyuvante convencional. Las composiciones farmacéuticas según la presente invención pueden estar bajo cualquier forma adecuada para su inyección, su aplicación tópica o su administración por vía oral.
Descripción detallada de la invención
La proteína quimérica Fc-PE según la presente invención tiene un cierto número de ventajas sobre los fármacos conocidos existentes:
1.
Especificidad: la Fc-PE es altamente específica, afectando a las células (mastocitos y basófilos) responsables de la liberación de mediadores alérgicos. Dado que impide el ataque alérgico, puede ser de gran valor como tratamiento profiláctico.
2.
Toxicidad: dado que actúa sobre las células afectoras y no sobre los órganos destinatarios, se espera que la Fc-PE tenga pocos efectos secundarios, si es que los tiene. Además, como el receptor no se expresa en las células madre no se prevé daño sobre la médula ósea ni inmunosupersión. Se espera que la recuperación del estado fisiológico normal se produzca varias semanas después de finalizar el tratamiento.
3.
Duración del efecto: dado que la maduración de los mastocitos dura varias semanas, se prevé que el efecto de la Fc-PE sea de duración sostenida, eliminando la necesidad de administraciones frecuentes. Además, como los estudios in vitro indican que la reducción del 80% en la síntesis proteica celular se observa en menos de 4 horas, se espera que el tiempo de inducción de la Fc-PE sea relativamente corto, permitiendo su uso en reacciones alérgicas en fase aguda.
La Fc-PE también puede ser valiosa en el tratamiento de hiperplasias y tumores de mastocitos y basófilos, como la mastocitosis sistémica (en las dos formas benigna y maligna) y la leucemia basófila. La quimioterapia no se adecuada para pacientes con mastocitosis benigna debido a los graves efectos secundarios. Por otro lado, no existe un buen protocolo clínico para el tratamiento de patologías malignas. La proteína quimérica Fc-PE, por ser altamente potente y selectiva, puede usarse en dolencias benignas y malignas que impliquen células que expresan los receptores Fc\varepsilonRI.
Los siguientes resultados experimentales indican que la proteína quimérica Fc_{2'-3}-PE_{40} según la presente invención es un candidato prometedor para el tratamiento eficaz y selectivo de la alergia.
La presente invención proporciona una proteína citotoxina quimérica Fc-PE para la eliminación dirigida de células que expresan Fc\varepsilon-RI, especialmente útil para el tratamiento de respuestas alérgicas tales como asma, rinitis alérgica, alergias alimentarias, dermatitis atópica y anafilaxia.
Dicha invención se describirá más detalladamente mediante los siguientes experimentos. Estos experimentos no pretenden limitar el alcance de la invención, sino únicamente demostrarla y clarificarla.
1. Elaboración de proteínas quiméricas Fc\varepsilon-PE_{40}
Para la fracción marcadora se usan los fragmentos de proteína quimérica de la región constante de la IgE de ratón (Fc\varepsilon), ya que se unen a los receptores de alta afinidad de IgE tanto humanos como de ratón (Conrad, D. H., Wingard, J. R. Y Ishizaka, T., 1983. The interaction of human and rodent IgE with the human basophil IgE receptor. J. Immunol. 130, 327).
Usamos una secuencia correspondiente a los a.a. 301-437 que contenía el COOH terminal del dominio 2 y el dominio 3(C_{2'}-C_{3}) completo. También usamos una secuencia correspondiente a los a.a. 225-552 que contenía los dominios C_{2}-C_{4} completos. El ADNc para estos fragmentos se obtuvo mediante RT-PCR usando ARN aislado a partir de linfocitos B de ratón que se alteraron isotópicamente para que secretaran IgE, y un conjunto específico de cebadores. Los linfocitos B obtenidos a partir del bazo de un ratón BALB/C de 6 semanas se separaron mediante selección negativa usando anti-Thy 1.2 y complemento de ratón. Las células se incubaron a 2x10^{6} céls/ml en presencia de lipopolisacárido (LPS, 10 \mug/ml) e IL_{4} (500 U/ml) durante 5 días para inducir una alteración isotípica para la producción de IgE. Después de 5 días se aisló el ARN celular total (equipo de aislamiento ARNzol TM B, producido por BIOTECK Laboratories, Houston, EE.UU.). El ARN total (2,5 \mug) se retrotranscribió entonces en una primera hebra de ADNc usando las condiciones del sistema de transcripción inversa (Promega, EE.UU.) recomendadas por el fabricante. El ADNc se diluyó hasta un volumen total de 1 ml con tampón TE (Tris-HCl 10 mM, pH 7,6, EDTA 1 mM) y se almacenó a 4ºC hasta su uso.
Los fragmentos de Fc\varepsilon se produjeron mediante PCR usando ADNc y un par de cebadores oligonucleótidos sintéticos 5'-GCG GAT CCC ATA TGG AGC AAT GGA TGT CGT-3' (sentido, partiendo del nucleótido 406 según una secuencia del banco genético J00476) y 5'-GCG GAT CCC ATA TGT GGG GTC TTG GTG ATG GAA C-3' (antisentido, partiendo del nucleótido 813) para la secuencia Fc\varepsilon_{2'-3} y 5'-GCG GAT CCC ATA TGC GAC CGT TCA ACA TCA CTG-3' (sentido, partiendo del nucleótido 175) y 5'-GCG GAT CCC ATA TGG GAG GGA CGG AGG GAG G-3'(antisentido, partiendo del nucleótido 1167) para la secuencia Fc\varepsilon_{2-4}.
Los oligonucleótidos sintéticos se sintetizaron en un sintetizador de ADN de Applied Biosystems y se purificaron en cartuchos de purificación de oligonucleótidos. Se usó la enzima vent polimerasa (TM) (Biolabs) para la amplificación. La mezcla de reacción se incubó en un ciclador térmico de ADN (MJ Research, Inc., EE.UU.) durante 33 ciclos. Cada ciclo consistió en 1 min a 95ºC, 1 min a la temperatura de hibridación y 2 min a 72ºC. La concentración de MgSO_{4} y la temperatura de hibridación usadas para cada primer par fueron: 2,5 ml y 61ºC para Fc_{2'-3}, 2 mM y 57ºC para Fc_{2-4}.
El plásmido pHL 906, que codifica la IL_{2}-PE_{40}, se describió previamente (Fishman, A., Bar-Kana, Y., Steinberger, I. y Lorberboum-Galski, H., 1994. Increased citotoxicity of IL2-PE chimeric proteins containing targeting signal for lysosomal membranes. Biochem., 33, 6235). El plásmido pHL 906 se cortó con Ndel, obteniendo el fragmento mayor, de 3596 pb. El anterior fragmento Fc\varepsilon se insertó en el sitio Ndel del pHL 906. Los plásmidos resultantes, pAF2302 y pAF2415, que codifican respectivamente para los fragmentos C_{2'}-C_{3} y C_{2}-C_{4}, cada uno fusionado en 5' con PE_{40}, se caracterizaron mediante restricción y análisis de secuencia (no se muestran los resultados). Se usó la cepa HB101 de Escherichia coli para la transformación y preparación de los plásmidos.
2. Expresión y purificación parcial de las proteínas quiméricas
La proteína quimérica recién diseñada, Fc\varepsilon-PE_{40}, codificada por el plásmido pAF2302, se expresó en la cepa de E. coli BL21 (lambda-DE3), que porta un gen de ARN polimerasa T7 en una forma lisogénica e inducible. La inducción se llevó a cabo a O.D._{590} 0,5 durante 180 min en presencia de isopropil-\beta-D-tiogalactósido (IPTG, concentración final 1 mM). Se suspendió una célula que expresaba sedimento en tampón TE (Tris 50 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM) que contenía 0,2 mg/ml de lisosima, se sometió a ultrasonidos (tres exposiciones de 30 s) y se centrífugo a 30.000 x g durante 30 min. El sobrenadante (fracción soluble) se extrajo y se conservó para su análisis. El sedimento se desnaturalizó con tampón de extracción (guanidina-clorhidruro 6 M, Tris 0,1 M pH 8,6, EDTA 1 mM, NaCl 0,05 M y DTT 10 mM) y se agitó durante 30 min a 4ºC. La suspensión se clarificó por centrifugación a 30.000 x g durante 15 min y el sedimento se descartó. Entonces se dializó el sobrenadante frente a Tris 0,1 M (pH 8,0), EDTA 1 mM, NaCl 0,25 mM y L-arginina 0,25 mM durante 16 h. El dializado se centrífugo a 15.000 x g durante 15 min y el sobrenadante resultante (fracción insoluble, tratada con guanidina-clorhidruro) se usó como fuente de proteínas quiméricas. Las proteínas se caracterizaron mediante electroforesis en gel (Fig. 2). El perfil proteico de los extractos celulares completos reveló el alto nivel de expresión de la proteína quimérica.
La proteína se caracterizó adicionalmente mediante análisis por inmunotransferencia usando anticuerpos contra PE (Fig. 3A) y contra IgE (Serotec, Inglaterra) (Fig. 3B). Las muestras electroforetizadas se transfirieron a nitrocelulosa y se inmunotransfirieron según se ha descrito (loberboum-Galski, H., Fitzgerald, D. J., Chaudhary, V., Ashya, S. Y Pastan, I., 1988. Cytotoxic activity of an interleukin 2 - Pseudomonas exotoxin chimeric protein produced in Eschericia coli. Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU. 85, 1992). Se usó un equipo Vectastain ABC (Vector Laboratories, EE.UU.) según las intrucciones del fabricante. La quimera reaccionó con ambos anticuerpos, confirmando así la clonación y la producción de una proteína quimérica en estructura y de longitud completa.
El fraccionamiento subcelular de las células expresoras reveló que la fracción insoluble (anticuerpos de inclusión) era especialmente rica en proteína quimérica (Fig. 2). Esta fracción se usó por tanto como fuente de la proteína quimérica.
La actividad de ADP-ribosilación de las muestras ensayadas se midió usando extractos de germen de trigo enriquecidos en factor de elongación 2 como sustrato, según se describió previamente, y revelaron que la nueva proteína quimérica era activa enzimáticamente (los resultados no se muestran).
3. Efecto de la proteína quimérica Fc_{2'-3}-PE_{40} sobre líneas celulares de mastocitos de ratón
Se ensayó el efecto citotóxico de la proteína quimérica sobre diversas líneas celulares de mastocitos de ratón de las que se sabe que expresan el receptor Fc\varepsilonRI. Se evaluó la actividad citotóxica de la proteína quimérica mediante inhibición de la síntesis proteica, medida por la incorporación de [^{3}H]-leucina. Se añadieron diversas concentraciones de proteína quimérica, diluidas con albúmina sérica bovina al 0,25% en disolución salina tamponada con fosfato, a 2 x 10^{4} células/0,2 ml sembradas en placas de 96 pocillos durante 20 h, seguido de un pulso de 8 h con 2 \muCi de [^{3}H]-leucina. Los resultados se expresan como porcentaje de los experimentos de control, en los que las células no fueron expuestas a la proteína quimérica. Todos los ensayos se llevaron a cabo por triplicado en tres experimentos por separado.
Se usaron tres líneas celulares destinatarias que expresaban el receptor Fc\varepsilonRI: MC-9, una línea celular de mastocitos procedente de hígado fetal de ratón y dependiente de la IL_{3} para su crecimiento, C57, una línea celular de mastocitos independiente de IL_{3} procedente de médula ósea de ratón, y la línea celular de mastocitos transformada del virus de Abelson procedente de placenta embrionaria de ratón a mitad de gestación.
Se encontró que la Fc\varepsilon-PE_{40} era citotóxica de una forma dosis dependiente para todas las líneas celulares ensayadas (Fig. 4). Las líneas MC-9 y C57 eran extremadamente sensibles a la toxina quimérica, con una DI_{50} de 50-75 ng/ml y 100-125 ng/ml, respectivamente. La línea celular de Alelson era mucho menos sensible (DI_{50} de 1.200-1.500 ng/ml).
4. Especificidad de la respuesta a Fc\varepsilon-PE_{40}
Para comprobar la especificidad de la actividad Fc_{2'-3}-PE_{40} se crearon y evaluaron dos proteínas de control, PE_{40} y Fc_{2'-3}-PE_{40M} para comprobar su efecto sobre células destinatarias y no destinatarias. Para crear la Fc_{2'-3}-PE_{40M} se escindió con EcoRI y BamHI la región que codifica para los 122 aminoácidos en el extremo C de la PE y se reemplazó por el correspondiente fragmento que porta una deleción en el aminoácido 553.
La PE_{40}, que no tiene capacidad marcadora intrínseca, no tuvo, según se esperaba, ningún efecto sobre las líneas celulares destinatarias (Fig. 4). La Fc_{2'-3}-PE_{40M}, que posee una fracción Fc_{2'-3} unida a una forma mutada y enzimáticamente inactiva de PE_{40}, tampoco fue citotóxica para las células destinatarias (Fig. 4).
Además, fue posible bloquear el efecto citotóxico de la Fc_{2'-3}-PE_{40} hacia las células destinatarias mediante IgE completa de ratón (40 \mug/ml, Fig. 5A) o mediante un anticuerpo policlonal \alphaPE (10 g/ml, Fig. 5B).
También se ensayó el efecto de la Fc_{2'-3}-PE_{40} en diversas líneas celulares de ratón no destinatarias (Tabla 1). Todas las líneas celulares de origen hematopoyético no se vieron afectadas por la proteína quimérica. Sorprendentemente, las líneas celulares de fibroblastos y células sanguíneas mostraron una cierta sensibilidad ante la toxina quimérica, aunque los valores de DI_{50} fueron veinte veces mayores que los de las células MC-9 (Tabla 1).
Los datos anteriores demuestran que el efecto tóxico de la Fc_{2'-3}-PE_{40} sobre las líneas celulares de mastocitos es debido a una respuesta específica mediada por la fracción Fc_{2'-3}, que marca la parte citotóxica de la quimera (PE_{40}) en la célula.
5. Efecto de las proteínas quiméricas sobre mastocitos primarios
Dado que es probable que los mastocitos frescos de ratón reaccionen de forma diferente a las líneas celulares establecidas, también ensayamos mastocitos primarios obtenidos a partir de ratones normales para comprobar su sensibilidad a la Fc_{2'-3}-PE_{40}. Cuando se cultivó en presencia de IL_{3} durante dos semanas, la médula ósea de ratón se diferencia en una población de células prácticamente pura con la morfología de mastocitos inmaduros, que contienen gránulos y expresan el receptor Fc\varepsilonRI.
Se sacrificaron ratones BALB/C de 4-6 semanas, y su médula ósea se enjuagó asépticamente, a partir de los fémures, con NaCl frío al 0,9%. La suspensión de células se lavó dos veces con NaCl al 0,9%, se centrífugo durante 10 min a 300 x g, y finalmente se resuspendió en medio RPMI 1640 que contenía suero fetal de ternera inactivado por calor al 10%, L-glutamina 4 mM, piruvato sódico 1 mM, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, \beta-mercaptoetanol 5 x 10^{-5} M, 100 u/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina y 20 u/ml de IL_{3} de ratón recombinante. Las células se hicieron crecer en matraces de cultivo tisular a una densidad de 10^{6} céls/ml, a 37ºC en una atmósfera humidificada de CO_{2} al 5% durante 2-3 semanas. Los medios de cultivo se cambiaron cada 7 días. La IL_{4} recombinante (10 u/ml) se añadió partiendo del día 7 de cultivo.
\newpage
Para controlar el grado de maduración las células se extendieron sobre portaobjetos, se tiñeron con Azul de Toluidina ácido (pH 1,0) y se examinaron al microscopio bajo aceite.
Se ensayó el efecto de las proteínas quiméricas sobre mastocitos derivados de la médula ósea (MDMO) el decimosexto día de cultivo. Como se muestra en la Fig. 6, la Fc_{2'-3}-PE_{40} fue citotóxica para los MDMO de una forma dosis dependiente, con una DI_{50} de 125 ng/ml. A una elevada dosis de proteína quimérica había prácticamente un 100% de inhibición de la síntesis proteica. Ninguna de las proteínas de control Fc_{2'-3}-PE_{40M} o PE_{40} mostró citotoxicidad frente a los MDMO (Fig. 6). Así, los mastocitos primarios respondieron frente a la proteína quimérica de una forma similar a la establecida para las líneas celulares de mastocitos (Figs. 4 y 6).
6. Especificidad de receptor de la Fc_{2'-3}-PE_{40}
Aparte del receptor Fc\varepsilonRI de alta afinidad, se informó de que otras tres estructuras de la superficie de la membrana unían la IgE con baja afinidad - el receptor de baja afinidad Fc\varepsilonRII, la proteína fijadora de \varepsilonBP-galactósido (también denominada MAC-2 o CBP35) y el receptor Fc\gammaRII/III. Estas estructuras aparecen en diversos tipos celulares, principalmente de origen hematopoyético, pero también en fibroblastos (\varepsilonBP). Los Fc\gammaRII/III y \varepsilonBP aparecen en las membranas de mastocitos, además del Fc\varepsilonRI. Dado que nuestro propósito era marcar únicamente los mastocitos, era fundamental probar que la proteína quimérica no reconoce estas estructuras, y por tanto no puede ser internalizada a través de ellas. Teóricamente, nuestra proteína quimérica no cumple los requisitos de unión de las estructuras de baja afinidad de unión de IgE, los Fc\varepsilonRII, \varepsilonBP y Fc\gammaRII/III. El Fc\varepsilonRII sólo une dímeros de cadenas \varepsilon unidos por disulfuro, mientras que nuestra proteína no tiene el dominio 4, que es esencial para la dimerización. El \varepsilonBP sólo une IgE glucosilada; la Fc_{2'-3}-PE_{40} que se produce en las bacterias no está glucosilada. El Fc\gammaRII/III une inmunocomplejos de IgE, pero no IgE libre. No obstante, el asunto de la unión del receptor se puso a prueba experimentalmente.
Los experimentos que implicaban el \varepsilonBP y el Fc\gammaRII/III se realizaron en mastocitos C57, de los que se sabe que expresan estos receptores además del Fc\varepsilonRI. Para ensayar si la proteína quimérica podía entrar o no en la célula vía los receptores Fc\gammaRII/III, las células se preincubaron con el anticuerpo 2.4G2 (Pharmigen) (50 \mug/m) antes de añadir la proteína quimérica. Este anticuerpo monoclonal, que se une a los dominios extracelulares de los receptores Fc\gammaRII y Fc\gammaRIII, demostró ser un inhibidor competitivo de la unión de IgE. Como puede verse en la Fig. 7A, no hubo diferencia alguna en la respuesta celular a la Fc_{2'-3}-PE_{40} entre las células de control y las células preincubadas con el anticuerpo.
A continuación examinamos si el \varepsilonBP estaba implicado en la citotoxicidad de la Fc_{2'-3}-PE_{40}. Dado que el \varepsilonBP está unido a determinantes carbohidratos de la membrana, la adición de lactosa al medio de cultivo provoca su disociación de la superficie celular. No encontramos ninguna diferencia en la respuesta celular a Fc_{2'-3}-PE_{40} en presencia o en ausencia de lactosa (25 mM, Fig. 7B).
Se realizaron experimentos adicionales en presencia de anticuerpo 2.4G2 y lactosa sobre líneas celulares de fibroblastos, y se encontró que respondían parcialmente ante la proteína quimérica (Tabla 1). De nuevo, no hubo diferencia alguna entre la citotoxicidad de la Fc_{2'-3}-PE_{40} frente a células tratadas y de control (no se muestran los resultados).
Para ensayar si la Fc_{2'-3}-PE_{40} afecta a las células portadoras del Fc\varepsilonRII usamos la línea celular 0.12A3, un hibridoma linfocitario de ratón que expresa el receptor Fc\varepsilonRII. Las células 0.12A3 no respondieron en absoluto a la Fc_{2'-3}-PE_{40}, incluso a dosis altas (>5.000 ng/ml, Fig. 8). Dado que esta línea pierde el receptor durante un cultivo a largo plazo, a continuación del ensayo se realizó un análisis FACS con el anticuerpo B3B4 contra el receptor (Pharmigin). Los resultados mostraron que el receptor estaba expresado en el 54% de las células (no se muestran los resultados).
Se realizó un experimento adicional con esplenocitos B frescos de ratón preincubados durante 16 h con LPS (50 \mug/ml) para estimular la expresión del Fc\varepsilonRII. La Fc_{2'-3}-PE_{40} no tuvo efecto alguno sobre estos esplenocitos B (no se muestran los resultados), aunque el 69% de las células expresaron el receptor, según se determino mediante análisis FACS.
En conjunto, estos resultados sugieren que la Fc_{2'-3}-PE_{40} no se une a las estructuras de unión de baja afinidad de la IgE, a saber, Fc\varepsilonRII, Fc RII/III y \varepsilonBP.
7. Efecto de la Fc_{2'-3}-PE_{40} sobre la desgranulación celular
Debido a la posible aplicabilidad clínica de la Fc_{2'-3}-PE_{40}, era importante ensayar si el tratamiento de los mastocitos con Fc_{2'-3}-PE_{40} produce la liberación de mediadores alérgicos desencadenada por la unión de la proteína quimérica al Fc\varepsilonRI.
Se incubaron células C57 durante la noche con [^{3}H]-hidroxitriptamina (10 \muci/ml) a 37ºC. Las células se lavaron 3 veces para eliminar la [^{3}H]-hidroxitriptamina libre, se colocaron en tampón de Tirod (Hepes 10 mM pH 7,4, NaCl 130 mM, KCl 5 mM, glucosa 5,6 mM, ASB al 0,5%) a 2,5 x 10^{5} céls/0,5 ml en placas de 24 pocillos de cultivo tisular, y se incubaron con IgE (10 \mug/ml) durante 1 hora a 4ºC. Se añadieron entonces MgCl_{2} y CaCl_{2} hasta una concentración final de 1 mM y 1,6 mM, respectivamente, seguido de una incubación con dinitrofenil-albúmina sérica humana (DNP-ASH, 50 ng/ml) durante 30 minutos o con las diferentes concentraciones de proteína quimérica durantes varios tiempos a 37ºC. Las células libres sobrenadantes se recogieron mediante centrifugación, y se midió la cantidad de [^{3}H]-hidroxitriptamina liberada. No se observó desgranulación con ninguna concentración de proteína quimérica ensayada (figura 9A). Como control se expusieron a DNP células preincubadas con IgE en las mismas condiciones. El efecto de desencadenamiento de la desgranulación por DNP es claramente visible (figura 9a). La Fc_{2'-3}-PE_{40} no provocó desgranulación ni siquiera en las etapas tardías de su interacción con la célula destinataria (figura 9b), mientras que sí inhibe la síntesis proteica en más del 80% (figura 9c). Nuestros resultados demuestran que la Fc_{2'-3}-PE_{40} no desencadena la desgranulación en ninguna etapa durante su interacción con la célula.
8. Caracterización electroforética de Fc\varepsilon-PE_{40}
El análisis por inmunotransferencia de las muestras electroforetizadas realizado en condiciones no reductoras (prescindiendo del 2-mercaptoetanol en el tampón de la muestra) reveló que la proteína quimérica Fc_{2'-3}-PE_{40} está presente de forma predominante en forma de monómero (figura 10b). Para la PAGE natural se prescindió del 2-mercaptoetanol en el tampón de la muestra y las muestras no se calentaron. Además, el SDS se reemplazó con volúmenes equivalentes de agua en el gel del tampón de la muestra y en el tampón de funcionamiento del electrodo. En condiciones no desnaturalizantes, la proteína quimérica avanza como una banda ancha (figura 10c). Un sistema natural sencillo no puede distinguir los efectos del peso molecular, carga y conformación sobre la movilidad electroforética de la proteína. Sin embargo, la proximidad de las moléculas en la banda indica que no pueden diferir mucho en estos parámetros.
9. Ensayo de internalización
La actividad in vitro de la proteína quimérica sólo se consigue tras su internalización. Para ensayar si la proteína quimérica es internalizada se incubaron 5 x 10^{5} céls/3 ml durante 1 hora con 20 \mug de la proteína quimérica a 37ºC. Después de 3 lavados con PBS frío, el sedimento se trató con 0,5 ml de disolución ácida (NaCl 0,15 M, ácido acético 0,15 M (pH 3)) durante 3 min en hielo para eliminar la proteína quimérica unida a la membrana. Entonces se neutralizó el pH mediante la adición de FCS al 50% seguido de tres lavados con RPMI/10% FCS. El sedimento celular se lisó con 0,3 ml de tampón de lisis RIPA (NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, tris-HCl 20 mM pH 7,4, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM, SDS al 15%, ácido desoxicólico al 1%, Nonidet P-40 al 1%). Se electroforetizaron varias muestras y se inmunotransfirieron usando \alpha-PE y el sistema de detección ECL (Amersham). El análisis por inmunotransferrencia reveló que, indudablemente, la proteína quimérica Fc_{2'-3}-PE_{40} es internalizada por las células destinatarias (figura 11).

Claims (11)

1. Una proteína quimérica que comprende una fracción marcadora celular para células que expresan Fc\varepsilonRI, y una fracción citolítica, para obtener la eliminación dirigida de las células que expresan Fc\varepsilonRI, para su uso como un medicamento.
2. Una proteína quimérica según la reivindicación 1, en la que la fracción citolítica es la toxina bacterina exotoxina de Pseudomonas (PE).
3. Una proteína quimérica según la reivindicación 1 ó 2, en la que la fracción marcadora celular es la región Fc de la molécula de IgE de ratón.
4. Una proteína quimérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que las fracciones marcadoras celulares y de citólisis se fusionan genéticamente.
5. Una proteína quimérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que se fusionan genéticamente una secuencia que codifica para los aminoácidos 225-552 de la región Fc de la molécula de IgE de ratón con PE_{40}, una forma truncada de PE sin el dominio de unión celular.
6. Una proteína quimérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 precedentes, en la que se fusiona genéticamente una secuencia que codifica para los aminoácidos 301-437 de la región Fc de la molécula de IgE de ratón con PE_{40}, una forma truncada de PE sin el dominio de unión celular.
7. Uso de una proteína quimérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 precedentes para la fabricación de una composición farmacéutica que también contiene un coadyuvante farmacéutico.
8. Uso de una proteína quimérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 precedentes para la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento de respuestas alérgicas, patologías alérgicas, tumores que implican células que expresan el receptor Fc\varepsilonRI, asma, rinitis alérgica, alergias alimentarias, dermatitis atópica, anafilaxia, hiperplasia.
9. Una composición farmacéutica según la reivindicación 7 u 8, preparada para inyección (intravenosa, intraarticular, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal), intranasal, intratecal, intradérmica, transdérmica, inhalación, aplicación tópica, administración oral, liberación sostenida y la vía enteral.
10. Procedimiento para preparar una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, que comprende la etapa de fusionar genéticamente la región Fc de la molécula de IgE de ratón con PE.
11. Procedimiento para preparar una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, que comprende el uso de un plásmido en el que se une operativamente un promotor a una molécula de ADN que codifica para una proteína según las reivindicaciones 1 a 6.
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