ES2321992T3 - Formas no anafilacticas de alergenos y su uso. - Google Patents

Formas no anafilacticas de alergenos y su uso. Download PDF

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Abstract

Un inmunógeno derivado de un alérgeno proteínico, caracterizado porque dicho inmunógeno comprende una forma polimérica recombinante de un alérgeno proteínico Bet v 1, en el que el alérgeno proteínico constituye las unidades monoméricas, en el que el número de unidades monoméricas de la forma polimérica es un número entero que se selecciona a partir de 2 a 10.

Description

Formas no anafilácticas de alérgenos y su uso.
Campo técnico y antecedentes
La presente invención se refiere a formas no anafilácticas de un alérgeno proteínico y al uso de las formas para la hiposensibilización. La invención también se refiere al uso de las formas no anafilácticas para la preparación de un medicamento para usar en un procedimiento de hiposensibilización de un individuo mamífero, habitualmente un individuo humano, que padece alergia de tipo I contra un alérgeno proteínico.
La invención se refiere principalmente a alérgenos proteínicos para tratar seres humanos.
Por alérgeno proteínico se quiere decir el alérgeno principal del polen de abedul Bet v 1.
En abril de 1997, los presentes inventores publicaron un artículo que trataba sobre fragmentos no anafilácticos del alérgeno Bet v 1. Véase Vrtala y cols., "Conversion of the major birch pollen allergen, Bet v 1, into two non-anaphylactic T cell epitope containing fragments", J. Clin. Invest. 99 (7) abril de 1997, 1673-1681.
La alergia de tipo I representa un gran problema sanitario en los países industrializados en los que más del 20% de la población padece de reacciones alérgicas de tipo I (rinitis alérgica, conjuntivitis, asma alérgica y choque anafiláctico) (Kaplan (ed) Allergy. Churchill Livingstone, Nueva York (1985)). Las proteínas ambientales del polen, los ácaros y el epitelio de los animales están entre los principales componentes que inducen la liberación de mediadores biológicos (por ejemplo histamina) al unirse a anticuerpos IgE específicos unidos a células efectoras (mastocitos, basófilos). La producción de IgE específicas por los linfocitos B es estimulada por los linfocitos T cooperadores específicos que, en su mayoría, pertenecen al tipo TH2 (Romagnani, Immunol. Today 13 (1992) 379-381). El tratamiento de las enfermedades alérgicas de tipo I, actualmente se realiza mediante tratamiento farmacológico y mediante inmunoterapia específica. La inmunoterapia específica se estableció ya a principios del siglo pasado (Noon, Lancet 1 (1911) 1572-1573) y supone la aplicación sistémica de dosis cada vez mayores de alérgenos durante periodos prolongados. Aunque se reconoce que la inmunoterapia específica es un tratamiento eficaz, la aparición de efectos secundarios anafilácticos representa una de las principales desventajas de este tratamiento. Para reducir las reacciones anafilácticas, recientemente se ha propuesto el uso de epítopos de linfocitos T para la inmunoterapia con alérgenos específicos (Briner y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 7608-7612, y Norman, Curr. Opin. Immunol. 5 (1993) 986-973).
Los alérgenos alojan una gran variedad de diferentes epítopos de linfocitos T (Ebner y cols., J. Immunol 150 (1993) 1047-1054; Joost-van-Neerven y cols., J. Immunol. 151 (1993) 2326-2335; y Schenk y cols., J. Allergy Clin. Immunol. 96 (1995) 986-996) que pueden superponerse a los epítopos de IgE contiguos. Para evitar el entrecruzamiento de la IgE unida a células efectoras (mastocitos, basófilos) y la liberación de mediadores, deben separarse los epítopos de los linfocitos T y los epítopos de IgE. Siguiendo el concepto de convertir un alérgeno principal en una vacuna de linfocitos T, los presentes inventores seleccionaron Bet v 1 (Breiteneder y cols., EMBO J. 8 (1989) 1935-1938), el principal alérgeno del polen de abedul, como modelo.
Se seleccionó Bet v 1 porque el análisis de los epítopos indicó que forma epítopos de IgE de conformación (Visco y cols., J. Immunol. 157 (1996) 956-962; y Laffer y cols., J. Immunol. 157 (1996) 4953-4962). Además, Bet v 1 representa uno de los alérgenos más habituales que es reconocido por el 95% de los individuos alérgicos al polen de los árboles y a alimentos y casi el 60% de ellos presentan sensibilización exclusiva a Bet v 1 (Jarolim y cols., Allergy 44 (1989) 385-394). Recientemente se ha aislado el ADNc que codifica Bet v 1 (Breiteneder y cols., EMBO J. 8 (1989) 1935-1938) y se ha expresado Bet v 1 recombinante en Escherichia coli (Valenta y cols., J. Allergy Clin. Immunol. 88 (1991) 889-894; y Ferreira y cols., J. Biol. Chem. 268 (1993) 19574-19580). Se ha demostrado que Bet v 1 recombinante posee una capacidad de unirse a IgE similar a la del Bet v 1 natural y comparte epítopos de IgE así como de linfocitos T con proteínas homólogas a Bet v 1 presentes en el polen de diversos árboles y alimentos derivados de vegetales (Ebner y cols., J. Allergy Clin. Immunol. 95 (1995) 962-969; Ebner y cols., J. Immunol. 150 (1993) 1047-1054; y Schenk y cols., Eur. J. Biochem. 224 (1994) 717-724). La actividad biológica de la Bet v 1 recombinante se ha demostrado mediante experimentos de liberación de histamina y mediante pruebas de punción de pacientes alérgicos (Valenta y cols., J. Allergy Clin. Immunol. 91 (1993) 88-97; Pauli y cols., J. Allergy Clin. Immunol. 98 (1996) 1100-1109; y Menz y cols., Clin. Exp. Allergy 26 (1995) 50-60).
La reducción de capacidad alergénica de los alérgenos mediante polimerización química es conocida por ejemplo a través de Patterson y Suszko, Arbeiten aus dem Paul-Ehrlich-Institut, Heft F8, 1983.
Se conoce la expresión y la purificación de grandes cantidades de Bet v 1 y el uso de Bet v 1 en inmunoterapia través de Hoffmann-Sommergruber y cols., Protein expression and purification, 9, 33-39 (1997).
La invención
Un primer aspecto de la presente invención es un inmunógeno derivado de Bet v 1. Tiene una capacidad anafiláctica muy reducida comparada con el alérgeno proteínico del que se deriva y por lo tanto en el contexto de la presente invención se denominará no anafiláctico. El inmunógeno se caracteriza porque comprende:
una forma polimérica recombinante de dicho alérgeno proteínico en la que el alérgeno proteínico constituye las unidades monoméricas, en la que el número de unidades monoméricas de la forma polimérica es un número entero que se selecciona a partir de 2 a 10.
Así, de acuerdo con la presente invención, se reduce la capacidad de unión a IgE de un alérgeno mediante polimerización.
Formas poliméricas quiere decir que el inmunógeno comprende de 2 a 10 de las unidades monoméricas definidas anteriormente. En la fecha de prioridad se habían obtenido resultados con formas poliméricas que contenían 2, 3 y 4 unidades monoméricas.
Los inmunógenos se producen mediante técnicas recombinantes proporcionando directamente las formas poliméricas. En el inmunógeno final que va a usarse para la terapia de hiposensibilización, las formas poliméricas pueden haber estado enlazadas a un transportador para aumentar la capacidad inmunógena. En el caso de que este transportador sea una proteína y se quiera tener un inmunógeno lineal, es posible producir el inmunógeno en una etapa mediante la expresión de la construcción génica correspondiente en la célula huésped apropiada, tal como una célula procariota (por ejemplo E. coli) o eucariota (levadura o una línea celular de mamífero). Véase además Scheiner O y Kraft D, Allergy 50 (1995) 384-391; y Valenta R y Kraft D, Current Opinion in Immunology 7 (1995) 751-756.
Mediante el uso de técnicas de recombinación es fácil introducir enlazadores oligopeptídicos entre cada unidad monomérica de las formas poliméricas del inmunógeno. Los restos aminoacídicos adecuados del enlazador pueden seleccionarse entre los aminoácidos hidrófobos o hidrófilos, o entre los básicos, ácidos o neutros. Los aminoácidos hidrófobos son Trp, Gly, Ala, Phe, Pro, Met, Val, Leu, e Ile. Los aminoácidos hidrófilos son por ejemplo Gln, Ser, Gly, Glu, Pro, His y Arg. Los longitud del enlazador oligopeptídico habitualmente es un número entero del intervalo 0-30, tal como del intervalo de 0-10 restos aminoacídicos. En la fecha de prioridad, el enlazador preferido era el tripéptido Leu-Val-Pro.
En la parte experimental, se ilustra la invención con el alérgeno del polen de abedul Bet v 1.
Un segundo aspecto de la invención se refiere a un tratamiento de hiposensibilización específico. Este tratamiento puede realizarse tal como se conoce en la técnica para los alérgenos proteínicos y engloba administrar repetidamente al mamífero, habitualmente a un individuo humano, que padece alergia de tipo I a un alérgeno proteínico, un inmunógeno que es capaz de provocar una respuesta inmunitaria IgG contra el alérgeno proteínico. La administración puede realizarse por vía sistémica, por ejemplo mediante inyección, infusión, etc., pero también se ha sugerido la vía oral para exponer a la parte intestinal del sistema inmunitario. El inmunógeno puede mezclarse con adyuvantes adecuados tales como óxido de aluminio. Véase además Norman PS, "Current status of immunotherapy for allergies and anaphylactic reactions" Adv. Internal. Medicine 41 (1996) 681-713.
La invención se definirá en las reivindicaciones anexas que son parte de la memoria descriptiva. La invención se ilustrará ahora mediante tres Ejemplos no limitantes.
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Parte experimental Ejemplo 1 Polímeros de Bet v 1 Construcción de los polímeros de Bet v 1
El ADNc de Bet v 1 (Breiteneder y cols., "The gene coding for the major birch pollen allergen Bet v 1 is highly homologous to a pea resistance response gene", EMBO J. 8 (1989) 1935-1938) se amplificó por PCR con los siguientes cebadores oligonucleotídicos:
Dímero de Bet v 1:
Para la construcción del primer segmento de Bet v 1:
Secuencia ID. N.º 1:
100 
\newpage
Secuencia ID. N.º 2:
101
Para la construcción del segundo segmento de Bet v 1:
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia ID. N.º 3:
102 
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia ID. N.º 4:
103 
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Trímero de Bet v 1:
Primer segmento de Bet v 1:
Se usaron los mismos cebadores que para la construcción del primer segmento del dímero de Bet v 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Segundo segmento de Bet v 1:
Secuencia ID. N.º 5:
104 
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Secuencia ID. N.º 6:
105
Tercer segmento de Bet v 1:
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia ID. N.º 7:
106
107 
\newpage
Protocolo para la amplificación por PCR. Mezcla de reacción (GeneAmp PCR kit, Perkin Elmer, Branchburg, N.J. EE. UU.): 44 \mul de H_{2}Odd, 10xl 10x tampón de PCR, 4 \mul de dATP 5 mM, 4 \mul de dCTP 5 mM, 4 \mul de dGTP 5 mM, 4 \mul dGTP de 5 mM, 4 \mul de MgCl_{2} 25 mM, 3 \mul de 10xM cebador 1, 3 \mul de 10xM cebador 2, 10 \mul de 1 ng/\mul de Bet v 1, 10x tampón de PCR: Tris-HCl 100 mM, a pH 8,3, y KCl 500 mM. La mezcla de reacción se calentó durante 5 minutos a 94ºC, después se realizaron 35 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 2 minutos a 40ºC, y 3 minutos a 72ºC. Durante el primer ciclo se añadieron 10 \mul de ADN polimerasa AmpliTaq (2,5 U/10 \mul).
Después de la amplificación por PCR, los productos de la PCR se digirieron con las enzimas de restricción correspondientes. Los cebadores que contenían sitios Eco RI adicionales, se digirieron primero con Eco RI para facilitar la subclonación. Los fragmentos digeridos se purificaron usando columnas Nick (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia), y se ligaron en plásmidos pET-17b (Novagen, Madison, EE. UU.). El plásmido, que contenía el primer segmento de Bet v 1, se digirió además con Kpn I/Xho I en el caso del dímero de Bet v 1, o con Kpn I/Spe I en el caso del trímero de Bet v 1, obteniendo vectores, en los que podrían incorporarse los segundos segmentos de Bet v 1. En el caso del trímero de Bet v 1, esta construcción se digirió además con Spe I/Eco R I y se añadió el tercer segmento de Bet v 1.
Expresión y purificación de polímeros de Bet v 1 recombinantes. Se expresaron dímero de Bet v 1 recombinante y trímero de Bet v 1 recombinante en E. coli BL21 (DE3) mediante inducción con isopropil beta-tiogalactopiranosida 0,5 mM a una DO600 de 0,5-0,8 en cultivo líquido (medio LB) durante 5 horas a 37ºC. Las células de E. coli se recogieron mediante centrifugación y se lavaron para eliminar el medio de cultivo. Medio LB: 10 g de cloruro sódico, 10 g de peptona, 5 g de extracto de levadura, a pH 7,5 con NaOH, sometido a autoclave antes de usar.
Purificación. Los polímeros de Bet v 1 recombinante se expresaron en forma de cuerpos de inclusión y se aislaron tal como se ha descrito (Vrtala y cols., "Immunologic characterization of purified recombinant timothy grass pollen (Phleum pratense) allergens (Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5)", J. Allergy Clin. Immunol. 97 (1996) 781-786. Los cuerpos de inclusión se solubilizaron con urea 8 M, Tris 10 mM, a pH 8, EDTA 1 mM, beta-mercaptoetanol 5 mM, se diluyó con Tris 10 mM, a pH 8, a una concentración de urea 6 M y se centrifugó durante 15 minutos a 10,000 g para eliminar el material insoluble. El sobrenadante, que contenía la proteína recombinante, se dializó a una concentración final de urea 2 M. Después de centrifugar (15 minutos, 10,000 g), el sobrenadante se aplicó a una columna de DEAE Sepharose (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia), y la proteína se eluyó con un gradiente de NaCl 0-0,5 M. Las fracciones, que contenían la proteína recombinante con una pureza > 80%, se dializaron con urea 6 M, NaH_{2}PO_{4} 10 mM, a pH 4,8, y se volvieron a cromatografiar en una columna de SP Sepharose (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia). Las fracciones, que contenían dímero de Bet v 1 recombinante o trímero de Bet v 1 recombinante con pureza > 95% se dializaron con Tris 10 mM, a pH 7,5 y se almacenaron a -20ºC hasta su uso.
Resultados de los estudios de los polímeros Bet v 1
Construcción de los polímeros Bet v 1. Refiérase al esquema con secuencias y figuras de vectores al final de la parte descriptiva. El ADNc de Bet v 1 (Breiteneder y cols., EMBO J. 8 (1989) 1935-1938) se se amplificó por PCR con cebadores oligonucleotídicos que contenían diferentes sitios de escisión por enzimas de restricción. Los productos de la PCR después se ligaron tal como se indica en el esquema y se subclonaron en el plásmido pET-17b (Novagen, Madison, EE. UU.).
Figura 1
Gel de SDS-PAGE con tinción con coomassie que muestra monómero de Bet v 1 y polímeros de Bet v 1 recombinante
Carril M: marcador de peso molecular; el carril 1 contiene 3 \mug de monómero de Bet v 1 recombinante purificado, carril 2: 3 \mug de dímero de Bet v 1 recombinante purificado, y carril 3: 3 \mug de trímero de Bet v 1 recombinante purificado.
Resultados: Las proteínas purificadas tenían una pureza superior al 95%. Las proteínas disueltas se separaron del material insoluble mediante centrifugado a alta velocidad antes de cargar las muestras.
Figura 2
Reactividad de IgE en pacientes alérgicos al polen de abedul con monómero, dímero y trímero de Bet v 1 recombinante purificado transferido sobre nitrocelulosa
Se separaron monómero, dímero y trímero de Bet v 1 recombinante mediante SDS-PAGE y se transfirieron sobre nitrocelulosa. Se usó suero de 8 pacientes alérgicos al polen de abedul (carriles 1-8) y suero de una persona no alérgica (carril 9) para detectar los alérgenos transferidos. La IgE unida se detectó con anticuerpos contra IgE humana marcados con ^{125}I (Pharmacia & Upjohn Diagnostics, Uppsala, Suecia) y se visualizaron mediante autorradiografía.
Resultado: La capacidad de unirse a IgE de los polímeros de Bet v 1 transferidos sobre nitrocelulosa era comparable a la del monómero de Bet v 1.
\newpage
Figura 3
Determinación de la reactividad de IgE suero de pacientes alérgicos al polen de abedul monómero y polímeros de Bet v 1 mediante ELISA
Se diluyó el suero de 4 pacientes alérgicos al polen de abedul (A-D) 1: 2 (1), 1: 10 (2), 1: 20 (3), 1: 40 (4) y 1: 80 (5) y se analizó para determinar la reactividad de IgE con monómero de Bet v 1, dímero de Bet v 1 y trímero de Bet v 1 recombinante. Los valores de DO se presentan en el eje y.
Resultado: La IgE en suero de pacientes alérgicos se unía a los polímeros de Bet v 1 de forma comparable a un monómero de Bet v 1.
Figura 4
Inhibición de la unión de IgE a monómero de Bet v 1 recombinante usando polímeros de Bet v 1
El suero de 4 pacientes alérgicos al polen de abedul (A-D) se preincubó con diferentes concentraciones (5 \mug, 500 ng, 50 ng y 5 ng) de monómero de Bet v 1 recombinante, dímero de Bet v 1 y trímero de Bet v 1 purificados. El suero preincubado se analizó después para determinar la reactividad de IgE contra monómero de Bet v 1 recombinante purificado mediante ELISA. Las densidades ópticas (DO) se presentan en el eje y.
Resultado: La unión de IgE a monómero de Bet v 1 se inhibe al aumentar las concentraciones de los polímeros de Bet v 1 de forma dependiente de la dosis. Las cantidades de polímeros de Bet v 1 necesarias para la inhibición a ciertas concentraciones (50 ng comparado con 5 ng) sin embargo fue aproximadamente diez veces mayor que el monómero.
Figura 5
Reactividad de IgG_{1} en suero de ratones inmunizados con polímero Bet v 1 con Bet v 1 recombinante
Se inmunizaron 8 ratones Balb/c una vez al mes con 5 \mug de dímero de Bet v 1 recombinante purificado y Al (OH)_{3} como adyuvante, se inmunizaron 8 ratones Balb/c una vez al mes con 5 \mug de trímero de Bet v 1 recombinante purificado-Al (OH)_{3} y se tomaron muestras de sangre después de cada inmunización. Las muestras de suero obtenidas 19 y 25 semanas después de la inmunización y el suero extraído antes de la inmunización (suero preinmunitario 0 =) se diluyeron 1: 1000 y se analizaron para determinar la reactividad de IgG_{1} con monómero de Bet v 1 recombinante purificado en un ELISA. Los símbolos representan los valores de DO que corresponden a la unión de IgG_{1} en los 8 ratones con dímero de Bet v 1 o trímero de Bet v 1.
Resultado: Los polímeros de Bet v 1 tienen capacidad de inducir niveles elevados de anticuerpos IgG_{1}, que presentan reacción cruzada con monómero de Bet v 1.
Figura 6
Capacidad de los polímeros de Bet v 1 recombinante de inducir la liberación de histamina
Se incubaron granulocitos de un paciente alérgico al polen de abedul con concentraciones crecientes (0,01 \mug/ml, 0,1 \mug/ml, 1 \mug/ml y 10 \mug/ml) de, monómero de Bet v 1 recombinante, dímero de Bet v 1, trímero de Bet v 1, tetrámero de Bet v 1 purificados y anticuerpos contra IgE como control positivo. La liberación de histamina en el sobrenadante acelular se midió mediante RIA (Immunotech, Marsella) y se expresa en términos de porcentaje de la liberación total de histamina.
Resultado: el dímero de Bet v 1 indujo una liberación de histamina ligeramente menor en los basófilos de los pacientes que el monómero, mientras que el trímero y el tetrámero de Bet v 1 presentaron una capacidad aproximadamente 100 veces menor de inducir la liberación de histamina. En los donantes analizados, el monómero de Bet v 1 indujo una liberación máxima de histamina a una concentración de 0,01 \mug/ml de trímero de Bet v 1 y el tetrámero de Bet v 1 a una concentración de 1 \mug/ml.
Tabla 1. Proliferación de clones de linfocitos T específicos contra Bet v 1 con polímeros de Bet v 1 recombinante.
La tabla completa se proporciona al final de la parte descriptiva. Se incubaron clones de linfocitos T de diferentes donantes alérgicos al polen (la columna 2 muestra las iniciales de los donantes) con especificidad por diferentes epítopos de Bet v 1 (en la columna 1, se indica la posición de los epítopos) con monómero de Bet v 1 recombinante (columna 4), dímero de Bet v 1 (columna 5), trímero de Bet v 1 (columna 6) y tetrámero de Bet v 1 (columna 7) purificados. Como control negativo, se analizaron los clones solo con medio (columna 3). La proliferación se determinó por la captación de _{3}H Timidina y se presenta en términos de recuentos por minuto (cpm) (columnas 3-7).
Resultado: Los polímeros de Bet v 1 y el monómero de Bet v 1 indujeron una proliferación comparable de clones de linfocitos T específicos.
Tabla 2. Pruebas cutáneas con monómero y polímeros de Bet v 1 recombinante.
La tabla completa se proporciona al final de la parte descriptiva. Se realizaron pruebas de punción en 6 individuos alérgicos al polen de abedul y 4 individuos no alérgicos de control en el antebrazo con extracto de polen natural de abedul, histamina como control positivo y con 10 \mug/ml y 100 \mug/ml de monómero de Bet v 1 recombinante, dímero de Bet v 1 y trímero de Bet v 1 purificados. Los diámetros medios de las pápulas (DM) se presentan en la tabla.
Resultado: el dímero de Bet v 1 indujo una reacción cutánea aproximadamente 10 veces menor en los pacientes alérgicos que el monómero de Bet v 1, mientras que el trímero de Bet v 1 indujo en algunos pacientes que no apareciera ninguna reacción con pápula, hasta una concentración de 100 \mug/ml. La reacción de las pápulas aumentó de forma dependiente de la dosis con las concentraciones de la proteína. Los individuos no alérgicos de control presentaron sólo reacciones cutáneas a la histamina pero no a las preparaciones de Bet v 1. Tanto los ensayos de liberación de histamina como las pruebas cutáneas indican que los polímeros de Bet v 1 tienen una actividad anafiláctica mucho menor (hasta 100 veces) que un monómero de Bet v 1. La reducción del potencial anafiláctico es proporcional al grado de polimerización.
Resumen - Estudios de los polímeros Bet v 1.
Los presentes inventores expresaron en plásmidos pET-17b (Novagen, Madison, EE. UU.) Bet v 1 en forma de dímero, trímero y tetrámero. Los polímeros de Bet v 1 se expresaron a niveles elevados en E. coli BL21 (DE3) (Novagen, Madison, EE. UU.) y se purificaron a homogeneidad. Los polímeros de Bet v 1mantuvieron su capacidad de unirse a IgE, tal como se demostró mediante inmunotransferencia por ELISA. Los clones de linfocitos T de donantes alérgicos al abedul, con especificidad por Bet v 1 proliferaron al ser incubados con todos los polímeros, lo que indicaba que los polímeros contienen los epítopos relevantes de los linfocitos T de Bet v 1. El trímero y el tetrámero de Bet v 1 presentaban una capacidad reducida en 100 veces de inducir la liberación de histamina en los basófilos de los pacientes y un potencial anafiláctico mucho menor según se evaluó mediante pruebas cutáneas. Debido a la reducción de su actividad anafiláctica, los polímeros de Bet v 1 pueden considerarse herramientas seguras para la inmunoterapia específica del polen de árboles y de alergias alimentarias asociadas. Los pacientes alérgicos pueden tratarse con dosis elevadas de estos derivados con menor riesgo de efectos secundarios anafilácticos. La diferencia entre los polímeros recombinantes y el derivado de alérgeno no anafiláctico que contiene epítopos de linfocitos T es que contienen sitios de unión de IgE pero tienen un menor potencial anafiláctico.
Ejemplo 2 Mapeo del sitio de unión de anticuerpos en Bet v 1
Únicamente con fines ilustrativos.
Figura 7: Se usaron dos anticuerpos monoclonales contra Bet v 1 (moAb A y B) junto con tres péptidos sintéticos derivados de Bet v 1 en ELISA. Las secuencias de los tres péptidos se muestran en la parte inferior de la figura y corresponden a los aa 49-60 (p17), aa 52-63 (p18) y aa 55-66 (p19) de Bet v 1. Los péptidos se analizaron para determinar su unión a los dos monoclonales específicos de Bet v 1. Los valores de DO se presentan en el eje y. Ambos moAb se unen a los péptidos p18 y p19, mapeados en la primera mitad de Bet v 1.
Tabla 3. La tabla completa se proporciona al final de la parte descriptiva. Los anticuerpos monoclonales contra Bet v 1 (A, B) inhiben la unión de IgE humana a Bet v 1 recombinante. Se preincubó Bet v 1 transferida en puntos con MoAb A y B antes de sondar con IgE de suero de 60 donantes alérgicos a Bet v 1. La IgE unida se detectó con anticuerpos contra IgE humana marcados con ^{125}I y se cuantificó mediante recuento de gamma. La inhibición de la unión a IgE se determinó de la forma siguiente:
100 - (cpm_{1}/cpm_{2}) 100 = % de inhibición
cpm_{1} = recuentos por minuto para la incubación con moAb
cpm_{2} = recuentos por minuto para la incubación con tampón.
El % de inhibición de la unión a IgE comparado con la preincubación con tampón se presenta en la tabla.
Ejemplo 3 Dos fragmentos de Bet v 1 recombinantes no anafilácticos
Únicamente con fines ilustrativos.
Véase además Vrtala y cols., "Conversion of the major birch pollen allergen, Bet v 1, into two non-anaphylactic T cell epitope containing fragments", J. Clin. Invest. 99 (7) abril de 1997, 1673-1681.
Métodos
Suero de pacientes alérgicos, anticuerpos, extractos proteínicos y cepas de E. coli . El suero de los pacientes alérgicos al polen de abedul y los individuos de control se caracterizó mediante RAST y se analizó con alérgenos recombinantes tal como se describe (Valenta y cols., J. Allergy Clin. Immunol. 88 (1991) 889-894; Valenta y cols., Int. Arch. Allergy Immunol. 97 (1992) 287-294). Además, todos los pacientes se caracterizaron por su historia y pruebas de punción cutánea. El anticuerpo monoclonal moab 14 de ratón con especificidad por los aa 40-65 de Bet v 1 se ha descrito en Lebecque y cols., J. Allergy Clin. Immunol. 99 (3) (1997) 374-384). El extracto de polen de abedul natural se preparó como se describe en Vrtala y cols., Int. Arch. Allergy Immunol. 102 (1993) 160-169). El plásmido pET-17b que contenía la resistencia a ampicilina y el promotor de T7 se obtuvo de Novagen, Madison, EE. UU. Los fragmentos de Bet v 1 recombinante se expresaron en lisógenos \lambdaDE3 de E. coli cepa BL21 (F-ompTrb-mB-) (Studier y cols., Meth. Enzymol. 185 (1990) 60-89).
La expresión de fragmentos de Bet v 1 (aa 1-74, aa 75-160) en E. coli . Se generaron fragmentos de Bet v 1 recombinante (aa 1-74, aa 75-160) para mantener los epítopos (aa 40-65) de anticuerpos monoclonales murinos que inhibían la unión de la IgE de los pacientes alérgicos a Bet v 1 (Lebecque y cols., J. Allergy Clin. Immunol. 99 (3) (1997) 374-384) y para conservar los epítopos principales de los linfocitos T que se habían mapeado usando péptidos superpuestos sintetizados de acuerdo con la secuencia de Bet v 1 (Ebner y cols., J. Immunol. 150 (1993) 1047-1054). Los ADNc que codifican el fragmento aa 1-74 y aa 75-160 mediante amplificación por PCR del ADNc de Bet v 1 usando los siguientes cebadores oligonucleotídicos (Pharmacia Biotech AB, Upsala Suecia):
Bet v 1 (aa 1-74)
Secuencia ID N.º 9:
5'GG\underline{G \ AAT \ \mathit{T}}CC ATA TGG GTG TTT TCA ATT AC3'
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Secuencia ID N.º 10:
5'CGG GGT ACC TTA CTC ATC AAC TCT GTC CTT3'
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Bet v 1 (aa 75-160)
Secuencia ID N.º 11:
5'GGG AAT TC C ATA TGG TGG ACC ACA CAA ACT3'
Secuencia ID N.º 12:
5'CGG GGT ACC TTA GTT GTA GGC ATC GGA3'
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Los sitios Eco RI que se incorporaron en los primeros cebadores están subrayados, los sitios Nde I y Kpn I están en cursiva. Para mejorar la eficacia de la subclonación, primero se cortaron los productos de la PCR con Eco RI y Kpn I, se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa, se subclonaron en el sitio Eco RI y Kpn I del plásmido pEt-17b (Novagen, Madison, EE. UU.) y se transformaron en E. coli BL21 (DE3) (Novagen, Madison, EE. UU.) mediante electroporación. Después los insertos se escindieron con Nde I/Kpn I y se subclonaron de nuevo en el plásmido pET-17b y se transformaron. Las colonias que expresaban los fragmentos correctos se identificaron mediante inmunotamizado usando mab 14 para los aa 1-74 de Bet v 1 y un antisuero contra el extremo C de Bet v 1 para los aa 75-160 de Bet v1. El ADN de los clones positivos se aisló usando columnas Qiagen tip (Quiagen, Hilden, Alemania) y se secuenciaron ambas hebras de ADN de acuerdo con Sanger usando un kit de secuenciación con polimerasa de T7 (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia) y _{35}S dCTP (NEN, Stevehage, Reino Unido) (24). Bet v 1 (aa 1-74 y Bet v1 (aa 75-160) recombinantes se expresaron en E. coli BL21 (DE3) mediante inducción con IPTG 0,5 mM a una DO600 de 0,5-0,8 en cultivo líquido durante 5 horas a 37ºC.
Purificación de Bet v1 (aa 1-74) y Bet v1 (aa 75-160) recombinantes. Se expresaron Bet v1 (aa 1-74) y Bet v1 (aa 75-160) en cuerpos de inclusión aislados como se ha descrito (Vrtala y cols., J. Allergy Clin. Immunol. 97 (1996) 781-787). Los cuerpos de inclusión se solubilizaron con urea 8 M, Tris 10 mM, a pH 8, EDTA (ácido etilenediaminatetraacético) 1 mM, beta-\betamercaptoetanol 5 mM, se diluyó con Tris 10 mM, a pH 8, a una concentración de urea 6 M y se centrifugó durante 15 minutos a 10,000 x g para eliminar el material insoluble. El sobrenadante, que contenía la proteína recombinante, se dializó a una concentración final de urea 2 M. Después de centrifugar (15 minutos, 10,000 x g), el sobrenadante se aplicó a una columna de DEAE (dietilaminoetil) Sepharose (Pharmacia Biotech AB), y la proteína se eluyó con un gradiente de concentración de NaCl de 0-0,5 M. Las fracciones, que contenían la proteína recombinante con una pureza superior a 80%, se dializaron con urea 6 M, NaH_{2}PO_{4} 10 mM, a pH 4,8, y se volvieron a cromatografiar en una columna de SP Sepharose (Pharmacia Biotech AB). Las fracciones que contenían Bet v 1 recombinante (aa 1-74) o Bet v 1 recombinante (aa75-160) con una pureza superior a 95% se dializaron con Tris 10 mM, a pH 7,5 y se liofilizaron hasta su uso.
Capacidad de unión a IgE de fragmentos de Bet v 1 y Bet v 1 recombinantes. Se analizaron fragmentos de Bet v 1 y Bet v 1 recombinantes purificados (aa 1-74, aa 75-160) para determinar su capacidad de unirse a IgE mediante transferencia Western y en ensayos de transferencia en puntos. Para la inmunotransferencia, se separó aproximadamente 1 \mug/cm de proteína purificada mediante SDS-PAGE (Fling y cols., Anal. Biochem. 155 (1986) 83-88) y se transfirieron sobre nitrocelulosa de acuerdo con Towbin (Towbin y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) 4350-4353). Para evitar la desnaturalización de las proteínas, se realizaron experimentos de transferencia en puntos en paralelo. En las tiras de nitrocelulosa se transfirió en puntos 1 \mug de Bet v 1 recombinante purificado, 1 \mug de cada fragmento de Bet v 1 y 1 \mug de albúmina serosa bovina y albúmina serosa humana (HSA) (controles negativos). Las tiras de nitrocelulosa que contenían los alérgenos de la transferencia Western o las proteínas de la transferencia en puntos se incubaron con IgE de suero de individuos alérgicos, individuos de control no alérgicos y tampón sin la adición de suero tal como se ha descrito (Valenta y cols., J. Exp. Med. 175 (1992) 377-385). Los anticuerpos IgE unidos se detectaron con anticuerpos contra IgE humana marcados con ^{125}I y se visualizaron mediante autorradiografía.
Resultados: El suero de los pacientes alérgicos al polen de abedul reaccionaron con Bet v 1 recombinante pero no con los fragmentos de Bet v 1. El suero de los individuos alérgicos al polen no reaccionó ni con Bet v 1 recombinante ni con los fragmentos de Bet v 1 recombinante.
El dicroísmo circular mostró que los dos fragmentos de Bet v 1 no mostraban tendencia a plegarse en presencia mutua.
Experimentos de liberación de histamina. Se aislaron granulocitos de sangre heparinizada de individuos alérgicos al polen de abedul mediante sedimentación con dextrano (Valent y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 5542-5547). Las células se incubaron con diferentes concentraciones (0,001 \mug/ml-10 \mug/ml) de Bet v 1 purificado recombinante, fragmentos de Bet v 1 recombinante (aa 1-74, aa 75-160) por separado y en mezcla equimolar, o con anticuerpos contra IgE humana. La histamina liberada en el sobrenadante se midió mediante radioinmunoensayo (RIA) (Immunotech, Marsella, Francia) (Valenta y cols., J. Allergy Clin. Immunol. 91 (1993) 88-97). La histamina total se determinó en los lisados celulares después de descongelar. Los resultados se obtuvieron en términos de valores medios a partir de determinaciones por triplicado y se expresaron en términos de la liberación total de histamina.
Resultados: los fragmentos de Bet v 1 recombinante tienen una capacidad aproximadamente 1000 veces menor de inducir la liberación de histamina en los basófilos de los pacientes que Bet v 1 recombinante. Una mezcla equimolar de ambos fragmentos de Bet v 1 no indujo una liberación significativa de histamina comparada con cada uno de los fragmentos analizados.
Pruebas cutáneas. Se realizaron pruebas de punción cutánea en los antebrazos de los individuos colocando 20 \mul de cada solución (Pauli y cols., J. Allergy Clin. Immunol. 97 (1996) 1100-1109; Menz y cols., Clin. Exp. Allergy 26 (1996) 50-60). Se disolvieron en el momento Bet v 1 recombinante y los fragmentos de Bet v 1 recombinante en una solución estéril a 0,9% p/v de cloruro sódico a concentraciones de 100 \mug/ml y 10 \mug/ml. Como controles se usaron extracto de polen de abedul SQ (calidad estándar), solución de cloruro sódico (control negativo) y clorhidrato de histamina (control positivo) (ALK, Horsholm, Dinamarca). Cada gota se pinchó con una lanceta nueva (ALK, Horsholm, Dinamarca) y los resultados se registraron después de 20 minutos con un bolígrafo transfiriendo el área de la pápula con cinta adhesiva y mediante fotografía. El diámetro medio de la pápula (Dm) se calculó midiendo el diámetro longitudinal máximo (D) y el diámetro transversal máximo (d) de acuerdo con la fórmula (D+d)/2=Dm.
Resultados: Ninguno de los dos fragmentos de Bet v 1 recombinante, ni solos ni combinados, provocan reacciones cutáneas anafilácticas comparados con el Bet v 1 recombinante intacto.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 1 Proliferación de clones de linfocitos T específicos contra Bet v 1 con polímeros de Bet v 1 recombinante
1
TABLA 2 Pruebas cutáneas con monómero y polímeros de Bet v 1 recombinante
3 
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TABLA 3
4 
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5
7 
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8 
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9
10
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12

Claims (4)

1. Un inmunógeno derivado de un alérgeno proteínico, caracterizado porque dicho inmunógeno comprende una forma polimérica recombinante de un alérgeno proteínico Bet v 1, en el que el alérgeno proteínico constituye las unidades monoméricas,
en el que el número de unidades monoméricas de la forma polimérica es un número entero que se selecciona a partir de 2 a 10.
2. El inmunógeno de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque dichas unidades monoméricas están separadas las unas de las otras por un oligopéptido enlazador, que habitualmente está constituido por 1-30 restos aminoacídicos que pueden ser hidrófilos.
3. El inmunógeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque dicho inmunógeno también contiene un transportador para dicha forma polimérica.
4. El uso del inmunógeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para la preparación de un medicamento a usar en la hiposensibilización de un individuo mamífero que padece alergia de tipo I.
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