PT1219301E - Vacinas contendo polipéptidos híbridos, consistindo em, pelo menos, duas proteínas alergénicas diferentes - Google Patents
Vacinas contendo polipéptidos híbridos, consistindo em, pelo menos, duas proteínas alergénicas diferentes Download PDFInfo
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Description
DESCRIÇÃO "VACINAS CONTENDO POLIPÉPTIDOS HÍBRIDOS, CONSISTINDO EM, PELO MENOS, DUAS PROTEÍNAS ALERGÉNICAS DIFERENTES" A alergia do tipo I é uma doença de hipersensibilidade, determinada geneticamente, afectando quase 500 milhões de indivíduos em todo o mundo. Os sintomas imediatos (rinoconjuntivite alérgica, asma, choque anafiláctico), assim como os sintomas tardios (dermatite atópica, determinadas formas de asma bronquial alérgica) são baseados no reconhecimento de alergénios pelos anticorpos IgE. Os sintomas imediatos resultam da reticulação de IgE efectora ligada a células, induzida por um alergénio e a libertação subsequente de mediadores biológicos (e. g., histamina, leucotrienos) enquanto que os sintomas tardios podem ser causados pela apresentação de alergénios a células T, mediada por IgE e activação dos eosinófilos. A única abordagem de terapia curativa, a imunoterapia específica para um alergénio, é baseada na administração sistémica de alergénios a doentes, de forma a induzir uma "ausência de resposta" específica para um alergénio (Noon, Lancet 1911, 1: 1572-1573; Bousquet et al. (1998) J Allergy Clin Immunol 102: 558-562; Durham e Till (1998) J. Allergy Clin. Immunol. 102, 157-164). Não foi possível produzir alergénios puros para imunoterapia específica utilizando tecnologias convencionais e, por esse motivo, a vacinação é realizada com extractos de alergénio. Estes extractos consistem em alergénios e componentes não-alergénicos, os quais são difíceis de 1 padronizar. Consequentemente, os doentes não podem ser tratados de acordo com o seu perfil de sensibilização especifico e são, frequentemente, observados efeitos anafilácticos secundários, devido à administração de material alergénico (Mellerup et al. (2000). Clin. Exp. Allergy 30, 1423-1429).
Constitui um objectivo da presente invenção, proporcionar uma composição vantajosa para o tratamento ou a prevenção de distúrbios alérgicos.
Surpreendentemente, os requerentes determinaram que é possível produzir alergénios híbridos, montando os epitopos de alergénios imunologicamente distintos, para diagnóstico e terapia da alergia do tipo I. A invenção, consequentemente, refere-se a um polipéptido híbrido, compreendendo, pelo menos, duas proteínas alergénicas diferentes ou os seus fragmentos, em que cada fragmento consiste em, pelo menos, oito aminoácidos consecutivos da respectiva proteína alergénica, caracterizada por a proteína alergénica, da qual o polipéptido híbrido é derivado, consistir nos principais alergénios não relacionados de capim timóteo.
Numa forma de realização, o polipéptido híbrido compreende, pelo menos, uma proteína alergénica completa. Este pode, também, compreender duas proteínas alergénicas completas diferentes. É possível, não apenas combinar grupos diferentes de pólen de herbáceas alergénico mas, também, combinar proteínas alergénicas derivadas de fontes diferentes. Numa forma de realização particular, todas as sequências do polipéptido híbrido derivadas de proteínas alergénicas, representam proteínas alergénicas completas. 2
Numa outra forma de realização, o polipéptido híbrido compreende, pelo menos, um fragmento de uma proteína alergénica, em que o fragmento consiste em, pelo menos, oito aminoácidos consecutivos da respectiva proteína alergénica. De um modo preferido, o fragmento consiste em, pelo menos, 12, de um modo mais preferido em, pelo menos, 20 e de um modo muito preferido em, pelo menos, 30 aminoácidos consecutivos das respectivas proteínas alergénicas. Numa outra forma de realização, todas as sequências de aminoácido derivadas de proteínas alergénicas são fragmentos de, pelo menos, oito aminoácidos consecutivos das respectivas proteínas alergénicas das quais estes são derivados. O comprimento preferido destes fragmentos é de, pelo menos, 12, de um modo mais preferido, pelo menos, 20, de um modo muito preferido, pelo menos, 30 aminoácidos consecutivos da respectiva proteína alergénica.
Quando são utilizados fragmentos de proteínas alergénicas, é possível preparar um polipéptido híbrido compreendendo apenas fragmentos que têm uma actividade alergénica que é mais baixa em comparação com as respectivas proteínas alergénicas das quais estes são derivados. Este efeito pode ser devido à destruição de epitopos pela estrutura secundária ou terciária modificada do fragmento, em comparação com a proteína completa. Na forma de realização muito preferida, o polipéptido híbrido tem uma actividade alérgica, a qual é mais baixa do que a actividade alergénica de cada uma das proteínas alergénicas das quais o polipéptido híbrido é derivado. Normalmente, a actividade alergénica do polipéptido híbrido é inferior a 50% de cada uma das proteínas alergénicas das quais o polipéptido híbrido é derivado. Numa forma de realização particular, o polipéptido híbrido não tem, substancialmente, qualquer actividade alergénica. 3
De acordo com a invenção, a actividade alergénica de uma amostra é determinada pela determinação dos anticorpos igE que são induzidos num animal de teste, após a aplicação da amostra. A actividade alergénica é, de um modo preferido, definida em testes in vitro ou in vivo adequados. Um teste in vitro preferido consiste no ensaio de libertação de histamina de basófilos, como descrito em Vrtala et al.r J. Clin. Invest. 1997, 99, pp. 1673-1681. Alternativamente, a actividade alergénica é determinada num teste dérmico, como descrito em van Hage-Hamsten et al. J. Allergy Clin. Immunol. 1999, 104, pp. 969-977 ou em Pauli et al. Clin. Exp. Allergy 2000, 30, pp. 1076-1084.
Numa forma de realização, o polipéptido híbrido compreende duas porções, as quais são derivadas de duas proteínas alergénicas diferentes. No entanto, o polipéptido híbrido da invenção, pode compreender três, quatro, cinco ou até mais porções, cada uma das quais é derivada de uma proteína alergénica diferente. O polipéptido híbrido da invenção não consiste, necessariamente, apenas nas sequências de aminoácido derivadas de proteínas alergénicas. É possível que sejam inseridas sequências artificiais (e. g., sequências espaçadoras) entre as unidades representando sequências de proteínas alergénicas diferentes. É, também, possível que as sequências de aminoácido das proteínas alergénicas de ocorrência natural sejam modificadas, e. g.r por engenharia genética, para introduzir mutações, as quais reduzem a actividade alergénica do fragmento. É, também, preferido que o polipéptido híbrido compreenda uma sequência de "marcação", a qual facilite a purificação do 4 polipéptido híbrido após expressão numa célula hospedeira. Um exemplo de uma "marcação" consiste na marcação com hexa-histidina, a qual permite a purificação através de cromatografia por quelante de Ni2+. São conhecidas, na técnica, outras marcações. 0 polipéptido híbrido da invenção pode ser preparado por vários métodos. Numa forma de realização, o polipéptido é preparado pela expressão de um polinucleótido numa célula hospedeira. A célula hospedeira pode ser uma célula procariota ou eucariota. Se forem utilizadas células procariotas, o hospedeiro é, de um modo preferido, E. coli. Os exemplos de células eucariotas são leveduras, células de insecto ou linhas celulares como de células CHO. Após a introdução de um polinucleótido adequado, codificando o polipéptido da invenção, numa célula hospedeira, a célula hospedeira é cultivada sob condições de forma a que o polipéptido seja expresso na célula. 0 polipéptido pode ser segregado pela célula ou acumular-se no interior da célula. Podem ser utilizados métodos de purificação conhecidos, para recuperar o polipéptido híbrido a partir da célula ou a partir do meio de cultura. A invenção abrange, também, a preparação do polipéptido híbrido por síntese química, tal como, síntese em fase sólida. A invenção refere-se, adicionalmente, a um polinucleótido codificando um polipéptido híbrido de acordo com a invenção. Devido à degenerescência do código genético, muitas moléculas polinucleotídicas diferentes podem codificar um único polipéptido. De um modo preferido, o polinucleótido da invenção é uma construção de expressão para a obtenção do polipéptido após a expressão em células hospedeiras. A construção de 5 expressão pode compreender, adicionalmente, componentes que são, geralmente, conhecidos na técnica, tais como sequências promotoras, genes codificando factores de resistência a antibióticos, uma origem de replicação, etc. A invenção refere-se, adicionalmente, a uma célula transfectada ou transformada com um polinucleótido da invenção. A célula pode ser uma célula eucariota ou uma célula procariota. As células eucariotas podem ser transfectadas por um método conhecido, per se, tais como transfecção mediada por fosfato de cálcio, electroporação, lipofecção, etc. A invenção refere-se, adicionalmente, a uma composição farmacêutica contendo um polipéptido, polinucleótido ou uma célula de acordo com a invenção. A composição farmacêutica pode conter, adicionalmente, um veiculo ou diluente farmaceuticamente aceitável, tais como um tampão ou uma solução salina. De um modo preferido, a composição farmacêutica da invenção é uma composição de vacina. Numa forma de realização particular, a composição farmacêutica contém, adicionalmente, um adjuvante tal como AI(OH)3. A invenção refere-se, também, a um método para a preparação de um polipéptido híbrido da invenção. 0 método compreende o fornecimento de um polinucleótido codificando um polipéptido híbrido, introduzindo o referido polinucleótido numa célula hospedeira, cultivando a célula hospedeira, deste modo obtida, sob condições nas quais o polipéptido híbrido é expresso e a recuperação do produto de expressão a partir da célula. 0 polinucleótido pode ser preparado por métodos conhecidos na técnica, é preferido que seja utilizada tecnologia da PCR para preparar o polinucleótido codificando o polipéptido híbrido. 6 A invenção refere-se, adicionalmente, à utilização de um polipéptido híbrido, de um polinucleótido ou de uma célula da invenção, para a preparação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio alérgico.
Esse medicamento pode ser composto pelo polinucleótido codificando uma vacina híbrida, a qual pode ser utilizada, directamente, na vacinação à base de ADN contra a alergia do tipo I. 0 polipéptido híbrido, recombinante ou sintético, pode ser utilizado para preparar formulações para o tratamento oral, sublingual ou parentérico de distúrbios alérgicos do Tipo I, da forma que estes são, no presente, normalmente utilizados em imunoterapia. Constituem exemplos, formulações para imunoterapia sublingual ou polipéptidos híbridos ligados a adjuvante para imunoterapia por injecção. As aplicações possíveis compreendem, também, formas de imunoterapia de base celular, as quais podem ser baseadas em, e. g., células dendríticas ou outras células apresentadoras de antigénio. Essas células são transformadas e expressam o antigénio in vivo. De um modo preferido, são utilizadas células autólogas transformadas com vectores adequados.
Um modo de aplicação pode consistir em injecção subcutânea de polipéptidos híbridos ligados a adjuvante. Outra possibilidade consiste na administração oral ou nasal do polipéptido híbrido, de forma a induzir tolerância imunológica ou anergia contra os componentes dos polipéptidos híbridos. Todas estas formulações possíveis podem ser preparadas de acordo com regras (dosagem, adjuvantes, esquemas de administração) que são conhecidas dos especialistas na técnica. 7 A invenção refere-se, também, à utilização de um polipéptido híbrido, de um polinucleótido ou de uma célula da invenção para a preparação de um medicamento para vacinação profiláctica ou indução de tolerância. A administração profiláctica de polipéptidos híbridos significa que a administração do polipéptido a indivíduos, de um modo preferido, a crianças que ainda não sofrem de alergia do tipo I, de forma a induzir um estado de tolerância imunológica, anergia ou ausência de resposta ou uma imunidade protectora contra os componentes da vacina híbrida. Isto pode ser obtido através de vários protocolos delineados para o tratamento de um distúrbio alérgico estabelecido. 0 tratamento profiláctico pode ser realizado com polipéptidos híbridos consistindo em polipéptidos híbridos ou em polinucleótidos codificando para os polipéptidos híbridos, como descrito anteriormente.
Numa nova forma de realização, a invenção refere-se à utilização de um polipéptido híbrido da invenção para a detecção de anticorpos contra uma proteína alergénica numa amostra. 0 anticorpo pode ser um anticorpo IgM, IgE, IgG ou IgA. A concentração do anticorpo pode ser determinada a partir de uma amostra, a qual foi obtida a partir de um fluido corporal. A amostra pode ser derivada de animais ou de humanos. Esses testes podem utilizar um polipéptido híbrido imobilizado em fase sólida ou o polipéptido híbrido na fase fluida. Os testes de ELISA, os testes de transferência de Western ou qualquer outro teste em que o polipéptido híbrido seja imobilizado, para se ligar a anticorpos específicos da amostra de teste, podem ser exemplos desses testes. Alternativamente, o polipéptido híbrido é adicionado, directamente, ao fluido contendo anticorpo, de forma a adsorver anticorpos específicos como, e. g., é realizado para ensaios imunológicos competitivos. 8 0 polipéptido da invenção pode ser, também, utilizado para testes celulares, tais como um teste de proliferação de células T, teste de libertação do mediador, etc. 0 polipéptido híbrido pode ser exposto a vários tipos de células, de forma a promover respostas mensuráveis. Essas respostas podem compreender a libertação da histamina ou de outros mediadores (e. g., leucotrienos, serotonina, ECP), no caso de células efectoras alérgicas (e. g., mastócitos basófilos, eosinófilos) . Num outro tipo de ensaio, a proliferação ou a morte (e. g., apoptose) das células, podem ser medidas e. g., pela incorporação de Timidina 3H ou por qualquer outro ensaio adequado. Essas células podem ser células T. Para além disso, os polipéptidos híbridos podem ser utilizados para induzir a libertação de citocinas ou de outras substâncias imunologicamente relevantes (e. g., a partir de células T) , que possam ser medidas. Para além disso, estes podem ser utilizados em ensaios de apresentação de antigénio. 0 polipéptido híbrido da invenção pode ser, também, utilizado com objectivos de rastreio de diagnóstico. Os polipéptidos híbridos podem ser, também, utilizados em testes de provocação, in vivo. Esses testes podem compreender testes dérmicos (e. g., picada na pele ou teste intradérmico), testes de provocação nasal, todas as formas de testes de desafio alimentar ou testes de provocação bronquial.
Uma vez que os polipéptidos híbridos podem conter epitopos de alergénios não relacionados, estes podem ser utilizados para testes de rastreio de diagnóstico (in vitro, in vivo como descrito em cima), de forma a detectar a sensibilização ou a ausência de resposta contra um dos componentes do polipéptido híbrido. Isto pode permitir proporcionar um teste de diagnóstico ao médico, o qual é adequado para rastrear doentes 9 sensibilizados, de um modo rápido. Actualmente, esses testes (e. g., Phadiatop, Pharmacia, Upsala, Suécia) consistem numa mistura de alergénios ligados não-covalentemente, os quais são ligados a um veiculo. Consequentemente, a taxa de ligação dos componentes individuais é difícil de controlar, dado que um polipéptido híbrido iria representar uma formulação preferida para a preparação desse teste de rastreio.
Mais de 40% dos doentes alérgicos é sensível a pólens de herbáceas de diferentes espécies. As herbáceas são, também, fontes importantes de alergénios, devido a sua distribuição em todo o mundo e à forte produção de pólen. Estes contêm vários componentes alergénicos diferentes, os quais ocorrem, sob a forma de alergénios com reacção cruzada, em monocotiledóneas diferentes. Os requerentes demonstraram que é possível produzir alergénios híbridos por tecnologia de ADN recombinante, os quais consistem em alergénios não relacionados imunologicamente e nos seus epitopos.
Num primeiro passo, foram determinadas as co-sensibilizações frequentes, utilizando alergénios recombinantes purificados de pólen de capim timóteo, para seleccionar as combinações de alergénio mais frequentemente reconhecidas, para a abordagem do alergénio híbrido. De acordo com as experiências piloto, foram concebidos híbridos consistindo nos principais alergénios do pólen de capim timóteo imunologicamente não relacionados. Estes compreenderam híbridos dos principais alergénios do pólen de capim timóteo, Phl p 5/Phl p 1, Phl p 2/Phl p 6 e uma combinação de todas as quatro moléculas. Como demonstrado para Phl p 2/Phl p 6, os requerentes não detectaram qualquer indício de que uma determinada ordem na concepção dos componentes individuais 10 afectasse a apresentação dos epitopos. Tanto o híbrido, rPhl p 2/Phl p 6 como o híbrido rPhl p 6/Phl p 2 conservaram os epitopos relevantes das células B e T dos componentes. 0 gigante, consistindo em todos os 4 alergénios, continha, também, os epitopos relevantes dos componentes isolados. A abordagem do alergénio híbrido irá abrir novas perspectivas para o diagnóstico e tratamento da alergia do Tipo I. Os híbridos, consistindo nos alergénios mais frequentemente reconhecidos, com epitopos conservados, representam moléculas candidatas para testes de rastreio de alergia, in vitro, tal como in vivo. 0 gigante descrito no presente pedido irá identificar, provavelmente, mais de 95% dos doentes alérgicos a pólen de capim timóteo, quando utilizado em diagnóstico, dado que este se assemelha com a maioria dos epitopos IgE relevantes, presentes no extracto de pólen de capim timóteo natural. Podem ser, também, produzidas moléculas, tal como o gigante, para outros sistemas de alergénio (e. g., alergia aos ácaros). A vantagem em utilizar alergénios híbridos em diagnóstico, consiste nestes poderem ser produzidos de uma forma bem controlada. Ao contrário dos extractos de alergénios naturais, os quais consistem numa mistura de alergénios e materiais não-alergénicos, difícil de padronizar, os alergénios híbridos irão conter os epitopos relevantes numa proporção bem definida.
Os alergénios híbridos recombinantes podem ser, também, utilizados em imunoterapia. Estes podem ser compostos por componentes biologicamente activos ou por unidades de alergénio hipoalergénicas. Podem ser, então, utilizados alergénios híbridos abrangendo padrões de co-sensibilização frequente, no tratamento de alergias a fontes de alergénio complexas, e. g., alergia a pólen de herbáceas, dado que estes se assemelham aos 11 epitopos relevantes do extracto completo. Uma vez que os alergénios híbridos consistem em componentes definidos, irá ser possível produzir formulações bem definidas para tratamento por vacinação. Os alergénios híbridos produzidos a partir de variantes hipoalérgicas serão tolerados em doses elevadas e, deste modo, podem ser utilizados como vacinas regularmente utilizadas para a prevenção de infecções virais. No que a isto respeita pode ser considerada a utilização de alergénios híbridos, contendo os epitopos dos alergénios mais relevantes para vacinação profiláctica ou indução de tolerância, mesmo em indivíduos ainda não sensibilizados. 0 facto da fusão de diferentes componentes antigénicos sob a forma de uma molécula híbrida aumentar a imunogenicidade dos componentes individuais, tem várias implicações para a imunoterapia especifica para um alergénio e para a vacinação em geral. Os alergénios ou os antigénios contra os quais são pretendidas as respostas imunitárias e que, per se, apresentam imunogenicidade baixa, podem ser fundidos com híbridos, para aumentar a sua imunogenicidade, sem utilizar outras proteínas veículo ou adjuvantes. Este princípio irá permitir a indução de níveis elevados de respostas de anticorpos protectores contra alergénios, fragmentos de alergénio, epitopos de alergénio ou seus miméticos. É, também, possível aumentar a resposta imunitária contra antigénios/epitopos derivados de agentes infecciosos, tumores ou outros componentes, contra os quais é difícil induzir respostas imunitárias, utilizando este princípio. 12
Descrição das tabelas e figuras: A tabela 1 mostra a inibição em percentagem da ligação de IgE a Phl p 2 e Phl p 6 recombinante, obtida após pré-adsorção de soros de 20 doentes com os alergénios híbridos (rPhl p 2/rPhl p 6, rPhl p 6/rPhl p 2) ou com os alergénios recombinantes (rPhl p 2, rPhl p 6) . A tabela 2 mostra a inibição em percentagem da ligação de IgE a Phl p 1, Phl p 5 e Bet v 1 recombinantes, obtida após a pré-adsorção de soros de 20 doentes com o alergénio híbrido rPhl p 5/rPhl p 1 ou com os alergénios recombinantes (rPhl p 1, rPhl p 5 e rBet v 1).
Tabela 3. Anti-soros de murganho produzidos contra moléculas híbridas inibem a ligação aos alergénios individuais, de IgE de doentes alérgicos ao pólen de herbáceas. Os alergénios ligados às placas de ELISA (A: rPhl p 2 e rPhl p 6; B: rPhl p 1 e rPhl p 5) foram pré-incubados com anti-soros de murganho (anti-rP2-P6, anti-rP6-P2, anti-rPhl p 2, anti-rPhl p 6, anti-rP5-Pl, anti-rPhl p 1, anti-rPhl p 5 de murganho. É apresentada a percentagem de inibição da ligação da IgE, obtida para 4 doentes alérgicos a pólen de herbáceas. A figura 1 mostra a frequência da co-sensibilização aos alergénios do pólen de capim timóteo, rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 5 e rPhl p 6, como determinado numa população de 110 doentes alérgicos a pólen de herbáceas. A figura 2 descreve a construção de vacinas híbridas. A fusão dos dois genes (e. g., Phl p 5, Phl p 1) é mediada por uma reacção de PCR em dois passos, criando extremidades 13 sobreponíveis na primeira reacção de PCR, seguida pela amplificação de ambas as sequências num segundo passo de PCR. A figura 3 mostra o resultado do exemplo 3. Foram aplicados alergénios do pólen de capim timóteo purificados (rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 5 e rPhl p 6) e seus hibridos (rPhl p 5/rPhl p 1, rPhl p 2/rPhl p 6 e rPhl p 6/rPhl p 2), num gel de poliacrilamida com SDS e foram corados com azul brilhante de Coomassie. Os pesos moleculares são apresentados na margem esquerda.
Na figura 4 (A) foi aplicado em gota, em filtros de nitrocelulose, um hibrido recombinante purificado, consistindo em Phl p 6/Phl p 2/Phl p 5/Phl p 1. Na fila (B) foram imobilizados rPhl p 2 (faixa 1,3,4 e 5) e rPhl p 5 (faixa 2). Os filtros foram incubados com anti-soros de coelho contra rPhl p 1 (faixa 1), rPhl p 2 (faixa 2), rPhl p 5 (faixa 3) e rPhl p 6 (faixa 4) . 0 filtro na faixa 5 foi exposto a um anticorpo monoclonal de murganho anti marcação de His.
As figuras 5 a 7 mostram que as moléculas híbridas recombinantes induzem respostas de anticorpo IgGi mais fortes, em murganhos, do que os componentes individuais ou as suas misturas.
Figura 5. Foram incubados alergénios recombinantes purificados, ligados a placas de ELISA (A: rPhl p 2; B: rPhl p 6; C: rPhl p 1; D: rPhl p 5), com soros de murganhos (8 murganhos por grupo), os quais tinham sido imunizados com as moléculas híbridas (rP2-P6, rP6-P2, rP5-Pl), com os alergénios recombinantes individuais (rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 5, rPhlp 6) ou com o extracto de pólen de capim timóteo como indicado no 14 eixo dos xx. Os níveis médios de IgGi, dos soros recolhidos 4 e 8 semanas após a imunização, correspondem aos valores de OD apresentados no eixo dos yy.
Figura 6. Foram incubados alergénios recombinantes purificados, ligados a placas de ELISA (rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 5, rPhl p 6) com soros de murganhos (8 murganhos por grupo), os quais tinham sido imunizados com (A) a molécula gigante ou com os alergénios recombinantes individuais rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 5, rPhl p 6 e com (B) a molécula gigante ou com uma mistura equimolar de rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 5 e rPhl p 6, como indicado no eixo dos xx. Os níveis médios de IgGi, dos soros recolhidos 4 e 8 semanas após a imunização, correspondem aos valores de OD apresentados no eixo do y.
Figura 7. 0 gigante (A) e o extracto de pólen de capim timóteo (B) ligados à placa de ELISA, foram incubados com soros de murganhos (8 murganhos por grupo), os quais tinham sido imunizados com o gigante ou com o extracto de pólen de capim timóteo, como indicado no eixo dos xx. Os níveis médios de IgGi, dos soros recolhidos 4 e 8 semanas após a imunização, correspondem aos valores de OD apresentados no eixo do y.
Os exemplos seguintes ilustram, adicionalmente, a invenção:
Exemplo 1: Determinação de padrões de co-sensibilização frequente 0 pólen de herbáceas contém vários alergénios imunologicamente distintos e relacionados. Estes componentes são reconhecidos em diferentes frequências e intensidades. Os 15 alergénios do pólen de capim timóteo recombinantes, rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 5 e rPhl p 6, foram anteriormente identificados como os componentes mais importantes que se assemelham com a maioria dos epitopos IgE de extractos naturais de pólen de herbáceas (Niederberger et al. (1998), os anticorpos IgE contra alergénios do pólen recombinantes (Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5 e Bet v 2) correspondem a uma elevada percentagem de IgE especificas para pólen de herbáceas. J Allergy Clin Immunol 101: 258-264). Na Figura 1 são apresentados os resultados da avaliação das co-sensibilizações de 110 doentes alérgicos a pólen de herbáceas, com combinações dos alergénios do pólen de capim timóteo recombinantes. Os testes por ELISA, com alergénios recombinantes purificados, mostraram que uma percentagem de 60% dos doentes foram co-sensibilizados para rPhl p 1 e rPhl p 5, 30% continham anticorpos IgE contra rPhl p 2 e rPhl p 6 e 30% reagiram, simultaneamente, com a totalidade dos quatro alergénios recombinantes (Figura 1) . Estudos de competição prévios indicaram que uma mistura dos quatro alergénios acima continha a maioria dos epitopos IgE presentes em 8 pólens de monocotiledóneas diferentes (herbáceas, milho) (Laffer et al. (1996) Comparison of recombinant timothy grass pollen allergens with natural extract for diagnosis of grass pollen allergy in different populations. J Allergy Clin Immunol; 98: 652-658).
Soros de doentes, anti-soros e alergénios recombinantes:
Os soros de 110 doentes alérgicos foram caracterizados através de um resultado positivo em RAST (teste radioalergoabsorvente) para pólen de capim timóteo e pela determinação de anticorpos IgE contra o extracto de pólen de capim timóteo por transferência de Western como descrito 16 (Niederberger et al. (1998) Allergy J Clin Immunol 101: 258-264). Os alergénios do pólen de capim timóteo recombinantes rPhl p Ϊ, rPhl p 2, rPhl p 5 e rPhl p 6 foram purificados como descrito anteriormente (Vrtala et al. (1995) J. Allergy Clin. Immunol 97: 781-787; Vrtala et al. (1999) J. Immunol. 163:5489-5496) . Os anti-soros de coelho anti-rPhl p 1, anti-rPhl p 2, anti-rPhl p 5 e anti-rPhl p 6, foram produzidos contra rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 5 e rPhl p 6 purificados, utilizando CFA (Charles River, Kissleg, Alemanha).
Exemplo 2: Construção de alergénios híbridos recombinantes O protocolo para a construção de alergénios híbridos recombinantes é apresentado na Figura 2. Como exemplificado para um híbrido consistindo em rPhl p 5 ligado a rPhl p 1, são amplificados ADNc codificando para os componentes com pares de iniciadores adequados (Figura 2: Phl p 5: w, x; Phl p 1: y, z), de forma a criar extremidades sobreponíveis. Numa segunda reacção de PCR subsequente, é criado um ADNc compreendendo ambos os ADNc, com iniciadores específicos para a extremidade 5' do primeiro ADNc (Phl p 5: w) e para a extremidade 3' do segundo ADNc (Phl p 1: z) , utilizando ambos os produtos da PCR das primeiras reacções como moldes. Os requerentes, utilizando esta tecnologia, produziram híbridos recombinantes consistindo numa combinação de Phl p 5/Phl p 1, rPhl p 2/rPhl p 6, rPhl p 6/rPhl p 2 e a totalidade dos quatro alergénios (terminal N-rPhl p 6-rPhl p 2-rPhl p 5-rPhl p 1-terminal-C) , sendo este último designado como o "gigante". 17
Construção de plasmídeos de expressão para as proteínas híbridas rPhl p 5/rPhl p 1-, rPhl p 2/rPhl p 6-, rPhl p 6/rPhl p 2- e rPhl p 6/rPhl p 2/rPhl p 5/rPhl p 1:
Os ADNc de Phl p 5 e Phl p 1 foram obtidos por reacção em cadeia da polimerase, utilizando os iniciadores 5'GGA ATT CAT ATG GCC GAT CTC GGT TAC 3' (SEQ ID N°: 1) e 5' CGG GGT ACC GAC TTT GTA GCC ACC AGT 3' (SEQ ID N° : 2) para Phl p 5 e 5' CGG GGT ACC ATG ATC CCC AAG GTT CCC 3' (SEQ ID N° : 3) e 5' CGG GAT CCT CAG TGG TGG TGG TGG TGG TGC TTG GAC TCG TAG CTG GT 3' (SEQ ID N°: 4) para Phl p 1. 0 péptido sinal de Phl p 5 foi substituído por um local de restrição Ndel, contendo o codão de iniciação ATG na extremidade 5' da região codificante. Foi introduzido um local de restrição Kpnl na extremidade 3' de Phl p 5, em substituição do codão de terminação. A sequência Phl p 1, sem péptido sinal, inicia com um local de restrição Kpnl na extremidade 5' . Na extremidade 3' foi introduzida uma extensão nucleotidica codificando para uma marcação de Hexa-histidina, seguida por um codão de terminação e um local de restrição BamHI. Os produtos da PCR foram inseridos, sob a forma de um fragmento Ndel/Kpnl/BamHI, num vector de expressão pET17b.
As sequências Phl p 2/Phl p 6 e Phl p 6/Phl p 2 foram construídas utilizando "processamento de genes por extensão de sobreposições" baseado em PCR (17) . Numa primeira reacção de PCR, os ADNc de Phl p 2 e Phl p 6 foram amplificados, utilizando os iniciadores 5' GGA ATT CAT ATG GTG CCG AAG GTG ACG 3' (SEQ ID N°: 5) e 5' CGT GGC CTT CCC CAT AAG CTT CTC TTC TGG CGC GTA GGT 3' (SEQ ID N°: 6) para Phl p 2 e 5' AAG CTT ATG GGG AAG GCC ACG ACC 3' (SEQ ID N°: 7) e 5' C GGG ATC CTA GTG GTG GTG GTG GTG GTG CGC GCC GGG CTT GAC AGC 3' (SEQ ID N°: 8) para Phl p 6, de forma a criar extremidades sobreponíveis. Os dois produtos da PCR 18 purificados em gel de agarose (utilizando o kit de purificação em gel da QIAGEN) foram utilizados como moldes numa reacção de PCR subsequente e foram amplificados, utilizando os iniciadores 5' GGA ATT CAT ATG GTG CCG AAG GTG ACG 3' (SEQ ID N° : 9) e 5' C GGG ATC CTA GTG GTG GTG GTG GTG GTG CGC GCC GGG CTT GAC AGC 3' (SEQ ID N°: 10) . O péptido sinal de Phl p 2 foi substituído por um local de restrição Ndel na extremidade 5', o codão de terminação na extremidade 3' foi removido. Foi introduzida uma marcação de Hexa-histidina na sequência Phl p 6, igualmente, sem péptido sinal, seguida por um codão de terminação e um local de restrição BamHI. A construção Phl p 2/Phl p 6, resultante, foi inserida no vector de expressão pET17b, sob a forma de um fragmento Ndel/BamHI. A sequência Phl p 6/Phl p 2 foi construída, utilizando o mesmo método, com os iniciadores de PCR 5' GGA ATT CAT ATG GGG AAG GCC ACG ACC GAG 3' (SEQ ID N° : 11) e 5' CAC CTT CGG CAC CAT AAG CTT CGC GCC GGG CTT GAC AGC 3' (SEQ ID N° : 12) para Phl p 6 e 5' AAG CTT ATG GTG CCG AAG GTG ACG 3' (SEQ ID N°: 13) e 5' C GGG ATC CTA GTG GTG GTG GTG GTG GTG CTC TTC TGG CGC GTA GGT 3' (SEQ ID N°: 14) para Phl p 2, na primeira reacção de PCR e os iniciadores 5' GGA ATT CAT ATG GGG AAG GCC ACG ACC GAG 3' (SEQ ID N° : 15) e 5' C GGG ATC CTA GTG GTG GTG GTG GTG GTG CTC TTC TGG CGC GTA GGT 3' (SEQ ID N° : 16,) na segunda reacção de PCR. A construção Phl p 6/Phl p 2, resultante, foi inserida no vector pET17b sob a forma de um fragmento Ndel/BamHI.
Para a construção do hibrido ("gigante") Phl p 6/Phl p 2/Phl p 5/Phl p 1, a construção Phl p β/Phl p 2 foi utilizada como molde, numa reacção de PCR, utilizando os iniciadores 5' GGA ATT CAT ATG GGG AAG GCC ACG ACC GAG 3' (SEQ ID N° : 17) e 5' GGG ATT TCC ATA TGC TCT TCT GGC GCG TAG G 3' (SEQ ID N° : 18) 19 substituindo a marcação de Hexa-histidina 3' e o codão de terminação, por um local de restrição Ndel. A sequência foi clonada no vector pETl7b, contendo a construção Phl p 5/Phl p 1 sob a forma de um fragmento Ndel. A orientação correcta da inserção foi averiguada por digestão de restrição.
Exemplo 3: Expressão e purificação de alergénios híbridos
Os alergénios híbridos recombinantes com uma marcação de hexa-histidina no terminal C foram expressos em E. coli BL21 (DE3) e foram purificados por cromatografia de afinidade de Níquel. Os híbridos rPhl p 2/rPhl p 6 e rPhl p 6/rPhl p 2 foram purificados a partir da fracção citoplasmática solúvel de extractos de E. coli, enquanto que o híbrido rPhl p 5/rPhl p 1 e o "gigante" foram solubilizados a partir da fracção do corpo de inclusão insolúvel de E. coli em ureia. A Figura 3 mostra uma SDS-PAGE corada com Coomassie, contendo três dos híbridos e os alergénios recombinantes isolados. A massa molecular determinada por SDS-PAGE correspondeu ao peso molecular calculado para os híbridos com base na sua sequência de aminoácidos deduzida (rPhl p 5/rPhl p 1:60 kDa; rPhl p 2/rPhl p 6 e rPhl p 6/rPhl p 2:22 kDa; "gigante": 82 kDa; dados não apresentados).
Protocolo experimental:
Todas as construções foram expressas em E. coli BL21 (DE3). As células foram cultivadas em meio LB contendo ampicilina 100 mg/L até uma D06oo de 0,8. A expressão das proteínas recombinantes foi induzida pela adição de isopropil-beta-tiogalactopiranósido (IPTG), numa concentração final de 0,5 mM. 20
Após 4 horas a 37 °C, as células foram recolhidas por centrifugação.
Os rPhl p 2/rPhl p 6 e rPhl p 6/rPhl p 2 foram expressos sob a forma de proteínas solúveis. As células foram ressuspensas em tampão de lise (NaH2P04 50 mM, NaCl 300 mM, imidazole 10 mM, pH 8,0) e foram lisadas com um ultraturrax (Polytron, Kinematica AG, Suíça). O lisado foi centrifugado a 10000 x g durante 30 min, a 4 °C, para sedimentar os detritos celulares. O sobrenadante foi aplicado numa coluna Ni-NTA (QIAGEN), as proteínas foram eluídas com imidazole 250 mM e foram dialisadas contra a água.
Os rPhl p 5/rPhl p 1 e rPhl p 6/rPhl p 2/rPhl p 5/rPhl p 1 foram expressos na fracção dos corpos de inclusão. As células foram ressuspensas em Tris 10 mM, Triton a 0,1%, pH 7,4 e foram lisadas pela adição de lisozima a 1 mg/mL. Após centrifugação a 14000 x g durante 20 min, a 4 °C, o sedimento foi lavado 4 x com Tris 5 mM a pH 8,0, NaCl 0,05 M, Desoxicolato a 0,25%, β-Mercaptoetanol 0,25 mM e, uma vez, com Tris 10 mM, pH 8,0, isopropanol a 3%. Os corpos de inclusão foram solubilizados com ureia 8 M, NaH2P04 100 mM, Tris 10 mM, pH 8,0. Após centrifugação a 14000 x g durante 20 min, o sobrenadante foi aplicado numa coluna Ni-NTA (Qiagen). As proteínas foram renaturadas na coluna, utilizando um gradiente linear de ureia 6 M-l M, em NaCl 500 mM, glicerol a 20%, Tris 20 mM, pH 7,4), durante um período de 1,5 h (18). As proteínas foram eluídas pela adição de imidazole 250 mM e foram dialisadas contra PBS a pH 7,4. 21
Exemplo 4: Os alergénios híbridos contêm os epitopos relevantes dos seus componentes
Os alergénios híbridos recombinantes continham as sequências de aminoácido primárias completas dos seus componentes e, deste modo, o repertório completo de epitopos de células T dos alergénios isolados. A presença de epitopos de células B foi investigada com anticorpos com especificidade pré-definida para os componentes individuais e por experiências de competição imunológica. A figura 4 mostra que o "gigante" é reconhecido por anti-soros produzidos contra, respectivamente, rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 5 e rPhl p 6 (Figura 4, fila A: 1-4) . A expressão correcta da marcação de hexa-histidina do terminal C, foi demonstrada pela reactividade de um anticorpo monoclonal de murganho anti marcação de His, o qual reconheceu, especificamente, o "Gigante (Figura 4: fila A, 5) mas não rPhl p 2 que não continha qualquer marcação de hexa-histidina (Figura 4: fila B, 5) . OS Phl p 2 (fila B: 1, 3, 4) e rPhl p 5 (fila B: 2) (controlos negativos) recombinantes não reagiram com os anti-soros (Figura 4: fila B).
Seguidamente, os requerentes investigaram se os alergénios híbridos podiam ser utilizados para bloquear a ligação dos anticorpos IgE de doentes alérgicos a pólen de herbáceas (n = 20) aos componentes individuais (Tabelas 1, 2) . A tabela 1 mostra que o híbrido rPhl p 2/rPhl p 6 assim como o rPhl p 6/rPhl p 2 inibiram a ligação da IgE a ambos os componentes (rPhl p 2, rPhl p 6) , de uma forma comparável à dos alergénios recombinantes isolados (inibição de, aproximadamente, 80% da ligação da IgE) . Do mesmo modo, os requerentes verificaram que o híbrido rPhl p 5/rPhl p 1 inibiu ligação da IgE dos 20 doentes, tanto a rPhl p 1, como a rPhl p 5, de um modo tão eficiente como os 22 componentes isolados (85% de inibição média) (Tabela 2). Não foi observada qualquer inibição quando os soros foram pré-adsorvidos com o hibrido rPhl p 5/rPhl p 1 e feitos reagir com um alergénio não relacionado (alergénio principal do pólen de bétula, Bet v 1), enquanto que rBet v 1 causou uma autoinibição quase completa (83% de inibição) (Tabela 2).
Protocolo experimental:
Experiências de competição de ELISA:
Foram diluidos soros de 20 doentes, 1:10, em soro fisiológico Tamponado com Tris (TBS) para a inibição com rPhl p 5/rPhl p 1 e 1:5, para a inibição com rPhl p 2/rPhl p 6 e rPhl p 6/rPhl p 2. Os soros foram pré-adsorvidos durante a noite a 4 °C, com qualquer um de Phl p 1, Phl p 5, Phl p 5/Phl p 1, Phl p 2, Phl p 6, Phl p 2/Phl p 6, Phl p 6/Phl p 2, Bet v 1 ou BSA recombinantes (10 pg/mL). As placas de ELISA foram revestidas com Phl p 1, rPhl p 2, Phl p 5, Phl p 6 e Bet v 1 recombinantes (5 pg/mL), a 4 °C, durante a noite. O ELISA foi realizado como descrito (Niederberger et al. (1998) J Allergy Clin Immunol 101: 258-264).
Aplicações em gota:
Foram aplicadas aliquotas de, aproximadamente, 1 pg de rPhl p 6/Phl p 2/Phl p 5/Phl p 1 purificados, recombinantes e rPhl p 5 e rPhl p 2 como controlos negativos, em gota, em membranas de nitrocelulose. Os filtros foram bloqueados com TBS, BSA a 1%, Tween-20 a 0,05%, durante 1 hora e foram incubados com 23 soros de coelho anti-Phl p 1, anti-Phl p 5 (diluído 1:5000), anti-Phl p 2 (diluído 1:500), anti-Phl p 6 (diluído 1:2000) e com um Ab monoclonal de murganho anti-Hexa-histidina (Dianova, Alemanha) diluído 1:1000 em TBS, BSA a 1%, Tween-20 a 0,05%. Os filtros foram lavados 3 x com TBS, Tween-20 a 0,05%, foram incubados com um anticorpo IgG secundário de cabra anti-coelho ligado a fosfatase alcalina (Jackson) e, para a detecção da marcação de His, com um anticorpo IgG anti-murganho ligado a fosfatase alcalina (PharMingen), diluído 1:1000 em TBS, BSA a 1%, Tween-20 a 0,05%, durante 1 hora e foram lavados 3x com TBS, Tween-20 a 0,05%. A reacção de coloração foi iniciada pela adição de NBT/BCIP (300 pg/mL) e terminada pela a adição de água.
Exemplo 5: As moléculas híbridas induzem respostas imunitárias mais fortes em murganhos do que os componentes individuais ou as suas misturas.
Para avaliar se a imunização com os alergénios híbridos induz anticorpos IgG que reconhecem os componentes de alergénio individuais, foram imunizados grupos, com 8 murganhos cada, com os híbridos, alergénios individuais ou extracto de pólen de capim timóteo. A figura 5 demonstra que as respostas de IgGi médias, induzidas pelas moléculas híbridas contra cada um dos alergénios individuais (rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 5 ou rPhl p 6) foram mais elevadas do que as obtidas por imunização com os componentes de alergénio isolados. Os níveis elevados de anticorpo IgGi induzidos pelos híbridos eram já detectáveis 4 semanas após a primeira imunização e ainda aumentaram ao fim de 4 semanas adicionais. Possivelmente, o mais interessante consistiu na verificação de que as moléculas híbridas induziram 24 níveis mais elevados de IgGi contra os componentes de alergénio individuais, do que o extracto de pólen de capim timóteo (Figura 5) . Esta verificação foi, particularmente, evidente para Phlp 2, Phlp 6 e Phl p 1, os quais foram fracamente reconhecidos por anticorpos induzidos por extractos, enquanto que as moléculas híbridas induziram respostas vigorosas de anticorpos anti-Phl p 1, anti-Phl p 2 e anti-Phl p 6 (Figura 5) .
Do mesmo modo, os requerentes verificaram que a imunização com a molécula gigante induziu respostas de anticorpo mais fortes contra cada um dos componentes (Phl p 1, Phl p 2, Phlp 5, Phl p 6) do que a imunização com os antigénios individuais (Figura 6A) ou uma mistura equimolar dos antigénios (Figura 6B) . A imunização com o gigante produziu, também, melhores respostas imunitárias do que a imunização com extracto de pólen de capim timóteo. Os anticorpos IgG induzidos com o extracto de pólen de capim timóteo apresentaram uma reactividade mais baixa contra o gigante e contra o extracto, do que os induzidos com o gigante (Figura 7A, B).
Imunização de murganhos e medição de níveis de anticorpos específicos
Foram imunizados grupos de 8 murganhos BALB/c fêmea (idade: 8 semanas) (Charles River, Alemanha), subcutaneamente, com rPhlp 1, rPhl p 2, rPhl p 5, rPhl p 6, rP2-P6, rP6-P2, rP5-Pl, molécula gigante, extracto de pólen de capim timóteo ou uma mistura equimolar de rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 5 e rPhl p 6 adsorvida a AI(OH)3 (Alu-Gel-S, Serva, Ingelheim, Alemanha). Os animais foram mantidos na unidade de bem-estar animal do Instituto de Patofisiologia, Universidade de Viena, de acordo 25 com as orientações locais de bem-estar animal. Os murganhos foram imunizados e foi recolhido sangue das veias da cauda, com intervalos de quatro semanas e os soros foram armazenados a -20 °C até à análise.
As respostas de IgGi contra rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 5, rPhl p 6, rP2-P6, rP6-P2, rP5-Pl, molécula gigante, mistura equimolar de rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 5 e rPhl p 6 e extracto de pólen de capim timóteo, foram medidas por ELISA. Foram revestidas placas Nunc Maxisorp (Roskilde, Dinamarca) com alergénios (alergénios recombinantes: 5 pg/mL; extracto: 50 pg/mL) e foram incubadas com soros de murganho diluídos 1:1000. Os anticorpos ligados foram detectados com uma IgGi monoclonal de rato anti-murganho (Pharmingen, San Diego, CA, EUA), diluída 1:1000 e um anti-soro de ovelha anti-rato marcado com HRP (Amersham, Buckinghamshire, UK), diluído 1:2000.
Exemplo 6: As moléculas híbridas induzem respostas de anticorpo protectoras, que bloqueiam a ligação de IgE de doentes alérgicos aos alergénios do pólen de herbáceas
Seguidamente, os requerentes averiguaram se os anticorpos de murganho induzidos com as moléculas híbridas podem bloquear a ligação dos anticorpos IgE de doentes alérgicos ao pólen de herbáceas, a alergénios do pólen de herbáceas purificados (Tabela 3) . As experiências de competição de ELISA realizadas com soros de 4 doentes alérgicos ao pólen de herbáceas representativos, mostraram que os anticorpos induzidos pelas moléculas híbridas inibiram, significativamente, a ligação de IgE aos alergénios purificados: os anticorpos IgG induzidos por rP2-P6 e pela molécula híbrida rP6-P2 causaram uma inibição de 26 48%-54% da ligação da IgE a Phl p 2 e uma inibição de 54%-67% da ligação da IgE a Phl p 6 (Tabela 3A). Pelo contrário, a inibição da reactividade de IgE produzida pela pré-incubação com anticorpos induzidos com rPhl p 2 e rPhl p 6 isolados foi muito baixa (0-15%) (Tabela 3A). Os anticorpos anti-P5-Pl causaram uma inibição da ligação da IgE a Phl p 5 (inibição média de 59,5%) superior ao dobro da dos anticorpos produzidos contra Phl p 5 isolado (28%) (Tabela 3B). A inibição da ligação da IgE a Phlp 1, produzida com os anticorpos produzidos contra o hibrido rP5-Pl (inibição média de 18,5%) e Phl p 1 isolado (inibição média de 29,5%) foi mais baixa (Tabela 3B).
Foram obtidos resultados semelhantes com a molécula gigante, a qual induziu anticorpos IgG que bloquearam, eficientemente, a ligação de IgE de doentes alérgicos a pólen de herbáceas, a Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5, Phl p 6 e extracto de pólen de capim timóteo (dados não apresentados). ELISA para avaliação do bloqueamento da actividade dos anticorpos A capacidade dos anticorpos anti-rP2-P6, anti-rP6-P2 e anti-rP5-Pl de murganho, para inibirem a ligação de Abs IgE de doentes alérgicos ao pólen de herbáceas, a rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 5 ou rPhl p 6 foi averiguada por experiências de competição de ELISA. Foram revestidas placas de ELISA (Nunc) com Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5 e Phl p 6 recombinantes (1 pg/mL), durante a noite, a 4 °C, as placas foram lavadas duas vezes com TBST (soro fisiológico tamponado com Tris, Tween a 0,05%), saturado com 200 pL TBST/BSA 1% e foram pré-incubadas com anti-soros de murganho anti-rP2-P6, anti-rP6-P2 e anti-rP5-Pl 27 ou, para fins de controlo, com os soros pré-imunitários correspondentes, cada um, diluido 1:50 em TBST/BSA 0,5%, durante a noite, a 4 °C. Após lavagem 5 vezes com TBST, as placas foram incubadas com soros humanos de doentes alérgicos a pólen de herbáceas, diluídos 1:5 em TBST/BSA 0,5% durante a noite, a 4 °C. Após lavagem 5 vezes com TBST, a IgE humana ligada foi detectada com um Ab IgE de murganho anti-humano marcado com AP (Pharmingen) diluído 1:1000 em TBST/BSA 0,5% (1 hora a 37 °C, 1 hora a 4 °C) . Após lavagem 5 vezes com TBST, a reacção de coloração foi iniciada adicionando 100 pL de substrato de ELISA (Sigma Diagnostics, Inc., St. Louis, EUA). A percentagem da redução da ligação de IgE humana após pré-incubação com anti-soros de murganho foi determinada de acordo com a fórmula: % de inibição da ligação de IgE = lOO-ODjVODp x 100. OD: e ODP representam, respectivamente, as extinções após pré-incubação com o soro imunitário e com o soro pré-imunitário. 28
Doente rPhl p 2 rPhl p 2/ rPhl p 6 rPhl p 6/ rPhl p 2 rPhl p 6 rPhl p 2/ rPhl p 6 rPhl p 6/ rPhl p 2 1 69 72 78 72 72 73 2 72 78 81 81 80 81 3 97 95 98 93 91 97 4 93 93 94 80 80 80 5 79 79 78 69 76 75 6 44 44 45 80 82 82 7 97 97 97 87 97 96 8 92 93 92 84 93 93 9 84 85 85 64 68 68 10 53 56 56 45 53 52 11 83 84 82 78 93 91 12 67 64 65 70 72 71 13 90 89 89 86 91 91 14 94 94 93 85 89 89 15 81 81 81 86 89 95 16 97 96 97 95 96 96 17 97 97 94 95 97 97 18 90 90 91 43 53 52 19 76 75 76 68 83 82 20 97 97 97 73 89 89 média 83 83 84 77 82 83
Tabela 1 revestidas com rPhl p 2 revestidas com rPhl p 6 29
Doente rPhl p 1 rPhl p 5/ rPhl p 1 rPhl p 5 rPhl p 5/ rPhl p 1 rBet v 1 rPhl p 5/ rPhl p 1 1 77 81 85 83 74 0 2 90 89 94 92 96 18 3 96 92 96 92 67 0 4 92 92 95 90 - 5 82 84 87 87 - - 6 92 93 93 93 75 9 7 88 90 90 91 97 0 8 90 91 93 92 88 2 9 50 52 57 57 59 4 10 89 89 93 90 58 5 11 88 95 89 94 - - 12 95 95 95 96 97 0 13 94 96 94 95 97 0 14 95 96 95 95 98 0 15 78 78 81 79 92 0 16 94 95 95 94 94 0 17 46 58 66 65 - - 18 77 78 86 85 63 42 19 91 91 94 93 - - 20 95 93 97 95 96 32 Média 85 86 89 88 83 7 revestidas com rPhl p 1_ revestidas com rPhl p 5 _ revestidas com rBet v 1
Tabela 2. 30 A % Inibição da ligação de IgE a rPhl p 2 rPhl p 6 rPhl p 2 rPhl p 6 rPhl p 2 rPhl p 6 com murganho anti-rP2-P6 murganho anti-rP6- P2 murganho murganho anti-rPhl p 2 anti-rPhl p 6 doente 1 56 62 48 63 0 5 2 38 63 38 65 0 29 3 56 39 53 65 0 18 4 65 52 54 75 0 9 média 54 54 48 67 0 15 B rPhl p 1 rPhl p 5 rPhl p 1 rPhl p 5 com murganho anti-rP5-Pl murganho anti-rPhl p 1 murganho anti-rPhl p 5 doente 1 16 59 33 23 2 19 67 39 15 3 14 69 17 40 4 25 43 29 33 média 19 60 30 28
Tabela 3.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> SHAN-Beteiligungsgesellschaft m.b.H. <120> Vacinas para a alergia contendo polipéptidos híbridos <130> Vacinas para a alergia contendo polipéptidos híbridos < 14 0 > 31 <141> <15Ο> ΕΡ-Α 00.128660.8 <151> 2000-12-28 <16 0 > 18 <170> PADAT Sequenzmodul, Versão 1.0
<210> 1 <211> 27 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador <4 00> 1 ggaattcata tggccgatct cggttac 27
<210> 2 <211> 27 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador <400> 2 cggggtaccg actttgtagc caccagt 27
<210> 3 <211> 27 <212> ADN 32 <213> sequência artificial <220> <223> iniciador <400> 3 cggggtacca tgatccccaa ggttccc
<210> 4 <211> 47 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador < 4 0 0 > 4 cgggatcctc agtggtggtg gtggtggtgc ttggactcgt agctggt
<210> 5 <211> 27 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador < 4 0 0 > 5 ggaattcata tggtgccgaa ggtgacg
<210> 6 <211> 39 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador <400> 6 cgtggccttc cccataagct tctcttctgg cgcgtaggt
<210> 7 <211> 24 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador < 4 0 0 > 7 aagcttatgg ggaaggccac gacc
<210> 8 <211> 46 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador < 4 0 0 > 8 cgggatccta gtggtggtgg tggtggtgcg cgccgggctt gacagc <210> 9
<211> 27 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador <400> 9 ggaattcata tggtgccgaa ggtgacg 27
<210> 10 <211> 46 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador < 4 0 0 > 10 cgggatccta gtggtggtgg tggtggtgcg cgccgggctt gacagc 46
<210> 11 <211> 30 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador 35 ggaattcata tggggaaggc caccaccgag
<210> 12 <211> 39 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador < 4 0 0 > 12 caccttcggc accataagct tcgcgccggg cttgacagc <210> 13 <211> 24 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador < 4 0 0 > 13 aagcttatgg tgccgaaggt gacg
<210> 14 <211> 46 <212> ADN <213> sequência artificial <2 2 Ο > <223> iniciador <4 00> 14 cgggatccta gtggtggtgg tggtggtgct cttctggcgc gtaggt 46
<210> 15 <211> 30 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador < 4 0 0 > 15 ggaattcata tggggaaggc cacgaccgag 30
<210> 16 <211> 46 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador < 4 0 0 > 16 cgggatccta gtggtggtgg tggtggtgct cttctggcgc gtaggt 46
<210> 17 <211> 30 <212> ADN <213> sequência artificial 37 <2 2 Ο > <223> iniciador <4 00> 17 ggaattcata tggggaaggc cacgaccgag 30
<210> 18 <211> 31 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador <4 00> 18 gggatttcca tatgctcttc tggcgcgtag g 31
Lisboa, 20 de Agosto de 2007 38
Claims (20)
- REIVINDICAÇÕES 1. Alergénio híbrido, o qual é um polipéptido compreendendo, pelo menos, duas proteínas alergénicas diferentes ou seus fragmentos, em que cada fragmento consiste em, pelo menos, oito aminoácidos consecutivos da respectiva proteína alergénica, caracterizada por a proteína alergénica, a partir da qual o polipéptido híbrido é derivado, consistir nos principais alergénios do pólen de capim timóteo imunologicamente não relacionados.
- 2. Alergénio híbrido de acordo com a reivindicação 1, em que o polipéptido híbrido compreende os principais alergénios do pólen de capim timóteo não relacionados, seleccionados a partir de Phl p 5/Phl p 1, Phl p 2/Phl p 6 e uma combinação da totalidade das quatro moléculas.
- 3. Alergénio híbrido de acordo com a reivindicação 1, em que o polipéptido híbrido compreende, pelo menos, uma proteína alergénica completa.
- 4. Alergénio híbrido de acordo com a reivindicação 3, em que o polipéptido híbrido compreende, pelo menos, duas proteínas alergénicas completas.
- 5. Alergénio híbrido de acordo com a reivindicação 1, em que o polipéptido híbrido compreende, pelo menos, um fragmento de uma proteína alergénica, em que o fragmento tem uma actividade alergénica substancialmente reduzida em comparação com a proteína alergénica da qual é derivado. 1
- 6. Alergénio híbrido de acordo com a reivindicação 5, em que o polipéptido híbrido compreende fragmentos de, pelo menos, duas proteínas alergénicas diferentes, em que a totalidade dos fragmentos tem uma actividade alergénica substancialmente reduzida em comparação com as respectivas proteínas alergénicas das quais estes são derivados.
- 7. Alergénio híbrido de acordo com qualquer das reivindicações 1-6, caracterizado por este compreender, pelo menos, três proteínas alergénicas diferentes ou seus fragmentos.
- 8. Um polinucleótido codificando um polipéptido de acordo com qualquer das reivindicações 1-7.
- 9. Utilização de um polinucleótido de acordo com a reivindicação 8 para a preparação de uma vacina de ADN.
- 10. Célula transfectada ou transformada com um polinucleótido compreendendo um polinucleótido de acordo com a reivindicação 8.
- 11. Composição farmacêutica contendo um polipéptido de acordo com qualquer das reivindicações 1-7, um polinucleótido de acordo com a reivindicação 8 ou uma célula de acordo com a reivindicação 10.
- 12. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, a qual é uma composição de vacina.
- 13. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11 ou 12 contendo, adicionalmente, um adjuvante. 2
- 14. Método para a preparação de um polipéptido híbrido de acordo com qualquer das reivindicações 1-7, compreendendo os seguintes passos: a) proporcionar um polinucleótido codificando o polipéptido híbrido; b) introduzir o referido polinucleótido numa célula hospedeira; c) cultivar a célula hospedeira obtida no passo b) sob condições nas quais o polipéptido híbrido seja expresso; e d) recuperar o produto de expressão da célula.
- 15. Método de acordo com a reivindicação 14, em que o polinucleótido codificando o polipéptido híbrido é preparado utilizando tecnologia de PCR.
- 16. Método para a preparação de um polipéptido híbrido de acordo com qualquer das reivindicações 1-7, caracterizado por o polipéptido ser preparado por síntese química.
- 17. Utilização de um polipéptido híbrido de acordo com qualquer das reivindicações 1-7 ou de um polinucleótido de acordo com a reivindicação 8 ou de uma célula de acordo com a reivindicação 10, para a preparação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio alérgico.
- 18. Utilização de um polipéptido híbrido de acordo com qualquer das reivindicações 1-7 ou de um polinucleótido de acordo 3 com a reivindicação 8 ou de uma célula de acordo com a reivindicação 10, para a preparação de um medicamento para a vacinação profiláctica ou indução de tolerância.
- 19. Utilização de um polipéptido híbrido de acordo com qualquer das reivindicações 1-7, para a detecção de anticorpos contra uma proteína alergénica numa amostra.
- 20. Utilização de acordo com a reivindicação 19, em que a detecção é realizada por testes de anticorpos in vítro e testes utilizando células. Lisboa, 20 de Agosto de 2007 4
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