ITRM20000494A1

ITRM20000494A1 - Varianti di allergeni ns-ltps, loro usi e composizioni che le comprendono.

Info

Publication number: ITRM20000494A1
Application number: IT2000RM000494A
Authority: IT
Inventors: Giovanni Duro; Vincenzo Izzo; Maria Assunta Costa; Domenico Geraci; Paolo Colombo
Original assignee: C N R Consiglio Naz Delle Ri C
Priority date: 2000-09-11
Filing date: 2000-09-11
Publication date: 2002-03-11
Also published as: ES2239162T3; EP1317543A1; US20050031631A1; EP1317543B1; CA2421840A1; IT1317905B1; ATE290081T1; ITRM20000494A0; DE60109180D1; WO2002020790A9; AU2001292230A1; WO2002020790A1

Description

Descrizione dell'invenzione industriale dal titolo:

"VARIANTI DI ALLERGENI NS-LTPS, LORO USI E COMPOSIZIONI CHE LE COMPRENDONO"

DESCRIZIONE

Campo Della Invenzione

La presente invenzione si riferisce al campo della prevenzione e del trattamento di manifestazioni allergiche associate ad allergeni appartenenti alla famiglia delle proteine ns-LTPs (proteine di trasferimento non specifico di lipidi: "non specific Lipid Transfer Protein").

Stato della tecnica

Le proteina ns-LTPs sono piccole molecole proteiche particolarmente stabili di approssimativamente 10 KDa naturalmente presenti in tutti gli organismi vegetali sino ad oggi studiati. In alcune specie è stato anche dimostrata una loro capacità allergenica come nel caso delle Rosaceae Prunoideae (pesca, albicocca, prugna) e Pomoideae (mela), e Graminaceae, come le Urticacee quali Parietaria Judaica. ([18-23]).

Tali proteine sono accomunate dalla capacità di promuovere in vitro il trasferimento non specifico di molecole lipidiche attraverso membrane, proprietà questa che giustifica la loro denominazione e trova corrispondenza in almeno alcune delle attività esercitate in vivo (17).

A dispetto comunque delle diverse funzioni e della eterogeneità della loro sequenza, le proteine ns-LTPs presentano una struttura secondaria estremamente conservata, comprendente quattro alfa eliche (separate da strutture a cappio) ed un foglietto beta ripiegato disposte in direzione 5'-3' secondo un motivo α-α-α-α-β, riportato in figura 1, dove tale struttura è riportata in corrispondenza delle sequenze amminoacidiche delle ns-LTPs Parj1 e ParJ2.

Tale struttura è assicurata dalla presenza di quattro ponti disolfuro formati da otto residui cisteinici presenti nelle 4 alfa eliche nel quarto cappio, nel foglietto beta ripiegato e nella regione ammino terminale. In particolare:

- un primo ponte disolfuro connette la regione amminoterminale e la terza alfa elica,

- un secondo ponte disolfuro connette la prima alfa elica e la terza alfa elica,

- un terzo ponte disolfuro connette la seconda alfa elica ed il quarto cappio ed

- un quarto ponte disolfuro connette la terza alfa elica ed il foglietto beta ripiegato,

Tali residui cisteinici sono estremamente conservati in tutte le ns-LTPs, e con riferimento ad essi è possibile derivare una sequenza consensus ([17]) evidenziata nella figura 2, in cui sono evidenziati anche i ponti disolfuro.

Nonostante la loro elevata conservazione, data l'eterogeneità delle sequenze delle proteine ns-LTPs non esiste un sistema di numerazione per la individuazione dei residui formati ponti disolfuro che sia valido per tutte le proteine ns-LTPs, anche se un tecnico del ramo può facilmente individuare tali cisteine utilizzando le conoscenze di cui allo stato della tecnica.

Con riferimento particolare alla proteina Parj1, e specificamente alla forma ParJl.0102 maturo (la sequenza primaria del Par j 1.0102 nella forma matura è riportata nella lista di sequenze annessa come SEQ ID NO:11) le cisteine capaci di formare ponti disolfuro sono i residui 4, 14, 29, 30, 50, 52, 75 e 91, ed i relativi ponti sono disposti secondo l'ordine 4-52 (primo ponte), 14-29 (secondo ponte), 30-75 (terzo ponte), 50-91 (quarto ponte). [12].

Par J1, oltre ad essere una ns-LTP è, insieme a Par J2 uno degli allergeni maggiori della Parietaria Judaica, pianta il cui polline costituisce uno degli antigeni ambientali più diffusi soprattutto nell'aerea mediterranea (1).

Il polline di Parietaria Judaica, contiene infatti almeno nove allergeni che hanno pesi molecolari tra 10 e 80 KDa e diversa capacità di legare le IgE [1-9].

Tra di essi Parj1 e Parj2 acquistano una notevole rilevanza in quanto allergeni maggiori, ed in tal senso tali due ns-LTPs sono capaci di inibire la maggioranza delle IgE specifiche agli allergeni della Parietaria, e se somministrati ed entrambi presentano un comportamento immunologico del tutto simile agli estratti commerciali normalmente utilizzati [11].

Di ParJ 1 sono state isolate due isoforme derivanti da geni indipendenti Parj1.0102 e Parj1 .0201, che può essere considerato una variante più corta di ParJ 1.0102 [10]); di Parj2 è stata isolata un'unica forma che mostra una omologia del 45% a livello aminoacidico con Parj1.

ParJ1 e ParJ2 non costituiscono comunque le uniche ns-LTP con proprietà allergeniche in quanti negli ultimi anni sono stati pubblicati alcuni lavori scientifici in cui si descrive la caratterizzazione di nuove molecole allergeniche con omologia con le ns-LTP (18-23).

Nonostante la eterogenicità delle sequenze, è stato dimostrato in seguito ad esperimenti di reazione crociata tra diversi allergeni ns-LTP e relativi anticorpi prodotti, che essi costituiscono una famiglia diffusa di allergeni (pan-allergene) come già descritto per la profilina {19).

A fronte però delle molte informazioni sulla struttura di questo "pan-allergene", non esistono invece informazioni complete sulla localizzazione che gli epitopi per IgE ed IgG avrebbero in esso, né naturalmente nei singoli allergeni ns-LTP (Parj1 e ParJ2 inclusi). Relativamente all'allergene Parj1 ad esempio si è stata identificato un possibile dominio IgE nella porzione 1-30 (12) ma la dislocazione degli altri epitopi IgE della proteina e quella degli epitopi IgG nella molecola non è nota. L'unica informazione accertata è che il repertorio epitopico di Parj1 è differente da quello di ParJ2 (11).

La derivazione di una tale mappa sarebbe invece di enorme rilievo per la elaborazione di un nuovo approccio terapeutico di tali forme allergiche, e ciò in conseguenza del meccanismo che presiede lo sviluppo della risposta allergica, ed al ruolo accertato di IgG ed IgE in esso.

Le IgE prodotte dai linfociti B sono infatti causa del rilascio da mastociti e basofili di mediatori dell'infiammazione come istamina, il quale localizzato o generalizzato, è alla base della tipica sintomatologia allergica. Un rilascio localizzato dà infatti luogo a prurito, eritema, edema formazione di ponfi e eruzioni cutanee (orticaria) nonché rino-congiuntivite (allergie stagionali) . Un rilascio generalizzato provoca broncocostrizione a livello broncopolmonare, e imponenti fenomeni a carico del sistema cardiovascolare, concretizzantesi in patologie più gravi quali l'asma e l 'anafilassi.

Le IgG (ed in particolare le IgG4) sono invece associate alla immunosoppressione della risposta allergica ed alla induzione del fenotipo Thl (produzione di citochine di tipo I, quali IFN-γ e TNF in grado di promuovere la risposta cellulo-mediata come nel caso delle infezioni prodotte da microrganismi o per l'uccisione di cellule tumorali) attraverso diversi meccanismi di selezione clonale (cfr.[13])

In tal senso la derivazione di molecole incapaci di legare le IgE ma al contempo capaci di suscitare la risposta IgG, ed in particolare IgG4 aprirebbe enormi prospettive sia da un punto di vista terapeutico che preventivo.

L'attuale terapia dell'allergia in atto consiste infatti nella sola cura della sintomatologia allergica mediante farmaci.

Esiste invece una terapia "preventiva" rappresentata dall'immunoterapia specifica (SIT) che consiste nella somministrazione per via sottocutanea di quantità diluite dell'allergene al paziente in maniera tale da sopprimere la reazione specifica nei confronti dell'allergene. Benché tale pratica sia utilizzata sin dal 1911, non sono ad oggi noti i meccanismi molecolari responsabili dell 'immunosoppressione anche se sempre maggiori evidenze sembrano mostrare appunto un ruolo chiave delle IgG4 bloccanti e della induzione del fenotipo Thl.

Inoltre la maggior parte degli estratti proteici usati in commercio a questo scopo sono comunque degli estratti crudi, miscele di numerosi componenti in cui una precisa standardizzazione della componente allergenica è difficile .

In tal senso la strategia SIT può comportare la somministrazione di componenti allergenici cui il paziente non è sensibile inducendo la produzione di IgE specifiche verso altri componenti l'estratto. Inoltre, la somministrazione dell'allergene in toto presenta la possibilità di effetti collaterali che, seppur in percentuali molto basse, possono causare anche shock anafilattico .

Per quanto riguarda in particolare la Parietaria Judaica, studi epidemiologici hanno inoltre messo in evidenza una diversa distribuzione dei due allergeni principali nella popolazione (12 milioni di persone interessate nell'area del Mediterraneo) dove, circa il 20% dei pazienti allergici alla Parietaria Judaica non presentano la contemporanea presenza di IgE specifiche contro entrambi gli allergeni. Pertanto la somministrazione di estratti crudi totali o parzialmente purificati potrebbe avere come effetto la somministrazione di allergeni maggiori cui il paziente non è allergico.

L'utilizzo quindi di molecole ricombinanti rappresenterebbe una valida alternativa rispetto a quella tradizionale degli estratti crudi in quanto permetterebbe la personalizzazione della diagnosi e quindi della terapia .

In tal senso la caratterizzazione e lo sviluppo di molecole alternative con ridotti effetti collaterali, capaci cioè di non interagire con le IgE mantenendo la capacità di legare le IgG (in particolare le IgG4) e quindi la capacita' di immunosopprimere la risposta T, consentirebbe di concretizzare un approccio alternativo che supererebbe gli svantaggi propri dell'approccio tradizionale .

Inizialmente si è tentato di ricavare tali molecole alternative con ridotta capacità anafilattica ([16]) mediante la produzione di estratti crudi polimerizzati con formaldeide o gluteraldeide. Nonostante la sperimentazione clinica ha dimostrato l'efficacia di tali molecole modificate, queste ultime presentavano tutti i limiti già precedentemente descritti riguardanti la difficoltà di standardizzazione degli estratti stessi.

La possibilità di modificare geneticamente gli allergeni ha rappresentato quindi in tal senso una soluzione di maggiore affidabilità scientifica poiché la conoscenza della sequenza nucleotidica e quindi aminoacidica di tali molecole ha permesso la produzione di proteine mutate in forma pura.

In seguito all'avvento dell'ingegneria genetica attraverso la manipolazione genetica, da una parte sono stati isolati e caratterizzati molti allergeni ricombinanti con caratteristiche immunologiche del tutto simili a quelle già descritte per gli allergeni nativi cfr. [14 e 15]).

Inoltre, attraverso la manipolazione genetica, sono state inoltre derivate molecole a ridotta attività allergenica con caratteristiche tali da renderle utilizzabili in terapia come molecole sostitutive delle proteine native.

In ogni caso molecole con caratteristiche mutate in modo da consentire la interazione selettiva con le IgG (ed in particolare IgG4) ma non con le IgE, non sono state comunque ancora derivate, con particolare riferimento agli allergeni ns-LTPs.

SOMMARIO DELLA INVENZIONE

La presente invenzione ha per oggetto una variante di un allergene appartenente alla famiglia delle proteine ns-LTP, priva di almeno uno dei quattro ponti disolfuro costituenti la struttura di detto allergene.

Un primo vantaggio della variante della presente invenzione è costituito dal fatto che una tale variante rispetto all'allergene nativo mostra una ridotta o assente capacità di legare IgE ed al contempo una intatta capacità di legare le IgG di soggetti sensibili.

Tale ridotta capacità di legare le IgE di soggetti sensibili è in particolare modo più accentuata nelle varianti in cui tale ponte mancante sia localizzato nella regione ammino-terminale dell'allergene in corrispondenza del dominio alfa elica 1- cappio 1- alfa elica 2, specialmente nelle varianti prive di almeno due ponti dìsolfuro.

Nel caso in cui tali varianti siano prive di tre ovvero di tutti e quattro i ponti disolfuro dell'allergene nativo, le varianti della presente invenzione si presentano come completamente incapaci di legare le IgE.

Particolarmente preferita è la forma di realizzazione in cui la variante secondo la presente invenzione è costituita da una muteina in cui almeno una delle cisteine costituenti detti ponti disolfuro è deleta, ovvero sostituita da un residuo amminoacidico incapace di formare ponti disolfuro.

In tale ultimo caso particolare efficacia ha mostrato la sostituzione del residuo di cisteina con serina o alanina in quanto amminoacidi risultati compatibili con la struttura α-α-α-α-β delle ns-LTP.

Particolarmente preferita è la forma di realizzazione relativa a varianti degli allergeni maggiori di Parietaria Judaica.

In tal senso di particolare rilievo sono le varianti di Parjl, specialmente le muteine di Parjl in cui i residui deleti o sostituiti sono le cisteine 4, 14, 29, 30, 50, 52, 75 e 91 ed in particolare le varianti aventi una sequenza scelta dal gruppo costituito dalle sequenze riportate nella lista di sequenze come SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 7.

Oggetto della presente invenzione è anche un polinucleotide codificante per le varianti della presente invenzione, in particolare per le muteine sopra indicate e specificamente i polinucleotidi comprendenti una sequenza scelta dal gruppo costituito dalle sequenze riportate nella lista di sequenze come SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 8, nonché i vettori che li comprendono.

In considerazione delle proprietà mostrate oggetto della presente invenzione sono anche le varianti sopra menzionate per uso come medicamento, ed in particolare il loro uso per la preparazione di farmaci per il trattamento e/o la prevenzione della forma allergica associata ad un allergene appartenente alla famiglia di proteine ns-LTP, (ciò alla luce della caratteristica di pan-allergene accertata per gli allergeni ns-LTP), in particolare all'allergene corrispondente a detta variante .

Nel caso specifico degli allergeni maggiori di Parietaria Judaica qui esposto a titolo esemplificativo i quali mostrano una diseguale capacità di stimolo delle IgE sieriche nei pazienti allergici. In tal senso un diagnosi specifica per il singolo allergene, può essere ottenuta secondo utilizzando le varianti della invenzione ad esempio come segue: inizialmente la versione ricombinante di ciascun delle molecole native (parJl e Parj2) viene utilizzata per una diagnosi specifica dell'allergia mediante esperimenti di "skin test". I pazienti positivi ad uno di due allergeni possono essere quindi poi analizzati per la positività alle singole varianti dell'allergene cui sono risultati positivi in modo da evidenziare le varianti che danno esito negativo. In seguito tali varianti possono essere somministrate in sostituzione agli estratti proteici attualmente in commercio sviluppando una immunoterapia allergenespecifica. Ulteriori modalità di utilizzazione sia a fine diagnostico che a fine terapeutico sono comunque derivabili da parte di un tecnico del ramo sulla base delle conoscenze di cui allo stato della tecnica.

Oggetto della presente invenzione è infine anche una composizione farmaceutica comprendente una quantità terapeuticamente efficace di almeno una delle varianti ovvero un polinucleotide o un vettore tra quelli sopra menzionati, ed un veicolo farmaceuticamente compatibile, nonché tutte le composizioni di materia che comprendono almeno una della molecola sopra menzionate ed un veicolo ad essa chimicamente compatibile.

Tale veicolo farmaceuticamente e/o chimicamente compatibile può essere un qualunque veicolo noto in arte in quanto utilizzabile per composizioni farmaceutiche o di materia contenenti le molecole sopra menzionate, in particolare quindi peptidi e coniugati e/o oligonucleotidi in qualsiasi forma in particolare in forma solida ed in forma liquida; un esempio di composizione in forma liquida è dato da composizioni il cui veicolo è acqua, soluzioni saline, quali ad esempio soluzioni contenenti NaCl e/o fosfato, o altre soluzioni contenenti molecole capaci di mantenere stabile il pH.

Ulteriore oggetto della presente invenzione è un kit per la derivazione dell'allergogramma personalizzato di un soggetto, per una forma allergica associata ad un allergene ns-LTP comprendente

una prima composizione comprendente detto allergene ns-LTP nella forma nativa unitamente ad un veicolo chimicamente e/o farmaceuticamente;

- almeno una composizione comprendente una singola variante di detto allergene ns-LTP come sopra descritta ed un veicolo chimicamente e/o farmaceuticamente compatibile;

detto allergogramma essendo derivabile mettendo in contatto dette composizioni con immunoglobuline di detto soggetto ed osservando gli effetti così ottenuti.

Particolarmente preferite sono le forme di realizzazione in cui il kit comprende oltre a detta prima composizione un numero di composizioni comprendenti ciascuna una singola variante di detto allergene ns-LTP, pari al numero delle varianti di detto allergene ns-LTPs e quella in cui detto allergene è un allergene di Parietaria Judaica, specificamente ParJl (in una qualsiasi delle sue forme) o ParJ2 (in una qualsiasi delle sue forme).

In particolare tali composizioni possono essere messe in contatto con immunoglobuline in vivo mediante "skin test" ovvero in vi tro su tessuti del paziente quali ad esempio il sangue. Altre modalità di uso del kit della presente invenzione a fini diagnostici sono derivabili dal tecnico del ramo sulla base delle conoscenze di cui allo stato della tecnica. La invenzione verrà meglio descritta con l'ausilio delle figure annesse.

DESCRIZIONE DELLE FIGURE

La figura 1 riporta le sequenze amminoacidiche del Par J 1.0102 e Par j 2.0101 nativi allineate tra di loro ed in rapporto alla loro struttura tridimensionale. La numerazione degli amminoacidi si riferisce alla sequenza del Par j 1.0102

La figura 2 mostra le sequenze amminoacidiche del Par j 1.0101 e di alcune proteine ns-LTP allineate tra di loro. Le frecce indicano i ponti disolfuro presenti nella struttura tridimensionale delle proteine. Gli amminoacidi sono indicati con il codice ad una lettera. Le C riportate nell'ultima riga della tabella indicano i residui di cisteina conservati in tutte le proteine della famiglia ns-LTP.

La figura 3 riporta la rappresentazione schematica dei mutanti dell'allergene maggiore della Parietaria Judaica Par j 1.0102, la cui sequenza è riportata nella lista di sequenze come SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 7. Gli aminoacidi sono riportati con il codice ad una lettera. Gli amminoacidi sottolineati indicano le mutazioni introdotte nella sequenza nativa. Le frecce indicano i ponti disolfuro.

La figura 4 mostra nel pannello A l'esito di un esperimento di Western Blot con un gruppo di sieri provenienti da pazienti allergici alla Parietaria Judaica, volto a dimostrare la capacità di legare le IgE di alcuni mutanti della presente invenzione estesamente descritto nell'esempio 4.

Nella linea 1 è riportato il Par j 1.0101 nativo; nella linea 2 è riportato il mutante Par j 1,29-30; nella linea 3 è riportato il mutante Par j1,50-52; nella linea 4 è riportato il mutante Par j 1,111; e nella linea 5 è riportato il mutante Par j 1,Q.

Nel pannello B è mostrato l'esito di un esperimento di un esperimento di Western blot con un gruppo di sieri provenienti da pazienti allergici alla Parietaria Judaica, volto a dimostrare la capacità di legare le IgG4 degli stessi mutanti sopra descritti, anch'esso estesamente descritto nell'esempio 4.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELLA INVENZIONE

L'approccio sperimentale che ha portato alla presente invenzione è consistito in una strategia di mutagenesi diretta alla distruzione in modo mirato di tutti i ponti disolfuro presenti nelle ns-LTP intere. Ciò al fine di generare molecole con scarsa o assente affinità per IgE ma con intatta affinità con le altre classi di anticorpi in grado di svolgere un'attività di competizione con le IgE specifiche contro l'allergene nativo. L'allergene ns-LTPs preso come modello è stato il Parj1 ed in particolare la isoforma Par j 1.0102. E' stata in particolare utilizzata la tecnologia del DNA ricombinante in una strategia di mutagenesi sito specifica a carico delle cisteine 4, 29, 30, 50 e 52, le cisteine cioè costituenti i ponti disolfuro secondo il modello strutturale noto in arte.

I risultati di tali esperimenti dimostrano la stretta relazione esistente tra struttura tridimensionale della proteina e capacità di formare epitopi per le IgE, ed in particolare che la distruzione progressiva dei ponti disolfuro causa una riduzione del legame con le IgE seriche mentre non influenza la loro capacità di legare le IgG4.

Ciò risulta chiaramente in esito all'esperimento di western blot descritto nell'esempio 4, e nella figura 4, in cui le linee 2, 3 e 4 (vedi legenda Fig.4 pannello A per dettagli) mostrano la riduzione della capacità di legare le IgE seriche da parte dei mutanti della presente invenzione da considerarsi come mutanti tridimensionali.

Specialmente il mutante 29-30 mostra una debolissima banda di legame (Fig. 4 linea 2) mentre il mutante 50-52 è ancora in grado di legare fortemente le IgE(Fig.4 linea 3) . Più interessante è invece il risultato mostrato dai mutanti III e Q (Fig.4 linee 4 e 5) per i quali non è possibile evidenziare alcun legame con le IgE umane. Tali dati in vitro sono stati poi confermati dalla analisi mediante "skin test" dove le proteine ricombinanti pure sono state provate su pazienti monoallergici alla Parietaria Judaica, secondo le tecniche mostrate nell'esempio 5.

Tale gruppo di pazienti ha mostrato una reattività cutanea esclusivamente per le proteine nativa, "29-30", "50-52" e nel 9% dei casi per la proteina mutata "III". Questi risultati ottenuti analizzando singoli individui dimostra l'attendibilità dei dati in vitro precedentemente descritti e soprattutto che la distruzione dei ponti disolfuro "4-52" e "50-91" non modifica in maniera sostanziale la capacità di questo mutante di legare le IgE umane.

Inoltre, tali pazienti mantengono comunque la caratteristica di mantenere domini strutturali in grado di essere riconosciuti da altre classi di anticorpi quali le IgG4 (vedi Fig. 4 pannello B). Per ciò che riguarda lo sviluppo di molecole ipoallergeniche da utilizzare in terapia sembrano comunque essere particolarmente interessanti i mutanti III e Q in cui la rottura dei ponti 4-52, 14-29, 30-75 e 50-91 hanno un effetto devastante sul riconoscimento IgE. Tutto ciò è stato dimostrato sia utilizzando un pool di sieri che una coorte di singoli pazienti indicando che il risultato da noi ottenuto è rappresentativo della risposta immune della popolazione allergica.

Tale risultato avrebbe comunque potuto essere raggiunto mediante tecniche quali la mutagenesi chimica (formaldeide e gluteraldeide) che consentono la rottura dei ponti disolfuro in assenza di mutazioni anche se la strategia di mutagenesi puntiforme presenta il notevole vantaggio di consentire l'inserimento di minime variazioni a livello della sequenza primaria della proteina nativa e quindi di creare mutanti che più probabilmente non interferiscono con il riconoscimento della variante operato dalle cellule T ma soprattutto la possibilità di generare proteine con una elevata riproducibilità. I mutanti chimici non garantiscono infatti un "pattern" di denaturazione costante ad ogni preparazione cosa invece che è garantita dalla mutagenesi genetica .

La strategia di mutagenesi adottata è comunque di fatto indipendente dalla sequenza primaria dell'allergene (e quindi dalla sequenza degli specifici epitopi IgE) in quanto tende esclusivamente a destabilizzare la struttura tridimensionale (non la sua sequenza specifica).

In conseguenza i risultati ottenuti sui su menzionati mutanti di Parj1.0102 sono estendibili a qualsiasi altra muteina dell'allergene Parj1 ed a qualsiasi muteina di altri allergeni ns-LTP le quali, indipendentemente dalla sostituzione e/o delezione di uno più residui amminoacidici della molecola, mantengano una struttura equivalente a quella di del corrispondente allergene nativo privato di almeno un ponte disolfuro.

Inoltre data la spiccata valenza strutturale di tali dati essi sono estendibili anche a varianti di tali allergeni ns-LTP in cui anche in assenza di mutazioni o delezioni, la rottura dei ponti disolfuro è comunque raggiunta, ad esempio tramite le tecniche sopra citate.

La rottura dei ponti disolfuro per se in allergeni ns-LTP è alla base della limitata o assente capacità di legame alle IgE di pazienti allergici delle relative varianti .

In tal senso inoltre in base a quanto noto in arte relativamente alla forte conservazione della struttura ed alla capacità di reazione incrociata che hanno portato alla individuazione del cosiddetto pan-allergene ns-LTP (vedi sopra) tali dati sono indicativi non solo di un uso nella terapia e prevenzione delle forme allergiche causate dagli allergeni corrispondenti alle singole varianti ma anche nella terapia e prevenzione di forme allergiche causate da allergeni ns-LTP diversi da quelli corrispondenti alle varianti utilizzate.

Si è data finora della presente invenzione una descrizione di carattere generale. Con l'aiuto dei seguenti esempi, verrà ora fornita una descrizione più dettagliata di sue specifiche forme di realizzazione, finalizzate a far meglio comprendere scopi, caratteristiche, vantaggi e modalità operative.

ESEMPI

Esempio 1;Clonaggio ed espressione del Par J 1.0102 Per la produzione dell'allergene maggiore della Parietaria Judaica Par j 1.0102 è stato utilizzato il vettore procariotico pQE30 (Qiagen). Tale vettore presenta la caratteristica di esprimere proteine ricombinanti fuse ad una breve coda di istidine ed inducibili con l'isopropil-β-D-tiogalattoside (IPTG). I residui di istidina permettono la purificazione della proteina ricombinante tramite una cromatografia per affinità.

Per questa ragione, il clone P5 contenente la versione processata del Par j 1.0102 la cui sequenza è riportata nella lista di sequenze annessa come SEQ ID NO: 12, è stato sottoposta ad un ciclo di polimerizzazione a catena del DNA (PCR) secondo il seguente schema : 94° C 1 min., 52°C 1 in, 72°C 1 in per 30 cicli. Sono stati utilizzati gli oligonucleotidi sintetici Par j 1.0102 "forward" e "reverse" la cui sequenza è riportata nella lista di sequenze annessa come SEQ ID NO:9 e SEQ ID NO: 10, rispettivamente.

Il frammento così generato è stato frazionato su gel di agarosio all'1% in I X TBE, estratto dal gel, purificato e digerito con gli enzimi di restrizione Barn HI e Hind III. Il vettore pQE30 è stato a sua volta digerito con gli stessi enzimi. Il vettore linearizzato ed i frammenti digeriti sono stati incubati a 16° C per 4 ore in presenza dell'enzima DNA ligasi secondo diversi rapporti stechiometrici. La miscela di reazione è stata poi trasformata nel ceppo batterico M15. I cloni ricombinanti sono stati sequenziati con il metodo di Sanger e la sequenza nucleotidica così determinata ha dimostrato che il frammento di DNA inserito all'interno del vettore pQE30 era identico a quanto noto in arte (10).

Esempio 2: Clonaggio ed espressione di mutanti conformazionali del ParJ 1.0102

La mutagenesi sito-specifica a carico dei residui di cisteina in posizione 4, 29, 30, 50 e 52 del clone avente la sequenza nucleotidica riportata nella lista di sequenze come SEQ ID NO: 12 è sequenza amminoacidica riportata nella lista di sequenza come SEQ ID NO: 11, è stata effettuata utilizzando il kit Transformer site-Directed Mutagenesis della Clontech seguendo le indicazioni del produttore. Il clone in grado di esprimere il Par j 1.0102 nativo è stato utilizzato come stampo per la mutagenesi e tutti i residui di cisteina sono stati trasformati in serina. La riuscita del procedimento è stata confermata dal sequenziamento dei cloni ricombinanti utilizzando il metodo di Sanger.

Mediante tale procedimento sono stati isolati 5 mutanti indipendenti di seguito definiti Par j 1,29-30 (SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4); Par j 1.,III (SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6), Par j 1,50-52 (SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8), e Par j 1,Q (SEQ ID NO: le SEQ ID NO: 2).

Esempio,3 : Purificazione delle proteine ricombinanti

10 ml della coltura 0/N sono stati quindi utilizzati per un inoculo in 400 mi di terreno di coltura 2YT contenente ampicillina e kanamicina ad una concentrazione finale di 100 ugr/ml e 10 ugr/ml rispettivamente. La crescita è stata condotta a 37°C e in agitazione. Dopo un'ora è stato prelevato un campione dalla coltura batterica (controllo non indotto) che ha permesso di valutare l'espressione delle diverse componenti proteiche nel sistema in assenza di IPTG. Alla coltura è stato quindi aggiunto IPTG alla concentrazione finale 1 mM e la crescita è stata fatta proseguire per 4 ore a 37°C in agitazione. Alla fine di questo periodo è stato quindi prelevato un altro campione dalla coltura (controllo indotto).

Un'aliquota dei due campioni, non indotto ed indotto, è stata quindi analizzata su PAGE-SDS al 10% poi colorato con blu Comassie. La coltura batterica è stata centrifugata a 5000 rpm per 15 minuti, il "pellet" risospeso in 5 ml/grammo di buffer B (8M urea, 0,1M NaH2P04 ed 0,01M TRIS pH8) e tenuto in agitazione a temperatura ambiente per 1 ora. Il lisato è stato quindi centrifugato a 14000 rpm per 30 minuti. Il supernatante è stato caricato su una colonna di contenente una resina in grado di legare selettivamente proteine contenenti una coda di istidine (Chelating Sepharose Fast Flow) e la proteina eluita seguendo il protocollo fornito dai venditori (Amersham). Il trattamento con urea ha permesso di incrementare notevolmente la quantità di Par j 1.0102 ricombinante prodotto (in media 2 mg per litro di coltura batterica) ma ha reso necessario un successivo passaggio per far riacquistare alla proteina il corretto assetto tridimensionale .

Per ottenere tale risultato, le frazioni contenenti la proteina, eluite dalla cromatografia di affinità, sono state infatti innanzitutto diluite 10 volte in "start buffer" senza urea per permettere la rinaturazione della stessa, e la soluzione ottenuta è stata quindi ricaricata su una colonna ad alta affinità per le istidine per eliminare l'urea contenuta nel tampone. Inoltre la proteina eluita è stata fatta passare attraverso una colonna di Sephadex G-25 per ottenere una purificazione definitiva. Le frazioni eluite sono state quindi nuovamente analizzate su PAGE-SDS al 10% e valutate quantitativamente allo spettrofotometro con il metodo di Bradford e per la loro capacità di legare le IgE da pazienti allergici alla Parietaria Judaica.

Le proteine così purificate sono state frazionate su gel di poliacrilammide (PAGE-SDS) al 16% e trasferite su nitrocellulosa grazie ad un sistema Dry-blot della Mi11ipore. La membrana viene incubata per 12-14 ore con un pool di sieri allergici alla Parietaria Judaica diluito nel rapporto 1:5 in PBS-tween. I complessi di legame proteine-IgE umane sono messi in evidenza utilizzando un anticorpo secondario anti-IgE coniugato alla perossidasi di rafano. I complessi sono così messi in evidenza utilizzando un sistema di chemioluminescenza (Super-signal della Pierce).

Esempio 5: Esperimenti di skin test con le muteine purificate

La molecola nativa ed i quattro mutanti sopra indicati sono stati poi utilizzati in esperimenti di "skin test" su pazienti allergici alla Parietaria Judaica per valutare la loro capacità di rilasciare istamina.

Per le proteine di tipo selvatico, Par Jl 29-30 e Par Jl III sono stati studiati 21 pazienti monoallergici alla Parietaria Judaica. Di questi tutti presentavano un ponfo edematoso quando venivano utilizzate le proteine native e Par Jl 29-30. In particolare, il mutante Par Jl 29-30 mostrava un ponfo di dimensione minore/uguale al 50% dell'area del ponfo indotto dalla proteina nativa. Il mutante Par Jl III rilasciava una piccolo ponfo esclusivamente in 2 pazienti (9%) mentre nei rimanenti 19 non era in grado di indurre rilascio di istamina.

Nel caso dei mutanti Par Jl 50-52 e Par Jl Q sono stai invece saggiati esclusivamente 5 pazienti e tutti mostravano una reazione al mutante 50-52 e nessuna al mutante quadruplo.

I dati qui riportati dimostrano quindi che mutazioni sito-specifiche a carico delle cisteine producono effetti consistenti sulla capacità di tali proteine ricombinanti di legare le IgE umane. Prescindendo dai mutanti ili e Q che sembrano avere perso la capacità di legame con le IgE umane (non possono pertanto essere più considerati degli allergeni), i mutanti 29-30 e 50-52 sono degli ipoallergeni in quanto legano con intensità diversa ed in ogni caso minore della proteina nativa gli anticorpi umani della classe E. Da tutto ciò si evince che l'incremento nel numero dei ponti disolfuro rotti, ed in particolare mutagenizzati, causa una progressiva dimin uzione del legame con le IgE (maggiore il numero di ponti mutati minore la capacità di legame).

Allo scopo di soddisfare ulteriori esigenze anche di carattere applicativo, un tecnico del ramo potrà derivare ulteriori modifiche e varianti, tutte peraltro comprese nell'ambito di protezione della presente invenzione, quale definito dalle rivendicazioni allegate.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Variante di un allergene appartenente alla famiglia delle proteine ns-LTP, detta variante essendo priva di almeno uno dei quattro ponti disolfuro costituenti la struttura di detto allergene.
2. Variante secondo la rivendicazione 1, detta variante essendo priva di almeno un ponte disolfuro nella regione ammino-terminale di detto allergene.
3. Variante secondo la rivendicazione 1 oppure 2, detta variante essendo priva di due di detti ponti disolfuro costituenti la struttura di detto allergene.
4. Variante secondo la rivendicazione 1, detta variante essendo priva di tre ovvero di tutti e quattro detti ponti disolfuro.
5. Variante secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, detta variante essendo una muteina in cui almeno una delle cisteine costituenti detti ponti disolfuro è deleta.
6. Variante secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5, detta variante essendo una muteina in cui almeno una delle cisteine costituenti detti ponti disolfuro è sostituita da un residuo amminoacidico incapace di formare ponti disolfuro.
7. Variante secondo la rivendicazione 6, in cui detto residuo amminoacidico è serina o alanina.
8. Variante secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7, in cui detto allergene è uno degli allergeni maggiori di Parietaria Judaica.
9. Variante secondo la rivendicazione 8, in cui detto allergene è Parjl, e dette cisteine costituenti i ponti disolfuro sono le cisteine 4, 14, 29, 30, 50, 52, 75 e 91
10. Variante secondo la rivendicazione 9, in cui la sequenza di detta variante comprende una sequenza scelta dal gruppo costituito dalle sequenze riportate nella lista di sequenze come SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 7.
11. Variante secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 10 per uso come medicamento.
12. Polinucleotide codificante per la variante secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 10.
13. Polinucleotide secondo la rivendicazione 12, in cui detto la sequenza di detta variante comprende una sequenza scelta dal gruppo costituito dalle sequenze riportate nella lista di sequenze come SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 8.
14. Vettore comprendente almeno un polinucleotide secondo la rivendicazione 12 oppure 13.
15 . Uso di una variante secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 10, per la preparazione di farmaci per il trattamento e/o la prevenzione della forma allergica associata ad un allergene appartenente alla famiglia di proteine ns-LTP.
16. Uso secondo la rivendicazione 15, in cui detto allergene appartenente alla famiglia di proteine ns-LTP è l'allergene corrispondente a detta variante.
17. Uso secondo la rivendicazione 15 oppure 16, in cui detto allergene è un allergene maggiore di Parietaria Judaica e detta forma allergica associata a detto allergene è una forma allergica da Parietaria Judaica.
18. Composizione farmaceutica comprendente almeno una muteina secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 10, ed un veicolo farmaceuticamente compatibile.
19. Composizione farmaceutica comprendente almeno un polinucleotide secondo la rivendicazione 12 oppure 13, e/o di un vettore secondo la rivendicazione 14, ed un veicolo farmaceuticamente compatibile.
20. Kit per la derivazione dell 'allergogramma personalizzato di un soggetto per una forma allergica associata ad un allergene ns-LTP, comprendente una prima composizione comprendente detto allergene ns-LTP nella forma nativa unitamente ad un veicolo compatibile; - almeno una composizione comprendente una singola variante di detto allergene ns-LTP secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 10 ed un veicolo compatibile; detto allergogramma essendo derivabile mettendo in contatto dette composizioni con immunoglobuline di detto soggetto ed osservando gli effetti così ottenuti.
21. Kit secondo la rivendicazione 20, comprendente detta prima composizione e un numero di composizioni comprendenti ciascuna una singola variante di detto allergene ns-LTP, pari al numero delle varianti di detto allergene ns-LTP.
22. Kit secondo la rivendicazione 20 oppure 21, in cui detto allergene ns-LTP è ParJ1.