ES2239162T3 - Variantes de antigeno ns-ltp de parietaria judaica, usos de las mismas y composiciones que las contienen. - Google Patents
Variantes de antigeno ns-ltp de parietaria judaica, usos de las mismas y composiciones que las contienen.Info
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Abstract
Una variante de un alergeno perteneciente al grupo de las proteínas ns-LTP, dicha variante conserva la mayor parte de la secuencia de aminoácidos del alergeno de tipo salvaje, dicha variante carece por lo menos de uno de los cuatro puentes disulfuro que constituyen la estructura de dicho alergeno y muestra una capacidad reducida de fijación de la IgE, al tiempo que mantiene la capacidad de inducir respuesta de la IgG.
Description
Variantes de antígeno ns-LTP de
Parietaria judaica, usos de las mismas y composiciones que
las contienen.
La presente invención se refiere a los ámbitos de
la prevención y el tratamiento de síntomas alérgicos asociados con
alergenos pertenecientes al grupo de las proteínas de transferencia
lípida no específica (ns-LTP = non specific Lipid
Transfer Protein).
Las proteínas ns-LTP están
formadas por moléculas proteicas pequeñas, de aproximadamente 10
kDa, que poseen una gran estabilidad y están presentes de forma
natural en todos los organismos vegetales estudiados hasta fechas
recientes. En diversas especies se han identificado también como
alergenos, tal es el caso de las rosáceas, prunoideas (melocotón,
albaricoque, ciruela) y pomoideas (manzana) y gramináceas así como
en las urticáceas del tipo Parietaria judaica (español =
hierba de los muros) (18-23).
Estas proteínas se caracterizan por su capacidad
de transportar lípidos a través de membranas "in
vitro", una capacidad que justifica su denominación y
corresponde por lo menos a algunas de las actividades que desempeñan
"in vivo" (17).
Sin embargo, a pesar de las diferentes funciones
y de la heterogeneidad de sus secuencias, las ns-LTP
tienen una estructura secundaria muy conservada, que consta de
hélices alfa (separadas por bucles) y una capa beta plegada,
dispuesta en la dirección 5'-3' con arreglo a un
modelo
\alpha-\alpha-\alpha-\alpha-\beta.
Esta estructura está dotada de la presencia de
cuatro puentes (enlaces) bisulfuro, formados por ocho restos
cisteína que están presentes en las 4 hélices alfa del cuarto
bucle, en la capa beta plegada y en la región terminal amino (véase
referencia 29).
En particular:
- un primer puente disulfuro conecta la región
terminal amino con la tercera hélice alfa,
- un segundo puente disulfuro conecta la primera
hélice alfa con la tercera hélice alfa,
- un tercer puente disulfuro conecta la segunda
hélice alfa con el cuatro bucle y
- un cuarto puente disulfuro conecta la tercera
hélice alfa con la capa beta plegada.
Estos restos cisteína están muy conservados en
todas las ns-LTP y respecto a ello puede derivarse
una secuencia de consenso (17).
A pesar de su gran conservación, debida a la
heterogeneidad de secuencia de las ns-LTP, no
existe un sistema de notación de los restos que forman puentes
disulfuro que sea válida para todas las ns-LTP, esto
no impide que los expertos
en la materia puedan escoger con facilidad tales cisteínas basándose en los conocimientos del estado de la técnica.
en la materia puedan escoger con facilidad tales cisteínas basándose en los conocimientos del estado de la técnica.
Con referencia especial a la proteína Parj1 y de
modo específico a la forma madura Parj1.0102, las cisteínas aptas
para formar puentes disulfuro son los restos 4, 14, 29, 30, 50, 52,
75 y 91 y los puentes en cuestión están dispuestos en el orden
Cys4-Cys52 (primer puente),
Cys14-Cys29 (segundo puente),
Cys30-Cys75 (tercer puente) y
Cys50-Cys91 (cuarto puente) (12).
La Parj1, además de ser una
ns-LTP, representa junto con la Parj2, uno de los
principales alergenos de la Parietaria judaica (PJ), una
planta cuyo polen constituye uno de los antígenos ambientales más
propagados, en especial en la región mediterránea (1).
De hecho, el polen de la Parietaria
judaica contiene por lo menos nueve alergenos, cuyos pesos
moleculares se sitúan entre 10 y 80 kDa, provistos de diferentes
capacidades de fijación de la IgE [1-9].
Entre ellas, la Parj1, en las dos isoformas
Parj1.1.2 y Paj1.0201, aisladas de genes independientes (10) y la
Parj2 adquieren una relevancia remarcable como alergenos
principales. Estas dos ns-LTP son capaces en
particular de inhibir la mayor parte de IgE específicas contra los
alergenos de Parietaria y una vez administradas presentan
ambas el comportamiento inmunológico similar en todo al de los
extractos comerciales que se utilizan habitualmente (11).
Sin embargo, la Parj1 y la Parj2, no son las
únicas ns-LTP que poseen propiedades alergénicas.
Recientemente se ha publicado algunos artículos científicos, en los
que se describe la caracterización de nuevas moléculas alergénicas
homólogas de las ns-LTP (18-23).
A pesar de la heterogeneidad de secuencia, a raíz
de los ensayos de reactividad cruzada entre los diferentes alergenos
ns-LTP y los anticuerpos producidos por ellos se ha
demostrado que las ns-LTP constituyen un amplio
grupo de alergenos (panalergenos), tal como se ha descrito ya para
la profilina (19).
Sin embargo, a diferencia de la abundante
información sobre la estructura de este "panalergeno" no se
dispone de información exhaustiva sobre la localización de los
epítopes de la IgE ni de la IgG, tampoco sobre los alergenos
ns-LTP individuales (incluidas las Parj1 y Parj2)
(11, 12).
Como resultado del mecanismo al que se atribuye
el desarrollo de la respuesta alérgica y del rol verificado que
tienen la IgG y la IgE en él, la derivación de tal mapa sería de
una importancia enorme para plantear una nueva estrategia
terapéutica de estas formas alérgicas (13).
En particular, la derivación de moléculas con
reducción o incluso ausencia de capacidad de fijación de la IgE,
pero todavía con la capacidad concomitante de inducir respuesta a
la IgG y en particular a la IgG4, se convertiría en un hito
importante tanto desde el punto de vista terapéutico como
preventivo.
Tal molécula permitiría la inmunosupresión de la
respuesta de la célula T, con reducción o incluso ausencia de
efectos secundarios.
De hecho, actualmente la terapia de una alergia
en curso consiste en la curación meramente farmacológica de la
sintomatología alérgica.
La terapia preventiva, consistente en una
inmunoterapia específica (SIT), se realiza actualmente mediante la
administración subcutánea de cantidades diluidas de alergeno al
paciente, con el fin de suprimir la reacción específica a dicho
alergeno.
La mayoría de los extractos proteínicos
comerciales utilizados para ellos son extractos en bruto de
diferentes tipos, mezclas de diversos componentes, en las que
resulta difícil una estandarización precisa del componente
alergénico.
Por lo tanto, la estrategia SIT contempla la
administración de componentes alergénicos a los que el paciente no
sea sensible, induciendo la secreción de IgE específicas con
respecto a los demás componentes del extracto. Por otro lado, la
administración del alergeno total incluye la posibilidad de efectos
secundarios que, a pesar de su aparición extremadamente baja, pueden
provocar incluso un choque anafiláctico.
Con respecto en especial a la Parietaria
judaica, los estudios epidemiológicos han puesto de manifiesto
además una distribución diferentes de los dos alergenos principales
en la población humana (12 millones de sujetos afectados en la
región mediterránea), en los que aproximadamente el 20% de los
pacientes alérgicos a la PJ no muestran la presencia concomitante de
la IgE específica contra ambos alergenos. Por consiguiente, la
administración de extractos en bruto, total o parcialmente
purificados, podría convertirse en la administración de alergenos
principales a los que el paciente no es alérgico.
Por lo tanto, el uso de moléculas recombinantes,
que permitan un diagnóstico y una terapia centrados en el cliente,
constituiría una alternativa válida al uso tradicional de extractos
en bruto.
En particular, la caracterización y el desarrollo
de moléculas alternativas de efectos secundarios menores, es decir,
que tengan una interacción reducida o nula con la IgE al tiempo que
mantienen la capacidad de fijar las IgG (en particular la IgG4) con
respecto al tipo salvaje y, por ello, la capacidad de
inmunosuprimir la respuesta T, permitiría llevar a cabo una
estrategia alternativa para superar los inconvenientes inherentes a
la estrategia tradicional.
Tales moléculas alternativas, de menor capacidad
anafiláctica, se buscan de hecho produciendo extractos en bruto
polimerizados con formaldehído o glutaraldehído (16).
Aunque efectivas, como se demuestra en ensayos
clínicos, estas moléculas modificadas han puesto de manifiesto que
presentan sin embargo el inconveniente ya mencionado antes de la
difícil estandarización de los extractos.
Después de la llegada de la ingeniería genética
se han derivado en forma pura tanto los alergenos recombinantes,
inmunológicamente similares a los alergenos nativos (14 y 15) y los
alergenos recombinantes que tienen una actividad alergénica
reducida con respecto a los alergenos de tipo salvaje (por
consiguiente, son terapéuticamente idóneos como sustitutos de los
últimos).
Sin embargo, ninguno de tales mutantes se ha
derivado con referencia particular a los alergenos
ns-LTP.
Un objeto de la presente invención es una
variante de un alergeno perteneciente al grupo de las proteínas
ns-LTP, en específico una variante hipoalergénica de
un alergeno completo o un fragmento del mismo del grupo de las
proteínas ns-LTP.
Un objeto particular de la invención es una
variante de un alergeno perteneciente al grupo de las
ns-LTP que carezca por lo menos de uno de los
cuatro puentes disulfuro que constituyen la estructura de dicho
alergeno.
La primera ventaja de la variante de la presente
invención consiste en que, con respecto al alergeno nativo, tiene
una capacidad reducida o incluso nula de fijación de la IgE,
conservando de modo concomitante una capacidad intacta de fijación
de IgG en dichos sujetos.
Esta capacidad diferencial de fijación se amplía
en particular en las variantes, en las que tal puente ausente se
localiza en la región amino terminal del alergeno, en el dominio
hélice alfa 1- bucle 1- hélice alfa 2, ya que tienen una actividad
particularmente reducida de fijación de la IgE, en especial en las
variantes que carecen por lo menos de dos puentes disulfuro.
En el caso de una variante que carezca de tres o
de los cuatro puentes disulfuro del alergeno nativo, la actividad
relevante de fijación de la IgE se reducen sustancialmente hasta
llegar a ser sustancialmente nula. Tal variante constituye, por
tanto, una forma preferida de ejecución de la invención.
La importancia de tal capacidad diferencial de
fijación de la variante de la invención estriba en que, con arreglo
al rol de las dos inmunoglobulinas en el mecanismo molecular de la
respuesta alérgica, evidenciada en el párrafo anterior, se pone de
manifiesto moléculas que, a pesar de ser inmunogénicas, tienen una
alergenicidad reducida o nula.
Las variantes de la invención que mantienen
principalmente la mayor parte de la secuencia de aminoácidos del
alergeno de tipo salvaje y, por consiguiente, tienen
sustancialmente la misma longitud que dicho alergeno, constituyen en
este contexto una forma preferida de ejecución de la invención.
Son preferidas en particular las variantes que
consisten en una muteína, en la que se ha borrado por lo menos uno
de dichos puentes disulfuro constitutivos de las cisteínas, o se ha
sustituido por un resto aminoácido que no es capaz de formar un
puente disulfuro.
En este último caso se ha probado como
particularmente eficaz la sustitución del resto cisteína por serina
o alanina como aminoácido, que se ha mostrado compatible con la
estructura
\alpha-\alpha-\alpha-\alpha-\beta
de las ns-LTP.
Es preferida en particular la forma de ejecución
referida a las variantes de los alergenos principales de la
Parietaria judaica.
Son especialmente relevantes en particular las
variantes Parj1, específicamente las muteínas Parj1 en las que los
restos borrados o sustituidos son las cisteínas 4, 14, 29, 30, 50,
52, 75 y 91 y en particular las variantes que tiene una secuencia
elegida entre el grupo formado por las secuencias descritas en el
listado de secuencias con el nombre de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6,
SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 10.
Es también objeto de la invención un
polinucleótido que codifica las variantes de la presente invención,
en particular las muteínas recién nombradas, y específicamente
polinucleótidos que contienen una secuencia elegida entre el grupo
formado por las secuencias descritas en el listado de secuencias con
el nombre de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9
así como los vectores que los contienen.
A la luz de lo dicho anteriormente son también
objeto de la presente invención todas las variantes mencionadas
antes para el uso como medicamento o como agente de diagnóstico y,
en particular, para el uso en el tratamiento y/o la prevención y/o
el diagnóstico de la forma alérgica asociada con un alergeno
perteneciente al grupo de las proteínas ns-LTP
(esto a la luz de la característica panalergénica verificada en los
alergenos ns-LTP), en particular el alergeno
correspondiente a dicha variante.
En el caso específico, descrito en la presente
mediante un ejemplo, de alergenos principales de la Parietaria
judaica que despliegan una capacidad dispar de estimular la
producción de la IgE en el suero de pacientes alérgicos, puede
llevarse a cabo un diagnóstico específico del alergeno individual
utilizando las variantes de la invención, p.ej. del modo siguiente:
inicialmente se utiliza la versión recombinante de cada molécula
nativa (Parj1 y Parj2) para el diagnóstico específico de la alergia
mediante un ensayo de punción de la piel. En los pacientes
sensibles a uno de los dos alergenos puede analizarse seguidamente
si son positivos a las variantes de alergeno individual al que han
dado resultados positivos en el ensayo, con el fin de desvelar las
variantes de ensayo negativas. A continuación pueden administrarse
tales variantes en sustitución de los extractos comerciales de
proteínas, desarrollando una inmunoterapia específica del alergeno.
Los expertos en la materia podrán derivar otros modos de uso con
fines diagnósticos y terapéuticos a la luz de los conocimientos del
estado de la técnica.
Es también objeto de la invención una composición
farmacéutica que contiene una cantidad terapéuticamente eficaz por
lo menos de una de las variantes, o un polinucleótido o un vector
entre los ya mencionados, y un excipiente farmacéuticamente
aceptable, así como todas las composiciones materiales que
contienen por lo menos una de las moléculas mencionadas
anteriormente y un excipiente químicamente compatible con las
mismas.
Este excipiente farmacéutica y/o químicamente
aceptable puede ser cualquier excipiente conocido de la técnica como
idóneo para composiciones farmacéuticas o materiales que contenga
moléculas similares a las ya mencionadas antes, por lo tanto y en
particular los péptidos y conjugados y/u oligonucleótidos en
cualquier forma, en particular en forma sólida y en forma líquida;
un ejemplo de composición en forma líquida se proporciona mediante
composiciones cuyo excipiente es agua, soluciones salinas del tipo,
p.ej. soluciones que contienen NaCl y/o fosfato u otras soluciones
que contienen moléculas tampón.
Otro objeto más de la presente invención es un
kit para la derivación de un alergograma correspondiente al sujeto
para una forma alérgica asociada con un alergeno
ns-LTP que consta de:
- una primera composición que contiene dicho
alergeno ns-LTP en forma nativa junto con un
excipiente química y/o farmacéuticamente aceptable;
- por lo menos una composición que contenga una
variante individual de dicho alergeno ns-LTP ya
descrita antes y un excipiente química y/o farmacéuticamente
aceptable;
dicho alergograma puede derivarse de la puesta en
contacto de dichas composiciones con inmunoglobulinas de dicho
sujeto y de la observación de los efectos obtenidos de este
modo.
Son preferidas en particular las formas de
ejecución en las que el kit contiene, además de la primera
composición ya mencionada, un número de composiciones, cada una de
las cuales contiene una variante individual de dicho alergeno
ns-LTP, igual al número de variantes de dicho
alergeno ns-LTP y en el que dicho alergeno es un
alergeno de Parietaria judaica, específicamente el Parj1 (en
cualquiera de sus formas) o el Parj2 (en cualquiera de sus
formas).
Tales composiciones pueden ponerse en contacto en
particular con inmunoglobulinas en un "ensayo de punción de la
piel" "in vivo" o en tejidos del paciente p.ej. la
sangre "in vitro". Los expertos en la materia podrán
derivar otros modos de empleo del kit de la presente invención con
finalidades de diagnóstico a la luz del conocimiento del estado de
la técnica. La invención se describe mejor mediante las figuras
adjuntas.
En la figura 1 se representan las secuencias de
aminoácidos del Parj1.0102 y del Parj2.0101 en paralelo, indicando
la estructura tridimensional de las mismas. La notación de los
aminoácidos se refiere a la secuencia del Parj1.0102.
En la figura 2 se representan las secuencias de
aminoácidos del Parj1.0101 y algunas proteínas
ns-LTP en forma paralela. Las flechas indican los
puentes disulfuro presentes en la estructura tridimensional de las
proteínas. Los aminoácidos se indican con símbolos de código de una
letra. Las letras C que se incluyen en la última fila de la tabla
indican los restos cisteína conservados en todas las proteínas del
grupo ns-LTP.
La figura 3 contiene la representación
esquemática de los mutantes del alergeno principal de la
Parietaria judaica Parj1.0102, la secuencia de los cuales se
describe en el listado de secuencias con el nombre de SEQ ID NO: 4,
SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 10. Los aminoácidos se
indican con el código de una letra. Los aminoácidos subrayados
indican las mutaciones efectuadas en la secuencia nativa. Las
flechas indican los puentes
disulfuro.
disulfuro.
En la figura 4 se representa un panel A del
análisis Western Blot, cuyos resultados indican la actividad de la
rParj1 y de sus variantes de puente disulfuro de fijación de la IgE
utilizando un conjunto de sueros (n = 30) de pacientes
monosensitivos alérgicos a Pj.
En el panel B se representa la tintura con azul
Coomassie Brilliant Blue de las proteínas recombinantes usadas.
En ambos paneles, en la primera pista se incluye
el resultado obtenido con el Parj1.0101 nativo; en la segunda pista
el resultado obtenido con el mutante PjA; en la tercera pista el
resultado obtenido con el mutante PjB; en la cuarta pista el
resultado obtenido con el mutante PjC; en la quinta pista el
resultado obtenido con el mutante PjD.
En el panel A de la figura 5 se representa el
resultado del análisis Western Blot con un conjunto de sueros de
pacientes alérgicos a la PJ con el fin de demostrar la capacidad
(actividad) de fijación de la IgE que tienen algunos mutantes de la
presente invención, descritos con detalle en el ejemplo 3.
En la primera pista se describe el resultado
obtenido con el Parj1.0101 nativo; en la segunda pista el resultado
obtenido con el mutante PjA; en la tercera pista el resultado
obtenido con el mutante PjB; en la cuarta pista el resultado
obtenido con el mutante PjC; en la quinta pista el resultado
obtenido con el mutante PjD.
En el panel B se presenta el resultado del
análisis Western Blot con un conjunto de sueros de pacientes
alérgicos a la PJ con el fin de demostrar la capacidad de fijación
de la IgG4 que tienen mismos mutantes ya mencionados, descritos
también con detalle en el ejemplo 3.
En la primera pista se describe el resultado
obtenido con el Parj1.0101 nativo; en la segunda pista el resultado
obtenido con el mutante PjA; en la tercera pista el resultado
obtenido con el mutante PjB; en la cuarta pista el resultado
obtenido con el mutante PjC; en la quinta pista el resultado
obtenido con el mutante PjD.
En la figura 6 se representa un histograma que
contiene los resultados del ensayo de detección ELISA realizado
empleando el conjunto de sueros del ejemplo 3, que se describe con
detalle en el ejemplo 4. El histograma negro indica los resultados
obtenidos con los sueros alérgicos; las barras punteadas indican los
resultados obtenidos con suero no alérgico. En el eje "y" se
representa la densidad óptica medida y en el eje "x" las
proteínas ensayadas (la rParj1 y sus variantes de puente disulfuro
PjA, PjB, PjC y PjD).
En la figura 7 se representan diez diagramas que
contienen los resultados del ensayo de detección ELISA realizado con
sueros monosensitivos de diez pacientes alérgicos a la Pj, descrito
con detalle en el ejemplo 4, cada diagrama corresponde a uno de
dichos pacientes.
En cada histograma, en el eje "y" se
representa la densidad óptica medida y en el eje "x" las
proteínas ensayadas (la rParj1 y sus variantes de puente disulfuro
PjA, PjB, PjC y PjD).
En cada diagrama, los cuadrados negros indican
sueros alérgicos, los cuadrados blancos un suero no alérgico.
En la figura 8 se representa un histograma que
contiene los resultados del ensayo de detección ELISA de la
actividad de fijación de Ig que tiene un antisuero policlonal de
conejo inmune y preinmune contra la rParj1, que se describe con
detalle en el ejemplo 6.
En el eje "y" se representa la densidad
óptica medida y en el eje "x" los antígenos utilizados (el
rParj1 y sus variantes de puente disulfuro PjA, PjB, PjC y
PjD).
Los cuadrados negros indican los resultados
obtenidos con un conejo inmune, los cuadrados de rejilla indican los
resultados obtenidos con un conejo preinmune.
La estrategia experimental que condujo a la
presente invención consistió en una estrategia de mutagénesis, cuyo
objetivo era la rotura intencionada de todos los puentes disulfuro
presentes en todas las ns-LTP. Esto se efectuó con
el fin de generar moléculas de afinidad reducida o nula con la IgE,
pero con afinidad intacta con respecto a las demás clases de
anticuerpos aptos para competir con las IgE específicas contra el
alergeno nativo. El alergeno Parj1 de ns-LTP, cuya
secuencia y estructura se representan en la figura 1 comparándolas
con las del Parj2, y en particular la isoforma Parj1.0102 (la
secuencia primaria del cual se representa en el listado de
secuencias anexo con los nombres SEQ ID NO: 1 y 2) se toman como
modelos moleculares a utilizar para llevar a cabo la mutagénesis y
consiguiente verificación de las propiedades de los mutantes
obtenidos. Se recurre en particular a la tecnología del DNA
recombinante en una estrategia de mutagénesis dirigida a sitio
contra las cisteínas 4, 29, 30, 50 y 52, es decir, las cisteínas
que constituyen los puentes disulfuros con arreglo al modelo
estructural ya conocido de la
técnica.
técnica.
Los resultados de estos ensayos demuestran la
relación estrecha que existe entre la estructura tridimensional de
la proteína y la capacidad de formar epítopes de las IgE y en
particular que la rotura gradual de los puentes disulfuro provoca
una reducción de la actividad de fijación de las IgE del suero que
tiene dicha proteína, mientras que esto no afecta su actividad de
fijación de la IgG4.
Esto a la luz del análisis Western Blot descrito
en el ejemplo 3 y en la figura 5, cuyas pistas 2, 3 y 4 (ver figura
5, panel A) indican la reducción de la actividad de fijación de las
IgE del suero que tienen los mutantes de la presente invención, que
podrían construirse como mutantes tridimensionales.
En particular, el mutante
Cys29-Cys30 (PjA) presenta una banda de fijación muy
débil (figura 5, pista 2), mientras que el mutante
Cys50-Cys52 (PjB) de alguna manera es todavía capaz
de fijar las IgE (figura 5, pista 3). A diferencia de ello es
todavía más notable el resultado obtenido con los mutantes PjC y PjD
(figura 5, pistas 4 y 5), en los que no se observa fijación de las
IgE humanas.
Tales resultados se han confirmado con ensayos
ELISA y de inhibición de IgE (ver ejemplos 4 y 5), en los que el PjB
es la única variante que todavía es capaz de fijar los anticuerpos
IgE específicos del Parj1 en solución, mientras que los demás
variantes presentan una capacidad de inhibición muy baja. La pérdida
de puentes disulfuro adicionales (PjC y PjD) conduce a la ausencia
de reconocimiento de la IgE (ver ejemplo 4 y figura 4).
Estos resultados indican en conjunto que las
variantes de Parj1 de ns-LTP, que carecen por lo
menos de un puente disulfuro, tienen una alergenicidad reducida,
que está ausente incluso en las variantes en las que el puente que
falta está localizado en la región amino terminal del alergeno, en
el dominio hélice alfa 1-bucle
1-hélice alfa 2, en particular cuando los puentes
que faltan son por lo menos dos.
Que estas variantes mantienen una antigenicidad
general que, a pesar de la alergenicidad reducida o nula, es
comparable o idéntica con la de un alergeno de tipo salvaje, se ha
puesto de manifiesto mediante ensayos en los que se ha comparado la
actividad de fijación del alergeno de tipo salvaje y de sus
variantes sobre anticuerpos distintos de la IgE.
Tales ensayos son Western Blots realizados
empleando como anticuerpos los anticuerpos policlonales de conejo y
las IgG4 de pacientes alérgicos a la Pj, dichos ensayos se
describen con detalle en los ejemplos 6 y 3, respectivamente.
En estos ensayos, las variantes hipoalergénicas
generadas por ingeniería genética presentan un comportamiento
similar al del tipo salvaje, con una baja reducción de su actividad
de fijación con respecto a los anticuerpos de conejo
anti-rParj1.
Por consiguiente, una variante que carezca por lo
menos de un puente disulfuro sigue conteniendo diversos dominios
proteicos similares a los de la molécula nativa y, aunque en grado
diferente, es apta para induce la producción de anticuerpos IgG
(ver ejemplo 3 y 6). La producción de IgE y/o la presentación
mediada por la IgE del alergeno se impediría bloqueando los
anticuerpos y reduciendo la proliferación de células T y la
liberación de citoquinas
(25).
(25).
Los datos anteriores se han confirmado también
"in vivo", en particular con el análisis de punción de
la piel (SPT), descrito en el ejemplo 7, en el que se ensayan
proteínas recombinantes puras de diez pacientes alérgicos a la PJ
(los mismos que se analizan con el ensayo ELISA del ejemplo 4 y la
figura 7).
En lo que respecta a los mutantes individuales,
el PjA presenta una actividad muy baja de fijación de la IgE y
solamente 3 de 10 pacientes con hipersensibilidad cutánea de tipo I
y una zona reducida del habón, por comparación con la inducida por
el alergeno de tipo salvaje. Por el contrario, la pérdida de los
puentes Cys50-Cys91 y Cys4-Cys52
parece tener un efecto menor, porque todavía están presentes la
actividad de fijación de la IgE y el ensayo SPT es positivo. La
pérdida de puentes disulfuro adicionales (PjC y PjD) conduce a la
ausencia de cualquier reacción cutánea (ver ejemplo 7).
Estos resultados obtenidos del análisis de
individuos demuestran la fiabilidad de los datos "in
vitro" descritos antes y sobre todo que la rotura de los
puentes disulfuro de la región terminal amino (en este caso
específico Cys4-Cys52 y
Cys50-Cys91) afecta aunque de forma no marcada la
capacidad de fijación de la IgE humana que tiene este mutante,
mientras que la rotura de los cuatro puentes (en este caso
específico Cys4-Cys52, Cys14-Cys29,
Cys30-Cys75 y Cys50-Cys91) tiene un
efecto devastador en el reconocimiento de la IgE y por lo tanto en
la respuesta alergénica.
Por consiguiente, en lo referente al desarrollo
de moléculas hipoalergénicas de utilidad terapéutica, las variantes
que carecen de tres o cuatro puentes, como en el caso específico de
los mutantes PjC y PjD, se consideran formas preferidas de
ejecución. Lo anterior se demuestra utilizando un conjunto de sueros
así como una cohorte de pacientes individuales, indicando que el
resultado obtenido es representativo de la respuesta inmune de la
población alérgica.
Se ha indicado que, a pesar de haberse obtenido
utilizando variantes específicas derivadas por mutación del alergeno
de tipo salvaje, estos resultados no se limitan de hecho a dichas
variantes específicas, ni a las técnicas empleadas para la
derivación relevante.
Dichos resultados son consecuentes con la
modificación de la estructura tridimensional del alergeno, por tanto
podrían haberse obtenido de cualquier otra manera por cualquier
mutagénesis que permita la rotura de los puentes disulfuro.
Por consiguiente, cualquier variante que pueda
obtenerse por deleción, sustitución y/o inserción de uno o varios
restos aminoácido, que dé como resultado variantes que carentes por
lo menos de un puente disulfuro se incluye en el objeto de la
invención.
Sin embargo, la estrategia de la mutación puntual
tiene la ventaja notable de permitir la inserción de variaciones
mínimas a nivel de la secuencia primaria de la proteína nativa y,
por tanto, de generar mutantes que muy probablemente no
interferirán con el reconocimiento de la variante, realizado por las
células T y sobre todo la posibilidad de generar proteínas que
tengan una gran reproducibilidad.
Las variantes que tienen sustancialmente la misma
longitud que el tipo salvaje se consideran por tanto como
preferidas.
En lo tocante a las técnicas utilizadas para
derivar las variantes de la invención, dichas técnicas no se
limitan a las de la ingeniería genética, ya que son obtenidas por
técnicas tales como la mutagénesis química (formaldehído y
glutaraldehído), que permiten la rotura de los puentes disulfuro,
incluso en ausencia de mutaciones.
Sin embargo, la mutagénesis genética implica la
ventaja notable de permitir la generación de proteínas que tienen
una gran reproducibilidad, mientras que los mutantes químicos no
aseguran un modelo de desnaturalización constante en cada
preparación.
Por otro lado, la estrategia descrita en la
presente es independencia de la secuencia de epítopes en sí misma,
ya que se basa en la modificación de la estructura tridimensional
de los determinantes IgE, la estrategia de mutagénesis adoptada es
actualmente independiente de la secuencia primaria del alergeno (y
por tanto de la secuencia de los epítopes IgE específicos).
Por esta razón se incluyen en el objeto de la
invención las variantes de todas las proteínas con actividad
alergénica que pertenezcan al grupo ns-LTP (incluida
la Parj2), debido a la estructura conservada (véase p.ej. la figura
2, en la que la secuencia Parj1 se presenta por comparación con la
secuencia de otras ns-LTP, junto con la ubicación
de los puentes disulfuro).
En una variante particular de la invención, no es
solo una muteína cualquiera del alergeno Parj1 o de otros alergenos
ns-LTP la que, con independencia de la mutación
efectuada (sustitución y/o deleción de uno o varios restos
aminoácido) y del modo en que se lleva a cabo dicha mutación (p.ej.
mediante las técnicas mencionadas anteriormente), conserva una
estructura equivalente a la del alergeno nativo correspondiente,
carente por lo menos de un puente disulfuro.
La rotura de los puentes disulfuro de los
alergenos ns-LTP es de por sí la base de la
capacidad limitada o nula de fijación de la IgE de los pacientes
alérgicos a las variantes en cuestión.
Por otro lado, en particular a la luz de lo que
ya es conocido en la técnica respecto a la alta conservación de la
estructura y la reactividad cruzada que ha conducido a la selección
de los llamados panalergenos ns-LTP (ver más
arriba), estos datos son indicativos no solamente de la idoneidad
para la terapia y prevención de las formas alérgicas provocadas por
los alergenos correspondientes a las variantes individuales, sino
también para la terapia y prevención de formas alérgicas provocadas
por alergenos ns-LTP distintos a los
correspondientes a las variantes utilizadas.
El experto en la materia podrá derivar sobre la
base de sus conocimientos cualquier información idónea para derivar
usos, composiciones y kit descritos en el resumen de la
invención.
Mediante los ejemplos siguientes se facilita
ahora una descripción más detallada de las formas de ejecución
específicas con el fin de permitir una mejor comprensión de los
objetos, características, ventajas y métodos de trabajo de la
presente invención.
Para la producción del alergeno principal de la
Parietaria judaica Parj1.0102 se utiliza el vector
procariótico pQE30 (Qiagen). Este último expresa de modo
característico las proteínas recombinantes fusionadas con una cola
corta de histidina e inducibles con el
isopropil-\beta-D-tiogalactósido
(IPTG). Los restos histidina permiten la purificación de la
proteína recombinante por cromatografía de afinidad.
Por esta razón se somete a una amplificación de
30 ciclos de reacción den cadena de polimerasa (PCR) 1 ng del clon
P5 que contiene la versión procesada del Parj1.0102 (número de
acceso EMBL: X77414), dicha secuencia se describe en el listado de
secuencias anexo con el nombre de SEQ ID NO: 12, dichos ciclos se
realizan con el programa siguiente: 94ºC durante 1 min, 52ºC durante
1 min, 72ºC durante 1 min. Se utilizan los oligonucleótidos
cebadores sintéticos, el P5 derecho y el P5 inverso, cuyas
secuencias se describen en el listado de secuencias anexo con el
nombre de SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12, respectivamente.
Se fracciona el fragmento así generado a través
de gel de agarosa del 1% en I X TBE, se extrae, se purifica y se
digiere en enzimas de restricción Bam H1 y Hind III y se clona en
el vector pQE30 (Qiagen), previamente digerido con la misma enzima.
Se incuban el vector linealizado y los fragmentos digeridos a 16ºC
durante 4 horas en presencia de la enzima DNA ligasa con arreglo a
diferentes proporciones estequiométricas. A continuación se
transforma la mezcla de reacción en la cepa bacteriana M15. Se
secuencias los clones recombinantes por el método de Sanger y la
secuencia de nucleótido así determina demuestra que el fragmento de
DNA insertado en el vector pQE30 es idéntico al ya conocido de la
técnica (10).
Se genera el mutante PjA (Cys29\rightarrowSer y
Cys30\rightarrowSer) utilizando el kit llamado Transforme
Site-Directed Mutagenesis Kit (Clontech) siguiendo
las instrucciones del fabricante y utilizando el oligonucleótido P5
(29, 30), descrito en el listado de secuencias con el nombre SEQ ID
NO: 13 (mapeo del nucleótido 88 al nucleótido 105) y la secuencia
del Parj1 como molde. El mutante PjB (Cys50\rightarrowSer y
Cys52\rightarrowSer) se genera por PCR utilizando como moldes el
nucleótido P5 (50-52) descrito en el listado de
secuencias con el nombre SEQ ID NO: 14 (mapeo desde el nucleótido 91
hasta el nucleótido 165) y el nucleótido P5 inverso y 1 ng de clon
Parj como molde. Se digiere el fragmento PCR con enzimas de
restricción Pst I y Hind III y se liga con el vector plásmido
linealizado Pst I-Hind III que contiene la secuencia
de Parj1 (que expresa los primeros 31 aminoácidos del alergeno
Parj1.0102 de tipo salvaje). Se genera el mutante PjC
(Cys4\rightarrowSer, Cys29\rightarrowSer y
Cys30\rightarrowSer) por amplificación mediante PCR empleando la
variante PjA como molde. El resto cisteína de la posición 4 se muta
por PCR empleando los oligonucleótidos P5 (triple), cuya secuencia
se describe con el nombre SEQ ID NO: 15, y P5 inverso.
Después de la purificación se digiere el
fragmento PCR con enzimas Bam HI y Hind III y se clona en el vector
pQE30 digerido previamente con las mismas enzimas de restricción.
Se genera el mutante PjD (Cys29\rightarrowSer,
Cys30\rightarrowSer, Cys50\rightarrowSer y
Cys52\rightarrowSer) utilizando el kit llamado Transformer
Site-Directed Mutagenesis Kit (Clontech), siguiendo
las instrucciones del fabricante y utilizando el oligonucleótido
sintético P5 (29,30), descrito en el listado de secuencias con el
nombre de SEQ ID NO: 13 y la variante PjB como molde. Todos los
clones se secuencian por el método de Sanger (24) y se confirman
las mutaciones y los marcos de lectura abiertos (ver figura 3 para
más detalle).
Con este proceso se aíslan 4 mutantes
independientes, denominados a continuación PjA (SEQ ID NO: 3 y SEQ
ID NO: 4); PjB (SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6); PjC (SEQ ID NO: 7 y
SEQ ID NO: 8); y PjD (SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10).
Se utilizan 10 ml de cultivo O/N de clones
recombinantes (cepa NM15, Qiagen) para la inoculación en 400 ml de
caldo 2YT (Bacto-tryptone 6 g/l,
Bacto-levadura 10 g/l, NaCl 5 g/l, pH 7,0) que
contiene ampicilina y canamicina, en una concentración final de 100
\mug/ml y 10 \mug/ml, respectivamente.
Se cultiva una solución 1:40 a 37ºC durante 1
hora y, después de este tiempo, se induce con
isopropiltio-\beta-galactósico 1
mM a 37ºC durante 4 horas. Se recolectan las células por
centrifugación y se purifican las proteínas recombinantes
utilizando el kit llamado His Trap (Pharmacia), siguiendo las
instrucciones del fabricante. Las proteínas recombinantes, que se
fijan en la columna quelante HiTrap, se eluyen utilizando un tampón
que contiene: tampón fosfato 20 mM de pH 7,4, NaCl 0,5 M, urea 8 M
e imidazol 500 mM; se analizan las fracciones por electroforesis
16% SDS-PAGE y tinción con azul Coomassie Brilliant
Blue. A continuación se diluyen las fracciones que contienen la
proteína purificada en proporción 1:100 en un tampón que contiene
tampón fosfato 20 mM, pH 7,4, NaCl 0,5 M e imidazol 500 mM. Después
se desalinizan las proteínas recombinantes empleando un dispositivo
filtrante centrífugo (Centriprep, Millipore) y se analiza su
capacidad de fijación de la IgE humana en paciente alérgicos a la Pj
por el análisis Western Blot, ya descrito antes (12), empleando un
conjunto de sueros (n = 30) de pacientes alérgicos a la Pj y que no
han recibido inmunoterapia específica alguna.
Este análisis pone de manifiesto que el mutante
PjB continúa siendo capaz de fijar la IgE humana, mientras que el
mutante PjA conserva únicamente una débil actividad de fijación de
la IgE. Los mutantes PjC y PjD no muestran actividad alguna de
fijación de la IgE, sugiriendo que el reconocimiento de la IgE
depende del pliegue tridimensional de la proteína (figura 4, panel
A).
Después de ello se despojan las membranas y se
someten de nuevo a prueba con reactivo específico de
His-tag (INDIA™ Hisprobe-HRP,
Pierce, EE.UU.) para verificar que el complejo
IgE-alergeno era específico de las proteínas
fusionadas recombinantes. Se determina la concentración de las
proteínas recombinantes por análisis densitométrico de los geles
SDS-PAGE teñidos con azul Coomassie Brilliant Blue
(ver figura 4, panel B).
Como confirmación de este ensayo se realiza otro
Western Blot empleando IgE e IgG4 de pacientes alérgicos.
Las proteínas purificadas se fraccionan en
SDS-PAGE del 16% y se transfieren a tanques de
nitrocelulosa de un sistema Dry-blot (Millipore). Se
incuba la membrana durante 12-14 horas con un
conjunto de sueros de pacientes alérgicos a la Pj (dilución 1:5) en
PBS-Tween. Se detectan los complejos de unión de
proteína-IgE e IgG4 humanas empleando
respectivamente un anticuerpo anti-IgE y
anti-IgG4 conjugados con peroxidasa de rábano
rusticano. Seguidamente se detectan los complejos empleando un
sistema de quimioluminiscencia (Super-signal,
Pierce). Los resultados relevantes se recogen en la figura 4.
El mismo conjunto de sueros alérgicos de
pacientes alérgicos no sensibles a la Pj empleado en el ejemplo 3
se utiliza ahora en el ensayo ELISA, para poner de manifiesto la
actividad de fijación de la IgE que tiene el rParj1 y sus variantes
con enlace disulfuro. Como control negativo del ELISA se realiza el
ensayo en un sujeto no alérgico.
Los resultados confirman los modelos de reacción
del ensayo del ejemplo 3 (figura 4, panel A) con la reacción de la
variante PjB de modo similar al alergeno de tipo salvaje. Se
representa un suero no alérgico como control negativo (figura
6).
La actividad de fijación de la IgE de las cuatro
variantes del Parj1 con enlaces disulfuro se comprueba también con
un ensayo ELISA utilizando sueros de diez pacientes alérgicos a la
Pj y monosensitivos. Los análisis de los sueros individuales ponen
de manifiesto una homogeneidad notable en la reacción. En
particular, los puentes Cys4-Cys52 y
Cys50-Cys91 no influyen en la alergenicidad de la
proteína, ya que este mutante (el PjB) presenta una actividad de
fijación de la IgE comparable a la del alergeno de tipo salvaje.
Por otro lado, los puentes Cys14-Cys29 y
Cys30-Cys75 parecen ser cruciales con vistas al
reconocimiento de la IgE. Todas las variantes que carecen de estos
dos enlaces (PjA, PjC y PjD) presentan una actividad de fijación de
la IgE baja o nula (figura 7).
La detección ELISA se lleva a cabo añadiendo 200
\mul de una solución que contiene 5 \mug/ml de antígeno en el
tampón de recubrimiento (tampón carbonato sódico, pH 9,5) a cada
hoyo de las placas de poliestireno, a temperatura ambiente durante
una noche. Después de varios pasos de lavado (1XPBS, 0,1% de Tween
20) se saturan las placas con una solución que contiene un 5% de
BSA, un 0,5% de Tween 20 en el tampón de recubrimiento. Después del
lavado se incuban a temperatura ambiente durante 4 horas 200 \mul
de suero (dilución 1:5) de pacientes alérgicos a la Pj o de un
sujeto no alérgico. Se detectan los anticuerpos IgE fijados con un
conjugado IgE-HRP de cabra
anti-humano (Biosource International), diluido en un
concentración de 0,5 ng/ml en 1XPBS, 0,25% de BSA, 0,1% de Tween
20, a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de varios
lavados se revela la reacción colorimétrica añadiendo 0,2 ml de
solución sustrato a cada hoyo (0,4 ml/ml de
o-fenilendiamina en tampón citrato 0,1 M). Se lee
la densidad óptica a 495 nm en un lector de microplacas
BIO-RAD.
Con el fin de investigar si las variantes con
enlace disulfuro son capaces de inhibir la fijación de la IgE sobre
el rParj1 se incuba una cantidad creciente de cada mutante
recombinante con un conjunto de sueros (n = 10) de pacientes
alérgicos monosensibles a la Pj.
La capacidad de las variantes disulfuro Parj1 de
interaccionar con los anticuerpos IgE se determina mediante un
ensayo de inhibición ELISA. Se preincuba durante una noche un
conjunto de sueros (dilución 1:5) de diez pacientes alérgicos a la
Pj y monosensitivos con una concentración creciente de cada
variante de enlace disulfuro (0,25-0,20 \mug/ml de
proteína). Se añaden las soluciones a los hoyos ELISA recubiertos
con 5 mg/ml de rParj1 y se llevan a cabo los pasos ELISA del modo
descrito antes. Se calcula el porcentaje de inhibición según la
fórmula % = 100-OD_{A}/OD_{B} X100, en la que
OD_{A} y OD_{B} significan la densidad óptica leída en el
conjunto de sueros inhibidos y no inhibidos, respectivamente.
Los resultados se recogen en la siguiente tabla
I.
\vskip1.000000\baselineskip
proteína ensayada | % de inhibición |
rParj1 | 95% |
PjA | 16% |
PjB | 85% |
PjC | 14% |
PjD | 15% |
Los datos recogidos en la tabla I sugieren que
todas las variantes carentes por lo menos de los enlaces disulfuro
Cys14-Cys29 y Cys30-Cys75 presentan
un nivel bajo similar de inhibición (en torno al 15%). Por el
contrario, la variante PjB (Cys50\rightarrowSer y
Cys52\rightarrowSer) presenta un porcentaje elevado de
inhibición, conservando una capacidad sustancial de fijar la IgE
humana (aprox. un 85%).
Se inmunizan los ratones en la empresa PRIMM srl
(Milán, Italia) empleando el alergeno rParj1. Como control se
analizan anticuerpos policlonales de conejo en un ensayo Western
Blot empleando extracto en bruto de Parietaria judaica,
detectando una banda en torno a 14.000 Da correspondiente al peso
molecular de la Parj1 nativa. Se recubren las placas ELISA en las
mismas condiciones que se han descrito anteriormente, con el Parj1
de tipo salvaje y con la misma cantidad de cada una de las
variantes recombinantes de enlace disulfuro y se realizan los
ensayos con suero policlonal específico anti-rParj1
para analizar sus actividades de fijación.
Se diluyen los sueros de conejo
pre-inmune e inmune a una concentración de 6 ng/ml
y se incuban 200 \mul de estas soluciones a temperatura ambiente
durante 1 hora. Se lavan los hoyos tres veces con 1XPBS, 0,1% de
Tween 20 y se detectan los anticuerpos fijados empleando un
HRP-Ig fijado de asno anti-conejo
(Amersham) en una dilución 1:1000. La reacción colorimétrica y la
medición de la densidad óptica se realizan del modo descrito
anteriormente.
Los datos obtenidos sugieren que las variantes
PjA, PjB y PjC tienen un comportamiento similar, mostrando una
ligera reducción de su capacidad de fijación (en torno al 10%), si
se compara con la fijación del Parj1. La variante PjD tiene una
actividad de fijación reducida (en torno al 20%), mientras que el
suero pre-inmune no presenta reactividad alguna con
las proteínas (figura 8).
En este estudio se analizan diez pacientes con un
claro historial de alergia a la Parietaria judaica y que
presentan monosensibilidad en ensayo de punción cutánea (SPT) al
extracto comercial de la Pj. Ninguno de los pacientes recibe
inmunoterapia contra el polen de Pj ni tampoco tratamiento de
glucorticosteroides. Los alergenos se utilizan en una concentración
de 1 \mug/ml, diluidos en NaCl del 0,9%. Se introducen unos 20
\mul de la solución a ensayar en los antebrazos de los pacientes,
a una distancia de más de 2,5 cm entre cada punción. Todos los
ensayos se realizan por duplicado. Se emplea histamina como control
positivo y una solución de NaCl al 0,9% como control negativo. Se
miden las reacciones al cabo de 20 min. Por comparación con la
superficie del habón generada por la histamina (100%), las SPT
positivas se dividen en tres clases: 4+ son las STP cuya área es
\geq 100% de la superficie inducida por la histamina; 3+ son las
STP con una superficie \geq 80-100% y 2+ son las
SPT con una superficie \geq 50-80%. Como controles
negativos se someten al ensayo dos pacientes no alérgicos (P.C. y
D.G.). Los investigadores informan a los pacientes y firman un
documento en el que dan el consentimiento antes del ensayo.
Todos los pacientes muestran una reacción cutánea
positiva al alergeno rParj1. El PjB es capaz de inducir
hipersensibilidad inmediata de tipo I en 9 de los 10 pacientes
sometidos al ensayo. El PjA da una reacción positiva en 3 de los 10
pacientes y las superficies de los habones provocados por la punción
se reducen en tamaño con respecto a los provocados por el alergeno
de tipo salvaje. El PjC y el PjD no dan ninguna reacción en el
ensayo SPT. No se observan reacciones en los sujetos no alérgicos
sometidos al ensayo, tal como se indica en la siguiente tabla
II.
\vskip1.000000\baselineskip
paciente nº | rParj1 | PjA | PjB | PjC | PjD |
1 | ++++ | - | - | - | - |
2 | +++ | ++ | +++ | - | - |
3 | ++++ | - | +++ | - | - |
4 | ++++ | - | ++++ | - | - |
5 | ++++ | ++ | +++ | - | - |
6 | ++++ | - | +++ | - | - |
7 | ++++ | - | ++++ | - | - |
8 | ++++ | ++ | +++ | - | - |
9 | +++ | - | ++ | - | - |
10 | +++ | - | ++ | - | - |
P.C. | - | - | - | - | - |
D.G. | - | - | - | - | - |
\newpage
1. Menegozzo, M., D. Geraci, and A.
Ruffilli, Isolation and characterization of an allergenic
fraction from Parietaria officinalis pollen.
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<110> Consiglio Nazionale delle
Ricerche
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<120> Variantes de alergeno de
ns-LTP, usos de las mismas y composiciones que las
contienen
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<130> BX1575R
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<160> 15
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<170> PatentIn version 3.1
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<210> 1
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<211> 420
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Parj.0102 de tipo salvaje, maduro
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(420)
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<223>
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 139
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Parj1.0102 de tipo salvaje,
maduro
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 420
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Variante PjA del Parj1
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(420)
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<223> Secuencia que codifica al mutante de
la proteína Parj1 por sustitución de la Cys 29 y 30 por Ser
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 139
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<212> PRT
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<213> Seuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>Variante PjA del Parj1
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 420
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223>Variante PjB del Parj1
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(420)
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<223> Secuencia que codifica al mutante de
la proteína Parj1 por sustitución Cys 50 y 52 por Ser
\newpage
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 139
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Variante PjB del Parj1
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 420
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223>Variante PjC del Parj1
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1) .. (420)
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<223>Secuencia que codifica al mutante de
Parj1 por sustitución de la Cys 4, 29 y 30 por Ser
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<400> 7
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<210> 8
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223>Variante PjC del Parj1
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<223> Variante PjD del Parj1
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<222> (1)..(420)
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<223> Secuencia que codifica al mutante de
Parj1 por sustitución de la Cys 29, 30, 50 y 52 por Ser
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<400> 9
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<213> Secuencia artificial
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<223> Variante PjD del Parj1
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<210> 11
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<211> 30
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Claims (28)
1. Una variante de un alergeno perteneciente al
grupo de las proteínas ns-LTP, dicha variante
conserva la mayor parte de la secuencia de aminoácidos del alergeno
de tipo salvaje, dicha variante carece por lo menos de uno de los
cuatro puentes disulfuro que constituyen la estructura de dicho
alergeno y muestra una capacidad reducida de fijación de la IgE, al
tiempo que mantiene la capacidad de inducir respuesta de la
IgG.
2. La variante según la reivindicación 1, dicha
variante carece por lo menos de un puente disulfuro en la región
terminal amino de dicho alergeno.
3. La variante según la reivindicación 1 ó 2,
dicha variante carece de dos de dichos puentes disulfuro que
constituyen la estructura de dicho alergeno.
4. La variante según la reivindicación 1, dicha
variante carece de tres o cuatro de dichos puentes disulfuro que
constituyen la estructura de dicho alergeno.
5. La variante según una cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 4, dicha variante es una muteína en la que
se ha suprimido por lo menos una de las cisteínas que constituyen
dichos puentes disulfuro.
6. La variante según una cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 5, dicha variante es una muteína en la que
se ha sustituido por lo menos una de las cisteínas que constituyen
dichos puentes disulfuro por un resto aminoácido que no es capaz de
formar puentes disulfuro.
7. La variante según la reivindicación 6, en la
que dicho resto aminoácido es la serina o la alanina.
8. La variante según una cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 7, en la que dicho alergeno es uno de los
alergenos principales de la Parietaria judaica.
9. La variante según la reivindicación 8, en la
que dicho alergeno es el Parj1 y dichas cisteínas que constituyen
los puentes disulfuro son las cisteínas 4, 14, 29, 30, 50, 52, 75 y
91.
10. La variante según la reivindicación 9, en la
que la secuencia de dicha variante consta de una secuencia elegida
entre el grupo formado por las secuencias descritas en el listado
de secuencias con los nombres SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID
NO: 5 y SEQ ID NO: 7.
11. La variante según una cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 10 para el uso de medicamento o de agente
diagnóstico.
12. La variante según la reivindicación 11 para
el uso en un tratamiento adaptado a un cliente y/o en la prevención
de una forma alérgica asociada con un alergeno perteneciente al
grupo de las proteínas ns-LTP.
13. La variante según la reivindicación 12, que
es una variante de un alergeno principal de la Parietaria
judaica y en el que la forma alérgica está asociada con un
alergeno de la Parietaria judaica.
14. La variante según las reivindicaciones 12 ó
13 para el uso en el tratamiento de la picazón, el eritema, el
edema, el habón, la formación de sarpullido (urticaria), la
rino-conjuntivitis (alergias de temporada), la
broncoconstricción, el asma y la anafilaxis.
15. La variante según las reivindicaciones de 11
a 14 para el uso en la inmunoterapia preventiva específica.
16. La variante según la reivindicación 11 para
el uso como agente de diagnóstico en el diagnóstico adaptado a un
cliente para determinar formas alérgicas.
17. Un polinucleótido que codifica a la variante
según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 11.
18. El polinucleótido según la reivindicación 17,
en el que dicha secuencia de dicha variante contiene una secuencia
elegida entre el grupo formado por las secuencias descritas en el
listado de secuencias con los nombres de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:
4, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8.
19. Un vector que contiene por lo menos un
polinucleótido según la reivindicación 17 ó 18.
20. El uso de una variante según una cualquiera
de las reivindicaciones de 1 a 11, para la fabricación de un
medicamento para el tratamiento y/o prevención de una forma
alérgica asociada con un alergeno perteneciente al grupo de las
proteínas ns-LTP.
21. El uso según la reivindicación 20, en el que
dicho alergeno perteneciente al grupo de las proteínas
ns-LTP es el alergeno correspondiente a dicha
variante.
22. El uso según la reivindicación 20 ó 21, en el
que dicho alergeno es un alergeno principal de la Parietaria
judaica y dicha forma alérgica asociada con dicho alergeno es
una forma alérgica de la Parietaria judaica.
23. Una composición farmacéutica que contiene por
lo menos una variante según una cualquiera de las reivindicaciones
de 1 a 11 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
24. Una composición farmacéutica que contiene por
lo menos un polinucleótido según la reivindicación 17 ó 18 y/o un
vector según la reivindicación 19 y un excipiente farmacéuticamente
aceptable.
25. Un agente de diagnóstico que contiene por lo
menos una variante según una cualquiera de las reivindicaciones de 1
a 11 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
26. Un kit para la derivación de un alergograma
adaptado a un sujeto de una forma alérgica asociada con un alergeno
de ns-LTP, que consta de
- una primera composición que contiene dicho
alergeno ns-LTP en forma nativa junto con un
excipiente aceptable;
- por lo menos una composición que contenga una
variante individual de dicho alergeno ns-LTP según
una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 11 y un excipiente
aceptable;
dicho alergograma puede derivarse de la puesta en
contacto de dichas composiciones con inmunoglobulinas de dicho
sujeto y de la observación de los efectos obtenidos de este
modo.
27. El kit según la reivindicación 26, que
contiene dicha primera composición y un número de composiciones,
cada una de las cuales contiene una variante individual de dicho
alergeno de ns-LTP, igual al número de las variantes
de dicho alergeno de ns-LTP.
28. El kit según la reivindicación 26 ó 27, en el
que dicho alergeno de ns-LTP es el Parj1.
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