ES2239162T3 - Variantes de antigeno ns-ltp de parietaria judaica, usos de las mismas y composiciones que las contienen. - Google Patents

Variantes de antigeno ns-ltp de parietaria judaica, usos de las mismas y composiciones que las contienen.

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ES2239162T3 ES01972467T ES01972467T ES2239162T3 ES 2239162 T3 ES2239162 T3 ES 2239162T3 ES 01972467 T ES01972467 T ES 01972467T ES 01972467 T ES01972467 T ES 01972467T ES 2239162 T3 ES2239162 T3 ES 2239162T3
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Giovanni Duro
Vincenzo Izzo
Maria Assunta Costa
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Abstract

Una variante de un alergeno perteneciente al grupo de las proteínas ns-LTP, dicha variante conserva la mayor parte de la secuencia de aminoácidos del alergeno de tipo salvaje, dicha variante carece por lo menos de uno de los cuatro puentes disulfuro que constituyen la estructura de dicho alergeno y muestra una capacidad reducida de fijación de la IgE, al tiempo que mantiene la capacidad de inducir respuesta de la IgG.

Description

Variantes de antígeno ns-LTP de Parietaria judaica, usos de las mismas y composiciones que las contienen.
Ámbito de la invención
La presente invención se refiere a los ámbitos de la prevención y el tratamiento de síntomas alérgicos asociados con alergenos pertenecientes al grupo de las proteínas de transferencia lípida no específica (ns-LTP = non specific Lipid Transfer Protein).
Estado de la técnica
Las proteínas ns-LTP están formadas por moléculas proteicas pequeñas, de aproximadamente 10 kDa, que poseen una gran estabilidad y están presentes de forma natural en todos los organismos vegetales estudiados hasta fechas recientes. En diversas especies se han identificado también como alergenos, tal es el caso de las rosáceas, prunoideas (melocotón, albaricoque, ciruela) y pomoideas (manzana) y gramináceas así como en las urticáceas del tipo Parietaria judaica (español = hierba de los muros) (18-23).
Estas proteínas se caracterizan por su capacidad de transportar lípidos a través de membranas "in vitro", una capacidad que justifica su denominación y corresponde por lo menos a algunas de las actividades que desempeñan "in vivo" (17).
Sin embargo, a pesar de las diferentes funciones y de la heterogeneidad de sus secuencias, las ns-LTP tienen una estructura secundaria muy conservada, que consta de hélices alfa (separadas por bucles) y una capa beta plegada, dispuesta en la dirección 5'-3' con arreglo a un modelo \alpha-\alpha-\alpha-\alpha-\beta.
Esta estructura está dotada de la presencia de cuatro puentes (enlaces) bisulfuro, formados por ocho restos cisteína que están presentes en las 4 hélices alfa del cuarto bucle, en la capa beta plegada y en la región terminal amino (véase referencia 29).
En particular:
- un primer puente disulfuro conecta la región terminal amino con la tercera hélice alfa,
- un segundo puente disulfuro conecta la primera hélice alfa con la tercera hélice alfa,
- un tercer puente disulfuro conecta la segunda hélice alfa con el cuatro bucle y
- un cuarto puente disulfuro conecta la tercera hélice alfa con la capa beta plegada.
Estos restos cisteína están muy conservados en todas las ns-LTP y respecto a ello puede derivarse una secuencia de consenso (17).
A pesar de su gran conservación, debida a la heterogeneidad de secuencia de las ns-LTP, no existe un sistema de notación de los restos que forman puentes disulfuro que sea válida para todas las ns-LTP, esto no impide que los expertos
en la materia puedan escoger con facilidad tales cisteínas basándose en los conocimientos del estado de la técnica.
Con referencia especial a la proteína Parj1 y de modo específico a la forma madura Parj1.0102, las cisteínas aptas para formar puentes disulfuro son los restos 4, 14, 29, 30, 50, 52, 75 y 91 y los puentes en cuestión están dispuestos en el orden Cys4-Cys52 (primer puente), Cys14-Cys29 (segundo puente), Cys30-Cys75 (tercer puente) y Cys50-Cys91 (cuarto puente) (12).
La Parj1, además de ser una ns-LTP, representa junto con la Parj2, uno de los principales alergenos de la Parietaria judaica (PJ), una planta cuyo polen constituye uno de los antígenos ambientales más propagados, en especial en la región mediterránea (1).
De hecho, el polen de la Parietaria judaica contiene por lo menos nueve alergenos, cuyos pesos moleculares se sitúan entre 10 y 80 kDa, provistos de diferentes capacidades de fijación de la IgE [1-9].
Entre ellas, la Parj1, en las dos isoformas Parj1.1.2 y Paj1.0201, aisladas de genes independientes (10) y la Parj2 adquieren una relevancia remarcable como alergenos principales. Estas dos ns-LTP son capaces en particular de inhibir la mayor parte de IgE específicas contra los alergenos de Parietaria y una vez administradas presentan ambas el comportamiento inmunológico similar en todo al de los extractos comerciales que se utilizan habitualmente (11).
Sin embargo, la Parj1 y la Parj2, no son las únicas ns-LTP que poseen propiedades alergénicas. Recientemente se ha publicado algunos artículos científicos, en los que se describe la caracterización de nuevas moléculas alergénicas homólogas de las ns-LTP (18-23).
A pesar de la heterogeneidad de secuencia, a raíz de los ensayos de reactividad cruzada entre los diferentes alergenos ns-LTP y los anticuerpos producidos por ellos se ha demostrado que las ns-LTP constituyen un amplio grupo de alergenos (panalergenos), tal como se ha descrito ya para la profilina (19).
Sin embargo, a diferencia de la abundante información sobre la estructura de este "panalergeno" no se dispone de información exhaustiva sobre la localización de los epítopes de la IgE ni de la IgG, tampoco sobre los alergenos ns-LTP individuales (incluidas las Parj1 y Parj2) (11, 12).
Como resultado del mecanismo al que se atribuye el desarrollo de la respuesta alérgica y del rol verificado que tienen la IgG y la IgE en él, la derivación de tal mapa sería de una importancia enorme para plantear una nueva estrategia terapéutica de estas formas alérgicas (13).
En particular, la derivación de moléculas con reducción o incluso ausencia de capacidad de fijación de la IgE, pero todavía con la capacidad concomitante de inducir respuesta a la IgG y en particular a la IgG4, se convertiría en un hito importante tanto desde el punto de vista terapéutico como preventivo.
Tal molécula permitiría la inmunosupresión de la respuesta de la célula T, con reducción o incluso ausencia de efectos secundarios.
De hecho, actualmente la terapia de una alergia en curso consiste en la curación meramente farmacológica de la sintomatología alérgica.
La terapia preventiva, consistente en una inmunoterapia específica (SIT), se realiza actualmente mediante la administración subcutánea de cantidades diluidas de alergeno al paciente, con el fin de suprimir la reacción específica a dicho alergeno.
La mayoría de los extractos proteínicos comerciales utilizados para ellos son extractos en bruto de diferentes tipos, mezclas de diversos componentes, en las que resulta difícil una estandarización precisa del componente alergénico.
Por lo tanto, la estrategia SIT contempla la administración de componentes alergénicos a los que el paciente no sea sensible, induciendo la secreción de IgE específicas con respecto a los demás componentes del extracto. Por otro lado, la administración del alergeno total incluye la posibilidad de efectos secundarios que, a pesar de su aparición extremadamente baja, pueden provocar incluso un choque anafiláctico.
Con respecto en especial a la Parietaria judaica, los estudios epidemiológicos han puesto de manifiesto además una distribución diferentes de los dos alergenos principales en la población humana (12 millones de sujetos afectados en la región mediterránea), en los que aproximadamente el 20% de los pacientes alérgicos a la PJ no muestran la presencia concomitante de la IgE específica contra ambos alergenos. Por consiguiente, la administración de extractos en bruto, total o parcialmente purificados, podría convertirse en la administración de alergenos principales a los que el paciente no es alérgico.
Por lo tanto, el uso de moléculas recombinantes, que permitan un diagnóstico y una terapia centrados en el cliente, constituiría una alternativa válida al uso tradicional de extractos en bruto.
En particular, la caracterización y el desarrollo de moléculas alternativas de efectos secundarios menores, es decir, que tengan una interacción reducida o nula con la IgE al tiempo que mantienen la capacidad de fijar las IgG (en particular la IgG4) con respecto al tipo salvaje y, por ello, la capacidad de inmunosuprimir la respuesta T, permitiría llevar a cabo una estrategia alternativa para superar los inconvenientes inherentes a la estrategia tradicional.
Tales moléculas alternativas, de menor capacidad anafiláctica, se buscan de hecho produciendo extractos en bruto polimerizados con formaldehído o glutaraldehído (16).
Aunque efectivas, como se demuestra en ensayos clínicos, estas moléculas modificadas han puesto de manifiesto que presentan sin embargo el inconveniente ya mencionado antes de la difícil estandarización de los extractos.
Después de la llegada de la ingeniería genética se han derivado en forma pura tanto los alergenos recombinantes, inmunológicamente similares a los alergenos nativos (14 y 15) y los alergenos recombinantes que tienen una actividad alergénica reducida con respecto a los alergenos de tipo salvaje (por consiguiente, son terapéuticamente idóneos como sustitutos de los últimos).
Sin embargo, ninguno de tales mutantes se ha derivado con referencia particular a los alergenos ns-LTP.
Resumen de la invención
Un objeto de la presente invención es una variante de un alergeno perteneciente al grupo de las proteínas ns-LTP, en específico una variante hipoalergénica de un alergeno completo o un fragmento del mismo del grupo de las proteínas ns-LTP.
Un objeto particular de la invención es una variante de un alergeno perteneciente al grupo de las ns-LTP que carezca por lo menos de uno de los cuatro puentes disulfuro que constituyen la estructura de dicho alergeno.
La primera ventaja de la variante de la presente invención consiste en que, con respecto al alergeno nativo, tiene una capacidad reducida o incluso nula de fijación de la IgE, conservando de modo concomitante una capacidad intacta de fijación de IgG en dichos sujetos.
Esta capacidad diferencial de fijación se amplía en particular en las variantes, en las que tal puente ausente se localiza en la región amino terminal del alergeno, en el dominio hélice alfa 1- bucle 1- hélice alfa 2, ya que tienen una actividad particularmente reducida de fijación de la IgE, en especial en las variantes que carecen por lo menos de dos puentes disulfuro.
En el caso de una variante que carezca de tres o de los cuatro puentes disulfuro del alergeno nativo, la actividad relevante de fijación de la IgE se reducen sustancialmente hasta llegar a ser sustancialmente nula. Tal variante constituye, por tanto, una forma preferida de ejecución de la invención.
La importancia de tal capacidad diferencial de fijación de la variante de la invención estriba en que, con arreglo al rol de las dos inmunoglobulinas en el mecanismo molecular de la respuesta alérgica, evidenciada en el párrafo anterior, se pone de manifiesto moléculas que, a pesar de ser inmunogénicas, tienen una alergenicidad reducida o nula.
Las variantes de la invención que mantienen principalmente la mayor parte de la secuencia de aminoácidos del alergeno de tipo salvaje y, por consiguiente, tienen sustancialmente la misma longitud que dicho alergeno, constituyen en este contexto una forma preferida de ejecución de la invención.
Son preferidas en particular las variantes que consisten en una muteína, en la que se ha borrado por lo menos uno de dichos puentes disulfuro constitutivos de las cisteínas, o se ha sustituido por un resto aminoácido que no es capaz de formar un puente disulfuro.
En este último caso se ha probado como particularmente eficaz la sustitución del resto cisteína por serina o alanina como aminoácido, que se ha mostrado compatible con la estructura \alpha-\alpha-\alpha-\alpha-\beta de las ns-LTP.
Es preferida en particular la forma de ejecución referida a las variantes de los alergenos principales de la Parietaria judaica.
Son especialmente relevantes en particular las variantes Parj1, específicamente las muteínas Parj1 en las que los restos borrados o sustituidos son las cisteínas 4, 14, 29, 30, 50, 52, 75 y 91 y en particular las variantes que tiene una secuencia elegida entre el grupo formado por las secuencias descritas en el listado de secuencias con el nombre de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 10.
Es también objeto de la invención un polinucleótido que codifica las variantes de la presente invención, en particular las muteínas recién nombradas, y específicamente polinucleótidos que contienen una secuencia elegida entre el grupo formado por las secuencias descritas en el listado de secuencias con el nombre de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 así como los vectores que los contienen.
A la luz de lo dicho anteriormente son también objeto de la presente invención todas las variantes mencionadas antes para el uso como medicamento o como agente de diagnóstico y, en particular, para el uso en el tratamiento y/o la prevención y/o el diagnóstico de la forma alérgica asociada con un alergeno perteneciente al grupo de las proteínas ns-LTP (esto a la luz de la característica panalergénica verificada en los alergenos ns-LTP), en particular el alergeno correspondiente a dicha variante.
En el caso específico, descrito en la presente mediante un ejemplo, de alergenos principales de la Parietaria judaica que despliegan una capacidad dispar de estimular la producción de la IgE en el suero de pacientes alérgicos, puede llevarse a cabo un diagnóstico específico del alergeno individual utilizando las variantes de la invención, p.ej. del modo siguiente: inicialmente se utiliza la versión recombinante de cada molécula nativa (Parj1 y Parj2) para el diagnóstico específico de la alergia mediante un ensayo de punción de la piel. En los pacientes sensibles a uno de los dos alergenos puede analizarse seguidamente si son positivos a las variantes de alergeno individual al que han dado resultados positivos en el ensayo, con el fin de desvelar las variantes de ensayo negativas. A continuación pueden administrarse tales variantes en sustitución de los extractos comerciales de proteínas, desarrollando una inmunoterapia específica del alergeno. Los expertos en la materia podrán derivar otros modos de uso con fines diagnósticos y terapéuticos a la luz de los conocimientos del estado de la técnica.
Es también objeto de la invención una composición farmacéutica que contiene una cantidad terapéuticamente eficaz por lo menos de una de las variantes, o un polinucleótido o un vector entre los ya mencionados, y un excipiente farmacéuticamente aceptable, así como todas las composiciones materiales que contienen por lo menos una de las moléculas mencionadas anteriormente y un excipiente químicamente compatible con las mismas.
Este excipiente farmacéutica y/o químicamente aceptable puede ser cualquier excipiente conocido de la técnica como idóneo para composiciones farmacéuticas o materiales que contenga moléculas similares a las ya mencionadas antes, por lo tanto y en particular los péptidos y conjugados y/u oligonucleótidos en cualquier forma, en particular en forma sólida y en forma líquida; un ejemplo de composición en forma líquida se proporciona mediante composiciones cuyo excipiente es agua, soluciones salinas del tipo, p.ej. soluciones que contienen NaCl y/o fosfato u otras soluciones que contienen moléculas tampón.
Otro objeto más de la presente invención es un kit para la derivación de un alergograma correspondiente al sujeto para una forma alérgica asociada con un alergeno ns-LTP que consta de:
- una primera composición que contiene dicho alergeno ns-LTP en forma nativa junto con un excipiente química y/o farmacéuticamente aceptable;
- por lo menos una composición que contenga una variante individual de dicho alergeno ns-LTP ya descrita antes y un excipiente química y/o farmacéuticamente aceptable;
dicho alergograma puede derivarse de la puesta en contacto de dichas composiciones con inmunoglobulinas de dicho sujeto y de la observación de los efectos obtenidos de este modo.
Son preferidas en particular las formas de ejecución en las que el kit contiene, además de la primera composición ya mencionada, un número de composiciones, cada una de las cuales contiene una variante individual de dicho alergeno ns-LTP, igual al número de variantes de dicho alergeno ns-LTP y en el que dicho alergeno es un alergeno de Parietaria judaica, específicamente el Parj1 (en cualquiera de sus formas) o el Parj2 (en cualquiera de sus formas).
Tales composiciones pueden ponerse en contacto en particular con inmunoglobulinas en un "ensayo de punción de la piel" "in vivo" o en tejidos del paciente p.ej. la sangre "in vitro". Los expertos en la materia podrán derivar otros modos de empleo del kit de la presente invención con finalidades de diagnóstico a la luz del conocimiento del estado de la técnica. La invención se describe mejor mediante las figuras adjuntas.
Descripción de las figuras
En la figura 1 se representan las secuencias de aminoácidos del Parj1.0102 y del Parj2.0101 en paralelo, indicando la estructura tridimensional de las mismas. La notación de los aminoácidos se refiere a la secuencia del Parj1.0102.
En la figura 2 se representan las secuencias de aminoácidos del Parj1.0101 y algunas proteínas ns-LTP en forma paralela. Las flechas indican los puentes disulfuro presentes en la estructura tridimensional de las proteínas. Los aminoácidos se indican con símbolos de código de una letra. Las letras C que se incluyen en la última fila de la tabla indican los restos cisteína conservados en todas las proteínas del grupo ns-LTP.
La figura 3 contiene la representación esquemática de los mutantes del alergeno principal de la Parietaria judaica Parj1.0102, la secuencia de los cuales se describe en el listado de secuencias con el nombre de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 10. Los aminoácidos se indican con el código de una letra. Los aminoácidos subrayados indican las mutaciones efectuadas en la secuencia nativa. Las flechas indican los puentes
disulfuro.
En la figura 4 se representa un panel A del análisis Western Blot, cuyos resultados indican la actividad de la rParj1 y de sus variantes de puente disulfuro de fijación de la IgE utilizando un conjunto de sueros (n = 30) de pacientes monosensitivos alérgicos a Pj.
En el panel B se representa la tintura con azul Coomassie Brilliant Blue de las proteínas recombinantes usadas.
En ambos paneles, en la primera pista se incluye el resultado obtenido con el Parj1.0101 nativo; en la segunda pista el resultado obtenido con el mutante PjA; en la tercera pista el resultado obtenido con el mutante PjB; en la cuarta pista el resultado obtenido con el mutante PjC; en la quinta pista el resultado obtenido con el mutante PjD.
En el panel A de la figura 5 se representa el resultado del análisis Western Blot con un conjunto de sueros de pacientes alérgicos a la PJ con el fin de demostrar la capacidad (actividad) de fijación de la IgE que tienen algunos mutantes de la presente invención, descritos con detalle en el ejemplo 3.
En la primera pista se describe el resultado obtenido con el Parj1.0101 nativo; en la segunda pista el resultado obtenido con el mutante PjA; en la tercera pista el resultado obtenido con el mutante PjB; en la cuarta pista el resultado obtenido con el mutante PjC; en la quinta pista el resultado obtenido con el mutante PjD.
En el panel B se presenta el resultado del análisis Western Blot con un conjunto de sueros de pacientes alérgicos a la PJ con el fin de demostrar la capacidad de fijación de la IgG4 que tienen mismos mutantes ya mencionados, descritos también con detalle en el ejemplo 3.
En la primera pista se describe el resultado obtenido con el Parj1.0101 nativo; en la segunda pista el resultado obtenido con el mutante PjA; en la tercera pista el resultado obtenido con el mutante PjB; en la cuarta pista el resultado obtenido con el mutante PjC; en la quinta pista el resultado obtenido con el mutante PjD.
En la figura 6 se representa un histograma que contiene los resultados del ensayo de detección ELISA realizado empleando el conjunto de sueros del ejemplo 3, que se describe con detalle en el ejemplo 4. El histograma negro indica los resultados obtenidos con los sueros alérgicos; las barras punteadas indican los resultados obtenidos con suero no alérgico. En el eje "y" se representa la densidad óptica medida y en el eje "x" las proteínas ensayadas (la rParj1 y sus variantes de puente disulfuro PjA, PjB, PjC y PjD).
En la figura 7 se representan diez diagramas que contienen los resultados del ensayo de detección ELISA realizado con sueros monosensitivos de diez pacientes alérgicos a la Pj, descrito con detalle en el ejemplo 4, cada diagrama corresponde a uno de dichos pacientes.
En cada histograma, en el eje "y" se representa la densidad óptica medida y en el eje "x" las proteínas ensayadas (la rParj1 y sus variantes de puente disulfuro PjA, PjB, PjC y PjD).
En cada diagrama, los cuadrados negros indican sueros alérgicos, los cuadrados blancos un suero no alérgico.
En la figura 8 se representa un histograma que contiene los resultados del ensayo de detección ELISA de la actividad de fijación de Ig que tiene un antisuero policlonal de conejo inmune y preinmune contra la rParj1, que se describe con detalle en el ejemplo 6.
En el eje "y" se representa la densidad óptica medida y en el eje "x" los antígenos utilizados (el rParj1 y sus variantes de puente disulfuro PjA, PjB, PjC y PjD).
Los cuadrados negros indican los resultados obtenidos con un conejo inmune, los cuadrados de rejilla indican los resultados obtenidos con un conejo preinmune.
Descripción detallada de la invención
La estrategia experimental que condujo a la presente invención consistió en una estrategia de mutagénesis, cuyo objetivo era la rotura intencionada de todos los puentes disulfuro presentes en todas las ns-LTP. Esto se efectuó con el fin de generar moléculas de afinidad reducida o nula con la IgE, pero con afinidad intacta con respecto a las demás clases de anticuerpos aptos para competir con las IgE específicas contra el alergeno nativo. El alergeno Parj1 de ns-LTP, cuya secuencia y estructura se representan en la figura 1 comparándolas con las del Parj2, y en particular la isoforma Parj1.0102 (la secuencia primaria del cual se representa en el listado de secuencias anexo con los nombres SEQ ID NO: 1 y 2) se toman como modelos moleculares a utilizar para llevar a cabo la mutagénesis y consiguiente verificación de las propiedades de los mutantes obtenidos. Se recurre en particular a la tecnología del DNA recombinante en una estrategia de mutagénesis dirigida a sitio contra las cisteínas 4, 29, 30, 50 y 52, es decir, las cisteínas que constituyen los puentes disulfuros con arreglo al modelo estructural ya conocido de la
técnica.
Los resultados de estos ensayos demuestran la relación estrecha que existe entre la estructura tridimensional de la proteína y la capacidad de formar epítopes de las IgE y en particular que la rotura gradual de los puentes disulfuro provoca una reducción de la actividad de fijación de las IgE del suero que tiene dicha proteína, mientras que esto no afecta su actividad de fijación de la IgG4.
Esto a la luz del análisis Western Blot descrito en el ejemplo 3 y en la figura 5, cuyas pistas 2, 3 y 4 (ver figura 5, panel A) indican la reducción de la actividad de fijación de las IgE del suero que tienen los mutantes de la presente invención, que podrían construirse como mutantes tridimensionales.
En particular, el mutante Cys29-Cys30 (PjA) presenta una banda de fijación muy débil (figura 5, pista 2), mientras que el mutante Cys50-Cys52 (PjB) de alguna manera es todavía capaz de fijar las IgE (figura 5, pista 3). A diferencia de ello es todavía más notable el resultado obtenido con los mutantes PjC y PjD (figura 5, pistas 4 y 5), en los que no se observa fijación de las IgE humanas.
Tales resultados se han confirmado con ensayos ELISA y de inhibición de IgE (ver ejemplos 4 y 5), en los que el PjB es la única variante que todavía es capaz de fijar los anticuerpos IgE específicos del Parj1 en solución, mientras que los demás variantes presentan una capacidad de inhibición muy baja. La pérdida de puentes disulfuro adicionales (PjC y PjD) conduce a la ausencia de reconocimiento de la IgE (ver ejemplo 4 y figura 4).
Estos resultados indican en conjunto que las variantes de Parj1 de ns-LTP, que carecen por lo menos de un puente disulfuro, tienen una alergenicidad reducida, que está ausente incluso en las variantes en las que el puente que falta está localizado en la región amino terminal del alergeno, en el dominio hélice alfa 1-bucle 1-hélice alfa 2, en particular cuando los puentes que faltan son por lo menos dos.
Que estas variantes mantienen una antigenicidad general que, a pesar de la alergenicidad reducida o nula, es comparable o idéntica con la de un alergeno de tipo salvaje, se ha puesto de manifiesto mediante ensayos en los que se ha comparado la actividad de fijación del alergeno de tipo salvaje y de sus variantes sobre anticuerpos distintos de la IgE.
Tales ensayos son Western Blots realizados empleando como anticuerpos los anticuerpos policlonales de conejo y las IgG4 de pacientes alérgicos a la Pj, dichos ensayos se describen con detalle en los ejemplos 6 y 3, respectivamente.
En estos ensayos, las variantes hipoalergénicas generadas por ingeniería genética presentan un comportamiento similar al del tipo salvaje, con una baja reducción de su actividad de fijación con respecto a los anticuerpos de conejo anti-rParj1.
Por consiguiente, una variante que carezca por lo menos de un puente disulfuro sigue conteniendo diversos dominios proteicos similares a los de la molécula nativa y, aunque en grado diferente, es apta para induce la producción de anticuerpos IgG (ver ejemplo 3 y 6). La producción de IgE y/o la presentación mediada por la IgE del alergeno se impediría bloqueando los anticuerpos y reduciendo la proliferación de células T y la liberación de citoquinas
(25).
Los datos anteriores se han confirmado también "in vivo", en particular con el análisis de punción de la piel (SPT), descrito en el ejemplo 7, en el que se ensayan proteínas recombinantes puras de diez pacientes alérgicos a la PJ (los mismos que se analizan con el ensayo ELISA del ejemplo 4 y la figura 7).
En lo que respecta a los mutantes individuales, el PjA presenta una actividad muy baja de fijación de la IgE y solamente 3 de 10 pacientes con hipersensibilidad cutánea de tipo I y una zona reducida del habón, por comparación con la inducida por el alergeno de tipo salvaje. Por el contrario, la pérdida de los puentes Cys50-Cys91 y Cys4-Cys52 parece tener un efecto menor, porque todavía están presentes la actividad de fijación de la IgE y el ensayo SPT es positivo. La pérdida de puentes disulfuro adicionales (PjC y PjD) conduce a la ausencia de cualquier reacción cutánea (ver ejemplo 7).
Estos resultados obtenidos del análisis de individuos demuestran la fiabilidad de los datos "in vitro" descritos antes y sobre todo que la rotura de los puentes disulfuro de la región terminal amino (en este caso específico Cys4-Cys52 y Cys50-Cys91) afecta aunque de forma no marcada la capacidad de fijación de la IgE humana que tiene este mutante, mientras que la rotura de los cuatro puentes (en este caso específico Cys4-Cys52, Cys14-Cys29, Cys30-Cys75 y Cys50-Cys91) tiene un efecto devastador en el reconocimiento de la IgE y por lo tanto en la respuesta alergénica.
Por consiguiente, en lo referente al desarrollo de moléculas hipoalergénicas de utilidad terapéutica, las variantes que carecen de tres o cuatro puentes, como en el caso específico de los mutantes PjC y PjD, se consideran formas preferidas de ejecución. Lo anterior se demuestra utilizando un conjunto de sueros así como una cohorte de pacientes individuales, indicando que el resultado obtenido es representativo de la respuesta inmune de la población alérgica.
Se ha indicado que, a pesar de haberse obtenido utilizando variantes específicas derivadas por mutación del alergeno de tipo salvaje, estos resultados no se limitan de hecho a dichas variantes específicas, ni a las técnicas empleadas para la derivación relevante.
Dichos resultados son consecuentes con la modificación de la estructura tridimensional del alergeno, por tanto podrían haberse obtenido de cualquier otra manera por cualquier mutagénesis que permita la rotura de los puentes disulfuro.
Por consiguiente, cualquier variante que pueda obtenerse por deleción, sustitución y/o inserción de uno o varios restos aminoácido, que dé como resultado variantes que carentes por lo menos de un puente disulfuro se incluye en el objeto de la invención.
Sin embargo, la estrategia de la mutación puntual tiene la ventaja notable de permitir la inserción de variaciones mínimas a nivel de la secuencia primaria de la proteína nativa y, por tanto, de generar mutantes que muy probablemente no interferirán con el reconocimiento de la variante, realizado por las células T y sobre todo la posibilidad de generar proteínas que tengan una gran reproducibilidad.
Las variantes que tienen sustancialmente la misma longitud que el tipo salvaje se consideran por tanto como preferidas.
En lo tocante a las técnicas utilizadas para derivar las variantes de la invención, dichas técnicas no se limitan a las de la ingeniería genética, ya que son obtenidas por técnicas tales como la mutagénesis química (formaldehído y glutaraldehído), que permiten la rotura de los puentes disulfuro, incluso en ausencia de mutaciones.
Sin embargo, la mutagénesis genética implica la ventaja notable de permitir la generación de proteínas que tienen una gran reproducibilidad, mientras que los mutantes químicos no aseguran un modelo de desnaturalización constante en cada preparación.
Por otro lado, la estrategia descrita en la presente es independencia de la secuencia de epítopes en sí misma, ya que se basa en la modificación de la estructura tridimensional de los determinantes IgE, la estrategia de mutagénesis adoptada es actualmente independiente de la secuencia primaria del alergeno (y por tanto de la secuencia de los epítopes IgE específicos).
Por esta razón se incluyen en el objeto de la invención las variantes de todas las proteínas con actividad alergénica que pertenezcan al grupo ns-LTP (incluida la Parj2), debido a la estructura conservada (véase p.ej. la figura 2, en la que la secuencia Parj1 se presenta por comparación con la secuencia de otras ns-LTP, junto con la ubicación de los puentes disulfuro).
En una variante particular de la invención, no es solo una muteína cualquiera del alergeno Parj1 o de otros alergenos ns-LTP la que, con independencia de la mutación efectuada (sustitución y/o deleción de uno o varios restos aminoácido) y del modo en que se lleva a cabo dicha mutación (p.ej. mediante las técnicas mencionadas anteriormente), conserva una estructura equivalente a la del alergeno nativo correspondiente, carente por lo menos de un puente disulfuro.
La rotura de los puentes disulfuro de los alergenos ns-LTP es de por sí la base de la capacidad limitada o nula de fijación de la IgE de los pacientes alérgicos a las variantes en cuestión.
Por otro lado, en particular a la luz de lo que ya es conocido en la técnica respecto a la alta conservación de la estructura y la reactividad cruzada que ha conducido a la selección de los llamados panalergenos ns-LTP (ver más arriba), estos datos son indicativos no solamente de la idoneidad para la terapia y prevención de las formas alérgicas provocadas por los alergenos correspondientes a las variantes individuales, sino también para la terapia y prevención de formas alérgicas provocadas por alergenos ns-LTP distintos a los correspondientes a las variantes utilizadas.
El experto en la materia podrá derivar sobre la base de sus conocimientos cualquier información idónea para derivar usos, composiciones y kit descritos en el resumen de la invención.
Mediante los ejemplos siguientes se facilita ahora una descripción más detallada de las formas de ejecución específicas con el fin de permitir una mejor comprensión de los objetos, características, ventajas y métodos de trabajo de la presente invención.
Ejemplos Ejemplo 1 Clonación y expresión del Parj1.0102
Para la producción del alergeno principal de la Parietaria judaica Parj1.0102 se utiliza el vector procariótico pQE30 (Qiagen). Este último expresa de modo característico las proteínas recombinantes fusionadas con una cola corta de histidina e inducibles con el isopropil-\beta-D-tiogalactósido (IPTG). Los restos histidina permiten la purificación de la proteína recombinante por cromatografía de afinidad.
Por esta razón se somete a una amplificación de 30 ciclos de reacción den cadena de polimerasa (PCR) 1 ng del clon P5 que contiene la versión procesada del Parj1.0102 (número de acceso EMBL: X77414), dicha secuencia se describe en el listado de secuencias anexo con el nombre de SEQ ID NO: 12, dichos ciclos se realizan con el programa siguiente: 94ºC durante 1 min, 52ºC durante 1 min, 72ºC durante 1 min. Se utilizan los oligonucleótidos cebadores sintéticos, el P5 derecho y el P5 inverso, cuyas secuencias se describen en el listado de secuencias anexo con el nombre de SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12, respectivamente.
Se fracciona el fragmento así generado a través de gel de agarosa del 1% en I X TBE, se extrae, se purifica y se digiere en enzimas de restricción Bam H1 y Hind III y se clona en el vector pQE30 (Qiagen), previamente digerido con la misma enzima. Se incuban el vector linealizado y los fragmentos digeridos a 16ºC durante 4 horas en presencia de la enzima DNA ligasa con arreglo a diferentes proporciones estequiométricas. A continuación se transforma la mezcla de reacción en la cepa bacteriana M15. Se secuencias los clones recombinantes por el método de Sanger y la secuencia de nucleótido así determina demuestra que el fragmento de DNA insertado en el vector pQE30 es idéntico al ya conocido de la técnica (10).
Ejemplo 2 Clonación y expresión de mutantes conformacionales del Parj1.0102
Se genera el mutante PjA (Cys29\rightarrowSer y Cys30\rightarrowSer) utilizando el kit llamado Transforme Site-Directed Mutagenesis Kit (Clontech) siguiendo las instrucciones del fabricante y utilizando el oligonucleótido P5 (29, 30), descrito en el listado de secuencias con el nombre SEQ ID NO: 13 (mapeo del nucleótido 88 al nucleótido 105) y la secuencia del Parj1 como molde. El mutante PjB (Cys50\rightarrowSer y Cys52\rightarrowSer) se genera por PCR utilizando como moldes el nucleótido P5 (50-52) descrito en el listado de secuencias con el nombre SEQ ID NO: 14 (mapeo desde el nucleótido 91 hasta el nucleótido 165) y el nucleótido P5 inverso y 1 ng de clon Parj como molde. Se digiere el fragmento PCR con enzimas de restricción Pst I y Hind III y se liga con el vector plásmido linealizado Pst I-Hind III que contiene la secuencia de Parj1 (que expresa los primeros 31 aminoácidos del alergeno Parj1.0102 de tipo salvaje). Se genera el mutante PjC (Cys4\rightarrowSer, Cys29\rightarrowSer y Cys30\rightarrowSer) por amplificación mediante PCR empleando la variante PjA como molde. El resto cisteína de la posición 4 se muta por PCR empleando los oligonucleótidos P5 (triple), cuya secuencia se describe con el nombre SEQ ID NO: 15, y P5 inverso.
Después de la purificación se digiere el fragmento PCR con enzimas Bam HI y Hind III y se clona en el vector pQE30 digerido previamente con las mismas enzimas de restricción. Se genera el mutante PjD (Cys29\rightarrowSer, Cys30\rightarrowSer, Cys50\rightarrowSer y Cys52\rightarrowSer) utilizando el kit llamado Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit (Clontech), siguiendo las instrucciones del fabricante y utilizando el oligonucleótido sintético P5 (29,30), descrito en el listado de secuencias con el nombre de SEQ ID NO: 13 y la variante PjB como molde. Todos los clones se secuencian por el método de Sanger (24) y se confirman las mutaciones y los marcos de lectura abiertos (ver figura 3 para más detalle).
Con este proceso se aíslan 4 mutantes independientes, denominados a continuación PjA (SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4); PjB (SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6); PjC (SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8); y PjD (SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10).
Ejemplo 3 Purificación de proteínas recombinantes y evaluación de la capacidad relevante de fijación de la IgE en pacientes alérgicos
Se utilizan 10 ml de cultivo O/N de clones recombinantes (cepa NM15, Qiagen) para la inoculación en 400 ml de caldo 2YT (Bacto-tryptone 6 g/l, Bacto-levadura 10 g/l, NaCl 5 g/l, pH 7,0) que contiene ampicilina y canamicina, en una concentración final de 100 \mug/ml y 10 \mug/ml, respectivamente.
Se cultiva una solución 1:40 a 37ºC durante 1 hora y, después de este tiempo, se induce con isopropiltio-\beta-galactósico 1 mM a 37ºC durante 4 horas. Se recolectan las células por centrifugación y se purifican las proteínas recombinantes utilizando el kit llamado His Trap (Pharmacia), siguiendo las instrucciones del fabricante. Las proteínas recombinantes, que se fijan en la columna quelante HiTrap, se eluyen utilizando un tampón que contiene: tampón fosfato 20 mM de pH 7,4, NaCl 0,5 M, urea 8 M e imidazol 500 mM; se analizan las fracciones por electroforesis 16% SDS-PAGE y tinción con azul Coomassie Brilliant Blue. A continuación se diluyen las fracciones que contienen la proteína purificada en proporción 1:100 en un tampón que contiene tampón fosfato 20 mM, pH 7,4, NaCl 0,5 M e imidazol 500 mM. Después se desalinizan las proteínas recombinantes empleando un dispositivo filtrante centrífugo (Centriprep, Millipore) y se analiza su capacidad de fijación de la IgE humana en paciente alérgicos a la Pj por el análisis Western Blot, ya descrito antes (12), empleando un conjunto de sueros (n = 30) de pacientes alérgicos a la Pj y que no han recibido inmunoterapia específica alguna.
Este análisis pone de manifiesto que el mutante PjB continúa siendo capaz de fijar la IgE humana, mientras que el mutante PjA conserva únicamente una débil actividad de fijación de la IgE. Los mutantes PjC y PjD no muestran actividad alguna de fijación de la IgE, sugiriendo que el reconocimiento de la IgE depende del pliegue tridimensional de la proteína (figura 4, panel A).
Después de ello se despojan las membranas y se someten de nuevo a prueba con reactivo específico de His-tag (INDIA™ Hisprobe-HRP, Pierce, EE.UU.) para verificar que el complejo IgE-alergeno era específico de las proteínas fusionadas recombinantes. Se determina la concentración de las proteínas recombinantes por análisis densitométrico de los geles SDS-PAGE teñidos con azul Coomassie Brilliant Blue (ver figura 4, panel B).
Como confirmación de este ensayo se realiza otro Western Blot empleando IgE e IgG4 de pacientes alérgicos.
Las proteínas purificadas se fraccionan en SDS-PAGE del 16% y se transfieren a tanques de nitrocelulosa de un sistema Dry-blot (Millipore). Se incuba la membrana durante 12-14 horas con un conjunto de sueros de pacientes alérgicos a la Pj (dilución 1:5) en PBS-Tween. Se detectan los complejos de unión de proteína-IgE e IgG4 humanas empleando respectivamente un anticuerpo anti-IgE y anti-IgG4 conjugados con peroxidasa de rábano rusticano. Seguidamente se detectan los complejos empleando un sistema de quimioluminiscencia (Super-signal, Pierce). Los resultados relevantes se recogen en la figura 4.
Ejemplo 4 Detección ELISA
El mismo conjunto de sueros alérgicos de pacientes alérgicos no sensibles a la Pj empleado en el ejemplo 3 se utiliza ahora en el ensayo ELISA, para poner de manifiesto la actividad de fijación de la IgE que tiene el rParj1 y sus variantes con enlace disulfuro. Como control negativo del ELISA se realiza el ensayo en un sujeto no alérgico.
Los resultados confirman los modelos de reacción del ensayo del ejemplo 3 (figura 4, panel A) con la reacción de la variante PjB de modo similar al alergeno de tipo salvaje. Se representa un suero no alérgico como control negativo (figura 6).
La actividad de fijación de la IgE de las cuatro variantes del Parj1 con enlaces disulfuro se comprueba también con un ensayo ELISA utilizando sueros de diez pacientes alérgicos a la Pj y monosensitivos. Los análisis de los sueros individuales ponen de manifiesto una homogeneidad notable en la reacción. En particular, los puentes Cys4-Cys52 y Cys50-Cys91 no influyen en la alergenicidad de la proteína, ya que este mutante (el PjB) presenta una actividad de fijación de la IgE comparable a la del alergeno de tipo salvaje. Por otro lado, los puentes Cys14-Cys29 y Cys30-Cys75 parecen ser cruciales con vistas al reconocimiento de la IgE. Todas las variantes que carecen de estos dos enlaces (PjA, PjC y PjD) presentan una actividad de fijación de la IgE baja o nula (figura 7).
La detección ELISA se lleva a cabo añadiendo 200 \mul de una solución que contiene 5 \mug/ml de antígeno en el tampón de recubrimiento (tampón carbonato sódico, pH 9,5) a cada hoyo de las placas de poliestireno, a temperatura ambiente durante una noche. Después de varios pasos de lavado (1XPBS, 0,1% de Tween 20) se saturan las placas con una solución que contiene un 5% de BSA, un 0,5% de Tween 20 en el tampón de recubrimiento. Después del lavado se incuban a temperatura ambiente durante 4 horas 200 \mul de suero (dilución 1:5) de pacientes alérgicos a la Pj o de un sujeto no alérgico. Se detectan los anticuerpos IgE fijados con un conjugado IgE-HRP de cabra anti-humano (Biosource International), diluido en un concentración de 0,5 ng/ml en 1XPBS, 0,25% de BSA, 0,1% de Tween 20, a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de varios lavados se revela la reacción colorimétrica añadiendo 0,2 ml de solución sustrato a cada hoyo (0,4 ml/ml de o-fenilendiamina en tampón citrato 0,1 M). Se lee la densidad óptica a 495 nm en un lector de microplacas BIO-RAD.
Ejemplo 5 Ensayo de inhibición de IgE
Con el fin de investigar si las variantes con enlace disulfuro son capaces de inhibir la fijación de la IgE sobre el rParj1 se incuba una cantidad creciente de cada mutante recombinante con un conjunto de sueros (n = 10) de pacientes alérgicos monosensibles a la Pj.
La capacidad de las variantes disulfuro Parj1 de interaccionar con los anticuerpos IgE se determina mediante un ensayo de inhibición ELISA. Se preincuba durante una noche un conjunto de sueros (dilución 1:5) de diez pacientes alérgicos a la Pj y monosensitivos con una concentración creciente de cada variante de enlace disulfuro (0,25-0,20 \mug/ml de proteína). Se añaden las soluciones a los hoyos ELISA recubiertos con 5 mg/ml de rParj1 y se llevan a cabo los pasos ELISA del modo descrito antes. Se calcula el porcentaje de inhibición según la fórmula % = 100-OD_{A}/OD_{B} X100, en la que OD_{A} y OD_{B} significan la densidad óptica leída en el conjunto de sueros inhibidos y no inhibidos, respectivamente.
Los resultados se recogen en la siguiente tabla I.
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TABLA I Inhibición de la fijación de la IgE
proteína ensayada % de inhibición
rParj1 95%
PjA 16%
PjB 85%
PjC 14%
PjD 15%
Los datos recogidos en la tabla I sugieren que todas las variantes carentes por lo menos de los enlaces disulfuro Cys14-Cys29 y Cys30-Cys75 presentan un nivel bajo similar de inhibición (en torno al 15%). Por el contrario, la variante PjB (Cys50\rightarrowSer y Cys52\rightarrowSer) presenta un porcentaje elevado de inhibición, conservando una capacidad sustancial de fijar la IgE humana (aprox. un 85%).
Ejemplo 6 Actividad de fijación policlonal en conejos
Se inmunizan los ratones en la empresa PRIMM srl (Milán, Italia) empleando el alergeno rParj1. Como control se analizan anticuerpos policlonales de conejo en un ensayo Western Blot empleando extracto en bruto de Parietaria judaica, detectando una banda en torno a 14.000 Da correspondiente al peso molecular de la Parj1 nativa. Se recubren las placas ELISA en las mismas condiciones que se han descrito anteriormente, con el Parj1 de tipo salvaje y con la misma cantidad de cada una de las variantes recombinantes de enlace disulfuro y se realizan los ensayos con suero policlonal específico anti-rParj1 para analizar sus actividades de fijación.
Se diluyen los sueros de conejo pre-inmune e inmune a una concentración de 6 ng/ml y se incuban 200 \mul de estas soluciones a temperatura ambiente durante 1 hora. Se lavan los hoyos tres veces con 1XPBS, 0,1% de Tween 20 y se detectan los anticuerpos fijados empleando un HRP-Ig fijado de asno anti-conejo (Amersham) en una dilución 1:1000. La reacción colorimétrica y la medición de la densidad óptica se realizan del modo descrito anteriormente.
Los datos obtenidos sugieren que las variantes PjA, PjB y PjC tienen un comportamiento similar, mostrando una ligera reducción de su capacidad de fijación (en torno al 10%), si se compara con la fijación del Parj1. La variante PjD tiene una actividad de fijación reducida (en torno al 20%), mientras que el suero pre-inmune no presenta reactividad alguna con las proteínas (figura 8).
Ejemplo 7 Ensayo de punción cutánea con muteínas purificadas
En este estudio se analizan diez pacientes con un claro historial de alergia a la Parietaria judaica y que presentan monosensibilidad en ensayo de punción cutánea (SPT) al extracto comercial de la Pj. Ninguno de los pacientes recibe inmunoterapia contra el polen de Pj ni tampoco tratamiento de glucorticosteroides. Los alergenos se utilizan en una concentración de 1 \mug/ml, diluidos en NaCl del 0,9%. Se introducen unos 20 \mul de la solución a ensayar en los antebrazos de los pacientes, a una distancia de más de 2,5 cm entre cada punción. Todos los ensayos se realizan por duplicado. Se emplea histamina como control positivo y una solución de NaCl al 0,9% como control negativo. Se miden las reacciones al cabo de 20 min. Por comparación con la superficie del habón generada por la histamina (100%), las SPT positivas se dividen en tres clases: 4+ son las STP cuya área es \geq 100% de la superficie inducida por la histamina; 3+ son las STP con una superficie \geq 80-100% y 2+ son las SPT con una superficie \geq 50-80%. Como controles negativos se someten al ensayo dos pacientes no alérgicos (P.C. y D.G.). Los investigadores informan a los pacientes y firman un documento en el que dan el consentimiento antes del ensayo.
Todos los pacientes muestran una reacción cutánea positiva al alergeno rParj1. El PjB es capaz de inducir hipersensibilidad inmediata de tipo I en 9 de los 10 pacientes sometidos al ensayo. El PjA da una reacción positiva en 3 de los 10 pacientes y las superficies de los habones provocados por la punción se reducen en tamaño con respecto a los provocados por el alergeno de tipo salvaje. El PjC y el PjD no dan ninguna reacción en el ensayo SPT. No se observan reacciones en los sujetos no alérgicos sometidos al ensayo, tal como se indica en la siguiente tabla II.
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TABLA II Ensayo de punción cutánea del rParj y de sus variantes con enlace disulfuro
paciente nº rParj1 PjA PjB PjC PjD
1 ++++ - - - -
2 +++ ++ +++ - -
3 ++++ - +++ - -
4 ++++ - ++++ - -
5 ++++ ++ +++ - -
6 ++++ - +++ - -
7 ++++ - ++++ - -
8 ++++ ++ +++ - -
9 +++ - ++ - -
10 +++ - ++ - -
P.C. - - - - -
D.G. - - - - -
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Referencias
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<210> 1
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<211> 420
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Parj.0102 de tipo salvaje, maduro
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(420)
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<400> 1
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Parj1.0102 de tipo salvaje, maduro
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<400> 2
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3
4
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<210> 3
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<213> Secuencia artificial
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<223> Variante PjA del Parj1
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(420)
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<223> Secuencia que codifica al mutante de la proteína Parj1 por sustitución de la Cys 29 y 30 por Ser
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<400> 3
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<211> 139
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<213> Seuencia artificial
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<223>Variante PjA del Parj1
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<211> 420
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223>Variante PjB del Parj1
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<221> CDS
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<222> (1)..(420)
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<223> Secuencia que codifica al mutante de la proteína Parj1 por sustitución Cys 50 y 52 por Ser
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 139
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Variante PjB del Parj1
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 420
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223>Variante PjC del Parj1
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<221> CDS
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<222> (1) .. (420)
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<223>Secuencia que codifica al mutante de Parj1 por sustitución de la Cys 4, 29 y 30 por Ser
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<400> 7
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13
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<210> 8
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223>Variante PjC del Parj1
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<400> 8
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<211> 420
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> Variante PjD del Parj1
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<221> CDS
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<222> (1)..(420)
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<223> Secuencia que codifica al mutante de Parj1 por sustitución de la Cys 29, 30, 50 y 52 por Ser
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<400> 9
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Claims (28)

1. Una variante de un alergeno perteneciente al grupo de las proteínas ns-LTP, dicha variante conserva la mayor parte de la secuencia de aminoácidos del alergeno de tipo salvaje, dicha variante carece por lo menos de uno de los cuatro puentes disulfuro que constituyen la estructura de dicho alergeno y muestra una capacidad reducida de fijación de la IgE, al tiempo que mantiene la capacidad de inducir respuesta de la IgG.
2. La variante según la reivindicación 1, dicha variante carece por lo menos de un puente disulfuro en la región terminal amino de dicho alergeno.
3. La variante según la reivindicación 1 ó 2, dicha variante carece de dos de dichos puentes disulfuro que constituyen la estructura de dicho alergeno.
4. La variante según la reivindicación 1, dicha variante carece de tres o cuatro de dichos puentes disulfuro que constituyen la estructura de dicho alergeno.
5. La variante según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4, dicha variante es una muteína en la que se ha suprimido por lo menos una de las cisteínas que constituyen dichos puentes disulfuro.
6. La variante según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5, dicha variante es una muteína en la que se ha sustituido por lo menos una de las cisteínas que constituyen dichos puentes disulfuro por un resto aminoácido que no es capaz de formar puentes disulfuro.
7. La variante según la reivindicación 6, en la que dicho resto aminoácido es la serina o la alanina.
8. La variante según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 7, en la que dicho alergeno es uno de los alergenos principales de la Parietaria judaica.
9. La variante según la reivindicación 8, en la que dicho alergeno es el Parj1 y dichas cisteínas que constituyen los puentes disulfuro son las cisteínas 4, 14, 29, 30, 50, 52, 75 y 91.
10. La variante según la reivindicación 9, en la que la secuencia de dicha variante consta de una secuencia elegida entre el grupo formado por las secuencias descritas en el listado de secuencias con los nombres SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 7.
11. La variante según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 10 para el uso de medicamento o de agente diagnóstico.
12. La variante según la reivindicación 11 para el uso en un tratamiento adaptado a un cliente y/o en la prevención de una forma alérgica asociada con un alergeno perteneciente al grupo de las proteínas ns-LTP.
13. La variante según la reivindicación 12, que es una variante de un alergeno principal de la Parietaria judaica y en el que la forma alérgica está asociada con un alergeno de la Parietaria judaica.
14. La variante según las reivindicaciones 12 ó 13 para el uso en el tratamiento de la picazón, el eritema, el edema, el habón, la formación de sarpullido (urticaria), la rino-conjuntivitis (alergias de temporada), la broncoconstricción, el asma y la anafilaxis.
15. La variante según las reivindicaciones de 11 a 14 para el uso en la inmunoterapia preventiva específica.
16. La variante según la reivindicación 11 para el uso como agente de diagnóstico en el diagnóstico adaptado a un cliente para determinar formas alérgicas.
17. Un polinucleótido que codifica a la variante según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 11.
18. El polinucleótido según la reivindicación 17, en el que dicha secuencia de dicha variante contiene una secuencia elegida entre el grupo formado por las secuencias descritas en el listado de secuencias con los nombres de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8.
19. Un vector que contiene por lo menos un polinucleótido según la reivindicación 17 ó 18.
20. El uso de una variante según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 11, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una forma alérgica asociada con un alergeno perteneciente al grupo de las proteínas ns-LTP.
21. El uso según la reivindicación 20, en el que dicho alergeno perteneciente al grupo de las proteínas ns-LTP es el alergeno correspondiente a dicha variante.
22. El uso según la reivindicación 20 ó 21, en el que dicho alergeno es un alergeno principal de la Parietaria judaica y dicha forma alérgica asociada con dicho alergeno es una forma alérgica de la Parietaria judaica.
23. Una composición farmacéutica que contiene por lo menos una variante según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 11 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
24. Una composición farmacéutica que contiene por lo menos un polinucleótido según la reivindicación 17 ó 18 y/o un vector según la reivindicación 19 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
25. Un agente de diagnóstico que contiene por lo menos una variante según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 11 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
26. Un kit para la derivación de un alergograma adaptado a un sujeto de una forma alérgica asociada con un alergeno de ns-LTP, que consta de
- una primera composición que contiene dicho alergeno ns-LTP en forma nativa junto con un excipiente aceptable;
- por lo menos una composición que contenga una variante individual de dicho alergeno ns-LTP según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 11 y un excipiente aceptable;
dicho alergograma puede derivarse de la puesta en contacto de dichas composiciones con inmunoglobulinas de dicho sujeto y de la observación de los efectos obtenidos de este modo.
27. El kit según la reivindicación 26, que contiene dicha primera composición y un número de composiciones, cada una de las cuales contiene una variante individual de dicho alergeno de ns-LTP, igual al número de las variantes de dicho alergeno de ns-LTP.
28. El kit según la reivindicación 26 ó 27, en el que dicho alergeno de ns-LTP es el Parj1.
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