ES2341367T3 - Variantes hipoalergenicas del alergeno principal del polen de betula verrucosa. - Google Patents
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Abstract
Proteína que es una variante hipoalergénica del alérgeno principal del polen de Betula verrucosa (Bet v 1) y que se caracteriza por: a) mostrar una reactividad reducida frente a IgE en comparación con Bet v 1 de tipo natural (SEQ ID NO:1); b) tener una secuencia de aminoácidos que: i) es al menos el 87%, preferiblemente al menos el 94%, más preferiblemente al menos el 97% idéntica a SEQ ID NO:1; ii) en una alineación de secuencia con SEQ ID NO:1, presenta una sustitución o deleción del residuo de Lys correspondiente al aminoácido 54 de SEQ ID NO:1.
Description
Variantes hipoalergénicas del alérgeno principal
del polen de Betula verrucosa.
La presente invención proporciona variantes de
secuencia hipoalergénicas de la proteína Bet v 1, moléculas de
ácido nucleico que las codifican, composiciones farmacéuticas que
contienen las mismas y su uso en la profilaxis y el tratamiento de
enfermedades alérgicas provocadas por el polen de plantas de la
especie Betula verrucosa.
Las alergias están provocadas por una disfunción
del sistema inmunitario, que reacciona frente a proteínas inocuas
contenidas en polen, ácaros, epitelios y ciertos alimentos
produciendo anticuerpos de la clase IgE.
Datos recientes indican que más del 10% de la
población en los países occidentales padece esta enfermedad, cuyos
síntomas pueden deteriorarse con el tiempo dando lugar a, por
ejemplo, asma o una sensibilización a otros alérgenos haciendo así
más difícil la elección del tratamiento apropiado.
La inmunoterapia hiposensibilizante específica,
a diferencia de la terapia farmacológica, es el único tratamiento
etiológico de enfermedades alérgicas que puede cambiar
favorablemente los parámetros inmunológicos en los que se basan
estas enfermedades.
La inmunoterapia hiposensibilizante consiste en
la administración de dosis crecientes de extractos normalizados
(vacunas) obtenidos de la misma sustancia que provoca la enfermedad
(1). De este modo, se induce gradualmente en el paciente una
especie de tolerancia inmunológica a dicha sustancia con la
desaparición posterior de los síntomas alérgicos.
Sin embargo, el riesgo de provocar efectos
secundarios graves (2), aunque se reduce notablemente con el uso de
o bien vacunas de liberación lenta o bien vacunas administradas a
través de vías alternativas a las inyecciones, ha limitado de hecho
la aplicación de la inmunoterapia hiposensibilizante específica en
el tratamiento de enfermedades alérgicas.
En los últimos años, la mayor parte de la
atención se ha centrado en el desarrollo de vacunas eficaces, más
seguras. En particular, el desarrollo de vacunas que consisten en
proteínas recombinantes mutagenizadas, es decir, variantes
hipoalergénicas que pueden influir favorablemente en la evolución
natural de la enfermedad sin provocar efectos secundarios no
deseados (3), ha representado un objetivo importante.
El polen de plantas conocidas taxonómicamente
como Fagales (abedul, aliso, avellano, roble, carpe) es una de las
causas más importantes de asma y rinitis alérgica en las regiones
templadas. Los dos alérgenos principales del polen del abedul, Bet
v 1 (ADNc depositado en GenBank con el n.º de registro X15877) y Bet
v 2 (n.º de registro M65179) son proteínas con un peso molecular de
17 y 14 kD, respectivamente (4, 5). Casi el 95% de los pacientes
con alergia al polen del abedul producen anticuerpos IgE contra Bet
v 1 y el 60% de estos pacientes muestran reactividad contra Bet v 1
solo (6).
Bet v 1 está presente de manera natural en más
de diez isoformas que muestran una identidad de secuencia
comprendida entre el 84,4% y el 99,4% (7). Este alérgeno pertenece
a la familia de las "proteínas relacionadas con la
patogénesis", es decir, proteínas ubicuas producidas por plantas
en respuesta a estrés patológico o medioambiental, cuyas funciones
se supone que están relacionadas con el transporte de esteroides
(8,9). La alta homología de secuencia con los alérgenos del grupo 1
en el polen de otras plantas del orden Fagales explica por qué los
pacientes con IgE específicas para Bet v 1 muestran síntomas
alérgicos durante la temporada de polinización de diferentes
plantas que pertenecen al mismo orden taxonómico (10). La alergia al
polen del abedul va acompañada a menudo por reacciones adversas
provocadas por la ingesta de frutas (por ejemplo, cereza, manzana,
pera) u hortalizas (por ejemplo, apio y zanahoria) frescas. El
motivo es que tales alimentos contienen proteínas caracterizadas
por una alta homología de estructura y secuencia con Bet v 1, que
son reconocidas por IgE específicas producidas por el alérgeno
principal del abedul (11). La inmunoterapia con el alérgeno Bet v 1
puede ser eficaz en el tratamiento de la alergia al polen del
abedul así como la polinosis a otras plantas del orden Fagales y la
alergia a alimentos que contienen alérgenos que reaccionan de manera
cruzada con Bet v 1 (12).
Un factor que se correlaciona con los efectos
beneficiosos de la inmunoterapia hiposensibilizante es la inducción
de anticuerpos IgG específicos para el alérgeno sensibilizante.
Tales anticuerpos (protectores) pueden inhibir la unión de IgE al
antígeno, específicamente a Bet v 1, alterando la conformación
tridimensional de esta molécula (13, 14). El desarrollo de vacunas
que consisten en proteínas recombinantes que poseen menos
alergenicidad y propiedades inmunogénicas inalteradas mejoraría el
tratamiento de enfermedades alérgicas.
Se ha encontrado ahora que sustituyendo o
delecionando uno o más residuos de aminoácido dentro de la secuencia
de proteína del alérgeno Bet v 1, éste se hace menos reactivo
frente a los anticuerpos IgE.
En un primer aspecto, la invención proporciona
una proteína hipoalergénica que es una variante de secuencia del
alérgeno Bet v 1, caracterizada por:
- 1)
- mostrar una actividad reducida frente a IgE en comparación con el alérgeno Bet v 1 de tipo natural (SEQ ID NO:1);
- 2)
- tener una secuencia de aminoácidos que:
- a)
- es al menos el 87%, preferiblemente al menos el 94%, más preferiblemente al menos el 97% idéntica a SEQ ID NO:1;
- b)
- en una alineación de secuencia con SEQ ID NO: 1, presenta una sustitución o deleción del residuo de Lys correspondiente a al aminoácido 54 de SEQ ID NO:1.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prefieren variantes de sustitución en vez de
deleción, especialmente aquéllas en las que el residuo de Lys en la
posición indicada se sustituye por un aminoácido neutro o polar. Más
preferiblemente, dicho aminoácido neutro o polar se selecciona de
Ala, Thr, Gly, Pro, Leu, Ile, Ser, Phe, aún más preferiblemente de
Ala, Thr y Ser.
En una realización preferida, la proteína
hipoalergénica consiste en SEQ ID NO:2.
Las variantes de sustitución y/o deleción del
alérgeno Bet v 1 según esta invención, en comparación con su
equivalente de tipo natural, muestran una reducción de la
reactividad de IgE en al menos el 25%, preferiblemente al menos el
50%, más preferiblemente al menos el 80%, frente al suero de
pacientes alérgicos al polen de Betula verru-
cosa.
La reactividad de IgE de la proteína SEQ ID NO:2
de un conjunto de sueros de pacientes alérgicos se sometió a prueba
en un ensayo ELISA (figura 1). En comparación con el alérgeno Bet v
1 de tipo natural (SEQ ID NO:1), se observó una reducción media del
56% de la reactividad de IgE con SEQ ID NO: 2, cuando se incubó esta
proteína con diversas diluciones (desde 1:2 hasta 1:8) de conjuntos
de suero de pacientes alérgicos al polen del abedul.
Estos resultados se confirmaron mediante
experimentos de ELISA de inhibición, que permiten evaluar la
reactividad de epítopos homólogos de diferentes proteínas. Estos
resultados indican claramente que la sustitución del aminoácido en
la posición 54 de SEQ ID NO:1 disminuye el reconocimiento del
alérgeno Bet v 1 por IgE.
Además, la reactividad de la proteína de SEQ ID
NO:2 frente a IgE de un conjunto de suero positivo para polen de
Betula verrucosa se sometió a ensayo mediante
inmunotransferencia de tipo Western. También en este caso, se
observó una reducción de la reactividad de IgE en los sueros
analizados, que, en comparación con Bet v 1 de tipo natural (SEQ ID
NO:1), era del 88% para SEQ ID NO:2 (figura 3).
En un aspecto adicional, la invención
proporciona un péptido inmunológicamente activo correspondiente a un
fragmento de Bet v 1 que contiene desde 15 hasta 35, más
preferiblemente desde 15 hasta 20 residuos de aminoácido y que
porta las sustituciones y/o deleciones descritas anteriormente. Tal
como se usa en el presente documento, la expresión "péptido
inmunológicamente activo" indica un péptido que puede provocar
una respuesta inmunitaria dependiente de IgE.
Pueden prepararse fácilmente variantes de
sustitución y/o deleción según la invención mediante mutagénesis de
la secuencia de ADNc de Bet v 1 (SEQ ID NO:6) usando métodos y
técnicas conocidos por cualquier experto en la técnica.
La secuencia de ADNc para la variante de
sustitución única SEQ ID NO:2 se identifica en SEQ ID NO:7.
En aspectos adicionales, la invención
proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica para una
proteína Bet v 1 hipoalergénica dada a conocer en el presente
documento, o un péptido derivado de la misma, y un vector de
expresión que contiene dicha molécula de ácido nucleico
funcionalmente unida a elementos genéticos que controlan la
expresión de dicha proteína o péptido en células eucariotas o
procariotas, tales como potenciadores, promotores de la
transcripción, secuencias señal y líder u otras secuencias
implicadas en la regulación de la transcripción. Los ejemplos de
vectores incluyen plásmidos, virus y fagos aunque puede empleare
también cualquier otro vector que se utilice comúnmente en
ingeniería genética.
La invención comprende además una célula huésped
procariota o eucariota que se transforma o transfecta con un vector
tal como se describió anteriormente. Se usan generalmente células
procariotas tales como Escherichia coli o Bacillus
subtilis, o células eucariotas tales como Saccharomyces
cerevisiae para la clonación del vector y la expresión de
ADNc.
Además, las variantes hipoalergénicas según la
invención pueden producirse como proteínas de fusión.
\newpage
Gracias a su reactividad de IgE reducida, las
variantes de Bet v 1 según la presente invención pueden usarse de
manera conveniente para la preparación de composiciones
farmacéuticas (por ejemplo comprimidos y cápsulas) para el
tratamiento preventivo o terapéutico de individuos alérgicos al
polen de Betula verrucosa.
En un aspecto adicional, la invención se refiere
por tanto a una composición farmacéutica que contiene una cantidad
eficaz de variante de Bet v 1 hipoalergénica tal como se proporciona
en el presente documento, opcionalmente en combinación con otros
alérgenos de Betula verrucosa y/o con vehículos y excipientes
farmacéuticamente aceptables. En una realización preferida de la
invención, la composición farmacéutica está en forma de una vacuna
que va a usarse en la profilaxis o el tratamiento de enfermedades
alérgicas, incluyendo asma bronquial, rinitis alérgica, dermatitis
alérgica y conjuntivitis alérgica. La teoría y práctica de la
vacunación las conoce cualquier experto en la técnica (15, 16).
Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente
la invención. A menos que se indique lo contrario, los métodos
usados en los ejemplos se describen en Sambrook, Fritsch ET Maniatis
"Molecular cloning. A laboratory manual" II ed. Vol.
1-2-3 CSH Lab Press 1989.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo la mutagénesis específica de
sitio del ADNc que codifica para el alérgeno Bet v 1 (SEQ ID NO: 6)
mediante clonación de ADNc en un vector procariota (pBluescript, n.º
de registro de GenBank X52327) seguido por amplificación por PCR.
Los oligonucleótidos usados como cebadores en la reacción de PCR
(tabla) realizaron las sustituciones de bases apropiadas. Para cada
mutagénesis, se usó un oligonucleótido complementario que se unía a
una región correspondiente de la hebra de ADN (17). Tras la
amplificación, se degradó selectivamente el molde original
inalterado con digestión enzimática catalizada mediante la enzima de
restricción DpnI. Se transformaron entonces células de
Escherichia coli con las moléculas mutagenizadas. Se
secuenciaron clones obtenidos de colonias bacterianas individuales
según Sanger para determinar la modificación de bases correcta y la
ausencia de mutaciones no específicas en el ADNc.
Se clonaron y expresaron ADNc de Bet v 1 de tipo
natural (SEQ ID NO. 6) y mutagenizados (SEQ ID N.
7-10), flanqueados por una secuencia que codificaba
para seis histidinas, en Escherichia coli según protocolos
convencionales (18, 19). Se recogieron las células mediante
centrifugación, se resuspendieron en tampón NaH_{2}PO_{4} 50
mM, NaCl 300 mM, pH 8, y se lisaron mediante sonicación. Se
separaron las proteínas recombinantes mediante centrifugación. Se
resuspendió el sedimento que contenía un agregado de proteína
insoluble en NaH_{2}PO_{4} 100 mM, Tris-HCl 10
mM, urea 8 M (pH 8) (tampón de desnaturalización) y se agitó durante
60 min. Se separaron las proteínas recombinantes solubilizadas de
los desechos insolubles mediante centrifugación y se purificaron
mediante cromatografía de afinidad en condiciones de
desnaturalización usando columnas de agarosa unidas a ácido
nitriloacético, que quela los iones níquel que interaccionan con la
parte de seis histidinas fusionada al alérgeno. Se replegaron las
proteínas purificadas mediante diálisis durante 16 horas a 4ºC en
disolución de NaCl al 0,68%, NaHCO_{3} al 0,275%.
\vskip1.000000\baselineskip
Se recogieron sueros de individuos con anamnesis
clínica de alergia estacional a polen de Betula verrucosa y
una reactividad específica RAST 4+ frente a alérgenos de B.
verrucosa y entonces se agruparon. Se usó como control negativo
un conjunto de sueros de pacientes no alérgicos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se adsorbió la misma cantidad de alérgeno de
tipo natural y de variantes mutagenizadas (0,5 \mug) en tampón
carbonato/bicarbonato 50 mM, pH 9,6, en pocillos de placas de
poliestireno para el ensayo ELISA mediante incubación a 4ºC durante
16 horas. Se lavaron los pocillos con disolución de lavado (tampón
fosfato 60 mM, pH 6,5, que contenía un 0,05% de
Tween-20) y se bloquearon con disolución de dilución
(25% de suero de caballo, EDTA 1 mM, 0,05% de Tween 20, 0,01% de
tiomersal en tampón fosfato 150 mM, pH 7,4). Se añadieron alícuotas
de 100 \mul de diluciones en serie (en tampón de dilución) de un
conjunto de sueros humanos RAST 4+ a cada muestra y se incubaron a
25ºC durante 2 horas. Tras tres lavados, se añadió suero
anti-IgE humana conjugado con peroxidasa (1:1500 en
tampón de dilución), seguido por incubación a 25ºC durante 1,5
horas. Tras tres lavados, se reveló la reacción colorimétrica
añadiendo 100 \mul de reactivo TMB (BioFX Laboratories, Owings
Mills, MD) e incubando durante 15 minutos a 25ºC. Se detuvo la
reacción añadiendo 100 \mul de HCl 1 N y se leyó a 450 nm usando
un espectrofotómetro lector de microplacas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se adsorbieron alícuotas de 1 \mug de alérgeno
de tipo natural en tampón carbonato/bicarbonato 50 mM, pH 9,6, en
pocillos de placas de poliestireno para el ensayo ELISA mediante
incubación a 4ºC durante 16 horas. Se lavaron los pocillos con
disolución de lavado (tampón fosfato 60 mM, pH 6,5, que contenía un
0,05% de Tween-20) y se bloquearon con tampón de
dilución (25% de suero de caballo, EDTA 1 mM, 0,05% de Tween 20,
0,01% de tiomersal en tampón fosfato 150 mM, pH 7,4). Se
preincubaron alícuotas de 100 \mul de un conjunto de sueros
humanos RAST 4+ diluidos 1:3 en tampón de dilución a 25ºC durante 2
horas con diluciones en serie de alérgeno de tipo natural y de
variante mutagenizada. Se colocó la disolución obtenida en los
pocillos y se incubó a 4ºC durante 16 horas. Tras tres lavados con
tampón fosfato 0,06 M pH 6,5, 0,05% de Tween-20, se
añadió suero anti-IgE humana conjugado con
peroxidasa a una dilución 1:1500 (en tampón de dilución), seguido
por incubación a 25ºC durante 1,5 horas. Tras tres lavados, se
reveló la reacción colorimétrica añadiendo 100 \mul de reactivo
TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) e incubando a 25ºC
durante 15 minutos. Se detuvo la reacción añadiendo 100 \mul de
HCl 1 N seguido por lectura espectrofotométrica a 450 nm.
Se calculó el porcentaje de inhibición tal como
sigue: 100x[(A-B)/A], en la que A es la absorbancia
a 450 nm en ausencia de inhibidor mientras que B es la absorbancia
en presencia de inhibidor.
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizaron electroforéticamente cantidades
iguales de alérgeno de tipo natural y formas mutagenizadas (1,5
\mug) en gel de poliacrilamida seguido por electrotransferencia
sobre membrana de nitrocelulosa, tal como se describe por Towbin
(20).
Se incubó en primer lugar la membrana durante
una hora en TBST (TBS, 0,05% de Tween-20) que
contenía un 5% de leche en polvo desnatada (tampón de saturación) y
se incubó entonces durante la noche con un conjunto de sueros de
sujetos alérgicos a Betula verrucosa que mostraban una
reactividad 4+, diluidos 1:3 en TBST con un 2% de leche en polvo
desnatada. Tras 1 h de incubación, se lavó la membrana tres veces
con TBST. Se pusieron en contacto los anticuerpos unidos a la
membrana con son suero anti-IgE humana conjugado con
peroxidasa y, tras varios lavados, se detectaron con el sistema de
detección de quimioluminiscencia usando luminol como sustrato de la
peroxidasa (ECL, Amersham).
Figura 1: Análisis ELISA de la reactividad de
IgE frente al alérgeno Bet v 1 y frente a variantes hipoalergénicas
de Bet v 1;
figura 2: Análisis de inmunotransferencia de
tipo Western de la reactividad de IgE frente al alérgeno Bet v 1 y
variantes del mismo.
\newpage
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<110> LOFARMA S.P.A.
\vskip1.000000\baselineskip
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<120> Variantes hipoalergénicas del
alérgeno principal del polen de Betula verrucosa
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<130> 7683MEUR
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<160> 10
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<170> PatentIn versión 3.3
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<210> 1
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<211> 159
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<212> PRT
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<213> Desconocido
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Bet v 1 de tipo natural de Betula
verrucosa
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<400> 1
\hskip1cm
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<210> 2
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<211> 159
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
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<220>
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<223> Bet v 1 mutante
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 159
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<212> PRT
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<213> Desconocido
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<220>
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<223> Bet v 1 mutante
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<400> 3
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\hskip1cm
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<210> 4
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<211> 159
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<212> PRT
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<213> Desconocido
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<220>
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<223> Bet v 1 mutante
\newpage
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<400> 4
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\hskip1cm
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<210> 5
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<211> 159
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<212> PRT
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<213> Desconocido
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Bet v 1 mutante
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<400> 5
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\hskip1cm
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<210> 6
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<211> 480
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<212> ADN
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<213> Desconocido
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia que codifica para Bet v 1
de tipo natural
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<400> 6
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\hskip1cm
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<210> 7
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<211> 480
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<212> ADN
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<213> Desconocido
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia que codifica para Bet v 1
mutante
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<400> 7
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\hskip1cm
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<210> 8
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<211> 480
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<212> ADN
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<213> Desconocido
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<220>
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<223> Secuencia que codifica para Bet v 1
mutante
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<400> 8
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\hskip1cm
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<210> 9
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<212> ADN
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<213> Desconocido
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<220>
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<223> Secuencia que codifica para Bet v 1
mutante
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<400> 9
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\hskip1cm
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<210> 10
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<211> 480
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<212> ADN
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<213> Desconocido
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<220>
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<223> Secuencia que codifica para Bet v 1
mutante
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm
Claims (15)
1. Proteína que es una variante hipoalergénica
del alérgeno principal del polen de Betula verrucosa (Bet v
1) y que se caracteriza por:
- a)
- mostrar una reactividad reducida frente a IgE en comparación con Bet v 1 de tipo natural (SEQ ID NO:1);
- b)
- tener una secuencia de aminoácidos que:
- i)
- es al menos el 87%, preferiblemente al menos el 94%, más preferiblemente al menos el 97% idéntica a SEQ ID NO:1;
- ii)
- en una alineación de secuencia con SEQ ID NO:1, presenta una sustitución o deleción del residuo de Lys correspondiente al aminoácido 54 de SEQ ID NO:1.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Proteína según la reivindicación 1, en la que
dicho residuo de Lys se sustituye por aminoácidos neutros o
polares.
3. Proteína según la reivindicación 2, en la que
dichos aminoácidos neutros o polares se seleccionan de Ala, Thr,
Gly, Pro, Leu, Ile, Phe, Ser.
4. Proteína según la reivindicación 3, en la que
dichos aminoácidos son Ala, Ser o Thr.
5. Proteína según la reivindicación 1, que tiene
la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:2.
6. Fragmento de péptido inmunológicamente activo
de una proteína según las reivindicaciones 1-5, que
contiene desde 15 hasta 35 aminoácidos y que porta la sustitución
y/o deleción de Lys tal como se definió anteriormente.
7. Péptido según la reivindicación 6, que
contiene desde 15 hasta 20 aminoácidos.
8. Molécula de ácido nucleico que codifica para
una proteína según las reivindicaciones 1-5 o para
un péptido según las reivindicaciones 6-7.
9. Molécula de ácido nucleico según la
reivindicación 8, que tiene la secuencia SEQ ID NO:7.
10. Vector que contiene la molécula de ácido
nucleico según las reivindicaciones 8-9.
11. Célula huésped que contiene el vector según
la reivindicación 10.
12. Composición farmacéutica que comprende una
cantidad eficaz de una proteína según las reivindicaciones
1-5, o un péptido según las reivindicaciones
6-7, junto con vehículos y excipientes
farmacéuticamente aceptables.
13. Composición según la reivindicación 12, que
está en forma de una vacuna.
14. Uso de una proteína según las
reivindicaciones 1-5, o un péptido según las
reivindicaciones 6-7, para la preparación de una
composición farmacéutica para el tratamiento profiláctico o
terapéutico de enfermedades alérgicas.
15. Uso según la reivindicación 14, para el
tratamiento de asma bronquial, rinitis, conjuntivitis y dermatitis
atópica.
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