ES2238487T3 - Variantes de la proteina alergica phl p1 de phleum pratense. - Google Patents

Variantes de la proteina alergica phl p1 de phleum pratense.

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ES2238487T3 ES01976216T ES01976216T ES2238487T3 ES 2238487 T3 ES2238487 T3 ES 2238487T3 ES 01976216 T ES01976216 T ES 01976216T ES 01976216 T ES01976216 T ES 01976216T ES 2238487 T3 ES2238487 T3 ES 2238487T3
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Abstract

Una variante hipoalergénica del alergeno mayor Phl p 1, en la que al menos uno de los residuos de lisina presentes en las posiciones 28, 35, 44, 48, 179, 181, 183 y 185 de la proteína madura del Phl p 1 (SEQ. ID. Nº:2 en la que los residuos de las posiciones 28, 35, 44, 48, 179, 181, 183 y 185 son lisina) es substituido o eliminado.

Description

Variantes de la proteína alérgica Phl p 1 de Phleum pratense.
La presente invención se relaciona con nuevas variantes de un alergeno del polen de las plantas de la especie Phleum pratense.
Más concretamente, la presente invención se relaciona con las secuencias aminoacídicas de las variantes hipoalergénicas del alergeno Phl p1, obtenidas mediante mutagénesis sitio específica de la secuencia nucleotídica codificada para dicho alergeno. Las variantes hipoalergénicas pueden ser empleadas en la inmunoterapia específica de las patologías alérgicas causadas por el polen de las gramíneas.
Antecedentes de la invención
Las gramíneas son la mayor causa de alergia en la zona mediterránea. En su polen se han identificado trece tipos distintos de proteínas alergénicas, conservadas filogenéticamente dentro de esta familia. Para cada alergeno, las proteínas homólogas presentes en varias especies constituyen una clase, dentro de la cual se observa una alta reactividad cruzada hacia las inmunoglobulinas E (IgE), los anticuerpos que modulan la respuesta alérgica.
Las clases 1 y 5 están formadas por alergenos mayores, i.e., los alergenos más relevantes clínicamente, y las IgE de los componentes de estos grupos se encuentran estadísticamente presentes en más del 80% de los sujetos alérgicos a las gramíneas.
La Phleum pratense, una gramínea ampliamente extendida debido a su valor como forraje, es, por lo tanto, extremadamente importante desde el punto de vista alergológico.
El alergeno mayor Phl p 1 de la Phleum pratense (identificado en el GenBank con el código de acceso X78813) es una proteína de 240 aminoácidos que forma in vivo uno de los componentes de la pared celular (beta-expansina). Este alergeno tiene una homología superior al 90% con las otras proteínas de la clase 1 caracterizadas hasta el momento. Una de las propiedades inmunoquímicas que el Phl p 1 comparte con el resto de los alergenos del mismo grupo es la presencia de epitopes comunes para las IgE. Por consiguiente, el alergeno Phl p 1 puede emplearse tanto para el diagnóstico como para la terapia de las alergias al polen de las gramíneas producidas por los alergenos mayores de la clase 1, independientemente de la especie de origen.
El único tratamiento etiológico para las alergias está representado por la inmunoterapia hiposensibilizadora específica (SIT). Ésta consiste en administrar dosis cada vez mayores de la sustancia que causa la alergia, induciendo así a una desensibilización gradual a dicha sustancia en el paciente.
La inmunoterapia puede, sin embargo, inducir a efectos sistémicos más graves que obliguen a restringir el uso de la misma.
Los avances en la SIT, enfocados a garantizar un tratamiento más efectivo y seguro, incluyen el uso de alergenos recombinantes mutados que tienen una reducida actividad alergénica (reactividad a las IgE), pero que mantienen a la vez su capacidad natural de inducir cambios inmunológicos favorables.
El documento WO 99/47680 revela mutantes no naturales de alergenos con una reducida fijación de IgE. El alergeno del veneno de la avispa Ves V 5 y el alergeno del polen Bet V 1 son presentados como ejemplos de mutantes de alergenos que llevan una sustitución de lisina en su secuencia de proteínas.
Revelación detallada de la invención
El análisis de la estructura del Phl p 1 (forma natural, GenBank X78813) y, particularmente, de su perfil de hidrofilicidad permitieron la identificación de regiones aparentemente responsables de la fijación a IgE. Se ha probado, por tanto, que el efecto alergénico del Phl p 1 puede ser reducido cambiando su secuencia aminoacídica en al menos una de las posiciones nº 28, 35, 44, 48, 179, 181, 183, 185, en las que se encuentra presente un residuo del aminoácido lisina. "Cambio" aquí significa substitución de uno o más residuos de las posiciones especificadas, preferiblemente, por aminoácidos neutrales o polares, o eliminación de uno o más residuos de lisina presentes en su forma natural, o simultáneamente, substitución y eliminación de dos o más residuos.
Las mutaciones preferidas mediante substitución son aquéllas en las que se inserta un residuo de alanina en cada una de las 8 posiciones indicadas arriba. Se prefiere aún más la variante en la que las ocho substituciones indicadas en la SEQ. ID. Nº:2 se encuentran presentes simultáneamente.
La presente invención comprende también las proteínas alergénicas de clase 1 de las gramíneas que tienen una homología de secuencia superior al 85% con respecto al Phl p 1 y que tienen, en las correspondientes posiciones de la secuencia aminoacídica, el mismo patrón de substitución/eliminación que se describe arriba para el Phl p 1.
La invención comprende además un péptido inmunológicamente activo que deriva de la secuencia aminoacídica del Phl p 1 y que contiene las ocho mutaciones descritas arriba.
En otro aspecto, la invención está dirigida a la molécula de ácido nucleico codificada para una variante de mutación del Phl p 1, para una variante homóloga del mismo o para un péptido derivado del mismo, tal y como se especifica arriba.
Las variantes de la secuencia de acuerdo con la invención se pueden preparar fácilmente comenzando por un cADN de la forma madura del alergeno Phl p 1 o de una variante homóloga del mismo, que no incluya la región que codifica el péptido señal y que se encuentre adecuadamente mutada en las posiciones deseadas.
En la SEQ. ID. Nº:1 se presenta la secuencia del cADN (bases mutadas en negrita) que codifica la variante preferida con las 8 substituciones correspondientes a la SEQ. ID. Nº:2.
El cADN de la SEQ. ID. Nº:1 fue expresado en células de Escherichia coli. La proteína recombinante producida ha reducido la reactividad IgE del suero de sujetos alérgicos al polen de Phleum pratense. En concreto, los inmunoensayos ELISA probaron que la reactividad IgE de la variante presentada en la SEQ. ID. Nº: 2 desciende un promedio de más del 95% en comparación con la de la proteína normal producida en la Escherichia coli [fig.1]. Este resultado fue confirmado mediante ensayos de inhibición (ELISA indirecta), que permitieron identificar los mismos epitopes en distintas proteínas. La fijación de la proteína Phl p 1 normal a IgE desde un pool de sueros RAST 5+ es inhibida al pretratar el suero con esta proteína [fig. 2, inhibidor normal]. Cuando el suero es preincubado con la proteína modificada presentada en la SEQ. ID. Nº: 2, la inhibición de la fijación de IgE al alergeno normal es menor del 5%, incluso a concentraciones altas del inhibidor [fig. 2, inhibidor modificado]. Estos resultados prueban claramente que los epitopes del alergeno Phl p 1 capaces de fijar IgE no están presentes en la variante modificada presentada en la SEQ. ID. Nº: 2.
La invención se relaciona además con un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para cualquiera de las variantes hipoalergénicas definidas arriba.
Dicho vector puede ser un plásmido, cósmido, virus, bacteriófago o cualquier otro vector habitualmente empleado en la ingeniería genética, y puede incluir, además de la molécula de ácido nucleico de la invención, elementos eucarióticos o procarióticos para el control de la expresión, tal como secuencias reguladoras para el inicio y fin de la transcripción, realzadores, promotores, secuencias de señales y similares.
Por otra parte, la invención comprende una célula receptora procariótica o eucariótica transformada en o transfectada con el vector de la invención. En principio, células procarióticas tales como Escherichia coli o Bacillus subtilis, o células eucarióticas tales como Saccharomyces cerevisiae serán usadas para la clonación del vector y la expresión del cADN.
Las variantes de la proteína de la invención pueden ser producidas como tales o como proteínas de fusión.
Gracias a la reducida reactividad IgE, dichas variantes pueden ser empleadas con propósitos terapéuticos en la preparación de vacunas para ser usadas en la inmunoterapia de las alergias al polen de las gramíneas.
Otro aspecto de la invención se relaciona, por lo tanto, con una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de la variante hipoalergénica de la invención, opcionalmente, en combinación con otros alergenos naturales o modificados de las gramíneas, junto con excipientes farmacéuticamente aceptables.
En una realización preferida, dicha composición farmacéutica es una vacuna para su uso en el tratamiento profiláctico y terapéutico de las enfermedades alérgicas, tales como el asma bronquial, la rinitis alérgica, la dermatitis alérgica y la conjuntivitis alérgica. Los principios y la práctica de vacunación son muy conocidos por los expertos en la técnica y están descritos, por ejemplo, en (6) y (7).
Los siguientes ejemplos ilustran la invención con mayor detalle.
Ejemplos
Los procedimientos empleados en los siguientes ejemplos, a no ser que se especifique lo contrario, son aquéllos descritos por Sambrook, Fritsch ET Maniatis en Molecular Cloning. A Laboratory Manual. II ed. Vol. 1, 2 y 3 CSH Lab Press, 1989.
Ejemplo 1 Mutagénesis sitio específica del cADN que codifica para el alergeno Phl p 1
La mutagénesis sitio específica del cADN que codifica para el alergeno Phl p 1 es llevada a cabo mediante amplificación PCR (Polymerase Chain Reaction, reacción en cadena de la polimerasa) del mismo cADN clonado en un vector procariótico (pBluescript).
Los oligonucleótidos utilizados como primer para la reacción PCR tienen las substituciones de bases requeridas. Para cada mutagénesis, se ha usado un par complementario de dichos oligonucleótidos, que se fijan a las correspondientes regiones de los dos filamentos de ADN. Tras la amplificación, la plantilla original inalterada es degradada selectivamente mediante digestión enzimática catalizada por la enzima de restricción Dpn 1. Las células de Escherichia coli son entonces transformadas con las moléculas mutadas. Los clones obtenidos a partir de colonias de bacterias individuales son secuenciados mediante el método de Sanger para verificar la correcta modificación de las bases y la ausencia de mutaciones específicas de cADN.
Ejemplo 2 Producción de la proteína Phl p 1 y la variante de la misma
El cADN normal del Phl p 1 y el cADN mutado, correspondiente a la SEQ. ID. Nº:1, tras clonarse en un vector de expresión (pCALn - Estratagen), se expresan en células de Escherichia coli de acuerdo con los protocolos normalizados, a las que se añade un cultivo en crecimiento exponencial (O.D. 600 nm = 0,6) de IPTG (isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido) para inducir la expresión del cADN. Las proteínas recombinantes son aisladas durante 2 horas tras la inducción de su síntesis mediante la lisis de las células bacteriales a través del tratamiento con ultrasonidos y la eliminación de las partículas celulares mediante centrifugación. Las proteínas son purificadas de sobrenandantes mediante cromatografía de afinidad, usando columnas en las que la matriz es adherida a la proteína calmodulina, que interactúa con la porción CBP (Calmodulin Binding Protein, proteína de fijación a la calmodulina) fusionada al alergeno.
Ejemplo 3 Ensayo ELISA para la reactividad IgE de la variante del Phl p 1
Cantidades iguales (0,1 \mug) del alergeno normal y de sus variantes mutadas en una solución tampón de carbonato/bicarbonato 50 mM a pH 9,6 son adsorbidas en pozos de platos de poliestireno para los ensayos ELISA mediante incubación a 4ºC durante 16 horas. Los antígenos son luego lavados con una solución de lavado (solución tampón de fosfato 60 mM a pH 6,5 con 0,05% de Tween-20) y los sitios libres son saturados con una solución diluyente (25% de suero equino, 1mM EDTA, 0,05% de Tween-20, 0,01% de Tiomersal en una solución tampón de fosfato 150 mM a pH 7,4). Se prepara una serie de disoluciones de pools de suero humano con reactividad RAST 5+ en una proporción de 1:2 en una solución tampón diluyente. Se añaden a cada muestra cantidades iguales (100 \mul) de varias diluciones de suero y se incuban a 25ºC durante 2 horas. Tras tres lavados, se añade antisuero conjugado de anti-IgE peroxidasa diluido 1:1.500 en una solución tampón diluyente y se incuba a 25ºC durante 1,5 horas. Tras tres lavados, se desarrolla la reacción colorimétrica mediante la adición de 100 \mul de reactivo Ultra Blu (Intergen, Milford, MA) y la incubación durante 15 minutos a 25ºC. Se detiene la reacción por adición de 100 \mul de HCL 1N y se evalúa a 450 nm con un espectrofotómetro.
Ejemplo 4 Inhibición EAST. Ensayo de inhibición ELISA para reactividad IgE de la variante del Phl p 1
Una cantidad (0,1 \mug) del alergeno normal Phl p 1 es adsorbida en pozos de platos ELISA, saturando los sitios libres tal y como se indica en el ejemplo 3. Se incuba una cantidad adecuada de un pool de suero humano con reactividad RAST 5+ al polen Phleum pratense con diferentes concentraciones de inhibidor a 25ºC durante 3 horas. Tras ello, se añade una cantidad igual (0,1 ml) de suero en cada pozo. Tras una incubación a 4ºC durante 16 horas, se llevan a cabo tres lavados con una solución tampón de fosfato 0,06 M a pH 6,5 con 0,05% de Tween-20. Luego, se añaden 0,1 ml de anticuerpo conjugado de anti-IgE peroxidasa adecuadamente diluido, para incubarlos a 25ºC durante 1,5 horas. Tras 3 lavados, se desarrolla una reacción colorimétrica mediante la adición de 0,1 ml del reactivo Ultra Blu (Intergen, Milford, MA) en cada pozo y la incubación durante 15 minutos a 25ºC. Se detiene la reacción mediante la adición de 0,1 ml de HCL 1N y se evalúa a 450 nm con un espectrofotómetro.
El porcentaje de inhibición se calcula mediante la siguiente fórmula:
100 x [(A-B)/A],
en la que A es la absorbancia a 450 nm en ausencia de inhibidor y B es la absorbancia en presencia de inhibidor.
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6) Paul, (1989), "Fundamental Immunology", Raven press, Nueva York.
7) Cryz, S. J. (1991), "Immunotherapy and Vaccines", VCH Verlagsgesellschaft.
<110> CONSIGLIO NAZIONALE DELLE RICERCHE
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<120> VARIANTES DE LAS PROTEÍNAS ALERGÉNICAS DE LA PHLEUM PRATENSE 
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<130> CNR
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<140>
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<141>
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<160> 2
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 720
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<212> ADN
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<213> Phleum pratense 
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<400> 1
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<212> PRT
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<213> Phleum pratense 
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2

Claims (12)

1. Una variante hipoalergénica del alergeno mayor Phl p 1, en la que al menos uno de los residuos de lisina presentes en las posiciones 28, 35, 44, 48, 179, 181, 183 y 185 de la proteína madura del Phl p 1 (SEQ. ID. Nº:2 en la que los residuos de las posiciones 28, 35, 44, 48, 179, 181, 183 y 185 son lisina) es substituido o eliminado.
2. Una variante de acuerdo con la reivindicación 1, que es homóloga al alergeno Phl p 1 en más del 85% y tiene en las correspondientes posiciones de la secuencia aminoacídica el mismo patrón de substitución/eliminación que se da en el Phl p 1.
3. Una variante de acuerdo con la reivindicación 1 y 2, en la que dichos residuos de lisina son substituidos por aminoácidos neutrales o polares.
4. Una variante de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, en la que dichos residuos de lisina son substituidos por el aminoácido alanina.
5. Una variante de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4, que tiene la secuencia SEQ. ID. Nº:2.
6. Un péptido que comprende una parte inmunológicamente activa de una variante según las reivindicaciones 1 a 5, que contiene las ocho mutaciones de lisina indicadas en la reivindicación 1.
7. Una molécula de ácido nucleico que codifica para una variante de la proteína según las reivindicaciones 1 a 5 o para un péptido según la reivindicación 6.
8. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 7, con secuencia SEQ. ID. Nº:1.
9. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de las reivindicaciones 7 y 8.
10. Una célula receptora transducida con el vector de la reivindicación 9.
11. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de una variante de la proteína de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5 o de un péptido de acuerdo con la reivindicación 6 junto con excipientes farmacéuticamente aceptables.
12. Una composición de acuerdo con la reivindicación 11, en forma de vacuna.
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