DE60110096T2

DE60110096T2 - Varianten des allergenen proteins phl p 1 aus phleum pratense

Info

Publication number: DE60110096T2
Application number: DE60110096T
Authority: DE
Inventors: Monica Sturaro; Angelo Viotti; Paolo Falagiani; Giovanni Mistrello; Daniela Roncarolo; Stefania Zanotta
Original assignee: Consiglio Nazionale delle Richerche CNR
Current assignee: Consiglio Nazionale delle Richerche CNR
Priority date: 2000-09-12
Filing date: 2001-09-11
Publication date: 2006-03-02
Anticipated expiration: 2021-09-12
Also published as: DE60110096D1; ES2238487T3; ES2238487T5; WO2002022679A2; WO2002022679A3; AU2001295558A1; US7029686B2; IT1318692B1; ITMI20001987A0; DE60110096T3; ITMI20001987A1; EP1317484B2; US20020064530A1; EP1317484A2; EP1317484B1; ATE293128T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Varianten eines Allergens von Pflanzenpollen der Spezies Phleum pratense.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Aminosäuresequenzen von hyperallergenen Varianten des Allergens Phl p 1, die durch eine seitenspezifische Mutagenese der Nukleotidsequenz, die für dieses Allergen kodiert, erhalten werden. Die hyperallergenen Varianten können für eine spezifische Immuntherapie von allergenen Pathologien, die durch Graminaceae-Pollen verursacht werden, verwendet werden.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Graminaceae stellen die Hauptursache von Allergien im mediterranen Raum dar. Es sind dreizehn unterschiedliche Arten von allergenen Proteinen, die innerhalb dieser Familie phylogenetisch konserviert sind, in deren Pollen identifiziert worden. Für jedes Allergen bilden die homologen Proteine, die in den verschiedenen Spezies vorkommen, eine Klasse, in der mit einer hohen Kreuzreaktivität gegenüber den Immunglobulinen E (IgE) die Antikörper die allergische Antwort modulieren.
Die Klassen 1 und 5 werden durch Hauptallergene, d.h. die klinisch am meisten relevanten Allergene, gebildet, da die IgEs als Bestandteile von diesen Gruppen statistisch gesehen in mehr als 80% der Testpersonen, die allergisch gegenüber Graminaceae sind, vorhanden sind.
Phleum pratense, eine Graminaceae, ist aufgrund ihres Nutzens als Futterpflanze weit verbreitet und ist daher von einem allergologischen Standpunkt aus gesehen von besonderer Bedeutung.
Das Hauptallergen Phl p 1 von Phleum pratense (beschrieben in GenBank unter der Hinterlegungsnummer X78813) ist ein Protein, das aus 240 Aminosäuren besteht und das in vivo einen der Bestandteile der Zellwand bildet (beta-Expansin). Dieses Allergen weist eine mehr als 90%ige Homologie zu den anderen Proteinen der Klasse 1 auf, die bis jetzt charakterisiert worden sind. Eine der immunchemischen Eigenschaften, die Phl p 1 mit den anderen Allergenen der selben Gruppe teilt, ist das Vorliegen von gemeinsamen Epitopen für IgEs. Dadurch kann das Allergen Phl p 1 sowohl für die Diagnose als auch für die Therapie von Allergien gegen Graminaceae-Pollen, die durch Hauptallergene der Klasse 1 verursacht werden, unabhängig von dem Ursprung der Spezies verwendet werden.
Die einzige ursächliche Behandlung von Allergien stellt eine spezifische hyposensibilisierende Immuntherapie (SIT) dar. Diese besteht aus der Verabreichung von steigenden Dosen der Substanz, die die Allergie auslöst, wobei dadurch eine graduelle Desensibilisierung gegenüber der Substanz in dem Patienten ausgelöst wird.
Eine Immuntherapie kann jedoch selbst zu ernsthaften systemischen Wirkungen führen, was deren Verwendung einschränkt.
Die Fortschritte bei der SIT, die darauf abzielten, eine wirksamere, sichere Behandlung zu gewährleisten, umfassen die Verwendung von mutagenisierten rekombinanten Allergenen mit einer verminderten allergenen Aktivität (Reaktivität gegen IgEs), während deren Potential zur Bewirkung von günstigen immunologischen Veränderungen unbeeinflusst bleibt.
Die WO 99/47680 offenbart nicht-natürlich vorkommende Allergenmutanten mit einer verminderten IgE-Bindung. Das Wespengiftallergen Ves V 5 und das Pollenallergen Bet V 1 stellen Beispiele von Allergenmutanten dar, die eine Lys-Substitution in deren Proteinsequenz aufweisen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Analyse der Struktur von Phl p 1 (natürliche Form, GenBank X78813) und insbesondere deren Profil der hydrophilen Eigenschaften hat es ermöglicht, die Regionen zu identifizieren, die offensichtlich für die Bindung an IgEs verantwortlich sind. Es wurde auf diese Weise bestätigt, dass die allergene Wirkung von Phl p 1 verringert werden kann, indem deren Aminosäuresequenz zumindest an einer der Positionen 28, 35, 44, 48, 179, 181, 183, 185, an denen ein Rest der Aminosäure Lysin vorhanden ist, ausgetauscht wird. "Austausch" bezeichnet hier eine Substitution von einem oder mehreren Resten an den genannten Positionen, vorzugsweise mit neutralen oder polaren Aminosäuren oder eine Deletion von einem oder mehreren Lys-Resten, die in der natürlichen Form vorhanden sind oder die gleichzeitige Substitution und Deletion von zwei oder mehreren Resten.
Die bevorzugten Mutationen durch Substitution sind solche, in denen ein Alanin-Rest an jede der oben genannten 8 Positionen eingefügt wird. Am meisten bevorzugt ist die Variante, in der die 8 Substitutionen, die in SEQ ID NO:2 angegeben sind, gleichzeitig vorliegen.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Allergenproteine von Graminaceae der Klasse I mit einer Sequenzhomologie von mehr als 85% im Vergleich zu Phl p 1 und dem selben Substitutions-/Deletionsmuster, wie es oben für Phl p 1 beschrieben wurde, an den korrespondierenden Positionen der Aminosäuresequenz.
Die Erfindung umfasst weiter ein immunologisch aktives Peptid, das sich von der Aminosäuresequenz von Phl p 1 ableitet und die oben beschriebenen 8 Mutationen enthält.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Nukleinsäuremolekül, das für eine Mutationsvariante von Phl p 1, für eine homologe Variante davon oder für ein davon abgeleitetes Peptid, wie oben definiert, kodiert.
Die erfindungsgemäßen Sequenzvarianten können leicht hergestellt werden, ausgehend von cDNA der reifen Form des Allergens Phl p 1 oder einer homologen Variante davon, die nicht die Region einschließt, die für das Signalpeptid kodiert, und an den gewünschten Positionen passend mutagenisiert ist.
Die cDNA-Sequenz (mutagenisierte Basen in Fettschrift), die für die bevorzugte Variante mit den 8 Substitutionen, die der SEQ ID NO:2 entspricht, kodiert, ist in SEQ ID NO:1 dargestellt.
Die cDNA von SEQ ID NO:1 wurde in Escherichia coli-Zellen exprimiert. Das hergestellte rekombinante Protein zeigte eine verringerte IgE-Reaktivität in dem Serum aus Testpersonen, die allergisch gegen Phleum pratense-Pollen sind. Insbesondere wurde mittels ELISA-Immunoassays nachgewiesen, dass sich die IgE-Reaktivität der Variante, die in SEQ ID NO:2 dargestellt ist, im Durchschnitt um mehr als 95% im Vergleich zu der des normalen Proteins, das in Escherichia coli hergestellt wor den ist, verringerte (1). Dieses Ergebnis wurde durch Inhibitionstests (indirekter ELISA) bestätigt, welche es ermöglichten, die selben Epitope in verschiedenen Proteinen zu identifizieren. Die Bindung von normalem Phl p 1-Protein an IgEs von einem Pool aus RAST 5 + Seren ist inhibiert, wenn das Serum mit diesem Protein vorbehandelt wurde (2, normaler Inhibitor). Wenn das Serum mit dem modifizierten Protein, das in SEQ ID NO:2 dargestellt ist, prä-inkubiert wird, ist die Inhibition der IgE-Bindung an das normale Allergen geringer als 5%, selbst bei hohen Konzentrationen des Inhibitors (2, modifizierter Inhibitor). Diese Ergebnisse bestätigen klar, dass die Epitope des Allergens Phl p 1, die in der Lage sind, IgEs zu binden, nicht in der modifizierten Variante, wie sie in SEQ ID NO:2 dargestellt ist, vorhanden sind.
Die Erfindung betrifft weiter einen Expressionsvektor, der ein Nukleinsäuremolekül umfasst, das für eine beliebige hypoallergene Variante, wie sie oben definiert wurde, kodiert.
Der Vektor kann ein Plasmid, Kosmid, Virus, Bakteriophage oder ein anderer Vektor sein, der üblicher Weise für eine genetische Manipulation verwendet wird und kann zusätzlich neben dem erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül eukaryontische oder prokaryontische Elemente zur Kontrolle der Expression einschließen, wie z.B. regulatorische Sequenzen für die Initiation und die Termination der Transkription, Enhancer, Promotoren, Signalsequenzen und dergleichen.
Darüber hinaus umfasst die Erfindung eine prokaryontische oder eukaryontische Wirtszelle, die mit dem erfindungsgemäßen Vektor transformiert oder transfiziert worden ist. Grundsätzlich werden prokaryontische Zellen wie Escherichia coli oder Bacillus subtilis oder eukaryontische Zellen wie Saccharomyces cerevisiae zur Klonierung des Vektors und der Expression der cDNA verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Proteinvarianten können entweder als solche oder als Fusionsproteine hergestellt werden.
Dank der verminderten IgE-Reaktivität können diese Varianten für therapeutische Zwecke bei der Herstellung von Vakzinen verwendet werden, die in der Immuntherapie von Allergien gegen Graminaceae-Pollen Einsatz finden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft daher eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge der erfindungsgemäßen Hyperallergenvariante umfasst, gegebenenfalls in Kombination mit anderen natürlichen oder modifizierten Allergenen von Graminaceae, zusammen mit pharmazeutisch annehmbaren Arzneistoffträger.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die pharmazeutische Zusammensetzung ein Vakzin zur Verwendung für die prophylaktische oder therapeutische Behandlung von allergischen Erkrankungen wie Bronchialasthma, allergische Rhinitis, allergische Dermatitis, allergische Konjunktivitis. Die Grundsätze der Impfung und deren Durchführung sind für den Fachmann bekannt und beispielsweise beschrieben in (6) und (7).
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung genauer.
BEISPIELE
Die Verfahren, die in den folgenden Beispielen verwendet werden, sind, soweit nicht anders angegeben, solche, die in Sambrook, Fritsch ET Maniatis "Molecular cloning. A laboratory manual", 2. Ausgabe, Band 1-2-3, CSH Lab Press, 1989, beschrieben worden sind.
BEISPIEL 1 - Stellenspezifische Mutagenese der cDNA, die für das Allergen Phl p 1 kodiert
Die stellenspezifische Mutagenese der cDNA, die für das Allergen Phl p 1 kodiert, wird durch eine PCR-Amplifikation (Polymerasenkettenreaktion) der selben cDNA, die in einem prokaryontischen Vektor kloniert ist (pBluescript), durchgeführt.
Die bei der PCR-Reaktion als Primer verwendeten Oligonukleotide weisen die erforderlichen Substitutionen von Basen auf. Es wurde für jede Mutagenese ein komplementäres Paar von diesen Oligonukleotiden verwendet, die an die korrespondierenden Regionen der beiden DNA-Stränge binden. Nach der Amplifikation wird das ursprüngliche, unveränderte Template selektiv durch einen enzymatischen Verdau, der durch das Restriktionsenzym Dpn 1 katalysiert wird, abgebaut. Escherichia coli-Zellen werden dann mit den mutagenisierten Molekülen transformiert. Klone, die von einzelnen Bakterienkolonien erhalten werden, werden entsprechend der Sangermethode sequenziert, um die korrekte Modifikation der Basen und das Fehlen von unspezifischen cDNA-Mutationen zu verifizieren.
BEISPIEL 2 - Herstellung des Proteins Phl p 1 und der Varianten davon
Normale cDNA von Phl p 1 und mutagenisierte cDNA, die der SEQ ID NO:2 entspricht, werden nach der Klonierung in einem Expressionsvektor (pCALn-Stratagene) in Escherichia coli-Zellen entsprechend den Standardprotokollen exprimiert, wobei zu den Kulturen während des exponentiellen Wachstums (O.D. 600 nm = 0,6) IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) zur Induktion der Expression der cDNA zugegeben wird. Die rekombinanten Proteine werden zwei Stunden nach der Induktion ihrer Synthese durch Lyse der bakteriellen Zellen über Sonifizierung und Entfernen der Zelltrümmer durch Zentrifugation isoliert. Die Proteine werden von dem Überstand durch Affinitätschromatographie, unter Verwendung von Säulen, bei denen die Matrix an das Calmodulin-Protein gebunden ist, das mit dem CBP-Teil (Calmodulin-Bindeprotein), das an das Allergen fusioniert ist, interagiert, gebunden.
BEISPIEL 3 - ELISA-Assay zur IgE-Reaktivität der Phl p 1-Variante
Es werden gleiche Mengen (0,1 μg) des normalen Allergens und dessen mutagenisierten Varianten in 50 mM Carbonat-/Bicarbonat-Puffer, pH 9,6, auf Vertiefungen von Polystyrolplatten für ELISA-Tests durch eine Inkubation von 4°C für 16 Stunden adsorbiert. Die Antigene werden dann mit einer Waschlösung gewaschen (60 mM Phosphat-Puffer, pH 6,5, enthaltend 0,05% Tween-20) und die freien Stellen werden mit verdünnter Lösung gesättigt (25% Pferdeserum, 1 mM EDTA, 0,05% Tween-20, 0,01% Thiomersal in 150 mM Phosphat-Puffer, pH 7,4). Es werden Serienverdünnungen von menschlichen Serumpools mit RAST 5 + Reaktivität in einem 1:2-Verhältnis im Verdünnungspuffer hergestellt. Gleiche Mengen (100 μl) der verschiedenen Serumverdünnungen werden zu jeder Probe zugegeben und bei 25°C für 2 Stunden inkubiert. Nach dreimaligen Waschen wird das Anti-Human-IgE-Peroxidase-konjugierte Antiserum, das in einem Verdünnungspuffer 1:1500 verdünnt ist, zugegeben und für 1,5 Stunden bei 25°C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen wird die Farbreaktion durch Zusatz von 100 μl Ultra-Blu-Reagens entwickelt (Intergen, Milford, MA) und bei 25°C für 15 Minuten inkubiert. Die Reaktion wird durch Zusatz von 100 μl 1 N HCl gestoppt und bei 450 nm mit einem Spektrophotometer ausgewertet.
BEISPIEL 4 - EAST-Inhibition ELISA-Inhibitions-Assay für die IgE-Reaktivität der Phl p 1-Variante
Eine Menge (0,1 μg) des normalen Allergens Phl p 1 wird auf Vertiefungen von ELISA-Platten adsorbiert und die freien Stellen werden, wie in Beispiel 3 gezeigt, gesättigt. Eine passende Menge eines Pools von humanen Seren mit RAST 5+ Reaktivität gegen Phleum pratense-Pollen wird bei verschiedenen Konzentrationen eines Inhibitors bei 25°C für 3 Stunden inkubiert. Danach wird eine gleiche Menge (0,1 ml) Serum zu jeder Vertiefung zugegeben. Nach einer Inkubation von 4°C für 16 Stunden erfolgt ein dreimaliges Waschen mit 0,06 M Phosphat-Puffer, pH 6,5, enthaltend 0,05% Tween-20; dann werden 0,1 ml von zweckmäßig verdünnten Anti-Human-IgE-Peroxidase-konjugierten Antikörpern zugegeben, und bei 25°C für 1,5 Stunden inkubiert. Nach dreimaligem Waschen wird die Farbreaktion entwickelt, indem 0,1 ml Ultra-Blu-Reagens (Intergen, Milford, MA) zu jeder Vertiefung zugegeben wird und für 15 Minuten bei 25°C inkubiert wird. Die Reaktion wird durch Zusatz von 0,1 ml 1 N HCl gestoppt und bei 450 nm mit einem Spektrophotometer ausgewertet.
Der Prozentsatz der Inhibition wird berechnet, indem die folgende Formel verwendet wird: 100 × [(A – B)/A], wobei A die Adsorption bei 450 nm in Abwesenheit des Inhibitors und B die Absorption in der Gegenwart des Inhibitors bezeichnet.
LITERATURSTELLEN

1) Laffer S., Valenta R., Vrtala S., Susani M., van Ree R., Kraft D., Scheine O., Duchene M., (1994) "Complementary DNA cloning of the major allergen Phl p 1 from timothy grass (Phleum pratense); recombinant Phl p 1 inhibSHT IgE binding to group I allergens from eight different grass species". J. Allergy Clin. Immunol. 94 (4): 689–698
2) Laffer S., Duchene M., Reimitzer I., Susani M., Mannhalter C., Kraft D., Valenta R., (1996) "Common IgE-epitopes of recombinant Phl p 1, the major timothy grass pollen allergen and natural group I grass pollen isoallergens". Mol. Immunol. 33 (4–5): 417–426
3) Bousquet J., Lockey R., Malling H.J., (1998). "Allergen immunotherapy: therapeutic vaccines for allergic diseases. A WHO position paper". J. Allergy Clin. Immunol. 102 (4 Pt 1): 558–562
4) Karaayvaz M., Erel F., Caliskaner Z., Ozanguc N., (1999). "Systemic reactions two to allergen immunotherapy". J. Investig. Allergol. Clin. Immunol. 9 (1): 39–44
5) Ferreira F., Ebner C., Kramer B., Casari G., Briza P., Kungl A.J., Grimm R., Jahn-Schmid B., Breiteneder H., Kraft D., Breitenbach M., Rheinberger H.J., Scheiner O., (1998). "Modulation of IgE reactivity of allergens by site-directed mutagenesis: potential use of hypoallergenic variants for immunotherapy". FASEB J. 12: 231–242
6) Paul, (1989), "Fundamental Immunology", Raven press, New York.
7) Cryz, S. J. (1991), "Immunotherapy and Vaccines", VCH Verlagsgesellschaft.

SEQUENZ-PROTOKOLL

Claims

Hypoallergene Variante des Phl p 1-Hauptallergens, wobei mindestens einer der Lys-Reste an den Positionen 28, 35, 44, 48, 179, 181, 183, 185 des reifen Phl p 1 -Proteins (SEQ ID NO: 2, worin die Reste an den Positionen 28, 35, 44, 48, 179, 181, 183 und 185 Lysin sind) subsituiert oder deletiert ist.
Variante nach Anspruch 1, die um mehr als 85% homolog zu dem Phl p 1-Allergen ist und an den korrespondierenden Positionen der Aminosäuresequenz das selbe Substitutions-/Deletitonsmuster aufweist als in Phl p 1.
Variante nach einem der Ansprüche 1–2, worin die Lys-Reste mit neutralen oder polaren Aminosäuren substituiert sind.
Variante nach einem der Ansprüche 1–3, worin die Lys-Reste mit der Aminosäure Alanin substituiert sind.
Variante nach einem der Ansprüche 1–4, mit der Sequenz SEQ ID NO: 2.
Peptid, umfassend einen immunologisch aktiven Teil einer Variante der Ansprüche 1–5, welche die acht in Anspruch 1 aufgeführten Lys-Mutationen enthält.
Nukleinsäuremolekül, das für eine Proteinvariante nach einem der Ansprüche 1–5 oder für ein Peptid nach Anspruch 6 kodiert.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 7, mit der Sequenz SEQ ID NO: 1.
Vektor, umfassend das Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 7–8.
Wirtszelle, die mit dem Vektor des Anspruchs 9 transduziert worden ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine wirksame Menge einer Proteinvariante nach einem der Ansprüche 1–5 oder ein Peptid nach Anspruch 6 zusammen mit pharmazeutisch verträglichen Arzneistoffträgern.
Zusammensetzung nach Anspruch 11, in der Form eines Vakzins.