DE60317189T2

DE60317189T2 - ALLERGEN AUS BEIFUß-POLLEN

Info

Publication number: DE60317189T2
Application number: DE60317189T
Authority: DE
Inventors: Fátima FERREIRA; Gudrun Hubinger; Christof Ebner; Klaus Richter
Original assignee: Biomay AG
Current assignee: Biomay AG
Priority date: 2002-06-04
Filing date: 2003-06-03
Publication date: 2008-08-14
Anticipated expiration: 2023-06-04
Also published as: CA2487915C; EP1509606A1; DK1509606T3; JP2005534297A; ATE377079T1; ES2291648T3; AU2003238199B2; CA2487915A1; EP1509606B1; JP4401288B2; EP1369483A1; DE60317189D1; AU2003238199A1; US20050215766A1; WO2003102189A1

Description

Pollenkörner, die von Kräutern stammen, insbesondere solche, die zu der sehr umfangreichen Pflanzenfamilie Compositae oder Asteraceae gehören, sind weltweit bekannte Quellen für Allergene. Die drei bedeutendsten windbestäubten Gattungen in dieser Familie sind Ambrosia (Traubenkraut), Parthenium (Mutterkraut) und Artemisia vulgaris (Beifuß). Im Spätsommer und im Herbst sind Beifußpollen eine der Hauptursachen für allergische Reaktionen in Mitteleuropa und Teilen von Asien (J. Charpin, R. Surinyach und A. W. Frankland (1974) Atlas of European Allergenic Pollens (Paris:Sandoz)). Annähernd 10% der Patienten, die an Pollinosis (Heuschnupfen) leiden, werden mit Beifußpollen sensibilisiert. Mit einer Prävalenz von ungefähr 50% bei atopischen Individuen sind Traubenkrautpollen die Hauptquelle an allergenen Proteinen in den Vereinigten Staaten und Kanada (L. P. Boulet, H. Turcotte, C. Laprise, C. Lavertu, P. M. Bedard, A. Lavoie und J. Hebert (1997) Comparative degree and type of sensitization to common indoor and outdoor allergens in subjects with allergic rhinitis and/or asthma. Clin. Exp. Allergy 27, 52). In Europa ist eine Allergie auf Traubenkraut nicht die Hauptursache für Pollinosis, sie nimmt jedoch schnell zu. Traubenkraut wurde erst zu Beginn des letzten Jahrhunderts in Europa eingeführt und war auf Ungarn beschränkt. Während des Zweiten Weltkriegs wurde es in Frankreich eingeführt, anschließend nach und nach verbreitet und tritt nun im Rhonetal (Frankreich), in Norditalien, östlichen Teilen von Österreich, Ungarn und Bulgarien übermäßig auf (G. D'Amato, F.T. Spieksma, G. Liccardi, S. Jager, M. Russo K. Kontou-Fili, H. Nikkels, B. Wuthrich und S. Bonini (1998) Pollen-related allergy in Europe. Allergy 53, 567).
Heutzutage wird weitgehend anerkannt, dass rekombinante Allergene viel versprechende Werkzeuge zur Diagnose und Therapie von Typ-I-Allergie darstellen. Der Wert dieser Moleküle für Diagnosezwecke wurde eingehend bewertet und für die routinemäßige Diagnose von Allergien auf bestimmte Inhalate, einschließlich Allergien auf Baum-(Birken-) und Graspollen, ist bereits eine Reihe von rekombinanten Allergenen verfügbar (R. Valenta et al. (1992) Int. Arch. Allergy Immunol. 97, 287; O. Scheiner und D. Kraft (1995) Allergy 50, 384; D. Kraft et al. (1998) Allergy 53, 62; D. Kraft et al. (1999) Int. Arch. Allergy Immunol. 118, 171), jedoch nicht für Allergie gegen Kräuterpollen. Zwei wichtige allergene Verbindungen der Traubenkrautpollen, die als Antigene E (Amb a 1) und K (Amb a 2) bekannt sind, wurden charakterisiert und es hat sich gezeigt, dass sie saure Proteine von ungefähr 38.000 Da sind (T. P. King (1980) Allergy 35, 187). Das Klonieren der cDNA von Amb a 1 und Amb a 2 offenbarte, dass diese Allergene in höchsten Maße zueinander homolog sind und zu der Familie der Pektatlyaseproteine gehören (T. Rafnar et al. (1991) J. Biol. Chem. 266, 1229; B. L. Rogers et al. (1991) J. Immunol. 147, 2547). Bis heute wurden keine Informationen über die vollständige Struktur und keine Daten über das molekulare Klonieren irgendeines Allergens der Beifußpollen veröffentlicht. Die einzige Ausnahme ist ein Allergen der Beifußpollen, das als Art v 1 bezeichnet wird und in der WO 99/49045 offenbart ist. Art v 1 ist nicht mit Amb a 1 oder irgendeinem anderen charakterisierten Traubenkrautallergen verwandt. Verschiedene Berichte zeigten, dass Traubenkraut- und Beifußpollen gemeinsame Allergenstrukturen, d. h. Antigene, die von kreuzreaktiven IgE-Antikörpern in verschiedenen Allergenquellen erkannt werden, teilen (C. Fernandez et al. (1993) J. Allergy Clin. Immunol., 92, 660; R. Hirschwehr et al. (1998) J. Allergy Clin. Immunol. 101, 196; H. S. Park et al. (1994) J. Korean Med. Sci. 9, 213). Die Erkennung von IgE durch diese gemeinsamen Antigene wird nach dem Kontakt mit verschiedenen Allergenquellen allergische Reaktionen in sensibilisierten Patienten auslösen. Die Charakterisierung von Allergenen der Beifußpollen und die Identifizierung gemeinsamer Allergenstrukturen bei Traubenkrautpollen wird daher grundlegende Informationen für die Auswahl und Produktion rekombinanter Allergene bereitstellen, die zur Diagnose und Therapie einer Allergie gegen Kräuterpollen ausreichen.
Die WO 96/13589 offenbart Peptide, die mindestens ein T-Zell-Epitop umfassen, das ausgewählt ist aus den Allergenen Amb a I.1, Amb a I.2, Amb a I.3, Amb a I.4 und Amb a II. Die Quelle für das Antigen ist Ambrosia artemisiifolia, das in Nordamerika und Kanada die Hauptursache für Heuschnupfen im Spätsommer ist.
Ferreira et al., International Arches of Allergy and Immunology, S. 77–79 (2001) berichten von dem Klonieren möglicher Allergene der Beifußpollen unter Verwenden einer Reihe von 12 monoklonalen Antikörpern, die gegen Proteine der Beifußpollen erzeugt wurden. Die Veröffentlichung offenbart jedoch keine Sequenz irgendeines Proteins.
Hirschwehr et al., Journal of Allergy and Clinical Immunology ... (1998), S. 196–206 beschreiben Immunoblotting und Inhibierungsversuche zur Untersuchung der kreuzreaktiven Allergene der Beifuß- und Traubenkrautpollen.
Es ist somit eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Allergen aus Beifußpollen zu identifizieren, das eine Typ-I-Allergie auslösen kann.
Den Erfindern gelang das Isolieren von vier bona fide- und vollständigen cDNA-Klonen, die einem 40,9 kDa großen Allergen der Beifuß-(Artemisia vulgaris-)Pollen entsprechen. Die Aminosäuresequenz des neuen, 40,9 kDa großen Pollenallergens ist in der SEQ ID NO:1 gezeigt.
Die Erfindung betrifft ein Allergen, das aus einem Polypeptid besteht, das ein Fragment aus mindestens 18 Aminosäuren der Aminosäuresequenz, wie sie in der SEQ ID NO:1 gezeigt ist, umfasst. Ein solches Polypeptid umfasst mindestens 18 aufeinander folgende Aminosäuren der Sequenz, wie sie in der SEQ ID NO:1 gezeigt ist. Die Länge des Fragments beträgt vorzugsweise mindestens 21 Aminosäuren, besonders bevorzugt mindestens 25 Aminosäuren, insbesondere bevorzugt mindestens 35 Aminosäuren und ganz besonders bevorzugt mindestens 50 Aminosäuren der Aminosäuresequenz, wie sie in der SEQ ID NO:1 gezeigt ist.
Das Allergen besteht vorzugsweise aus einem Polypeptid, wodurch die Länge des Polypeptids mindestens 25 Aminosäuren, ganz besonders bevorzugt mindestens 35 Aminosäuren beträgt. In weiteren Ausführungsformen besteht das Polypeptid der Erfindung aus mindestens 18 oder mindestens 21 oder mindestens 30 benachbarten Aminosäuren aus der Aminosäuresequenz, wie sie in der SEQ ID NO:1 gezeigt ist. In weiteren Aspekten beträgt die Länge des Polypeptids nicht mehr als 100 oder 50 oder 30 Aminosäuren. Polypeptide, die aus mindestens 7 Aminosäuren bestehen, können von T-Zellen erkannt werden (T-Zell-Epitope).
Ein noch weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Allergen, das aus einem Polypeptid besteht, das ein Fragment der Aminosäuresequenz, wie sie in der SEQ ID NO:1 gezeigt ist, umfasst, wobei das Fragment in der Lage ist, an IgE-Antikörper eines Individuums, das auf Beifußpollen allergisch ist, zu binden. Die Bezeichnung „IgE-Antikörper" bezeichnet eine Antikörperzubereitung, die mit an sich bekannten Verfahren erhalten werden kann. Bei empfindlichen Menschen führt der Kontakt mit Allergenen zu einem unmittelbaren Typ (IgE-vermittelt) einer allergischen Reaktion, die einen zweistufigen Prozess darstellt:

(1) Beim ersten Kontakt induzieren allergene Proteine die Synthese von IgE durch B-Zellen (Vercelli und Geha, 1989, J. Allergy Clin. Immunol. 9: 75–83). Diese spezifischen IgE-Antikörper binden dann über hochaffine Fcε-Rezeptoren (FcεRI) an die Oberflächen der Mastzellen und Basophilen.
(2) Bei nachfolgenden Kontakten binden Allergene an diese spezifischen IgE-Antikörper und vernetzen diese, was zu einer Freisetzung der vorgeformten und neu synthetisierten Entzündungsmediatoren (z. B. Histamin) und der chemotaktischen Substanzen (z. B. plättchenaktivierender Faktor) führt.

In Schritt (1) benötigt die Produktion von Allergen-spezifischem IgE durch B-Lymphozyten die „Hilfe" von T-Lymphozyten (Vercelli und Geha, 1989, J. Allergy Clin. Immunol. 9: 75–83), die durch lineare Peptidfragmente des Allergens aktiviert werden. Diese Peptide werden von Antigen-präsentierenden Zellen durch Verarbeitung des Antigens erzeugt und werden mit Molekülen des Haupthistokompatibilitätskomplexes (major histocompatibility complex, MHC) an der Zelloberfläche dargeboten, wo sie für die Erkennung und Bindung an den T-Zell-Rezeptor verfügbar sind (Schwartz, 1985, Annu. Rev. Immunol. 3: 237-255; Rothbart et al. 1989, Int. Immunol. 1: 479–486). In Schritt (2) zirkulieren Allergen-spezifische IgE-Antikörper, die von B-Zellen erzeugt wurden, und binden an FcεRI-Rezeptoren auf Mastzellen und Basophilen, wodurch sie als Rezeptor für das Allergen dienen. Eine Vernetzung dieser an die Zelloberfläche gebundenen IgE-Antikörper durch das Allergen stellt das Signal für die Freisetzung der vorgeformten und neu synthetisierten Entzündungsmediatoren und chemotaktischen Substanzen dar, was zu der typischen, allergischen Entzündungsreaktion führt.
Ein Individuum, das auf Beifußpollen allergisch ist, ist ein Individuum, das spezifische IgE-Antikörper zeigt, die Proteine von Beifußpollen erkennen, und das typische allergische Symptome (IgE-vermittelt) aufweist, wenn es Beifußpollen ausgesetzt wird. Solche allergischen Reaktionen können auch durch die Exposition gegen homologe Antigene, die in anderen Allergenquellen vorhanden sind, ausgelöst werden. Dieses Phänomen wird als Kreuzreaktivität definiert. Die Auswahl von Patienten, die auf Beifußpollen allergisch sind, wurde anhand der typischen Anamnese, eines positiven Haut-Pricktests und eines Radio-Allergo-Sorbent-Tests „RAST" > 3,5 durchgeführt.
Ein Polypeptid kann an einen Antikörper binden, wenn seine Affinität zu dem Antikörper signifikant höher als diejenige einer Referenzverbindung ist, die nicht an den Antikörper bindet. Die Bindung von spezifischen IgE-Antikörpern an ein bestimmtes Polypeptid oder Allergen kann mit verschiedenen Verfahren, z. B. RAST, einem Immunoblot, ELISA, unter Verwenden von Seren gesunder, nicht allergischer Individuen (anhand der Anamnese, eines negativen Haut-Pricktests, eines negativen RAST), die keine Allergenspezifischen IgE-Antikörper zeigen, als Referenz, bestimmt werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist das Polypeptid in der Lage, an IgE-Antikörper eines Individuums, das auf Beifußpollen allergisch ist, zu binden. Die vorliegende Erfindung ermöglicht, verschiedene Allergenstrukturen zu identifizieren, die Beifußpollen und Traubenkrautpollen gemeinsam sind. Diese Informationen sind für die Auswahl und Herstellung rekombinanter Allergene nützlich, die für die Diagnose und Therapie einer Allergie auf Unkrautpollen ausreichen. Peptide und Polypeptide, die solche gemeinsamen Allergenstrukturen enthalten, werden von der vorliegenden Erfindung umfasst.
Während der Reinigung von natürlichem Amb a 1 spaltet eine Trypsin-gleiche Protease der Pollen dieses Allergen. Die Reinigung führt daher oftmals zu der Isolierung eines 38 kDa großen Allergens in voller Länge plus zweier Fragmente mit einem Molekulargewicht von 26 und 12 kDa, die entsprechend als alpha (Aminosäuren 187 bis 396, die Nummerierung schließt das Signalpeptid ein) und beta (Aminosäuren 43 bis 180, die Nummerierung schließt das Signalpeptid ein) bezeichnet werden. Alle Ketten sind noch in hohem Maße mit polyklonalen Kaninchen-Antikörpern und humanem IgE von allergischen Patienten reaktionsfähig. Es wird erwartet, dass proteolytische Fragmente des natürlichen, 40,9 kDa großen Beifußpollen-Allergens, die diesen Ketten entsprechen, auch an IgE-Antikörper allergischer Patienten binden würden. Das erste, das der Beta-Kette entspricht, umfasst die Aminosäuren 21 bis 180 und das zweite, das der Alpha-Kette entspricht, umfasst die Aminosäuren 181 bis 396, wobei sich beide Nummerierungen auf die SEQ ID NO:1 beziehen. Erwartungsgemäß besitzen beide Ketten Epitope, die auch in den Amb a 1-Ketten vorhanden sind, was zu der gleichen Reaktivität mit IgE führt. Die Erfindung betrifft ein Polypeptid, das ein Fragment mit der Sequenz, wie sie in der SEQ ID NO:1 gezeigt ist, umfasst, wobei das Fragment aus den Aminosäuren 21 bis 180 oder 181 bis 396 der Sequenz, wie sie in der SEQ ID NO:1 gezeigt ist, besteht.
In einer Ausführungsform ist das Polypeptid der Erfindung kein Polypeptid, das aus der Aminosäuresequenz LENGAIFVASG (SEQ ID NO:10) besteht.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform sind die Polypeptide isolierte Polypeptide. d. h. sie liegen in im Wesentlichen reiner Form vor. „Im Wesentlichen rein" bedeutet, dass die Polypeptide durch die Abtrennung der Polypeptide von anderen Verbindungen zu mindestens 75%, vorzugsweise mindestens 90%, besonders bevorzugt 95% rein sind. Die Reinheit der Polypeptide kann von einem Fachmann unter Verwenden von in dem Bereich bekannten Techniken, z. B. mittels SDS-PAGE und anschließender Proteinfärbung, bestimmt werden. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) und Massenspektrometrie sind Verfahren, die zum Analysieren von Polypeptiden und ebenso kurzen Peptiden geeignet sind.
Die Polypeptide können auf verschiedene Weisen hergestellt werden. Die Polypeptide können mittels chemischer Synthese, vorzugsweise durch Anwenden von Festphasenverfahren hergestellt werden. Verfahren zur chemischen Synthese von Peptiden sind einem Fachmann bekannt (siehe z. B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149, 1963; Stewart et al., „Solid Phase Peptide Synthesis" (zweite Ausgabe), Pearce Chemical Co., Rockford, IL, 1984 und Bayer und Rapp, Chem. Pept. Prot. 3:3 (1986); und Atherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1989). Diese Verfahren sind insbesondere für die Herstellung von kurzen Polypeptiden mit einer Länge von 7 bis 50 Aminosäuren geeignet. Längere Polypeptide können durch chemisches oder enzymatisches Verknüpfen von Peptidfragmenten, die mittels chemischer Synthese erzeugt wurden, hergestellt werden. Die Polypeptide der Erfindung können auch mittels Expression von DNA-Sequenzen in Wirtszellen hergestellt werden. Diese Verfahren sind nachstehend ausführlicher beschrieben.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch verschiedene Polynukleotide. Die Polynukleotide können einzel- oder doppelsträngige DNA-Moleküle, RNA-Moleküle oder Nukleinsäuren, die von diesen abgeleitet sind, sein. Gemäß einem ersten Aspekt kodieren die Polynukleotide der Erfindung für die Aminosäuresequenz, wie sie in der SEQ ID NO:1 gezeigt ist. Infolge der Degeneration des genetischen Codes können viele unterschiedliche Polynukleotide ins Auge gefasst werden, die für die Aminosäuresequenz, wie sie in der SEQ ID NO:1 gezeigt ist, kodieren.
Gemäß einem zweiten Aspekt kodieren die Polynukleotide der Erfindung für ein erfindungsgemäßes Polypeptid, wie es vorstehend beschrieben ist.
Die hierin beschriebenen Polynukleotide können dazu verwendet werden, ähnliche Sequenzen in einer beliebigen Sorte oder Art des Beifußes zu identifizieren und auf diese Weise Sequenzen, die eine ausreichende Homologie für eine Hybridisierung mit beispielsweise DNA aus Beifußpollen besitzen, zu identifizieren oder zu isolieren. Dies kann zum Beispiel unter Bedingungen einer geringen Stringenz durchgeführt werden; diejenigen Sequenzen die eine ausreichende Homologie (im Allgemeinen mehr als 40%) aufweisen, können zur weiteren Beurteilung ausgewählt werden. Alternativ dazu können Bedingungen einer hohen Stringenz verwendet werden. Bedingungen einer hohen Stringenz werden allgemein so ausgewählt, dass sie bei einer definierten Innenstärke und einem definierten pH ungefähr 5°C bis ungefähr 10°C unterhalb des thermischen Schmelzpunktes (T_M) der spezifischen Sequenz liegen. Die T_M ist die Temperatur (bei einer definierten Innenstärke und einem definierten pH), bei der 50% der Zielsequenz mit einer perfekt passenden Sonde hybridisieren. Übliche Bedingungen einer hohen Stringenz sind solche, bei denen die Salzkonzentration bei einem pH von 7 bis zu ungefähr 15 mM Na⁺ (0,1 × SSC) beträgt und die Temperatur mindestens ungefähr 60°C beträgt.
Auf diese Weise kann die DNA der vorliegenden Erfindung dazu verwendet werden, in anderen Arten von Kräuterpollen Sequenzen zu identifizieren, die für Peptide mit Aminosäuren kodieren, die denjenigen des hierin beschriebenen, 40,9 kDa großen Proteins ähneln, um so in diesen anderen Arten der Kräuterpollen Allergene zu identifizieren. Die vorliegende Erfindung offenbart nicht nur das 40,9 kDa große Protein und andere Beifußpollen-Allergene, die von den vorliegenden DNA-Sequenzen kodiert werden, sondern auch andere Beifußpollen-Allergene, die von DNA kodiert werden die mit der DNA der vorliegenden Erfindung hybridisiert.
In einer Ausführungsform umfasst das Polynukleotid die Nukleotidsequenz, wie sie in der SEQ ID NO:2 gezeigt ist, oder die Nukleotidsequenz, wie sie in der SEQ ID NO:3 gezeigt ist. In einer anderen Ausführungsform umfasst das Polynukleotid der Erfindung mindestens 100, vorzugsweise mindestens 300, besonders bevorzugt mindestens 600, ganz besonders bevorzugt mindestens 1000 benachbarte Nukleotide der Sequenz, wie sie in der der SEQ ID NO:2 oder der SEQ ID NO:3 gezeigt ist.
Die Erfindung erfasst auch Polynukleotide, die im Vergleich zu den oben beschriebenen Polynukleotiden degeneriert sind. Die entsprechenden komplementären Stränge der offenbarten Polynukleotide werden von der vorliegenden Erfindung umfasst.
Die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise isolierte Polynukleotide. Die Polynukleotide sind vorzugsweise im Wesentlichen rein, d. h. sie sind zu mindestens 80%, besonders bevorzugt mindestens 90%, ganz besonders bevorzugt mindestens 95% rein. Die erfindungsgemäßen Polynukleotide können auf verschiedenen Wegen hergestellt werden (siehe z. B. Glick und Pasternack, Molecular Biotechnology, Principles and Applications of recombinant DNA, ASM Press, Washington D.C. 1994; Itakura et al., Annu. Rev. Biochem. 53: 323–56, 1984 und Climie et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:633–7, 1990). Sie können mit Hilfe chemischer Verfahren, die gewöhnlich zur Synthese von Oligonukleotiden verwendet werden, synthetisiert werden. Zum Synthetisieren der Polynukleotide, insbesondere längerer Polynukleotide, können auf PCR basierende Verfahren verwendet werden (siehe z. B. Lee et al., Nucleic Acid Amplification Technologies, Eaton Publishing, Natick, MA, 1997; McPherson, M. J. et al., PCR – A Practical Approach, Band 1 und 2, IRL Press, Oxford 1996). Längere Polynukleotide können auch durch chemisches oder enzymatisches Verknüpfen von Fragmenten, die unter Verwenden chemischer Verfahren synthetisiert wurden, hergestellt werden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Plasmid oder ein Vektor, der ein erfindungsgemäßes Polynuldeotid umfasst. Die Plasmide können Regulatorsequenzen enthalten, die die Replikation der Plasmide oder die Transkription und/oder die Translation der kodierten Sequenzen erleichtern. Beispiele für solche Sequenzen sind Promotoren, Terminatorsequenzen, usw. Die Plasmide können auch Nukleotidsequenzen enthalten, die für Aminosäuresequenzen kodieren, die die Reinigung der kodierten Polypeptide nach der Expression in einer Wirtszelle erleichtern. Beispiele für solche Sequenzen sind 6×His-Tag, ein FLAG-Tag und Sequenzen, die für bakterielle Proteine, wie GST, kodieren. Die Reinigung kann mittels Affinitätschromatographie unter Verwenden von Antikörpern, die gegen die entsprechenden Tag-Sequenzen oder die entsprechenden bakteriellen Sequenzen gerichtet sind, erreicht werden. Plasmide und Vektoren, die solche Tag-Sequenzen oder bakteriellen Sequenzen enthalten, sind einem Fachmann bekannt.
Die Erfindung betrifft ferner eine Zelle, die ein Plasmid oder einen Vektor und ein erfindungsgemäßes Polynukleotid enthält. Die Zellen können aus Pflanzenzellen, Bakterienzellen, Hefezellen und anderen Zellen ausgewählt sein. Es werden Zellen bevorzugt, die die Expression der Gene, die von den Polynukleotiden der Erfindung kodiert werden, zulassen. Besonders bevorzugt sind die Zellen E. coli-Zellen. Das erfindungsgemäße Plasmid, der erfindungsgemäße Vektor und/oder das erfindungsgemäße Polynukleotid kann mit Hilfe an sich bekannter Techniken, z. B. Transformation, Transfektion, usw. in die Zellen eingeschleust werden. Die Zellen können die Nukleinsäuremoleküle nur vorübergehend oder fest in ihrem Genom eingebaut enthalten. Insbesondere in letzterem Fall können die Nukleinsäuremoleküle infolge des Einbaus in das Genom trunkiert oder fragmentiert sein. Zellen, die solche trunkierten oder fragmentierten Versionen der Nukleinsäuremoleküle enthalten, sind im Umfang der vorliegenden Erfindung enthalten.
Die Zellen können für die Expression und Reinigung der Polypeptide der Erfindung verwendet werden. Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Polypeptids, das den Schritt des Kultivierens der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Zellen unter Bedingungen, die für die Expression des Polypeptids geeignet sind, und gegebenenfalls des anschließenden Rückgewinnens des Polypeptids umfasst. Die Zellen werden vorzugsweise unter Rühren in einem flüssigen Medium kultiviert. Wenn es geeignet ist, wird die Genexpression mit Hilfe eines induzierenden Mittels, z. B. IPTG, induziert. Techniken zum Manipulieren der klonierten DNA-Moleküle und Einschleusen der exogenen DNA in eine Vielzahl von Wirtszellen, Techniken zum Transformieren dieser Wirte und Techniken zum Exprimieren fremder DNA-Sequenzen, die darin kloniert wurden, sind in der Wissenschaft allgemein bekannt und z. B. bei Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Ausgabe, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989; und Ausubel et al., Hrsg., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1987 offenbart.
Nach der Kultivierung können die Zellen unter Verwenden etablierter Verfahren aufgeschlossen werden und das Polypeptid kann mittels Affinitätschromatographie rückgewonnen werden. Es können andere bekannte Verfahren für die Reinigung der Proteine verwendet werden. Beispielhafte Reinigungsschritte können Hydroxapatit-, Größenausschluss-, FPLC- und Reverse-Phase-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie einschließen. Geeignete Chromatographiemedien schließen derivatisierte Dextrane, Agarose, Cellulose, Polyacrylamid, spezielle Silicas und Ähnliche ein. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Polypeptid der Erfindung mit einem Verfahren isoliert, das den Schritt einer Affinitätschromatographie umfasst. Gemäß dieser Ausführungsform können einer oder mehrere Antikörper, die gegen das Polypeptid der Erfindung gerichtet sind, auf einem festen Träger immobilisiert werden. Vorzugsweise erkennt der Antikörper das Polypeptid der Erfindung spezifisch. Verfahren zum Binden der Antikörpermoleküle an Trägermedien sind in der Wissenschaft allgemein bekannt. Die Auswahl eines bestimmten Verfahrens ist routinemäßiges Vorgehen und wird zum Teil von den Eigenschaften des ausgewählten Trägers bestimmt.
Alternativ dazu kann eine Adsorptionschromatographie an immobilisierte Metallionen zum Reinigen Histidin-reicher Proteine, einschließlich solcher, die Polyhistidin-Tags umfassen, verwendet werden. In Kürze: zunächst wird ein Gel mit divalenten Metallionen geladen, um ein Chelat zu bilden. Histidin-reiche Proteine werden mit verschiedenen Affinitäten, die von den verwendeten Metallionen abhängig sind, an diese Matrix adsorbiert und werden mit Hilfe einer kompetitiven Flution, durch Erniedrigung des pH oder Verwendung starker Chelatbildner eluiert werden. Um die Reinigung zu erleichtern, kann in zusätzlichen Ausführungsformen der Erfindung eine Fusion zwischen dem Polypeptid von Interesse und dem Affinitäts-Tag konstruiert werden. Fusionsproteine können mit einem einem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt werden, indem jeder Bestandteil des Fusionsproteins erzeugt wird und diese chemisch konjugiert werden. Alternativ dazu können beide Bestandteile des Fusionsproteins unter Verwenden bekannter Techniken in dem richtigen Leserahmen erzeugt und mit hierin beschriebenen Verfahren exprimiert werden. Verfahren zur Proteinreinigung sind z. B. in Deutscher, M. P., Protein Purification, Academic Press, New York, 1990; Scopes, R. K., Protein Purification, Springer Verlag, Heidelberg, 1994; Doonan, S., Protein Purification Protocols, Humana Press, 1996 beschrieben.
Polypeptide können zum Beispiel als „gereinigte" Allergene verwendet werden. Solche gereinigten Allergene sind zur Standardisierung von Allergenextrakten, die wichtige Reagenzien für die Diagnose und Behandlung einer Traubenkraut-Allergie sind, von Nutzen. Des Weiteren können unter Verwenden von Peptiden, die auf Fragmenten der Aminosäuresequenz, wie sie in der SEQ ID NO:1 gezeigt ist, basieren, unter Verwenden von Standard-Verfahren Anti-Peptid-Antiseren oder monoklonale Antikörper hergestellt werden. Diese Seren oder monoklonalen Antikörper, die gegen das 40,9 kDa große Protein der Erfindung gerichtet sind, können zum Standardisieren von Allergenextrakten verwendet werden.
Ein Antikörper, der in der Lage ist, an ein Polypeptid zu binden, kann hergestellt werden. Der Antikörper kann ein polyklonaler oder ein monoklonaler Antikörper sein, wobei jedoch monoklonale Antikörper bevorzugt werden. Antikörper, die gegen das Polypeptid der Erfindung gerichtet sind, können auf bekannte Weise, siehe z. B. Harlow und Lane, 1988, „Antibodies: A Laborstory Manual"; Cold Spring Harbour Laborstory, hergestellt werden. In einer besonderen Ausführungsform liegt der Antikörper in einer im Wesentlichen reinen Form, d.h. zu mindestens 80% rein, vorzugsweise mindestens 90% rein, vor. In dem Fall von polyklonalen Antikörpern enthält die Antikörperzusammensetzung viele verschiedene Spezies an Antikörpermolekülen.
Der Antikörper kann für das Polypeptid, das die Aminosäuresequenz, wie sie in der SEQ ID NO:1 gezeigt ist, umfasst, spezifisch sein. Ein solcher Antikörper bindet nicht an jedes der Polypeptide Amb a I.1, Amb a I.2, Amb a I.3 und Amb a 2 der Traubenkrautpollen.
Ein anderer Antikörper kann jedoch an ein oder mehrere (z. B. zwei, drei oder vier) der Polypeptide Amb a I.1, Amb a I.2, Amb a I.3 und Amb a 2 der Traubenkrautpollen binden.
Antikörper können dazu verwendet werden, weitere Bestandteile der Beifuß-Allergene zu isolieren, die für eine weitere Definition der Eigenschaften dieser Allergenfamilie verwendet werden können. Ferner können Anti-Peptid-Seren oder monoklonale Antikörper, die gegen die Polypeptide der Erfindung gerichtet sind, dazu verwendet werden, den Gehalt an Hauttest-Reagenzien zu standardisieren und zu definieren.
Die Erfindung betrifft des Weiteren eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid und/oder Polynuldeotid umfasst.
Die hierin beschriebenen Materialien sowie Zusammensetzungen, die diese Materialien enthalten, können in Verfahren zum Diagnostizieren, Behandeln und Vorbeugen einer Beifuß-Allergie verwendet werden. Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist daher die Verwendung eines erfindungsgemäßen Polypeptids und/oder Polynukleotids und/oder Antikörpers zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung oder die Prophylaxe oder die Diagnose einer allergischen Erkrankung.
Das Arzneimittel wird vorzugsweise einem zu desensibilisierenden Individuum verabreicht.
Durch die Verwendung der Polypeptide der vorliegenden Erfindung können Allergenzubereitungen mit gleichmäßiger, eindeutiger Zusammensetzung und biologischer Aktivität hergestellt werden und für therapeutische Zwecke verabreicht werden (um z. B. die allergische Reaktion eines auf Beifuß sensitiven Individuums auf Beifußpollen zu modifizieren). Solche Polypeptide oder modifizierte Versionen davon können zum Beispiel die Reaktion der B-Zellen auf ein Beifuß-Allergen, die Reaktion der T-Zellen auf ein Beifuß-Allergen oder beide Reaktionen modifizieren. Gereinigte Allergene können auch dazu verwendet werden, modifizierte Derivate oder Analoga zu konstruieren, die bei einer Immuntherapie nützlicher sind als die nicht-modifizierten, natürlich vorkommenden Peptide.
Generell schaffen hohe Dosen an Allergenen die beste Abhilfe gegen die Symptome. Aufgrund ihrer allergischen Reaktionen auf die Allergene vertragen jedoch viele Menschen keine hohen Dosen der Allergene. Eine Modifikation natürlich vorkommender Allergene kann auch auf eine solche Weise gebildet werden, dass modifizierte Polypeptide, die gegenüber dem entsprechenden natürlichen vorkommenden Allergen die gleichen oder verstärkte, therapeutische Eigenschaften besitzen, jedoch weniger Nebenwirkungen, insbesondere verringerte anaphylaktische Reaktionen zeigen, hergestellt werden können. Dies kann zum Beispiel ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder ein modifiziertes Analogon (z. B. ein Polypeptid, bei dem die Aminosäuresequenz verändert wurde, um die Immunogenität zu modifizieren und/oder die Allergenität zu verringern oder zu dem ein Bestandteil für den gleichen Zweck gegeben wurde) sein. Die Polypeptide können zum Beispiel unter Verwenden des Polyethylenglykolverfahrens von A. Sehon und Mitarbeitern modifiziert werden. Die Deletion eines kurzen Abschnitts oder Aminosäuresubstitutionen in der Polypeptidsequenz führen zu einer abgeschwächten (einer schwächeren oder gar keinen) Bindung des Antikörpers. Diese Modifikation führt zu einer geringen Bindung von IgE und ist aufgrund der geringen Nebenwirkungen bei einer Immuntherapie sehr nützlich.
Die Verabreichung der Peptide der vorliegenden Erfindung an ein zu desensibilisierendes Individuum kann unter Verwenden bekannter Techniken durchgeführt werden. Ein Peptid oder eine Kombination aus verschiedenen Peptiden kann einem Individuum in einer Zusammensetzung verabreicht werden, die zum Beispiel einen geeigneten Puffer, einen geeigneten Träger und/oder einen geeigneten Hilfsstoff einschließt. Solche Zusammensetzungen werden in der Regel mittels Injektion, oraler Verabreichung, Inhalation, transdermaler Anwendung oder rektaler Verabreichung verabreicht. Unter Verwenden der nun verfügbaren Strukturinformationen ist es möglich, ein Polypeptid der Beifußpollen zu konstruieren, das, wenn es einem auf Beifuß sensitiven Individuum in ausreichenden Mengen verabreicht wird, die allergische Reaktion des Individuums auf ein Beifuß-Allergen modifizieren wird. Dies kann beispielsweise durch Untersuchen der Strukturen der Beifußproteine, Erzeugen von Peptiden, die auf ihre Fähigkeit, die Reaktionen von B-Zellen und/oder T-Zellen bei auf Beifuß sensitiven Individuen zu beeinflussen, untersucht werden sollen und Auswählen geeigneter Epitope, die von den Zellen erkannt werden, durchgeführt werden. Synthetische Aminosäuresequenzen, die diese Epitope nachahmen und die in der Lage sind, die allergische Reaktion auf ein Beifuß-Allergen herunterzuregulieren, können ebenso verwendet werden.
Polypeptide oder Antikörper können auch zum Nachweisen und Diagnostizieren einer Beifuß-Allergie verwendet werden. Zum Beispiel durch Vereinigen von Blut oder Produkten aus dem Blut, die von einem Individuum erhalten wurden, das mit einem isolierten, allergenen Peptid von Beifußpollen unter Bedingungen, die für das Binden der Bestandteile (z. B. Antikörper, T-Zellen, B-Zellen) in dem Blut mit dem Polypeptid geeignet sind, auf die Sensitivität für ein Beifuß-Allergen untersucht werden sollten, und durch Bestimmen des Ausmaßes, in dem eine solche Bindung erfolgt.
Es ist nun möglich, ein Mittel oder ein Arzneimittel zu konstruieren, das die Fähigkeit von Beifuß-Allergenen, bei auf Beifuß sensitiven Individuen eine allergische Reaktion zu induzieren, blockieren oder hemmen kann. Solche Mittel können zum Beispiel in einer solchen Weise konstruiert werden, dass sie an einen relevanten Anti-Beifuß-IgEs binden würden, wodurch die IgE-Antigen-Bindung und die anschließende Degranulierung der Mastzellen verhindert würden. Alternativ dazu könnten solche Mittel an zelluläre Bestandteile des Immunsystems binden, was zu einer Unterdrückung oder Desensibilisierung der allergischen Reaktion auf Beifuß-Allergene führt. Ein nicht einschränkendes Beispiel dafür ist die Verwendung geeigneter B- und T-Zell-Epitop-Peptide oder Modifikationen derselben, die auf den cDNA/Polypeptid-Strukturen der vorliegenden Erfindung basieren, um die allergische Reakion auf Beifuß-Allergene zu unterdrücken. Dies kann durchgeführt werden, indem die Strukturen der B- und T-Zell-Epitop-Peptide definiert werden, die die Funktion der B- und T-Zellen in in vitro-Untersuchungen mit Blutzellen von auf Beifuß sensitiven Individuen beeinflussen.
Schließlich betrifft die Erfindung Kits, die zur Diagnose, Behandlung und/oder Prophylaxe einer allergischen Erkrankung nützlich sind und ein Polypeptid und oder ein Polynukleotid umfassen. Die hierin beschriebenen Materialien sowie Zusammensetzungen und Kits, die diese Materialien enthalten, können in Verfahren zum Diagnostizieren, Behandeln und Vorbeugen einer Beifuß-Allergie verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung basiert auf einem rekombinanten DNA-Molekül und Fragmenten davon, die für ein 40,9 kDa großes Allergen der Beifuß-(Artemisia vulgaris-)Pollen kodieren, das eine Sequenzhomologie mit Amb a 1, einem Hauptallergen der Traubenkraut-(Ambrosia artemisiifolia-)Pollen zeigt, einem Verfahren zur Isolierung von Art v 1-Molekülen oder Fragmenten davon und einem Expressionsvektor und einer Wirtszelle, die so transformiert wurde, dass sie die Nukleinsäuresequenzen der Erfindung exprimiert. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Diagnose und Therapie von auf Unkrautpollen allergischen Patienten. Da das 40,9 kDa große Beifuß-Allergen eine Sequenzhomologie zu Amb a 1 zeigt, könnte dieses Beifußprotein ein kreuzreaktives Allergen sein und könnte nicht nur für die Diagnose und Therapie einer Allergie auf Beifußpollen, sondern auch für eine Allergie auf Unkrautpollen allgemein verwendet werden.
Die vorliegende Anmeldung beschreibt die Isolierung von vier bona fide. und vollständigen cDNA-Klonen, die einem 40,9 kDa großen Allergen der Beifuß-(Artemisia vulgaris-)Pollen entsprechen. Die Nukleotidsequenz der cDNA und die abgeleiteten Aminosäuresequenzen der Klone M4, M6 und M15 waren identisch (siehe 1 und 2). Der Klon M8 unterschied sich von den anderen um 8 Nukleotidsubstitutionen, die zu keiner Änderung der Aminosäuren führten (siehe 3). Die Klone sind an ihren 5'-Enden vollständig, da sie das Startcodon AUG in einem bei Eukaryoten üblichen Zusammenhang und einige Sequenzen stromaufwärtig von dem Startcodon enthalten. Die Klone sind in dem 3'-Bereich vollständig, da sie 90–120 Nukleotide nach dem Stoppcodon, gefolgt von dem polyA⁺-Schwanz, enthalten. Die Sequenzen außerhalb des offenen Leserahmens sind in den 2 und 3 nicht gezeigt. Die Alignments der Nukleotidsequenzen der Klone M4, M6, M8 und M15 sind in den 1A-1D gezeigt. Die Nukleotidsequenz des Kodierbereichs und die abgeleitete Aminoäuresequenz der Klone M4, M6 und M15 sind in 2 gezeigt. Die Nukleotidsequenz des Kodierbereichs und die abgeleitete Aminoäuresequenz des Klons M8 sind in 3 gezeigt.
Die 1A, 1B, 1C und 1D zeigen ein Alignment der Nukleotidsequenzen der Klone M4, M6, M8 und M15 (SEQ ID NO:6, 7, 8 und 9). Die Großbuchstaben in der Consensus-Sequenz geben die identischen Nukleotide in den vier Klonen an.
2 zeigt die Nukleotidsequenz des Kodierbereichs (SEQ ID NO:2 plus Stoppcodon) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO:1) der Klone M4, M6 und M15.
3 zeigt die Nukleotidsequenz des Kodierbereichs (SEQ ID NO:3 plus Stoppcodon) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO:1) des Klons M8.
4 zeigt die Struktur der multiplen Klonierungsstelle des Plasmids „pHis-Parallel 2", wie sie in Beispiel 2 verwendet wird. Die Aminosäuren, die für ein 6×His-Tag, einen Spacer-Bereich und eine Schnittstelle für die Protease kodieren, sind ebenso angegeben.
5A zeigt Beifußpollen-Extrakt, gereinigtes Beifußpollen-Allergen und gereinigtes Amb a 1 aus Traubenkrautpollen, die mittels Gelelektrophorese aufgetrennt wurden und danach mit Coomassie angefärbt wurden. 5B zeigt einen Immunoblot mit Kaninchen-Anti-Amb a 1-Antikörpern (siehe Beispiele 3 und 4).
6 zeigt einen Immunoblot mit IgE-Antikörpern (siehe Beispiele 3 und 4).
7 zeigt ein mit Coomassie angefärbtes Gel nach einer SDS-PAGE. Bahn 1 (links):Molekulargewichtsmarker RPN 756 (Amersham Biosciences); Bahn 2 (Mitte): Beifußpollen-Extrakt; Bahn 3 (rechts): gereinigtes, rekombinantes, 40,9 kDa großes Protein der Beifußpollen, ~ 3 μg (siehe Beispiel 5).
Die vorliegende Erfindung wird mit Hilfe der folgenden Beispiele, die diese in keinster Weise einschränken sollen, weiter veranschaulicht werden.
Beispiel 1: Immunoscreening einer cDNA-Bibliothek von Beifußpollen mit gereinigten Kaninchen-Anti-Amb a 1-Antikörpern
Die Isolierung des cDNA-Klons, der für das 40,9 kDa große Allergen der Beifußpollen kodiert, wurde folgendermaßen durchgeführt:
Der erste Schritt des Klonieren der cDNA des 40,9 kDa großen Allergens war die Isolierung der RNA aus den Beifußpollen, was sich als ein sehr schwieriger Prozess herausgestellt hat. Bei Verwenden mehrerer unterschiedlicher Standardverfahren zur Isolierung von RNA waren immer Färbemittelteilchen und andere organische Substanzen vorhanden, die gleichzeitig mit der RNA gereinigt wurden und die die für die Synthese der cDNA verwendeten Enzyme hemmten. Nach mehreren Versuchen war es jedoch möglich, eine ausreichend reine mRNA zu isolieren, um eine cDNA-Bibliothek aufzubauen, was auch bei dem Expressionsvektor lambda ZAP durchgeführt wurde.
Seren von Kaninchen, die mit Amb a 1 immunisiert worden waren, wurden freundlicherweise von Dr. Te Piao King (Rockefeller University, USA) bereitgestellt. Zum Screenen der Beifuß-cDNA-Bibliothek reinigten wir zunächst Amb a 1-spezifische Antikörper mit Hilfe von Affmitätschromatographie. Zu diesem Zweck wurden 5 mg Amb a 1, das aus Beifußpollen gereinigt worden war, an CNBr-aktivierte Sepharose (Pharmacia) gekoppelt. Nach dem Binden der Kaninchen-Seren wurde das Harz gewaschen und Amb a 1-spezifische Antikörper mit 0,2 M Glycin, pH 2,8 eluiert. Die Antikörper wurden neutralisiert und gegen PBS dialysiert. Mit diesen gereinigten Kaninchen-Anti-Amb a 1-Antikörpern wurden 450.000 Plaques einer cDNA-Bibliothek von Beifußpollen, die in lambda ZAP II-Phagen (Stratagene, CA, USA) konstruiert worden waren, gescreent. Insgesamt wurden 13 positive Klone isoliert und für die in vivo-Exzision eines einzigen Klons des pBluescript-Phagemid aus dem Uni- ZAP XR-Vektor verwendet. Für die Analyse der DNA-Sequenz, die mt Hilfe der „Primer Walking"-Technik unter Verwenden von 5 Primer, einschließlich der flankierenden Primer T7 und T3 durchgeführt wurde, wurden vier Klone (M4, M6, M8 und M15) ausgewählt. Beide Stränge wurden zweimal sequenziert. Die Nukleotidsequenzen der vier Klone M4, M6, M8 und M15, mit denen ein Alignment durchgeführt worden war, sind in den 1A-1D gezeigt. Die cDNA-Sequenzen der Klone M4, M6 und M15 waren identisch (2). Die cDNA-Sequenz in dem Kodierbereich von M8 unterschied sich von den anderen 3 Klonen um 8 Basen (3). Alle vier Klone führten jedoch zu dem gleichen Protein mit einem berechneten Molekulargewicht von 40,9 kDa (2 und 3).
Die Sequenz des 40,9 kDa großen Proteins wurde schließlich für die Durchsuchung der Datenbank auf Ähnlichkeiten verwendet. Eine signifikante Sequenzhomologie wurde mit Amb a 1, einem Hauptallergen aus Traubenkrautpollen, das zu der Familie der Pektatlyasen gehört (63,9% Gleichheit) gefunden.
Die cDNA der Erfindung kann nun ausgehend von den Sequenzinformationen, wie sie hierin beschrieben sind, erhalten werden. Die cDNA kann unter Verwenden eines Oligonukleotids oder Polynukleotids, das mit Hilfe einer chemischen Synthese hergestellt worden war, als Sonde aus einer cDNA-Bibliothek kloniert werden. Alternativ dazu kann die cDNA mit Hilfe einer PCR unter Verwenden von Primern, die von der SEQ ID NO:2 abgeleitet wurden, erhalten werden. Solche Verfahren sind einem Fachmann bekannt.
Beispiel 2: Klonieren des 40,9 kDa großen Beifuß-Allergens (Klon M4) in das Expressionsplasmid pHIS-parallel-2
Das Expressionsplasmid, das die cDNA des 40,9 kDa großen Beifuß-Allergens enthielt, wurde in den Vektor pHis-parallel 2 konstruiert (siehe 4). Für das Verfahren der Klonierung wurden zwei flankierende Klonierungsprimer konstruiert. Die vollständige cDNA-Sequenz war am 5'-Ende um 60 Nukleotide, die für das mögliche Signalpeptid codieren, trunkiert. Daher wurde nur die reife Form des Proteins in E. coli produziert.
Es wurden die folgenden Primer verwendet: Mug-Nco-fwd 5' GAG AGA GAC CAT GGC TCG GGC TGA CAT TGG TGA TGA GCT CG 3' (SEQ ID NO:4) und Mug-Xho-rev 5' GAG AGA GAC TCG AGT TAA CAA GGT TTT CCA GGA ACG CAT TTG 3' (SEQ ID NO:5) für die PCR, am 5'- und am 3'-Ende wurden NcoI- und XhoI-Restriktionsschnittstellen eingeführt. Die PCR-Produkte wurden mit den Restriktionsenzymen NcoI und XhoI verdaut und in die entsprechenden Stellen des Vektors pHis-parallel-2 kloniert. Der Klon wurde durch Sequenzierung der DNA analysiert.
Beispiel 3: Expression des rekombinanten, 40,9 kDa großen Beifuß-Allergens in E. coli
Für die rekombinante Herstellung des 40,9 kDa großen Beifuß-Allergens wurde der kompetente E. coli-Stamm BL21 (DE3, Stratagene, CA, USA) mit dem Expressionsplasmid pHis-parallel-2-M4 transformiert und auf 100 mg/l Ampicillin enthaltenden LB-Platten selektiert. Es wurde eine einzige Kolonie einer Transformante gepickt und die Bakterien wurden in einer 25 ml-Übernacht-Vorkultur mit Ampicillin enthaltendem LB-Medium bis zu einer optischen Dichte von 0,6 bei 600 nm angezüchtet. Das LB-amp-Medium wurde bis zu einem Volumen von 250 ml aufgefüllt. Isopropyl-β-D-galactopyranosid (IPTG) wurde bis zu einer Endkonzentration von 1 mM dazugegeben und die Inkubation für 7 Stunden bei 37°C fortgesetzt. Die Bakterienzellen wurden mittels Zentrifugation geerntet und die Pellets wurden in 50 mM Phosphatpuffer, pH 8, der 300 mM NaCl und 10 mM Imidazol enthielt, resuspendiert. Dann wurden die Zellen in drei Zyklen des Einfrieren in flüssigem Stickstoff, gefolgt von Auftauen bei 37°C, aufgebrochen. Nach der Zentrifugation bei 5.500 rpm für 25 Minuten wurde der Überstand entfernt (lösliche Fraktion) und es wurden 6 M Harnstoff zu dem Pellet gegeben. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand entfernt (unlösliche Fraktion) und beide Fraktionen, die lösliche und die unlösliche Fraktion, wurden mittels SDS-PAGE analysiert. Das rekombinante, 40,9 kDa große Beifuß-Protein wurde aus der unlöslichen Fraktion rückgewonnen, die dann für Immunoblots mit Anti-Amb a 1-Antikörpern (5B, Bahn 4) und mit Serum-IgE aus auf Unkrautpollen allergischen Patienten (6, Bahnen 3 und 4) verwendet. Als Kontrolle wurde der E. coli-Stamm BL21, der mit pHis-parallel-2 ohne Insert transformiert worden war, so, wie es oben beschrieben ist, verarbeitet und die unlösliche Fraktion für die Immunoblot-Versuche verwendet (6, Bahnen 5 und 6).
5A, Bahn 1 zeigt Beifußpollen-Extrakt, der alle Proteine (Allergene oder Nicht-Allergene), die aus den Pollen freigesetzt wurden, enthält.
Herstellung des Beifußpollen-Extrakts:
150 mg Beifußpollenkörner (Allergon AB, Schweden) wurden mit 1 ml Wasser gemischt. Die Pollensuspension wurde bei Raumtemperatur 10 Stunden lang vorsichtig gerührt. Nach der Zentrifugation wurde das Muster der Proteine, die aus den Beifußpollen freigesetzt wurden, mittels SDS-PAGE und Coomassie-Färbung analysiert.
Die Bahn 2 der 5A zeigt das gereinigte, natürliche, 40,9 kDa große Allergen der Beifußpollen. Die Reinigung wurde mit einem Immunoaffinitätschromatographieverfahren durchgeführt. Gereinigte Kaninchen-Anti-Amb a 1-Antikörper wurden an Cyanogenbromidaktivierte Sepharose CL4B (Pharmacia Biotech) gekoppelt und für die Reinigung des natürlichen, 40,9 kDa großen Beifuß-Proteins aus einem 10 Stunden lang filtrierten Pollenextrakt verwendet.
Die Bahn 3 der 5A zeigt gereinigtes, natürliches Amb a 1, ein Hauptallergen der Traubenkrautpollen. Die Reinigung wurde ebenso mit einem Immunoaffinitätschromatographieverfahren durchgeführt. Gereinigte Kaninchen-Anti-Amb a 1-Antikörper wurden an Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose CL4B (Pharmacia Biotech) gekoppelt und für die Reinigung des natürlichen Amb a 1 aus einem 10 Stunden lang filtrierten Traubenkrautpollen-Extrakt, einschließlich 10 mM Protease-Inhibitor 1,10 Phenantrolin, verwendet.
Beispiel 4: Reinigung des natürlichen, 40,9 kDa großen Allergens aus Beifußpollen
Das natürliche, 40,9 kDa große Allergen wurde mittels Immunoaffinitätschromatographie aus einem wässrigen Extrakt der Beifußpollen gereinigt. Gereinigte Kaninchen-Anti-Amb a 1-Antikörper wurden an CNBr-aktivierte Sepharose CL4B gekoppelt und für die Reinigung des 40,9 kDa großen Allergens verwendet. Das gereinigte, natürliche, 40,9 kDa große Allergen wurde dann in Immunoblots mit Anti-Amb a 1-Antikörpern (5A, Bahn 2) und mit IgE-Antikörpern as allergischen Patienten (6, Bahnen 1 und 2) getestet.
Es tritt eine Kreuzreaktivität zwischen dem US-Patienten, der gegen Traubenkraut sensibilisiert ist und dem gereinigten, natürlichen und rekombinanten, 40,9 kDa großen Protein bei Beifuß auf. Es kann daher ein positives Signal in der 6A und 6B beobachtet werden. Es wird erwartet, dass viel mehr Patienten eine Kreuzreaktivität zwischen diesen beiden Allergenen zeigen.
Beispiel 5: Expression und Reinigung des rekombinanten, 40,9 kDa großen Proteins der Beifußpollen
Die Expression des Proteins wurde in E. coli BL21-DE3, die ein pHis-parallel-2-Plasmid mit einer inserierten cDNA, die für das 40,9 kDa große Protein der Beifußpollen codierte, beherbergten, durchgeführt.
Das Kulturmedium (1% Pepton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl, 100 g Glycerin/1 l, 2 mM MgSO₄; 20 g (NH₄)₂SO₄, 10 mM PO₄, der pH ist auf 7,4 eingestellt) wurde mit 3% einer gesättigten Übernachtkultur angeimpft, die in dem Kulturmedium mit 150 μg/ml Penicillin G (Biochemie, Kundl, Österreich) angezüchtet worden war. In einem 10 l-Bioflow 3000-Fermenter (New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ) wurde bei 37°C mit einer Sauerstoffsättigung von 7% und unter Rühren mit 200–400 rpm eine Fermentation und bei einer optischen Dichte von 0,8 eine Induktion mit 0,4 mM IPTG durchgeführt.
Die Bakterienzellen wurden mit Hilfe einer nach der Induktion erfolgenden, 5-stündigen Zentrifugation (20 g Nasszellgewicht aus 10 l Kultur) geerntet und in 100 ml Lysepuffer (50 mM Tris-Base, 1 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, der pH wurde nicht eingestellt, 5 ml/g Zellen) resuspendiert. Nach der Zugabe von frisch gelöstem Lysozym (100 μg/g Zellen) und der Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur wurden die Zellen in 3 Einfrier-Auftau-Zyklen bei –70°C und 37°C lysiert. Die DNA wurde mit einem Ultraturax abgeschert. Die Abtrennung der löslichen Fraktion erfolgte durch Zentrifugation und die unbearbeiteten Einschlusskörperchen (Inclusion Bodies) wurden zweimal mit 1% Triton X-100, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA und anschließend zweimal mit 50% Ethanol, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 gewaschen. Die gereinigten Einschlusskörperchen wurden in 500 ml 8 M Harnstoff, 0,5 M NaCl, 20 mM TrisHCl, pH 8,0 gelöst und auf eine 150 ml-Säule mit chelatbildendem Cellufine (Millipore, Redford, MA; USA) geladen, die nach dem Beladen mit 0,1 M NiCl₂ entsprechend den Anweisungen des Herstellers mit dem gleichen Puffer voräquillibriert worden war. Alle Chromatographieschritte wurden in einem Biopilot FPLC-System (Amersham Biosciences, Uppsala, Schweden) durchgeführt. Gebundenes Protein wurde mit einem linearen Imidazolgradienten, der in einem Bereich von 0 bis 500 mM lag, eluiert. Die Reinheit der Fraktionen wurde mit einer gewöhnlichen SDS-PAGE analysiert. Aufgrund der Verunreinigung (hoher Untegrund) der Fraktionen, die das rekombinante, 40,9 kDa große Protein der Beifußpollen enthielten, wurde eine Kationenaustauschchromatographie unter denaturierenden Bedingungen durchgeführt.
Eine 180 ml-Säule mit der CEC-Matrix „Matrex Cellufine C-500" (Millipore) wurde mit 200 ml 100 mM NaAc, pH 5,5 äquillibriert. Nach dem Waschen der Säule mit 400 ml des Bindungspuffers (5 M Harnstoff, 20 mM NaAc, 10 mM β-Mercaptoethanol, 2 mM EDTA, pH 5,5) wurde die Proteinlösung mit einem pH von 5,5 aufgebracht.
Die Fraktionen wurden erneut mittels SDS-PAGE und Coomassie-Färbung analysiert. Die Fraktionen, die das Protein von Interesse enthielten, wurden in einem Pool gesammelt und für den Schritt der Gelfiltration unter denaturierenden Bedingungen und bei einem basischen pH vorbereitet.
Die Gelfiltration wurde in 6 M Harnstoff, 0,3 M NaCl, 30 mM TrisHCl, pH 8,0, 2 mM EDTA, 10 mM β-Mercaptoethanol auf einer Sephacryl S-200 HR-(Amersham Biosciences, Uppsala, Schweden) Säule (Abmessungen 50 × 1000 mm) durchgeführt.
Die Fraktionen des reinen, 40,9 kDa großen Proteins der Beifußpollen wurden aufkonzentriert und während des Zugebens von 5 mM NH₄HCO₃ durch Filtration durch eine Amicon-Ultrafiltrationsvorrichtung (Millipore) neu gefaltet. Die Gesamtausbeute betrug 4–6 mg Protein.
7, Bahn 3 zeigt das gereinigte, rekombinante, 40,9 kDa große Allergen der Beifußpollen mit einem His-Tag (~ 3 μg) nach SDS-PAGE und Coomassie-Färbung.
Beispiel 6: IgE-Blots mit dem rekombinantem, 40,9 kDa großen Protein der Beifußpollen
Es wurden Seren aus verschiedenen allergischen oder sensibilisierten Patienten auf eine Reaktionsfähigkeit mit dem neuen, 40,9 kDa großen Allergen der Beifußpollen getestet. Die Tests wurden gemäß dem folgenden Protokoll durchgeführt.

• vorbereitende 15%-ige SDS-Gele
• beladen mit ~ 80 μg des gereinigten, rekombinanten, 40,9 kDa großen Proteins (das z. B. gemäß Beispiel 5 erhalten wurde)
• SDS-Gelelektrophorese 100 V, 2,5 Stunden
• Western-Blot: auf einer PVDF-Membran 2 Stunden, 300 mA
• Inkubation mit dem 1. Antikörper: humane Seren: für mindestens 6 Stunden bei Raumtemperatur 1:10 in Goldpuffer verdünnen
• Waschschritt 3 × 10' in Goldpuffer
• Inkubation mit dem 2. Antikörper: Radiomarkiertes [¹²⁵I]-Anti-humanes IgE (auch als RAST bezeichnet), geliefert von MedPro (Kat.-Nr. VE39020, 5,2 ml, 5 μCi) – 1:40 in Goldpuffer, Übernacht bei Raumtemperatur
• 3 × für 10' in Goldpuffer waschen
• Anordnen der Platte (Screen) der Phosphor-Imager-Vorrichtung, so dass die weiße Stelle über den Streifen der Membran liegt
• die Platte 24–48 Stunden lang in der Phosphorimager-Kassette belichten
• die Platte in dem Phosphor-Imager entwickeln.

Blockierpuffer = Goldpuffer (1 l):	7,5 g Na₂HPO₄
	1,0 g Na₂HPO₄
	5,0 g BSA
	5,0 ml Tween 20
Transferpuffer (pro 5 l):	15,13 g Tris-Base
	72,06 g Glycin
	11 Methanol absolut
	dH₂O zugeben

Ein Serum wurde als "IgE-positiv" klassifiziert, wenn das Signal, das der 40,9 kDa großen Bande entsprach, signifikant über dem Signal des Untergrunds lag.

Es wurden folgende Ergebnisse erhalten: Tabelle 1: Traubenkrautseren als Referenz aus NIH/USA (Bahn 1–3) und aus auf Beifuß allergische Patienten aus Österreich (Bahn 4–22): Blot I

Nr.	Patient	IgE-positiv	IgE-negativ
1	humanes Anit-Traubenkraut		x
2	#3130	x
3	#3131		x
4	180.212		x
5	181.822		x
6	492.788		x
7	493.050	x
8	493.087		x
9	493.201		x
10	493.021		x
11	494.190		x
12	180.912		x
13	180.889	x
14	180.682	x
15	180.178	x
16	493.647		x
17	493.173	x
18	493.12x		x
19	492.712		x
20	494.102		x
21	493.910		x
22	493.885	x

Tabelle 2: Auf Beifuß allergische Patienten aus Österreich (Bahn 23–44): Blot II

Nr.	Patient	IgE-positiv	IgE-negativ
23	493.593	x
24	493.510		x
25	493.485	x
26	493.428		x
27	493.311	x
28	494.169		x
29	494.105		x
30	492.395		x
31	492.391	x
32	183.011		x
33	182.881	x
34	182.729	x
35	182.726	x
36	182.484		x
37	182.483	x
38	182.333	x
39	182.259		x
40	182.083		x
41	181.713		x
42	181.498		x
43	181.237		x
44	180.935		x

Tabelle 3: Mit Traubenkraut sensibilisierte Patienten aus den USA (Bahn 45–58) und Österreich (Bahn 59–63): Blot III

Nr.	Patient	IgE-positiv	IgE-negativ
45	2	x
46	3	x
47	5	x
48	8	x
49	14	x
50	15	x
51	17	x
52	18	x
53	19	x
54	24	x
55	25	x
56	27	x
57	28	x
58	29	x
59	1	x
60	4	x
61	7	x
62	9	x
63	10	x

Tabelle 4: Auf Beifuß allergische Patienten aus Salzburg (Bahn 64–68) und Art v 1-T-Zell-Patienten (Hahn 69–83): Blot IV

Nr.	Patient	IgE-positiv	IgE-negativ
64	1	x
65	2	x
66	3	x
67	4	x
68	5	x
69	1	x
70	7	x
71	10	x
72	14	x
73	15	x
74	16	x
75	22	x
76	22	x
77	23	x
78	24	x
79	25	x
80	26	x
81	27	x
82	29	x
83	31	x

Tabelle 5: Auf Traubenkraut allergische Patienten aus Kanada (Bahn 84–107): Blot V

Nr.	Patient	IgE-positiv	IgE-negativ
84	C1-6	x
85	C1-8	x
86	C1-11		x
87	C1-12	x
88	C2-17	x
89	C2-18		x
90	C2-19		x
91	C3-25		x
92	C3-27		x
93	C4-33	x
94	C5-36		x
95	C5-38	x
96	C5-40		x
97	C5-43		x
98	C5-48		x
99	C5-52		x
100	C5-55		x
101	C5-56	x
102	C6-59		x
103	C6-61		x

Tabelle 6: Auf Traubenkraut allergische Patienten aus Kanada und Österreich (Bahn 108–117): Blot VI

Nr.	Patient	IgE-positiv	IgE-negativ
104	C6-68		x
105	C6-69		x
106	C11-78		x
107	C11-82		x
108	5		x
109	10		x
110	11		x
111	12		x
112	13		x
113	14		x
114	15		x
115	16		x
116	17		x
117	18		x

Tabelle 7: Negativkontrollen: Blot VII (nur 2. Antikörper!!)

Nr.	Patient	IgE-positiv	IgE-negativ
118	---		x
119	---		x
120	---		x
121	---		x
122	---		x
123	---		x

Ergebnisse der getesteten Patientenseren:

Auf Beifuß allergische Patienten aus Österreich (Gesamtanzahl der getesteten Patientenseren = 61)
IgE-positiv: 36 = 59%
IgE-negativ: 25 = 41%
Auf Traubenkraut allergische Patienten aus den USA, Kanada und Österreich (Gesamtanzahl der getesteten Patientenseren = 56)
IgE-positiv: 27 = 48%
IgE-negativ: 29 = 52%

Gesamtergebnisse:

Gesamtanzahl an verfügbaren Seren aus auf Beifuß allergischen Patienten: 73
IgE-positiv: 36 = 49,4%
IgE-negativ: 37 = 50,6%
Gesamtanzahl an verfügbaren Seren aus auf Traubenkraut allergischen Patienten: 130
IgE-positiv: 27 = 20,8%
IgE-negativ: 103 = 79,2%

Nahezu 50% der mit Beifuß sensibilisierten Patienten und ungefähr 20% der mit Traubenkraut sensibilisierten Patienten besitzen IgE-Antikörper gegen das 40,9 kDa große Allergen. Dies ist ein relativ hoher Prozentsatz an Patienten, die mit diesem Allergen der Beifußpollen sensibilisiert wurden. Es ist daher wichtig, dieses Molekül zu einer Impfstoffzubereitung für die Behandlung der Allergie dieser Patienten zu geben. Neue Ansätze für eine Allergietherapie gehen in die Richtung auf Patienten zugeschnittene Impfstoffzusammensetzungen. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Allergen, bestehend aus einem Polypeptid, das ein Fragment aus mindestens 18 aufeinander folgenden Aminosäuren der Aminosäuresequenz, wie in der SEQ ID NO:1 gezeigt, umfasst.
Allergen nach Anspruch 1, worin das Fragment in der Lage ist, an IgE-Antikörper aus einem Individuum, das auf Beifußpollen allergisch ist, zu binden.
Allergen nach Anspruch 1 oder 2, umfassend die Aminosäuresequenz, wie in der SEQ ID NO: 1 gezeigt.
Allergen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es in der Lage ist, an IgE-Antikörper aus einem Individuum, das auf Traubenkrautpollen allergisch ist, zu binden.
Polynukleotid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Polynukleotiden, die für die Aminosäuresequenz, wie sie in der SEQ ID NO:1 gezeigt ist, codieren; b) Polynukleotiden, die für ein Polypeptid gemäß Anspruch 1 codieren, und c) Polynukleotiden, die die Nukleotidsequenz, wie in der SEQ ID NO:2 gezeigt, oder die Nukleotidsequenz, wie in der SEQ ID NO:3 gezeigt, umfassen oder der komplementäre Strang eines solchen Polynukleotids.
Plasmid oder Vektor, umfassend ein Polynukleotid gemäß Anspruch 5.
Zelle, enthaltend ein Plasmid oder einen Vektor gemäß Anspruch 6.
Zelle nach Anspruch 7, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Pflanzenzellen, Bakterienzellen und Hefezellen.
Verfahren zur Herstellung eines Allergens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, umfassend den Schritt des Kultivierens der Zellen gemäß Anspruch 7 oder 8 unter Bedingungen, die für die Expression des Polypeptids und gegebenenfalls des anschließenden Rückgewinnens des Polypeptids geeignet sind.
Verfahren nach Anspruch 9, worin die Zellen aufgeschlossen werden und das Polypeptid mittels Affinitätschromatographie rückgewonnen wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Allergen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 und/oder ein Polynukleotid gemäß Anspruch 5.
Verwendung eines Allergens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder eines Polynukleotids gemäß Anspruch 5 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prophylaxe einer Allergie auf Unkrautpollen.
Verwendung nach Anspruch 12, worin das Arzneimittel einem zu desensibilisierenden Individuum verabreicht wird.
Kit, das zur Diagnose, Behandlung und/oder Prophylaxe einer allergischen Erkrankung nützlich ist, umfassend ein Allergen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 und/oder ein Polynukleotid gemäß Anspruch 5.
Verwendung eines Allergens gemäß Anspruch 1 bis 4 oder eines Polynukleotids gemäß Anspruch 5 zur Diagnose einer Allergie auf Unkrautpollen.