AT400198B - Verwendung von poly(l-prolin) zur in vitro diagnose - Google Patents

Description

AT 400 198 B Während des Frühlings leidet ein großer Teil der Bevölkerung von Mittel-, Ost- und Nordeuropa, Amerika und Australien unter allergischen Symptomen (Rhinitis, Konjunktivitis, Dermatitis und Pollenasthma). Proteine, die aus Polien von Bäumen der Ordnung Fagales isoliert werden können, insbesondere aus Pollen von Birke, Erle, Hasel, Hainbuche und Eiche, sind für die meisten dieser allergischen Symptome 5 verantwortlich (1).

Diagnosemethoden für allergische Erkrankungen wie RAST (Radioallergosorbent Test), PRIST (Papier Radioimmunosorbent Test) EUSA (enzyme linked immunosorbent assay), und IgE Immunoblots hängen stark von der Verfügbarkeit von reinen Allergenen ab. Proteinextrakte aus Pollen sind schwierig 2u standardisieren, sie können unerwünschte Bestandteile enthalten und es können bestimmte Proteine fehlen, io die bei der Extraktionsprozedur verlorengehen (2). Deshalb sind diagnostische Tests, die gut definierte Allergene enthalten, solchen Tests überlegen, die lediglich rohe Pollenextrakte mit einer unzureichend definierten Mischung aus Allergenen und anderen Komponenten enthalten. Allergene können aus Pollen mit proteinchemischen Methoden zur Homogenität gereinigt werden, zum Beispiel mit Hilfe der Affinitätschromatographie (3). Diese Methoden sind relativ aufwendig und benötigen Pollen als eine teure Quelle für die 15 Allergene. Deshalb kann es effizienter sein, wenn man die cDNA, die ein allergenes Protein kodiert, isoliert und sequenziert. Dadurch wird es möglich, rekombinante Allergene oder synthetische Peptide herzustellen.

Die Hyposensibilisierung erwies sich als eine effektive Therapie bei allergischen Erkrankungen. Diese Therapie besteht aus einer parenteralen oder oralen Applikation von Allergenen in steigenden Dosen über einen langen Zeitraum. Wie die Diagnosemethoden benötigt sie ebenfalls reine und wohldefinierte Allerge-20 ne. Mit der Verwendung von rekombinanten Allergenen oder synthetischen Peptiden könnte das Risiko, den Patienten gegen unerwünschte Komponenten zu sensibilisieren, stark gesenkt werden.

Diese Erfindung befaßt sich mit einem Pollenallergen insbesondere der Birke (Betula verrucosa), in dieser Arbeit P14 genannt Dieses Allergen ist nicht nur Bestandteil des Birkenpollens, sondern immunologisch eng verwandte Proteine kommen auch in Pollen von nahe verwandten Bäumen der Ordnung Fagales 25 vor, insbesondere bei Erle, Hasel, Hainbuche und Eiche. Die Kreuzreaktivität der IgE Antikörper der Patienten ist in Abb. 1 dargestellt

Mit vorliegender Erfindung wird ein rekombinantes DNA Molekül zur Verfügung gestellt, das eine Nukleotidsequenz besitzt die für ein Polypeptid kodiert, das die Antigenität des Allergens P14 insbesondere der Gewächse der Ordnung Fagales besitzt. Die Erfindung liefert die vollständige cDNA Sequenz von 30 P14 und damit die vollständige Aminosäuresequenz. Weiters wurde die P14 cDNA in zwei prokaryontische Expressionssysteme, vorliegend Escherichia coli inseriert und die IgE Bindungsfähigkeit der exprimierten Polypeptide, eines Fusionsproteins und eines Nichtfusionsproteins, wurde nachgewiesen. Die IgE Bindungsfähigkeit wurde auch für eine Teilsequenz nachgewiesen, die in Lambda gt11 als /3-Galactosidase-Fusionsprotein exprimiert werden konnte. Auf diese Weise konnte gezeigt werden, daß diese Teilsequenz 35 ein IgE-bindendes Epitop darstellt. Weiters kann aus den Ergebnissen von IgE Immunoblots, Kreuzinhibitionstests, klinischen Tests und Northern (RNA) Blots (4-9) (Abb. 1 und 3) gefolgert werden, daß homologe IgE-bindende Polypeptide im Pollen der naheverwandten Bäume der Ordnung Fagales existieren. Deshalb wird durch diese Erfindung ein Polypeptid zur Verfügung gestellt, das die gleiche Antigenität wie die verwandten Pollenallergene von Erle, Hasel und Hainbuche aufweist. 40 Eine Computersuche in den verfügbaren Sequenzdatenbanken (EMBL, MIPSX, Swissprot) nach Proteinen, deren Sequenz zu P14 homolog ist, zeigte eine signifikante Homologie zwischen P14 und einem Cytoskelettprotein (Profilin), das in verschiedenen Eukaryonten vorhanden ist (10-14) (Abb. 5). Diese Homologie wirft die Frage nach einer Kreuzreaktivität der IgE Antikörper der Patienten mit humanem Profilin auf. Diese Autoreaktivität wurde demonstriert (Abb. 12). 45 In dieser Weise wird ein molekulares System zur Verfügung gestellt, das es erlaubt, die Hypothese zu testen, ob Autoimmunmechanismen bei allergischen und atopischen Erkrankungen eine Rolle spielen. Erste Daten zeigen, daß Patienten, deren IgE Antikörper mit P14 reagieren, eine Gruppe darstellen, die während eines großen Teils des Jahres an allergischen Symptomen leidet, ohne auf konventionelle Therapie befriedigend anzusprechen. Daraus wird gefolgert, daß P14, oder rekombinante oder chemisch synthetisier-50 te IgE bindende Polypeptide mit Sequenzen, die der Sequenz der P14 cDNA entsprechen, als prognostische Marker für die Hyposensibilisierungstherapie eingesetzt werden können.

Diese Erfindung eröffnet weiters einen effizienten Weg zur Reinigung des Pollenproteins sowie des rekombinanten oder synthetischen Polypeptids. Die Reinigungsmethode beruht auf der Affinität von P14 und homologen Polypeptiden zu poly(L-Prolin)(15,16). Da die Bindung des Pollenproteins sowie des 55 rekombinanten P14 an poly(L-Prolin) gezeigt werden konnte (Abb. 8, 9, 10), wird damit eine Methode zur Verfügung gestellt, dieses Allergen zu immobilisieren. So können bestimmte diagnostische Tests aufgebaut werden (zum Beispiel kann poly(L-Prolin) statt eines Antikörpers zum Binden von Profilin bei ELISAS verwendet werden). Ebenso sind Therapieformen möglich, die mit Hilfe von poly(L-Prolin) P14 und analoge 2

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Polypeptide als Allergen binden. Da es Hinweise gibt, daß Patienten, die an Autoimmunerkrankungen leiden, Antikörper gegen P14 bilden, könnten dieses Polypeptid oder homologe Polypeptide für Diagnostik oder Therapie dieser Erkrankungen eingesetzt werden. MATERIALIEN UND METHODEN : 1. Konstruktion der cDNA Genbank

Pollen (Allergon AB Engelholm, Schweden), der mit Hilfe von Licht- und Elektronenmikroskopie auf Reinheit untersucht worden war, wurde zur Isolierung von polyadenylierter RNA verwendet (17,18). cDNA Synthese wurde mit oligo-dT und random Primern durchgeführt (19, 20), die Enden der cDNA wurden mit T4-Polymerase glattverdaut und mit EcoRI-Linkern versehen. Die cDNA mit Linkem wurde in dephosphorylierte Lambda gt11 Arme (21) ligiert und verpackt. Es ergab sich eine cDNA Genbank von 800.000 unabhängigen Klonen. 2. Screening der cDNA Genbank

IgE Screening der Birkenpollen cDNA Genbank wurde durchgeführt wie beschrieben (22). IgE bindende Klone wurden angereichert und Phagen-DNA wurde daraus präpariert (23). Die Inserts wurden mit EcoRl herausgeschnitten und die Fragmente wurden in das Plasmid pUC18 (24) subkloniert. Von einem Klon wurde die DNA Sequenz erhalten (25). Obwohl sie am 3’-Ende (poly-A Schwanz) vollständig war, fehlten ihr ein großer Teil des 5'*Endes und damit auch das Startcodon. Deshalb wurde die originale Genbank nochmals mit Oiigodesoxinukleotiden gescreent, die komplementär zum kodierenden Bereich waren (26) und zwei unabhängige Klone konnten erhalten werden. 3. RNA (Northern) Blots

Zehn ug von Gesamt-RNA aus Pollen von Erle, Birke und Hasel wurden mit Hilfe einer denaturierenden Gelelektrophorese aufgetrennt und auf Nitrocellulose geblottet (27,28). Eine P14 cDNA Probe wurde mittels random Priming 32P-markiert (29).

Prähybridisierung und Hybridisierung wurden mit Standardmethoden durchgeführt (23). Die Blots wurden mit 0.75xSSC (20xSSC = 3M NaCI, 0,3M Na-Citrat, pH 7,0), 0.1% SDS (Natriumdodecylsulfat), bei 50* C gewaschen und autoradiographiert (Hyperfilm MP, Amersham, London, GB).

4. Expression der P14 cDNA 4.1. Expression des 3'-Teils der cDNA in Lambda gtn Phagen (Abb. 2)

Mit Hilfe von IgE Screening (22) wurde ein unvollständiger cDNA Klon erhalten, der für einen Teil von P14 codiert. Mit rekombinanten Lambda gt11 Phagen wurde der lysogene E. coli Stamm Y1089 infiziert und aus dem Ansatz wurde das ß-Galactosidase-Fusionsprotein gewonnen (19). Der Ansatz wurde auf einem 7.5% Polyacrylamidgel elektrophoretisiert und auf Nitrocellulose geblottet. Das Fusionsprotein wurde mit Hilfe von IgE Antikörpern in Patientenserum und einem jodmarkierten Kaninchen-anti-human IgE Antikörper (Pharmacia, Uppsala, Schweden) detektiert (Abb. 2). 4.2. Expression der vollständigen P14 cDNA als Fusions- und Nichtfusionsprotein

Die vollständige cDNA die für P14 kodiert, enthält eine prokaryontische Ribosomenbindungsstelle (Shine Dalgamo Sequenz (30)) und wurde in die EcoRl Stellen der Plasmide pKK223-3 (31) bzw. pEXB (32) inseriert, um P14 als ein Nichtfusionsprotein bzw. ein Fusionsprotein von P14 mit dem Lambda eil Protein zu erhalten. Mit Hilfe von Serum IgE und einer Koloniescreeningmethode (33), wurden IgE bindende Klone erhalten und mit Hilfe von DNA-Restriktionsanalyse überprüft.

Rekombinante Proteine wurden auf ihre Bindungsfähigkeit gegenüber Patienten IgE Antikörpern getestet wie beschrieben (22). 3

AT 400 198 B 5. Reinigung des Birkenpollen-P14 und des rekombinanten P14 P14 aus Birkenpöllen und rekombinantes P14 wurden mit Hilfe einer Affinitätsmethode nach einem Batchverfahren gereinigt (vergl. 15,16), das für die Profiline von Acanthamoeba (10), Hefe (11) und Mensch (13) geeignet ist. Birkenpollen und E. coli Zellen, die das Plasmid enthalten, das für P14 kodiert, wurden in PHEM-TX Puffer lysiert ( 2x PHEM-TX: 120 mM P1PES (Piperazin-1,4-bls(2-ethansu!fonsäure)), 50 mM HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure), 20 mM EGTA (Ethylenglycol-bis(jS-aminoethyle-ther)-N,N,N',N'-tetraessigsäure), 4mM MgCb, 10mM Glucose, 20 mg/ml Leupeptin, 156 mg/ml Benzamidin, 80 mg/ml Aprotinin, 1mM PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid),1,5% Triton-X100, pH 7,2) und das Lysat wurde eine Stunde bei 65000 xg,4*C zenrifugiert. Der Oberstand wurde über Nacht bei 4* C mit poly(L-Prolin) an BrCN-aktivierte Sepharose 4B (Pharmacia, Uppsala, Schweden) gekoppelt. Die Affinitätsmatrix wurde dann dreimal mit je einem doppelten Volumen von TBS-ATP (20 mM Tris, 150 mM NaCI, 0,5 mM ATP (Adeosintriphosphat), pH 7,6) gewaschen und danach fünf Minuten bei Raumtemperatur mit einem doppelten Volumen von Elutionspuffer l (TBS-ATP mit 2M Harnstoff) eluiert. .· Der Überstand wurde gesammelt. Die Prozedur wurde zweimal mit Elutionspuffer II (TBS-ATP mit 6M Harnstoff) wiederholt und die Überstände wurden gegen destilliertes Wasser bei 4· C dialysiert

Die Dialysate, die die Proteine enthielten, wurden lyophilisiert und mit Hilfe von Polyacrylamidgelelektrophorese und IgE-lmmunoblot analysiert (Abb. 8,9,10,11). ERGEBNISSE: BEISPIEL 1:

IgE Bindungsfähigkeit eines Teilstücks der P14 cDNA, das ein IgE bindendes Epitop enthält

Die 3'-Region der P14 cDNA (bp 419-478) wurde in die EcoRI Stelle von Lambda gt11 Moniert und als ein IgE-bindendes Polypeptid exprimiert (21) wie in Abb. 2 gezeigt. Das /9-Galactosidase-Fusionsprotein (Spur 4) band stark an IgE des Patienten, während die Kontrollspuren 1 und 2 mit den Proteinen von E. coli Y1089 und den Proteinen von E. coli Y1089, die mit Lambda gt11 Phagen ohne Insert infiziert waren, keine IgE-Bindung zeigten. Dieses Beispiel 2eigt, daß auch ein Teil-cDNA Klon, der zumindest ein Epitop des P14 Moleküls enthält, zur Verfügung gestellt wird. Daraus folgt, daß Teil-cDNA Klone, die rekombinante Polypeptide kodieren, oder synthetische Polypeptide IgE-bindende Epitope repräsentieren können, die in ähnlicher Weise wie das vollständige P14 Molekül oder homologe Proteine nützlich für Therapie oder Diagnose sein können. BEISPIEL 2:

Demonstration von zu P14 homologen Polynukleotiden und Polypeptiden innerhalb der Ordnung Fagales

Der Northern (RNA) Blot (Abb. 3) zeigt, daß die P14 Sequenz in der Lage ist, mit Pollen-mRNA aus Erle und Hasel unter stringenten Bedingungen zu kreuzhybridisieren. Die Sequenzhomologie der korrespondierenden Allergene der Bäume der Ordnung Fagales kann deshalb schon auf der Nukleinsäureebene demonstriert werden. Abb. 1 hatte bereits eine ähnliche IgE-Bindungskapazität der zu PI 4 homologen Proteine von Erle, Hasel und Hainbuche gezeigt Daraus wird gefolgert, daß die P14 cDNA Polypeptide von ähnlicher IgE Bindungsfähigkeit und Antigenität wie die nahe verwandten Baumpollenailergene kodiert. BEISPIEL 3:

Sequenzanalyse

Abb. 4 zeigt die Sequenz der cDNA, die P14 kodiert. Enthalten ist der vollständige Protein kodierende. Bereich. In der Abbildung ist die Sequenz des Peptids unterstrichen, das an /8-Galactosidase gekoppelt ein IgE-bindendes Epitop darstellt (siehe BEISPIEL 4).

Abb. 5 illustriert die Sequenzhomologie zwischen dem P14 Protein der Birke und menschlichem, Maus-, Kalb-, Hefe- und Acanthamoeba Profilin (13,12,14,11,10).

Die Kreuzreaktivität von Patienten-lgE mit P14 und menschlichem Profilin ist in Abb.12 gezeigt. Ähnliche chemische Eigenschaften dieser verwandten Proteine wurden auch durch ihre gemeinsame Affinität zu poly(L-Prolin) aufgezeigt (Abb. 8,10). Diese Daten geben einen Hinweis darauf, daß die Profiline 4

AT 400 198 B von Arten, die evolutionär so weit voneinander entfernt sind wie Mensch und Birke, als kreuzreaktive Panallergene wirken können, die zu einer IgE Autoimmunreaktivißt in Patienten führen können. BEISPIEL 4: s

Expression der P14 kodierenden cDNA in E. coli als Fusions- bzw. Nichtfusionsprotein und Nachweis der IgE-Bindungsfähigkeit dieser Polypeptide.

Das Polynukleotid, das für P14 kodiert, wurde in das Plasmid pKK223-3 inseriert, so daß ein io rekombinantes Nichtfusionsprotein (31) hergestellt werden konnte, während im Plasmid pEXB ein rekombin-antes Fusionsprotein produziert wurde (32). Die Reaktivität dieser Polypeptide mit Patienten-lgE wird in Abb- 6 gezeigt. Kontrollproteinextrakte von E.coli in den Spuren 1, 2, 5, und 6 binden kein IgE während rekombinantes P14 exprimiert als ein Nichtfusionsprotein (Spur 3, 4) und als ein Fusionsprotein (Spur 7, 8) IgE bindet 75 , ln Abb. 7 wurden Sera von Birkenpollenallergikern (A-K), Graspollenallergikern (L-N), Beifußallergikem (O-Q) und ein Pool von nicht allergischen Individuen (R), die alle gemäß ihrer Krankengeschichte, RAST und Hauttest ausgewählt worden waren, auf ihr IgE-Bindungsvermögen mit rekombinanten P14 getestet. IgEs der Sera D, E, F, l, J und P banden an P14 exprimiert in pKK223-3.

Daraus folgt, daß diese Erfindung ein Polynukleotid zur Verfügung stellt, das für Polypeptide kodiert, 20 welche ähnliche Antigenität und ähnliches IgE-Bindungsvermögen besitzen wie das P14 Protein der Birke, wenn das Polynukleotid im korrekten Leserrahmen von verschiedenen Expressionssystemen inseriert ist. Die IgE Bindungseigenschaften dieser Polypeptide konnten für Sera von Patienten, die mit verschiedenen Pollen allergische Reaktionen zeigen, demonstriert werden und weisen damit auf die große klinische Relevanz dieser Polypeptide hin (Abb. 7). 25 BEISPIEL 5 :

Reinigung von P14 aus Pollen und des rekombinanten P14 aus E. coli. 30 Wie in Materialien und Methoden beschrieben stellt diese Erfindung eine einfache Methode zur Verfügung, um natürliches wie rekombinantes P14 zu reinigen. Das Coomassie gefärbte Polyacrylamidgel in Abb. 8 zeigt daß reines P14 (Spur 3, 4 und 5) von Gesamtpollenprotein (Spur 1) getrennt werden kann. Die Proteine, die nicht an poly(L-Prolin)-Sepharose binden, werden auch gezeigt (Spur 2). Die Effizienz dieser Reinigungsmethode wurde mittels IgE Immunobiotting (Abb. 9) überwacht, wobei hierzu Serum eines 35 Patienten verwendet wurde, der die meisten Birkenpollenallergene mit IgE Antikörpern erkennt (Spur 1). Nach der Anwendung der Affinitätsmethode kann nahezu kein P14 gefunden werden (Spur 2) während in Spur 3, 4 und 5 das gereinigte P14 erhalten wurde.

Abb. 10 zeigt ein Polyacrylamidgel' das die Reinigung vonrekombinantem P14 aus E.COli JM105 demonstriert, der mit dem Plasmid pKK223-3 transformiert ist, das die P14-kodierende Sequenz trägt. Aus 40 den Gesamtproteinen (Spur 1) wurde rekombinantes P14 (Spur 3, 4) abgetrennt, die verbleibenden Proteine zeigt Spur 2. Abb.11 zeigt, daß aus E, coli JM105 transformiert mit pKK223-3 ohne Insert kein homologes Protein mittels der angewendeten Methode erhalten wird.

Wie Abb. 9, 6 und 7 zeigen, behält das gereinigte Protein (aus Birke und E. coli) seine IgE-Bindungsfähigkeit. So zeigt dieses Beispiel, daß die vorliegende Erfindung auch ein einfaches und rasches 45 Reinigungsverfahren für P14 als nicht rekombinantes wie als rekombinantes Polypeptid zur Verfügung stellt. Bei diesem Verfahren behält es seine Antigenißt und sein IgE-Bindungsvermögen. Die Methode bietet darüber hinaus eine Möglichkeit, das immunologisch aktive Polypeptid zu immobilisieren. BEISPIEL 6: so

IgE Reaktivität von allergischen und atopischen Patienten mit humanem Profilin

Verschiedene Patientensera wurden wie folgt ausgewählt (Abb. 12):

Patient 1 zeigt IgE Antikörper, die gegen die meisten Birkenpollenallergene einschließlich Betvl und P14 55 gerichtet sind, Patient 2 zeigt IgE Bindung ausschließlich mit P14 und Patient 3 ausschließlich mit ßefvl. Patient 4 ist ein Hausstaubmilbenallergiker und der Serumpool 5 wurde von nicht allergischen Individuen zusammengestellt. Spur 6 ist die Pufferkontrolle. All diese Sera wurden auf ihr IgE-Bindungsvermögen mit nichtrekombinantem und rekombinantem P14 und humanem Profilin getestet. Jeder Patient, der das 5

AT 400 198 B nichtrekombinante P14-aus Birke sowie das rekombinante P14 aus E. coli erkannte, hatte auch IgE Antikörper gegen das humane Profilin. Deshalb gibt diese Erfindung zum ersten Mal Hinweise auf molekularem Niveau, daß Autoimmunmechanismen eine Rolle bei atopischen und allergischen Erkrankungen spielen könnten. Da Patienten mit anderen Autoimmunerkrankungen Antikörper gegen P14 bilden, könnte diese Erfindung einen diagnostischen Marker für diese Erkrankungen liefern. BEISPIEL 7 :

Korrelation der Krankengeschichten von atopischen und allergischen Patienten mit der Bindung von IgE-Antikörpern an P14

Die Fallgeschichten von Patienten, die IgE-Antikörper gegen P14 bilden, zeigen, daß alle von ihnen unter schweren allergischen Symptomen leiden, die durch ganz verschiedene Allergene verursacht werden (Baum- und Graspollen, Milben-, Katzen- und Hundealiergene), daß sie einen erhöhten Gesamt-lgE Spiegel haben und eine unbefriedigenden Verlauf bei der Hyposensibilisierungstherapie zeigen. Daraus folgt, daß eine positive Reaktion des Serum-lgE der Patienten mit P14 als ein guter Marker zur Differenzierung von bestimmten Gruppen von Atopie- und Allergiepatienten verwendbar ist. LITERATUR: 1. L. Yman. Botanicai relations und immunologica! cross-reactions in pollen ailergy, 2nd ed. Uppsala, Sweden: Pharmacia AB, 1982. 2. W. R. Thomas, K.-Y. Chua, W. K. Greene und G. A. Stewart. Recombinant mite allergens. In: Epitopes of atopic allergens. A. H. Sehon, D. Kraft, und G. Kunkel (Hrsg.) UCB Institute of Ailergy, Brussels 1990. 3. E. Jarolim, M. Tejkl, M. Rohac, G. Schlerka, M. Breitenbach, 0. Scheiner, D. Kraft H. Rumpold. Monoclonal antibodies against birch pollen allergens; characterization by immunoblotting und use for single-step affinity purification of the major allergen flefvl. Int. Arch. Ailergy Appl. Immunol 90, 54-60 (1989). 4. H. Ipsen, H. Bowadt, H. Janniche, B. Nüchel Petersen, E. P. Munch, J. A. Wihl und H. Loewenstein. Immunochemical characterization of reference alder {Ainus glutinosa) und hazel {Corytus avellana) pollen extracts und the partial immunochemical identity between the major allergens of alder, birch, und hazel pollen. Ailergy 40, 510-518 (1985). 5. H. Rumpold, M. Rohac, B. Bohle, M. Breitenbach, 0. Scheiner und D. Kraft. The relationship of Betvi epitopes recognized by patients’ IgE und monoclonal anti-ßefvl antibodies. In: Epitopes of atopic allergens. A. Sehon,D. Kraft und G. Kunkel (Hrsg.). The UCB Institute of Ailergy, Brussels 1990. 6. R.Valenta, H. Breiteneder, K. Pettenburger, M. Breitenbach, H. Rumpold, D. Kraft und 0. Scheiner. Homology of the major pollen allergens of alder, hazel, und hombeam at the nucieic acid level as determined by cross-hybridization. J. Ailergy Clin. Immunol., zur Veröffentlichung eingereicht. 7. B. Nüchel Petersen, H. Janniche, E. P. Munch, J. A. Wihl, H. Böwadt H. Ipsen und H. Loewenstein. immunotherapy with partially purified und standardized tree pollen extracts. Ailergy 43,353-362 (1988). 8. J. A. Wihl, H. Ipsen, B. Nüchel Petersen, E. P. Munch, H. Janniche und H. Loewenstein. Immunotherapy with partially purified tree polten extracts. Ailergy 43, 363-369 (1988). 9. H. Ipsen, B. Schwartz, J. A. Wihl, B. Nüchel Petersen, E. P. Munch, H. Janniche und H. Loewenstein. Immunotherapy with partially purified und standardized tree pollen extracts. Ailergy 43, 370-377 (1988). 10. C- Ampe, J. Vandekerckhove, S. L. Brenner, L. Tobacman und E. D. Kom. The amino acid sequence of Acanthamoeba profilin. J. Biol. Chem. 260, 834-840 (1985). 11. V. Magdoien, U. Oechsner, G. Müller und W. Bandlow. The intron-containing gene for yeast profilin (PFV) encodes a vital function. Mol. Cell. Biol. 8, 5108-5115 (1988). 12. J. S. Widada, C. Ferraz und J.-P. Liautard. Total coding sequence of profilin cDNA from Mus musculus macrophage. Nucl. Acids Res. 17,2855 (1989). 13. D. J. Kwiatkowski und G. A. P. Bruns. Human profilin. Motecular cloning, sequence comparison. und chromosomal analysis. J. Biol. Chem. 263,5910-5915 (1988). 14. C. Ampe, F. Markey, U. Lindberg und J. Vandekerckhove. The primary structure of human platelet profilin: reinvestigation of the calf spieen profilin sequence. FEBS Lett 228,17-21 (1988). 15. U. Lindberg, C. E. Schutt, E. Hellsten, A.-C. Tjäder und T.Hult. The use of poly(L-proline)-Sepharose in the Isolation of profilin und profilactin complexes. Biochim. Biophys. Acta 967,391-400 (1988). 16. M. Tanaka und H. Shibata. Poly(L-proline)-binding proteins from chick embryos are a profilin und a profilactin. Eur. J. Biochem. 151, 291-297 (1985). 6

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Figuren:

Fig. 1: IgE Immunoblot: Pollenproteine aus Birke (B), Hainbuche (CA), Erle (A) und Hasel (C) wurden mit Hilfe von einer 12.5% Polyacrylamid-Elektrophorese aufgetrennt und auf Nitrocellulose geblottet. Die Nitrocellulose wurde in Streifen geschnitten (1-5), die mit Serumverdünnungen (1:5, 1:10,1:20, 1:40, 1:80) von einem ausgewählten Patienten inkubiert wurden, der mit seinen IgE Antikörpern die wichtigsten Birkenpollenaliergene erkannte. Pfeile und Sternchen zeigen die Molgewichte an. Das gebundene Serum-IgE wurde mit Hilfe einer Autoradiographie von daran gebundenen 125 J markierten Anti-Human IgE Antikörpern von Kaninchen detektiert. Die IgE-bindenden Proteine von Birke, Erle, Hasel und Hainbuche entsprachen sich, was die Ähnlichkeit der Antigene demonstriert Fig. 2: IgE Immunoblot:

Proteine wurden mit Hilfe einer 7.5% Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt und auf Nitrocellulose geblottet. Spur B: Birkenpollenproteine, Spur 1: Proteine aus E. coli Y1089 (lysogener Wirt) , Spur 2: Proteine von E. coli Y1089 infiziert mit dem Lambda gt11 Phagen ohne Insert, Spur 3: Proteine aus E. coli Y1089 infiziert mit einem rekombinanten Phagen, der ein Kontrollinsert trägt (Positivkontrolle), Spur 4: Proteine aus £ coli Y1089 infiziert mit den rekombinanten Phagen, die den 3’-Anteil der P14 cDNA enthielten, der für ein IgE bindendes Epitop kodiert, Spur 5: Proteine aus Hefe (Saccharomyces cerevi-siae).

Rekombinante jS-Gaiaktosidase-Fusionsproteine mit IgE-Bindungsfähigkeit, deren Molekulargewichte zwi- 7

Claims (4)

1. AT 400 198 B sehen 120 und 130 kD betrugen (Spur 3 und 4) wurden mit 125 J -markiertem Anti-Human IgE Antiserum aus Kaninchen detektiert Keine vergleichbare IgE-Bindung findet in Spur 1, 2 und 5 statt, während Spur B das IgE-Bindungsprofil des Patienten zeigt Fig. 3: Northern (RNA) Blot: Zehn ug Pollen RNA von Erle (Spur A), Birke (Spur B) und Hasel (Spur C) und als Marker RNA von £ coli (Spur M) wurden auf Nitrocellulose geblottet. Die P14 cDNA hybridisiert mit Pollen-mRNA von Erle, Birke und Hasel und ergibt unter stringenten Bedingungen (0.75 x SSC, 0.1% SDS, 50 *C) ein Signal bei 800 Basen. Fig. 4: cDNA Sequenz von P14. Der Leserahmen beginnt mit dem ATG (Basenpaare 80-82) und endet mit dem Stopcodon TAG (Basenpaare 479-481). Die abgeleitete Aminosäuresequenz ist unter der DNA Sequenz abgebildet. Die Sequenz von P14, die innerhalb eines Fusionsproteins in der Lage ist, IgE von Patienten zu binden und deshalb ein Epitop darstellt, ist unterstrichen dargestellt. Fig. 5: Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenz von P14 mit der Aminosäuresequenz des humanen (13), Kalbs- (14), Maus- (12), Hefe- (11) und Acanthamoeba (10) Profilins. Identische Aminosäurereste sind markiert. Der Prozentsatz von identischen Aminosäureresten zwischen dem P14 Protein der Birke und den Homologen beträgt 30% zum humanen Protein, 28% zu den homologen Proteinen von Kalb und Maus, 26% zum Hefeprotein und 25% zum Acanthamoeba Protein. Fig. 6: Western (Protein) Blot eines Polyacrylamid Gels geprobt mit IgE Antikörpern von Patienten Spur 1: Proteine von £. coli JM105 ohne Plasmid, Spur 2: Proteine von E. coli JM105 mit dem Plasmid pKK223-3 ohne Insert, Spur 3, 4: Proteine von E. coli JM105 mit jenem aus pKK223-3 abgeleiteten Plasmid, das von der inserierten cDNA das P14 Protein als Nichtfusionsprotein exprimiert, Spur 5: £ coli AR58 Proteine, Spur 6: E. coli AR58 mit dem Piasmid pEXB ohne Insert, Spur 7, 8: Extrakte aus £. coli AR58 transformiert mit dem aus pEXB abgeleiteten Plasmid, das die p14 cDNA als Fusionsprotein exprimiert, Spur 9: Birkenpollen-Proteinextrakt (Positivkontrolle). Fig. 7: Sera von verschiedenen allergischen Patienten wurden auf ihre IgE-Reaktivität gegenüber rekombinantem P14 getestet, das in pKK223-3 exprimiert war. Patienten D, E, F, I, J, und P zeigen IgE Bindung an das rekombinante P14. Spur R ist die Pufferkontrolle. Fig. 8: Coomassie-Färbung eines Polyacryiamidgels: Spur M Molekulargewichtsmarker, Spur 1: Gesamtpollenproteine der Birke, Spur 2: Birkenpollenproteine, aus denen nach der Affinitätsmethode P14 entfernt worden ist, Spur 3,4, und 5: eluiertes P14. Fig. 9: IgE Immunoblot: Eine in gleicher Weise gewonnene Probe von Proteinen wie in Abb. 8 wurde auf Nitrocellulose transferiert und mit Serum-lgE von einem Patienten inkubiert, der die meisten Birkenpollenallergene erkennt. Spuren 1-5 enthalten dasselbe Material wie in Abb. 8, Spur 6 enthält den Molekulargewichts-Marker. Fig. 10: Coomassie-gefärbtes Polyacrylamidgel. Spur M: Molekulargewichtsmarker, Spur 1: Gesamtproteine von E.coli JM105 mit dem aus pKK223-3 abgeleiteten Plasmid, das die P14 cDNA exprimierte, Spur 2: Proteinfraktion nach der Entfernung des rekombinanten P14, Spuren 3 und 4 : gereinigtes rekombinantes P14 - eluierte Fraktionen. Fig. 11: Coomassie-gefärbtes Polyacrylamidgel. Spur M: Molekulargewichtsmarker, Spur 1: Gesamtprotein aus Eco// JM105 mit dem Plasmid pKK223-3 ohne Insert, Spur 2: Proteinfraktion nach poly(L-Prolin)-Reinigüng, Spuren 3, 4 und 5: eluierte Fraktionen die zeigen, dafi aus dem Expressionssystem ohne Insert kein zu P14 homologes Protein isoliert werden kann. Fig. 12: IgE Immunoblot: Gereinigtes humanes Profilin wurde auf ein 12% Polyacrylamidgel geladen und auf Nitrocellulose geblottet. Von der Nitrocellulose wurden Streifen geschnitten und in folgender Weise inkubiert: Streifen 1 wurde mit Serum-lgE von einem Patienten inkubiert, der die meisten Birkenpollenailer-gene, P14 eingeschlossen, erkannte, Streifen 2 wurde mit Serum IgE von einem Patenten inkubiert, der nur P14 in Birkenpollenextrakten erkannte, Streifen 3 wurde mit Serum von einem Patienten inkubiert, dessen Serum-lgE nur gegen ßefvl gerichtet war, Streifen 4 wurde mit dem Serum eines Milbenallergikers inkubiert Streifen 5 mit Serum von einer Gruppe von nichtallergischen Spendern und Streifen 6 zeigt die Pufferkontrolle. IgE-Bindung wurde mit einem 125 J markierten Anti-Human IgE Antiserum vom Kaninchen nachgewiesen. Patentansprüche 1. Verwendung von poly(L-Prolin) zur in vitro Diagnose, die auf der Affinität zu einem Protein oder Polypeptid beruht, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein oder Polypeptid die Antigenität des P14 Proteins oder eines Epitops davon besitzt, wobei die Aminosäuresequenz der in Abbildung 4 gezeigten Sequenz im Ganzen oder in Teilen entspricht. 8 AT 400 198 B
2. 2. Verfahren zur Reinigung eines Proteins oder eines Polypeptids, das der Antigenität des P14 Proteins entspricht, dessen Aminosäuresequenz der in Abbildung 4 gezeigten Sequenz im Ganzen oder in Teilen entspricht, dadurch gekennzeichnet, daß Poly(L-Prolin) für eine affinitive Reinigung eingesetzt wird. 5
3. 3. Verfahren zur Reinigung von nativem Pollenextrakt, dadurch gekennzeichnet, daß das P14 Allergen, dessen Aminosäuresequenz der in Abb.
4. 4 gezeigten Sequenz im Ganzen oder in Teilen entspricht, durch affinitive Bindung an poly(L-Prolin) entfernt wird. to Hiezu 12 Blatt Zeichnungen 75 / so 25 30 35 40 45 SO 9 55