DE69434665T2

DE69434665T2 - Ein hausmilbeallergen (der p iii), dessen anwendung und dafür kodierte nukleinsäuren

Info

Publication number: DE69434665T2
Application number: DE69434665T
Authority: DE
Inventors: R. Wayne Nedlands THOMAS; Graduate Institute of Immunology Kaw-Yan 1 Jen-Ai Road 1st Section CHUA; L. Bruce Belmont ROGERS; Mei-chang Winchester KUO
Original assignee: INST CHILD HEALTH RES WEST PER; Institute for Child Health Research; Heska Corp
Current assignee: Institute for Child Health Research; Heska Corp
Priority date: 1993-12-08
Filing date: 1994-12-07
Publication date: 2007-02-08
Anticipated expiration: 2014-12-08
Also published as: AU1302795A; NO962407L; JPH09510083A; NZ277698A; ATE320445T1; US20110059522A1; KR20040004481A; NO962407D0; US9447154B2; US6752991B1; DE69434665D1; AU697491B2; EP0733064A1; US6180771B1; NO317850B1; EP0733064B1; CA2177612C; US20110117116A1; ES2260760T3; US7666429B2

Description

Hintergrund der Erfindung
Nahezu 10% der Bevölkerung reagiert überempfindlich (allergisch), nachdem sie einer Vielzahl von Quellen in der Umwelt ausgesetzt worden waren. Solche Antigene, die unmittelbare und/oder verzögerte Arten von Überempfindlichkeit hervorrufen, sind als Allergene bekannt ((King, T. P., (1976) Adv. Immunol. 23: 77-105). Diese umfassen Produkte aus Gräsern, Bäumen, Unkräutern, Tieren, Hautschuppen, Insekten, Nahrungsmitteln, Medikamenten und Chemikalien. Es wird angenommen, dass die genetische Veranlagung einer einzelnen Person bei der Entwicklung von unmittelbaren Reaktionen auf Allergene eine Rolle spielt (Young, R.P-et al. (1990) Clin. Sci., 79: 19a), wie z.B. bei einer atopischen Allergie oder einem anaphylaktischen Schock, deren Symptome Heuschnupfen, Asthma und Nesselsucht umfassen.
Die bei einer atopischen Allergie eine Rolle spielenden Antikörper gehören primär zu der IgE-Klasse der Immunglobuline. IgE bindet sich über einen spezifischen hochaffinen Rezeptor Fc⎕RI an basophile Zellen, Mastzellen und dendritische Zellen (Kinet. JP., (1990) Curr. Opin. Immunol., 2:499-505). Nach der Kombination eines als Ligand fungierenden Allergens mit seinem verwandten IgE-Rezeptor kann der an das IgE gebundene Fc⎕RI auf der Zelloberfläche vernetzt werden, was zu physiologischen Anzeichen für die IgE-Allergen-Wechselwirkung führt. Diese physiologischen Wirkungen umfassen neben anderen Substanzen die Freisetzung von Histamin, Serotonin, Heparin, (einem) chemotaktische(n) Faktor(en) für eosinophile Leukozyten und/oder die Leukotriene C4, D4 und E4, welche für eine längere Zusammenziehung der glatten Muskulatur der Bronchien sorgen (Hood, L.E. et al. Immunology (2. Ausg.), The Benjamin/Cumming Publishing Co, Inc. (1984)). Daher hat die Wechselwirkung eines Allergens mit IgE letzlich allergische Symptome zur Folge, welche durch die Freisetzung der obigen Mediatoren ausgelöst werden. Solche Symptome können je nach dem Eintrittsweg des Antigens und dem Verteilungsmuster des IgE auf Mastzellen). oder basophilen Zellen ihrer Natur nach systemisch oder lokal sein. Ein lokales Erscheinungsbild tritt im Allgemeinen auf epithelialen Oberflächen am Eintrittsort des Allergens auf. Systemische Wir kungen können eine Anaphylaxie (anaphylaktischen Schock) hervorrufen, was auf eine IgE-Antwort auf basophile Zellen bis hin zu einem zirkulierenden (intravaskulären) Antigen zurückzuführen ist.
In Studien mit gereinigten Allergenen ist gezeigt worden, dass etwa 80% der Patienten mit Allergie gegen die Milbe Dermatophagoides pteronyssinus ge gen Der p I und Der p II reaktives IgE produzieren (Chapman M.D. et al., J. Immunol. (1985) 76:; Van der Zee J.S. et al., J. Allergy Clin. Immunol., (1988) 81: 884-95). Für etwa die Hälfte der Patienten stellen diese spezifischen Wirkungen 50% der gegen die Milben gerichteten IgE-Antikörper dar. Das kürzlich als Trypsin identifizierte Allergen Der p III (Stewart GA. et al., Immunology (1992) 75: 29-35) reagiert mit einer ähnlichen oder höheren Häufigkeit (Stewart GA. et al., supra; Ford S.A. et al., Clin. Ex. Allergy (1989) 20: 27-31). In der bis heute einzigen quantitativen Studie wird berichtet, dass die Forscher ermittelten, dass das Ausmaß der IgE-Bindung an Der p III beträchtlich geringer war als das an Der p I. Mit elektrophoretischen Techniken (Ford S.A. et al., supra; Bengtsson A. et al, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. (1986) 80: 383-90; Lind. P. et al., Scand J. Immunol. 1983) 17: 263-37; Tuvey E.R. et al., J. Allergy Clin. Immunol. (1987) 79: 93-102) ist gezeigt worden, dass die meisten Seren IgE enthalten, das andere Allergene erkennt.
Die Bedeutung der Reaktivität von IgE gegen Der p III bleibt ungewiss. Es ist berichtet worden, dass die Reaktivität dieser Gruppe von Allergenen bei Einsatz eines Flüssigphasen Assays (Heymann et al., J. Allergy Clin. Immunol. (1989) 83: 1055-1067) so niedrig wie 16% ist und bei Einsatz eines RAST Assays (Stewart et al., Immunology (1992) so hoch wie 100%. Von verschiedenen anderen Forschern wurde eine Reaktivität zwischen 60-83% angegeben ((Tovey et al., J. Allergy Clin. Immunol. (1987) 79: 93-102; Thomas et al.; Exp. Appl. Acarol (1991) 16: 153-164); Yasueda et al., Clin. Exp. Allergy (1993) 23: 384-390). Die Widersprüche in der Häufigkeit der IgE-Reaktivität gegen Allergene der Gruppe III sind entweder den Unterschieden in der Reinheit der untersuchten Allergen-Präparate oder den Unterschieden in der Empfindlichkeit der eingesetzten Assay-Techniken zuzuschreiben. Um die Bedeutung besonderer Spezifitäten bei allergischen Reaktionen zu ermitteln, ist es notwendig, Mengen eines reinen Allergen zu verwenden, mit welchem quantitative IgE-Bindungstests und Untersuchungen über die Häufigkeit und das Lymphokin-Profil der T-Zell-Antworten gegen das Allergen möglich sind.
Viele Patienten mit einer Sensitivität gegen Haisstaubmilben-Allergene werden zur Zeit durch Verabreichung von kleinen, allmählich steigenden Dosen von Extrakten aus Hausstaubmilben behandelt.
Der Einsatz dieser Extrakte weist eine Vielzahl von Nachteilen auf, einschließlich eine mögliche Anaphylaxie während der Behandlung sowie die Notwendigkeit einer fortwährenden Therapie, oft über einen Zeitraum von einigen Jahren, um eine ausreichende Toleranz und eine signifikante Verminderung der klinischen Symptome aufzubauen. Die Möglichkeit, Zusammensetzungen des Hausstaubmilben-Allergens Der p III zu ersetzen, würde einige dieser Nachteile überwinden. Somit wäre eine Quelle für ein reines Allergen, das in einer Menge zur Verfügung gestellt werden könnte, um als diagnostisches oder therapeutisches Mittel Verwendung finden zu können, sowie therapeutische Verfahren, welche die mit den Extrakten von Hausstaubmilben einhergehenden Nachteile überwinden würden, höchst erwünscht.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung stellt, wie in Anspruch 1 beansprucht, eine rekombinante oder synthetische Nukleinsäure, die für ein Der p III Proteinallergen kodiert, zur Verfügung. In einem anderen Aspekt bezieht sich die Erfindung, wie in Anspruch 2 beansprucht, auf einen rekombinanten Expressionsvektor. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung wie in Anspruch 3 beansprucht, auf eine Wirtszelle; bevorzugte Merkmale dieser Wirtszelle werden in Anspruch 4 beansprucht. In einem weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung, wie in Anspruch 5 bansprucht, auf ein Verfahren, in einem Subjekt die Sensibilität gegen ein Hausstaubmilben-Allergen nachzuweisen. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung, wie in Anspruch 5 bansprucht, ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung. Bevorzugte Aspekte dieses Verfahrens sind in den Ansprüchen 7 bis 9 angegeben. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung, wie in Anspruch 10 bansprucht, ein chemisches Syntheseverfahren.
Isolierte Nucleinsäuren, welche Peptide mit mindestens einer biologischen Aktivität von Der p III, einem Allergen der Spezies Dermatophagoides pteronyssinus, aufweisen, werden ebenfalls beschrieben. Eine bevorzugte Nucleinsäure ist eine cDNA mit einer in 1A und 1B (SEQ ID NO: 1) wiedergegebenen Nucleotidsequenz. Peptide die von der gesamten cDNA (SEQ ID NO: 1) oder einem Teil derselben codiert werden und über mindestens eine biologische Aktivität von Der p III verfügen, werden ebenfalls beschrieben. Ebenfalls angestrebt sind isolierte Nucleinsäuren, die unter hochstingenten Bedingungen (z.B. äquivalent zu 20-27°C unterhalb des Tm und 1 M NaCl) an eine Nucleinsäure mit einer in 1A und 1B (SEQ ID NO: 1) gezeigten Nucleotidsequenz hybridisieren oder welche eine Peptid mit der gesamten oder einem Teil der in 1A und 1B (SEQ ID NO: 2) gezeigten Aminosäuresequenz codieren. Nucleinsäuren, welche Peptide mit einer Aktivität von Der p III codieren und mindestens 50% Homologie mit einer in 1A und 1B (SEQ ID NO: 2) gezeigten Sequenz aufweisen, werden ebenfalls beschrieben. Peptide mit einer Aktivität von Der p III, welche durch rekombinante Expression einer erfindungsgemäßen Nucleinsäure gewonnen wurden sowie Peptide mit einer Aktivität von Der p III, welche durch chemische Synthese hergestellt wurden, sind ebenfalls Gegenstand dieser Erfindung. Bevorzugte Peptide verfügen über die Fähigkeit, eine T-Zellantwort zu induzieren, welche eine Stimulation der T-Zellen (gemessen z.B. mittels T-Zell-Proliferation oder Sekretion von Cytokin) oder eine T-Zell-Resistenz umfassen kann (z.B. bringt der Kontakt mit dem Peptid oder einem Komplex des Peptids mit einem MHC-Molekül einer Antigen präsentierenden Zelle die T-Zelle dazu, auf stimulatorische Signale nicht mehr zu reagieren oder für eine Proliferation nicht mehr befähigt zu sein). Andere bevorzugte Peptide, entweder ohne die oder zusätzlich zu der Fähigkeit, eine T-Zellantwort zu induzieren, weisen die Fähigkeit auf, sich an das für die Hausstaubmilben spezifische IgE von Subjekten mit einer Allergie gegen Hausstaubmilben zu binden. Solche Peptide sind für ein Subjekt bei der Diagnose der Empfindlichkeit gegen Hausstaubmilben nützlich. Noch andere Peptide, entweder ohne die oder zusätzlich zu der Fähigkeit, eine T-Zellantwort zu induzieren, verfügen über eine deutlich verminderte oder vernachlässigbare Fähigkeit, sich an das für eine Allergie gegen Hausstaubmilben verantwortliche IgE zu binden. Solche Peptide sind als therapeutische Mittel von besonderem Nutzen.
Andere bevorzugte Peptide umfassen eine in 1A und 1B (SEQ ID NO: 2) gezeigte Aminosäuresequenz. Peptide mit einer Der p III-Aktivität und mit einem Abschnitt der Aminosäuresequenz der 1A und 1B (SEQ ID NO: 2) werden ebenfalls offenbart und weisen mindestens eine Länge von etwa 8-30 Aminosäuren, vorzugsweise etwa 10-20 Aminosäuren und am meisten bevorzugt etwa 10-16 Aminosäuren auf.
Auch Antikörper, welche spezifisch mit einem Peptid mit einer Der p III-Aktivität reagieren, werden beschrieben . Ein Peptid mit einer Der p III-Aktivität lässt sich in für eine pharmazeutische Verabreichung geeigneten Zusammensetzungen einsetzen. Beispielsweise können solche Zusammensetzungen auf ähnliche Weise wie die Extrakte von Hausstaubmilben eingesetzt werden, um bei einem Subjekt allergische Reaktionen gegen Hausstaubmilben zu behandeln oder zu verhindern. Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren und Peptide mit Der p III-Aktivität lassen sich auch bei einem Subjekt für die Diagnose der Empfindlichkeit gegen Hausstaubmilben einsetzen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1A und 1B zeigen die vollständige Nucleotidsequenz (SEQ ID NO: 1) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 2) des Der p III-Klons.
Die 2A und 2B zeigen die Aminosäuresequenzen von Der p III und einem Trypsin-Protein des Flusskrebses (SEQ ID NO: 3).
3 zeigt die Ergebnisse einer SDS-PAGE-Analyse verschiedener Konzentrationen von rekombinantem Der p III (Spur 1, 4,3 μg; Spur 2, 8,7 μg; Spue 3, 13,8 μg; Spur 3, 17,4 μg; die Marker sind durch M gekennzeichnet).
Genaue Beschreibung der Erfindung
Es werden isolierte Nucleinsäuren beschrieben, welche Peptide mit mindestens einer biologischen Aktivität von Der p III, einem Allergen der Gruppe III, aus der Gattung Dermatophagoides pteronyssinus codieren. Vorzugsweise ist die Nucleinsäure eine cDNA mit einer in den 1A und 1B (SEQ ID NO: 1) wiedergegebenen Nucleotidsequenz.
Die in den 1A und 1B (SEQ ID NO: 1) gezeigte cDNA codiert ein Der p III-Peptid, das einen vorhergesagten Prä-pro-Abschnitt aus 29 Aminosäuren enthält, welche von den Nucleotiden 63 bis 149 codiert werden. Diese Leader-Sequenz wird im reifen Der p III nicht gefunden, welches von den Basen 150 bis 845 codiert wird. Die auf dieser cDNA basierende abgeleitete Aminosäuresequenz wird ebenfalls in den 1A und 1B (SEQ ID NO: 2) gezeigt. Die cDNA codiert ein reifes Peptid von 232 Resten mit einem berechneten Molekulargewicht von 24.985 Dalton und enthält 7 Cysteinreste. In der cDNA kommt 179 Nucleotide nach der letzten Base eine Signalsequenz für eine Polyadenylierung vor (siehe 1A und 1B). Eine Kultur von E. coli, das mit einem Expressionsvektor mit der das Der p III codierenden cDNA transfiziert worden war, wurde gemäß dem Budapest-Abkommen am 15. Oktober 1993 bei der American Type Culture Collection hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer 69472.
Isolierte Nucleinsäuren mit Nucleotidsequenzen, die Der p III codieren, Fragmente desselben, welche Peptide mit mindestens einer biologischen Aktivität von Der p III codieren und/oder Äquivalente solcher Nucleinsäuren werden ebenfalls beschrieben. Der hier verwendete Ausdruck Nucleinsäure soll auch solche Fragmente und Äquivalente mit einschließen. Der Ausdruck Äquivalent soll Nucleotidsequenzen umfassen, die funktionell äquivalente Der p III-Peptide mit Der p III-Aktivität codieren. Definitionsgemäß verfügt ein Peptid mit einer Der p III-Aktivität mindestens über eine biologische Aktivität des Der p III-Allergens. Äquivalente Nucleotidsequenzen umfassen Sequenzen, die sich in einer oder mehreren Nucleotidsubstitutionen, Additionen oder Deletionen wie allele Varianten unterscheiden und sie umfassen auch Sequenzen, die sich wegen der Degeneration des genetischen Codes von der Nucleotidsequenz unterscheiden, die das in den 1A und 1B (SEQ ID NO: 1) gezeigte Der p III codiert. Äquivalente umfassen auch Nucleotidsequenzen, die unter stringenten Bedingungen (d.h. äquivalent zu ca. 20 bis 27°C unter der Schmelztemperatur (Tm) und ca. 1 M Salz) an die in den 1A und 1B (SEQ ID NO: 1) gezeigte Nucleotidsequenz von Der p III hybridisieren.
Peptide, die hier als mit einer Aktivität des Der p III oder mit Der p III-Aktivität bezeichnet werden, sind hier als Peptide definiert, welche eine Aminosäuresequenz aufweisen, die der gesamten oder einem Teil der in den 1A und 1B (SEQ ID NO: 2) gezeigten Aminosäuresequenz von Der p III entspricht. Beispielsweise kann ein Peptid mit einer Aktivität von Der p III die Fähigkeit besitzen, eine Reaktion in von Der p III-beschränkten T- Zellen zu induzieren, wie z.B. eine Stimulation (z.B. eine Proliferation von T-Zellen oder eine Sekretion von Cytokinen) oder eine Resistenz der T-Zellen zu induzieren. Alternativ oder zusätzlich kann ein Peptid mit einer Aktivität von Der p III die Fähigkeit besitzen, sich an Immunglobulin E- (IgE)-Antikörper von Subjekten mit einer Allergie gegen Hausstaubmilben zu binden (oder von ihnen erkannt zu werden). Peptide, die sich an IgE binden sind bei Verfahren zum Nachweis einer allergischen Empfindlichkeit gegen Der p III bei einem Subjekt von Nutzen. Peptide, die nicht an IgE gebunden werden oder sich in geringerem Ausmaß an IgE binden als ein gereinigtes natives Der p III-Protein an IgE gebunden wird sind als therapeutische Mittel besonders nützlich.
Die Nucleinsäure kann eine cDNA sein, die ein Peptid mit einer Aktivität von Der p III codiert. Vorzugsweise ist die Nucleinsäure ein cDNA-Molekül mit mindestens einem Abschnitt der Nucleotidsequenz, die das in den 1A und 1B (SEQ ID NO: 1) gezeigte Der p III codiert. Ein bevorzugter Abschnitt der cDNA-Moleküle der 1A und 1B (SEQ ID NO: 1) umfasst den codierenden Bereich des Moleküls.
Die Nucleinsäure kann ein Peptid mit Der p III-Aktivität codieren und umfasst eine in den 1A und 1B (SEQ ID NO: 2) gezeigte Aminosäuresequenz. Bevorzugte Nucleinsäuren codieren ein Peptid mit Der p III-Aktivität und mit mindestens etwa 50% Homologie, mehr bevorzugt mit mindestens etwa 60% Homologie und am meisten bevorzugt mit mindestens etwa 70% Homologie mit der in den 1A und 1B (SEQ ID NO: 2) gezeigten Sequenz. Nucleinsäuren, welche Peptide mit Der p III-Aktivität codieren und mindestens ca. 90%, mehr bevorzugt mindestens ca. 95% und am meisten bevorzugt mindestens ca. 98-99% Homologie mit einer in den 1A und 1B (SEQ ID NO: 2) gezeigten Sequenz aufweisen, werden ebenfalls offenbart. Homologie bezieht sich auf eine Ähnlichkeit in der Sequenz zwischen zwei Peptiden mit Der p III-Aktivität oder zwischen zwei Nucleinsäuremolekülen. Homologie lässt sich ermitteln, indem in jeder Sequenz eine Position verglichen wird, welche für Vergleichszwecke in einer Reihe dargestellt wird. Wird in der verglichenen Sequenz eine Position von derselben Base oder Aminosäure eingenommen, sind die Moleküle in dieser Position homolog. Ein Grad der Homologie zwischen Sequenzen ist eine Funktion der den Sequenzen gemeinsamen Anzahl der übereinstimmenden oder homologen Positionen.
Eine Nucleinsäure, welche unter hoch- oder niedrigstringenten Bedingungen an eine Nucleinsäure hybridisiert, die ein Peptid mit der gesamten oder einem Teil einer in den 1A und 1B (SEQ ID NO: 2) gezeigten Aminosäuresequenz codiert, wird ebenfalls offenbart. Geeignete Stringenzbedingungen, unter denen eine DNA-Hybridisierung abläuft, z.B. 6,0 × Natriumchlorid/Natriumcitrat (SSC) bei ca. 45°C, gefolgt von einem Waschvorgang von 2,0 × SSC bei 50°C sind dem Fachmann bekannt oder lassen sich in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y (1989), 6.3.1-6.3.6 nachlesen. Beispielsweise kann die Salzkonzentration im Waschschritt unter einer niedrigen Stringenz von ca. 2,0 × SSC bei 50°C bis zu einer hohen Stringenz von ca. 0,2 × SSC bei 50°C ausgesucht werden. Zusätzlich kann die Temperatur im Waschschritt von niedrigen Stringenzbedingungen bei Zimmertemperatur, etwa 22°C, bis zu hohen Stringenzbedingungen bei ca. 65°C angehoben werden.
Isolierte Nucleinsäuren, die, wie hier beschrieben, Peptide mit Der p III-Aktivität codieren und eine Sequenz aufweisen, die sich wegen der Degeneration des genetischen Codes von den in den 1A und 1B (SEQ ID NO: 1) gezeigten Nucleotidsequenzen unterscheiden, werden ebenfalls offenbart. Solche Nucleinsäuren codieren funktionell äquivalente Peptide (d.h. ein Peptid mit Der p III-Aktivität), unterscheiden sich aber wegen der Degeneration des genetischen Codes in ihrer Sequenz von den Sequenzen der 1A und 1B (SEQ ID NO: 1). Beispielsweise wird eine Anzahl von Aminosäuren durch mehr als ein Triplett bestimmt. Codons, welche für die gleiche Aminosäure stehen, oder Synonyme (z.B. sind CAU und CAC Synonyme für Histidin) können zu "stillen" Mutationen führen, welche keine Auswirkungen auf die Aminosäuresequenz des Der p III-Proteins haben. Es wird jedoch davon ausgegangen, dass DNA-Sequenz-Polymorphismen, welche zu Änderungen in der Aminosäuresequenz von Der p III führen, in einer Population von Hausstaubmilben vorkommen. Der Fachmann wird jedoch richtig einzuschätzen wissen, dass diese Variationen in einem oder mehreren Nucleotiden (bis zu etwa 3–4% der Nucleotide) der Nucleinsäuren, welche Peptide mit Der p III-Aktivität codieren, wegen der natürliche allelen Variation unter einzelnen Hausstaubmilben auftreten können. Jede und alle solchen Nucleotidvariationen und die daraus resultierenden Aminosäurepolymorphismen werden hier ebenfalls offenbart. Ferner können eine oder mehrere Isoformen oder verwandte, eine Kreuzreaktion eingehende Familienglieder von Der p III vorkommen. Solche Isoformen oder Familienglieder sind definiert als Proteine, welche hinsichtlich ihrer Funktion und Aminosäuresequenz mit Der p III verwandt sind, sie werden aber von Genen an unterschiedlichen Orten codiert.
Fragmente der Der p III codierenden Nucleinsäure werden ebenfalls offenbart. Der hier verwendete Ausdruck Fragment der Der p III codierenden Nucleinsäure bezieht sich auf eine Nucleotidsequenz mit weniger Nucleotiden als die Nucleotidsequenz, welche die gesamte Aminosäuresequenz des Der p III-Proteins codierent und welche ein Peptid mit einer wie hier definierten Der p III-Aktivität codiert (d.h. ein Peptid mit mindestens einer biologischen Aktivität des Der p III-Allergens).
Bevorzugte Nucleinsäurefragmente codieren Peptide mit einer Länge von mindestens 10 Aminosäureresten, vorzugsweise mit einer Länge von mindestens etwa 10-20 Aminosäureresten und mehr bevorzugt mit einer Länge von etwa 10-16 Aminosäureresten. Peptide mit Der p III-Aktivität codierende Nucleinsäure-Fagmente mit einer Länge von mindestens etwa 30 Aminosäureresten, mit einer Länge von mindestens etwa 40 Aminosäureresten, mit einer Länge von mindestens etwa 60 Aminosäureresten, mit einer Länge von mindestens etwa 80 Aminosäureresten, mit einer Länge von mindestens etwa 100 Aminosäureresten und mit einer Länge von mindestens etwa 200 Aminosäureresten oder mehr werden hier ebenfalls offenbart.
Die Nucleinsäurefragmente umfassen solche, die in der Lage sind, unter hoch- oder niedrigstringenten Bedingungen mit Nucleinsäuren aus anderen Tierarten zu hybridisieren, um zum Nachweis von Der p III oder Allergenen, die mit Der p III eine Kreuzreaktion eingehen beim Screening verwendet zu werden. Im Allgemeinen wird die Nucleinsäure, welche ein Peptid mit Der p III-Aktivität codiert aus den Basen ausgesucht, welche das reife Protein codieren, es kann jedoch in einigen Fällen erwünscht sein, das gesamte oder ein Teil eines Peptids aus dem Leadersequenzabschnitt der Nucleinsäuren auszuwählen. Die Nukleinsäuren können auch Linkersequenzen, modifizierte Restriktionsendo-nucleaseorte und andere für das molekulare Clonen, die Expression oder Reinigung von rekombinanten Peptiden mit Der p III-Aktivität nützliche Sequenzen enthalten.
Eine ein Peptid mit Der p III-Aktivität codierende Nucleinsäure lässt sich aus in Hausstaubmilben der Spezies Dermatophagoides pteronyssinus vorkommender mRNA erhalten. Es sollte auch möglich sein, Der p III codierende Nucleinsäuren aus genomischer DNA von Dermatophagoides pteronyssinus zu erhalten. Beispielsweise kann das Der p III codierende Gen entweder aus einer cDNA- oder einer Genom-Bibliothek nach den hier beschriebenen Verfahrensweisen cloniert werden. Eine Der p III codierende cDNA kann erhalten werden, indem die gesamte mRNA von Dermatophagoides pteronyssinus isoliert wird. Aus der gesamten mRNA lassen sich dann doppelsträngige cDNAs präparieren. Danach können die cDNAs unter Einsatz einer jeden der zahlreichen im Stand der Technik bekannten Techniken in ein geeignetes Plasmid oder einen Bakteriophagenvektor insertiert werden. Der p III codierende Gene lassen sich auch unter Einsatz bewährter Polymerasekettenreaktionstechniken gemäß der von der Erfindung gelieferten Information über die Nucleotidsequenz clonieren. Die Nucleinsäuren können DNA oder RNA sein. Eine bevorzugte Nucleinsäure ist eine Der p III codierende cDNA mit der in den 1A und 1B (SEQ ID NO: 1) wiedergegebenen Sequenz.
Expressionsvektoren, welche eine ein Peptid mit Der p III-Aktivität codierende Nucleinsäure enthalten, welche funktionsfähig mit mindestens einer regulatorischen Sequenz verbunden ist, werden ebenfalls offenbart. Funktionsfähig verbunden soll bedeuten, dass die Nucleotidsequenz so an eine regulatorische Sequenz gebunden ist, dass eine Expression der Nucleotidsequenz stattfinden kann. Regulatorische Sequenzen sind im Stand der Technik bekannt und werden ausgesucht, um die Expression der Peptide mit Der p III-Aktivität durch eine transfizierte Wirtszelle zu dirigieren. Der Begriffregulatorische Sequenz umfasst demgemäß Promotoren, Enhancer und andere Kontrollelemente der Expression. Solche regulatorischen Sequenzen sind in Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) beschrieben. Man sollte beachten, dass der Aufbau des Expressionsvektors von solchen Faktoren wie der Wahl der zu transformierenden Wirtszelle und/oder dem zu exprimierenden gewünschten Proteintyp abhängen kann. Der Expressionsvektor kann eine DNA aufweisen, die ein Peptid mit Der p III-Aktivität codiert. Solche Expressionsvektoren können dazu verwendet werden, Zellen zu transfizieren, um dadurch Proteine oder Peptide, einschließlich Fusionsproteine oder Peptide, die von den hier beschriebenen Nucleinsäuren codiert werden, zu gewinnen.
Eine Wirtszelle, die transfiziert wurde, um ein Peptid mit Der p III-Aktivität zu exprimieren, wird ebenfalls beschrieben. Die Wirtszelle kann eine beliebige prokaryotische oder eukaryotische Zelle sein. Beispielsweise lässt sich ein Peptid mit Der p III-Aktivität in Bakterienzellen wie E. coli, in Insektenzellen (Baculovirus), in Hefezellen oder in Säugerzellen wie den Eizellen von chinesischen Hamstern (CHO) exprimieren. Andere geeignete Wirtszellen lassen sich aus Goedel, (1990) supra entnehmen oder sind dem Fachmann bekannt.
Die Expression in eukaryotischen Zellen wie in Säugerzellen, Hefe- oder Insektenzellen kann zu einer teilweisen oder vollständigen Glykosylierung und/oder Bildung relevanter Disulfidbindungen zwischen den oder innerhalb der Ketten des rekombinanten Proteins führen. Beispiele von Vektoren für die Expression in der Hefe S. cerevisiae sind pYepSec1 (Badari et al., (1987) Embo J., 6: 229-234), pMFa (Kurjan und Herskowitz, (1982) Cell, 30: 933-943), pJRY88 (Schiltz et al., (1987) Gene, 54: 113-123) sowie pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vektoren von Bakuloviren, die zur Expression von Proteinen in kultivierten Insektenzellen (SF 9-Zellen) zur Verfügung stehen sind die pAc-Serie (Smith et al., (1983) Mol. Cell Biol., 3: 2156-2165) und die pVL-Serie (LOucklow, V. A. und Summers, M.D., (1989) Virology, 170: 31-39). Im Allgemeinen kommen für eine transiente Amplifikation/Expression in Säugerzellen COS-Zellen (Gluzman, Y, (1981) Cell, 23: 175-182) zusammen mit solchen Vektoren wie pCDM 8 (Aruffe, A. und Seed, B., (1987) Proc. Natl. Sci. USA, 83: 8573-8577) zum Einsatz, während CHO (dhfr – Chinese Hamster Ovary)-Zellen mit Vektoren wie pMT2PC (Kaufmann et al., (1987) EMBO J., 6: 187-195) für eine stabile Amplifikation/Expression in Säugerzellen eingesetzt werden. Vektor-DNA lässt sich in Säugerzellen über herkömmliche Techniken wie die Mitfällung von Calciumphosphat oder Calciumchlorid, eine DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion oder mittels Elektroporation einführen. Geeignete Verfahren zur Transformation von Wirtszellen sind in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) und in anderen Laborhandbüchern zu finden.
Die Expression in Prokaryonten erfolgt meistens in E. coli entweder mit durch Fusion oder durch keine Fusion induzierbaren Expressionsvektoren. Fusionsvektoren hängen gewöhnlich an die exprimierten Zielgene eine Anzahl von NH₂-endständigen Aminosäuren an. Diese NH₂-endständigen Aminosäuren werden oft als Reportergruppe bezeichnet. Solche Reportegruppen dienen gewöhnlich zwei Zwecken: 1) die Löslichkeit des rekombinanten Zielproteins zu erhöhen; und 2) bei der Reinigung des rekombinanten Zielproteins zu helfen, indem sie bei der Affinitätsreinigung als Ligand fungieren. Oft wird bei Fusionsexprerssionsvektoren an der Verbindung der Reportergruppe und dem rekombinanten Zielprotein eine proteolytische Spaltungsstelle eingeführt, um die Abtrennung des rekombinanten Zielproteins von der Reportergruppe nach der Reinigung des Fusionsproteins zu ermöglichen. Solche Enzyme und ihre verwandten Erkennungssequenzen sind Faktor Xa, Thrombin und Enterokinase. Typische Fusionsexpressionsvektoren sind pGEX (Amrad Corp., Melbourne, Australien), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRITS (Pharmacia, Piscataway, NJ), welche Gluthathion-S-Transferase, das Maltose-E-Bindungsprotein bzw. Protein A an das rekombinante Zielprotein fusionieren. Eine bevorzugte Reportergruppe ist Poly(His), welches bei einer Chromatographie mit Metallchelaten dafür sorgt, dass das rekombinante Fusionsprotein leicht gereinigt werden kann.
Induzierbare, nicht durch Fusion erhaltene Expressionsvektoren sind pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69: 301-315) und pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology: 185: Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89). Während die Expression des Zielgens auf der Transkription der Wirts-RNA-Polymerase vom Hybrid-trp-lac-Fusionspromotor in pTrc beruht, beruht die Expression der in pET 11d insertierten Zielgene auf der Transkription des von der mitexprimierten viralen RNA-Polymerase (T7 gal) vermittelten T7-gal-O-lac-O-Fusionspromotors. Diese virale Polymerase wird von den Wirtsstämmen B121(DE3) oder HMS174(DE3) aus einem residenten ⎕-Prophagen geliefert, der T7 gn1 unter der Transkriptionskontrolle des lacUV 5-Promotors beherbergt.
Eine Strategie, die Expression von rekombinantem Der p III in E. coli zu maximieren liegt darin, das Protein in einem Wirtsbakterium mit beeinträchtigter Kapazität zu exprimieren, um das rekombinante Protein zu spalten (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzmology, 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128). Eine andere Strategie würde darin bestehen, die Nucleinsäure zu ändern, welche das in einen Expressionsvektor zu insertierende Der p III-Protein codiert, so dass die einzelnen Codons für jede Aminosäure solche sein würden, welche vorzugsweise in hoch exprimierten E. coli-Proteinen verwendet werden (Wade et al., (1992) Nuc. Acids Research, 20: 2111-2118). Eine solche Änderung von erfindungsgemäßen Nucleinsäuren kann über standardmäßige DNA-Synthesetechniken erfolgen.
Die Nucleinsäuren der Erfindung lassen sich auch unter Einsatz von Standardtechniken chemisch synthetisieren. Es sind verschiedene Verfahren bekannt, Polydesoxynucleotide auf chemischem Wege zu synthetisieren, einschließlich der Festphasensynthese, welche wie die Peptidsynthese in handelsüblichen DNA-Synthesizern voll automatisiert worden sind (Siehe z.B. Itakura et al., US-Patent 4,598,049; Caruthers et al., US-Patent 4,459,066 und Itakura, US-Patent 4,401,796 sowie 4,373,071, welche hiermit als Referenz eingeführt werden).
Auch Verfahren zur Herstellung von Peptiden mit Der p II-Aktivität werden offenbart. Beispielsweise kann eine Wirtszelle, die mit einem Nucleinsäurevektor transfiziert worden ist, welcher die Expression einer ein Peptid mit Der p III-Aktivität codierenden Nucleotidsequenz dirigiert, unter geeigneten Bedingungen kultiviert werden, damit das Peptid exprimiert werden kann. Das Peptid kann aus einer Mischung von Zellen und dem das Peptid mit Der p III-Aktivität enthaltenden Medium ausgeschieden und isoliert werden. Alternativ kann das Peptid im Cytoplasma zurückgehalten und die Zellen geerntet, lysiert und das Protein dann isoliert werden. Eine Zellkultur umfasst Wirtszellen, Medien und andere Nebenprodukte. Geeignete Medien für eine Zellkultur sind im Stand der Technik gut bekannt. Unter Einsatz von im Stand der Technik bekannten Verfahren zur Reinigung von Proteinen einschließlich der Ionenaustausch-chromatographie, der Gelfiltrationschromatographie, der Ultrafiltration, der Elektrophorese und der Immunoaffinitätsreinigung mit spezifischen Antikörpern für solche Peptide lassen sich Peptide aus dem Zellkulturmedium, den Wirtszellen oder beiden isolieren.
Isolierte Peptide mit Der p III-Aktivität werden ebenfalls offenbart. Ein Peptid mit Der p III-Aktivität verfügt mindestens über eine biologische Aktivität des Der p III-Allergens. Beispielsweise kann ein Peptid mit Der p III-Aktivität die Fähigkeit besitzen, eine Reaktion in Der p III-spezifischen T-Zellen wie z.B. eine Stimulation (T Zell-Proliferation oder Cytokinsekretion) oder auch keine Reaktion der T-Zellen zu induzieren. Ein Peptid mit Der p III-Aktivität stimuliert T-Zellen, wie dies z.B. durch eine T-Zell-Proliferation oder Cytokinsekretion angezeigt wird. Peptide mit Der p III-Aktivität stimulieren eine T-Zell-Resistenz, wobei die T-Zellen, nachdem sie einem Der p III-Protein ausgesetzt worden waren, in der Folge auf ein Der p II-Peptid oder natives Der p II-Protein nicht reagieren. Im Vergleich mit dem gereinigten nativen Der p III-Protein verfügt ein Peptid mit Der p III-Aktivität nur über eine verminderte IgE-Bindungsaktivität. Ein Peptid mit Der p III-Aktivität kann sich von der in den 1A und 1B (SEQ ID NO: 2) wiedergegebenen Aminosäuresquenz des Der p III unterscheiden, solche Unterschiede führen jedoch zu einem modifizierten Protein, das auf die gleiche oder ähnliche Weise wie das Der p III-Protein funktioniert oder das die gleichen oder ähnliche Eigenschaften eines nativen Der p III-Proteins aufweist. Verschiedene Modifikationen des Der p III-Proteins zur Produktion solcher und anderer funktionell gleich wirkender Peptide werden hier ausführlich beschrieben. Der hier verwendete Ausdruck Peptid bezieht sich auf Peptide, Proteine und Polypeptide.
Ein Peptid kann durch Modifikation der Aminosäuresequenz des in den 1A und 1B (SEQ ID NO: 2) gezeigten Der p III-Proteins hergestellt werden, wie z.B. durch eine Substitution, Addition oder Deletion eines oder mehrerer Aminosäurereste. Solche Modifikationen können an Aminosäureresten stattfinden, die für die biologische Aktivität des Peptids keine Rolle spielen oder die Modifikationen können an solchen Aminosäureresten stattfinden, um eine besondere biologische Aktivität zu steigern oder zu eliminieren. Die hier beschriebenen Peptide können eine Länge von mindestens etwa 8 Aminosäure-resten, vorzugsweise eine Länge von etwa 10-20 Aminosäureresten und mehr bevorzugt eine Länge von etwa 10-16 Aminosäureresten aufweisen. Peptide, die über eine Der p III-Aktivität verfügen und die eine Länge von mindestens etwa 30 Aminosäureresten, eine Länge von mindestens etwa 40 Aminosäureresten, eine Länge von mindestens etwa 60 Aminosäureresten, eine Länge von mindestens etwa 80 Aminosäureresten, eine Länge von mindestens etwa 100 Aminosäure-resten und eine Länge von mindestens etwa 200 oder mehr Aminosäureresten aufweisen liegen ebenfalls im Geltungsbereich dieser Erfindung.
Peptide von einem verwandten Allergen der Gruppe III aus der Spezies Dermatophagoides farinae, Der f III, werden auch beschrieben. Solche Peptide sind aus einem gereinigten nativen Der f III-Protein isoliert worden und umfassen sie Sequenzen:
IVGGVKAKAGDSPYQISLQSSSHFXGGSILD (SEQ ID NO: 15), eine N-terminale Sequenz;
MICGGDVANGGVDSEQGD (SEQ ID NO: 10), ein internes Peptid: und
MTLDQTNAKPVPLPTS (SEQ ID NO: 12), ein internes Peptid.
Ein im Wesentlichen reines Präparat eines Peptids mit Der p III-Aktivität wird ebenfalls beschrieben. Ein solches Präparat ist im Wesentlichen frei von Proteinen und Peptiden, mit denen das Peptid natürlich, entweder in einer Zelle oder wenn es von einer Zelle ausgeschieden wird, vorkommt (d.h. andere Peptide der Hausstaubmilbe).
Der hier verwendete Ausdruck isoliert bezieht sich auf eine Nucleinsäure oder ein Peptid, welche, wenn sie durch rekombinante DNA-Techniken gewonnen wurden, frei von Zellmaterial oder Kulturmedium sind oder, wenn sie chemisch synthetisiert wurden, frei von chemischen Vorläufersubstanzen oder anderen chemischen Stoffen sind. Solche Proteine oder Peptide sind auch dadurch gekennzeichnet, dass sie frei von allen anderen Hausstaub-Proteinen der Milbe sind. Demgemäß wird ein isoliertes Peptid mit Der p III-Aktivität auf rekombinantem oder chemischem Wege gewonnen und ist im Wesentlichen frei von Zellmaterial und Kulturmedium oder im Wesentlichen frei von chemischen Vorläufersubstanzen oder anderen chemischen Stoffen und ist im Wesentlichen frei von allen anderen Proteinen Der Hausstaubmilbe. Eine isolierte Nucleinsäure ist auch frei von Sequenzen, welche in dem Organismus, aus welchem die Nucleinsäure stammt, natürlicherweise die Nucleinsäure flankieren (das sind Sequenzen, die an den 5'- und 3'-Enden der Nucleinsäure sitzen).
Peptide mit Der P III-Aktivität können beispielsweise erhalten werden, indem die Peptide gescreent werden., die aus dem entsprechenden Fragment der Nucleinsäure von Der p III, welche solche Peptide codiert, auf rekombinantem Wege gewonnen werden. Zusätzlich lassen sich Fragmente chemisch synthetisieren, indem im Stand der Technik bekannte Techniken eingesetzt werden, wie z.B. die Merrifield-Festphasentechnik unter Verwendung von t-Moc und t-Boc. Beispielsweise kann das Der p III-Protein willkürlich in zwei Fragmente von gewünschter Länge ohne Überlappung der Fragmente oder vorzugsweise in überlappende Fragmente von gewünschter Länge aufgeteilt werden. Die Fragmente können (rekombinant oder durch chemische Synthese) gewonnen und getestet werden, um solche Peptide zu identifizieren, die über Der p III-Aktivität verfügen (d.h. die Fähigkeit aufweisen, eine Antwort der T-Zellen wie z.B. eine Stimulation (Proliferation, Sekretion von Cytokinen) oder Resistenz zu induzieren und/oder die eine verminderte IgE-Bindungsaktivität aufweisen).
Peptide mit Der p III-Aktivität können durch die Fähigkeit der Peptide identifiziert werden, T-Zellen zu stimulieren oder eine Resistenz der T-Zellen zu induzieren. T-Zellen stimulierende Peptide, welche z.B. durch die Proliferation von T-Zellen oder die Sekretion von Cytokinen ermittelt wurden, sind hier so definiert, dass sie über mindestens ein T-Zell-Epitop verfügen. Es wird angenommen, dass T-Zell-Epitope am Beginn und bei der Fortdauer der Immunantwort auf das Allergenprotein, das für die klinischen Symptome der Allergie verantwortlich ist, eine Rolle spielen. Es wird angenommen, dass diese T-Zell-Epitope frühe Ereignisse auf der Stufe der T-Helferzellen auslösen, indem sie sich an geeignete HLA-Moleküle auf der Oberfläche einer Antigen präsentierenden Zelle binden und dadurch mit dem relevanten T-Zell-Rezeptor für das Epitop die T-Zell-Subpopulation stimulieren. Diese Ereignisse führen zu einer Proliferation der T-Zellen, einer Sekretion von Lymphokinen, lokalen Entzündungsreaktionen, der Rekrutierung zusätzlicher Immunzellen an den Ort der Wechselwirkung von Antigen und T-Zellen und der Aktivierung der B-Zellkaskade, welche zur Produktion von Antikörpern führt. Ein Isotyp dieser Antikörper, IgE, ist bei der Ausbildung allergischer Symptome von ganz besonderer Wichtigkeit und seine Produktion wird in der Kakade von Ereignisse früh auf der Stufe der T-Helferzellen durch die Natur der ausgeschiedenen Lymphokine beeinflusst. Ein T-Zell-Epitop ist das Grundelement oder die kleinste Einheit für die Erkennung durch einen T-Zell-Rezeptor, wobei das Epitop zur Erkennung des Rezeptors essentielle Aminosäuren umfasst. Aminosäure-sequenzen, welche solche der T-Zellepitope nachahmen und die allergische Antwort auf Proteinallergene modifizieren, werden ebenfalls beschrieben.
Das Screening von Peptiden nach solchen, welche, wie hier beschrieben, eine Der p III-Aktivität aufweisen, kann unter Einsatz von einem oder mehreren der einzelnen verschiedenen Assays erfolgen. Beispielsweise lässt sich in vitro die stimulatorische Aktivität des Der p III gegen T-Zellen untersuchen, indem ein Peptid, von dem bekannt ist oder von dem vermutet wird, dass es über Der p III-Aktivität verfügt, mit einer Antigen präsentierenden Zelle in Kontakt gebracht wird, die in einer Kultur aus T-Zellen geeignete MHC-Moleküle präsentiert. Wird ein Peptid mit Der p III-Aktivität in Assoziation mit geeigneten MHC-Molekülen T-Zellen zusammen mit der nötigen Costimulierung präsentiert, hat dies die Wirkung einer Transmission eines Signals an die T-Zelle, das die Produktion größerer Mengen von Cytokinen, insbesondere von Interleukin-2 und Interleukin-4, induziert. Der Kulturüberstand kann erhalten und auf Interleukin-2 oder andere bekannte Cytokine hin untersucht werden. Beispielsweise lässt sich jeder der einzelnen verschiedenen Assays für Interleukin-2 verwenden, wie z.B. der in Proc. Natl. Acad. Sci USA, 86: 1333 (1989) beschriebene. Ein Kit für einen Assay zur Produktion von Interferon kann auch von der Genzyme Corporation (Cambridge, MA) bezogen werden.
Alternativ wird in einem allgemeinen Assay zur Proliferation von T-Zellen der Einbau von Tritium markiertem Thymidin gemessen. Die Proliferation von T-Zellen kann in vitro gemessen werden, indem die Menge an ³H-markiertem Thymidin ermittelt wird, das in die replizierende DNA der kultivierten Zellen eingebaut worden ist. Folglich lässt sich die DNA-Syntheserate und andererseits die Zellteilungsrate quantitativ angeben.
Ein Peptid mit Der p III-Aktivität wird auf die Fähigkeit, T-Zell-Resistenz zu induzieren, gescreent. Die Fähigkeit eines Peptids, von dem bekannt ist, dass es T-Zellen stimuliert (ermittelt nach einem oder mehreren der obigen Assays ), um die Aktivität von gereinigtem nativen Der p III oder einen Teil davon zu hemmen oder völlig zu blockieren und einen Zustand von Resistenz zu induzieren, lässt sich ermitteln, indem nachfolgende Versuche bei der Stimulation der T-Zellen mit Antigen präsentierenden Zellen verwendet werden, welche nach der Exposition des Peptids mit Der p III-Aktivität natives Der p III oder ein Peptid mit Der p III-Aktivität präsentieren. Wenn die T-Zellen nicht auf die nachfolgende Aktivierungsversuche ansprechen, was durch die Synthese von Interleukin-2 und/oder die Proliferation von T-Zellen ermittelt wird, ist ein Zustand von Resistenz induziert worden. Siehe z.B. Gimmi et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6586-6590 und Schwartz (1990) Science, 248: 1349-1356 zu Assay-Systemen, die als Grundlage für einen Assay gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können.
Peptide mit Der p III-Aktivität werden über die IgE-Bindungsaktivität identifiziert. Für therapeutische Zwecke binden die hier beschriebenen Peptide vorzugsweise kein IgE, das spezifisch für ein Allergen der Hausstaubmilbe ist oder sie binden solches IgE in einem wesentlich geringeren Ausmaß als das entsprechende gereinigte native Allergen der Hausstaubmilbe solches IgE bindet. Reduzierte IgE-Bindungsaktivität bezieht sich auf eine IgE-Bindungsaktivität, welche geringer ist als die von gereinigtem nativen Der p III-Protein. Soll ein Peptid mit Der p III-Aktivität als diagnostisches Reagenz eingesetzt werden, ist es nicht nötig, dass das Peptid im Vergleich mit nativem Der p III-Allergen eine reduzierte IgE-Bindungsaktivität aufweist. Die IgE-Bindungsaktivität von Peptiden lässt sich z.B. mit einem Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) ermitteln, indem beispielsweise Seren verwendet werden, welche von einem Subjekt (d.h. einem allergischen Subjekt) erhalten wurden, welches zuvor dem nativen Der p III-Allergen ausgesetzt worden war. Kurz gesagt wird das Peptid, von dem angenommen wird, dass es eine Der p III-Aktivität aufweist in die Vertiefungen einer Mikrotiter-Platte eingetragen. Nach Waschen und Blockierung der Vertiefungen wird in den Vertiefungen eine Lösung von Antikörpern induziert, die aus dem Plasma eines allergischen Subjekts besteht, welches einem Peptid ausgesetzt worden ist, von dem angenommen wurde, dass es Der p III-Aktivität aufweist. Vor der Inkubation ist das Plasma im Allgemeinen frei von IgG. In die Vertiefungen wird ein markierter sekundärer Antikörper eingetragen und inkubiert. Das Ausmaß der IgE-Bindung wird sodann quantitativ ermittelt und mit der Menge von IgE verglichen, die von einem gereinigten nativen Der p III- Protein gebunden wurde. Alternativ lässt sich die IgE-Bindungsaktivität eines Peptids mit der Western Blot-Analyse ermitteln. Beispielsweise wird ein Peptid, von dem erwartet wird, dass es Der p III-Aktivität aufweist, auf einem Polyacrylamidgel unter Einsatz des SDS-PAGE laufen gelassen. Das Peptid wird sodann auf Nitrocellulose übertragen und sodann mit Seren aus einem allergischen Subjekt inkubiert. Nach Inkubation mit einem markierten sekundären Antikörper wird sodann die Menge des gebundenen IgE ermittelt und quantitativ bestimmt.
Ein anderer Assay, der zur Bestimmung der IgE-Bindungsaktivität eines Peptids Verwendung finden kann ist ein kompetitiver ELISA-Assay. Kurz gesagt wird ein Pool aus IgE-Antikörpern angelegt, indem Plasma von Subjekten mit Allergie gegen Hausstaubmilben, von denen mit einem direkten ELISA gezeigt wurde, dass sie gegen natives Der p III IgE-reaktiv sind, vereinigt wird. Dieser Pool wird in kompetitiven ELISA-Assays dazu verwendet, die IgE-Bindung von nativem Der p III und einem Peptid, von dem angenommen wird, dass es Der p III-Aktivität aufweist, miteinander zu vergleichen. Die IgE-Bindung für das native Der p III-Protein und einem Peptid, von dem angenommen wird, dass es Der p III-Aktivität aufweist, wird ermittelt und quantitativ bestimmt.
Falls ein Peptid mit Der p III-Aktivität IgE bindet und als therapeutisches Mittel verwendet werden soll, ist bevorzugt, dass eine solche Bindung nicht zu einer Freisetzung von Mediatoren (z.B. Histaminen) aus Mastzellen oder basophilen Zellen führt. Um zu bestimmen, ob ein Peptid, das IgE bindet, zu einer Freisetzung von Mediatoren führt, kann unter Einsatz von Standardreagenzien und Verfahren, die von Amac. Inc. (Westbrook, ME) erhalten werden können, ein Assay zur Freisetzung von Histamin durchgeführt werden. Kurz gesagt wird eine gepufferte Lösung eines Peptids, von dem angenommen wird, dass es Der p III-Aktivität aufweist, mit einem gleichen Volumen von heparinisiertem Vollblut von einem allergischen Subjekt kombiniert. Nach dem Mischen und Inkubieren werden die Zellen pelettisiert und die Überstände weiterverarbeitet und unter Einsatz eines Radioimmunassays analysiert, um die Menge an freigesetztem Histamin zu bestimmen.
Peptide mit Der p III-Aktivität, die als Therapeutika eingesetzt werden sollen, werden vorzugsweise in Säugermodellen von atopischer Allergie gegen Hausstaubmilben eingesetzt, wie das in Tamura et al., (1986) Microbiol. Immunol., 30: 883-896 oder in dem US-Patent 4,939,239 beschriebene Mausmodell oder das in Chiba et al., (1990) Int. Arch. Allergy Immunol., 93: 83-88 beschriebene Primatenmodell. Das anfängliche Screening nach einer IgE-Bindung an ein Peptid mit Der p IIII-Aktivität kann mit Kratztests oder intrakutanen Hauttests an Labortieren oder menschlichen Freiwilligen durchgeführt werden oder in in vitro-Systemen wie RAST, RAST Hemmung, ELISA-Assay, RIA (Radioimmunassay) oder wie oben beschrieben, in einem Test zur Freisetzung von Histamin.
Es ist möglich, die Struktur eines Peptids mit Der p III-Aktivität für solche Zwecke wie eine höhere Löslichkeit, eine gesteigerte therapeutische oder prophylaktische Wirksamkeit oder Stabilität (z.B. Lagerbeständigkeit ex vivo und Widerstand gegen proteolytischen Abbau in vivo) zu modifizieren. Solche modifizierten Peptide werden als, wie hier definiert, funktionelle Äquivalente von Peptiden mit Der p III-Aktivität angesehen. Zur Modifikation der Immunogenität und/oder Verminderung der Allergenität lässt sich ein modifiziertes Peptid herstellen, in welchem die Aminosäuresequenz geändert worden ist, wie z.B. durch Substitution, Deletion oder Addition von Aminosäuren oder an welche eine Komponente für denselben Zweck angehängt worden ist.
Beispielsweise lässt sich ein Peptid mit Der p III-Aktivität so modifizieren, dass es die Fähigkeit zur Induktion einer T-Zell-Resistenz beibehält und MHC-Proteine bindet, ohne die Fähigkeit zu besitzen, eine starke proliferative Reaktion oder möglicherweise jede proliferative Reaktion zu induzieren, wenn es in immunogener Form verabreicht wird. In diesem Fall können kritische Bindungsreste für die T-Zell-Rezeptorfunktion bestimmt werden, indem bekannte Techniken eingesetzt werden (z.B. die Substitution von jedem Rest und die Ermittlung des Vorkommens oder Fehlens von T-Zell-Aktivität). Solche Reste, von denen gezeigt worden ist, dass sie für die Wechselwirkung mit den T-Zell-Rezeptoren essentiell sind, können durch den Austausch der essentiellen Aminosäure durch einen anderen, vorzugsweise ähnlichen Aminosäurerest (konservative Substitution) modifiziert werden, von dem gezeigt wurde, dass sein Vorkommen die T-Zell-Reaktivität erhöht, vermindert aber nicht eliminiert oder nicht beeinflusst. Zusätzlich lassen sich solche Aminosäurereste, die für eine Wechselwirkung mit dem T-Zell-Rezeptor nicht essentiell sind, modifizieren, indem sie durch eine andere Aminosäure ersetzt werden, deren Einbau die T-Zell-Reaktivität erhöht, vermindert aber nicht eliminiert oder nicht beeinflusst, die Bindung an einen relevanten MHC jedoch nicht eliminiert.
Zusätzlich kann ein Peptid mit Der p III-Aktivität modifiziert werden, indem eine Aminosäure von der gezeigt worden ist, dass sie für die Wechselwirkung mit dem MHC-Protein-Komplex essentiell ist durch einen anderen, vorzugsweise ähnlichen Aminosäurerest (konservative Substitution) ersetzt wird, von dem gezeigt wurde, dass sein Vorkommen die T-Zell-Aktivität erhöht, vermindert aber nicht eliminiert oder nicht beeinflusst. Zusätzlich lassen sich Aminosäurereste, die für eine Wechselwirkung mit dem MHC-Protein-Komplex nicht essentiell sind aber immer noch den MHC-Protein-Komplex binden, modifizieren, indem sie durch eine andere Aminosäure ersetzt werden, deren Einbau die T-Zell-Reaktivität erhöhen, nicht beeinflussen oder vermindern aber nicht eliminieren kann. Bevorzugte Aminosäuresubstitutionen für nicht essentielle Aminosäure sind, jedoch nicht ausschließlich, Substitutionen mit Alanin, Glutaminsäure oder mit einer Methylaminosäure.
Ein weiteres Beispiel für eine Modifikation eines Peptids mit Der p III-Aktivität ist die Substitution von Cysteinresten, vorzugsweise durch Alanin-, Serin-, Threonin-, Leucin- oder Glutaminsäurereste, um eine Dimerisierung über Disulfidbrücken möglichst klein zu halten. Zusätzlich können Aminosäureseitenketten von Fragmenten des Proteins der Erfindung chemisch modifiziert werden. Eine andere Modifikation besteht in einer Cyclisierung des Peptids.
Um die Stabilität und/oder Reaktivität zu erhöhen, kann ein Peptid mit Der p III-Aktivität modifiziert werden, um in die Aminosäuresequenz des aus irgendeiner natürlichen Allelvariation stammenden Allergenproteins einen oder mehrere Polymorphismen einzubauen. Zusätzlich lassen sich D-Aminosäuren, nicht natürliche Aminosäuren oder Nichtaminosäureanaloge substituieren oder anfügen, um modifizierte Proteine im Geltungsbereich der Erfindung herzustellen. Ferner kann ein Peptid mit Der p III-Aktivität modifiziert werden, indem gemäß dem Verfahren von A. Sehon und Mitarbeitern (Wie et al., supra) Polyethylenglykol (PEG) eingesetzt wird, um ein mit PEG konjugiertes Protein herzustellen. Zusätzlich kann PEG während der chemischen Synthese des Proteins zugesetzt werden. Andere Modifikationen des Peptids mit Der p III-Aktivität sind die Reduktion/Alkylierung (Tarr, Methods of Protein Microcharacterization, Hrg. J. E. Silver, Humana Press Clifton NJ 155-194 (1986)); die Acylierung (Tarr, supra); die chemische Kopplung an einen geeigneten Träger (Hrg. Mishell und Shiigi, Selected Methods in Cellular Immunology, WH Freeman, San Francisco, CA (1980), US-Patent 4,939,239) oder eine milde Behandlung mit Formalin (Marsh, (1971) Int. Arch. of Allergy and Appl. Immunology, 41: 199-215).
Um bei einem Peptid mit Der p III-Aktivität die Reinigung zu erleichtern und möglicherweise die Löslichkeit zu erhöhen, ist es möglich, ein Fusionsstück aus Aminosäuren an das Grundgerüst des Peptids anzuhängen. Beispielsweise kann zur Reinigung mittels Ionenaffinitätschromatographie mit immobilisiertem Metall Hexahistidin an das Protein angehängt werden (Hochuli, E. et al., (1988) Bio/Technology, 6: 1321-1325). Um die Isolierung der Peptide frei von irrelevanten Sequenzen zu erleichtern, können zusätzlich spezifische Spaltungsstellen für eine Endoprotease zwischen die Sequenzen des Fusionsstücks und des Peptids eingeführt werden. Um ein Subjekt erfolgreich gegen das Der p III-Protein oder ein verwandtes Allergen unempfindlich zu machen, kann es notwendig sein, die Löslichkeit des Proteins durch Anheften von funktionellen Gruppen an das Protein zu erhöhen oder hydrophobe Bereiche des Proteins weg zu lassen.
Um potentiell dabei zu helfen, dass die T-Zell-Epitope innerhalb eines Der p III richtig auf das Antigen ansprechen, können zwischen die Bereiche über rekombinante oder synthetische Verfahren Protease sensitive Erkennungs-sequenzen eingearbeitet werden, von denen jede mindestens ein T-Zell-Epitop aufweist. Beispielsweise können geladene Aminosäurepaare wie KK oder RR zwischen die Bereiche innerhalb eines Proteins oder Fragments während deren rekombinantem Aufbau eingeführt werden. Die erhaltenen Peptide können für die Spaltung durch Cathepsin und/oder andere Trypsin-ähnliche Enzyme empfindlich gemacht werden, was Abschnitte des Proteins bereitstellen würde, welche über ein oder mehrere T-Zell-Epitope verfügen. Zusätzlich können solche geladenen Aminosäurereste zu einer höheren Löslichkeit des Peptids führen.
Es kann eine zielgerichtete Mutagenese einer ein Peptid mit Der p III-Aktivität codierenden Nucleinsäure eingesetzt werden, um mit im Stand der Technik bekannten Verfahren die Struktur des Peptids zu modifizieren. Solche Verfahren können u.a. die Polymerasekettenreaktion (PCR) mit Oligonucleotidprimern, die eine oder mehrere Mutationen tragen (Ho et al., (1989) Gene, 77: 51-59) oder eine Totalsynthese mutierter Gene (Hostomsky, Z et al., (1989) Biochem. et Biophs. Res. Comm., 161: 1056-1063) umfassen. Um die Expression des rekombinanten Proteins zu steigern, lassen sich die oben angegebenen Verfahren anwenden, um die in der cDNA-Sequenz der Erfindung vorkommenden Codons zu solchen zu verändern, die bevorzugt von der Wirtszelle verwendet werden, in welcher das rekombinate Protein exprimiert werden soll (Wada et al., supra).
Ein Antikörper, der spezifisch mit einem Peptid mit Der p III-Aktivität reagiert, wird ebenfalls beschrieben. Die Antikörper dieser Erfindung lassen sich verwenden, um die Allergenextrakte zu standardisieren oder um die natürlich vorkommende oder native Form von Der p III zu isolieren. Durch den Einsatz von z.B. auf der cDNA-Sequenz von Der p III basierenden Peptiden mit Der p III-Aktivität lassen sich unter Einsatz von Standardverfahren Anti-Protein/Anti-Peptid-Antiseren oder monoklonale Antikörper herstellen. Ein Säugetier wie eine Maus, ein Hamster oder ein Kaninchen kann mit einer immunogenen Form des Peptids (z.B. Der p III-Protein oder ein antigenes Fragment, das zum Auslösen einer Antikörperantwort befähigt ist) immunisiert werden. Techniken, die einem Protein oder Peptid immunogene Eigenschaften verleihen, umfassen die Konjugation an Träger oder andere im Stand der Technik gut bekannte Techniken. Ein Peptid mit Der p III-Aktivität kann in Gegenwart eines Adjuvans verabreicht werden. Das Fortschreiten der Immunisierung lässt sich durch Ermittlung des Antikörpertiters im Plasma oder Serum kontrollieren. Der Standard-ELISA-Assay oder ein anderer Immunoassay kann mit dem Immunogen als Antigen dazu verwendet werden, den Antikörpertiter zu ermitteln.
Nach der Immunisierung können Anti-Der p III-Antiseren erhalten werden und, falls erwünscht, aus dem Serum isolierte polyklonale Anti-Der p III-Antikörper. Zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern können aus einem immunisierten Tier Antikörper produzierende Zellen gewonnen und mit Standardverfahren für eine somatische Zellfusion mit unsterblich gemachten Zellen wie z.B. Myelomzellen fusioniert werden, um Hybridomzellen zu erhalten. Solche Techniken sind im Stand der Technik gut bekannt, z.B. die ursprünglich von Köhler und Milstein, (1975) Nature, 256: 495-497 entwickelte Hybridom-Technik sowie andere Techniken wie die Human-B-Zell-Hybridom-Technik (Kozbar et al., (1983) Immunolog Today, 4: 72) und die EBV-Hybridom-Technik zur Herstellung humaner monoklonaler Antikörper (Cole et al., (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. SS 77-96). Hybridomzellen können immunochemisch auf die Produktion von Antikörpern, die spezifisch mit einem Peptid mit Der p III-Aktivität reagieren und die isolierten monoklonalen Antikörper gescreent werden.
Der hier verwendete Ausdruck Antikörper soll auch deren Fragmente umfassen, die ebenfalls spezifisch mit dem Peptid mit Der p III-Aktivität reagieren. Antikörper lassen sich unter Einsatz konventioneller Techniken fragmentieren und die Fragmente auf ihre Nützlichkeit ebenso screenen, wie dies oben für ganze Antikörper beschrieben wurde. Beispielsweise lassen sich durch Behandeln von Antikörpern mit Trypsin F(ab')₂-Fragmente gewinnen. Die erhaltenen F(ab')₂-Fragmente können behandelt werden, um die Disulfidbrücken zu reduzieren, um Fab'-Fragmente zu gewinnen. Der Antikörper der vorliegenden Erfindung soll ferner biospezifische und chimäre Moleküle mit einem Anti-Der p III-Abschnitt umfassen.
Klone von T-Zellen und lösliche T-Zell-Rezeptoren, die spezifisch mit einem Peptid mit Der p III-Aktivität reagieren, werden ebenfalls offenbart. Monoklonale T-Zell-Populationen (das sind T-Zellen, die untereinander identisch sind und identische T-Zell-Rezeptoren exprimieren) können von einem Individuum mit Sensitivität gegen Der p III erhalten werden, gefolgt von einer repetitiven in vitro-Stimulierung mit einem Der p III-Protein oder Peptid mit Der p III-Aktivität in Gegenwart von an MHC angepassten Antigen präsentierenden Zellen. Einzelne Der p III-MHC-reaktive Zellen können dann geklont werden, indem die Verdünnung und die expandierten und durch periodische in vitro-Restimulation gehaltenen permanenten Reihen limitiert werden. Alternativ lassen sich Der p III-spezifische Hybridome mit Techniken herstellen, die der Produktion von B-Zell-Hybridomen ähnlich sind. Beispielsweise wird ein Säugetier wie eine Maus mit einem Peptid mit Der p III-Aktivität immunisiert, dann die T Zellen gereinigt und mit einer autonom wachsenden T-Zell-Tumorlinie fusioniert. Aus den erhaltenen Hybridomen werden Zellen, die auf ein Peptid mit Der p III-Aktivität ansprechen ausgewählt und kloniert. Verfahren zum Propagieren monoklonaler T-Zellpopulationen werden in Cellular and Molecular Immunology (hrg. K. Abbas et al.), W.B. Saunders Company, Philadelphia, PA (1991) auf Seite 139 beschrieben. Lösliche T-Zell-Rezeptoren, die spezifisch mit einem Peptid mit Der p III-Aktivität reagieren, können mittels Immunopräzipitation unter Einsatz eines Antikörpers gegen den T-Zell-Rezeptor erhalten werden, wie dies in Immunology: A Synthesis (zweite Ausgabe), Hrg. Edward S. Golub et al., Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1991) Seiten 366-369 beschrieben wird.
T-Zell-Klone, welche spezifisch mit einem Peptid mit Der p III-Aktivität reagieren, können eingesetzt werden, um das den betreffenden T-Zell-Rezeptor codierende Gen zu isolieren und molekular zu klonieren. Zusätzlich kann ein löslicher T-Zell-Rezeptor, welcher spezifisch mit einem Peptid mit Der p III-Aktivität reagiert, eingesetzt werden, um die Antigen-abhängige Aktivierung der betreffenden T-Zell-Population zu beeinträchtigen oder zu hemmen, beispielsweise durch Verabreichung an ein Individuum, das empfindlich gegen Der p III ist. Antikörper, welche mit solchen T-Zell-Rezeptoren spezifisch reagieren, lassen sich nach den hier beschriebenen Techniken gewinnen. Solche Antikörper können eingesetzt werden, um die T-Zell-Wechselwirkung mit von MHC präsentierten Peptiden zu blockieren oder zu beeinträchtigen.
Werden allergische Subjekte Peptiden mit Der p III-Aktivität und mit T-Zell-stimulierender Aktivität ausgesetzt, kann dies die geeigneten T-Zell-Subpopulationen veranlassen, resistent gegen das jeweilige Allergenprotein zu werden (z.B. gibt es nach einer solchen Exposition keine Stimulierung einer Immunantwort). Zusätzlich kann eine solche Verabreichung im Vergleich mit einer Exposition von natürlich vorkommendem Allergenprotein oder einem Teil desselben das Profil der Lymphokin-Sekretion verändern (z.B. kann es zu einer Abnahme von IL-4 und/oder einer Zunahme von IL-2 kommen). Werden sie ferner Peptiden mit Der p III-Aktivität und mit T-Zell-stimulierender Aktivität ausgesetzt, kann dies die T-Zell-Subpopulationen beeinflussen, die normalerweise an der Reaktion gegen das Allergen beteiligt sind, so dass diese T-Zellen vom Ort (den Orten) der normalen Allergen-Exposition (z.B. Nasenschleimhaut, Haut und Lunge) zu dem Ort (den Orten) der therapeutischen Verabreichung des Proteins oder des davon abstammenden Fragments weggezogen werden. Diese Umverteilung der T-Zell-Subpopulationen kann die Fähigkeit des Immunsystems eines Individuums verbessern oder vermindern, die gewöhnliche Immunantwort am Ort der normalen Allergenexposition zu stimulieren, was zu einer Verminderung der allergischen Symptome führt.
Wird ein Peptid mit Der p III-Aktivität einem gegen Hausstaubmilben empfindlichen Subjekt verabreicht, ist es in der Lage, die B-Zell-Antwort, die T-Zell-Antwort oder sowohl die B-Zell- als auch die T-Zell-Antwort des Subjekts gegen das Allergen zu modifizieren. Der hier verwendete Begriff Modifikation der allergischen Antwort einer Person gegen eine Hausstaubmilbe kann definiert werden als eine mit klinischen Standardverfahren (siehe z.B. Varney et al.: (1990) British Medical Journal, 302: 265-269) ermittelte Resistenz oder ein Nachlassen der Symptome auf das Allergen, einschließlich dem Nachlassen der von den Hausstaubmilben induzierten asthmatischen Symptome. Das hier beschriebene Nachlassen der Symptome umfasst jede Abnahme der allergischen Antwort einer Person auf das Allergen nach Behandlung mit einem Peptid der Erfindung. Das Nachlassen der Symptome kann subjektiv ermittelt werden (z.B. fühlt sich der Patient wohler, nachdem er dem Allergen ausgesetzt worden war) oder klinisch, wie z.B. mit einem Standard-Hauttest.
Die Peptide oder Antikörper können auch eingesetzt werden, um eine Empfindlichkeit gegen Der p III zu ermitteln und zu diagnostizieren. Dies kann beispielsweise so erfolgen, dass Blut oder Blutprodukte, die aus einem auf seine Empfindlichkeit zu untersuchenden Subjekt erhalten wurden, mit einem Peptid mit Der p III-Aktivität unter Bedingungen versetzt werden, die zum Binden von Blutkomponenten (z.B. Antikörper, T-Zellen, B-Zellen) an das (die) Peptid(e) geeignet sind und das Ausmaß ermittelt wird, mit dem eine solche Bindung erfolgt. Andere diagnostische Verfahren für allergische Krankheiten, in welchen die Peptide oder Antikörper der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können sind der Radioallergosorbent-Test (RAST), der Papierradioimmunosorbent-Test (PRIST), der Enzymelinked Immunosorbent Assay (ELISA), die Radioimmunoassays (RIA), die Immunoradiometrischen Assays (IRMA) der Lumineszent-Immunoassay (LIA), die Histamin Release Assays und die IgE-Immunoblots.
In einem anderen Assay kann das Vorkommen von spezifisch auf Der p III reagierendem IgE in Subjekten und die Fähigkeit der T-Zellen dieser Subjekte, auf die T-Zell-Epitope des Der p III zu reagieren, ermittelt werden, indem das Subjekt einem Immidiate Type Hypersensitivity-Test und/oder einem Delayed Type Hypersensitivity-Test (siehe z.B. Immunology (1985) Roitt, I.M., Brostoff, J., Male, D.K. (Hrg.), C.V. Mosby Co., Gower Medical Publishing, London, NY, SS 19.2-19.18; SS 22.1-22.10) unterzogen wird, indem ein Peptid mit Der p III-Aktivität oder eine modifizierte Form eines Peptids mit Der p III-Aktivität eingesetzt werden, von denen jedes für das Allergen spezifisches IgE bindet. Dieselben Subjekte werden vor, gleichzeitig mit oder nach der Durchführung des Immidiate Type Hypersensitivity-Tests einem Delayed Type Hypersensitivity-Test unterzogen. Falls natürlich der Immidiate Type Hypersensitivity-Test vor dem Delayed Type Hypersensitivity-Test durchgeführt wird, würden solche Subjekte dem Delayed Type Hypersensitivity-Test unterzogen, welche eine spezifische Immidiate Type Hypersensitivity-Reaktion zeigen. Im Delayed Type Hypersensitivity-Test wird ein Peptid mit Der p III-Aktivität verwendet, das über eine Human-T-Zell-Stimulierungsaktivität verfügt und das in einem wesentlichen Prozentsatz der Population von Subjekten, die empfindlich gegen das Allergen sind (z.B. mindestens etwa 75%), kein spezifisch auf das Allergen reagierendes IgE bindet. Solchen Subjekten, bei denen gefunden wurde, dass sie sowohl eine spezifische Immidiate Type Hypersensitivity-Reaktion als auch eine spezifische Delayed Type Hypersensitivity-Reaktion eingehen, wird eine Menge einer für die pharmazeutische Verabreichung geeignete Zusammensetzung verabreicht. Die Zusammensetzung umfasst das im Delayed Type Hypersensitivity-Test eingesetzte Peptid mit Der p III-Aktivität sowie einen pharmazeutisch verträgliche Träger oder ein Verdünnungsmittel.
Ein Peptid mit Der p III-Aktivität kann in Verfahren der Behandlung und Verhinderung von allergischen Reaktionen auf ein Allergen der Hausstaubmilbe oder ein kreuzreaktives Allergenprotein eingesetzt werden. Somit werden auch für eine pharmazeutische Verabreichung geeignete Zusammensetzungen, die eine Menge von mindestens einem Peptid mit Der p III-Aktivität sowie einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen, beschrieben . Die Verabreichung der Zusammensetzungen an ein zu desensibilisierendes Subjekt kann unter Einsatz bekannter Verfahren mit Dosierungen und über einen Zeitraum erfolgen, die ausreichen, um die Empfindlichkeit des Subjekts gegen Hausstaubmilben herabzusetzen (d.h. die allergische Antwort zu verringern). Der Ausdruck Subjekt soll lebende Organismen umfassen, bei denen sich eine Immunantwort auslösen lässt, z.B. Säugetiere. Beispiele für Subjekte umfassen Menschen, Hunde, Katzen, Mäuse, Ratten und deren transgene Arten. Die Menge von mindestens einem Peptid mit Der p III-Aktivität, die ausreicht, um eine therapeutische Wirkung zu erzielen kann je nach Faktoren wie dem Empfindlichkeitsgrad des Subjekts gegen Hautschuppen des Hundes, dem Alter, dem Geschlecht und Geicht des Subjekts sowie der Fähigkeit eines Peptids mit Der p III-Aktivität zum Auslösen einer Antigenantwort in dem Subjekt variieren. Es lassen sich Dosierungsweisen einstellen, um für eine optimale therapeutische Antwort zu sorgen. Es können z.B. täglich einige geteilte Dosen verabreicht werden, oder die Dosen können je nach den Erfordernissen der therapeutischen Situation proportional kleiner werden.
Die aktive Verbindung (d.h. ein Peptid mit Der p III-Aktivität) kann nach herkömmlicher Weise verabreicht werden, wie z.B. mittels Injektion (subkutan, intravenös usw.), mittels oraler Verabreichung, mittels Inhalation, mittels transdermaler Verabreichung oder mittels rektaler Verabreichung. Je nach dem Verabreichungsweg kann die aktive Verbindung mit einem Material beschichtet sein, um die Verbindung vor der Einwirkung von Enzymen, Säuren und anderen natürlichen Bedingungen zu schützen, welche die Verbindung inaktivieren könnten.
Um ein Peptid mit Der p III-Aktivität über eine andere Verabreichung als die parenterale zu verabreichen, kann es notwendig sein, das Peptid mit einem Material zu beschichten oder zusammen zu verabreichen, um seine Inaktivierung zu verhindern. Beispielsweise kann ein Peptid mit Der p III-Aktivität einem Individuum in einem geeigneten Träger, Verdünnungsmittel oder Adjuvans, zusammen mit Enzyminhibitoren oder in einem geeigneten Träger wie Liposomen verabreicht werden. Pharmazeutisch verträgliche Verdünnungsmittel umfassen Saline und wässrige Pufferlösungen. Adjuvans wird in seinem weitesten Sinne gebraucht und umfasst jede immunstimulierende Verbindung wie z.B. Interferon. Die hier zum Einsatz kommenden Adjuvantien umfassen Resorcine, nicht-ionische Tenside wie Polyoxyethylenoleylether und n-Hexadecylpolyethylenether. Die Enzyminhibitoren umfassen den pankreatischen Trypsininhibitor, Diisopropylfluorphosphat (DEP) und Trasylol. Die Liposomen umfassen sowohl Wasser-in Öl-in Wasser CGF-Emulsionen als auch herkömmliche Liposomen (Strejan et al., (1984) J. Neuroimmunol., 7: 27). Für die Zwecke der Induktion eine T-Zell-Resistenz wird die Zusammensetzung vorzugsweise in nicht immunogener Form verabreicht, z.B. einer Form, die kein Adjuvans enthält.
Die aktive Verbindung kann auch parenteral oder intraperitoneal verabreicht werden. Dispersionen lassen sich auch in Glycerin, flüssigen Polyethylenglykolen und Mischungen derselben sowie in Ölen herstellen. Unter gewöhnlichen Bedingungen der Aufbewahrung und Nutzung können diese Präparate ein Konservierungsmittel enthalten, um ein Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern.
Für Injektionen geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen enthalten sterile wässrige Lösungen (sofern wasserlöslich) oder Dispersionen und sterile Pulver für die improvisierte Zubereitung von sterilen injizierbaren Lösungen oder Dispersionen. Auf alle Fälle muss die Zusammensetzung steril sein und so flüssig, dass sie sich leicht spritzen lässt. Sie muss unter den Bedingungen der Herstellung und Lagerung stabil sein und muss gegen die kontaminierende Wirkung von Mikroorganismen, wie z.B. Bakterien und Pilzen, einer Konservierung unterzogen werden. Der Träger kann ein Lösungsmittel oder ein Dispersionsmedium sein, das z.B. Wasser, Ethanol, ein Polyol (z.B. Glycerin, Propylenglykol und flüssiges Polyethylenglykol und dergl.), geeignete Mischungen derselben und Pflanzenöle enthält. Die richtige Fluidität lässt sich beispielsweise durch Verwendung eines Beschichtungsmittels wie Lecithin, durch Einhaltung der erforderlichen Teilchengröße im Falle einer Dispersion und durch den Einsatz von Tensiden gewährleisten. Die Wirkung von Mikroorganismen lässt sich durch den Einsatz verschiedener antibakterieller Mittel und Antipilzmittel, z.B. von Parabenen, Chlorbutanol, Phenol, Ascorbinsäure, Thimerosal und dergl. verhindern. In vielen Fällen ist bevorzugt, der Zusammensetzung isotone Mittel zuzusetzen, wie z.B. Zucker, Polyalkohole wie Mannit, und Sorbit, sowie Natriumchlorid. Eine verlängerte Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann man erhalten, wenn der Zusammensetzung ein Mittel zugesetzt wird, das die Absorption verzögert, z.B. Aluminiummonostearat und Gelatine.
Sterile injizierbare Lösungen lassen sich herstellen, indem die aktive Verbindung (d.h. ein Peptid mit Der p III-Aktivität) in der erforderlichen Menge einem geeigneten Lösungsmittel mit einem oder einer Kombination der oben beschriebenen Inhaltsstoffe wie erforderlich zugesetzt wird und dann eine Sterilfiltration erfolgt. Im Allgemeinen werden Dispersionen hergestellt, indem die aktive Verbindung in ein steriles Vehikel eingebracht wird, welches ein Grunddispersionsmedium und die erforderlichen oben ausgewiesenen anderen Inhaltsstoffe enthält. Im Falle von sterilen Pulvern für die Herstellung von sterilen injizierbaren Lösungen sind die bevorzugten Herstellungsverfahren das Vakuumtrocknen und das Gefriertrocknen, womit man ein Pulver aus dem aktiven Inhaltsstoff (d.h. mindestens ein Peptid mit Der p III-Aktivität) plus jedem zusätzlichen gewünschten Inhaltsstoffaus einer zuvor steril filtrierten Lösung davon erhält.
Wenn das Peptid mit Der p III-Aktivität, wie oben beschrieben, auf geeignete Weise geschützt ist, kann das Peptid oral verabreicht werden, z.B. mit einem inerten Verdünnungsmittel oder einem assimilierbaren genießbaren Träger. Das Peptid und die anderen Inhaltsstoffe können auch in einer Kapsel aus Hart- oder Weichgelatine eingeschlossen, zu Tabletten verpresst oder direkt in der Nahrung des Individuums enthalten sein. Für eine orale therapeutische Verabreichung kann die aktive Verbindung mit Trägersubstanzen eingenommen und in Form von Kautabletten, Bukkaltabletten, Pastillen, Kapseln, Elixieren, Suspensionen, Sirups, Oblaten und dergl. eingesetzt werden. Der Prozentanteil für die Zusammensetzungen und Präparate kann natürlich variiert werden und kann herkömmlicherweise zwischen etwa 5% bis etwa 80% des Gewichts der Einheit liegen. Die Menge der aktiven Verbindung in solchen therapeutisch nützlichen Zusammensetzungen ist so, dass eine geeignete Dosierung erhalten wird.
Der hier verwendete Ausdruck "pharmazeutisch verträglicher Träger" umfasst jeweils alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Beschichtungen, Antibakterien- und Antipilzmittel, isotonische und die Absorption verzögernde Mittel und dergl. Der Einsatz von solchen Medien und Mitteln für pharmazeutisch aktive Substanzen ist im Stand der Technik gut bekannt. Außer dann, wenn irgendein konventionelles Medium oder Mittel sich mit der aktiven Verbindung nicht verträgt, wird deren Verwendung in den therapeutischen Zusammensetzungen angestrebt. Ergänzende aktive Verbindungen können ebenfalls in die Zusammensetzungen aufgenommen werden.
Es ist von besonderem Vorteil, wenn die parenteralen Zusammensetzungen für eine bequeme Verabreichung und konstante Dosierung in Form einer Dosierungseinheit formuliert werden. Der hier verwendete Begriff Form einer Dosierungseinheit bezieht sich auf physikalisch diskrete Einheiten, die als Einheitsdosierungen für zu behandelnde Säugetiere geeignet sind; jede Einheit enthält eine vorbestimmte Menge der aktiven Verbindung, die so berechnet ist, dass die gewünschte therapeutische Wirkung zusammen mit dem erforderlichen pharmazeutischen Träger erbracht wird. Die Spezifikation für die Formen der Dosierungseinheit der Erfindung werden vorgegeben von und hängen ab von (a) den eindeutigen Eigenschaften der aktiven Verbindung und der zu erreichenden besonderen therapeutischen Wirkung und (b) den inhärenten Einschränkungen beim Zusammensetzen einer solchen aktiven Verbindung zur Behandlung der Empfindlichkeit in Subjekten.
Die Erfindung stellt auch eine Zusammensetzung mit mindestens zwei Peptiden mit Der p III-Aktivität zur Verfügung (z.B. eine physikalische Mischung aus mindestens zwei Peptiden), von denen jede eine T-Zellen stimulierende Aktivität aufweist. Alternativ kann einem allergischen Subjekt ein Peptid mit mindestens zwei Abschnitten, von denen jeder eine T-Zellen stimulierende Aktivität aufweist (d.h. jeder Abschnitt umfasst mindestens ein T-Zell-Epitop) verabreicht werden. Eine Zusammensetzung aus zwei Peptiden mit Der p III-Aktivität oder eine Zusammensetzung aus zwei Peptiden mit mindestens zwei Abschnitten, von denen jeder eine T-Zell-stimulierende Aktivität aufweist, kann einem Subjekt, wie oben beschrieben, in Form einer Zusammensetzung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger verabreicht werden. Eine Menge aus einer oder mehreren solcher Zusammensetzungen kann einem empfindlich auf ein Allergen der Hausstaubmilben reagierenden Subjekt gleichzeitig oder nacheinander verabreicht werden, um eine solche Sensibilität zu behandeln.
Die cDNA (oder die mRNA, die während der reversen Transkription als Matrize diente), welche ein Peptid mit Der p III-Aktivität codiert, kann dazu verwendet werden, ähnliche Nucleinsäuresequenzen in jeder Varietät und Art von Tier aufzufinden und so auf molekularer Ebene Gene zu klonieren, welche eine ausreichende Sequenzhomologie aufweisen, um an die ein Peptid mit Der p III-Aktivität codierende cDNA zu hybridisieren. Somit umfasst die vorliegende Erfindung nicht nur Peptide mit Der p III-Aktivität, sondern auch andere Proteine, welche Allergene sein können, die von einer DNA codiert werden, die an DNA der vorliegenden Erfindung hybridisiert.
Andere isolierte Peptide als die bereits identifizierten, welche immunologisch mit Der p III verwandt sind, wie z.B. durch Antikörper-Kreuzreaktivität oder T-Zell-Kreuzreaktivität, liegen im Geltungsbereich der Erfindung. Solche Peptide binden Antikörper, die spezifisch für das Protein und die Peptide der Erfindung sind oder stimulieren T-Zellen, die spezifisch für das Protein und die Peptide der Erfindung sind.
Ein Peptid mit Der p III-Aktivität (d.h. rekombinant oder mittels chemischer Synthese gewonnenes Der p III) ist frei von allen anderen Proteinen der Hausstaubmilbe und ist somit nützlich bei der Standardisierung von Allergenextrakten, die Schlüsselreagenzien für die Diagnose und Behandlung einer Überempfindlichkeit gegen Hausstaubmilben darstellen. Ein solches Peptid ist zusätzlich von einer konsistenten gut definierten Zusammensetzung und biologischen Aktivität zur Verwendung in Präparaten, die für therapeutische Zwecke verabreicht werden können (z.B., um die allergische Antwort eines Subjekts, das empfindlichen gegen Hausstaubmilben ist, zu modifizieren). Solche Peptide können auch eingesetzt werden, um den Mechanismus der Immuntherapie einer Allergie gegen D. pteronyssinuss zu untersuchen und um modifizierte Derivate oder Analoge, die in der Immuntherapie von Nutzen sind, zu entwerfen.
In den Arbeiten von anderen wurde gezeigt, dass hohe Dosen von Allergenextrakten während einer Immuntherapie im Allgemeinen die besten Ergebnisse liefern (d.h. die beste Erleichterung von Symptomen). Viele Subjekte sind jedoch wegen der von den Allergenen und anderen in diesen Präparaten enthaltenen Komponenten nicht in der Lage, hohe Dosen solcher Extrakte zu tolerieren. Ein Peptid mit Der p III-Aktivität weist den Vorteil auf, dass es frei von allem anderen Milbenprotein ist. Somit lässt sich ein solches Peptid für therapeutische Zwecke mit weniger erwarteten Nebenwirkungen verabreichen.
Es ist nun auch möglich, ein Mittel oder ein Arzneimittel zu entwerfen, das in der Lage ist, die Fähigkeit eines Allergens der Hausstaubmilbe zur Induktion einer allergischen Reaktion bei empfindlichen Subjekten zu blockieren oder zu hemmen. Derartige Mittel könnten z.B. so entworfen werden, dass sie an relevante Der p III-IgE-Moleküle binden und somit eine IgE- Allergen-Bindung und die darauf folgende Degranulation von Mastzellen/basophilen Zellen verhindern. Alternativ könnten solche Mittel an Zellkomponenten des Immunsystems binden, was zu einer Unterdrückung oder Desensibilisierung der allergischen Antworten auf Allergene der Hausstaubmilbe führt. Ein nicht einschränkendes Beispiel dafür ist die Verwendung von Peptiden, welche B- oder T-Zell-Epitope von Der p III oder Modifikationen derselben aufweisen, basierend auf der cDNA-Protein-Struktur von Der p III, um die allergische Antwort auf ein Allergen der Hausstaubmilbe zu unterdrücken. Dies könnte so erfolgen, dass die Strukturen von Fragmenten definiert werden, die B- und T-Zell-Epitope codieren, welche die B- und T-Zell-Funktion in in vitro-Untersuchungen mit Blutkomponenten aus gegen Hausstaubmilben empfindlichen Subjekten beeinflussen.
BEISPIELE
Material und Methoden
D. pteronyssinus-Kulturen
Von den Commonwealth Serum Laboratories, Parkville, Australien wurden ganze Milben gekauft und das Spent-Medium war eine Spende aus derselben Quelle.
Reinigung von nativem Der p III
Unter Anwendung eines von Heymann et al. (Heymann et al., J Allergy Clin. Immunol. (1989) 83: 1055-1067) übernommenen Verfahrens wurden 15 ml eines 50-80% gesättigten Ammoniumsulfat. Niederschlages des D. pteronyssinus-Spent-Growth-Mediums auf eine aufwärts fließende, in PBS äquilibrierte Polyacrylamid P-100-Säule von 2 cm × 90 cm (Pharmacia, LKB Biotechnology, Uppsala, Schweden) aufgetragen. Der Proteingehalt der Fraktionen von 5 ml wurde mittels Messen der optischen Dichte (A 280 nm) und mittels SDS-PAGE-Analyse ermittelt. Solche Fraktionen, die überwiegend Bande im 30 kDa-Bereich aufwiesen, wurden zusammengegeben, mittels Polyethylen 6000 (BDH Chemicals, Aus. PTY, Ltd. Kilsyth, Vic. Aust) konzentriert, gegen PBS dialysiert und wieder über die Säule laufen gelassen. Dies wurde zweimal wiederholt bis die Analyse mittels SDS-PAGE ergab, dass die einzigen nachweisbaren Bande eine Dublette mit einem Molekulargewicht von annähernd 30 kDa waren.
Sequenzanalyse des Proteins
Die mittels Affinität gereinigten nativen Der p III- und Der f III-Proteine wurden unter Einsatz eines 12% Säulensystems (Applie Biosystems, Foster City, CA) einer HPEC unterzogen. Die mittels Affinität gereinigten Proteine oder die HPEC-Fraktionen mit dem geeigneten Molrkulargewicht wurden sodann unter Einsatz eines Applied Biosystems Modell 4777A-Gasphasen-Sequenators mit einer On-line-Phenylhydantoin-Derivative-Analysis (Modell 120) einer Protein-Sequenzanalyse unterzogen. Alternativ wurden die mittels Affinität gereinigten Proteine zuerst mittels SDS-PAGE (Biorad) aufgetrennt, auf Problot (Applied Biosystems) übertragen und unter Einsatz eines Beckman Modell LF3000 sequenziert. Nach der anfänglichen Sequenzanalyse der Proteine wurde zur Blockieung der N-terminalen Enden mit Ausnahme der Prolin-Enden (Position 13 von DER p III) o-Phthalaldehyd verwendet, um verunreinigende Peptidreaquenzien zu eliminieren und die N-terminale Sequenz aug eindeutige Weise zu verlängern. Die CNBr-Peptide wurden hergestellt, indem die mittels Affinität gereinigten Proteine mit 2% (w/v) CNBr in 70% (w/v) Ameisensäure über Nacht bei Raumtemperatur gespalten wurden. Die verdauten Peptide wurden zur Reinigung einer HPEC und die Peptidfragmente sodann einer Sequenzanalyse unterzogen.
Bevorzugte Codon-Verwendung
Für die reifen Proteine Der f I (Dilworth et al., Clin. Exp. Allergy (1991) 21: 25-32), Der f II (Trudinger et al., Clin. Exp. Allergy (1991) 21: 33-37), Der p I (Chua et al., J. Exp. Med. (1988) 167: 175-182) und Der p II (Chua et al., Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. (1990) 91: 118-123) wurden die bevorzugten Codon-Verwendungen ermittelt. Für jedes dieser 4 Proteine von Dermatophagoides wurde die mittlere prozentuale Verwendung eines jeden Triplett-Codons für jede Aminosäure ermittelt und die Ergebnisse in Tabelle 1 zusammengestellt.
Tabelle 1. Bevorzugte Codon-Verwendung für Dermatophagoides-Allergene
Konstruktion der D. pteronyddinus-λ gt10-cDNA-Bibliothek
Es wurde polyadenylierte mRNA (10 μg) verwendet, um unter Verwendung eines Kits (Amersham International, Aylesbury UK) mit Hilfe des RNase-H-Verfahrens (Gubler et al., Gene (1983) 25: 263-269) cDNA zu synthetisieren. Nach Zugabe von EcoR I-Restriktionsenzym-Linkern (New England Biolabs, Beverly, USA) wurde die cDNA an mit alkalischer Phosphatase behandelte Lambda-gt10-Arme (Promega Biotec, Madison, Wisc.) ligiert. Die rekombinante Phagen-DNA wurde gepackt und in E. coli-JP777 ausplattiert, um eine Bibliothek von 5 × 10⁵ Rekombinanten zu gewinnen.
Endmarkierung der Oligonucleotide mit Kinase
Die Oligonucleotide wurden unter Einsatz eines Applied Biosystem-PCR-Mate (Applied Biosystems, Foster City, CA) synthetisiert. 20 pM Oligonucleotid-DNA wurden unter Verwendung von T4-Polynucleotid-Kinase (Promega Corp., Madison, Wisc.) mit (⇕-³²P)-ATP endmarkiert (Maniatis, T., Fritsch, E.F. und Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Die markierten Oligonucleotide wurden mit 15% Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt und dann in steriles destilliertes Wasser eluiert.
Isolierung der Der p III-cDNA-Klone aus der -λ gt10-cDNA-Bibliothek
Das Screening der Bibliothek erfolgte mit zwei konstruierten Sonden, indem Sequenzdaten über sowohl N-terminale als auch interne Proteinsequenzen verwendet wurden, welche, wie oben für die Allergene der Gruppe III beschrieben, erhalten wurden. Die erste, P3Forward3 (P3F3) war in der Länge ein 38-Mer mit der folgenden Nucleotidsequenz: 5'TCAGAAAAAGCTTTGGCTGGTGAATCACCATATCAAAT3' (SEQ ID NO: 8). Die zweite Sonde, P3Reverse4, war ein 41-Mer mit der folgenden Nucleoridsequenz: 5'GAATCAACACCACCATTAGCAACATCACCACCGCAAATCAT3' (SEQ ID NO: 9). Die Bibliothek wurde mit 25.000 pfu pro 150 mm Petrischale plattiert und der Phage auf Nitrocellulose (Schleicher & Schuell, Dassel, Deutschland) übertragen. Von jeder Platte wurden zweifache Filterüberträge denaturiert und für die Hybridisierung mit einer sich von den zwei Sonden unterscheidenden Sonde gebacken (Maniatis, T., Fritsch, E.F. und Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Die Hybridisierungen erfolgten über Nacht in einer Hybridisierungsmischung (6 × Natriumchlorid/Natriumcitrat von pH 7 (SSC), 0,1 % Denhard's Reagenz, 100 μg/ml denaturierter DNA aus Herinsspermien) bei 42°C mit 10⁶ cpm/ml markierter Sonde. Die Filter wurden dreimal bei 42°C 20 Minuten lang und dann bei 50°C 10 Minuten lang in 400 ml Waschlösung, die 6 × SSC, 0,1% Triton X-100 enthielt, gewaschen.
Isolierung von DNA aus ⎕gt-Der p III-Klonen
Die Phagen-DNA aus den Der p III-Klonen wurde unter Einsatz eines Polyethylenglykol-Fällungsverfahrens (Chua et al., J. Exp. Med. (1988) 167: 175-182) gewonnen.
Subklonierung und DNA-Sequenzierung
Die gereinigte Phagen-DNA wurden mit dem Restriktionsenzym EcoR I (Toyobo) verdaut und das freigesetzte Fragment an den mit dem EcoR I-Restriktionsenzym verdauten Sequenzierungsvektor M13mp19 (Messing, Meth. Enzymol. (1983) 101: 20-78) ligiert. Die rekombinante DNA wurde unter Verwendung von E. coli-TG-1 transformiert und die Sequenzierung unter Einsatz des Dinucleotid-Kettenterminations-Verfahrens und von Sequenase (U.S. Biochemicals) (Sauger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1977) 74: 5463-5467) durchgeführt. Die für die Sequenzierung verwendeten Oligonucleotid-Primer umfassten die universellen Primer, einen 17-Mer-Sequenzierungs-Primer (-40)5' CAGCACTGACCCTTTTG3' (SEQ ID NO: 4) und einen 16-Mer reversen Sequenzierungs-Primer (-24)5'AACAGCTATGACCATG 3' (SEQ ID NO: 5), die beiden für das Screening der Bibliothek verwendeten internen Primer (SEQ ID NO: 8 und 9) und die zwei internen Primer P3Forward5 (P3F5 5' AAAGCTGTTGGATTACCA 3' (SEQ ID NO: 6) and P3Reverse5 (P3R5) 5' TACATCCGATCCTTTTGC 3' (SEQ ID NO: 7) sowie P3F4 5' GCGGATCCATTOTTGOTGGT 3'(SEQ ID NO: 18). Die beiden internen Sonden wurden so entworfen, dass sie den Nucleotidresten 456-473 (P3F5) und 491-474 (P3R5) entsprachen (1A und 1B). Die Primer wurden verwendet, um den isolierten Klon ine beiden Richtungen zu sequenzieren.
DNA- und Protein-Sequenzanalyse
Die Sequenzanalyse erfolgte unter Einsatz der MAC-VECTOR-Software (IBI, New Haven, USA). Die Computersuche nach Sequenzhomologie mit anderen Proteinen erfolgte am NCBI unter Einsatz des BLAST Network-Service. Die verwendete BLAST Version war BLAST 1.3.1 OMP (07. Juli 1993).
BEISPIEL 1: Sequenz der nativen Allergene der Gruppe III
Das Verfahren der Proteinisolierung ergab eine Der p III-Probe, die bei der Analyse mittels SDS-PAGE als eine Dublette mit Molekulargewichten von 30.000 und 28.000 lief. Beide Bande reagierten gemäß der zuvor beschriebenen Kreuzreaktivität zwischen den Arten (Thomas et al., Exp. Appl. Acarol. (1992) 16: 153-164) mit polyklonalem Maus-Anti-Der p III. Das aus einer Säule mit 5A12 monoklonalen Antikörpern (Heymann et al., J. Allergy Clin. Immun. (1989): 1055-1067) isolierte Der f III zeigte ähnliche Eigenschaften. Indem o-Phthalaldehyd zur Eliminierung kontaminierender Proteinsequenzen eingesetzt wurde, korrigierten und erweiterten sowohl das native Der p III als auch Der f III die bekannte Der p III-Sequenz und erweiterten die Der f III-Sequenz. Die N-terminale Sequenz von Der p III wurde zu IVGGEKALAGQSPYQISLQSSSHFSGGTIL (SEQ ID NO: 16) erweitert. Die N-terminale Sequenz von Der f III wurde zu IVGGVKAKAGDSPYQISLQSSSHFXGGSILD (SEQ ID NO: 15) erweitert. Ein Vergleich der von Stewart et al. (Immunology (1992) 75: 29-35) und Heymann et al. (J. Allergy Clin. Immunol. (1989) 83: 1055 -1067) veröffentlichten Sequenzdaten für die Allergene der Gruppe III mit den hier offenbarten Daten zeigten in der veröffentlichten Sequenz einige Fehler. Insbesonder wurde eine nicht konservative Änderung bei Rest 8 von positiv geladenem Lysin zu einem nicht polaren hydrophoben Leucin gefunden (Der f III, Heymann et al., J. Allergy Clin. Immunol. (1989) 83: 1055-1067). Nach CNBr-Verdau des natürlichen Proteins wurden mittels HPEC zwei interne Peptide von Der f III isoliert, MICGGDVANGGVDSEQGD (SEQ ID NO: 10) und MTLDQTNAKPVPLPTS (SEQ ID NO: 12).
BEISPIEL 2: Sequenz von rekombfnantem Der p III
Die Information über die Proteiensequenz, die wie in Beispiel 1 beschrieben erhalten wurde, wurde zusammen mit den Daten zur bevorzugten Codon-Verwendung (Tabelle 1) herangezogen, um zwei Oligonucleotid-Sonden zu konstruieren. Diese Oligonucleotide wurden so hergerichtet, dass sie an die Nucleotidreste 159-196 und an die Nucleotidreste 688-648 des Der p III-Klons hybridisierten (2A und 2B). Aus der λ gt10-cDNA-Bibliothek wurden nur Klone isoliert, die stark mit beiden Sonden hybridisierten. Die erhaltene Nucleotidsequenz für den P3WS1-Klon und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz sind in den 1A und 1B wiedergegeben. Die vollständige Nucleotidsequenz betrug in der Länge 1059 Basenpaare. Diese umfasst einen 5' nicht kodierenden Abschnitt von 62 Basenpaaren, einen 3' nicht translatierten Abschnitt von 211 Basenpaaren und ein offenes Leseraster von 786 Basenpaaren mit einem Stop-Codon (TGA) an den Nucleotidresten 846-848. Es gibt keinen Poly-A-Schwanz, aber es erscheint ein Signal für eine Polyadenylierung (AATAAA). Das offene Leseraster codiert ein Protein, das einen Prä-Pro-Abschnitt von 29 Aminosäuren umfasst und am N-terminalen Isoleucin beginnt, ein reifes Protein von 232 Aminosäureresten mit einem berechneten Molekulargewicht von 24.985 und einem pI von 8,5. Der Methioninrest (ATG) an der Aminosäureposition -29 ist höchstwahrscheinlich der Initiationsort für die Translation. Die Wahl für diesen Initiationsort beruhte zum Teil auf dem Vorkommen einer auf das Methionin folgenden Sequenz, welche ein klassisches Signalpeptid von 18 Aminosäureresten kodiert, wobei vorwiegend hydrophobe Reste vorkommen. Darüber hinaus passt die unmittelbar vor diesem ATG-Codon liegende Sequenz 5' GAAAGATG 3' in etwa zu der Konsensussequenz von Kozak (CCACCATG) des Initiationsorts für eine eukaryotische Translation mit dem entscheidenden Purin (meistens A) an der Position -3 (Kozak, Nucleic Acid Research (1984) 12: 857-872).
Die in Beispiel 1 beschriebenen Daten für die Proteinsequenzierung von Der p III unterscheiden sich in Folge der Substitutionen von Glu/Gln an Rest 11 und einer möglichen Cys/Ser-Substitution an Rest 17 von der aus der c-DNA des P3WS1-Klons abgeleiteten Aminosäuresequenz. Diese Substitutionen können auf das Vorkommen von unterschiedlichen Isoformen für Der p II zurückzuführen sein. Eine Analyse der für Der p III-P3WS1 abgeleiteten Aminosäuresequenz bestätigte, dass für die Position des Der f III-CNBr-Peptids 1 (MI(C)GGDVANGGVDS(E)QGD) (SEQ ID NO: 10) korrekt vorausgesagt wurde, dass sie von den Aminosäureresten 177-183 reicht und eine 88% Identität mit der rekombinanten Sequenz MICGGDVANGGKDSCQD(SEQIDNO: 11) in diesem Bereich aufweist. Interessanterweise gibt es zwei identische nicht konservative Änderungen, die vorkommen, wenn man die Sequenz für das native Der f III-Peptid mit der Sequenz für den P3WS1-Klon nebeneinander aufreiht. Es gibt eine Änderung von einem nicht polaren hydrophoben Valin an Position 178 (nach der Zählung in den 1A und 1B) im Der f III zu einem positiv geladenen Lysinrest in den Sequenzen für den P3WS1-Klon. Die andere Änderung ist ein Glutaminsäurerest an Position 181 von Der f II an Stelle eines Cysteinrests in der Sequenz für den P3WS1-Klon. In diesen beiden und den meisten anderen Trypsin-Proteinen bildet das Cystein eine der Disulfidbrücken. Das vorausgesagte Alignment des zweiten Der f III-Peptids (M)TLDQTNA(K)PVPL(P)(T)(S) (SEQ ID NO: 12), das mittels CNBr-Verdau gewonnen wurde, reichte von den Aminosäureresten 95-110 (MKLNQKNAKAVGLPAK)(SEQIDNO: 13). Es besteht eine 63% Homologie mit dem P3WS1.-Klon in diesem Bereich. Die Unterschiede in den Proteinsequenzen von Der p III und Der f III sind konsistent mit der 20% Sequenzvariation, die zwischen anderen homologen Allergenen aus dieser Spezies, wie sie z.B. bei Der p I und Der f I sowie Der p II und Der f II gefunden wurden.
Die vollständige Sequenz für den Der p III-P3WS1-Klon codiert ein Protein von 319 Aminosäuren. Der p III wird, wie alle bekannten Trypsine, als ein Prä-pro-Zymogen synthetisiert. Es wird postuliert, dass sich die Spaltungsstelle für das Signalpeptid zwischen den Aminosäureresten -12 und -11 befindet, da die Reste um diese Stelle mit den von Heijne (von Heijne, Euro . J. Biochem. (1983) 133; 17-21) gezeigten Aminosäure-Zwängen übereinstimmen. Von Heijne schlug vor, dass kleine neutrale Aminosäuren an den Positionen -1 und -3 von der Spaltungsstelle ab stark bevorzugt werden, so wie die im Der p III-Gen beobachteten Alanin und Tyrosin. Prolinreste werden an den Positionen +1 bis -3 niemals gefunden, so dass alle anderen Stellen ausgeschlossen sind. Es ist berichtet worden, dass die meisten Trypsinproteine aus Säugern Prä- oder Signalpeptide aus 15 oder 16 Aminosäuren aufweisen. Das Der p III-Peptid hat eine Länge von 18 Aminosäuren. Während der Unterschied in der Länge relativ gering ist, scheint es, dass die Länge des Signalpeptids auf die phylogenetische Mannigfaltigkeit der Spezies zurückgeführt werden kann, aus welcher das Trypsin stammt. Dies ist am augenscheinlichsten bei Streotomyces griseus mit einem Prä-Peptid von 32 Aminosäuren (Kim et al., Biochem. Biophys, Res. Commun. (1991) 181: 707- 713). Es ist auch berichtet worden, dass bei Trypsinen aus Säugern das Signalpeptid zwei spezifische Häufungsstellen aus zwei und dann vier hydrophoben Resten enthält (MacDonald et al., J. Biol. Chem. (1982) 257: 9724-9732; Le Huerou et al., Eur. J. Biochem. (1990) 193: 767-73). In diesem Abschnitt des Der p III-Gens besteht ein Überschuss an hydrophoben Resten, sie sind jedoch nicht in hoch konservierten Anhäufungen angeordnet. Das Gleiche trifft für die Signalpeptide sowohl von Drosophila melanogaster (Davis et al., Nucleic Acid Research (1988) 13: 6605-6615) als auch von S. griseus (Kim et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1991) 181: 707-713) zu. Es ist daher möglich, dass die hoch konservierten Anhäufungen von hydrophoben Resten keine charakteristische Eigenschaft aller Trypsinproteine ist, sondern eher eine von Trypsinen von Säugern.
Abwärts vom Signalpeptid sitzt das Prä-Aktivierungspeptid aus 11 Resten von den Aminosäuren -11 bis -1. Ein Vergleich dieses Pro-Abschnitts mit anderen Pro-Abschnitten von Trypsinen aus verschiedenen Spezies weist darauf hin, dass das Der p III-Pro-Peptid ungewöhnlich ist. Es ist gezeigt worden, dass Trypsine sowohl bei Vertebraten als auch Invertebraten einen Pr-Abschnitt aus einem Octapeptid und/oder einem Hexapeptid mit vier aufeinander folgenden Aspartylresten gefolgt von einem Lysinrest an Position -1 aufweisen Le Huerou et al., Eur. J. Biochem. (1990) 193: 767-73). Es ist der Carboxyl-Abschnitt dieses Lysinrestes, welcher während der Aktivierung des Trypsinogens zu Trypsin abgespalten wird. Bei Der p III fehlt diese Polyaspartyl-Lysin-Sequenz. Trypsin lässt sich daher nicht mit dem üblichen Mechanismus aktivieren. Es gibt in diesem Zusammenhang wenige andere Trypsine, die dem Der p II ähnlich sind, D. melanogaster (Davis et al., Nucleic Acid Research (1988) 13: 6605-6615), S. griseus (Kim et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1991) 181: 707-713) und höchst interessant, ein anionisches Trypsin von 32.000 Da aus dem Pankreas der Ratte (Gendry and Launay, Biochimica et Biophysica Acta (1988) 955: 243-249). Diese Gruppe zeigte, dass Enterokinase, ein Enzym mit hoch spezifischer Aktivität zu den Polyaspartyl-Lysin-Resten in Trypsinproteinen, keine Wirkung auf Trypsin ausübte, das sie isoliert hatten. Sie nahmen daher an, dass für den Aktivierungsprozess ein unterschiedlicher Mechanismus zum Einsatz kam. Das Fehlen einer jeglichen Homologie des Proenzymabschnitts von Der p II mit irgend einer der bekannten Sequenzen kann auf einen einmaligen Aktivierungsmechanismus hinweisen.
Ein Durchsuchen der Protein-Datenbank hat bestätigt, dass Der p III-P3WS1 sowohl zu den Trypsinen der Vertebraten als auch der Invertebraten homolog ist. Das Der p III-Allergen ist kein Chymotrypsin der Milbe (Gendry and Launay, Biochimica et Biophysica Acta (1988) 955: 243-249), da ein Vergleich der N-terminalen Proteinsequenzen zeigte, dass sie sich um 50% unterscheiden. In den 2A und 2B wird ein Vergleich der Aminosäuresequenzen von Der p III-P3WS1 und den Trypsinen des Flusskrebses (SEQ ID NOS. 2 und 3) gezeigt. Der Flusskrebs weist eine 44% Homologie mit Der p III auf. Es kommen 7 Cysteinreste vor, von denen bekannt ist, dass 6 dieser Reste, 54-70, 181-198 und 210-236, Disulfidbrücken bilden (2A und 2B) (Hartley, Phil Trans Rov Soc Lond B (1970) 257: 77-87). Es ist äußerst wichtig, dass das Der p III-Protein die hoch konservierten Reste enthält, welche bei der katalytischen Aktivität und Substratspezifität der Trypsinproteine eine Rolle spielen. Die konservierten His 40 und Ser 185 (1A und 1B) stellen das Ladungsübertragungssystem dar, welches das aktive katalytische Zentrum des Trypsinenzyms umfasst. Der positiv geladene Asparaginsäue-Rest an Position 179 stellt das für Trypsin spezifische Zentrum dar. An diesem Rest weisen die meisten Serinproteasen eine neutrale Aminosäure auf (Keil, The Enzymes, Academic Press, New York, 1971, SS. 249-279). Die Glycinreste an den Positionen 206 und 211 zusammen mit der Asparaginsäure an Position 179 sind verantwortlich dafür, dass die sperrigen, positiv geladenen Seitenketten des Lysins und Arginins, die von den Trypsinen gespaltenen Substratreste, Platz finden. Die Aminosäurereste 179-185 und 202-206 (1A und 1B) bilden die S1-Bindungstaschen, die bei der Bindung des Substrats an das Trypsinmolekül eine Rolle spielen. Die alle diese wichtigen Reste unmittelbar umgebenden Bereiche sind die am meisten konservierten Abschnitte des Der p III-Proteins. Alle diese Ergebnisse stimmen mit der Tatsache überein, dass unter den Trypsinproteinen aus verschiedenen Spezies strukturelle Variationen in den Bereichen des Moleküls auftreten, die für die katalytische Aktivität nicht von Bedeutung sind (Vithayathil et al., Arch. Biochem. Biophys. (1961) 92: 532-540).
In Allgemeinen weisen die meisten Trypsinproteine eine gemeinsame Paarbildung von Cysteinresten auf, um 6 Disulfidbrücken zu bilden, wobei zwei dieser Brücken, Cys 15-145 und Cys 117-218 für diese Gruppe von Proteinen einzigartig sind. Wie sowohl beim Flusskrebs (Titani et al., Biochemistry (1983) 22: 1459-1465) als auch bei S. griseus fehlen bei Der p III diese beiden einzigartigen Bindungen, was aber wichtiger ist, Der p III ist einzigartig, da er einen zusätzlichen ungepaarten Cysteinrest aufweist. Dieser Rest kann dem Cys 15 im Rindertrypsin äquivalent sein, der anders als Cys 145, 117 und 218 während des evolutionären Auseinanderdriftens des Trypsins der Milbe nicht eliminiert worden ist.
Die Isolierung des Gens, welches die Nucleotidsequenz für das Allergen der Gruppe III, Der p III, codiert, stellt die erste Bestimmung der Primärsequenz für diese Gruppe von Dermatophagoides-Allergenen dar. Ein Vergleich der Sequenz mit anderen Serin-Proteasen von Vertebraten und Invertebraten weist vor dem Hintergrund von Substrat-Bindungs-Versuchen (Stewart et al., Immunology (1992) 75: 29-35; Ando et al., Arerugi (1992) 41: 704-707) darauf hin, dass die Allergene der Gruppe III Trypsinproteine sind. Trypsinproteine werden bei allen Vertebraten- und Invertebraten-Arten als Prä-pro-Zymogene von den Azinuszellen des Pankreas ausgeschieden. Es ist berichtet worden, dass die Trypsine der Invertebraten ein Molekulargewicht im Bereich von 20.000 bis 30.000 Da aufweisen (Graf et al., Insect Biochem. (1985) 15: 611-618). Das Der p III-P3WS 1-Trypsinogen hat ein berechnetes Molekulargewicht von 28.000 Da und das entsprechende reife Protein ein Molekulargewicht von 24.985 kDa, während das gereinigte native Protein als Doppel mit einem mittels SDS-PAGE geschätzten Molekulargewicht von 28.000 und 30.000 auftrat. Es hat andere Berichte von Protein-Mehrfachbanden gegeben, die sowohl aus Der f III (Thomas et al., Exp. Appl. Acarol (1992) 16: 153-164) als auch aus Der p III (Stewart et al., Immunology (1992) 75: 29-35) isoliert worden waren. Diese Ergebnisse sind nicht ungewöhnlich, da von Trypsinproteinen bekannt ist, dass sie in verschiedenen Isoformen vorkommen. Gendry und Launay (1988) isolierten doppelte Proteinbande aus einem anionischen trypsinähnlichen Protein aus dem Pankres der Ratte. Sie zeigten, dass die höhere Bande von 32.000 Da das inaktive Trypsin darstellte und die niedrigere Bande von 30.000 Da die aktive Form des Trypsins, welches die Spaltung der Bande mit 32.000 Da autokatalysieren konnte. Es ist daher möglich, dass die Bande von 30.000 Da das inaktive Trypsinogen und die Bande von 28.000 Da das aktive Trypsin darstellen. Es ist berichtet worden, dass die Zahl der Isoenzyme für die Trypsine der Invertebraten im Bereich von 1-12 liegt (MacDonald et al., J. Biol. Chem. (1982) 257: 9724-9732). Stewart et al. (1992) schlugen 9 Hauptisoformen für Der p III vor mit pIs im Bereich von 4 bis > 8.
BEISPIEL 3: Expression und Reinigung von rekombinantem Der p III
Ein Der p III codierendes DNA-Insert (1A und 1B) wurde mit EcoR I verdaut und in pUC19 insertiert. Um sowohl die nicht translatierte 5'-Sequenz als auch einen Teil des mutmaßlichen hydrophoben Leaders zu entfernen, wurde die cDNA mit MscI gespalten und und ein EcoR I-Linker angehängt. Danach wurde das gestutzte Der p III-Fragment mit EcoR I verdaut und in den Expressionsvektor pET11d subkloniert (Studier et al., Gene Expression Technology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89). Mittels DNA-Sequenzierung wurden die Srquenz und das Leseraster bestimmt. Die Der p III codierende Sequenz umfasste Rest 13 bis zum Stop-Codon (siehe 1A und 1B). Der Expressionsvektor pET11d-Der p III wurde in den E.coli-Wirtsstamm BL21(DE3) transformiert und auf Platten mit 150 μg/ml Ampicillin selektiert (Studier et al., Gene Expression Technology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89). Eine einzelne tranformierende Kolonie wurde in einem Volumen von 2 ml BHIB-Medium, das 159 μg/ml Ampicillin enthielt, bei 37°C ungefähr 6 Stunden lang angezüchtet. 19 ml diese Kultur wurden auf eine Selektionsplatte gesprüht und über Nacht bei 37°C gezüchtet. Der Bakterienrasen wurde in 2 ml Medium aufgenommen und zu 500 ml BHIB.Medium (159 μg/ml Ampicillin) hinzugefügt und bei 37°C bis zu einem A₆₀₀ von 1,0 gezüchtet. Durch Zugabe von IPTG bis zu einer Endkonzentration von 1 mM wurde die rekombinante Expression induziert. Nach 2 Stunden Wachstum wurden die Zellen geerntet, lysiert und die Proteine in 6 M Guanidin-HCl-Puffer mit 100 mM 2-ME solubilisiert, wie dies schon vorher für die rekombinanten Allergene der Ambrosiapflanze Amb a I.1 und Amb a II beschrieben worden war (Rogers et al. (1991) J. Immunol., 147: 2547 – 2552).
Das Der p III enthaltende Guanidin-HCl-Lysat wurde unter denaturierenden Bedingungen in 8 M Harnstoff einer Ni²⁺-Metallionen-Affinitätschromatographie unterzogen (Hochuli, E. et al. (1988) Bio/Technology 6: 1321-1325). Nach Elution aus dem Ni²⁺-chelierenden Träger, Qiagen NTA-Agarose (Diagen GmbH, Düsseldorf, Deutschland) wurden die rekombinanten Der p III-Präparate einer SDS-PAGE-Analyse unterzogern (3).
Das rekombinante Der p III wies ein erwartetes Molekulargewicht von ca. 27.000 Da auf, wie dies für die 252 Aminosäuren plus die für die Reinigung verwendeten angehängten Aminosäuren (MGHHHHHHEF (SEQ ID NO: 17)) vorhergesagt wurde. Das petlld-Expressionssystem und das Ni²⁺-Methyl-Ionenaffinitäts-chromatographie-Verfahren lieferte ungefähr 12 mg rekombinantes Der p III pro Liter Wachstumsmedium (durch A₂₈₀-Messung ermittelt). Dieses Expressions- und Reinigungsschema ergab eine Proteinpräparat mit einer Reinheit von über 90%, ermittelt mittels SDS-Page und Anfärben mit Coomassie-Blau (3). Das beobachtete scheinbare Molekulargewicht von etwa 32.000 liegt gerinfügig über dem aus der Primärstruktur vorausgesagten (1A und 1B sowie oben). In 3 wurden steigende Konzentrationen des Der p III-Präparats untersucht, um die Reinheit auf ihre Richtigkeit hin zu überprüfen (Spur 1, 4,3 μg; Spur 2, 8,7 μg, Spur 3, 13,8 μg, Spur 4, 17,4 μg; die Marker sind mit M angegeben).
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Rekombinante oder synthetische Nukleinsäure, die für ein Der p III Proteinallergen kodiert, wobei die Nukleinsäure (a) die Nukleotidsequenz umfasst, die in 1A und 1B (SEQ ID NO 1) gezeigt ist; oder (b) die kodierende Region der Nukleotidsequenz umfasst, die in 1A und 1B (SEQ ID NO 1) gezeigt ist; oder (c) eine Nukleotidsequenz umfasst, die zu wenigstens 90% identisch zu der Nukleotidsequenz ist, die in 1A und 1B (SEQ ID NO: 1) gezeigt ist.
Rekombinanter Expressionsvektor, der die Nukleinsäure von Anspruch 1 umfasst.
Wirtszelle, die mit dem rekombinanten Expressionsvektor von Anspruch 2 transfiziert worden ist, der in der Lage ist, die Expression eines Peptids, das eine Aktivität von Der p III aufweist, zu steuern.
Wirtszelle nach Anspruch 3, wobei die Wirtszelle eine eukaryontische Zelle ist.
Verfahren zur Detektion von Sensitivität gegenüber einem Hausstaubmilben-Allergen in einem Subjekt, wobei man eine Blutprobe, die von dem Subjekt erhalten worden ist, mit einem Proteinallergen, das von der Nukleinsäure, dem rekombinanten Expressionsvektor oder der Wirtszelle der Ansprüche 1 bis 4 kodiert wird, unter Bedingungen vereinigt, die für die Bindung von Blutkomponenten mit dem Proteinallergen geeignet sind, und das Ausmaß, zu dem diese Bindung erfolgt, bestimmt, wobei gegebenenfalls das Ausmaß, zu dem diese Bindung erfolgt, durch Feststellen von T-Zell-Funktionen, T-Zell-Proliferation, B-Zell-Funktion, Binden des Proteins an Antikörper, die in dem Blut vorhanden sind, oder einer Kombination davon bestimmt wird.
Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder eines Diagnosemittels umfassend ein rekombinantes Hausstaubmilben-Proteinallergen, wobei dieses Verfahren den folgenden Schritt umfasst: (a) Kultivieren einer Wirtszelle, die einen Expressionsvektor enthält, der ein die Nukleinsäure nach Anspruch 1 umfassendes DNA-Molekül umfasst.
Verfahren von Anspruch 6, wobei der Expressionsvektor eine regulatorische Sequenz umfasst, die funktionsfähig mit der Nukleotidsequenz verbunden ist.
Verfahren von Anspruch 6 oder 7, wobei das Proteinallergen mit einem zusätzlichen Polypeptid fusioniert oder coexprimiert wird.
Verfahren von Anspruch 8, wobei das zusätzliche Polypeptid Glutathion-S-Transferase ist.
Chemisches Syntheseverfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder eines Diagnosemittels umfassend ein Hausstaubmilben-Proteinallergen, wobei dieses Allergen durch die Nukleinsäure nach Anspruch 1 kodiert wird.