KR101420064B1 - Panonychus 속 진단용 종-특이적 프라이머 및 이의 용도 - Google Patents

Panonychus 속 진단용 종-특이적 프라이머 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR101420064B1
KR101420064B1 KR1020130167989A KR20130167989A KR101420064B1 KR 101420064 B1 KR101420064 B1 KR 101420064B1 KR 1020130167989 A KR1020130167989 A KR 1020130167989A KR 20130167989 A KR20130167989 A KR 20130167989A KR 101420064 B1 KR101420064 B1 KR 101420064B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
species
seq
panonychus
specific
primer
Prior art date
Application number
KR1020130167989A
Other languages
English (en)
Inventor
이경열
틴모캉
심재경
이종호
Original Assignee
경북대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 경북대학교 산학협력단 filed Critical 경북대학교 산학협력단
Priority to KR1020130167989A priority Critical patent/KR101420064B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101420064B1 publication Critical patent/KR101420064B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/204—Modifications characterised by specific length of the oligonucleotides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 Panonychus 속 응애 진단 또는 검출을 위한 특이 프라이머 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 Panonychus 속 응애 4종(P. citri, P. ulmi, P. mori, 및 P. caglei) 각각을 특이적으로 진단 또는 검출할 수 있는 프라이머 세트; 이를 포함하는 Panonychus 속 응애 종-특이적 검출용 조성물; 진단 키트; 및 이를 이용한 Panonychus 속 응애 종-특이적 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 프라이머 세트는 Panonychus 속 응애 4종(P. citri, P. ulmi, P. mori, 및 P. caglei) 각각을 특이적으로 검출 또는 진단할 수 있어, 이를 이용하는 경우 형태 및 색깔이 유사하여 종간 구별이 어려워 오동정할 위험성이 있는 Panonychus 속 응애의 종류를 신속하고 정확하게 동정할 수 있다. 따라서 본 발명의 Panonychus 속 응애 종-특이적 프라이머 및 이를 이용한 Panonychus 속 응애 4종(P. citri, P. ulmi, P. mori, 및 P. caglei)의 검출방법은 농업 현장의 효율적인 해충진단 뿐만 아니라, 수출입식물검역에 사용되어 정확한 종 진단이 가능하게 함으로써 수출입 농산물의 안정성 또한 향상시킬 수 있는 이점을 갖는다.

Description

Panonychus 속 진단용 종-특이적 프라이머 및 이의 용도{Species-specific primers for the diagnosis of the genus Panonychus mites and uses thereof}
본 발명은 Panonychus 속 응애 진단 또는 검출을 위한 특이 프라이머 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 Panonychus 속 응애 4종(P. citri, P. ulmi, P. mori, 및 P. caglei) 각각을 특이적으로 검출 또는 진단할 수 있는 프라이머 세트; 이를 포함하는 Panonychus 속 응애 종-특이적 검출용 조성물; 진단 키트; 및 이를 이용한 Panonychus 속 응애 종-특이적 검출 방법에 관한 것이다.
잎응애과(Tetranychidae)에 속하는 응애는 전 세계적으로 71속 약 1,200종이 분포하고 있는데(Bolland et al.,1998), 한국에는 12속 41종이 보고되었다(Lee and Koh, 2010). 이 과(family)의 Panonychus 속에 15종이 알려져 있는데 일본에는 6종이 보고되었고 한국에는 현재 2종 [Panonychus citri(귤응애)와 P. ulmi(사과응애)]이 보고되었다[Bolland et al, 1998 World cataloque of the spider mite family (Acari: Tetranychidae)]. 본 연구에서 처음으로 보고하는 국내 미기록종 2종을 포함하여 현재 4종이 존재하는 것으로 보고한다.
Panonychus citri(귤응애)와 P. ulmi(사과응애)는 전세계에 분포하며 다양한 과수에 심각한 피해를 끼치고 있는 원예해충이다. 한편, Panonychus mori (Yokoyama, 1929)는 지금까지 일본에서만 발견이 되었는데 (Yokoyama, 1929, Saishin Nippon Sangyo Gaichu Zensho, Meibun-do, Tokyo, 569pp), 최근 국내의 경북 경산 대추밭에서 채집이 되었다(Khaing and Lee, 논문 준비중). 또한, Panonycus caglei (Mellot, 1968)는 브라질, 미국, 중국, 타이완에 분포하는 것으로 보고된 바 있으며, 영명은 raspberry red mite(산딸기응애)인데 최근 국내의 서해안 변산반도지역 새만금방조제의 가력도에 서식하는 칡(Pueraria thunbergiana) 군집에서 채집이 되었다(Khaing and Lee, 논문 준비중).
Panonychus 속 응애들은 크기가 작고, 형태가 유사하여 종간 구별이 어렵고 종(species) 내에서도 색깔이 다른 경우가 있어 다른 종으로 오동정할 위험성이 있다. 이에 수컷의 생식기를 토대로 종을 구분하기도 하였으나, 수출입식물검역의 특성상 미성숙 개체(알, 유충, 약충) 및 월동형 암컷 성충 개체로 발견되고 있다. 특히 과일, 채소, 화훼류 등 우리 농산물 수출시 검출되는 경우, 정확한 종 동정이 되지 않는다는 이유로 검역조치(소독처리, 통관지연 등)를 당하는 등 수출의 장애 요인이 되고 있다.
최근 지구온난화 및 수출입 농산물의 증가로 인해 검역 병해충의 유출입이 증가하고 있다. 특히, 본 속의 귤응애 및 사과응애는 중요한 검역 관련 해충이기 때문에 정확한 종 진단기술의 개발이 절실한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, Panonychus 속 응애 4종(species)을 대상으로 종-특이 프라이머를 제작하고 상기 프라이머를 이용하여 PCR진단을 하는 경우, 종 특이적으로 진단 가능함을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
한국공개특허 제10-2002-0075996호 한국등록특허 제10-1074466호
따라서 본 발명의 목적은 Panonychus 속 응애 4종(P. citri, P. ulmi, P. mori, 및 P. caglei) 각각을 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 Panonychus 속 응애 종-특이적 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 Panonychus 속 응애 종-특이적 검출 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하여 Panonychus 속 응애의 다양한 종(P. citri, P. ulmi, P. mori, 및 P. caglei )을 효과적으로 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 제 1 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 제 2 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 제 3 프라이머 쌍; 또는 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 제 4 프라이머 쌍을 포함하는, Panonychus 속 응애 종-특이적 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 Panonychus속 응애는 P. citri, P. ulmi, P. mori, 및 P. caglei 로 이루어진 군으로부터 선택되는 종(species)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 제1 프라이머 쌍은 서열번호 9의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 414bp의 P. citri 종-특이 PCR 산물을 증폭할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 제2 프라이머 쌍은 서열번호 10의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 405bp의 P. ulmi 종-특이 PCR 산물을 증폭할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 제3 프라이머 쌍은 서열번호 11의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 291bp의 P. mori 종-특이 PCR 산물을 증폭할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 제4 프라이머 쌍은 서열번호 12의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 260bp의 P. caglei 종-특이 PCR 산물을 증폭할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 Panonychus 속 응애 종-특이적 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 Panonychus 속 응애 종-특이적 검출 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 시료에서 Panonychus 속 응애 게놈 DNA를 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항 또는 제2항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, Panonychus 속 응애의 종-특이적 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 Panonychus 속 응애는 P. citri, P. ulmi, P. mori, 및 P. caglei 로 이루어진 군으로부터 선택되는 종(species)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 프라이머 세트는 Panonychus 속 응애 4종(P. citri, P. ulmi, P. mori, 및 P. caglei) 각각을 특이적으로 검출 또는 진단할 수 있어, 이를 이용하는 경우 형태 및 색깔이 유사하여 종간 구별이 어려워 오동정할 위험성이 있는 Panonychus 속 응애의 종류를 신속하고 정확하게 동정할 수 있다. 따라서 본 발명의 Panonychus 속 응애 종-특이적 프라이머 및 이를 이용한 Panonychus속 응애 4종(P. citri, P. ulmi, P. mori, 및 P. caglei)의 검출방법은 농업 현장에서 효율적인 해충진단 뿐만 아니라, 수출입식물검역에 사용되어 정확한 종 진단이 가능하게 함으로써 수출입 농산물의 안정성 또한 향상시킬 수 있는 이점을 갖는다.
도 1은 본 발명에 사용한 Panonychus 속 응애의 사진들을 나타낸다: P. citri (A), P. ulmi (B), P. mori (C), P. caglei (D).
도 2는 본 발명에 사용한 4종 Panonychus 속 응애의 세부구조를 나타낸 것으로 주요 동정 형질인 수컷 생식기의 형태를 비교한 것이다: P. citri (A), P. ulmi (B), P. mori (C), P. caglei (D).
도 3은 Panonychus 속 4종의 ITS2 영역의 염기서열을 비교한 것으로서 각 종의 종-특이적 프라이머 영역(화살표)을 표시하였다.
도 4는 본 발명의 Panonychus 속 4종의 종-특이 프라이머 조합 4개를 이용하여 Panonychus속 응애 종들을 대상으로 PCR 진단 결과를 나타낸 것이다: DNA marker (M), P. citri (A), P. ulmi (B), P. mori (C), P. caglei (D).
본 발명은 잎응애과(Tetranychidae) Panonychus 속(genus)에 속하는 다양한 종을 특이적으로 진단 또는 검출할 수 있는 프라이머 세트를 제공함에 그 특징이 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 Panonychus 속 응애는 사과응애(P. citri), 귤응애(P. ulmi), P. mori, 및 P. caglei 로 이루어진 군으로부터 선택되는 종(species)일 수 있다.
본 발명에서 "잎응애"란 몸길이가 0.5mm의 이하의 아주 작은 절지동물로서 거미강에 속하는 해충으로 알려져 있다. 본 발명에서의 잎응애는 성충뿐만 아니라, 알, 유충, 번데기, 유생 등을 모두 포함하는 개념이다.
본 발명에서 상기 "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 15 내지 30개의 염기로 구성된다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.
본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.
한편, 본 발명에서 제공하는 프라이머 세트는 Panonychus 속(genus)에 속하는 사과응애(Panonychus ulmi), 귤응애(P. citri) 2종과 현재까지 국내 미기록종인 P. mori와 P. caglei 2종과 함께 총 4종(species)을 특이적으로 검출 또는 진단할 수 있도록 고안된 정방향과 역방향의 프라이머이다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 제 1 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 제 2 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 제 3 프라이머 쌍; 또는 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 제 4 프라이머 쌍을 사용할 수 있다.
본 발명의 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 제 1 프라이머 쌍을 이용하는 경우 414bp의 사과응애(P. ulmi) 종-특이 PCR 산물이 증폭될 수 있으며; 본 발명의 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 제 2 프라이머 쌍을 이용하는 경우 405bp의 귤응애(P. citri) 종-특이 PCR 산물이 증폭될 있고; 본 발명의 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 제 3 프라이머 쌍을 이용하는 경우 291bp의 P. mori 종-특이 PCR 산물이 증폭될 수 있으며; 본 발명의 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 제 4 프라이머 쌍을 이용하는 경우 260bp의 P. caglei 종-특이 PCR 산물이 증폭될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 제 1 프라이머 쌍을 이용하여 증폭되는 414bp의 사과응애(P. ulmi) 종-특이 PCR 산물은 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 있으며; 상기 제 2 프라이머 쌍을 이용하여 증폭되는 405bp의 귤응애(P. citri) 종-특이 PCR 산물은 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 있고; 상기 제 3 프라이머 쌍을 이용하여 증폭되는 291bp의 P. mori 종-특이 PCR 산물은 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 있으며; 상기 제 4 프라이머 쌍을 이용하여 증폭되는 260bp의 P. caglei 종-특이 PCR 산물은 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명자들은 국내 Panonychus 속 응애 4종(P. citri, P. ulmi, P. mori, 및 P. caglei)을 선발하고, 상기 종들의 DNA 샘플을 채취한 후, 4종의 Ribosomal DNA 영역에 존재하는 ITS2(Internal transcribed space 2) 염기서열에서 종 특이적으로 나타나는 염기만을 발굴하여 종-특이적 프라이머를 제작하였으며, 제작된 프라이머는 상기에서 언급한 바와 같이 서열번호 1 내지 8로 나타내었다.
본 발명자들은 상기 제작된 Panonychus속 응애 4종(P. citri, P. ulmi, P. mori, 및 P. caglei) 각각의 종-특이 프라이머를 이용하여, DNA 샘플 채취에 사용된 총 4종의 Panonychus속 응애를 대상으로 PCR을 수행하였으며, 그 결과 각각의 종(species)에서만 밴드가 증폭되는 것으로 나타났다. 이러한 결과를 통해 본 발명의 제 1 프라이머 쌍은 사과응애(P. ulmi), 제 2 프라이머 쌍은 귤응애(P. citri), 제 3 프라이머 쌍은 P. mori , 제 4 프라이머 쌍은 P. caglei 　만을 종 특이적으로 표식함을 확인할 수 있었다.
본 발명은 또한, 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 제 1 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 제 2 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 제 3 프라이머 쌍; 또는 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 제 4 프라이머 쌍을 포함하는 Panonychus 속 응애 종-특이적 검출용 조성물을 제공한다.
상기 프라이머는 Panonychus 속 응애의 Ribosomal DNA 영역에 존재하는 ITS2(Internal transcribed space 2) 염기서열에서 종 특이적으로 나타나는 염기 부위를 포함하는 DNA 서열에 혼성화하여 DNA 단편을 증폭시킬 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 제 1 프라이머 쌍을 이용하는 경우 서열번호 9의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 414bp의 사과응애(P. ulmi) 종-특이 PCR 산물이 증폭될 수 있으며; 본 발명의 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 제 2 프라이머 쌍을 이용하는 경우 서열번호 10의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 405bp의 귤응애(P. citri) 종-특이 PCR 산물이 증폭될 수 있고; 본 발명의 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 제 3 프라이머 쌍을 이용하는 경우 서열번호 11의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 291bp의 P. mori 종-특이 PCR 산물이 증폭될 수 있으며; 본 발명의 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 제 4 프라이머 쌍을 이용하는 경우 서열번호 12의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 260bp의 P. caglei 종-특이 PCR 산물이 증폭될 수 있다.
본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명은 또한, 상기 조성물을 포함하는 Panonychus 속 응애 종-특이적 검출 또는 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 Panonychus 속 응애의 Ribosomal DNA 영역에 존재하는 ITS2(Internal transcribed space 2) 염기서열 영역에 존재하는 종-특이 염기 부위를 확인함으로써 Panonychus 속 응애의 다양한 종을 검출 또는 진단하는데 사용될 수 있다. 상기 키트에는 본 발명의 프라이머 세트(서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 제 1 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 제 2 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 제 3 프라이머 쌍; 또는 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 제 4 프라이머 쌍)뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. PCR 키트는, 본 발명의 프라이머 세트(서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 제 1 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 제 2 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 제 3 프라이머 쌍; 또는 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 제 4 프라이머 쌍) 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액 (pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드 (dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수 (DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또한, 상기 키트는 안내서를 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명은 또한, (a) 시료에서 Panonychus 속 응애 게놈 DNA를 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 프라이머 세트(서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 제 1 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 제 2 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 제 3 프라이머 쌍; 또는 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 제 4 프라이머 쌍)를 이용하여 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 Panonychus 속 응애의 종-특이적 검출 방법을 제공한다.
상기 PCR 수행을 통해 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될수 있다. 하나의 구체적 예로서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사선을 발하는 물질일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 바람직하게는 상기 표지 물질은 에티디움브로마이드(Ethidium Bromide: EtBr), Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5′-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사선 물질을 이용한 표지는 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사선 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방산선이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사선으로 표지될 수 있다.
상기 증폭된 산물의 검출은 DNA 칩. 겔 전기영동, 방사선 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5′-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사선 측정 방법은 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사선 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사선 측정기구, 예를 들면, 가이어 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사선을 측정할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
< 실시예 1>
Panonychus 속( genus ) 응애 4종( species )의 DNA 확보
국내 Panonychus 속 응애 4종을 선발하고, 상기 종들의 DNA 샘플을 확보하였다. 상기 Panonychus 속 응애 4종은 하기 표 1에 나타내었으며, DNA 추출 과정은 하기에 자세히 나타내었다.
식물 잎으로부터 응애들을 채집하여 DNA 추출 키트인 Pure link genomic DNA kit(Invitrogen, USA)를 이용하여 각 개체별로 DNA 추출을 수행하였다. 각각의 응애 샘플을 proteinase K(20 μl) 용액이 포함된 Genomic digestion buffer(180μl)가 담긴 E-tube에 담군 뒤 55℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 12시간 후, 20μl의 RNase를 상기 반응용액에 넣은 뒤 3분간 반응시켰다. 반응이 완료된 후, Genomic lysis/binding buffer(200μl)를 넣고 잘 섞은 뒤, 99% 에탄올 200μl를 첨가하였다. Genomic spin column에 상기 반응 용액을 넣고 10,000 rpm으로 1 분간 원심분리시켰다. 상기 컬럼에 Wash 1 buffer(500 μl)를 넣고 1분간 10,000 rpm으로 원심분리한 후, 다시 컬럼에 Wash 2 buffer(500 μl)를 넣고 3분간 12,000 rpm으로 원심분리하였다. 새로운 1.5ml E-tube에 컬럼을 설치한 후 Elution buffer(20 μl)를 넣고 1분간 방치하였다. 그러고 나서, 상기 튜브를 12,000 rpm에서 1분간 원심분리하여 DNA 용액을 추출하였다.
Panonychus 속의 응애 4종
종명 개체군명 기주식물 채집지 NCBI 등록번호
ITS2 COI
P. citri Pc-BS1 Citrus unshiu (감귤)
Poncirus trifoliate (오렌지)
Morus alba (뽕나무)		 수원
부산
청주, 대구		 JF774169 KC502919
P. ulmi Pc-GH1 Malus pumila (사과)
Pyrus ussuriensis (배)
Glycine max (콩)		 수원
대구
청주		 JF776969 KC502918
P. mori Pm-GH1 Ziziphus zizyphus (대추) 하양 KC502915 KC502917
P. caglei Pcag-DMC1 Pueraria thunbergiana (칡) 변산반도 KC502916 KC502920
T. urticae Tu -CBNU1 Malus pumila (사과) 청주 JF774165 AF131105
< 실시예 2>
종-특이적 프라이머 제작
상기 총 4종의 응애 DNA 샘플 중, 4종의 Ribosomal DNA 영역에 존재하는 ITS2(Internal transcribed space 2) 염기서열을 확보하기 위하여 종 특이적으로 나타나는 염기만을 발굴하여 종-특이적 프라이머를 제작하였다. ITS2 염기서열은 NCBI(National Center for Biological Information) database에서 발굴한 것과 채집한 응애로 부터 분리한 염기서열을 분석한 것을 이용하였으며, 활용한 염기서열은 귤응애(P. citri) 10개, 사과응애(P. ulmi) 17개, P. mori 5개, P. caglei 5개를 이용하였다. 대조구로서 근연속(genus)인 Tetranychus 속의 점박이응애(T. urticae) 3개를 이용하였다. 채집한 샘플에서 염기서열을 확보하기 위하여 universal primer set (Ben-David et al., 2007)를 이용하였다. 이에 사용한 universal primer set는 다음과 같다; Forward 5’-GTC ACA TCT GTC TGA GAG TTG AGA-3’; reverse: 5‘-GTA RCC TCA CCT RMT CTG AGA TC-3. 이후 총 40개의 염기서열을 비교하여 각 종에 특이적인 염기를 발굴하였으며 (도 3), 이 염기를 포함하는 영역을 선정하여 종-특이적 프라이머를 아래 표 2와 같이 제작하였다.
Panonychus 속 응애 종-특이적 프라이머 및 PCR 조건
종 프라이머 세트 시퀀스(5‘-3’) 서열번호 size(bp) annealing temp/cycle
P. citri Pc-ITS2 포워드 GCAGTAGTTTAACACCTACTCTGC 1 414 55/30
리버스 AATGGAAGACGGGATACATGCG 2
P. ulmi Pu-ITS2 포워드 GCTTAGCAGAGTTTAAATACTCTGC 3 405 55/30
리버스 TGGAGATGTGTGATACACGCTAC 4
P. mori Pm-ITS2 포워드 GTTCGGTCTTAATTGATTCGAACC 5 291 55/30
리버스 TGCTAAGGATACAACCAACAGTC 6
P. caglei Pca-ITS2 포워드 ACAGCAATATCAGCAGCAACAG 7 260 55/30
리버스 AGGGAGATGCGTGATACATGC 8
< 실시예 3>
본 발명의 Panonychus 속 응애 종-특이적 프라이머를 이용한 PCT 진단
상기 실시 예 2에서 제작된 4종의 종-특이적 프라이머를 이용하여, DNA 샘플 채취에 사용된 총 4종의 Panonychus 속 응애를 대상으로 PCR을 수행하였다.
먼저, PCR buffer(10mM Tris-HCL, 40mM KCl, 1.5mM MgCl2, pH 9.0), 0.2mM dNTPs, 0.4μM의 각각의 프라이머, Taq2000 2units(Takara Bio Inc., Shiga, Japan) 및 0.1g의 DNA를 혼합하여 50μl의 PCR 용액을 제조하였다. 이후 PCR 반응은 PTC-200 thermal cycler(MJ Research, Watertown, MA, USA)를 이용하여 수행하였으며, 각 종(species) 당 annealing temperature 및 PCR cycle은 상기 표 2에 표시된 조건으로 수행하였다. 이후 PCR 반응의 증폭산물은 1 % 아가로즈젤 전기영동으로 분석하였다.
그 결과 도 4에서 나타낸 바와 같이, 4종의 종-특이적 프라이머를 이용하여 PCR 진단 결과, 각각의 종(species)만을 표식하고 다른 종은 표식하지 않음을 볼 수 있다.
상기와 같은 결과를 통해, 본 발명의 4세트의 프라이머가 각각의 종만을 특이적으로 표식함으로써 종-특이적임을 확인할 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Species-specific primers for the diagnosis of the genus Panonychus mites and uses thereof <130> PN1312-406 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pc-ITS2_forward primer <400> 1 gcagtagttt aacacctact ctgc 24 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pc-ITS2_reverse primer <400> 2 aatggaagac gggatacatg cg 22 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pu-ITS2_forward primer <400> 3 gcttagcaga gtttaaatac tctgc 25 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pu-ITS2_reverse primer <400> 4 tggagatgtg tgatacacgc tac 23 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pm-ITS2_forward primer <400> 5 gttcggtctt aattgattcg aacc 24 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pm-ITS2_reverse primer <400> 6 tgctaaggat acaaccaaca gtc 23 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pca-ITS2_forward primer <400> 7 acagcaatat cagcagcaac ag 22 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pca-ITS2_reverse primer <400> 8 agggagatgc gtgatacatg c 21 <210> 9 <211> 414 <212> DNA <213> Panonychus citri specific PCR product(414bp) <400> 9 gcagtagttt aacacctact ctgctatgac ttagttcaca tacggcttcg taatatttta 60 atccttttct tggcttggtc cttaactgga tacaagccta gtaaggagtt tgtataaatg 120 gtggtgcatg gtgaaaactt gttggttgtg tattgttaaa tacatcaaca gccacagaac 180 aacgggatgt tggaatatat ttcactggca ggggatacct gagaatgctg gtcaatctgc 240 cgacgctcaa gtcgaacagc ggattaacat gacccgaaga aaaggcttct cattataaag 300 gatctcgttt gttacataaa ggtgaactat agtctgttgg ttctgttgtt gtaatactta 360 acatatacac aacatatata acttgttagt agcgcatgta tcccgtcttc catt 414 <210> 10 <211> 405 <212> DNA <213> Panonychus ulmi specific PCR product(405bp) <400> 10 gcttagcaga gtttaactac tctgctatga cttagttcac atacggcatc gttatattta 60 aatccttttc ttggtttggt ctttactgac acaaacctag taaggagttg tactgatggt 120 ggtgcattgt gaaaactgtt tgttgtattg actaaataca ttcaacagca acagaacaac 180 ttgattgttg gaatatattt cactggcagg ggatacctga gaatgctggt caatctgccg 240 acgctcaagt cgaacagcgg attaacatga cccgaaattg aaaaggcttc tcgctataaa 300 ggatctcgtt tgttaaataa aggtggaata tagtctgttg attgttggtt gtaaaactta 360 gcgtataact tgtaacatgt tagtagcgtg tatcacacat ctcca 405 <210> 11 <211> 291 <212> DNA <213> Panonychus mori specific PCR product(291bp) <400> 11 gttcggtctt aattgattcg aacctagtaa ggagttgcaa cgatggtggt gcatggtgaa 60 agctgtttgt tgtacttttg ctaatacatc aacggcaaca gaacaacatt gatttgttgg 120 aatatatttc actggcaggg gatacctgag aatgctggtc aatctgccga cgctcaagtc 180 gaacagcgga ttatcatgac ccgatctaga caaggcttct cattataaag gatctcgttt 240 gttacataaa ggtggaatat agtctgttga ctgttggttg tatccttagc a 291 <210> 12 <211> 260 <212> DNA <213> Panonychus caglei specific PCR product(260bp) <400> 12 acagcaatat cagcagcaac agaacaactt aattgttgga atatatttca ctggcagggg 60 atacctgaga atgctggtca atctgccgac gctcaagtcg aacagcggat taacatgacc 120 cgaaattgaa aaggcttctc gttataaagg atctcgtttg ttacataaag agtggaatat 180 agtctgttga ctgttgtatt gtgtagtatt ttgacttaca acttgtaaca tgttaagtag 240 catgtatcac gcatctccct 260

Claims (11)

  1. 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 제 1 프라이머 쌍;
    서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 제 2 프라이머 쌍;
    서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 제 3 프라이머 쌍; 및
    서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 제 4 프라이머 쌍을 포함하는, Panonychus 속 응애 종-특이적 검출용 프라이머 세트.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 Panonychus 속 응애는 P. citri, P. ulmi, P. mori, 및 P. caglei 로 이루어진 군으로부터 선택되는 종(species)인 것을 특징으로 하는 Panonychus 속 응애 종-특이적 검출용 프라이머 세트.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제1 프라이머 쌍은 서열번호 9의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 414bp의 P. citri 종 특이 PCR 산물을 증폭하는 것을 특징으로 하는 Panonychus 속 응애 종-특이적 검출용 프라이머 세트.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 제2 프라이머 쌍은 서열번호 10의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 405bp의 P. ulmi 종 특이 PCR 산물을 증폭하는 것을 특징으로 하는 Panonychus 속 응애 종-특이적 검출용 프라이머 세트.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 제3 프라이머 쌍은 서열번호 11의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 291bp의 P. mori 종 특이 PCR 산물을 증폭하는 것을 특징으로 하는 Panonychus 속 응애 진단용 프라이머 세트.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 제4 프라이머 쌍은 서열번호 12의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 260bp의 P. caglei 종 특이 PCR 산물을 증폭하는 것을 특징으로 하는 Panonychus 속 응애 종-특이적 검출용 프라이머 세트.
  7. 제1항의 프라이머 세트를 포함하는 Panonychus 속 응애 종-특이적 검출용 조성물.
  8. 제7항의 조성물을 포함하는 Panonychus 속 응애 종-특이적 검출 키트.
  9. (a) 시료에서 Panonychus 속 응애 게놈 DNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항 또는 제2항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    (c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, Panonychus 속 응애의 종-특이적 검출 방법.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 Panonychus 속 응애는 P. citri, P. ulmi, P. mori, 및 P. caglei 로 이루어진 군으로부터 선택되는 종(species)인 것을 특징으로 하는 Panonychus속 응애의 종-특이적 검출 방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 Panonychus 속 응애의 종-특이적 검출 방법.
KR1020130167989A 2013-12-31 2013-12-31 Panonychus 속 진단용 종-특이적 프라이머 및 이의 용도 KR101420064B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020130167989A KR101420064B1 (ko) 2013-12-31 2013-12-31 Panonychus 속 진단용 종-특이적 프라이머 및 이의 용도

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020130167989A KR101420064B1 (ko) 2013-12-31 2013-12-31 Panonychus 속 진단용 종-특이적 프라이머 및 이의 용도

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR101420064B1 true KR101420064B1 (ko) 2014-07-15

Family

ID=51742296

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020130167989A KR101420064B1 (ko) 2013-12-31 2013-12-31 Panonychus 속 진단용 종-특이적 프라이머 및 이의 용도

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101420064B1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106967822A (zh) * 2017-05-09 2017-07-21 西南大学 柑橘全爪螨响应阿维菌素胁迫蛋白编码基因的分子检测方法
KR102268679B1 (ko) 2019-12-23 2021-06-24 대한민국 산딸기속 식물의 종 구별용 조성물

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101074466B1 (ko) * 2010-11-10 2011-10-18 대한민국(관리부서 : 농림수산식품부 농림수산검역검사본부) 잎응애 진단용 종-특이적 프라이머 개발
US8287875B2 (en) * 1993-12-08 2012-10-16 Merck Patent Gmbh Nucleic acids encoding a house dust mite allergen, Der p III, and uses therefor

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8287875B2 (en) * 1993-12-08 2012-10-16 Merck Patent Gmbh Nucleic acids encoding a house dust mite allergen, Der p III, and uses therefor
KR101074466B1 (ko) * 2010-11-10 2011-10-18 대한민국(관리부서 : 농림수산식품부 농림수산검역검사본부) 잎응애 진단용 종-특이적 프라이머 개발

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Exp. Appl. Acarol., Vol. 41, pp. 169-181 (2007.03.09.) 1부. *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106967822A (zh) * 2017-05-09 2017-07-21 西南大学 柑橘全爪螨响应阿维菌素胁迫蛋白编码基因的分子检测方法
KR102268679B1 (ko) 2019-12-23 2021-06-24 대한민국 산딸기속 식물의 종 구별용 조성물

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101516190B1 (ko) 참외 계통 또는 품종의 구별을 위한 ｓｓｒ 프라이머 세트 및 이들의 용도
KR20190037609A (ko) 엽록체 유전체와 45Ｓ ｎｒＤＮＡ 염기서열 정보를 활용한 들깨 배수체간 품종 판별용 분자 마커 및 이의 용도
KR101816573B1 (ko) 수박의 덩굴마름병 저항성 또는 감수성 판별용 마커
KR101420064B1 (ko) Panonychus 속 진단용 종-특이적 프라이머 및 이의 용도
KR101624026B1 (ko) 사과갈색무늬병균 검출을 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트 및 이의 용도
KR102192664B1 (ko) Scar 분자표지 다중검정을 이용한 키위 품종 판별 방법
KR101678851B1 (ko) 플란타인 모틀 바이러스 진단 또는 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도
KR101166781B1 (ko) 미토콘드리아 ｄｎａ 다형성 분석에 의한 느타리버섯류의 품종 판별 특이 프라이머 및 이의 용도
KR101959732B1 (ko) 이질4배체 감귤 특이적 ssr 마커 검출용 프라이머 및 이의 용도
KR102335806B1 (ko) 대추 산조 품종을 구별하기 위한 엽록체 게놈 서열 기반 분자마커 및 이의 용도
KR20150050062A (ko) 온실가루이 진단을 위한 특이 프라이머 및 이의 용도
KR101144988B1 (ko) 사과의 품종 판별용 ｓｃａｒ 표지 및 이의 용도
KR101767371B1 (ko) 감나무 둥근무늬낙엽병균 검출을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도
KR101761293B1 (ko) 무 위황병 저항성 판별용 snp 프라이머 세트 및 이의 용도
KR101766274B1 (ko) 초위성체 마커를 이용한 블루베리 품종식별 방법
KR101137799B1 (ko) 느타리버섯 수한 계통 판별용 특이 프라이머 및 이의 용도
KR101795937B1 (ko) 호접란 품종 식별을 위한 kslg-cp001 프라이머 세트 및 이를 포함하는 마커용 조성물
KR102370010B1 (ko) 국내 대추 품종과 일본 대추 품종을 구별하기 위한 엽록체 게놈 서열 기반 분자마커 및 이의 용도
KR102261896B1 (ko) 들깨 속 식물의 유전적 배경을 구별하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도
KR101137803B1 (ko) 느타리버섯 원형 계통 판별용 특이 프라이머 및 이의 용도
KR102291826B1 (ko) 잔디품종 및 제초제 저항성 유전자 변형 판별용 조성물 및 이의 용도
KR102261239B1 (ko) 들깨 속 식물의 엽색 판별용 ssr 프라이머 세트 및 이의 용도
KR102151225B1 (ko) 국내 재래종 도라지를 구별하기 위한 핵 게놈 서열 기반 분자마커 및 이의 용도
KR101391555B1 (ko) 인삼 병원균 검출용 동시다중 유전자 증폭용 검출 방법
KR101687581B1 (ko) 삽주 마일드 모틀 파라레트로바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
A302 Request for accelerated examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170621

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180626

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190627

Year of fee payment: 6