KR101074466B1 - 잎응애 진단용 종-특이적 프라이머 개발 - Google Patents

잎응애 진단용 종-특이적 프라이머 개발 Download PDF

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Abstract

본 발명은 잎응애를 종(species) 특이적으로 진단할 수 있는 종-특이 프라이머 제작에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 서열번호 1, 3, 5 및 7로 구성된 군에서 선택된 염기서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 2, 4, 6 및 8로 구성된 군에서 선택된 염기서열을 갖는 역방향 프라이머를 포함하는 잎응애 진단용 프라이머에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 잎응애로부터 종 특이적으로 나타나는 염기를 발굴하여 종-특이적 프라이머를 제작할 수 있으며, 상기 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 경우 그 종에 대해 특이적으로 표식함을 확인하였다. 따라서 본 발명의 잎응애 종-특이적 프라이머와 잎응애 진단 방법을 검역 현장에 적용시킬 경우, 검역 현장에서 검출되는 잎응애류 응애의 신속하고 정확한 동정이 가능할 것이며, 검역 현장의 효율적인 해충진단뿐만 아니라 수출입 농산물의 안정성 또한 향상시킬 수 있을 것으로 사료된다.

Description

잎응애 진단용 종-특이적 프라이머 개발{Development of species-specific primers for the diagnosis of spider mites}
본 발명은 잎응애를 종(species) 특이적으로 진단할 수 있는 종-특이 프라이머에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 서열번호 1, 3, 5 및 7로 구성된 군에서 선택된 염기서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 2, 4, 6 및 8으로 구성된 군에서 선택된 염기서열을 갖는 역방향 프라이머를 포함하는 잎응애 진단용 프라이머에 관한 것이다.
잎응애는 식물의 잎에 기생하여 엽록소를 흡즙하여 생활하는 초소형 원예작물 해충으로서 이들은 계통분류학적으로 집먼지진드기나 저장진드기와는 같은 응애목에 속한다. 점박이응애는 사과, 배, 포도 등의 과수뿐만 아니라 화훼, 채소, 잡초 등의 잎에도 기생하는 기주 식물의 범위가 광범위하게 분포하여, 우리나라뿐만 아니라 전 세계적으로도 높은 밀도로 분포한다. 특히, 점박이응애는 농약 살포가 빈번할 때에 살충제 저항성이 쉽게 발달하며, 전정 등 집약적인 재배 관리가 이루어지는 작물에서 발생 밀도가 높은 특징이 있다. 또한, 이는 농약에 의해 천적이 제거됨에 따라 점박이응애에 대한 천적의 밀도 억제 작용이 큰 역할을 하지 못하여, 기주 식물의 영양 조건이 향상되어 점박이응애의 생존과 번식률이 높아졌기 때문인 것으로 추정된다. 실제로 과수에 해를 주는 해충 중에서 점박이응애를 포함한 잎응애는 제2차 세계 대전 이전까지는 문제되지 않았으나, 2차 대전 이후 농약이 광범위하게 사용되기 시작하면서 다른 해충은 많이 제거되었으나, 잎응애는 살충제 저항성이 발달함으로서 오히려 그 밀도가 증가하기 시작하여 최근 조사에 의하면 과수 농사에서 가장 문제가 되는 해충으로 지적되고 있다[Kim YK et al., Spider mites: common outdoor allergens among individuals living in rural areas (Review), Clin. Exp. Allergy 2000; 30: 1364-70].
잎응애과 응애들은 크기가 작고, 형태가 유사하여 종간 구별이 어렵고 종내에서도 색깔이 다른 경우가 있어 다른 종으로 오동정할 위험성이 있다. 이에 수컷의 생식기를 토대로 종을 구분하기도 하였으나, 수출입식물검역의 특성상 미성숙 개체(알, 유충, 약충) 및 월동형 암컷 성충 개체로 발견되고 있다. 특히 과일, 채소, 화훼류 등 우리 농산물 수출시 검출되는 경우, 정확한 종 동정이 되지 않는다는 이유로 검역조치(소독처리, 통관지연 등)를 당하는 등 수출의 장애 요인이 되고 있다 (도 1 및 2 참조).
지구온난화 및 삶의 질 향상으로 외국 및 아열대산 재식용 식물 및 관상식물 등의 수입 증가와 함께 잎응애류의 유입위험이 증가하고 있으나, 식물검역 현장에서 적절히 검색ㆍ동정하기에 어려움이 있다. 따라서 최근 발달한 분자생물학적 방법을 이용한 신속하고 정확한 종 동정 기술 개발이 절실히 요구되며, 외부 형태적으로 유사한 종 및 미성숙 발육태로 검출되는 표본들을 종 수준까지 구분하기 위한 DNA 바코드(barcode) 구축이 요구된다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 잎응애 주요 종(species)들로부터 각 종들의 종-특이 프라이머를 제작하고 상기 프라이머를 이용하여 PCR 진단을 하는 경우, 종 특이적으로 진단 가능함을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 잎응애의 종 특이적으로 진단 가능한 잎응애 진단용 특이 프라이머를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 잎응애 진단용 특이 프라이머 제작 방법 및 상기 프라이머를 이용한 잎응애 종-특이적 진단 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1, 3, 5 및 7로 구성된 군에서 선택된 염기서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 2, 4, 6 및 8로 구성된 군에서 선택된 염기서열을 갖는 역방향 프라이머를 포함하는 잎응애 진단용 프라이머를 제공한다.
본 발명의 잎응애 진단용 프라이머에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1 및 2의 프라이머 조합; 서열번호 3 및 4의 프라이머 조합; 서열번호 5 및 6의 프라이머 조합; 및 서열번호 7 및 8의 프라이머 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 잎응애는 점박이응애(Tetranychus urticae), 점박이응애붙이(Tetranychus cinnabarinus), 차응애(Tetranychus kanzawai), 콩응애(Tetranychus phaselus) 및 작은점박이응애(Tetranychus truncatus) 종(species)인 것을 특징으로 한다.
구체적으로, 서열번호 1 및 2의 프라이머 조합은 점박이응애(T. urticae) 또는 점박이응애붙이(T. cinnabarinus)를, 서열번호 3 및 4의 프라이머 조합은 차응애(T. kanzawai)를, 서열번호 5 및 6의 프라이머 조합은 콩응애(T. phaselus)를, 서열번호 7 및 8의 프라이머 조합은 작은점박이응애(T. truncatus)를 종 특이적으로 진단할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 프라이머를 포함하는 잎응애 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 잎응애 진단용 키트에 있어서, 포함되는 프라이머는 서열번호 1 및 2의 프라이머 조합; 서열번호 3 및 4의 프라이머 조합; 서열번호 5 및 6의 프라이머 조합; 또는 서열번호 7 및 8 조합이 될 수 있다.
본 발명의 키트는 PCR에 필요한 시약을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 시약은 예를 들면, 이에 제한되지 않고, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머, 내열성 중합효소 및 반응 완충액 등일 수 있으며, 내열성 중합효소는 Taq 중합효소 등을 이용할 수 있다.
또한, 상기 키트는 안내서를 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 잎응애 프라이머 제작 방법을 제공한다:
a) 잎응애에서 DNA 샘플을 분리하는 단계;
b) 분리한 DNA 염기서열과 NCBI 데이터베이스의 염기서열을 비교ㆍ분석하여 각 종에 특이적인 염기를 발굴하는 단계; 및
c) 상기 b) 단계의 종 특이적인 염기를 포함하는 영역을 선정하여 종-특이적 프라이머를 제작하는 단계.
본 발명의 구체적인 실시 예에서는, 총 5 종의 잎응애로부터 DNA 샘플을 채취하였으며, 그 결과 총 4종 즉, 점박이응애, 차응애, 콩응애 및 작은점박이응애의 Ribosomal DNA 영역에 존재하는 ITS2 염기서열에서 종 특이적으로 나타나는 염기를 특정하여 각각의 종-특이적 프라이머를 제작하였으며, 제작된 프라이머는 서열번호 1 내지 8로 나타내었다. 그리고 제작된 프라이머를 이용하여 DNA 추출시 사용된 5 종의 잎응애를 대상으로 PCR을 수행해본 결과, 차응애, 콩응애 및 작은점박이응애 종-특이적 프라이머는 각각의 종만 표식하고 다른 4종은 표식하지 않았으나, 점박이응애 프라이머의 경우에는 점박이응애를 특이적으로 표식하지만, 근연종인 점박이응애붙이도 표식하였다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 잎응애 종-특이적 진단 방법을 제공한다:
a) 식물 시료에서 전체 RNA를 분리하는 단계;
b) 상기 분리된 전체 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 잎응애 진단용 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계.
식물 시료에서 전체 RNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, 페놀 추출방법을 이용할 수 있다. 상기 분리된 전체 RNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 하나 이상의 프라이머 조합을 프라이머로 이용하여 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 잎응애 종-특이적 진단 방법에 있어서, 상기 식물은 과수, 채소 및 화훼류로 구성된 식물군에서 선택된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동 또는 형광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하나, 이에 한정되지 않는다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 잎응애로부터 종 특이적으로 나타나는 염기를 추출하여 종-특이적 프라이머를 제작할 수 있으며, 상기 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 경우 그 종에 대해 특이적으로 표식함을 확인하였다.
따라서 본 발명의 잎응애 종-특이적 프라이머와 잎응애 진단 방법을 검역 현장에 적용시킬 경우, 검역 현장에서 검출되는 잎응애류 응애의 신속하고 정확한 동정이 가능할 것이며, 검역 현장의 효율적인 해충진단뿐만 아니라 수출입 농산물의 안정성 또한 향상시킬 수 있을 것으로 사료된다.
도 1은 본 발명에 사용한 잎응애의 사진들을 나타낸다: T. urticae (1-6), T. kanzawai (7-9), T. cinnabarinus (10), T. phaselus (11), 및 T. truncatus (12).
도 2는 본 발명에 사용한 5종 잎응애의 슬라이드 표본 사진과 세부구조를 나타낸 것으로 주요 동정 형질인 기문륜(peritreme)의 형태와 수컷 생식기의 형태를 비교한 것이다.
도 3은 본 발명의 잎응애 종-특이 프라이머 조합 4개를 이용하여 잎응애 종들을 대상으로 PCR 진단 결과를 나타낸 것이다: DNA marker (M), T. cinnabarinus (1), T. urticae (2), T. kanzawai (3), T. phaselus (4), 및 T. truncatus (5).
이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시 예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시 예 1. 잎응애 5종의 DNA 확보
국내 주요 잎응애 5종을 선발하고, 상기 종들의 DNA 샘플을 확보하였다. 상기 잎응애 5종은 하기 표 1에 나타내었으며, DNA 추출 과정은 하기에 자세히 나타내었다.
식물 잎으로부터 잎응애들을 채집하여 DNA 추출 키트인 Pure link genomic DNA kit(Invitrogen, USA)를 이용하여 각 개체별로 DNA 추출을 수행하였다. 각각의 응애 샘플을 proteinase K(20 μl) 용액이 포함된 Genomic digestion buffer(180 μl)가 담긴 E-tube에 담군 뒤 55 ℃에서 12 시간 동안 반응시켰다. 12 시간 후, 20 μl의 RNase를 상기 반응용액에 넣은 뒤 3 분간 반응시켰다. 반응이 완료된 후, Genomic lysis/binding buffer(200 μl)를 넣고 잘 섞은 뒤, 99% 에탄올 200 μl를 첨가하였다. Genomic spin column에 상기 반응 용액을 넣고 10,000 rpm으로 1 분간 원심분리시켰다. 상기 컬럼에 Wash 1 buffer(500 μl)를 넣고 1 분간 10,000 rpm으로 원심분리한 후, 다시 컬럼에 Wash 2 buffer(500 μl)를 넣고 3 분간 12,000 rpm으로 원심분리하였다. 새로운 1.5 ml E-tube에 컬럼을 설치한 후 Elution buffer(20 μl)를 넣고 1 분간 방치하였다. 그러고 나서, 상기 튜브를 12,000 rpm에서 1 분간 원심분리하여 DNA 용액을 추출하였다.
[표 1. 잎응애 5종]
Figure 112010073236837-pat00001

실시 예 2. 종-특이적 프라이머 제작
상기 총 5종의 잎응애 DNA 샘플 중, 4종의 Ribosomal DNA 영역에 존재하는 ITS2(Internal transcribed space 2) 염기서열에서 종 특이적으로 나타나는 염기만을 발굴하여 종-특이적 프라이머를 제작하였다. ITS2 염기서열은 NCBI(National Center for Biological Information) database에서 발굴한 것과 채집한 응애로 부터 분리한 염기서열을 분석한 것을 이용하였으며, 활용한 염기서열은 점박이응애(T. urticae) 33개, 점박이응애붙이(T. cinnabarinus) 30개, 차응애(T. kanzawai) 6개, 콩응애(T. phaselus) 5개, 작은점박이응애(T. truncatus) 7개를 이용하였다. 총 81개의 염기서열을 비교하여 각 종에 특이적인 염기를 발굴하였으며 (표 2), 이 염기를 포함하는 영역을 선정하여 종-특이적 프라이머를 아래 표 3과 같이 제작하였다.
[표 2. 잎응애 4종의 프라이머 영역을 표시하는 염기서열(빨간색 염기는 각종의 종-특이적 염기임)]
Figure 112010073236837-pat00002

[표 3. 잎응애 종-특이적 프라이머 및 PCR 조건]
Figure 112010073236837-pat00003

실시 예 3. PCR 진단
상기 실시 예 2에서 제작된 4종의 종-특이적 프라이머를 이용하여, DNA 샘플 채취에 사용된 총 5종의 잎응애를 대상으로 PCR을 수행하였다.
먼저, PCR buffer(10 mM Tris-HCL, 40 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, pH 9.0), 0.2 mM dNTPs, 0.4 μM의 각각의 프라이머, Taq2000 2units(Takara Bio Inc., Shiga, Japan) 및 0.1 g의 DNA를 혼합하여 50 μl의 PCR 용액을 제조하였다. 이후 PCR 반응은 PTC-200 thermal cycler(MJ Research, Watertown, MA, USA)를 이용하여 수행하였으며, 각 종(species) 당 annealing temperature 및 PCR cycle은 상기 표 3에 표시된 조건으로 수행하였다. 이후 PCR 반응의 증폭산물은 1 % 아가로즈젤 전기영동으로 분석하였다. 분석 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 차응애(T. kanzawai), 콩응애(T. phaselus)와 작은점박이응애(T. truncatus)의 종-특이적 프라이머를 이용하여 PCR 진단 결과, 각각의 종(species)만을 표식하고 다른 4종은 표식하지 않음을 볼 수 있으나, 점박이응애(T. urticae) 종-특이적 프라이머를 이용하는 경우 점박이응애를 특이적으로 표식하지만 근연종인 점박이응애붙이(T. cinnabarinus)도 표식함을 알 수 있다. 따라서 차응애, 콩응애 및 작은점박이응애의 특이적 프라이머는 그 종만 표식하므로 종-특이적 진단이 가능하나, 점박이응애 특이적 프라이머는 그 종을 표식하는 것 이외에도 근연종 1종을 표식하므로 2차 진단이 요구된다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (8)

  1. 서열번호 1 및 2의 프라이머 조합; 서열번호 3 및 4의 프라이머 조합; 서열번호 5 및 6의 프라이머 조합; 및 서열번호 7 및 8의 프라이머 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 프라이머 조합을 포함하고, 상기 서열번호 1 및 2의 프라이머 조합은 점박이응애(T. urticae) 또는 점박이응애붙이(T. cinnabarinus)를, 서열번호 3 및 4의 프라이머 조합은 차응애(T. kanzawai)를, 서열번호 5 및 6의 프라이머 조합은 콩응애(T. phaselus)를, 서열번호 7 및 8의 프라이머 조합은 작은점박이응애(T. truncatus)를 종 특이적으로 진단하는 것을 특징으로 하는 잎응애 진단용 프라이머.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1항에 따른 프라이머를 포함하는 잎응애 진단용 키트.
  5. 삭제
  6. 하기 단계를 포함하고, 서열번호 1 및 2의 프라이머 조합은 점박이응애(T. urticae) 또는 점박이응애붙이(T. cinnabarinus)를, 서열번호 3 및 4의 프라이머 조합은 차응애(T. kanzawai)를, 서열번호 5 및 6의 프라이머 조합은 콩응애(T. phaselus)를, 서열번호 7 및 8의 프라이머 조합은 작은점박이응애(T. truncatus)를 종 특이적으로 진단하는 것을 특징으로 하는 잎응애 종-특이적 진단 방법:
    a) 식물 시료에서 전체 RNA를 분리하는 단계;
    b) 상기 분리된 전체 RNA를 주형으로 하고, 제 1항의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 식물은 과수, 채소 및 화훼류로 구성된 식물군에서 선택된 것을 특징으로 하는 잎응애 종-특이적 진단 방법.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동 또는 형광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 잎응애 종-특이적 진단 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR101420064B1 (ko) * 2013-12-31 2014-07-15 경북대학교 산학협력단 Panonychus 속 진단용 종-특이적 프라이머 및 이의 용도

Non-Patent Citations (2)

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Exp. Appl. Acarol., Vol. 41, pp. 169-181 (공개일: 2007.03.09.)
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