NO317850B1

NO317850B1 - Isolert nukleinsyre som koder for Der p III-proteinallergen,isolert Der p III proteinallergen, farmasoytisk blanding omfattende allergenet, samt anvendelse derav for fremstilling av farmasoytisk blanding og fremgangsmater for fremstilling av slike.

Info

Publication number: NO317850B1
Application number: NO19962407A
Authority: NO
Inventors: Bruce L Rogers; Mei-Chang Kuo; Wayne R Thomas; Kaw-Yan Chua
Original assignee: Immulogic Pharma Corp; Inst Child Health Res
Priority date: 1993-12-08
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 2004-12-20
Also published as: AU697491B2; KR20040004481A; EP0733064B1; CA2177612C; JPH09510083A; US8287875B2; DE69434665T2; AU1302795A; US6752991B1; ATE320445T1; US20110059522A1; WO1995015976A1; US7666429B2; ES2260760T3; US20050123569A1; EP0733064A1; NO962407D0; NZ277698A; US6180771B1; CA2177612A1

Description

Nærmere 10% av befolkningen blir hypersensibilisert (allergiske) etter eksponering for antigener fra en rekke kilder i miljøet. Antigener som induserer umiddelbar og/eller forsinket type hypersensitivitet, er kjent som allergener {King, T.P., (1976) Adv. Immunol., 22:77-105). Allergener kan omfatte produkter fra gress, trær, ugress, avfall fra dyr, insekter, næringsmidler, medikamenter og kjemikalier. Genetisk predisponering hos et individ antas å spille en rolle ved utviklingen av allergiske straks-responser (Young, R.P., et al., (1990) Clin. Sei., 79:19) så som atopi og anafylaksi, hvis symptomer innbefatter høyfeber, astma og elveblest.

De antistoffer som er involvert i atopisk allergi til-hører primært IgE-klassen av immunglobuliner. IgE binder seg til basofiler, mastceller og dendritiske celler via en spesifikk høyaffinitets-reseptor FceRI (Kinet, J.P., (1990) Curr. Opin. Immunol., 2:499-505). Etter kombinasjon av et allergen, som virker som en ligand, med dets tilhørende reseptor IgE, kan FceRI bundet til IgE kryssbindes på celle-overflaten, hvilket resulterer i fysiologiske manifestasjoner av IgE-allergen-interaksjonen. Disse fysiologiske virkningene inkluderer frigjøringen av bl.a. histamin, serotonin, heparin, kjemotaktiske faktorer for eosinofile leukocytter og/eller leukotrienene C4, D4 og E4, som forårsaker forlenget konstriksjon av glatte muskelceller i bronkier (Hood, L.E. et al., Immunology (2.utg.) The Benjamin/Cumming Publishing Co., Inc. (1984)). Den endelige konsekvens av interaksjonen mellom et allergen og IgE, er allergiske symptomer utløst gjennom frigjøringen av ovennevnte mediatorer. Slike symptomer kan av natur være systemiske eller lokale, avhengig av hvilken vei antigenet kommer inn og av avleiringsmønsteret av IgE på mastceller eller basofiler. Lokale manifestasjoner inntrer i alminnelighet på epiteloverflater på det stedet hvor allergener kommer inn. Systemiske virkninger kan indusere anafylaksi (anafylaktisk sjokk) som er et resultat av IgE-basofil respons på sirkulerende (intravaskulært) antigen.

Studier foretatt med rensede allergener har vist at ca. 80% av pasienter som er allergiske overfor midden

Dermatophagoidea pteronyssinus produserer IgE som er reaktive overfor Der p I og Der p II (Chapman M.D. et al-, J. Immunol.

(1980) 125:587-92; Lind P., J. Allergy Clin. Immunol. (1985) 76:753-61; Van der Zee J.S. et al., J. Allergy Clin. Immunol.

(1988) 81.:884-95) . For omtrent halvparten av pasientene utgjør disse spesifisiteter 50% av IgE-anti-midd-antistoffet. Allergenet Der p III, nylig identifisert som trypsin (Stewart, G.A. et al., Immunology (1992) 75_:29-35) reagerer med en lignende eller høyere hyppighet (Stewart G.A. et al., supra; Ford S.A. et al., Clin. Exp. Allergy (1989) 20:27-31). I den eneste kvantitative undersøkelse som hittil er rapportert, har imidlertid forskerne fastslått at nivået av IgE-binding til Der p III var betydelig lavere enn for Der p I. Elektroforese-teknikker (Ford S.A. et al., supra; Bengtsson A. et al., Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. (1986) 80=383-90); Lind P. et al., Scand. J. Immunol. (1983) 17:263-73; Tovey E.R. et al., J. Allergy Clin. Immunol. (1987) 79:93-102) har vist at de fleste sera inneholder IgE som gjenkjenner andre allergener.

Betydningen av IgE-reaktiviteten overfor Der p III er fortsatt usikker. Reaktiviteten av denne gruppe allergener har vært angitt å være så lav som 16% ved å benytte en bestemmelse i væskefase (Heymann et al., J. Allergy Clin. Immunol. (1989) 83.= 1055-1067) og så høy som 100% ved å benytte RAST-assay (Stewart et al., Immunology (1992) 75:29-35). Flere andre har rapportert IgE-reaktivitet på mellom 60-83% (Tovey et al., J. Allergy Clin. Immunol. (1987) 7£:93-102; Thomas et al., Exp. Appl. Acarol. (1992) 16:153-164; Yasueda et al., Clin. Exp. Allergy (1993) 21:384-390). Mangelen på overensstemmelse med hensyn til hyppigheten av IgE-reaktivitet overfor gruppe III allergener kan skyldes enten forskjeller i renheten av det undersøkte allergenpreparat eller forskjeller i følsomhet for den anvendte analyseteknikk. For å bestemme betydningen av bestemte spesifisiteter for de allergiske reaksjoner, er det behov for større mengder rent allergen som ville muliggjøre kvantitative undersøkelser av IgE-binding og undersøkelser av hyppigheten og den lymfokine profil av T-celleresponser på allergenet.

Mange pasienter med følsomhet for husstøvmidd-allergener behandles idag ved administrering av små, gradvis tiltagende doser av ekstrakter av husstøvmidd. Anvendelsen av disse ekstraktene har mange ulemper, inklusivt potensiell anafylaksi under behandling og behovet for kontinuerlig terapi, ofte i tidsrom på flere år, for å bygge opp tilstrekkelig toleranse og vesentlig svekke kliniske symptomer. Muligheten for å erstatte blandinger av husstøvmidd-allergen Der p III, ville kunne fjerne flere av disse ulempene. En ren allergenkilde som kunne frembringes i en viss mengde for anvendelse som et diagnostisk eller terapeutisk reagens, og terapeutiske metoder som ville fjerne de ulemper som er assosiert med ekstrakter av husstøvmidd, er i høy grad ønskelig.

Oppfinnelsen tilveiebringer isolert nukleinsyre som koder for et Der p III-proteinallergen,kjennetegnet ved at nukleinsyren omfatter nukleotidsekvensen vist i figur 1 (SEKV. ID. NR:1), den kodende region derav {nukleotider 150-845 av SEKV. ID. NR:1) eller derivater eller varianter derav, som koder for et protein som har den samme biologiske aktivitet som proteinet kodet for av SEKV. ID. NR:1. Der p III er et allergen av arten Dermatophagoides pteronyssinua (husstøvmidd). Oppfinnelsen vedrører også isolerte peptider som er kodet for av en nukleinsyre ifølge enten krav 1 eller 2. Spesielt foretrukket dekker foreliggende oppfinnelse deler av det krevede proteinallergenet Der p III som er kjennetegnet ved at delen inneholder en T-celleepitop eller en B-celleepitop av allergenet. Den omfatter også isolerte nukleinsyrer som koder for protein som har den samme biologiske aktivitet som proteinet kodet for av SEKV ID. NR:1, eventuelt som er i det minste 90% identisk til nukleotidsekvensen vist i figur 1 (SEKV ID. NR:1). Nukleinsyrer som koder for peptider som har en Der p III-virkning, og som har minst 90% homologi med en sekvens vist i Figur IA og IB (SEKV. ID. NR:l) inngår i oppfinnelsen. Isolert Der p III-proteinallergen kjennetegnes ved at det er produsert i en vertscelle transformert med nukleinsyren ifølge krav 1, omfattende nukleotidsekvensen vist i figur 1 (SEKV. ID. NR:1), eller en kodende region derav. Foretrukne peptider har evnen til å indusere en T-cellerespons som kan inkludere T-cellestimulering (målt for eksempel ved T-celleproliferasjon eller cytokinsekresjon) eller T-celle ikke-responsivitet (dvs. kontakt mellom peptidet eller et kompleks av peptidet og et MHC-molekyl av en antigen-presenterende celle, induserer T-cellen slik at den ikke responderer på stimulerende signaler eller blir ute av stand til å proliferere). Andre foretrukne peptider har utenom eller i tillegg til evnen til å indusere en T-cellerespons, evnen til å binde spesifikt IgE i husstøvmidd-allergiske individer. Slike peptider kan benyttes ved diagnostisering av sensitivitet overfor husstøvmidd. Andre peptider har utenom eller i tillegg til evnen til å indusere en T-cellerespons, en betydelig redusert eller negliserbar evne til å binde husstøvmidd-allergisk IgE. Slike peptider er særlig egnet som terapeutiske midler.

Andre foretrukne peptider omfatter en aminosyresekvens vist i Figur 2 (SEKV. ID. NR:2) eller en moden del derav, som kodes for av nukleotidene 150-845 av SEKV. ID. NR:1, nevnte proteinallergen er fri fra alle andre husstøvmiddproteiner. Ifølge én utførelsesform har peptider som har en Der p III-virkning og omfatter en del av aminosyresekvensen av Figur IA og IB (SEKV. ID. NR:2) en lengde på minst 8-30 aminosyrer, fortrinnsvis ca. 10-20 aminosyrer og helst 10-16 aminosyrer.

Peptider som har en Der p III-virkning kan benyttes i farmasøytiske blandinger. Foreliggende oppfinnelse omfatter en farmasøytisk blanding kjennetegnet ved at den omfatter proteinallergenet ifølge enten krav 7 eller krav 8 som eventuelt ytterligere omfatter en farmasøytisk akseptabel bærer. For eksempel kan slike blandinger benyttes på tilsvarende måte som husstøvmidd-ekstrakter for å behandle eller forebygge allergiske reaksjoner mot husstøvmidd. Ett aspekt ved foreliggende oppfinnelse er derfor anvendelse av et proteinallergen for fremstilling av et medikament for anvendelse i behandling av sensitivitet for

husstøvmiddallergen, hvor proteinallergenet i det minste er et proteinallergen ifølge enten krav 7 eller krav 8. Nukleinsyrer

ifølge oppfinnelsen og peptider som har en Der p III-virkning, kan også benyttes for diagnostisering av sensitivitet mot husstøvmidd hos et individ. Fremgangsmåten for å påvirke sensitivitet i et individ for husstøvmidd-allergen ifølge oppfinnelsen er kjennetegnet av at den omfatter å kombinere en blodprøve oppnådd fra individet med et proteinallergen ifølge enten krav 7 eller krav 8, under betingelser egnet for binding av blodkomponenter med peptidet og bestemmelse av graden av binding som forekommer. Foreliggende oppfinnelse omfatter også fremgangsmåte for fremstilling av en farmasøytisk blanding eller diagnostisk reagens som omfatter et rekombinant støvmiddallergen, kjennetegnet ved at fremgangsmåten omfatter trinnene: (a) dyrking av bakterievertsceller inneholdende en ekspresjonsvektor omfattende et DNA-molekyl omfattende nukleotidsekvensen som vist i figur 1 {SEKV. ID. NR:1) og som koder for et Der p III-proteinallergen eller en nukleotidsekvens som er minst 90% identisk med sekvensen i figur 1 (SEKV. ID. NR:1); og (b) gjenvinning av det rekombinante proteinallergenet fra kulturen. Foretrukket kjennetegnes fremgangsmåten av at ekspresjonsvektoren omfatter en ekspresjonskontrollsekvens operativt bundet til nukleotidsekvensen, og eventuelt ved at proteinallergenet er fusjonert eller ko-uttrykt med et tilleggspolypeptid.

Fremgangsmåten for fremstilling av en farmasøytisk blanding ifølge foreliggende oppfinnelse er foretrukket kjennetegnet ved at allergenet omfatter (a) en aminosyresekvens som vist i figur 1 (SEKV. ID. NR:2); eller (b) aminosyrerestene 1-232 av sekvensen vist i figur 1 (SEKV. ID. NR:2); eller (c) en aminosyresekvens som i det minste er 90% identisk med aminosyresekvensen vist i figur 1 (SEKV. ID. NR:2).

Foreliggende oppfinnelse omfatter også en kjemisk syntesefremgangsmåte for fremstilling av en farmasøytisk blanding eller et diagnostisk reagens omfattende et støvmiddproteinallergen, kjennetegnet ved at nevnte allergen omfatter (a) en aminosyresekvens som vist i figur 1 (SEKV. ID. NR:2); eller (b) aminosyrerestene 1-232 av sekvensen vist i figur 1 (SEKV. ID. NR:2); eller (c) en aminosyresekvens som i det minste er 90% identisk med aminosyresekvensen vist i figur 1 (SEKV. ID. NR:2).

Figur IA og IB viser de fullstendige nukleotid- (SEKV. ID. NR:l) og deduserte aminosyre- (SEKV. ID. NR:2) sekvenser av Der p III-klonen. Figur 2A og 2B viser aminosyresekvensen av Der p III (SEKV. ID. NR:2) og et trypsinprotein fra kreps (SEKV. ID. NR:3). Figur 3 viser resultatene av SDS-PAGE i forskjellige konsentrasjoner av rekombinant Der p III (bane 1, 4,3 ug; bane 2, 8,7 ug; bane 3, 13,8 ug; bane 4, 17,4 ug; markører er angitt med M).

Denne oppfinnelse vedrører isolerte nukleinsyrer som koder for peptider som har minst én av de biologiske virkninger av Der p III, en gruppe III-allergener av arten Dermatophagoides pteronyssinus. Fortrinnsvis er nukleinsyren en cDNA som omfatter en nukleotidsekvens vist i Figur IA og IB

(SEKV. ID. NR:1).

Den cDNA som er vist i Figur IA og IB (SEKV. ID. NR:1) koder for et Der p III-peptid som innbefatter en predikert 29 aminosyreresters pre-pro-region som kodes av nukleotidene 63 til 149. Denne ledersekvens forekommer ikke i det modne Der p III, som kodes av nukleotidene 150 til 845. Den deduserte aminosyresekvens basert på denne cDNA er også vist i Figur IA og IB (SEKV. ID. NR:2). Denne cDNA koder for et 232 resters modent peptid som har en predikert molekylvekt på 24.985 dalton og som innbefatter syv cysteinrester. En polyadenylerings-signalsekvens 179 nukleotider etter den siste base, forekommer i denne cDNA (se Figur IA og IB). En kultur av E. coli transfektert med en ekspresjonsvektor inneholdende den cDNA som koder for Der p III, ble deponert i henhold til Budapestavtalen i the American Type Culture Collection den 15. oktober, 1993 og gitt tilgangsnummer 69472.

Ett aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører således isolerte nukleinsyrer som koder for et Der p III-proteinallergen, hvor nukleinsyren omfatter nukleotidsekvensen vist i figur 1 (SEKV. ID. NR:1), den kodende region derav (nukleotider 150-845 av SEKV. ID. NR:1) eller derivater eller varianter derav, som koder for et protein som har den samme biologiske aktivitet som proteinet kodet for av SEKV. ID. NR:1. Betegnelsen nukleinsyre er her ment å inkludere fragmenter og ekvivalenter. Betegnelsen ekvivalent er ment å inkludere nukleotidsekvenser som koder for funksjonelt ekvivalente Der p III-peptider som har en Der p III-virkning. Som her definert har et peptid som har en Der p III-virkning minst én av de biologiske virkningene til Der p III-allergenet. Ekvivalente nukleotidsekvenser inkluderer sekvenser som adskiller seg gjennom én eller flere nukleotid-substitusjoner, addisjoner eller delesjoner, så som alleliske varianter, og innbefatter sekvenser som adskiller seg fra den nukleotidsekvens som koder for Der p III vist i Figur IA og IB (SEKV. ID. NR:l) som følge av den genetiske kodes degenerasjon. Ekvivalenter kan inkludere nukleotidsekvenser som under stringente betingelser (dvs. tilsvarende ca. 20-27°C under smeltepunktet (TJ og ca. IM NaCl) hybridiserer til nukleotidsekvensen av Der p III, vist i Figur IA og IB (SEKV.

ID. NR:1).

Peptider som her er angitt å ha en Der p III-virkning er her definert som peptider som har en aminosyresekvens tilsvarende hele eller en del av den aminosyresekvens av Der p III som er vist i Figur IA og IB (SEKV. ID. NR:2). For eksempel kan et peptid som har en Der p III-virkning, ha evnen til å indusere en respons i Der p III-begrensede T-celler, så som stimulering (f.eks. T-celleproliferasjon eller cytokinsekresjon) eller indusere ikke-responsivitet i T-celler. Som et alternativ eller i tillegg, kan et peptid som har en Der p III-virkning, ha evnen til å binde (til å gjen-kjennes av) immunglobulin E-antistoffer hos husstøvmidd-allergiske individer. Peptider som binder IgE kan benyttes i fremgangsmåter for å påvise allergisk følsomhet for Der p III i et individ. Peptider som ikke binder IgE, eller binder IgE i mindre grad enn et renset, nativt Der p III-protein binder IgE, er særlig anvendelige som terapeutiske midler.

I henhold til en utførelsesform er nukleinsyren en cDNA som koder for et peptid som har en Der p III-virkning. Fortrinnsvis er nukleinsyren et cDNA-molekyl som omfatter minst en del av den nukleotidsekvens som koder for Der p III, vist i Figur IA og IB (SEKV. ID. NR:l). En foretrukket del av cDNA-molekylet i Figur IA og IB (SEKV. ID. NR:1) inkluderer molekylets kodende område.

I henhold til en annen utførelsesform koder nukleinsyren ifølge oppfinnelsen for et peptid som har en Der p III-virkning og omfatter en aminosyresekvens vist i Figur IA og IB (SEKV. ID. NR:2). Foretrukne nukleinsyrer koder for et peptid som har en Der p III-virkning og som har minst 90% homologi med sekvensen vist i Figur IA og IB (SEKV. ID. NR:1). Nukleinsyrer som koder for peptider som har en Der p III-virkning og som har minst ca. 90%, fortrinnsvis minst ca. 95% og helst minst ca. 98-99% homologi med en sekvens angitt i Figur IA og IB (SEKV. ID. NR:2) ligger også innenfor rammen av oppfinnelsen. Homologi refererer seg til sekvenslikhet mellom to peptider som har en Der p III-virkning eller mellom to nukleinsyremolekyler. Homologi kan bestemmes ved å sammenligne en posisjon i hver sekvens som for sammenligningsformål kan være stillet på linje ovenfor hverandre. Når en posisjon i den sammenlignede sekvens okkuperes av den samme base eller aminosyre, er molekylene homologe i denne posisjonen. Graden av homologi mellom sekvenser er en funksjon av det antall av overensstemmende eller homologe posisjoner som sekvensene deler.

Det tilveiebringes en nukleinsyre som under høye eller lave stringensbetingelser hybridiserer til en nukleinsyre som koder for et peptid som har hele eller en del av aminosyresekvensen vist i Figur IA og IB (SEKV. ID. NR:2). Passende stringensbetingelser som fremmer DNA-hybridisering, for eksempel 6,0 x natriumklorid/natriumcitrat (SSC) ved ca. 45°C, etterfulgt av vask med 2,0 x SSC ved 50°C vil være kjent for fagmannen eller tilgjengelig gjennom Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. For eksempel kan saltkonsentrasjonen i vasketrinnet velges fra en lav stringens på ca. 2,0 x SSC ved 50°C til en høy stringens på ca. 0,2 x SSC ved 50°C. Dessuten kan temperaturen under vasketrinnet økes fra lavstringente betingelser ved romtemperatur, ca. 22°C, til høystringente betingelser ved ca. 65°C.

Isolerte nukleinsyrer som koder for et peptid som har den her beskrevne Der p III-virkning og som har en sekvens som adskiller seg fra den nukleotidsekvens som er vist i Figur IA og IB (SEKV. ID. NR:1) som følge av den genetiske kodes degenerasjon, faller også inn under rammen for oppfinnelsen. Slike nukleinsyrer som adskiller seg i sekvens fra sekvensen i Figur IA og IB (SEKV. ID. NR:1) koder for funksjonelt ekvivalente peptider (dvs. peptider som har en Der p III-virkning) forårsaket av degenerasjonen i den genetiske kode. For eksempel angis en rekke aminosyrer med mer enn én triplett. Kodoner som angir samme aminosyre, eller synonymer (for eksempel CAU og CAC er synonymer for histidin) kan resultere i "tause" mutasjoner som ikke påvirker aminosyresekvensen av Der p III-proteinet. Det er imidlertid å forvente at DNA-sekvens-polymorfisme som ikke fører til endringer i aminosyresekvensen til Der p III, vil eksistere innen husstøvmidd-populasjonen. Fagmannen vil innse at disse variasjoner i én eller flere nukleotider (opptil ca. 3-4% av nukleotidene) av de nukleinsyrer som koder for peptider som har en Der p III-virkning, kan foreligge blant enkelte husstøvmidd som følge av naturlig allelisk variasjon. Samtlige slike nukleotidvariasjoner og resulterende aminosyre-polymorfismer ligger innenfor rammen av oppfinnelsen. Det kan dessuten finnes én eller flere isoformer eller beslektede kryssreagerende medlemmer av Der p III-familien. Slike isoformer eller familiemedlemmer er definert som proteiner som i funksjon og aminosyresekvens, er beslektet med Der p III, men kodes av gener i andre loci.

Fragmenter av en nukleinsyre som koder for Der p III ligger også innenfor rammen av oppfinnelsen. I denne sammenheng refererer et fragment av en nukleinsyre som koder for Der p III seg til en nukleotidsekvens som har færre nukleotider enn den nukleotidsekvens som koder for hele aminosyresekvensen til Der p III-proteinet og som koder for et peptid som har en Der p III-virkning (dvs. et peptid som har minst én av de biologiske virkninger av Der p III-allergenet) som her definert.

Foretrukne nukleinsyrefragmenter koder for peptider på minst 10 aminosyreresters lengde, fortrinnsvis ca. 10-20 aminosyreresters lengde og helst ca. 10-16 aminosyreresters lengde. Nukleinsyrefragmenter som koder for peptider som har en Der p III-virkning på minst 30 aminosyreresters lengde, minst ca. 40 aminosyreresters lengde, minst ca. 60 aminosyreresters lengde, minst ca. 80 aminosyreresters lengde, minst ca. 100 aminosyreresters lengde og minst ca. 200 aminosyreresters lengde eller mer, ligger også innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse.

Nukleinsyrefragmenter innenfor rammen av oppfinnelsen, innbefatter fragmenter som under høy eller lav stringens, er i stand til å hybridisere med nukleinsyrer fra andre dyrearter, for anvendelse i screeningmetoder for å påvise Der p III eller allergener som er kryssreaktive med Der p III. Nukleinsyren som koder for et peptid som har en Der p III-virkning vil i alminnelighet bli valgt fra de baser som koder for det modne protein, men det kan i enkelte tilfeller være ønskelig å velge hele eller en del av peptidet fra ledersekvens-delen av nukleinsyren ifølge oppfinnelsen. Nukleinsyre innenfor rammen av oppfinnelsen kan også inneholde 1inkersekvenser, modifiserte restriksjonsendonukleaseseter og andre sekvenser anvendelige ved molekylær kloning, ekspresjon eller rensing av rekombinante peptider som har en Der p III-virkning.

En nukleinsyre som koder for et peptid som har en

Der p III-virkning kan oppnås fra mRNA forekommende i husstøvmidd av arten Dermatophagoides pteronyssinus. Det burde også være mulig å oppnå nukleinsyrer som koder for Der p III fra genomisk DNA i Dermatophagoides pteronys sinus. For eksempel kan det gen som koder for Der p III klones fra et cDNA- eller et genomisk bibliotek i henhold til her beskrevne fremgangsmåter. Et cDNA som koder for Der p III kan oppnås ved å isolere totalt mRNA fra Dermatophagoides pteronyssinus. Dobbeltkjedede cDNA kan deretter fremstilles fra det totale mRNA. De oppnådde cDNA kan deretter settes inn i en egnet plasmid- eller bakteriofagvektor ved å benytte én av en rekke kjente teknikker. Gener som koder for Der p III kan også klones ved å benytte etablert PCR (polymerase chain reaction) i henhold til den nukleotidsekvensinformasjon som fremgår av oppfinnelsen. Nukleinsyrene ifølge oppfinnelsen kan være DNA eller RNA. En foretrukket nukleinsyre er et cDNA som koder for Der p III som har den sekvens som er vist i Figur IA og IB

(SEKV. ID. NR:1).

Denne oppfinnelse tilveiebringer også rekombinant ekspresjonsvektor kjennetegnet ved at den omfatter nukleinsyren ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3. Nukleinsyren er operativt koblet til en regulatorsekvens på en måte som muliggjør ekspresjon av nukleotidsekvensen. Regulatorsekvenser er kjent på området og velges for å styre en transfektert vertscelles ekspresjon av det peptid som har en Der p III-virkning. Betegnelsene regulatorsekvens inkluderer følgelig promotere, enhancere og andre ekspresjons-kontrollelementer. Slike regulatorsekvenser er beskrevet i Goeddel Gene Exspression Technology: Methods in Enzymology, 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Det vil være klart at konstruksjonen av ekspresjonsvektoren kan avhenge av slike faktorer som valg av den vertscelle som skal transformeres og/eller typen av protein som ønskes uttrykt. Ifølge oppfinnelsen inkluderer ekspresjonsvektoren en DNA som koder for et peptid som har en Der p III-virkning. Slike ekspresjonsvektorer kan benyttes for å transfektere celler til å produsere proteiner eller peptider, inklusivt fusjons-proteiner eller peptider som kodes av nukleinsyrer som her beskrevet.

Oppfinnelsen vedrører videre en vertscelle transfektert med den rekombinante ekspresjonsvektoren ifølge krav 5, som er i stand til å styre ekspresjonen av et peptid som har en aktivitet av Der p III. Vertscellen kan være en hvilken som helst prokaryot eller eukaryot celle. For eksempel kan et peptid som har en Der p III-virkning, uttrykkes i bakterieceller som f.eks. E. coli, insektceller (baculovirus), gjær, eller pattedyrceller som CHO (chinese hamster ovary cells). Andre egnede vertsceller er omtalt i Goeddel (1990) supra, eller kjent for fagmannen.

Ekspresjon i eukaryote celler som f.eks. pattedyr-, gjær-eller insektceller, kan føre til partiell eller fullstendig glykosylering og/eller dannelse av relevante inter- eller intra-kjede disulfidbindinger i et rekombinant peptidprodukt. Eksempler på vektorer for ekspresjon i gjæren S. cerevisiae inkluderer pYepSecl (Baldari, et al., (1987) Embo J. 6,:229-234), pMFa (Kurjan & Herskowitz (1982) Cell, 30:933-943, pJRY88 (Schultz et al. (1987), Gene, 54:113-123) og pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Tilgjengelige baculovirus-vektorer for ekspresjon av proteiner i dyrkede insektceller (SF 9 celler) innbefatter pAc-rekkene (Smith et al., (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) og pVL-rekkene (Lucklow, V.A. & Summers, M.D., (1989) Virology, 170:31-39). Generelt benyttes COS-celler (Gluzman, Y., (1981) Cell, 23/: 175-182) sammen med slike vektorer som pCDM 8 (Aruffo, A. & Seed, B. (1987) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 84=8573-8577) for forbigående amplifisering/ekspresjon i pattedyrceller, mens CHO (dhfr" Chinese Hamster Ovary) celler benyttes med vektorer som pMT2PC (Kaufman et al., (1987), EMBO J. 6:187-195) for stabil amplifisering/ekspresjon i pattedyrceller. Vektor-DNA kan innføres i pattedyrceller gjennom konvensjonell teknikk som f.eks. kalsiumfosfat- eller kalsiumklorid-kopresipitasjon, DEAE-dekstran-mediert transfeksjon eller elektroporering. Egnede metoder for transformering av vertsceller finnes hos Sambrook et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.utg. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) og andre laboratorie-oppslagsverk.

Ekspresjon i prokaryoter foretas oftest i E. coli enten med fusjons- eller ikke-fusjons-induserbare ekspresjonsvektorer. Fusjonsvektorer tilføyer i alminnelighet en rekke NH2-terminale aminosyrer til det uttrykte målgen. Disse NHa-terminale aminosyrene omtales ofte som en rapportørgruppe. Slike rapportørgrupper tjener vanligvis to formål: 1) å øke løseligheten av det rekombinante målprotein og 2) bidra til rensingen av det rekombinante målprotein ved å virke som en ligand ved affinitetsrensing. I fusjonsekspresjonsvektorer innføres ofte et proteolytisk spaltningssete ved overgangen mellom rapportørgruppen og det rekombinante målprotein for å muliggjøre separasjon av det rekombinante målprotein fra rapportørgruppen etter rensing av fusjonsproteinet. Slike enzymer og deres tilhørende gjenkjenningssekvenser, inkluderer faktor Xa, trombin og enterokinase. Typiske fusjonsekspresjonsvektorer innbefatter pGEX (Amrad Corp., Melbourne, Australia), pMAL (New England Biolaba, Beverley, MA) og pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) som fusjonerer henholdsvis glutation-S-transferase, maltose-E-bindende protein eller protein A til det rekombinante målprotein. En foretrukket rapportørgruppe er poly(His), som gjør det lettere å rense det rekombinante fusjonsprotein ved metallchelat-kromatografi.

Induserbare ikke-fusjonsekspresjonsvektorer innbefatter pTrc (Amann et al., (1988) Gene, 69:301-315) og pETlld (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89). Mens målrettet genekspresjon er basert på vertens RNA-polymerasetranskripsjon fra hybrid trp-lac-fusjonspromoteren i pTrc, er ekspresjon av målgener innskutt i pETlld basert på transkripsjon fra T7 gnlO-lac 0 fusjonspromoteren mediert gjennom samtidig uttrykt viral RNA-polymerase (T7 gni). Denne virale polymerase leveres av vertsstammene BL21(DE3) eller HMS174(DE3) fra en resident A profag som inneholder en T7 gni under transkripsjonen kontroll av lacUV 5 promoteren.

En strategi for å maksimere rekombinant Der p III-ekspresjon i E. coli, består i å uttrykke proteinet i en vertsbakterie med en nedsatt evne til proteolytisk å spalte det rekombinante protein (Gottesman, S. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, 185. Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128). En annen strategi kan være å endre den nukleinsyre som koder for Der p III som skytes inn i en ekspresjonsvektor slik at de enkelte kodoner for hver aminosyre vil være de som fortrinnsvis utnyttes i høyt uttrykte E. coli-proteiner (Wada et al., (1992) Nuc. Acids Res., 20.:2111-2118) . En slik endring av nukleinsyrer ifølge oppfinnelsen kan foretas gjennom standard DNA-synteseteknikk.

Nukleinsyrene ifølge oppfinnelsen kan også syntetiseres kjemisk ved å benytte standardteknikk. Det er således kjent forskjellige metoder for kjemisk syntetisering av poly-deoksynukleotider, herunder fastfase-syntese som i likhet med peptidsyntese, er fullstendig automatisert i kommersielt tilgjengelige DNA-syntesmaskiner (se f.eks. Itakura et al., US-patent 4.598.049; Caruthers et al., US-patent 4.458.066; og Itakura US-patent 4.401.796 og 4.373.071, som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse).

Foreliggende oppfinnelse vedrører dessuten fremgangsmåter for fremstilling av peptider som har en Der p III-virkning. Eksempelvis kan en vertscelle transfektert med en nukleinsyre-vektor som styrer ekspresjonen av en nukleotidsekvens som koder for et peptid som har en Der p III-virkning, dyrkes under betingelser som tillater at ekspresjon av peptidet skjer. Peptidet kan utskilles og isoleres fra en blanding av celler og medium som inneholder peptidet. Alternativt kan peptidet holdes tilbake cytoplasmatisk og cellene høstes og lyseres og proteinet isoleres. En cellekultur inkluderer vertsceller, medier og andre biprodukter. Egnede medier for cellekultur er velkjent på området. Peptider ifølge oppfinnelsen kan isoleres fra cellekulturmedium og/eller vertsceller ved å benytte kjente teknikker for rensing av proteiner, som bl.a. ionebytterkromatografi, gelfiltrering, ultrafiltrering, elektroforese og immunaffinitetsrensing med spesifikke antistoffer for slike peptider.

Et annet aspekt ved oppfinnelsen vedrører isolerte peptider som har en Der p III-virkning. Et peptid som har en Der p III-virkning har i det minste én av de biologiske virkningene av Der p III-allergenet. Et peptid som har en Der p III-virkning kan for eksempel ha evnen til å indusere en respons i Der p III-spesifikke T-celler, som f.eks. stimulering (T-celleproliferasjon eller cytokinsekresjon) eller indusere T-celle ikke-responsivitet. Ifølge en utførelsesform stimulerer et peptid som har en Der p III-virkning, T-celler, hvilket for eksempel fremgår av T-celleproliferasjon eller cytokinsekresjon. Ifølge en annen utførelsesform induserer peptider som har en Der p III-virkning, T-celle ikke-responsivitet, hvor T-celler er uten respons på et påfølgende irritament med et Der p III-peptid eller nativt Der p III-protein etter eksponering for peptidet. Ifølge nok en utførelsesform har et peptid som har en

Der p III-virkning, redusert IgE-bindingsaktivitet sammenlignet med renset, nativt Der p III-protein. Et peptid som har en Der p III-virkning kan avvike i aminosyresekvens fra den Der p III-sekvens som er vist i Figur IA og IB {SEKV. ID. NR:2), men slike forskjeller resulterer i et modifisert protein som virker på samme eller lignende måte som et nativt Der p III-protein eller har samme eller lignende karakteristika som Der p III-proteinet. Forskjellige modifikasjoner av Der p III-protein til fremstilling av disse og andre funksjonelt ekvivalente peptider, er her utførlig beskrevet. Betegnelsen peptid refererer seg i denne sammenheng til peptider, proteiner og polypeptider.

Et peptid kan fremstilles ved en modifisering av aminosyresekvensen av det Der p III-protein som er vist i Figur IA og IB (SEKV. ID. NR:2), f.eks. gjennom en substitusjon, addisjon eller delesjon av én eller flere aminosyrerester. Slike modifiseringer kan rettes mot aminosyrerester som ikke er involvert i en av peptidets biologiske virkninger, eller modifiseringene kan være rettet mot slike aminosyrerester med det formål å øke eller fjerne en bestemt biologisk virkning. Peptider ifølge oppfinnelsen har en lengde på minst 8 aminosyrerester, fortrinnsvis 10-20 aminosyrerester og helst ca. 10-16 aminosyrerester. Peptider med Der p III-virkning på minst 30 aminosyreresters lengde, minst ca. 40 aminosyreresters lengde, minst ca. 60 aminosyreresters lengde, minst ca. 80 aminosyreresters lengde, minst ca. 100 aminosyreresters lengde og minst ca. 200 aminosyreresters lengde eller mer, faller også inn under rammen for oppfinnelsen.

Det beskrives peptider fra en beslektet gruppe III-allergener av arten Dermatophagoides farinae, Der fIII. Slike peptider har vært isolert fra et renset, nativt Der flll-protein og omfatter sekvensene: IVGGVKAKAGDSPYQISLQSSSHFXGGSILD (SEKV. ID. NR:15), som er en N-terminal sekvens;

MICGGDVANGGVDSEQGD (SEKV. ID. NR:10), som er et internt peptid; og

MTLDQTNAKPVPLPTS (SEKV. ID. NR:12), et internt peptid.

Det beskrives et tilnærmet rent preparat av et peptid som har en Der p III-virkning. Et slikt preparat er tilnærmet fritt for proteiner og peptider som peptidet ellers opptrer naturlig sammen med (dvs. andre husstøvmidd-peptider) i en celle eller når det utskilles av en celle.

Betegnelsen isolert refererer seg i denne sammenheng til en nukleinsyre eller et peptid som er tilnærmet fritt for cellemateriale eller dyrkningsmedium når disse er fremstillet ved rekombinant DNA-teknikk, eller for kjemiske mellomprodukter eller andre kjemikalier når de er syntetisert kjemisk. Karakteristisk for slike peptider er også at de er frie for alle andre husstøvmidd-proteiner. Det fremstilles følgelig ved rekombinant teknikk eller syntetisk, et isolert peptid som har en Der p III-virkning og som er tilnærmet fritt for cellemateriale og dyrkningsmedium eller tilnærmet fritt for kjemiske mellomprodukter eller andre kjemikalier og fritt for alle andre husstøvmidd-proteiner. En isolert nukleinsyre er også fri for sekvenser som naturlig flankerer nukleinsyren

(dvs. sekvenser lokalisert i 5'- og 3<1->endene av nukleinsyren)

i den organisme som nukleinsyren er avledet fra.

Peptider som har en Der p III-virkning kan eksempelvis oppnås ved screening av peptider som er fremstillet ved rekombinant teknikk fra det tilsvarende fragment av den nukleinsyre av Der p III som koder for slike peptider. I tillegg kan fragmenter syntetiseres kjemisk ved å benytte kjent teknikk, så som konvensjonell Merrifield fastfase f-Moc-eller t-Boc-kjemi. For eksempel kan Der p III-proteinet inn-deles vilkårlig i fragmenter av ønsket lengde uten fragment-overlapping eller fortrinnsvis avdeles i overlappende fragmenter av ønsket lengde. Fragmentene kan fremstilles (ved rekombinant teknikk eller ved kjemisk syntese) og undersøkes for å identifisere de peptidene som har en Der p III-virkning, dvs. evnen til å indusere en T-cellerespons, så som T-cellestimulering (T-celleproliferasjon, cytokinsekresjon) eller bevirke T-celle ikke-responsivitet og/eller har redusert IgE-bindende virkning.

Ifølge en utførelsesform kan peptider som har en

Der p III-virkning identifiseres gjennom peptidets evne til å stimulere T-celler eller indusere T-celle ikke-responsivitet. Peptider som stimulerer T-celler, som for eksempel kan fast-slås gjennom T-celleproliferasjon eller cytokinsekresjon, er her definert som omfattende minst én T-celleepitop. T-celleepitoper antas å være involvert i initieringen og opprettholdelsen av immunresponsen for det proteinallergen som er ansvarlig for de kliniske symptomer ved allergi. Disse T-celleepitopene antas å utløse tidlige begivenheter på T-hjelpercellenivåer ved å binde seg til et passende HLA-molekyl på overflaten av en antigen-presenterende celle, hvorved T-cellesubpopulasjonen stimuleres med den relevante T-cellereseptor for epitopen. Disse begivenhetene fører til T-celleproliferasjon, lymfokinsekresjon, lokale inflammatoriske reaksjoner, rekruttering av ytterligere immunceller til setet for antigen/T-celleinteraksjonen, og aktivering av B-cellekaskaden som da fører til dannelse av antistoffer. En isotype av disse antistoffene, IgE, er av grunnleggende betydning for utviklingen av allergiske symptomer, og dannelsen av denne påvirkes tidlig i kaskaden av begivenheter på T-hjelpercellenivået av de sekreterte lymfokiners natur. En T-celleepitop er det grunnleggende element eller den minste gjenkjenningsenhet for en T-cellereseptor, hvor epitopen omfatter aminosyrer som er essensielle for reseptor-gjenkjenning. Aminosyresekvenser som utgjør en etterligning av T-celleepitopens sekvenser og som modifiserer den allergiske respons på proteinallergener, ligger innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse.

Screening av peptider med henblikk på slike som opprettholder en Der p III-virkning som beskrevet her, kan skje gjennom bruk av én eller flere ulike bestemmelser. For eksempel måles Der p III T-cellestimulerende virkning in vitro ved å bringe et peptid som er kjent eller mistenkt for å ha en Der p III-virkning, i kontakt med en antigenpresenterende celle som presenterer passende MHC-molekyler, i en T-cellekultur. Presentasjonen av et peptid som har en Der p III-virkning i assosiasjon med passende MHC-molekyler for T-celler samtidig med den nødvendige kostimulering, har den effekt at det til T-cellen overføres et signal som induserer produksjon av økede nivåer av cytokiner, særlig av interleukin-2 og " interleukin-4. Kultursupernatanten kan uttas og bestemmes med henblikk på interleukin-2 eller andre kjente cytokiner. For eksempel kan en av flere konvensjonelle metoder for interleukin-2, benyttes, som f.eks. bestemmelsen beskrevet i Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 86.:1333 (1989), hvorav relevante deler inkorporeres i foreliggende beskrivelse. Et analysesett for produksjonen av interferon kan dessuten anskaffes fra Genzyme Corporation (Cambridge, MA).

Som et alternativ innebærer en vanlig bestemmelse av T-celleproliferasjon måling av tritiert tymidin-inkorporering. Proliferasjonen av T-celler kan måles in vitro ved å bestemme den mengde av <3>H-merket tymidin som inkorporeres i det replikerende DNA i dyrkede celler. Hastigheten av DNA-syntese og i neste omgang av celledelingen kan således kvantifiseres.

I henhold til en annen utførelsesform underkastes et peptid som har en Der p III-virkning, screening med henblikk på evnen til å indusere T-celle ikke-responsivitet. Evnen til et peptid som er kjent for å stimulere T-celler (fastslått gjennom én eller flere av de ovenfor beskrevne metoder) til å inhibere eller fullstendig blokkere virkningen av renset nativt Der p III, eller en del av dette, og indusere en tilstand av ikke-responsivitet, kan bestemmes ved å benytte senere forsøk på stimulering av de T-celler med antigen-presenterende celler som presenterer nativt Der p III, eller et peptid som har en Der p III-virkning, etter eksponering for det peptid som har en Der p III-virkning. Dersom T-cellene ikke gir respons på de senere aktiveringsforsøk, bestemt ved interleukin-2-syntese og/eller T-celleproliferasjon, er det indusert en tilstand av ikke-responsivitet. Se f.eks. Gimmi, et al., (1993) Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 90:6586-6590; og Schwartz (1990) Science, 248:1349-1356. angående bestemmelses-systemer som kan benyttes som basis for en bestemmelse i henhold til foreliggende oppfinnelse.

I henhold til en ytterligere utførelsesform påvises peptider som har en Der p III-virkning ved IgE-bindende aktivitet. For terapeutiske formål binder peptider ifølge oppfinnelsen fortrinnsvis ikke IgE som er spesifikt for et husstøvmiddallergen eller binder slikt IgE i betydelig mindre grad enn hva det rensede, native husstøvmiddallergen binder slikt IgE. Redusert IgE-bindende aktivitet refererer seg til IgE-bindende aktivitet som er mindre enn den for et renset, nativt Der p III-protein. Dersom et peptid som har en Der p III-virkning skal benyttes som diagnostisk reagens, er det ikke nødvendig at peptidet har redusert IgE-bindende aktivitet sammenlignet med det native Der p III-allergen. IgE-bindende aktivitet av peptider kan bestemmes for eksempel gjennom ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) ved for eksempel å benytte serum oppnådd fra et individ (f.eks. et allergisk individ) som tidligere har vært eksponert for det native Der p III-allergen. Kort beskrevet belegges det peptid som mistenkes for å ha Der p III-virkning på brønnveggene i en nikrotiterplate. Etter vasking og blokkering av brønnene inkuberes antistoffløsning bestående av plasma fra et allergisk individ som har vært eksponert for et peptid iiistenkt for å ha en Der p III-virkning, i brønnene. Plasmaet gr i alminnelighet før inkubering, befridd for IgG. Et merket, andre, antistoff tilsettes deretter til brønnene og inkuberes. lengden av IgE-binding kvantifiseres og sammenlignes med den nengde IgE som er bundet av et renset, nativt Der p III-protein. Alternativt kan den IgE-bindende aktivitet av et peptid bestemmes ved western blott-analyse. For eksempel undersøkes et peptid som er mistenkt for å ha en Der p III-virkning på en polyakrylamid-gel ved å benytte SDS-PAGE. Peptidet overføres deretter til nitrocellulose og inkuberes med serum fra et allergisk individ. Etter inkubering med et merket, andre, antistoff, bestemmes og kvantifiseres mengden av bundet IgE.

En annen metode som kan benyttes for å bestemme den IgE-bindende aktivitet av et peptid, består i en kompetitiv ELISA-bestemmelse. Herunder frembringes en IgE-antistoffkilde ved å kombinere plasma fra husstøvmiddallergiske individer som ved direkte ELISA har vist seg å ha IgE som er reaktivt med nativt Der p III. Denne kilde benyttes ved kompetitiv ELISA-bestemmeIse for å sammenligne IgE-binding av native Der p III og et peptid som mistenkes for å ha Der p III-virkning. IgE-binding av det native Der p III og et peptid mistenkt for å ha Der p III-virkning bestemmes og kvantifiseres.

Dersom et peptid som har en Der p III-virkning, binder IgE og skal benyttes som et terapeutisk middel, er det å fore-trekke at slik binding ikke resulterer i frigjøring av mediatorer (f.eks. histaminer) fra mastceller eller basofiler. For å bestemme hvorvidt et peptid som binder IgE resulterer i frigjøring av mediatorer, kan en histaminfrigjørings-bestemmelse foretas ved å benytte standardreagenser og prosedyrer fra Amac, Inc. (Westbrook, ME). Kort beskrevet, kombineres en bufferholdig løsning av et peptid som mistenkes for å ha en Der p III-virkning med et tilsvarende volum av heparinisert helblod fra et allergisk individ. Etter blanding og inkubering sentrifugeres cellene, hvoretter supernatanten behandles og analyseres ved hjelp av radioimmunoassay for å bestemme mengden av frigjort histamin.

Peptider som har en Der p III-virkning og som skal benyttes som terapeutiske midler, testes fortrinnsvis i patte-dyrmodeller med henblikk på husstøvmidd-atopi, for eksempel i forsøksmodellen på mus beskrevet av Tamura et al., (1986) Microbiol. Immunol. 30.:883-896, eller i US-patent 4.939.239 eller i en modell på primater beskrevet i Chiba et al., (1990) Int. Arch. Allergy Immunol. 93:83-88. En forutgående screening av IgE-binding til et peptid som har en Der p III-virkning, kan foretas ved hjelp av prikktester eller intradermale hud-tester på laboratoriedyr eller forsøkspersoner eller i in vitro systemer som f.eks. RAST, RAST-inhibering, ELISA, RIA (radioimmunoassay) eller en histaminfrigjøringsbestemmelse som beskrevet ovenfor.

Det er mulig å modifisere strukturen av et peptid som har en Der p III-virkning med det formål å øke løseligheten, forsterke terapeutisk eller profylaktisk effekt eller stabilitet {f.eks. lagringstid ex vivo og motstandsdyktighet mot proteolytisk nedbrytning in vivo). Slike modifiserte peptider er å anse som funksjonelle ekvivalenter av peptider som har en Der p III-virkning som her definert. Det kan fremstilles et modifisert peptid hvor aminosyresekvensen er endret, f.eks. ved aminosyresubstitusjon, delesjon eller addisjon, for å modifisere immunogenitet og/eller redusere allergenitet eller hvor det for samme formål er addert en komponent.

Således kan for eksempel et peptid som har en Der p III-virkning, modifiseres slik at den opprettholder evnen til å indusere T-celle ikke-responsivitet og binde MHC-proteiner uten evnen til å indusere en sterk proliferativ respons eller eventuelt, noen som helst proliferativ respons, når det administreres i immunogen form. I så fall kan rester som er avgjørende for bindingen av T-cellereseptorfunksjonen, bestemmes ved å benytte kjente teknikker (f.eks. substitusjon av hver rest og bestemmelse av hvorvidt T-cellereaktivitet forekommer eller ikke). Rester som har vist seg å være essensielle for interaksjon med T-cellereseptoren, kan modifiseres ved å erstatte den essensielle aminosyre med en annen, fortrinnsvis lignende, aminosyrerest (en konservativ substitusjon) hvis nærvær har vist seg å øke, svekke, men ikke eliminere, eller ikke påvirke T-cellereaktivitet. Dessuten kan de aminosyrerestene som ikke er essensielle for T-cellereseptor-interaksjon, modifiseres ved å erstattes med en annen aminosyre, hvis inkorporering kan øke, svekke, men ikke eliminere, eller ikke påvirke T-cellereaktiviteten, men hvis inkorporering ikke opphever bindingen til relevante MHC.

I tillegg kan et peptid som har en Der p III-virkning modifiseres ved å erstatte en aminosyre som har vist seg å være essensiell for interaksjonen med MHC-proteinkomplekset, med en annen, fortrinnsvis lignende, aminosyrerest (konservativ substitusjon) hvis nærvær viser seg å øke, svekke, med ikke eliminere, eller påvirke T-celleaktiviteten. Dessuten kan aminosyrerester som ikke er essensielle for interaksjonen med MHC-proteinkomplekset, men som fremdeles binder MHC-proteinkomplekset, modifiseres ved å erstattes med en annen aminosyre, hvis inkorporering kan øke, ikke påvirke eller svekke, men ikke eliminere, T-cellereaktivitet. Foretrukne aminosyresubstitusjoner for ikke-essensielle aminosyrer inkluderer, men er ikke begrenset til, substitusjoner med alanin, glutaminsyre eller en metylaminosyre.

Et annet eksempel på modifisering av et peptid som har en Der p III-virkning, er substitusjon av cysteinrester, fortrinnsvis med alanin, serin, treonin, leucin eller glutaminsyrerester for å minimalisere dimerisering via disulfidbindinger. Dessuten kan aminosyresidekjeder av peptider ifølge oppfinnelsen modifiseres kjemisk. En annen modifisering består i syklisering av peptidet.

For å øke stabilitet og/eller reaktivitet, kan et peptid som har en Der p III-virkning, modifiseres slik at det i aminosyresekvensen av proteinallergenet inkorporeres én eller flere polymorfismer som skriver seg fra en hvilken som helst naturlig allelisk variasjon. I tillegg kan D-aminosyrer, ikke-naturlige aminosyrer eller ikke-aminosyreanaloger, substitueres eller tilsettes for å frembringe et modifisert protein innenfor rammen av denne oppfinnelse. Videre kan et peptid som har en Der p III-virkning, modifiseres ved å benytte polyetylenglykol (PEG) i henhold til metoden til A. Sehon og medarbeidere (Wie et al., supra) for å frembringe et protein konjugert med PEG. Dessuten kan PEG tilsettes under kjemisk syntese av proteinet. Andre modifikasjoner av et peptid som har en Der p III-virkning inkluderer reduksjon/alkylering (Tarr, Methods of Protein Micro-characterization, J.E. Silver, red. Humana Press, Clifton NJ 155-194 (1986)); acylering (Tarr, supra), kjemisk kobling til en passende bærer (Mishell & Shiigi, red. Selected Methods in Cellular Immunology, WH Freeman, San Francisco, CA (1980), US-patent 4.939.239; eller forsiktig formalinbehandling (Marsh

(1971), Int. Arch. of Allergy and Appl. Immunol. 41:199-215).

For å forenkle rensing og eventuelt øke løseligheten av et peptid som har en Der p III-virkning, er det mulig å til-føye en aminosyre-fusjonsdel til peptidskjelettet. Eksempelvis kan heksahistidin adderes til proteinet for å muliggjøre rensing ved immobilisert metallion-affinitetskromatografi (Hochuli, E. et al., (1988) Bio/Technology 6:1321-1325). I tillegg til å forenkle isoleringen av peptider frie for irrelevante sekvenser, kan det innføres spesifikke endoprotease-spaltningsseter mellom sekvensene for fusjons-delen og peptidet. For vellykket desensibilisering av et individ mot Der p III-proteinet eller beslektet allergen, kan det være nødvendig å øke løseligheten av proteinet ved å addere funksjonelle grupper til proteinet eller utelate hydrofobe regioner i proteinet.

For eventuelt å bidra til riktig antigenprosessering av T-celleepitoper innen Der p III, kan det ved hjelp av rekombinant teknikk eller ved syntetiske metoder, mellom regioner konstrueres anerkjente kanoniske proteasefølsomme seter som hver omfatter minst én T-celleepitop. For eksempel kan ladede aminosyrepar, så som KK eller RR, innføres mellom regioner innen et protein, eller fragment, under den rekombinante konstruksjon av dette. Det resulterende peptid kan gjøres følsomt for spaltning med katepsin og/eller andre trypsinlignende enzymer som ville føre til deler av det protein som inneholder én eller flere T-celleepitoper. Dessuten kan slike ladede aminosyrerester resultere i en økning av peptidets løselighet.

Kjente metoder for stedsrettet mutagenese av en nukleinsyre som koder for et peptid som har en Der p III-virkning, kan benyttes for å modifisere strukturen av peptidet. Slike metoder kan bl.a. innbefatte PCR (polymerasekjedereaksjon) med oligonukleotid-primere som har én eller flere mutasjoner (Ho et al., (1989) Gene 77:51-59) eller totalsyntese av muterte gener (Hostomsky, Z. et al., (1989) Biochem. Biophys. Res, Comm. 161:1056-1063). For å forbedre den rekombinante protein-ekspresjon, kan ovennevnte metoder benyttes for å endre de kodoner som forekommer i cDNA-sekvensen ifølge oppfinnelsen, til de som fortrinnsvis benyttes av den vertscelle hvori det rekombinante protein uttrykkes (Wada et al., supra).

Det beskrives et antistoff som er spesifikt reaktivt med et peptid som har en Der p III-virkning. Antistoffene ifølge oppfinnelsen kan benyttes til standardisering av allergenekstrakter eller til å isolere den naturlig forekommende eller native form av Der p III. Ved for eksempel å benytte peptider som har en Der p III-virkning basert på cDNA-sekvensen til Der p III, kan det fremstilles anti-protein/anti-peptid-antisera eller monoklonale antistoffer, ved å benytte standardmetoder. Et pattedyr som mus, hamster eller kanin, kan immuniseres med en immunogen form av peptidet (f.eks. Der p III-protein eller et antigent fragment som er i stand til å frembringe en antistoffrespons). Teknikker for å gi et protein eller peptid immunogenitet innbefatter konjugering til bærere eller andre velkjente teknikker. Et peptid som har en Der p III-virkning kan administreres i nærvær av adjuvans. Immuniseringsutviklingen kan følges ved å påvise antistoff-titere i plasma eller serum. Standard-ELISA eller annen immunotestanalyse kan benyttes med immunogenet som antigen for å fastslå nivåene av antistoffer.

Etter immunisering kan det oppnås anti-Der p III-antisera, og polyklonale anti-Der p III-antistoff eventuelt isoleres fra serumet. For å frembringe monoklonale antistoffer kan antistoffproduserende celler (lymfocytter) høstes fra et immunisert dyr og fusjoneres gjennom standardprosedyrer for somatisk cellefusjon med immortaliserte celler, som f.eks. myelomceller, for å oppnå hybridomceller. Slike teknikker er velkjent på området, som for eksempel hybridomteknikken som opprinnelig ble utviklet av Kohler & Milstein (Nature (1975) 256:4 95-497) så vel som andre teknikker som f.eks. human B-cellehybridomteknikken (Kozbar et al., Immunology Today (1983) 4:72) og EBV-hybridomteknikken for fremstilling av humane monoklonale antistoffer (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (1985) Alan R. Liss, Inc. s. 77-96). Hybridomceller kan underkastes immunkjemisk screening med henblikk på produksjon av antistoffer som er spesifikt reaktive med et peptid som har en Der p III-virkning, hvorpå de monoklonale antistoffene kan isoleres.

Betegnelsen antistoff er her ment å inkludere fragmenter av disse som også er spesifikt reaktive med et peptid som har har en Der p III-virkning. Antistoffer kan fragmenteres ved å benytte konvensjonell teknikk og fragmentene underkastes screening med henblikk på anvendelighet på samme måte som beskrevet ovenfor for hele antistoffer. For eksempel kan F (ab') j-fragmenter frembringes ved å behandle antistoff med pepsin. Det resulterende F (ab') a-f ragment kan behandles for å redusere disulfidbroer slik at det dannes Fab'-fragmenter. Antistoffer er videre ment å inkludere bispesifikke og kimære molekyler som har en anti-Der p III-del.

Det beskrives videre T-cellekloner og løselige T-cellereseptorer som er spesifikt reaktive med et peptid som har en Der p III-virkning. Monoklonale T-cellepopulasjoner (dvs. T-celler som genetisk er identiske med hverandre og uttrykker identiske T-cellereseptorer) kan avledes fra et individ som er følsomt for Der p III, med påfølgende gjentatt in vitro stimulering med et Der p III-protein eller peptid som har en Der p III-virkning, i nærvær av MHC-forlikelige antigenpresenterende celler. Der p III MHC-responderende enkeltceller kan deretter klones ved begrensende fortynning og permanente linjer formeres og opprettholdes ved periodisk in vitro restimulering. Der p III-spesifikke T-T-hybridomer kan alternativt fremstilles ved en teknikk som ligner B-cellehybridomfremstilling. For eksempel kan et pattedyr som mus, immuniseres med et peptid som har en Der p III-virkning, hvoretter T-celler fra pattedyret kan renses og fusjoneres med en autonomt voksende T-celletumorlinje. Fra de resulterende hybridomer selekteres og klones celler som responderer på et peptid som har en Der p III-virkning. Fremgangsmåter for formering av monoklonale T-cellepopulasjoner er beskrevet i Cellular and Molecular Immunology (Abul K. Abbas et al. red.), W.B. Saunders Company, Philadelphia, PA (1991) side 139. Løselige T-cellereseptorer som er spesifikt reaktive med et peptid som har en Der p III-virkning, kan oppnås gjennom immunpresipitasjon ved å benytte et antistoff mot T-cellereseptoren, slik som beskrevet i Immunology: A Synthesis (Second Edition), Edward S. Golub et al., red. Sinauer Associates, Inc. Sunderland, MA (1991) side 366-369.

T-cellekloner som er spesifikt reaktive med et peptid som har en Der p III-virkning, kan benyttes for å isolere og molekylært klone, det gen som koder for den relevante T-cellereseptor. I tillegg kan en løselig T-cellereseptor som er spesifikt reaktiv med et peptid som har en Der p III-virkning, benyttes til å interferere med eller inhibere antigen-avhengig aktivering av den relevante T-cellesubpopulasjon, for eksempel ved administrasjon til et individ som er følsomt for Der p III. Antistoffer som er spesifikt reaktive med en slik T-cellereseptor kan fremstilles i henhold til de her beskrevne teknikker. Slike antistoffer kan benyttes til å blokkere eller interferere med T-cellers interaksjon med peptider som presenteres av MHC.

Eksponering av allergiske individer for peptider som har en Der p III-virkning og som har T-cellestimulerende aktivitet, kan bevirke at de aktuelle T-cellesubpopulasjoner blir ikke-responderende for det respektive proteinallergen (f.eks. ikke stimulerer en immunrespons etter slik eksponering). Dessuten kan slik administrering endre lymfokin-sekresjonsprofilen i forhold til eksponering for det naturlig forekommende proteinallergen eller del av dette (f.eks. resultere i en senkning av IL-4 og/eller en økning av IL-2). Eksponering for peptider som har en Der p III-virkning og som har T-cellestimulerende aktivitet, kan videre påvirke.T-cellesubpopulasjoner som normalt deltar i responsen på allergenet, slik at disse T-cellene trekkes bort fra stedene for normal allergen eksponering (f.eks. neseslimhinne, hud og lunger) og mot stedene for terapeutisk administrering av proteinet eller fragmentene av dette. Denne omfordeling av T-cellesubpopulasjoner kan lindre eller redusere immunsystemets evne hos vedkommende til å stimulere den vanlige immunrespons på det normale eksponeringssted for allergenet og resultere i en svekkelse av allergiske symptomer.

Et peptid som har en Der p III-virkning er når det administreres til et individ som er følsomt for husstøvmidd, i stand til å modifisere vedkommendes B-cellerespons, T-cellerespons eller både B-celle- og T-cellerespons på allergenet. Modifikasjon av et individs allergiske respons på et husstøvmiddallergen kan i denne sammenheng defineres som ikke-responsivitet eller symptomsvekkelse overfor allergenet, fastslått gjennom standardiserte kliniske prosedyrer (se f.eks. Varney et al., (1990) British Medical Journal, 302:265-269), inklusivt svekkelse av husstøvmiddinduserte astmatiske symptomer. Som nevnt her innbefatter en symptomsvekkelse enhver reduksjon av et individs allergiske respons på allergenet etter et behandlingsregime med et peptid ifølge oppfinnelsen. Denne symptomsvekkelse kan bestemmes subjektivt (f.eks. pasienten føler seg bedre etter eksponering for allergenet), eller klinisk, f.eks. med en standardhudtest.

Peptider ifølge foreliggende oppfinnelse kan også benyttes for å påvise og diagnostisere følsomhet for Der p III. For eksempel kan dette gjøres ved å kombinere blod eller blodprodukter tatt fra et individ som skal undersøkes med henblikk på sensitivitet, med et peptid som har en Der p III-virkning, under betingelser egnet for å binde komponenter i blodet (f.eks. antistoffer, T-celler, B-celler) med peptidene og bestemme i hvilken grad slik binding inntrer. Andre diagnostiske metoder for allergiske sykdommer som peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan benyttes for, inkluderer RAST (radio-allergosorbent test), PRIST (papir radioimmunosorbent test), ELISA (enzymbundet immunosorbent test), RIA (radioimmunotest), IRMA (immunoradiometrisk test), LIA (luminescens immunotest), histamin-frigjøringsbestemmelser og IgE-immunoblott.

Ved en annen bestemmelse kan forekomsten av IgE som er spesifikke for Der p III i et individ og T-cellenes evne hos vedkommende til å svare på T-celleepitoper av Der p III, bestemmes ved at vedkommende administreres en "Umiddelbar Type" hypersensitivitetstest (ITH) og/eller "Forsinket Type" hypersensitivitetsstest (DTH) (se f.eks. Immunology (1985) Roitt, I.M., Brostoff, J., Male, D.K. (red.), CV. Mosby Co., Gower Medical Publishing, London, NY. s. 19.2-19.18; s. 22.1-22.10) ved å gjøre bruk av et peptid som har en Der p III-virkning eller en modifisert form av et peptid som har en Der p III-virkning som begge binder IgE som er spesifikt for allergenet. De samme individer gis en DTH-test før, samtidig med eller etter, administrering av ITH-testen. Selvsagt ville man dersom ITH-testen administreres før DTH-testen, gi DTH-testen til de individer som oppviser en spesifikk ITH-reaksjon. DTH-testen gjør bruk av et peptid som har en Der p III-virkning, som har human T-cellestimulerende aktivitet og som ikke binder IgE som er spesifikt for allergenet i en vesentlig prosentdel av den populasjon av individer som er følsomme for allergenet (f.eks. minst ca. 75%). De individer som viser seg å ha både en spesifikk ITH-reaksjon og en spesifikk DTH-reaksjon administreres en mengde av en blanding egnet for farmasøytisk administrering. Blandingen omfatter det peptid som har en Der p III-virkning som benyttet i DTH-testen og en farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynner.

Et peptid som har en Der p III-virkning kan benyttes i fremgangsmåter for behandling og forebyggelse av allergiske reaksjoner mot et husstøvmiddallergen eller et kryssreaktivt proteinallergen. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således blandinger egnet for farmasøytisk administrering og som omfatter en mengde av minst ett peptid som har en Der p III-virkning og en farmasøytisk akseptabel bærer. Administrering av blandingen ifølge foreliggende oppfinnelse til et individ som skal desensibiliseres, kan foretas ved å benytte kjente fremgangsmåter i doseringer og tidsrom som effektivt reduserer vedkommendes sensitivitet (dvs. reduserer den allergiske respons) på husstøvmidd. Betegnelsen individ er ment å inkludere levende organismer i hvilke det kan frembringes en immunrespons, f.eks. pattedyr. Eksempler på individer er bl.a. mennesker, hunder, katter, mus, rotter og transgene arter av disse. En mengde av minst ett peptid som har en nødvendig Der p III-virkning til å oppnå en terapeutisk effekt, kan variere med slike faktorer som graden av individets følsomhet overfor husstøvmidd, individets alder, kjønn og vekt, og evnen til et peptid som har en Der p III-virkning, til å frembringe en antigenrespons hos individet. Doseringsregimet kan justeres for å gi den optimale terapeutiske respons. For eksempel kan det daglig administreres flere avdelte doser eller kan dosene reduseres forholdsmessig alt etter hva den terapeutiske situasjon krever.

Virkestoffet (dvs. minst ett peptid som har en Der p III-virkning) kan administreres på en hensiktsmessig måte som f.eks. ved injeksjon (subkutant, intravenøst, etc), ved peroral administrering, inhalering, transdermal påføring eller rektal administrering. Avhengig av administrasjonsmåte kan virkestoffet overtrekkes med et materiale som beskytter forbindelsen fra virkningen av enzymer, syrer og andre naturlige betingelser som kan inaktivere forbindelsen.

For å administrere et peptid som har en Der p III-virkning på annen måte enn ved parenteral administrering, kan det være nødvendig å overtrekke peptidet med eller gi peptidet sammen med et materiale som forhindrer inaktivering. Et peptid som har en Der p III-virkning kan for eksempel administreres i en passende bærer, fortynner eller hjelpestoff som gis sammen med enzyminhibitorer eller i en passende bærer som f.eks. liposomer. Farmasøytisk akseptable fortynningsmidler inkluderer saltløsninger og vandige buffere. Adjuvansbegrepet benyttes i dets videste betydning og inkluderer enhver immun-stimulerende forbindelse, som f.eks. interferon. Adjuvanser som kan komme på tale inkluderer resorcinoler, ikke-ioniske overflateaktive midler som f.eks. polyoksyetylen-oleyleter og n-heksadekylpolyetyleneter. Enzyminhibitorer innbefatter pankreatisk trypsininhibitor, diisopropylfluorfosfat (DEP) og trasylol. Liposomer inkluderer vann-i-olje-i-vann CGF-emulsjoner så vel som konvensjonelle liposomer (Strejan et al., (1984) J. Neuroimmunol. 7:27). For å indusere T-celle ikke-responsivitet administreres blandingen fortrinnsvis i ikke-immunogen form, f.eks. i en form som ikke inneholder adj uvans.

Virkestoffet kan også administreres parenteralt eller intraperitonealt. Dispersjoner kan også fremstilles i glycerol, flytende polyetylenglykoler og blandinger av disse og i oljer. Under vanlige lagrings- og bruksbetingelser kan disse preparatene inneholde et konserveringsmiddel for å forhindre vekst av mikroorganismer.

Farmasøytiske blandinger egnet for injeksjon innbefatter sterile, vandige løsninger (når de er vannløselige) eller dispersjoner og sterile pulvere for umiddelbar fremstilling av sterile injiserbare løsninger eller dispersjoner. Under enhver omstendighet må blandingen være steril og tilstrekkelig flytende til at den lett kan håndteres med injeksjonssprøyter. Den må være stabil under fremstillings- og lagrings-betingelsene og være konservert mot den forurensende virkning av mikroorganismer som f.eks. bakterier og sopp. Bæreren kan være et løsningsmiddel eller dispergeringsmedium som for eksempel inneholder vann, etanol, polyol, (for eksempel glycerol, propylenglykol og flytende polyetylenglykol og lignende), egnede blandinger av disse og vegetabilske oljer. Riktig fluiditet kan opprettholdes for eksempel ved bruk av overtrekk som f.eks. lecitin, ved å holde den nødvendige partikkelstørrelse når det er tale om dispersjon og ved å benytte overflateaktive midler. Virkningen av mikroorganismer kan forhindres med forskjellige antibakterielle og fungicide midler som for eksempel parabens, klorbutanol, fenol, askorbinsyre, thimerosal og lignende. I mange tilfeller vil det være fordelaktig å inkludere isotonitetsbefordrende midler som for eksempel sukkere, natriumklorid eller polyalkoholer som mannitol og sorbitol, i blandingen. Lenger vedvarende absorpsjon av de injiserbare blandinger kan oppnås ved å tilsette blandingen et middel som forsinker absorpsjon, for eksempel aluminium-monostearat eller gelatin.

Sterile injiserbare løsninger kan fremstilles ved å inkorporere virkestoffet (dvs. minst ett peptid som har en Der p III-virkning) i nødvendig mengde i et passende løsnings-middel med en av ovennevnte ingredienser, eller en kombinasjon av slike, etterfulgt av filtersterilisering. Generelt fremstilles dispersjoner ved å inkorporere virkestoffet i en steril bærer som inneholder et dispersjonsgrunnlag og de øvrige av de ovenfor angitte ingredienser. Når det gjelder sterile pulvere for fremstilling av sterile injiserbare løsninger, er de foretrukne fremstillingsmetoder tørking og frysetørking som fører frem til et pulver av virkestoffet (dvs. minst ett peptid som har en Der p III-virkning) i tillegg til ytterligere ønskede ingredienser fra en tidligere sterilfiltrert løsning derav.

Når det peptid som har en Der p III-virkning er passende beskyttet, som beskrevet ovenfor, kan peptidet administreres peroralt, for eksempel med et inert fortynningsmiddel eller en assimilerbar spiselig bærer. Peptidet og de øvrige ingredienser kan også innkapsles i en hård eller myk gelatin-kapsel, presses til tabletter eller inkorporeres direkte i vedkommendes næring. For peroral terapeutisk administrering kan virkestoffet blandes med hjelpestoffer og benyttes i form av fordøyelige tabletter, buccaltabletter, pastiller, kapsler, miksturer, suspensjoner, siruper, oblater og lignende. Prosentdelen av virkestoff i blandingene og preparatene kan selvsagt varieres og kan hensiktsmessig være mellom ca. 5 og ca. 80% av enhetens vekt. Mengden virkestoff i slike terapeutisk anvendelige blandinger velges slik at det oppnås en passende dosering.

I denne sammenheng innbefatter "farmasøytisk akseptabel bærer" ethvert løsningsmiddel, dispergeringsmedier, overtrekk, antibakterielle og fungicide midler, isotoniske og absorpsjonsforsinkende midler og lignende. Anvendelsen av slike medier og midler for farmasøytiske virkestoffer er velkjent på området. Bortsett fra når konvensjonelle medier eller midler er uforlikelige med virkestoffet, er blandinger egnet for farmasøytisk administrering aktuelle. Supplerende virkestoffer kan også inkorporeres i blandingene.

Det er spesielt fordelaktig å formulere parenterale blandinger i enhetsdoseform for å lette administrering og doseringsuniformitet. Enhetsdoseform refererer seg i denne sammenheng til fysisk diskrete enheter egnet som enhetsdoser for det pattedyr-individ som behandles, idet hver enhet inneholder en forutbestemt mengde virkestoff beregnet til å frembringe den ønskede terapeutiske effekt, sammen med den nød-vendige farmasøytiske bærer. Spesifikasjonen for enhetsdose-formene ifølge oppfinnelsen styres av og er direkte avhengig av, (a) virkestoffets unike karakteristika og av den bestemte terapeutiske effekt som skal oppnås og (b) de begrensninger som naturlig ligger i kunsten å sette sammen en slik virksom forbindelse for behandling av overfølsomhet.

Oppfinnelsen tilveiebringer også en blanding som omfatter minst to peptider som har en Der p III-virkning {f.eks. en fysikalsk blanding av minst to peptider) som hver har T-cellestimulerende virkning. Alternativt kan et peptid som har minst to regioner som hver har T-cellestimulerende virkning

(dvs. hver region omfatter minst én T-celleepitop)

administreres til et allergisk individ. En blanding av to peptider som har en Der p III-virkning eller en blanding av to peptider som har minst to regioner som hver har T-cellestimulerende virkning, kan administreres til et individ i form av en blanding med en farmasøytisk akseptabel bærer som beskrevet ovenfor. En viss mengde av én eller flere slike blandinger kan administreres samtidig eller suksessivt til et individ som er sensitivt for et husstøvmiddallergen, for å behandle slik sensitivitet.

Det cDNA (eller mRNA som tjener som templat under revers transkripsjon) som koder for et peptid som har en Der p III-virkning, kan benyttes for å identifisere lignende nukleinsyrer i et hvilket som helst utvalg eller type av dyr og således molekylært klone gener som har tilstrekkelig sekvens-homologi til å hybridisere til det cDNA som koder for et peptid som har en Der p III-virkning. Foreliggende oppfinnelse inkluderer således ikke bare peptider som har en Der p III-virkning, men også andre proteiner som kan være allergener som kodes av DNA, som hybridiserer til DNA ifølge foreliggende oppfinnelse.

Isolerte peptider som er immunologisk beslektet med

Der p III, for eksempel ved antistoff-kryssreaktivitet eller T-cellekryssreaktivitet, utenom de som allerede er angitt, ligger også innenfor rammen for oppfinnelsen. Slike peptider binder antistoffer som er spesifikke for proteinet og peptidene ifølge oppfinnelsen eller stimulerer T-celler som er spesifikke for proteinet og peptidene ifølge oppfinnelsen.

Et peptid som har en Der p III-virkning (dvs. Der p III fremstillet ved rekombinant teknikk eller ved kjemisk syntese) er fritt for alle andre husstøvmiddproteiner og er derfor anvendelige ved standardisering av allergenekstrakter som er nøkkelreagenser for diagnostisering og behandling av husstøvmiddhypersensitivitet. Dessuten har et slikt peptid en fast, veldefinert blanding og biologisk aktivitet for bruk i preparater som vil kunne administreres for terapeutiske formål (f.eks. for å modifisere den allergiske respons hos et individ som er sensitivt for husstøvmidd). Slike peptider kan også benyttes for å studere den immunterapeutiske mekanisme av D. pteronyssinus-allergi og for å utvikle modifiserte derivater eller analoger anvendelige innen immunterapien.

Andre forskere har vist at høye doser av allergenekstrakter generelt gir best resultater ved immunterapi (dvs. best symptomlindring). Mange individer er imidlertid ute av stand til å tolerere store doser av slike ekstrakter som følge av systemiske reaksjoner som utløses av allergenene og andre komponenter i disse preparatene. Et peptid som har en Der p III-virkning har fordelen av å være fri for alle andre midd-proteiner. Et slikt peptid kan for terapeutiske formål, derfor administreres med færre forventede bivirkninger.

Det er nå også mulig å utvikle et middel eller medikament som er i stand til å blokkere eller inhibere

husstøvmiddallergenets evne til å indusere en allergisk

reaksjon i sensitive individer. Slike midler vil for eksempel kunne utvikles på en slik måte at de binder seg til relevante anti-Der p III-IgE-molekyler og således forhindre IgE-allergenbinding og påfølgende mastcelle-/basofildegranulering. Alternativt kunne slike midler binde seg til cellulære komponenter i immunsystemet og resultere i undertrykkelse eller desensibilisering av de allergiske responser på husstøvmidd-allergener. Et eksempel på dette som ikke er ment å medføre noen begrensning, er anvendelsen av peptider som innbefatter B- eller T-celleepitoper av Der p III, eller modifikasjoner derav, basert på cDNA-proteinstrukturen til Der p III, for å undertrykke den allergiske respons på et husstøvmiddallergen. Dette kunne foretas ved å definere de strukturer av fragmenter som koder for B- og T-celleepitoper og som påvirker B- og T-cellefunksjonen, i in vitro under-søkelser med blodkomponenter fra individer som er sensitive for husstøvmidd.

Oppfinnelsen illustreres ytterligere gjennom de etter-følgende eksempler. Innholdet i referanser og publiserte patentsøknader som er sitert, refereres det herved til med hele sitt innhold.

Den følgende metodikk ble benyttet i eksemplene.

EKSEMPLER

Materialer og metoder

D. pteronyseinus-kulturer

Hele midd ble anskaffet fra the Commonwealth Serum Laboratories, Parkville, Australia og brukt medium var en gave fra samme kilde.

Rensing av nativt Der p III

Ved å benytte en tilpasset metode tatt fra Heymann et al.

(Heymann et al., J. Allergy Clin Immunol. (1989) 83:1055-1067), ble 15 mL av en 50-80% mettet ammoniumsulfat-utfelling av D. pteronyssinus brukt vekstmedium påført en oppover vandrende 2 cm x 90 cm polyakrylamid P-100 kolonne ekvilibrert med PBS (Pharmacia, LKB Biotechnology, Uppsala, Sverige).

Protein-innholdet i de eluerte 5 mL fraksjonene ble bestemt ved å måle den optiske tetthet (A280 nm) og ved analyse ved hjelp av SDS-PAGE. Fraksjoner som i det vesentlige inneholdt bånd i 30 kDa regionen ble slått sammen, konsentrert ved polyetylenglykol 6000 (BHD Chemicals, Aust. PTY. Ltd. Kilsyth, Vie. Aust.), dialysert mot PBS og sendt gjennom kolonnen på nytt. Dette ble gjentatt to ganger inntil analysen ved SDS-PAGE fastslo at de eneste bånd som kunne påvises var en dublett med en molekylvekt på ca. 30 kDa.

Protein-sekvensanalyse

De affinitetsrensede native Der p III og Der flll-proteinene ble underkastet HPEC ved å benytte et 12% kolonne-system (Applied Biosystems, Foster City, CA). De affinitetsrensede proteinene eller HPEC-fraksjonene med riktig molekylvekt, ble deretter underkastet proteinsekvensanalyse ved bruk av Applied Biosystems Model 477A gass-fase sekvenseringsmaskin med online fenyltiohydantoin-derivatanalyse (Model 120). Som et alternativ ble de affinitetsrensede proteinene først separert ved SDS-PAGE (BioRad), overført til Problot (Applied Biosystems) og sekvensert ved hjelp av en Beckman Model LF3000. Etter en første sekvensanalyse av proteinene ble o-ftalaldehyd benyttet for å blokkere N-terminaler, unntatt de med proliner (posisjon 13 for Der p III), for å eliminere kontaminerende peptidsekvenser og forlenge N-terminalsekvensen entydig. CNBr-peptidene ble fremstillet ved å spalte de affinitetsrensede proteinene med 2% (vekt/vol.) CNBr i 70%

(vekt/vol.) maursyre ved romtemperatur over natten. De opp-sluttede peptidene ble underkastet HPEC for rensing, hvoretter peptidfragmentene ble underkastet sekvensanalyse.

Foretrukket kodonanvendelse

Kodonanvendelsen er skjev til fordel for de modne proteiner Der f I (Dilworth et al., Clin. Exp. Allergy (1991) 21:25-32), Der f II (Trudinger et al., Clin. Exp. Allergy

(1991) 21:33-37), Der p I (Chua et al., J. Exp. Med (1988) 167:175-182) og Der p II (Chua et al., Int. Arch Allergy Appl Immunol (1990) .91:118-123) ble bestemt. Den gjennomsnittlige prosentuelle anvendelse av hver kodontriplett for hver aminosyre ble bestemt for hver av disse fire Dermatophagoides-proteinene og resultatene er angitt i Tabell 1.

Konstruksjon av D. pteronyaainuB XgtlO cDNA biblioteket

Polyadenylert mRNA (10 ug) ble benyttet til syntese av cDNA ved hjelp av RNase H metoden (Gubler et al., Gene (1983) 25_:263-269) ved å benytte et sett (Amersham International, Aylesbury, U.K.). Etter tilsetning av EcoRI-restriksjonsenzym-linkere (New England Biolabs, Beverly, U.S.A.) ble cDNA ligert til alkalisk-fosfatase-behandlede lambda gtlO-armer (Promega Biotec, Madison, Wisc). Den rekombinante fag DNA ble pakket og utplatet i E. coli JP777 for å frembringe et bibliotek på

5 x IO<5> rekombinanter.

Kinase endemerking av oligonukleotider

Oligonukleotider ble syntetisert ved å benytte et Applied Biosystems PCR apparat (Applied Biosystems, Foster City, CA). Tyve pikomol av oligonukleotid DNA ble endemerket med (y_"<p>) ATP ved å benytte T4 polynukleotidkinase (Promega Corp. Madison, Wisc.) (Maniatis, T., Fritsch, E.F. & Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utg. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Merket oligonukleotid ble renset ved hjelp av 15% polyakrylamidgelelektroforese og deretter eluert over i sterilt destillert vann.

Isolering av Der p III cDNA-kloner fra XgtlO cDNA-biblioteket

Screening av biblioteket ble foretatt med to prober som var konstruert ved å benytte både N-terminale og interne proteinsekvensdata oppnådd som beskrevet ovenfor for gruppe III-allergenene. Den første, P3forward3 (P3F3) var en 38mer med følgende nukleotidsekvens,

5'TCAGAAAAAGCTTTGGCTGGTGAATCACCATATCAAAT3' (SEKV. ID. NR:8).

Den andre proben, P3reverse4(P3R4) en 41mer med følgende nukleotidsekvens 5'GAATCAACACCACCATTAGCAACATCACCACCGCAAATCAT3'

(SEKV. ID. NR:9). Biblioteket ble utsådd som 25.000 pfu per 150 mm petriskål og fagen overført til nitrocellulose (Schleicher & Schuell, Dassel, Tyskland). To sett filter-overføringer fra hver plate ble denaturert og varmebehandlet for hybridisering med den andre av de to probene (Maniatis, T. , Fritsch, E.F. & Sambrook, J. Molecular Cloning: A

Laboratory Manual, 2. utg. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Hybridiseringene ble foretatt i hybridiserings-blanding (6 x natriumklorid/natriumcitrat pH 7,0 (SSC), 0,1% Denhardts, 100 ug/mL denaturert sildesperma DNA) ved 42°C med 10* cpm/mL merket probe over natten. Filteret ble vasket tre ganger ved 42°C i 20 minutter og deretter ved 50°C i 10 minutter i 400 mL vaskeløsning inneholdende 6 x SSC, 0,1% Triton X 100.

Isolering av DNA fra XgtlO Der p III-kloner

Fag DNA fra Der p III-kloner ble fremstillet ved å benytte en polyetylenglykol-utfellingsmetode (Chua et al., J. Exp. Med. (1988) 167:175-182).

Subkloning og DNA-sekvensering

Renset Der p III fag DNA ble kuttet med EcoRI-retriksjonsenzymer (Toyobo) og det frigjorte fragment ligert til EcoRI-restriksjonsenzym-kuttet M13mpl9 sekvenseringsvektor (Messing, Meth. Enzymol. (1983) 101:20-78). Den rekombinante DNA ble transformert ved å benytte E. coli TG-1 og sekvenseringen foretatt ved å benytte dideoksynukleotidkjede-termineringsmetoden og Sequenase (U.S. Biochemicals) (Sanger et al., Proe. Nati. Acad. Sei USA (1977) 74:5463-5467). Oligo-nukleotidprimerne benyttet for sekvenseringen inkluderte de universelle primerne, en 17-mer sekvenseringsprimer (-40)5'CAGCACTGACCCTTTTG3<1> (SEKV. ID. NR:4) og en 16-mer revers sekvenseringsprimer (-24)5'AACAGCTATGACCATG3' (SEKV. ID. NR.-5), de to interne primerne benyttet for bibliotek-screeningen (SEKV. ID. NR:8 og 9) og to interne primere P3forwards(P3F5)

5'AAAGCTGTTGGATTACCA3<1> (SEKV. ID. NR:6) og P3reverse5(P3R5) 5'TACATCCGATCCTTTTGC3' (SEKV. ID. NR:7) og P3F4 5<1>GCGGATCCATTGTTGGTGGT3' (SEKV. ID. NR:18). De to interne probene ble konstruert for å tilsvare nukleotidrestene 456-473 (P3F5) og 491-474 (P3R5) (Figur IA og IB). Primerne ble benyttet for sekvensering av den isolerte klon i begge retninger.

DNA- og proteinsekvensanalyse

Sekvensanalyse ble foretatt ved å benytte MAC VECTOR programvaren (IBI, New Haven, U.S.A.). Beregning av sekvens-homologi med andre proteiner ble foretatt ved NCBI ved å benytte BLAST nettverk service. BLAST-versjonen som ble benyttet var BLAST 1.3.10MP (7-Jul-93).

EKSEMPEL 1: Sekvens av den native gruppe III-allergener

Fremgangsmåten for proteinisolering førte til en

Der p III-prøve som ved analyse ved SDS-PAGE, vandret som en dublett med molekylvekter på 3 0 og 28k. Begge bånd reagerte med polyklonalt mus-anti-Der f III i overensstemmelse med tidligere rapportert kryssreaktivitet innen arter (Thomas et al., Exp. Appl. Acarol. (1992) 16:153-164). Der f III isolert fra en 5A12 monoklonal antistoffkolonne (Heymann et al., J. Allergy Clin. Immun. (1989):1055-1067) oppviste lignende karakteristika. Ved å benytte o-ftalaldehydet for å fjerne de forurensende proteinsekvensene bevirket den N-terminale sekvensering av både nativt Der p III og Der f III at den kjente Der p III-sekvens ble korrigert og forlenget og Der f III-sekvensen ble forlenget. Den Der p III N-terminale sekvens ble forlenget til IVGGEKALAGQSPYQISLQSSSHFSGGTIL (SEKV. ID. NR:16). Den Der f III N-terminale sekvens ble forlenget til IVGGVKAKAGDSPYQISLQSSSHFXGGSILD (SEKV. ID. NR:15). Sammenligning av sekvensdata publisert av Stewart et al., (Immunology (1992) 75:29-35) og Heymann et al., (J. Allergy Clin. Immunol. (1989) 83.: 1055-1067) for gruppe III-allergenene med de her foreliggende data, tydet på flere feil i den publiserte sekvens. Spesielt ble det funnet en ikke-konservativ endring i rest 8 fra et positivt ladet lysin til et upolart hydrofobt leucin (Der f III, Heymann et al., J. Allergy Clin. Immunol. (1989) 83_: 1055-1067) . To interne peptider av Der f III ble isolert ved HPEC etter CNBr-oppslutning av det naturlige protein, MICGGDVANGGVDSEQGD (SEKV. ID. NR:10) og MTLDQTNAKPVPLPTS (SEKV. ID. NR:12).

EKSEMPEL 2: Sekvens av rekombinant Der p III

Proteinsekvens-informasjonen oppnådd som beskrevet i Eksempel 1 ble benyttet i forbindelse med data for foretrukket kodonanvendelse (Tabell 1) for å konstruere to oligonukleotid-prober. Disse oligonukleotidene ble konstruert for å hybridisere til nukleotidrestene 159-196 og til restene 688-648 av Der p III-klonen (Figur 2A og 2B). Bare de kloner som hybridiserte sterkt til begge prober ble isolert fra AgtlOc DNA biblioteket. Den resulterende nukleotidsekvens for P3WS1-klonen og den deduserte aminosyresekvens er vist i Figur IA og IB. Den fullstendige nukleotidsekvens hadde en iengde på 1059 bp. Denne inkluderer en 5<*> ikke-kodende region på 62 bp, en 211 bp 3' utranslatert region og en åpen leseramme på

786 bp med et stoppkodon (TGA) i nukleotidrestene 846-848. Den inneholder ingen poly A-hale, men det synes å foreligge et polyadenyleringssignal (AATAAA). Den åpne leseramme koder for et protein som inkluderer en 29 aminosyrers pre-pro-region og starter ved det N-terminale isoleucin, et modent protein på 232 aminosyrerester med en beregnet molekylvekt på 24.985 og pl på 8,5. Metioninresten (ATG) i aminosyreposisjon -29 er det mest sannsynlige translasjonsinitieringssetet. Seleksjon for dette initieringssetet ble tildels basert på nærværet av en sekvens etter methionin som koder for et klassisk signalpeptid på 18 aminosyrerester, hvor hovedsakelig hydrofobe rester forekommer. Dessuten stemmer sekvensen umiddelbart før dette ATG-kodon, 5'GAAAGATG3', tilnærmet til Kozak konsensus-sekvensen (CCACCATG) for det eukaryote translasjons-initieringssete med det avgjørende purin (oftest A) i -3 posisjonen (Kozak, Nucleic Acid Research (1984) 12:857-872).

Proteinsekvenseringsdataene for Der p III beskrevet i Eksempel 1, avviker fra aminosyresekvensen dedusert fra cDNA til p3WSl-klonen som følge av substitusjonene av Glu/Gln i rest 11 og en mulig Cys/Ser-substitusjon i rest 17. Disse substitusjoner kan skyldes forekomsten av Der p III i forskjellige isoformer. Analyse av den deduserte proteinsekvens for Der p III P3WS1 bekreftet at posisjonen av Der f III CNBr-peptid 1 -(MI(C)GGDVANGGVDS(E)QGD) (SEKV. ID. NR:10) var korrekt predikert til å være fra aminosyrerestene 177-183 og hadde 88% identitet med den rekombinante sekvens i denne region, MICGGDVANGGKDSCQD (SEKV. ID. NR:11). Interessant er det at det forekommer to identiske ikke-konservative endringer når den native Der f III peptidsekvens rettes inn overfor P3WSl-klonsekvensen. Det forekommer en endring fra et upolart hydrofobt valin i 178 (i henhold til nummereringen i Figur IA og IB) i Der f III til en positivt ladet lysinrest i P3WS1-klonsekvensene. Den andre endringen er en glutaminsyrerest i 181 i Der f III i stedet for en cyBteinrest i P3WSl-klon-sekvensen. Cysteinet danner én av disulfidbroene i begge disse og de fleste andre trypsinproteiner. Den predikerte sammen-lignings -innretting av det andre Der f III-peptid, (M)TLDQTNA(K)PVPL(P)(T)(S) (SEKV. ID. NR:12) frembragt ved CNBr-oppslutningen, var fra aminosyrerestene 95-110 (MKLNQKNAKAVGLPAK) (SEKV. ID. NR:13). Det er 63% homologi med P3WS1-klonen i denne region. Disse forskjellene mellom

Der p III og Der f III-proteinsekvensene er i overensstemmelse med den 20% Bekvensvariasjon som finnes mellom andre homologe allergener fra disse arter, som f.eks. Der p I og Der f I, og Der p II og Der f II.

Den fullstendige sekvens for Der p III P3WSl-klonen koder for et protein på 319 aminosyrer. Der p III syntetiseres i likhet med alle kjente trypsiner, som et pre-pro-zymogen. Spaltningssetet for signalpeptidet postuleres å ligge mellom aminosyrerestene -12 og -11 siden restene omkring dette setet stemmer overens med aminosyrespenninger skissert av von Heijne, (von Heijne, Eur. J. Biochem. (1983) 133:17-21). Von Heijne foreslo at små nøytrale aminosyrer sterkt foretrekkes i posisjonene -1 og -3 fra spaltningssetet slik som det alanin og tyrosin som sees i Der p III-genet. Prolinrester finnes aldri i posisjonene +1 til -3 og utelukker således alle andre seter. De fleste pattedyr-trypsinproteiner har vært angitt å ha pre- eller signalpeptider på 15 eller 16 aminosyrer.

Der p III-peptidet er 18 aminosyrer langt. Selv om forskjellen i lengde er relativt liten, synes det som om signalpeptidets lengde kan skyldes den fylogenetiske diversitet i de arter som trypsinet skriver seg fra. Dette er mest tydelig i Streptomyces griseus med et 32 aminosyrers pre-peptid (Kim et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1991) 181:707-713). Det har også vært angitt at signalpeptidet for pattedyrtrypsiner inneholder to spesifikke ansamlinger (dusters) av to og deretter fire, hydrofobe rester (MacDonald et al., J. Biol. Chem. (1982) 257:9724-9732; Le Huerou et al., Eur. J. Biochem.

(1990) 193:767-73). Det er rikelig av hydrofobe rester innen denne region av Der p III-genet, men de er ikke anbragt i høyt konserverte ansamlinger. Det samme gjelder signalpeptidene for både Drosophila melanogastor (Davis et al., Nucleic Acid Research (1988) 13:6605-6615) og S. griseus (Kim et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. (1991) 181:707-713). Det er derfor mulig at de høyt konserverte ansamlingene av hydrofobe rester ikke er et karakteristikum for alle trypsinproteiner, men snarere for pattedyrtrypsiner.

Nedstrøms fra signalpeptidet er det 11 resters pre-aktiveringspeptid fra aminosyrerestene -11 til -1. Sammenligning av denne pro-region med andre pro-regioner fra trypsiner fra forskjellige arter tyder på at Der p III-pro-peptidet er uvanlig. Både vertebrate og invertebrate trypsiner har vist seg å ha en oktapeptid- og/eller en heksapeptid-pro-region med fire sammenhengende aspartylrester etterfulgt av en lysinrest i -1 posisjonen (Le Huerou et al., Eur. J. Biochem.

(1990) 193:767-73). Det er karboksylregionen av denne lysinrest som spaltes under aktiveringen av trypsinogenet til trypsin. Der p III mangler denne polyaspartyl-lysinsekvensen. Trypsinogenet kan derfor ikke aktiveres av den vanlige mekanismen. Det finnes noen få andre trypsiner som ligner Der p III i denne henseende, D. melanogastor (Davis et al., Nucleic Acid Research (1988) 13:6605-6615), 3. griseus (Kim et al., Biochem. Biophys. Res. Commun (1991) 181:707-713) og høyst interessant, et 32 kDa anionisk trypsin fra rottepankreas (Gendry & Launay, Biochemica et Biophysica Acta

(1988) 955:243-249). Denne forskningsgruppe viste at enterokinase, et enzym som har en høyst spesifikk affinitet for polyaspartyl-lysinrestene i trypsinproteiner, ikke hadde noen effekt på det trypsin som de hadde isolert. De mente derfor at det ble benyttet en annen mekanisme for denne aktiverings-prosess. Mangelen på homologi mellom Der p III pro-enzym-regionen og noen av de kjente sekvenser, kan tyde på en unik aktiveringsmekanisme. En gjennomsøkning av proteindatabasen har bekreftet at Der p III P3WS1 er homolog med både vertebrate og invertebrate trypsiner. Der p III-allergenet er ikke et midd-chymotrypsin (Gendry & Launay, Biochemica et Biophysica Acta (1988) 955:243-249) siden sammenligning av de N-terminale protein-sekvenser viste at de adskiller seg så meget som '50%. Figur 2A og 2B viser en sammenligning av aminosyresekvensene av Der p III P3WS1- og kreps-trypsiner (SEKV. ID. NR:2 og 3). Krepsen har 44% homologi med Der p III. Det forekommer syv cysteinrester, hvorav seks vites å danne disulfidbroer, 54-70, 181-198 og 210-236 (Figur 2A og 2B). (Hartley, Phil Trans Roy Soc Lond B (1970) 257:77-87). Særlig vesentlig er det at Der p III-protein inneholder de høyt konserverte restene som er involvert i trypsinproteinets katalytiske aktivitet og substratspesifisitet. Det konserverte His 40 og Ser 185 (Figur IA og IB) representerer ladning-relésystemet som omfatter trypsinenzymets aktive katalytiske sete. Den positivt ladede asparaginsyrerest i 179 representerer trypsin-spesifisitets-setet. De fleste serinproteaser har en nøytral aminosyre ved denne rest (Keil, The Enzymes Academic Press, New York,1971, sidene 249-279). Glycinrestene i 206 og 211 i kombinasjon med asparaginsyren i 179 er ansvarlig for tilpasning av de uformelige positivt ladede sidekjedene til lysin og arginin, substratrestene som avspaltes av trypsiner. Aminosyrerestene 179-185 og 202-206 (Figur IA og IB) danner de Sl-bindende lommer som er involvert i substratets binding til trypsin-molekylet. De områder som umiddelbart omgir alle disse viktige restene er de mest konserverte regionene av Der p III-proteinet. Alle disse resultatene stemmer overens med det faktum at det blant trypsinproteiner fra ulike arter, opptrer strukturelle variasjoner i de regioner av molekylet som ikke er viktig for katalytisk aktivitet (Vithayathil et al., Arch. Biochem Biophys (1961) 92:532-540). De fleste trypsinproteiner har i alminnelighet en vanlig pardannelse av cysteinrester slik at det dannes seks disulfidbroer, hvorav to av disse broene, Cys 15-145 og Cys 117-218 er unike for denne proteingruppe. Der p III i likhet med både kreps (Titani et al., Biochemistry (1983) 22:1459-1465) og 3. griseus mangler disse to unike sammenkoblingene, men enda viktigere er det at Der p III er unik ved å inneholde en ekstra uparet cysteinrest. Denne rest kan være ekvivalenten til Cys 15 i bovint trypsin som til forskjell fra Cys 145, 117 og 218, ikke ble eliminert under den evolusjonære divergens i midd-trypsinet. Isoleringen av det gen som koder for nukleotidsekvensen for gruppe III-allergenet, Der p III, er den første primær-sekvensbestemmelse for denne gruppe av Dermatophagoides allergener. Sammenligning av sekvensen med andre vertebrate og invertebrate serinproteaser med henblikk på substrat-bindingsforsøk (Stewart et al. Immunology (1992) 75:29-35; Ando et al., Arerugi (1992) 41:704-707) tyder på at gruppe III-allergenene er trypsinproteiner. Trypsinproteiner utskilles som pre-pro-zymogener av de pankreatiske acinus-celler i alle vertebrate og invertebrate arter. Invertebrate trypsiner har vært angitt å ha en molekylvekt varierende fra 20 til 30 kDa (Graf et al., Insect Biochem (1985) 15:611-618). Der p III P3WS1 trypsinogenet har en beregnet molekylvekt på 28 kDa og det tilsvarende modne protein en molekylvekt på 24.985 kDa, mens det native protein, renset, ifølge SDS-PAGE eksisterte som duplikat av 28 og 30 kDa. Det har også vært rapportert at multipler av proteinbånd har vært isolert både fra Der f III (Thomas et al, Exp. Appl Acarol (1992) 16:153-164) og Der p III (Stewart et al., Immunology (1992) 75:29-35). Disse resultatene er ikke uvanlige siden trypsinproteiner er kjent for å forekomme i flere isoformer. Gendry & Launay

(1988) isolerte dobbelte proteinbånd av et anionisk trypsinlignende protein fra rottepankreas. De viste at det høyere 32 kDa-bånd representerte det inaktive trypsin og det lavere

30 kDa-bånd representerte den virksomme form av trypsinet som

kunne autokatalysere spaltningen av 32 kDa-båndet. Det er derfor mulig at 30 kDa-båndet representerer det inaktive trypsinogen og 28 kDa-båndet det aktive trypsin. Antallet isozymer for invertebrate trypsiner har vært angitt å variere fra 1 til 12 (MacDonald et al., J. Biol. Chem. (1982) 257:9724-9732). Stewart et al. (1992) antydet at det eksisterte ni hovedisoformer av Der p III, med pl-verdier varierende fra 4 til >8.

EKSEMPEL 3: Ekspresjon og rensing av rekombinant Der p III

Et komplementært DNA-innskudd som koder for Der p III (Figur IA og IB) ble kuttet med EcoRI og skutt inn i pUC19. For å fjerne den ikke-translaterte 5'-sekvens så vel som en del av den antatte hydrofobe ledersekvens, ble cDNA spaltet med Mscl og tilføyd en EcoRI-linker. Deretter ble det rett-avkuttede Der p III-fragment åpnet med EcoRI og subklonet inn i ekspresjonsvektoren pETlld (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185. Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89). Sekvensen og leserammen ble verifisert ved DNA-sekvensering. Den Der p III-kodende sekvens omfattet rest 13 til stoppkodonet (se Figur IA og IB). Ekspresjonsvektoren pETlld Der p III ble transformert inn i E. coli-vertsstammen BL21(DE3) og selektert på skåler inneholdende 150 ug/mL ampicillin (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89). En enkelt transformantkoloni ble dyrket opp i et 2 mL volum BHIB-medium inneholdende 150 ug/mL ampicillin ved 37°C i ca. 6 timer. 10 mL av denne kulturen ble strøket ut på en seleksjonsskål og dyrket over natten ved 37°C. Bakterieplenen ble tatt opp i 2 mL medium og tilsatt til 500 mL BHIB-medium (150 ug/mL ampicillin) og dyrket ved 37°C til A400=1 , 0 . Rekombinant-ekspresjon ble indusert ved tilsetning av IPTG til en sluttkonsentrasjon på 1 mM. Etter vekst i 2 timer ble cellene høstet, lysert og proteinene solubilisert i 6 M guanidin»HCl-buffer inneholdende 100 mM 2-ME som tidligere beskrevet for ambrosia-rekombinant-allergenene, Amb a 1.1 og Amb a II (Rogers et al., (1991) J. Immunol. 147:2547-2552).

Guanidin»HCl-lysatet inneholdende Der p III ble underkastet Ni<J*->metallion-affinitetskromatografi under denaturerende betingelser i 8 M urea (Hochuli, E. et al.,

(1988) Bio/Technology 1:1321-1325). Etter eluering fra den Ni<a* >chelaterende bærer, QIAGEN NTA-Agarose (Diagen GmbH, Dusseldorf, Tyskland), ble de rekombinante Der p III-proteinpreparatene underkastet SDS-PAGE-analyse (Figur 3).

Rekombinant Der p III hadde en forventet molekylvekt på ca. 27 kDa som predikert for de 252 aminosyrene pluss aminosyrer benyttet som rensirigsmarkør (MGHHHHHHEF (SEKV. ID. NR: 17) . pETlld-ekspresjonssystemet og Ni<2*> metallion-affinitetskromatografimetoden utviklet ca. 12 mg rekombinant Der p III per liter vekstmedium (bestemt ved A^-måling) . Dette ekspresjons- og renseskjema førte til et proteinpreparat som ifølge SDS-PAGE fremkalt ved farving med coomassieblått (Figur 3), hadde en renhet på mer enn 90%. Den observerte tilsynelatende molekylvekt på ca. 32 kDa er en tanke høyere enn den som ble predikert fra primærstrukturen (Figur IA og IB og ovenfor). I Figur 3 ble tiltagende konsentrasjoner av Der p III-preparat undersøkt for å bekrefte renheten (bane 1, 4,3 ug; bane 2, 8,7 ug; bane 3, 13,8 ug; bane 4, 17,4 ug; markører er angitt med M).

Claims

1. Isolert nukleinsyre som koder for et Der p III-proteinallergen, karakterisert ved at nukleinsyren omfatter nukleotidsekvensen vist i figur 1 (SEKV. ID. NR:1), den kodende region derav (nukleotider 150-845 av SEKV. ID. NR:1) eller derivater eller varianter derav, som koder for et protein som har den samme biologiske aktivitet som proteinet kodet for av SEKV. ID. NR:1.

2. Isolert nukleinsyre som koder for et Dei- p III-proteinallergen ifølge krav 1, karakterisert ved at nukleinsyren omfatter en nukleotidsekvens som er i det minste 90% identisk til nukleotidsekvensen vist i figur 1 (SEKV. ID. NR:1).

3. Isolert Der p III-proteinallergen, karakterisert ved at det er kodet for av en nukleinsyre ifølge enten krav 1 eller 2.

4. Del av proteinallergenet ifølge krav 3, karakterisert ved at delen inneholder en T-celleepitop eller en B-celleepitop av Der p III-proteinallergenet.

5. Rekombinant ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den omfatter nukleinsyren ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3.

6. Vertscelle, karakterisert ved at den er transfektert med den rekombinante ekspresjonsvektoren ifølge krav 5, som er i stand til å styre ekspresjonen av et peptid som har en aktivitet av Der p III.

7. Isolert Der p III-proteinallergen, karakterisert ved at det omfatter aminosyresekvensen vist i figur 2 (SEKV. ID. NR:2), eller en moden del derav, som kodes for av nukleotidene 150-845 av SEKV. ID. NR:1, nevnte proteinallergen er fri fra alle andre husstøvmiddproteiner.

8. Isolert Der p III-proteinallergen, karakterisert ved at det er produsert i en vertscelle transformert med nukleinsyren ifølge krav 1, omfattende nukleotidsekvensen vist i figur 1 (SEKV. ID. NR:1), eller en kodende region derav.

9. Farmasøytisk blanding, karakterisert ved at den omfatter proteinallergenet ifølge enten krav 7 eller krav 8.

10. Blanding ifølge krav 9, karakterisert ved at den ytterligere omfatter en farmasøytisk akseptabel bærer.

11. Anvendelse av et proteinallergen for fremstilling av et medikament for anvendelse i behandling av sensitivitet for husstøvmiddallergen, hvor proteinallergenet i det minste er et proteinallergen ifølge enten krav 7 eller krav 8.

12. Fremgangsmåten for å påvise sensitivitet i et individ for husstøvmiddallergen, karakterisert ved at den omfatter å kombinere en blodprøve oppnådd fra individet med et proteinallergen ifølge enten krav 7 eller krav 8, under betingelser egnet for binding av blodkomponenter med peptidet og bestemmelse av graden av binding som forekommer.

13. Fremgangsmåte for fremstilling av en farmasøytisk blanding eller diagnostisk reagens som omfatter et rekombinant støvmiddallergen, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter trinnene: (a) dyrking av bakterievertsceller inneholdende en ekspresjonsvektor omfattende et DNA-molekyl omfattende nukleotidsekvensen som vist i figur 1 {SEKV. ID. NR:1) og som koder for et Der p III-proteinallergen eller en nukleotidsekvens som er minst 90% identisk med sekvensen i figur 1 (SEKV. ID. NR:1); og (b) gjenvinning av det rekombinante proteinallergenet fra kulturen.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at ekspresjonsvektoren omfatter en ekspresjonskontrollsekvens operativt bundet til nukleotidsekvensen.

15. Fremgangsmåte ifølge enten krav 13 eller 14, karakterisert ved at proteinallergenet er fusjonert eller ko-uttrykt med et tilleggspolypeptid.

16. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 13 til 15, karakterisert ved at allergenet omfatter (a) en aminosyresekvens som vist i figur 1 (SEKV. ID. NR:2); eller (b) aminosyrerestene 1-232 av sekvensen vist i figur 1 (SEKV. ID. NR:2); eller (c) en aminosyresekvens som i det minste er 90% identisk med aminosyresekvensen vist i figur 1 (SEKV. ID. NR:2).

17. Kjemisk syntesefremgangsmåte for fremstilling av en farmasøytisk blanding eller et diagnostisk reagens omfattende et støvmiddproteinallergen, karakterisert ved at nevnte allergen omfatter (a) en aminosyresekvens som vist i figur 1 (SEKV. ID. NR:2); eller (b) aminosyrerestene 1-232 av sekvensen vist i figur 1 (SEKV. ID. NR:2) eller (c) en aminosyresekvens som i det minste er 90% identisk med aminosyresekvensen vist i figur 1 (SEKV. ID. NR:2).