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Kürzliche
Berichte haben die Bedeutung von Reaktionen der Gruppe I (beispielsweise
Der p I und Der f I) und der Gruppe II (beispielsweise Der p II
und Der f II) Proteinallergene in der Hausstaubmilbenallergie dokumentiert.
Es wurde beispielsweise dokumentiert, dass über 60 % der Patienten zumindest
50 % ihrer Anti-Milben-Antikörper
gegen diese Proteine gerichtet haben (beispielsweise Lind, P. et
al. Allergy, 39: 259–274 (1984);
van der Zee, J. S. et al., Journal Allergy and Clinical Immunology,
81: 884-896 (1988)). Es ist möglich, dass
Kinder einen größeren Grad
an Ansprechbarkeit bzw. Reaktivität gegenüber den Allergenen der Gruppe I
und der Gruppe II zeigen (Thompson, P.J., et al., Immunology, 64:
301–314
(1988)). Eine Allergie gegenüber Milben
der Art Dermatophagoides (D.) ist mit Zuständen wie beispielsweise Asthma,
Rhinitis und ektopischer Dermatitis verbunden. Zwei Spezies, D.
pteronyssinus und D. farinae, herrschen vor und es wurde deswegen als
Ergebnis ein beträchtlicher
Aufwand betrieben, die Allergene zu identifizieren, die von diesen
beiden Spezies erzeugt werden.
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Eine
konzertierte Anstrengung wurde vorgenommen, um die Hauptallergene
sowohl von D. pteronyssinus als auch D. farinae durch Genklonieren
zu charakterisieren. Konsequenterweise haben zahlreiche Publikationen
die vollständige
Nukleotidsequenzen von mehreren Allergenen berichtet, einschließlich Der
p I (Thomas, W.R. et al., International Archves of Allergy and Applied
Immunology, 85: 127–129
(1988); und Chua, K.Y. et al., Journal of Experimental Medicine,
167: 175–182
(1988)), Der p II (Chua, K.Y., et al., International Archives of
Allergy and Applied Immunology, 91: 118-123 (1990)), Der f I (Dilworth,
R.J. et al., Clinical and Experimental Allergy 21: 25–32 (1991)),
Der f II (Yuuki, T., et al., Japan Journal Allergol., 39: 557–461 (1990);
und Trudinger, M. et al., Clinical and Experimental Allergy, 21:
33–37
(1991)) und eines Niedermolekulargewichtsallergens (Ovey, E.R.,
et al., Journal of Experimental Medicine, 170: 1457–1462 (1989)).
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Die
veröffentlichten
Nukleotidsequenzen von cDNAs, die Der p I und Der f I codieren,
zeigen, dass diese beiden Proteine auf der Aminosäureebene
in hohem Maße
homolog sind (81 % Iden tität)
und dass die reifen Proteinprodukte 222 bzw. 223 Reste umfassen
(Chua, K.Y.et al., Journal of Experimental Medicine, 167: 175–182 (1988);
und Dilworth, R.J. et al., siehe oben)). Die Proteinallergene Der
p II und Der f II umfassen beide 129 Reste und sind ebenfalls in
hohem Maße
homolog (88 % Identität)
in ihrer Aminosäuresequenz
(Trudinger, M. et al., siehe oben; Yuuki, T., et al., siehe oben);
Chua, K.Y., et al., International Archives of Allergy and Applied
Immunology 91: 118–1223
(1990)).
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Die
Isolierung von cDNA-Klonen, die Der p I und Der p II codieren, hat
Antikörperbindungsstudien
an rekombinanten Antigenen ermöglicht
(Gree, W.K., et al., International Archives of Allergy and Applied
Immunology, 92: 30–38
(1990); Chua, K.Y., et al., International Archives of Allergy and
Applied Immunology, 91: 124–129
(1990)). Komplementäre
DNA-Fragmente von Der p I wurden in E. coli exprimiert und IgE-Bindungsstudien
mit gepoolten humanen Milbenallergen-IgE-Seren haben bindende und
nicht-bindende Regionen im gesamten Molekül gezeigt (Thomas, W.R., et
al., In: Epitopes of Atopic Allergens, Proceedings of Workshop from
XIV Congress of the European Academy of Allergy and Clinical Immunology,
Berlin, Sept. 1989, Seiten 77–82).
Die T-Zell-Epitope von Der p I wurden berichtet (O'Hehir, R.E., et al.,
Annual Review Immunology, 9: 67–95
(1991); Stewart, G.A., et al., In: Epitopes of Atopic Allergens,
Proceedings of Workshop from XIV Congress of the European Academy
of Alleregy and Clinical Immunology, Berlin, Sept. 1989, Seiten
41–47;
Yessel, H. et al., In: T cell Activation in Health and Disease:
Discrimination Between Immunity and Tolerance. Conference 22–26 Sept.,
1990, Trinity College, Oxford, U.K. und Hessel, H. et al., Journal
of Immunology, 148 (3): 738–745
(Feb. 1, 1992).
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt isolierte modifizierte Peptide der
Hauptproteinallergene der Art Dermatophagoides bereit, wie in den
Ansprüchen
definiert.
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Ebenfalls
bereitgestellt werden Peptide der Erfindung, die weiter modifiziert
wurden, und die ähnliche oder
bessere pharmazeutische Eigenschaften als die entsprechenden natürlich vorkommenden
Allergene oder Anteile hiervon zeigen, die jedoch reduzierte Nebenwirkungen
aufweisen, ebenso wie modifizierte Peptide, die verbesserte Eigenschaften
wie beispielsweise erhöhte
Löslichkeit
und Stabilität
aufweisen. Peptide der Erfindung sind dazu in der Lage, in einem
Hausstaubmilben-empfindlichen Individuum, dem sie verabreicht werden,
die allergische Reak tion des Individuum gegenüber einem Hausstaubmilbenallergen
oder einem Allergen, das immunologisch mit einem Hausstaubmilbenallergen
kreuzreaktiv ist, zu modifizieren. Verfahren zur Behandlung oder
zur Diagnose der Empfindlichkeit gegenüber Hausstaubmilben in einem
Indivduum und therapeutische Zusammensetzungen, die ein oder mehrere
Peptide der Erfindung umfassen, sind ebenfalls beschrieben.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 zeigt
das Subklonieren und die Expression von Allergenen der Gruppe I
und Gruppe II von D. Pteronyssinus und D. farinae.
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2a zeigt Adaptoren, die bei der Expression von
Der p I und Der f I verwendet werden, und 2b zeigt
Primer für
die Amplifikation von Der f II und Der p II und einen Der f II Mutagenese-Primer.
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3 zeigt
verschiedene Peptide der erwünschten
Länge,
abgeleitet von den Der p I und Der p II Proteinallergenen.
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4 zeigt
verschiedene Peptide erwünschter
Länge,
die aus den Der f I und Der f II Proteinallergenen abgeleitet sind.
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5 ist
eine graphische Darstellung, die die Reaktionen der T-Zell-Linien
von 33 Patienten zeigt, die in vitro gegenüber entweder aufgereinigten
nativen (N) oder rekombinanten (R) Der p I Proteinen geprimed und
bezüglich
einer Reaktion gegenüber
verschiedenen überlappenden
Der p I Peptiden durch die prozentuale Reaktion mit einem T-Zell-Stimulationsindex
(S.I.) von zumindest 2 innerhalb der getesteten Individuen, dem durchschnittlichen
T-Zell-Stimulationsindex
positiver Reaktionen für
das Peptid und der Rangsumme der Peptidreaktionen analysiert wurden.
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6 ist
eine graphische Darstellung, die die Reaktionen der T-Zell-Linien
von 16 Patienten zeigt, die in vitro gegenüber dem Der f I Protein geprimed
und bezüglich
einer Reaktion auf verschiedene überlappende Der
f I Peptide durch prozentuale Reaktionen mit einem S.I. von zumindest
2 innerhalb den geteste ten Individuen, der durchschnittlichen T-Zell-Stimulationsindizes
positiver Reaktionen für
das Peptid und der Rangsumme von Peptidreaktionen analysiert wurden.
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7 ist
eine graphische Darstellung, die die Reaktionen von T-Zell-Linien
aus 14 Patienten zeigt, die in vitro gegenüber dem Der p I Protein geprimed
und bezüglich
einer Reaktion auf verschiedene überlappende Der
p I Peptide und im Wesentlichen übereinstimmende
Der f I Peptide durch Prozentzahlen der Reaktionen mit einem S.I.
von zumindest 2 innerhalb der getesteten Individuen, dem durchschnittlichen
T-Zell-Stimulationsindex positiver Reaktionen für das Peptid und der Rangsumme
der Peptidreaktionen analysiert wurden.
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8 ist
eine graphische Darstellung, die die Reaktionen der T-Zell-Linien
von acht Patienten zeigt, die in vitro gegenüber dem Der f I Protein geprimed
wurden und die für
eine Reaktion gegenüber
verschiedene überlappende
Der f I Peptide und im Wesentlichen übereinstimmende Der p I Peptide
durch prozentuale Reaktionen mit einem S.I. von zumindest zwei innerhalb
der getesteten Individuen, dem durchschnittlichen T-Zell-Stimulationsindex
positiver Reaktionen für
das Peptid und der Rangsumme von Peptidreaktionen untersucht wurden.
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9 ist
eine graphische Darstellung, die die Reaktionen der T-Zell-Linien
von 29 Patienten zeigt, die in vitro gegenüber dem Der p II Protein geprimed
wurden und bezüglich
einer Reaktion gegenüber
verschiedene überlappende
Der p II Peptide durch prozentuale Reaktionen mit einem S.I. von
zumindest 2 innerhalb der getesteten Individuen, dem durchschnittlichen
T-Zell-Stimulationsindex
positiver Reaktionen für
das Peptid und der Rangsumme von Peptidreaktionen untersucht wurden.
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10 ist eine graphische Darstellung, die die Reaktionen
von T-Zell-Linien aus 10 Patienten zeigt, die in vitro gegenüber dem
Der f II Protein geprimed wurden und die bezüglich einer Reaktion gegenüber verschiedene überlappende
Der f II Peptide durch prozentuale Reaktionen mit einem S.I. von
zumindest 2 innerhalb der getesteten Individuen, dem durchschnittlichen
T-Zell- Stimulationsindex
positiver Reaktionen für
das Peptid und der Rangsumme der Peptidreaktionen analysiert wurden.
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11 ist eine graphische Darstellung, die die Reaktionen
der T-Zell-Linien aus 10 Patienten zeigt, die in vitro gegenüber dem
Der f II Protein geprimed wurden und die bezüglich einer Reaktion gegenüber verschiedene überlappende
Der f II Peptide und im Wesentlichen übereinstimmende Der p II Peptide
durch prozentuale Reaktionen mit einem S.I. von zumindest 2 innerhalb
der getesteten Individuen, dem durchschnittlichen T-Zell-Stimulationsindex
positiver Reaktionen für
das Peptid und der Rangsumme von Peptidreaktionen analysiert wurden.
-
12 ist eine graphische Darstellung, die die Reaktionen
von T-Zell-Linien aus 26 Patienten zeigt, die in vitro gegenüber dem
Der p II Protein geprimed wurden und die bezüglich einer Reaktion gegenüber verschiedene überlappende
Der f II Peptide durch prozentuale Reaktionen mit einem S.I. von
zumindest 2 innerhalb der getesteten Individuen, dem durchschnittlichen
T-Zell-Stimulationsindex
positiver Reaktionen für
das Peptid und der Rangsumme der Peptidreaktionen analysiert wurden.
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13 ist eine graphische Darstellung, die die Reaktionen
von T-Zell-Linien aus 33 Patienten darstellt, die in vitro gegenüber dem
Der p II Protein geprimed wurden und die bezüglich einer Reaktion auf ausgewählte Peptide
erwünschter
Längen,
abgeleitet aus dem Der p I Proteinallergen, durch prozentuale Reaktionen
mit einem S.I. von zumindest 2 innerhalb der getesteten Individuen,
dem durchschnittlichen T-Zell-Stimulationsindex positiver Reaktionen
für das
Peptid und der Rangsumme der Peptidreaktionen analysiert wurden.
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14 ist eine graphische Darstellung, die die Reaktionen
von T-Zell-Linien aus 9 Patienten darstellt, die in vitro gegenüber dem
Der p I Protein geprimed wurden und bezüglich einer Reaktion auf ausgewählte Peptide
erwünschter
Länge,
die aus dem Der f I Proteinallergen abgeleitet waren, durch prozentuale
Reaktionen mit einem S.I. von zumindest 2 innerhalb der getesteten
Individuen und dem durchschnittlichen T-Zell-Stimulationsindex positiver
Reaktionen für
das Peptid und der Rangsumme der Peptidreaktionen analysiert wurden.
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15a ist eine graphische Darstellung, die die Reaktionen
von T-Zell-Linien aus 30 übereinstimmenden
bzw. gepaarten Patienten darstellt, die in vitro gegenüber dem
Der p I Protein geprimed wurden und die bezüglich einer Reaktion gegenüber ausgewählten Peptiden
erwünschter
Länge,
die aus den Der p I und den Der f Proteinallergenen gewonnen wurden,
durch prozentuale Reaktionen mit einem S.I. von zumindest 2 innerhalb
der getesteten Individuen und dem durchschnittlichen T-Zell-Stimulationsindex
positiver Reaktionen für
das Peptid analysiert wurden.
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15b ist eine graphische Darstellung, die aus denselben
wie in 15a dargestellten Daten gewonnen
wurde, und zeigt die Reaktion der Der p I geprimten T-Zellen gegenüber bevorzugten
Der p I Peptiden, analysiert durch prozentuale Reaktion mit einem
S.I. von zumindest 2 innerhalb der getesteten Individuen (oberhalb
jedes Balkens), dem durchschnittlichen T-Zell-Stimulationsindex
(oberhalb jedes Balkens in Klammern) und der Rangsumme der Peptidreaktionen.
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16a ist eine graphische Darstellung, die die Reaktionen
der T-Zell-Linien aus 9 Patienten darstellt, die in vivo gegenüber dem
Der p I Protein geprimed wurden und bezüglich einer Reaktion gegenüber ausgewählten Peptiden
erwünschter
Länge,
abgeleitet aus den Der f I und Der p I Proteinallergenen, durch
prozentuale Reaktionen mit einem S.I. von zumindest 2 innerhalb
der getesteten Individuen und dem durchschnittlichen T-Zell-Stimulationsindex
von Reaktionen mit einem S.I. von zumindest 2 für das Peptid analysiert wurden.
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16b ist eine graphische Darstellung, die aus denselben
wie in 16a dargestellten Daten gewonnen
wurde, und zeigt die Reaktion der Der p I geprimten T-Zell-Linien gegenüber bevorzugten
Der f I und Der p I Peptiden durch prozentuale Reaktionen mit einem
S.I von zumindest 2 innerhalb der getesteten Individuen und dem
durchschnittlichen T-Zell-Stimulationsindex von Reaktionen mit einem
S.I. von zumindest 2 für das
Peptid.
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17a ist eine graphische Darstellung, die die Reaktion
von T-Zellen aus 29 Patienten zeigt, die in vitro gegenüber dem
Der p II Protein geprimed wurden und die bezüglich einer Reaktion gegenüber ausgewählten Peptiden
erwünschter
Länge,
die aus dem Der p II Protein abgeleitet wurden, durch T-Zell-Stimulationsindex
einer Reaktion mit einem S.I. von zumindest 2 für das Peptid analysiert wurden.
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17b ist eine graphische Darstellung, die die Reaktion
von 30 Patienten, die in vitro gegenüber dem Der p II Protein geprimed
und bezüglich
einer Reaktion auf ausgewählte
Peptide, die vom Der p II abgeleitet wurden, durch prozentuale Reaktionen
mit einem S.I. von zumindest 2 innerhalb der getesteten Individuen (oberhalb
jedes Balkens), dem durchschnittlichen T-Zell-Stimulationsindex
(oberhalb jedes Balkens in Klammern) und der Rangsumme der Peptidreaktionen
(x-Achse) analysiert wurden.
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18a ist eine graphische Darstellung, die die Reaktion
von T-Zellen aus 10 Patienten zeigt, die in vitro gegenüber dem
Der p II Protein geprimed und bezüglich einer Reaktion auf ausgewählte Peptide
erwünschter
Länge,
die aus den Der p II und Der f II Protein abgeleitet waren, durch
den T-Zell-Stimulationsindex einer Reaktion mit einem S.I. von zumindest
2 für das
Peptid untersucht wurden.
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18b ist eine graphische Darstellung, die aus denselben
Daten, wie sie in 18a dargestellt sind, gewonnen
wurde, und zeigt die Reaktion der Der f II geprimten T-Zell-Linien
gegenüber
bevorzugten Der p II Peptiden, die durch prozentuale Reaktionen
mit einem S.I. von zumindest 2 innerhalb der getesteten Individuen
(oberhalb jedes Balkens), dem durchschnittlichen T-Zell-Stimulationsindex
(oberhalb jedes Balkens in Anführungsstrichen)
und der Rangsumme der Peptidreaktionen (x-Achse) untersucht wurden.
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18c ist eine graphische Darstellung, die die Reaktionen
der T-Zell-Linien aus 4 gematchten bzw. paarweise ausgesuchten Patienten
darstellt, die in vitro mit dem Milben-Gruppe-I-Allergen geprimed
und bezüglich
einer Reaktion gegenüber
bevorzugten Der p I und Der f I Peptiden durch prozentuale Reaktionen
mit einem S.I. von zumindest 2 innerhalb der getesteten Individuen
und dem durchschnittlichen T-Zell-Stimulationsindex positiver Reaktionen
für das
Peptid untersucht wurden.
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18d ist eine graphische Darstellung, die die Reaktionen
von T-Zell-Linien aus 6 paarweise ausgesuchten Patienten zeigt,
die in vitro mit Milben-Gruppe-II-Allergen geprimed und bezüglich einer
Reaktion gegenüber
bevorzugten Der p II Peptiden durch prozentuale Reaktionen mit einem
S.I. von zumindest 2 innerhalb der Individuen, die getestet wurden,
und dem durchschnittlichen Stimulationsindex positiver Reaktionen
für das
Peptid untersucht wurden.
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19a–19b sind graphische Darstellungen der Ergebnisse
eines Direktbindungsassays von IgE gegenüber Affinitäts-aufgereinigten und rekombinanten
Der p I und Der p II Proteinen und bestimmten Der p I und Der p
II überlappenden
Peptiden.
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20a–20b sind graphische Darstellungen der Ergebnisse
eines direkten Bindungsassays von IgE an Affinitäts-aufgereinigte und rekombinante
Der f I und Der f II Proteinen und bestimmter Der f I und Der f
II überlappender
Peptide.
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21a–21h sind graphische Darstellungen der Ergebnisse
eines Direktbindungsassays von IgE an ein Gemisch biochemisch aufgereinigter
Milbenallergene (PMA) und verschiedener Peptide, die aus Der p I,
Der f I, Der p II und Der f II abgeleitet wurden.
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22 ist eine zusammengesetzte Anordnung bzw. Alignment
der Aminosäuresequenzen
von fünf Der
p I Klonen (a) bis (e), die den Polymorphismus im Der p I Protein
darstellt. Die Nummerierung betrifft die Sequenz des Der p I (a)
Klons. Das Symbol (–)
wird verwendet, darauf hinzuweisen, dass der Aminosäurerest eines
Der p I Klones mit den entsprechenden Aminosäuresequenzen von Der p I (a)
an dieser Position identisch ist. Die Aminosäuresequenzen dieser Klone zeigen,
dass eine signifikante Variation in Der p I vorliegen kann, mit
fünf polymorphen
Aminosäureresten,
die in den fünf
Sequenzen zu finden sind.
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23 ist ein zusammengesetztes Alignment der Aminosäuresequenzen
von drei Der p II Klonen (c), (1) und (2), die den Polymorphismus
im Der p II Protein veranschaulicht. Die Nummerierung betrifft die
Sequenz des Der p II (c) Klons. Das Symbol (.) wird verwendet, darauf
hinzuweisen, dass der Aminosäurerest eines
Der p II Klons mit dem entsprechenden Aminosäurerest von Der p II (c) in
dieser Position identisch ist.
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24 ist ein zusammengesetztes Alignment der Aminosäuresequenzen
von sechs Der f II Klonen (d. h. pFL1, pFL2, MT3, MT5, MT18 und
MT16), das den Polymorphismus des Der f II Proteins zeigt. Die Bezifferung
betrifft die Sequenzen des Der f pLF1 Klons. Das Symbol (.) wird
dazu verwendet, anzuzeigen, dass der Aminosäurerest eines Der f II Klons
mit dem entsprechenden Aminosäurerest
von Der f II pFL1 in dieser Position identisch ist.
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25 zeigt die Aminosäuresequenzen der modifizierten
Peptide.
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26 zeigt die Aminosäuresequenz von modifizierten
Peptiden gemäß der Erfindung.
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt isolierte modifizierte Peptide bereit,
die von den Hauptproteinallergenen der Art Dermatophagoides abgeleitet
sind, wie sie in den Ansprüchen
definiert sind. Wie hierin definiert, betrifft ein Peptid oder Fragment
eines Proteins eine Aminosäuresequenz,
die weniger Aminosäurereste
als die gesamte Aminosäuresequenz
des Proteins aufweist. Wie hierin verwendet, betrifft ein modifiziertes
Peptid ein Peptid, das von einem Proteinallergen der Art Dermatophagoides
abgeleitet ist, dessen Aminosäuresequenz
durch Aminosäuresubstitution,
Deletion oder Addition verändert
wurde.
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Isolierte
Peptide der vorliegenden Erfindung können durch DNA-Rekombinationstechniken
in einer Wirtszelle hergestellt werden, die mit einer Nukleinsäure mit
einer Sequenz transformiert wurde, die ein solches Peptid codiert.
Die isolierten Peptide der vorliegenden Erfindung können ebenfalls
durch chemische Synthese hergestellt werden. In bestimmten beschränkten Situationen können isolierte
Peptide durch chemische Spaltung des Proteinallergens erzeugt werden.
Wenn ein Peptid durch Rekombinationstechniken erzeugt wird, werden
Wirtszellen, die mit einer Nucleinsäure mit einer Sequenz, die
das Peptid codiert oder das funktionelle Äquivalent er Nucleinsäuresequenz,
in einem Medium kultiviert, das für die Zellen geeignet ist,
und die Peptide können
aus dem Zellkulturmedium, den Wirtszellen oder beidem unter Verwendung
von Techniken aufgereinigt werden, die in der Technik der Aufreinigung
von Peptiden und Proteinen bekannt sind, einschließlich Ionenaustauscherchromatographie,
Gelfiltrationschromatographie, Ultrafiltration, Elektrophorese oder
Immunaufreinigung mit Antikörpern,
die für
das Peptid spezifisch sind, das Proteinallergen der Art Dermatophagoides, von
der das Peptid abgeleitet ist, oder einen Teil hiervon. Isolierte
Peptide der Erfindung sind im Wesentlichen frei von zellulärem Material
oder Kulturmedium, wenn sie durch DNA-Rekombinationstechniken erzeugt
werden, oder sind im Wesentlichen frei von chemischen Vorläufern oder
anderen Chemikalien, wenn sie chemisch synthetisiert werden.
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Die
vorliegende Erfindung stellt Expressionsvektoren und Wirtszellen
bereit, die zum Exprimieren der Nucleinsäuresequenzen der Erfindung
transformiert wurden. Eine Nucleinsäuresequenz, die ein Milbenallergen
oder zumindest ein Fragment hiervon codiert, kann in bakteriellen
Zellen wie beispielsweise E. coli, Insektenzellen (Baculovirus),
Hefe- oder Säugetierzellen
wie beispielsweise Chinesischen-Hamster-Ovarzellen (CHO) exprimiert
werden. Geeignete Expressionsvektoren, Promotoren, Enhancer und
andere Expressionskontrollelemente können in Sambrook et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) gefunden werden.
Weitere geeignete Expressionsvektoren, Promotoren, Enhancer und
andere Expressionselemente sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt.
Eine Expression in Säugetier-,
Hefe- oder Insektenzellen führt
zur teilweisen oder vollständigen
Glycosylierung des rekombinanten Materials und zur Bildung irgendwelcher
Inter- oder Intrakettendisulfidbrücken. Geeignete Vektoren zur
Expression in Hefe schließen
YepSec1 (Baldari et al. (1987), Embo J. 6: 229–234); pMFa (Kurjan und Herskowitz
(1982), Cell 30: 933–943);
JRY88 (Schultz et al. (1987), Gene 54: 113–123) und pYES2 (Invitrogen
Corporation, San Diego, CA) ein. Diese Vektoren sind frei erhältlich.
Baculovirus- und Säugetierexpressionssysteme
sind ebenfalls verfügbar.
Beispielsweise ist ein Baculovirus-System kommerziell erhältlich (PharMingen,
San Diego, CA) zur Expression in Insektenzellen, während der pMSG-Vektor
zur Expression in Säugetierzellen
kommerziell erhältlich
ist (Pharmacia, Piscataway, NJ).
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Zur
Expression in E. coli schließen
geeignete Expressionsvektoren u. a. pTRC (Amann et al. (1988), Gene
69: 301–315);
pGEX (Amrad Corp., Melbourne, Australien); pMAL (N.E. Biolabs, Beverly,
MA); pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ); pET-11d (Novagen, Madison
WI); Jameel et al. (1990), J. Virol. 64: 3963–3966; und pSEM (Knapp et al.
(1990), BioTechniques 8: 280–281)
ein. Die Verwendung von pTRC und pET-11d wird beispielsweise zur
Expression des unfusionierten Proteins führen. Die Verwendung von pMAL,
pRIT5, pSEM und pGEX wird zur Expression eines Allergens führen, das
an Maltose-E-Bindungsprotein (pMAL), Protein A (pRIT5), trunkierte β-Galactosidase
(PSEM) oder Glutathion-S-Transferase (pGEX) fusioniert wird. Wenn
ein Milbenproteinallergen, Fragment oder Fragmente hiervon als Fusionsprotein
exprimiert wird, ist es besonders vorteilhaft, eine enzymatische
Spaltstelle an der Fusionskreuzung zwischen dem Trägerprotein
und einem Milbenproteinallergen oder Fragment hiervon einzubringen.
Ein Milbenproteinallergen oder Fragment hiervon kann dann aus dem
Fusionsprotein durch enzymatische Spaltung an der enzymatischen
Stelle und durch biochemische Aufreinigung unter Verwendung konventioneller
Techniken zur Aufreinigung von Proteinen und Peptiden gewonnen werden.
Geeignete enzymatische Spaltstellen schließen solche für Blutgerinnungsfaktor Xa
oder Thrombin ein, für
die die geeigneten Enzyme und Vorschriften zur Spaltung kommerziell
beispielsweise von Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, und N.E.
Biolabs, Beverly, MA, erhältlich
sind. Die unterschiedlichen Vektoren weisen ebenfalls unterschiedliche
Promotorregionen auf, die eine konstitutive oder induzierbare Expression
beispielsweise mit IPTG-Induktion (PRTC, Amann et al. (1988), siehe
oben; pET-11d, Novagen, Madison, WI) oder Temperaturinduktion (pRIT5,
Pharmacia, Piscataway, NJ), ermöglichen.
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Um
isolierte Peptide der vorliegenden Erfindung zu gewinnen, wird ein
Milbenallergen in zwei nicht-überlappende
Peptide der erwünschten
Länge oder überlappende
Peptide von erwünschten
Längen
wie in Beispiel III diskutiert aufgeteilt, die rekombinant, synthetisch
oder in bestimmten limitierten Situationen durch chemische Spaltung
des Allergens hergestellt werden können. Peptide, die zumindest
ein T-Zell-Epitop umfassen, sind dazu in der Lage, eine T-Zell-Reaktion
auszulösen,
wie beispielsweise eine Stimulierung (d. h. Proliferation oder Lymphokin-Sekretion),
und/oder sind dazu in der Lage, eine T-Zell-Anergie (d. h. Tolerierung) zu
induzieren. Um Peptide zu bestimmen, die zumindest ein T-Zell-Epitop
umfassen, werden isolierte Peptide beispielsweise durch T-Zell-Biologietechniken
getestet, um zu bestimmen, ob die Peptide eine T-Zell-Reaktion hervorrufen oder eine
T-Zell-Anergie induzieren. Solche Peptide, von denen sich herausstellt,
dass sie eine T-Zell-Reaktion zeigen oder eine T-Zell-Anergie induzieren,
werden als eine T-Zell-stimulierende Aktivität aufweisend definiert.
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Wie
in den Beispielen diskutiert wird, kann eine humane T-Zell-stimulierende
Aktivität
durch Kultivieren von T-Zellen, die aus einem gegenüber einem
Milbenallergen empfindlichen Individuum gewonnen werden (d. h. ein
Individuum, das eine IgE-vermittelte Immunreaktion gegenüber ein
Milbenallergen aufweist) mit einem Peptid getestet werden, das aus
dem Allergen abgeleitet wird, und unter Bestimmung, ob eine Proliferation
von T-Zellen in Reaktion auf das Peptid wie gemessen eintritt, beispielsweise
durch zelluläre
Aufnahme des mit Tritium versehenen (tritiierten) Thymidins. Die
Stimulationsindizes für
Reaktionen durch T-Zellen gegenüber Peptide
können
als maximale CPM in Reaktion gegen ein Peptid berechnet werden,
geteilt durch die Kontroll-CPM. Ein T-Zell-Stimulationsindex (S.I)
gleich oder mehr als zweimal das Hintergrundniveau wird als „positiv" bezeichnet. Positive
Ergebnisse werden dazu verwendet, den durchschnittlichen Stimulationsindex
für jedes
Peptid der Gruppe der getesteten Peptide zu berechnen. Bevorzugte
Peptide dieser Erfindung umfassen zumindest ein T-Zell-Epitop und
weisen einen durchschnittlichen T-Zell-Stimulationsindex von mehr
als oder gleich 2,0 auf. Ein Peptid mit einem T-Zell-Stimulationsindex
von mehr als oder gleich 2,0 wird als als therapeutisches Mittel
nützlich
angesehen. Bevorzugte Peptide weisen einen durchschnittlichen T-Zell-Stimulationsindex
von zumindest 2,5, besonders bevorzugt zumindest 3,5, noch mehr
bevorzugt zumindest 4,0 und am meisten bevorzugt zumindest 5,0 auf.
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Zusätzlich weisen
bevorzugte Peptid einen Positivitätsindex (P.I.) von zumindest
ungefähr
100, besonders bevorzugt zumindest 150, noch mehr bevorzugt zumindest
200 und am meisten bevorzugt zumindest 250 auf. Der Positivitätsindex
für ein
Peptid wird durch Multiplizieren des durchschnittlichen T-Zell-Stimulationsindexes
mit den Prozent Individuen in einer Population von Individuen, die
gegenüber
Hausstaubmilben empfindlich sind (beispielsweise vorzugsweise zumindest
9 Individuen, besonders bevorzugt zumindest 16 Individuen oder mehr,
besonders bevorzugt zumindest 29 Individuen oder mehr oder noch
mehr bevorzugt zumindest 30 Individuen oder mehr), die T-Zellen
aufweisen, die gegen das Peptid reagieren, bestimmt. Somit repräsentiert
der Positivitätsindex
sowohl die Stärke
einer T-Zell-Reaktion gegenüber
einem Peptid (S.I.) als auch die Häufigkeit einer T-Zell-Reaktion
gegen ein Peptid in einer Population von Individuen, die gegenüber Hausstaubmilben
empfindlich sind.
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Um
die präzisen
T-Zell-Epitope beispielsweise durch genaue Kartierungstechniken
zu bestimmen, wird ein Peptid, das eine T-Zell-stimulierende Aktivität aufweist
und somit zumindest ein T-Zell-Epitop, wie durch T-Zell-Biologie-Techniken
bestimmt, umfasst, durch Zusatz oder De letion von Aminosäureresten
an entweder dem Amino- oder Carboxyterminus des Peptids modifiziert
und getestet, um eine Veränderung
der T-Zell-Reaktivität
gegenüber
dem modifizierten Peptid zu bestimmen. Wenn zwei oder mehrere Peptide,
die ein Überlappungsareal
in der nativen Proteinsequenz miteinander teilen, eine humane T-Zell-stimulierende
Aktivität
zeigen, wie es durch T-Zell-Biologie-Techniken bestimmt wird, können zusätzliche
Peptide erzeugt werden, die die Gesamtheit oder einen Teil solcher
Peptide umfassen und diese zusätzlichen
Peptide können durch
ein ähnliches
Verfahren getestet werden. Gemäß dieser
Technik werden Peptide ausgewählt
und rekombinant oder synthetisch erzeugt. Peptide werden auf Grundlage
verschiedener Faktoren ausgewählt,
einschließlich
der Stärke
der T-Zell-Reaktion gegenüber
dem Peptid (beispielsweise Stimulationsindex), der Frequenz der
T-Zell-Reaktion gegenüber
dem Peptid in einer Population von Individuen, die gegenüber Hausstaubmilben
empfindlich sind, und der potentiellen Kreuzreaktivität des Peptids
mit anderen Allergenen der Art Dermatophagoides. Die physikalischen
und chemischen Eigenschaften dieser ausgewählten Peptide (beispielsweise
Löslichkeit,
Stabilität)
werden überprüft, um zu
bestimmen, ob die Peptide zur Verwendung in therapeutischen Zusammensetzungen
geeignet sind oder ob die Peptide eine Modifikation erfordern, wie
hierin beschrieben ist. Das Vermögen
der ausgewählten
Peptide oder ausgewählten
modifizierten Peptide, humane T-Zellen zu stimulieren (beispielsweise
eine Proliferation, Lymphokin-Sekretion
zu induzieren), wird bestimmt.
-
Zusätzlich binden
bevorzugte Peptide der Erfindung Immunglobulin E (IgE) nicht oder
binden IgE in einem wesentlich geringeren Umfang als das Proteinallergen,
aus dem das Peptid abgeleitet ist, IgE bindet. Die Hauptkomplikationen
einer Standardimmuntherapie sind IgE-vermittelte Reaktionen wie beispielsweise eine
Anaphylaxie. Immunglobulin E ist ein Mediator anaphylaktischer Reaktionen,
die sich aus der Bindung und Vernetzung eines Antigens an IgE an
Mastzellen oder Basophilen ergeben, und der Freisetzung von Mediatoren
(beispielsweise Histamin, Serotonin, Eosinophil-Chemotaxisfaktoren).
Somit könnte
eine Anaphylaxie zu einem beträchtlichen
Prozentsatz der Population von Individuen, die gegenüber Hausstaubmilben
empfindlich sind, durch Verwendung eines Peptids oder von Peptiden
in der Immuntherapie vermieden werden, die IgE nicht in einem beträchtlichen
Prozentsatz (beispielsweise zumindest ungefähr 75 %) einer Population von
Individuen, die gegenüber
einem Hausstaubmilbenallergen empfindlich sind, binden oder wenn
das Peptid IgE bindet, resultiert eine solche Bindung nicht in der
Freisetzung von Mediatoren aus Mastzellen oder Basophilen. Das Risiko
einer Anaphylaxie könnte
durch Verwendung eines Peptids oder von Peptiden, die eine reduzierte IgE-Bindung
aufweisen, in der Immuntherapie, reduziert werden. Überdies
sind Peptide, die eine minimale IgE-stimulierende Aktivität aufweisen,
für die
therapeutische Effizienz erwünscht.
Eine minimale IgE-stimulierende Aktivität betrifft die IgE-Produktion,
die geringer als die Menge der IgE-Produktion und/oder IL-4-Produktion
ist, die durch das native Proteinallergen stimuliert wird (beispielsweise
Der pI).
-
Ein
Peptid der vorliegenden Erfindung ist, wenn es einem Hausstaubmilben-empfindlichen
Individuum verabreicht wird, dazu in der Lage, die allergische Reaktion
des Individuums gegenüber
dem Allergen zu modifizieren. Insbesondere sind Peptide der Erfindung,
die zumindest ein T-Zell-Epitop
eines Milbenallergens oder zumindest zwei Regionen, die aus einem
Milbenallergen abgeleitet sind, umfassen, die jeweils zumindest ein
T-Zell-Epitop umfassen, wenn sie einem gegenüber Hausstaubmilben empfindlichen
Individuum verabreicht werden, dazu in der Lage, die T-Zell-Reaktion
des Individuums gegenüber
dem Allergen zu modifizieren. Wie hierin verwendet, kann die Modifikation
der allergischen Reaktion eines Individuums gegenüber einem Hausstaubmilbenallergen
als Nicht-Ansprechbarkeit oder Verminderung der Symptome definiert
werden, nach Exposition gegenüber
einem Milbenallergen, wie es durch klinische Standardprozeduren
bestimmt wird (siehe beispielsweise Varney et al., British Medical
Journal 302: 265-269 (1990)), einschließlich einer Verringerung der
Hausstaubmilbenallergen-induzierten Asthma-Symptome. Wie hierin bezeichnet, schließt eine
Verringerung von Symptomen jede Reduktion der allergischen Reaktion
eines Individuums gegenüber
einem Allergen ein, nachdem das Individuum eine Behandlungsvorschrift
mit einem Peptid oder Protein der Erfindung abgeschlossen hat. Diese
Verringerung kann subjektiv sein (d. h. der Patient fühlt sich
in Gegenwart des Allergens besser). Eine Verringerung der Symptome
kann klinisch ebenso unter Verwendung von Standard-Hauttests bestimmt
werden, wie es in der Technik bekannt ist.
-
Als
Ergebnis der hierin beschriebenen Arbeiten wurden modifizierte Peptide,
die aus Milbenallergenen abgeleitet waren, die zumindest ein T-Zell-Epitop
umfassen, hergestellt. Es wird angenommen, dass T-Zell-Epitope in
die Initiation und Perpetuation der Immunreaktionen gegen Hausstaubmilben
involviert sind, die für
die klinischen Symptome einer Milbenallergie verantwortlich sind.
Diese T-Zell-Epitope lösen
angenommenermaßen
Frühereignisse
auf der Ebene der T-Helferzellen durch Bindung an ein geeignetes
HLA-Molekül auf
der Oberfläche
einer Antigen-präsentierenden
Zelle aus und stimulieren die relevante T-Zell-Subpopulation. Diese
Ereignisse führen
zu einer T-Zell-Proliferation, Lymphokin-Sekretion, lokalen Entzündungsreaktionen,
der Rekrutierung zusätzlicher
Immunzellen an den Ort und der Aktivierung der B-Zell-Kaskade, die zur Erzeugung
von Antikörpern
führt.
Ein Isotyp dieser Antikörper,
IgE, ist funda mental bedeutend bei der Entwicklung von allergischen
Symptomen, und seine Produktion wird früh in der Kaskade von Ereignissen
auf der Ebene der T-Helferzellen durch die Art der sezernierten
Lymphokine beeinflusst. Ein T-Zell-Epitop ist das Basis-Element
oder die kleinste Einheit der Erkennung durch einen T-Zell-Rezeptor,
wobei das Epitop Aminosäurereste
umfasst, die für
die Rezeptorerkennung essentiell sind, die in der Aminosäuresequenz
des Proteins benachbart und/oder nicht-benachbart sein können. Aminosäuresequenzen,
die solche von T-Zell-Epitopen nachahmen
und die die allergische Reaktion gegenüber Proteinallergenen der Art
Dermatophagoides modifizieren, liegen innerhalb des Umfangs dieser
Erfindung.
-
Die
Exposition von Milbenallergie-Patienten gegenüber Peptiden der vorliegenden
Erfindung kann geeignete T-Zell-Subpopulationen der Art tolerieren
oder anergisieren, dass sie gegenüber Milbenallergenen nicht
mehr ansprechbar sind und am allmählichen Anwachsen einer Immunreaktion
nach einer solchen Exposition nicht mehr teilnehmen. Zusätzlich kann
die Verabreichung eines Peptids der vorliegenden Erfindung das Lymphokin-Sekretionsprofil
im Vergleich mit der Exposition gegenüber dem natürlich vorkommenden Milbenproteinallergen
oder Teilen hiervon modifizieren (beispielsweise hat es eine Abnahme
von IL-4 und/oder eine Zunahme an IL-2 zur Folge). Weiterhin kann
eine Exposition gegenüber
einem Peptid der Erfindung T-Zell-Subpopulationen beeinflussen, die normalerweise
an der Reaktion gegenüber
Milbenallergenen teilnehmen, derart, dass diese T-Zellen von dem
Ort einer normalen Exposition gegenüber dem Allergen weggezogen werden
(beispielsweise Nasenschleimhaut, Haut oder Lunge), hin zum Ort
der therapeutischen Verabreichung des Peptids. Diese Umverteilung
von T-Zell-Subpopulationen
kann das Vermögen
des individuellen Immunsystems, eine Immunreaktion am Ort einer
normalen Exposition gegenüber
dem Milbenallergenen entstehen zu lassen, lindern oder reduzieren,
was eine Verringerung der allergischen Symptome zur Folge hat.
-
Für Zwecke
der therapeutischen Wirksamkeit umfassen therapeutische Zusammensetzungen
vorzugsweise zumindest zwei T-Zell-Epitope eines Milbenallergens.
Demgemäß umfassen
isolierte Peptide vorzugsweise zumindest zwei T-Zell-Epitope und
demgemäß umfasst
das Peptid zumindest ungefähr
8 Aminosäurereste
und vorzugsweise 15 Aminosäurereste.
Zusätzlich
umfassen therapeutische Zusammensetzungen eine ausreichende Prozentzahl
der T-Zell-Epitope des gesamten Proteinallergens derart, dass eine
therapeutische Vorschrift der Verabreichung der Zusammensetzung
an ein Individuum, das gegenüber
der Hausstaubmilbe empfindlich ist, zur Folge hat, dass T-Zellen
des Individuums gegenüber
dem Proteinallergen eine Toleranz entwickeln. Synthetisch produzierte
Peptide der Erfindung sind besonders wünschenswert, weil Zunahmen der
Länge Schwierigkeiten
in der Peptidsynthese ebenso wie in der Retention einer unerwünschten
Eigenschaft (beispielsweise Immunglobulin-Bindung oder enzymatische
Aktivität)
aufgrund der Aufrechterhaltung einer Konformationsähnlichkeit
zwischen dem Peptid und dem Proteinallergen, von dem es abgeleitet
ist, zur Folge haben.
-
Die
individuellen Peptidregionen können
produziert und getestet werden, um zu bestimmen, welche Regionen
Immunglobulin E binden, das für
ein Milbenallergen spezifisch ist, und welche solcher Regionen die Freisetzung
von Mediatoren (beispielsweise Histamin) aus Mastzellen oder Basophilen
verursachen könnten. Solche
Peptidregionen, von denen sich herausstellt, dass sie Immunglobulin
E binden und die Freisetzung von Mediatoren aus Mastzellen oder
Basophilen in mehr als ungefähr
10 bis 15 % der allergischen Sera verursachen, die getestet wurden,
sind vorzugsweise nicht in den Peptidregionen eingeschlossen, die
angeordnet wurden, um Peptide der Erfindung zu bilden.
-
Bevorzugte
Peptide umfassen verschiedene Kombinationen von zwei oder mehr Regionen,
wobei jede Region zumindest ein T-Zell-Epitop eines Proteinallergens
der Art Dermatophagoides umfasst, wobei die Regionen aus denselben
oder unterschiedlichen Proteinallergenen der Art Dermatophagoides
abgeleitet sein können,
wobei zumindest eine Region eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus
der folgenden Gruppe ausgewählt
ist:
DP I-21.1 (SEQ ID NO: 27); DP I-21.2 (SEQ ID NO: 28);
DP I-22.1 (SEQ ID NO: 29); DP I-23.1
(SEQ ID NO: 33); DP I-25.2 (SEQ ID NO: 36); DP I-26.1 (SEQ ID NO:
37); DP-I-28.1 (SEQ ID NO: 39); DP I1 (SEQ ID NO: 9); DF I-1 (SEQ
ID NO: 72); DF I-21.1 (SEQ ID NO: 90); DF I-22.1 (SEQ ID NO: 92);
DF I-23.1 (SEQ ID NO: 95); DF I-25.1 (SEQ ID NO: 97); DP II-1 (SEQ
ID NO: 41); DP II-1.2 (SEQ ID NO: 58); DP II-2.0 (SEQ ID NO: 56);
DP II-20.3 (SEQ ID NO: 53); DP II-21 (SEQ ID NO: 62); DP II-22 (SEQ
ID NO: 63); DP II-25 (SEQ ID NO: 69); DP II-25.2 (SEQ ID NO: 71);
DF II-2 (SEQ ID NO: 104); DF II-4.5 (SEQ ID NO: 107); DF II-15 (SEQ
ID NO: 109); DF II-17 (SEQ ID NO: 111); DF II-19.1 (SEQ ID NO: 114);
DF I-22.2 (SEQ IDNO: 93); und DP II-20.6 (SEQ ID NO: 56), alle wie
in den 3 bis 4 dargestellt
und wobei zumindest eine Region eine Aminosäuresequenz umfasst, ausgewählt aus
der Gruppe, die aus Folgendem besteht:
DP I-21.7; DP I-23.10;
DP I-23.11; DP I-23.12; DP I-23.5; DP I-23.6; DP I-23.7; DP I-23.8;
DP I-23.9; DP I-26.2; DP II-20.7; DP II-22.6; DP II-22.3; DP II-22.4;
DP II-22.5; DP II-25.3; DP II-25.4;
DP I-23.13; DP I-23.14; DP I-23.15; DP I-23.16; DP I-23.17; DP I-26.3;
DP I-26.4; DP I- 26.5;
DP II-22.7; DP II-22.8; DP II-22.9; DP II-22.10; und DP II-22.11,
alle wie in 26 dargestellt, wobei zumindest
eine Region die Aminosäuresequenz
von DP I-21.7 umfasst.
-
Bevorzugte
Peptide umfassen eine Kombination von zwei oder mehreren Regionen
(wobei jede Region eine wie in den 3, 4 und 25 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist), die Folgendes
einschließen:
DP
I-21.7 und/oder DF I-22.2, DP I-23.13, DP I-26.1, DP II-20.6, DP
II-22.3, und DP II-25.2; DP I-21.2, DF I-22.2, DP I-23.10, DP I-26.2,
DP I-20.6, DP II-22.4, und DP II-25.3, DP I-21.7, DF I-22.2, DP
I-23.11, DP I-26.3, DP II-20.7, DP II-22.5, und DP II-25.4; DP I-21.7,
DF I-22.2, DP I-23.12, DP I-26.4, DP II-20.6, DP II-22.6, und DP
II-25.2; DP I-21.7, DF I-22.2, DP I-23.5, DP I-26.5, DP II-20.7,
DP II-22.7, und DP II-25.3; DP I-21.7, DF I-22.2, DP I-23.6, DP
I-26.2, DP II-20.6, DP II-22.8, und DP II-25.4; DP I-21.7, DF I-22.2,
DP I-23.7, DP I-26.3, DP II-20.7, DP II-22.9, und DP II-25.3; DP
I-21.7, DF I-22.2, DP I-23.8, DP I-26.4, DP II-20.6, DP II-22.3
und DP II-25.4; DP I-21.7, DF I-22.2, DP I-23.9, DP I-26.1, DP II-20.7,
DP II-22.4, und DP II-25.3;
DP I-21.7, DF I-22.2. DP I-23.13, DP I-26.2, DP II-20.6, DP II-22.5,
und DP II-25.4; DP I-21.7,
DF I-22.2, DP I-23.14, DP I-26.3, DP II-20.7, DP II-22.6, und DP
II-25.3; DP I-21.7, DF I-22.2,
DP I-23.15, DP I-26.4, DP II-20.6, DP II-22.6, und DP II-25.3; DP
I-21.7, DF I-22.2, DP I-23.16,
DP I-26.5, DP II-20.6, DP II-22.3, und DP II-25.4; DP I-21.7, DF
I-22.2, DP I-23.17, DP I-26.2, DP II-20.6, DP II-22.4, und DP II-25.3;
DP I-21.7, DF I-22.2, DP I-23.8, DP I-26.3, DP II-20.6, DP II-22.5,
und DP II-25.4; DP I-21.7, DF I-22.2, DP I-23.9, DP I-26.4, DP II-20.6,
DP II-22.6 und DP II-25.3; und DP I-21.7, DF I-22.2, DP I-23.5,
DP I-26.1, DP II-20.6, DP II-22.7, and DP II-25.4.
-
Zusätzliche
bevorzugte Peptide umfassen zumindest zwei der folgenden Kombination
von Regionen in irgendeiner Anordnung:
X, Y, Z, A, B, C, D,
wobei X DP I-21.2 oder DP I-21.7 ist; Y DF I-22.2 ist; Z DP I-23.1,
DP I-23.10 ist, DP I-23.11, DP I-23.12, DP I-23.13, DP I-23.14,
DP I-23.15, DP I-23.16, DP I-23.17, DP I-23.5, DP I-23.6, DP I-23.7, DP I-23.8
oder DP I-23.9 ist; A DP I-26.1, DP I-26.2, DP I-26.3, DP I-26.4,
oder DP I-26.5 ist; B DP I-20.6 oder DP II-20.7 ist; C DP II-22,
DP II-22.6, DP II-22.7, DP II-22.8, DP II-22.9, DP II-22.10, DP
II-22.11, DP II-22.3, DP II-22.4, oder DP II-22.5 ist; und D DP
II-25.2, DP II-25.3, oder DP II-25.4 ist, unter dem Vorbehalt, dass
X, Y, Z, A, B, C, D nicht die folgende Kombination von Regionen
ist: DP I-21.2, DF I-22.2, DP I-23.1, DP I-26.1, DP II-20.6, DP
II-22, und DP II-25.2, wobei zumindest eine Region DP I-21.7 umfasst.
-
Ein
weiteres bevorzugtes Peptid umfasst eine spezifische Sequenzanordnung
von Aminosäuresequenzen,
wobei die spezifische Sequenzanordnung die folgende Formel aufweist:
ADYCZBX,
wobei X DP I-21.2 oder DP I-21.7 ist; Y DF I-22.2 ist; Z DP I-23.1,
DP I-23.10, DP I-23.11, DP I-23.12, DP I-23.13, DP I-23.14, DP I-23.15,
DP I-23.16, DP I-23.17, DP I-23.5, DP I-23.6, DP I-23.7, DP I-23.8 oder
DP I-23.9 ist; A DP I-26.1, DP I-26.2, DP I-26.3, DP I-26.4, oder DP I-26.5
ist; B DP I-20.6 oder DP II-20.7 ist; C DP II-22, DP II-22.6, DP
II-22.7, DP II-22.8, DP II-22.9, DP II-22.10, DP II-22.11, DP II-22.3,
DP II-22.4, oder DP II-22.5 ist; und D DP II-25.2, DP II-25.3, oder
DP II-25.4 ist, unter dem Vorbehalt, dass ADYCZBX nicht DP I-26.1,
DP II-25.2, DF I-22.2, DP II-22, DP I-23.1, DP II-20.6 und DP I-21.2
ist, wobei zumindest eine Sequenz DP I-21.7 ist.
-
Ein
weiteres bevorzugtes Peptid umfasst eine spezifische Sequenzanordnung
von Aminosäuren,
wobei die spezifische Sequenzanordnung die folgende Formel aufweist:
DYZCAXB wobei X DP I-21.2 oder DP I-21.7 ist; Y DF I-22.2 ist; Z
DP I-23.1, DP I-23.10, DP I-23.11, DP I-23.12, DP I-23.13, DP I-23.14,
DP I-23.15, DP I-23.16, DP I-23.17, DP I-23.5, DP I-23.6, DP I-23.7,
DP I-23.8 oder DP I-23.9 ist; A DP I-26.1, DP I-26.2, DP I-26.3,
DP I-26.4, oder DP I-26.5 ist; B is DP I-20.6 oder DP II-20.7 oder;
C DP II-22, DP II-22.6, DP II-22.7, DP II-22.8, DP II-22.9, DP II-22.10,
DP II-22.11, DP II-22.3, DP II-22.4, oder DP II-22.5 ist; und D
DP II-25.2, DP II-25.3,
oder DP II-25.4 ist, unter dem Vorbehalt, dass DYZCAXB nicht DP
II-25.2, DF I-22.2, DP I-23.1, DP II-22, DP I-26.1, DP I-21.2 bzw.
DP II-20.6 ist, wobei zumindest eine Sequenz DP I-21.7 ist.
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Ein
noch weiter bevorzugtes Peptid weist eine spezifische Anordnung
von Aminosäuresequenzen
auf, wobei die spezifische Sequenzanordnung die folgende Formel
aufweist:
DXZACBY, wobei X DP I-21.2 oder DP I-21.7 ist; Y
DF I-22.2 ist; Z DP I-23.1, DP I-23.10, DP I-23.11, DP I-23.12,
DP I-23.13, DP I-23.14, DP I-23.15, DP I-23.16, DP I-23.17, DP I-23.5,
DP I-23.6, DP I-23.7, DP I-23.8 oder DP I-23.9 ist; A DP I-26.1,
DP I-26.2, DP I-26.3, DP I-26.4,
oder DP I-26.5 ist; B DP I-20.6 oder DP II-20.7 ist; C DP II-22,
DP II-22.6, DP II-22.7, DP II-22.8, DP II-22.9, DP II-22.10, DP
II-22.11, DP II-22.3, DP II-22.4, oder DP II-22.5 ist; und D DP
II-25.2, DP II-25.3, oder DP II-25.4 ist, unter dem Vorbehalt, dass
DXZACBY nicht DP II- 25.2,
DP I-21.2, DP I-23.1, DP I-26.1, DP II-22, DP II-20.6, bzw. DF I-22.2
ist, wobei zumindest eine Sequenz DP I-21.7 ist.
-
Peptide
von Proteinallergenen der Art Dermatophagoides im Umfang der Erfindung
können
in Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung allergischer Reaktionen
gegenüber
Milbenallergenen verwendet werden. Somit stellt ein Aspekt der vorliegenden
Erfindung therapeutische Zusammensetzungen bereit, die ein Peptid
oder ein modifiziertes Peptid gemäß der Erfindung und eine pharmazeutisch
verträglichen
Träger
oder Verdünnungsmittel
umfassen. In einem weiteren Aspekt umfasst die therapeutische Zusammensetzung
einen pharmazeutisch verträglichen
Träger
oder Verdünnungsmittel
und ein Peptid, das zumindest zwei Regionen umfasst, wobei jede
Region zumindest ein T-Zell-Epitop eines Milbenallergens umfasst
und aus denselben oder aus unterschiedlichen Milbenproteinallergenen
abgeleitet ist.
-
Die
Zusammensetzung umfasst eine ausreichende Prozentzahl der T-Zell-Epitope
zumindest eines Proteinallergens derart, dass eine Therapievorschrift
der Verabreichung der Zusammensetzung an ein Individuum, das gegenüber Hausstaubmilbenallergenen
empfindlich ist, zur Folge hat, dass T-Zellen des Individuums gegenüber dem
Proteinallergen eine Toleranz entwickeln. Vorzugsweise umfasst die
Zusammensetzung eine ausreichende Prozentzahl der T-Zell-Epitope
eines oder mehrere Proteinallergene, so dass zumindest ungefähr 40 %
und besonders bevorzugt zumindest 60 % der T-Zell-Reaktivität dieses
Proteins in die Zusammensetzung eingeschlossen sind. Solche Zusammensetzungen
können
dem Individuum verabreicht werden, so dass eine Empfindlichkeit
gegenüber
einer Hausstaubmilbe oder einem Allergen, das immunologisch mit Hausstaubmilben
kreuzreaktiv ist, behandelt oder eine Empfindlichkeit vermieden
wird.
-
Eine
Verabreichung der therapeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden
Erfindung zum Desensibilisieren eines Individuums kann unter Verwendung
bekannter Techniken durchgeführt
werden. Beispielsweise kann ein Peptid von einem Milbenallergen
abgeleitet werden, das zumindest ein T-Zell-Epitop umfasst, und
kann in Kombination mit einem geeigneten Verdünnungsmittel, einem Träger und/oder
einem Adjuvans, verabreicht werden. Um in einem Individuum eine
T-Zell-Anergie zu induzieren, wird die therapeutische Zusammensetzung
vorzugsweise in nicht-immunogener Form verabreicht, beispielsweise
enthält
sie keinen Zusatzstoff. Pharmazeutisch verträgliche Verdünnungsmittel schließen Salz-
und wässrige
Pufferlösungen
ein. Pharmazeutisch verträgliche
Träger
schließen
Polyethylenglykol ein (Wie et al., International Archives of Allergy
and Applied Immunology 64: 84–99
(1981)) und Liposome (Strejan et al., Journal of Neuroimmunology
7: 27 (1984)). Solche Zusammensetzungen werden im Allgemeinen durch
Injektion (subkutan, intravenös,
etc.), orale Verabreichung (beispielsweise in Fom einer Kapsel),
Inhalation, transdermale Verabreichung oder rektale Verabreichung,
verabreicht werden. Die therapeutischen Zusammensetzungen der Erfindung
werden Individuen verabreicht, die gegenüber Hausstaubmilben empfindlich
sind, in Dosierungen und für
Zeitspannen, die zur Reduzierung der Empfindlichkeit effektiv sind,
(d. h. Reduzierung der allergischen Reaktion) des Individuums gegenüber einem
Hausstaubmilbenallergen. Eine therapeutisch wirksame Menge einer
oder mehrerer derselben oder unterschiedlichen therapeutischen Zusammensetzungen
kann simultan oder sequentiell einem Individuum verabreicht werden,
das gegenüber
Hausstaubmilben empfindlich ist. Wirksame Mengen der therapeutischen
Zusammensetzung variieren gemäß Faktoren
wie beispielsweise dem Grad der Empfindlichkeit des Individuums
gegen Hausstaubmilben, dem Alter, dem Geschlecht und dem Gewicht
des Individuums und der Fähigkeit
des Peptids, in dem Individuum eine T-Zell-Reaktion zu stimulieren.
-
Eine
bevorzugte therapeutische Zusammensetzung der Erfindung umfasst
DP I-21.7 und zumindest eines der folgenden modifizierten Peptide
der Erfindung, das zumindest ein T-Zell-Epitop umfasst, und einen pharmazeutisch
verträglichen
Träger
oder Verdünnungsmittel:
DP
I-23.10; DP I-23.11; DP I-23.12; DP I-23.5; DP I-23.6; DP I 23.7;
DP I-23.8; DP I-23.9; DP I-26.2; DP II-2().7; DP II-22.6; DP II-22.3;
DP II-22.4; DP II-22.5; DP II-25.3; DP II-25.4; DP I-23.13; DP I-23.14;
DP I-23.15; DP I-23.16; DP I-23.17; DP I-26.3; DP I-26.4; DP I-26.5;
DP II-22.7; DP II-22.8;
DP II-22.9; DP II-22.10; und DP II-22.11, alle wie in 26 dargestellt.
-
In
einem noch weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine
Zusammensetzung bereitgestellt, die zumindest zwei Peptide (beispielsweise
ein physisches Gemisch von zumindest zwei Peptiden) umfasst, wobei
jedes zumindest ein T-Zell-Epitop eines Proteinallergens der Art
Dermatophagoides umfasst. Die Peptide oder modifizierten Peptide
werden aus demselben oder aus unterschiedlichen Milbenallergenen
abgeleitet. Derartige Zusammensetzungen können in Form einer therapeutischen
Zusammensetzung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel
verabreicht werden. Eine therapeutisch wirksame Menge einer oder
mehrerer derartiger Zusammensetzungen kann simultan oder sequentiell
einem Individuum verabreicht werden, das gegenüber Hausstaubmilben empfindlich
ist.
-
Bevorzugte
therapeutische Zusammensetzungen, die einen pharmazeutisch verträglichen
Träger oder
Verdünnungsmittel
umfassen und zumindest zwei Peptide, die jeweils zumindest ein T- Zell-Epitop umfassen,
umfassen zumindest ein Peptid, ausgewählt aus der Gruppe, die aus
Folgendem besteht:
DP I-1 (SEQ ID NO: 9); DP I-2 (SEQ ID NO:
10); DP I-3 (SEQ ID NO: 11); DP I-4 (SEQ ID NO: 12); DP I-11.1 (SEQ
ID NO: 13); DP I-12.1 (SEQ ID NO: 14); DP I-5 (SEQ ID NO: 15); DP
I-13 (SEQ ID NO: 17); DP I-14 (SEQ ID NO: 18); DP I-15 (SEQ ID NO:
19); DP I-6.1 (SEQ ID NO: 20); DP I-7.1 (SEQ ID NO: 21); DP I-8
(SEQ ID NO: 22); DP I-9 (SEQ ID NO: 23); DP I16 (SEQ ID NO: 24);
DP I-10 (SEQ ID NO: 25); DP I-17 (SEQ ID NO: 26); DP I-21.1 (SEQ
ID NO: 27); DP I-21.2 (SEQ ID NO: 28); DP I-22.1 (SEQ ID NO: 29);
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30); DP I-22.3 (SEQ ID NO: 31); DP I22.4 (SEQ ID NO: 32); DP I-23.1
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35); DP I-25.2 (SEQ ID NO: 36); DP I-26.1 (SEQ ID NO: 37); DP I-27.1 (SEQ
ID NO: 38); DP I-28.1 (SEQ ID NO: 39); DP I-28.2 (SEQ ID NO: 40),
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NO: 74); DF I-4 (SEQ ID NO: 75); DFI-11 (SEQ ID NO: 76); DF I-12
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NO: 102); DP II-20 (SEQ ID NO: 50); DP II-20.1 (SEQ ID NO: 51);
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DP II-6 (SEQ ID NO: 46); DP II-7 (SEQ ID NO: 47); DP II-8 (SEQ ID
NO: 48); DP II-9 (SEQ ID NO: 49); DP II-1.1 (SEQ ID NO: 57); DP
II-1.2 (SEQ ID NO:
58); DP II-2.1 (SEQ ID NO: 59); DP II-22 (SEQ ID NO: 60); DP II-2.3
(SEQ ID NO: 61); DP II-21 (SEQ ID NO: 62); DP II-22 (SEQ ID NO: 63);
DP II-26 (SEQ ID NO: 64); DP II-26.1 (SEQ ID NO: 65); DP II-23 (SEQ
ID NO: 66); DP II-23.1 (SEQ ID NO: 67); DP II-24 (SEQ ID NO: 68);
DP II-25 (SEQ ID NO: 69); DP II-25.1 (SEQ ID NO: 70); DP II-25.2
(SEQ ID NO: 71); DF II-1 (SEQ ID NO: 103); DF II-2 (SEQ ID NO: 104);
DF II-13.1 (SEQ ID NO: 105); DF II-3.1 (SEQ ID NO: 106); DF II-4.5
(SEQ ID NO: 107); DF II-4.3 (SEQ IDNO: 108); DF II-15 (SEQ ID NO:
109); DF II-16 (SEQ ID NO: 110); DF II-17 (SEQ ID NO: 111); DF II-18
(SEQ ID NO: 112); DF II-19 (SEQ ID NO: 113); DF II-19.1 (SEQ ID
NO: 114); DF II- 21
(SEQ IDNO: 115); und DF II-22 (SEQ ID NO: 116), DP I-23.1.1, DP
I-23.1.2, DP I-23.1.3, DP I-23.1.4, DP II-22.1, DP II-22.2 (alle
wie in den 3, 4 und 25 dargestellt)
und zumindest eine Region, die DP I-21.7 und eine modifizierte Aminosäuresequenz
umfasst, ausgewählt
aus der folgenden Gruppe:
DP I-23.10; DP I-23.11; DP I-23.12;
DP I-23.5; DP I-23.6; DP I-23.7; DP 1-23.8; DP I-23.9; DP I-26.2;
DP II-20.7; DP II-22.6; DP II-22.3; DP II-22.4; DP II-22.5; DP II-25.3;
DP II-25.4; DP I-23.13;
DP I-23.14; DP I-23.15; DP I-23.16; DP I-23.17; DP I-26.3; DP I-26.4;
DP I-26.5; DP II-22.7;
DP II-22.8; DP II-22.9; DP II-22.10; und DP II-22.11, alle wie in 26 dargestellt.
-
Noch
mehr bevorzugte therapeutische Zusammensetzungen, die einen pharmazeutisch
verträglichen Träger oder
Verdünnungsmittel
und zumindest zwei Peptide umfassen, die jeweils zumindest ein T-Zell-Epitop umfassen,
umfassen zumindest ein Peptid, ausgewählt aus der Gruppe, die aus
Folgendem besteht:
DP I-21.1 (SEQ ID NO: 27): DP I-21.2 (SEQ
ID NO: 28); DP I-22.1 (SEQ ID NO: 29); DP I-22.2 (SEQ ID NO: 30); DP I-22.3 (SEQ
ID NO: 31); DP I-22.4 (SEQ ID NO: 32); DP I-23.1 (SEQ ID NO: 33);
DP I-23.2 (SEQ ID NO: 34); DP I-25.1 (SEQ ID NO: 35); DP I-25.2
(SEQ ID NO: 36); DP I-26.1 (SEQ ID NO: 37): DP I-27.1 (SEQ ID NO:
38); DP I-28.1 (SEQ ID NO: 39); DP I-28.2 (SEQ ID NO: 40); DP I-1(SEQ
ID NO: 9); DF I-1(SEQ ID NO: 72); DF I-21.1 (SEQ ID NO: 90); DF
I-21.2 (SEQ ID NO: 91); DF I-22.1 (SEQ ID NO: 92); DF I-22.2 (SEQ ID
NO: 93); DF I-22.4 (SEQ ID NO: 94); DF I-23.1 (SEQ ID NO: 95); DF
I-23.2 (SEQ ID NO: 96); DF I-25.1 (SEQ ID NO: 97); DF I-25.2 (SEQ
ID NO: 98); DF I-26.1 (SEQ ID NO: 99); DF I-27.1 (SEQ ID NO: 100);
DF I-28.1 (SEQ ID NO: 101); DF I-28.2 (SEQ ID NO: 102); DP II-20
(SEQ ID NO: 50); DP II-20.1 (SEQ ID NO: 51); DP II-20.2 (SEQ ID
NO: 52); DP II-20.3
(SEQ ID NO: 53); DP II-20.4 (SEQ ID NO: 54); DP II-20.5 (SEQ ID
NO: 55); DP II 20.6 (SEQ ID NO: 56); DP II-1 (SEQ ID NO: 41); DP
II-1.1 (SEQ ID NO: 57); DP II-1.2 (SEQ ID NO: 58); DP II-2.1 (SEQ
ID NO: 59); DP II-2.2 (SEQ ID NO: 60); DP II-2.3 (SEQ ID NO: 61);
DP II-21 (SEQ ID NO: 62); DP II-22 (SEQ ID NO: 63); DP II-26 (SEQ
ID NO: 64); DP II-26.1 (SEQ ID NO: 65); DP II-23 (SEQ ID NO: 66);
DP II-23.1 (SEQ ID NO: 67); DP II-24 (SEQ ID NO: 68); DP II-25 (SEQ
ID NO: 69); DP II-25.1 (SEQ ID NO: 70); DP II-25.2 (SEQ ID NO: 71);
DF II-1 (SEQ ID NO: 103); DF II-2 (SEQ ID NO: 104); DF II-13.1 (SEQ ID
NO: 105); DF II-3.1 (SEQ ID NO: 106); DF II-4.5 (SEQ ID NO: 107);
DF II-4.3 (SEQ ID NO: 108); DF II-15 (SEQ ID NO: 109); DF II-16
(SEQ ID NO: 110); DF II-17 (SEQ ID NO: 111); DF II-18 (SEQ ID NO:
112); DF II-19 (SEQ ID NO: 113); DF II-19.1 (SEQ ID NO: 114); DF II-21 (SEQ
ID NO: 115); und DF II-22 (SEQ ID NO: 116), und zu mindest ein modifiziertes
Peptid ist aus der Gruppe von DP I-21.7; DP I-23.10; DP I-23.11;
DP I-23.12; DP I-23.5; DP I-23.6; DP I-23.7; DP I-23.8; DP I-23.9;
DP I-26.2; DP II-20.7; DP II-22.6;
DP II-22.3; DP II-22.4; DP II-22.5; DP II-25.3; DP II-25.4; DP I-23.13;
DP I-23.14; DP I23.15; DP I-23.16; DP I-23.17; DP I-26.3; DP I-26.4;
DP I-26.5; DP II-22.7;
DP II-22.8; DP II-22.9; DP II-22.10;
und DP II-22.11 ausgewählt,
alle wie in 26 dargestellt, wobei die Zusammensetzung
eine ausreichende Prozentzahl der T-Zell-Epitope zumindest eines
Proteinallergens derart umfasst, dass nach Verabreichung der Zusammensetzung
an ein Individuum, das gegenüber
einem Hausstaubmilbenallergen empfindlich ist, die T-Zellen des
Individuums gegenüber
zumindest einem Proteinallergen eine Toleranz entwickeln, und wobei
zumindest ein modifiziertes Peptid DP I-21.7 ist.
-
Weitere
bevorzugte Zusammensetzungen der Erfindung umfassen die folgende
Kombination von Peptiden und/oder modifizierten Peptiden und pharmazeutisch
verträglichen
Trägern
oder Verdünnungsmitteln:
DP
I-21.7, DF I-22.2, DP I-23.13. DP I-26. 1. DP II-20.6, DP II-22.3,
und DP II-25.2; DP I-21.2, DF I-22.2, DP I-23.10, DP I-26.2; DP
I-20.6, DP II-22.4, und DP II-25.3, DP I-21.7, DF I-22.2, DP I-23.11,
DP I-26.3, DP II-20.7, DP II-22.5, und DP II-25.4; DP I-21.7, DF
I-22.2, DP I-23.12,
DP I-26.4, DP II-20.6, DP II-22.6, und DP II-25.2; DP I-21.7, DF
I-22.2, DP I-23.5. DP I-26.5,
DP II-20.7, DP II-22.7, und DP II-25.3; DP I-21.7, DF I-22.2, DP
I-23.6,
DP I-26.2, DP II-20.6, DP II-22.8, und DP II-25.4;
DP I-21.7, DF I-22.2, DP I-23.7, DP I-26.3, DP II-20.7, DP II-22.9,
und DP II-25.3; DP I-21.7, DF I-22.2, DP I-23.8, DP I-26.4, DP II-20.6,
DP II-22.3 und DP II-25.4; DP I-21.7, DF I-22.2, DP I-23.9, DP I-26.1,
DP II-20.7, DP II-22.4, und DP II-25.3; DP I-21.7, DF I-22.2, DP
I-23.13, DP I-26.2, DP II-20.6, DP II-22.5. und DP II-25.4; DP I-21.7,
DF I-22.2, DP I-23.14, DP I-26.3, DP II-20.7, DP II-22.6, und DP
II-25.3; DP I-21.7,
DF I-22.2, DP I-23.15, DP I-26.4, DP II-20.6, DP II-22.6, und DP
II-25.3; DP I21.7, DF I-22.2,
DP I-23.16, DP I-26.5, DP II-20.6, DP II-22.3, und DP II-25.4;
DP
I-21.7, DF I-22.2, DP I-23.17, DP I-26.2, DP II-20.6, DP II-22.4,
und DP II-25.3; DP I-21.7, DF I-22.2, DP I-23.8, DP I-26.3, DP II-20.6,
DP II-22.5, und DP II-25.4; DP I-21.7, DF I-22.2, DP I-23.9, DP
I-26.4, DP II-20.6, DP II-22.6 und DP II-25.3; und DP I-21.7, DF
I-22.2, DP I-23.5,
DP I-26.1, DP II-20.6, DP II-22.7, und DP II-25.4.
-
In
einem noch weiteren Aspekt der Erfindung wird eine Zusammensetzung
bereitgestellt, die einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel
und zumindest zwei, vor zugsweise zumindest vier, besonders bevorzugt
zumindest sechs, noch mehr bevorzugt zumindest sieben der nachfolgenden
Kombinationen von Peptiden umfassen:
X, Y, Z, A, B, C, D, wobei
X DP I-21.2 oder DP I-21.7 ist; Y DF I-22.2 ist; Z DP I-23.1, DP
I23.10, DP I-23.11, DP I-23.12, DP I-23.13, DP I-23.14, DP I-23.15,
DP I23.16, DP I-23.17, DP I-23.5, DP I-23.6, DP I-23.7, DP I-23.8
oder DP I-23.9 ist; A DP I-26.1, DP I-26.2, DP I-26.3, DP I-26.4,
oder DP I-26.5 ist; B DP I-20.6 oder DP II-20.7 ist; C DP II-22,
DP II-22.6, DP II-22.7,
DP II-22.8, DP II-22.9, DP II-22.10, DP II-22.11, DP II-22.3, DP II-22.4,
oder DP II-22.5 ist; und D DP II-25.2, DP II-25.3, oder DP II-25.4
ist, unter dem Vorbehalt, dass X, Y, Z, A, B, C, D nicht die folgende
Kombination von Peptiden ist: DP I-21.2, DF I-22.2, DP I-23.1, DP
I-26.1, DP II-20.6,
DP II-22, und DP II-25.2; und (b) die Zusammensetzung DP I-21.7
umfasst.
-
Die
vorliegende Erfindung stellt ebenfalls Verfahren zum Nachweisen
der Empfindlichkeit in Individuen gegenüber Hausstaubmilbenallergenen
bereit, die das Kombinieren einer Blutprobe, gewonnen aus dem Individuum,
mit einem Peptid der vorliegenden Erfindung umfasst, unter Bedingungen,
die zur Bindung von Blutbestandteilen mit dem Peptid geeignet sind,
und unter Bestimmung des Ausmaßes,
demgegenüber
eine solche Bindung eintritt. Das Ausmaß, in dem eine Bindung eintritt,
wird durch Feststellung bzw. Bestimmung der T-Zell-Funktion, T-Zell-Proliferation oder
einer Kombination hiervon bestimmt.
-
Es
ist ebenfalls möglich,
die Struktur eines Peptids der Erfindung für solche Zwecke wie die Erhöhung der
Löslichkeit,
Verbesserung der therapeutischen oder präventiven Leistungsfähigkeit
oder Stabilität
zu modifizieren oder weiter zu modifizieren (beispielsweise Lagerfähigkeit
ex vivo und Beständigkeit
gegenüber
einem proteolytischen Abbau in vivo). Ein modifiziertes Peptid kann
produziert werden, dessen Aminosäuresequenz
verändert
wurde, wie beispielsweise durch Aminosäuresubstitution, -deletion
oder -addition, um die Immunogenität zu modifizieren und/oder
die Allergenität
zu reduzieren oder zu der ein Bestandteil zum selben Zweck hinzugefügt wurde.
-
Beispielsweise
kann ein Peptid so modifiziert werden, dass es die Fähigkeit
beibehält,
eine T-Zell-Anergie
zu induzieren und MHC-Proteine zu binden, ohne die Fähigkeit,
eine starke proliferative Reaktion zu induzieren oder möglicherweise
irgendeine proliferative Reaktion zu induzieren, wenn es in immunogener
Form verabreicht wird. In diesem Fall können die entscheidenden Bindungsreste
für den
T-Zell-Rezeptor unter Verwendung bekannter Techniken bestimmt werden
(beispielsweise eine Substitution jedes Restes und eine Bestimmung
des Vorhandenseins und der Abwesenheit einer T-Zell-Reaktivität). Diese
Reste, von denen gezeigt wurde, dass sie zum Interagieren mit dem
T-Zell-Rezeptor essentiell sind, können durch Ersetzen der essentiellen
Aminosäure
mit einem anderen, vorzugsweise ähnlichen
Aminosäurerest
(eine konservative Substitution), dessen Gegenwart sich als Vergrößerung,
Verkleinerung, jedoch nicht Eliminierung oder Nicht-Auswirken auf
die T-Zell-Reaktivität
erwiesen hat, modifiziert werden. Zusätzlich können solche Aminosäurereste,
die für die
T-Zell-Rezeptorinteraktion nicht essentiell sind, durch Ersetzen
durch eine andere Aminosäure
modifiziert werden, deren Einbau die T-Zell-Reaktivität vergrößern, verkleinern oder nicht
beeinflussen kann, jedoch die Bindung an relevantes MHC nicht eliminiert.
-
Zusätzlich können Peptide
der Erfindung durch Ersetzen einer Aminosäure modifiziert werden, von
der gezeigt wurde, dass sie zum Interagieren mit der MHC-Proteinkomplex
essentiell ist, durch einen anderen, vorzugsweise ähnlichen
Aminosäurerest
(konservative Substitution) ersetzt wird, dessen Gegenwart die T-Zell-Aktivität vergrößert, verkleinert,
jedoch nicht eliminiert oder nicht bewirkt. Zusätzlich können Aminosäurereste, die für die Interaktion
mit dem MHC-Proteinkomplex
nicht essentiell sind, die jedoch nach wie vor den MHC-Proteinkomplex
binden, durch Ersetzen durch eine andere Aminosäure modifiziert wurden, deren
Einbau die T-Zell-Reaktivität vergrößern, nicht
beeinflussen oder verringern, jedoch nicht eliminieren mag. Bevorzugte Aminosäuresubstitutionen
oder nicht-essentielle Aminosäuren
schließen
ein, sind jedoch nicht beschränkt
auf, Substitutionen mit Alanin, Glutaminsäure oder einer Methylaminosäure.
-
Ein
weiteres Beispiel einer Modifikation von Peptiden ist die Substitution
von Cysteinresten, vorzugsweise mit Serin, Threonin, Leucin oder
Glutaminsäure,
zur Minimierung der Dimerisierung über Disulfidbrücken. Beispielsweise
kann die Stabilität
eines Peptids von Der p II oder Der f II, das die ersten 10 Aminosäurereste
jedes Allergens einschließt,
durch Ersetzen des Cysteins, befindlich am 8. Aminosäurerest,
vorzugsweise durch Alanin oder Glutaminsäure oder alternativ durch Serin
oder Threonin gesteigert werden.
-
Um
die Stabilität
und/oder Reaktivität
zu vergrößern, können Peptide
ebenfalls modifiziert werden, so dass sie ein oder mehrere Polymorphismen
in der Aminosäuresequenz
eines Proteinallergens einbauen, die sich aus natürlicher
Allel-Variation ergeben. Zusätzlich
können
D-Aminosäuren, nicht-natürliche Aminosäuren oder
Nicht-Aminosäure-Analoga
substituiert oder zugesetzt werden, um ein modifiziertes Peptid
innerhalb des Umfangs der Erfindung zu erzeugen. Weiterhin können Peptide
der vorliegenden Erfindung unter Verwendung des Polyethy lenglycol
(PEG)-Verfahrens von A. Sehon und Mitarbeitern (Wie et al., siehe
oben) modifiziert werden, um ein Peptid zu erzeugen, das mit PEG
konjugiert ist. Zusätzlich
kann PEG während
der chemischen Synthese eines Peptids der Erfindung zugesetzt werden.
Modifikationen von Peptiden oder Anteilen hiervon können ebenfalls
eine Reduktion/Alkylierung einschließen (Tarr in: Methods of Protein
Microcharacterization, J.E. Silver Hsg., Humana Press, Clifton,
NJ, Seiten 155-194 (1986)); Acylierung (Tarr, siehe oben); Veresterung
(Tarr, siehe oben): Chemische Kopplung an einen geeigneten Träger (Mishell
und Shiigi, Hsg. Selected Methods in Cellular Immunology, W.H. Freeman,
San Francisco, CA (1980); US-Patent 4 939 239); oder eine milde
Formalin-Behandlung (Marsh International Archives of Allergy and
Applied Immunology 41: 199-215 (1971)) einschließen.
-
Peptide
innerhalb einer Allergengruppe (beispielsweise Der p I oder Der
p II) können
modifiziert werden, um die T-Zell-Reaktivität zu steigern. Unter Vorgabe
der Kreuzreaktivität
innerhalb der Gruppe-I- und Gruppe-II-Allergene kann ein Peptid
einer Gruppe von Allergenen, die weniger reaktiv sind als ein Peptid
einer weiteren Gruppe von Allergenen und sich in der Aminosäureposition
entsprechen, ein oder mehrere Aminosäuren durch ein oder mehrere
Aminosäuren
aus dem entsprechenden Peptid substituiert aufweisen. Zusätzlich können Peptide
so modifiziert werden, dass ein Polymorphismus in die Aminosäuresequenz
eines Proteinallergens eingebaut wird, was sich aus einer natürlichen
Allelvariation ergibt. Eine Modifikation von Peptiden, so dass sie
ein oder mehrere dieser Polymorphismen einschließen, kann eine erhöhte Stabilität und/oder
Reaktivität
zur Folge haben.
-
Um
die Aufreinigung und potentielle Zunahme der Löslichkeit von Peptiden der
Erfindung zu erleichtern, ist es möglich, Reportergruppen dem
Peptidgrundgerüst
hinzuzufügen.
Beispielsweise kann Polyhistidin einem Peptid zugesetzt werden,
um das Peptid an einer immobilisierten Metallionenaffinitätschromatographie aufzureinigen
(Hochuli, E. et al., Bio/Technology, 6: 1321–1325 (1988)). Zusätzlich können spezifische
Endoprotease-Spaltstellen, falls erwünscht, eingebracht werden,
zwischen einer Reportergruppe und den Aminosäuresequenzen eines Peptids,
um die Isolierung von Peptiden zu erleichtern, die frei von irrelevanten
Sequenzen sind. Um ein Individuum erfolgreich gegenüber einem
Proteinallergen zu desensibilisieren, kann es notwendig sein, die
Löslichkeit
eines Peptids durch Zusetzen funktioneller Gruppen zum Peptid oder
durch Nicht-Einschließen
hydrophober T-Zell-Epitope oder Regionen zu erhöhen, die hydrophobe Epitope
in den Peptiden enthalten.
-
Um
potentiell eine richtige Antigenprozessierung von T-Zell-Epitopen
innerhalb eines Peptides zu unterstützen, können kanonische Protease-empfindliche
Stellen rekombinant oder synthetisch zwischen Regionen gentechnisch
eingefügt
werden, die jeweils zumindest ein T-Zell-Epitop umfassen. Beispielsweise
können geladene
Aminosäurepaare,
beispielsweise KK oder RR, zwischen Regionen innerhalb eines Peptides
während
der rekombinanten Konstruktion des Peptides eingeführt werden.
Das sich ergebende Peptid kann gegenüber Cathepsin und/oder anderen
Trypsin-artigen Enzymen eingefügt
werden und gespalten werden, um Anteile des Peptids zu erzeugen,
die ein oder mehrere T-Zell-Epitope enthalten. Zusätzlich können solche
geladenen Aminosäurereste
eine Erhöhung
der Löslichkeit
eines Peptids zur Folge haben.
-
Eine
ortsgerichtete Mutagenese von DNA, die ein Peptid der Erfindung
codiert, kann dazu verwendet werden, die Struktur des Peptids zu
modifizieren. Solche Verfahren können
eine PCR einschließen
(Ho et al., Gene, 88: 51–59
(1989)) oder eine Gesamtsynthese mutierter Gene (Hostomsky, Z.,
et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 161: 1056–1063 (1989)). Um die bakterielle
Expession zu erhöhen,
können
die vorher erwähnten Verfahren
in Verbindung mit anderen Verfahren verwendet werden, um die eukaryontischen
Kodone in den DNA-Konstrukten, die die Peptide der Erfindung codieren,
zu solchen zu verändern,
die vorzugsweise in E. coli verwendet werden.
-
Spezielle
Beispiele von Peptiden, die gemäß einer
oder mehrerer der Modifikationsverfahren, die oben diskutiert wurden,
modifiziert werden, schließen
ein, sind jedoch nicht beschränkt
auf, Modifikationen gegenüber
Peptid DP I-23.1, wie in 25 dargestellt,
und gegenüber
Peptid DP II-22,
wie in 25 dargestellt. Insbesondere
schließen
Modifikationen an den Peptiden an 23.1 den Zusatz geladener Aminosäuren (DP
I-23.7), geladene Aminosäurenpaare
(DP I-23.5) zur Erhöhung
der Löslichkeit
und zum Ersetzen eines Cysteinrestes durch Serin (DP I-23.6) oder
einer Glutaminsäure
zur Erhöhung
der Löslichkeit
ein. Veränderungen
des Peptides DP II-22 schließen
den Zusatz geladener Aminosäurepaare
(22.6 und 22.3) zur Erhöhung
der Löslichkeit ein,
wie in 25 dargestellt ist.
-
Die
vorliegende Erfindung stellt ebenfalls Nucleinsäuren bereit, die Sequenzen
aufweisen, die die Peptide der Erfindung codieren. Nucleinsäuresequenzen,
die in irgendeiner Ausführungsform
dieser Erfindung verwendet werden, können hierin beschriebene cDNA
sein, oder alternativ können
sie irgendeine Oligodesoxynucleotidsequenz sein, die den gesamten
Anteil einer Sequenz oder einen Teil hiervon, wie hierin dargestellt,
oder deren funktionelle Äquivalente
sein.
-
Solche
Oligodesoxynucleotidsequenzen können
chemisch oder mechanisch unter Verwendung bekannter Techniken hergestellt
werden.
-
Die
Erfindung wird weiterhin durch die folgenden nicht-einschränkenden
Beispiele beschrieben.
-
Beispiel 1 Aufreinigung
von nativem Milbenallergen
-
Es
folgt eine Beschreibung der Arbeiten, die durchgeführt wurden,
um die Allergene der Gruppe I und Gruppe II der Hausstaubmilben
Dermatophagoides pteronyssinus und Dermatophagoides farinae in ihrer
nativen Form als primäre
Antigene für
die humane T-Zell-Epitopkartierung aufzureinigen.
-
Alle
vier Proteinallergene, nämlich
Der f I, Der p I, Der f II und Der p II wurden aus gespendeten Milbenkulturmedien
durch Immunaffinität
aufgereingt, die entweder aus den Commonwealth Sera Laboratores, Melbourne,
Australien, oder von Dr. Larry G. Arlian an der Wright State University
Dayton, Ohio, bezogen wurden. Ein 10%iger (G/V) wässriger
Extrakt von getrocknetem verbrauchten Milbenkulturmedium wurde in
PBS (Phosphat-gepufferte Salzlösung)
unter Rühren über Nacht
bei 4° C
hergestellt. Das unlösliche
Material wurde durch Zentrifugation bei 10.000 × g für 1 Stunde bei 4° C entfernt.
Der Überstand
wurde dann auf einem Vakuumsammelrohr durch Whatman-Nr.1-Papier
filtriert und bei 15.000 × g
für 1 Stunde
bei 4° C
rezentrifugiert. Eine endgültige
Filtration wurde durch einen 0,45 m Cellulose-Acetatfilter durchgeführt.
-
Die
monoklonalen Antikörper
4C1 und 6D6 (University of Virginia, NC) wurden für eine Immunaffinitätsaufreinigung
von Milbenallergenen der Gruppe I und Gruppe II jeweils verwendet
(Champan et al., J. Allergy Clin. Immunol. 80: 1479–1484 (1987);
Heymann et al., J. Allergy Clin. Immunol. 83: 1055–1067 (1989)).
Der monoklonale Antikörper
4Cl reagiert mit einem Epitop, das sowohl von den Der f I als auch
Der p I Proteinen geteilt wird; in ähnlicher Weise reagiert der
monoklonale Antiköper
6D6 mit sowohl den Der f II als auch Der p II Proteinen.
-
Für jeden
monoklonalen Antikörper
wurde Ascites-Flüssigkeit
in 50 % Ammoniumsulfat geschnitten, und die Antikörper wurden
an CNBr-aktivierter Sepharose 4B (Pharmacia) in 100 mM NaHCO3, 500 mM NaCl, pH 8,3 über Nacht bei 4° C gekoppelt.
-
Monoklonale
Antikörpersäulen wurden
in PBS equilibriert und die filtrierten Extrakte zu 15 ml pro Stunde
eingefüllt.
Die Säule
wurde dann in 20 Volumina PBS gewaschen, wonach eine stringentere
Waschung von 20 Säulenvolumina
mit PBS durchgeführt
wurde, das mit 500 mM NaCl ergänzt
wurde. Proteine wurden in 500 mM NaCl, 100 mM Glycin pH 11,0 eluiert
und die Fraktionen bezüglich
ihres Proteingehalts durch spektrophotometrische Absorption bzw.
Extinktion bei 280 nm ausgewertet. Die Peak-Fraktionen wurden gepoolt
und umfassend gegen PBS dialysiert, mit einer negativen Druckdialysevorrichtung
konzentriert (bezogen von Amicon, Beverly MA) und wurden in T-Zell-Epitopkartierungsstudien
der Allergene der Milbengruppe I und Gruppe II verwendet. Wiedergewonnene
Proteine wurden in Reinheiten erhalten, die sich von 80 % (Gruppe
II) bis 90 % (Gruppe I) bewegten.
-
Eine
Umkehrphasen-HPLC-Chromatographie wurde angewendet, um die Immunaffiniätsaufgereinigten
Milbenproteinallergene der Gruppe II weiter gemäß den Bedingungen in Heymann
et al., J. Allergy Clin. Immunol. 83: 1055–1067 (1989) aufzureinigen.
Kurz gesagt, wurde ein Immunaffinitäts-aufgereinigtes Protein auf
eine 5 μm
300 Å C-8
Säule (Applied
Biosystems Inc.) in 0,1 % Vol/Vol TFA/H2O
aufgebracht. Die Strömungsgeschwindigkeit
für die
Säule betrug
1 ml/min mit einem Gradienten von 0 bis 60 % Acetonitril/0,1 % TFA über 60 Minuten.
Die Gruppe-II-Proteine eluierten um 45 % Acetonitril/0,1 % TFA.
Die Fraktionen wurden bezüglich
ihrer Reinheit durch SDS-Polyacrylamin-Gelelektrophorese, gefolgt
von einem densitometrischen Scannen, analysiert. Solche Fraktionen
mit Gruppe-II-Protein einer Reinheit von mehr als 90 % wurden anschließend für die humane
T-Zell-Kartierung – des
Allergens verwendet.
-
Beispiel II Rekombinante
Milbenallergenexpression
-
Es
folgt nunmehr die Beschreibung der Arbeit, die durchgeführt wurde,
um die Allergene der Gruppe I und Gruppe II der Hausstaubmilben
Dermatophagoides pteronyssinus und Dermatophagoides farinae als
rekombinante Proteine in E. coli zu erzeugen.
-
Alle
vier Proteinallergene, Der f I, Der p I, Der f II und Der p II,
wurden an ihren reifen Amino-Termini mit
der Leadersequenz MGHHHHHHEF (wobei die Aminosäuren EF durch die EcR-I-Restriktionsstelle GAATTC
codiert sind) fusioniert. Weil der H6-Abschnitt
der Aminosäuren
Ni++-Ionen auf NTA-Agarosesäulen (Diagen
GmbH) koordiniert, wurde diese Aktivität bei der Aufreinigung der
rekombinanten Proteine ausgenutzt (Hochuli et al., Biotechnology
86: 1321-1325 (1988)).
Letztendlich wurden alle vier Allergene in den Expressionsvektor
pET 11d (Stu dier et al., Methodes in Enzymology 185: 60-88 (1990))
unter der Transkriptionskontrolle des Phagen-T7-gn-10-Promotors
subkloniert.
-
Die
cDNAs, die die Allergene der Gruppe I von D. pteronyssinus und D.
farinae codierten, wurden von Dr. Wayne Thomas in Plasmidform als
Subklone von λgt11
erhalten (Chua et al., J. Exp. Med. 167: 175–182 (1988); Dilworth et al.,
Clin. Exp. Allergy 21: 25–32
(1991)). Die Der p I cDNA wurde aus einem M13-RP-Plasmid als EcoRI-Fragment
in pUC18 durch Dr. Roland Buelow bei ImmuLogic (Palo Alto) subkloniert,
während die
Der f I cDNA direkt aus dem M13mp19-RF-Plasmid DfI(1) manipuliert
wurde.
-
Anfänglich wurden
die cDNAs in den Expressionsvektor pTrc99A His6 Insert
RRRS subkloniert, der eine modifizierte Version von pTrc99A (Amann
et al., Gene 69: 301-315 (1988)) war. Der ursprüngliche Vektor wurde durch
Zusatz eines Syntheseadaptors (der aus zwei komplementären Oligonucleotiden
bestand) modifiziert, der die Leadersequenz MGHHHHHHEF zwischen
seinen NcoI(MG)- und EcoRI(EF)-Stellen am 5'-Ende des Polylinkers und ein RRS (Retroregulatorische
Sequenz) in seinem HindIII-Ort am Polylinker-3'-Ende enthielt. Die Leadersequenz wurde
als Aufreinigungshilfe wie oben beschrieben verwendet, während das
RRS zugesetzt wurde, um die rekombinante Botschaftsstabilität zu erhöhen und
dadurch die Ausbeute an rekombinantem Protein zu erhöhen (Skoglund
et al., Gene 88: 1–5
(1990)). Als Letztes wurde ein Insert, in diesem Falle eine Amb-a-I.1-cDNA,
die das Hauptallergen der kurzen Beifußblättrigen Ambrosie (short ragweed)
codierte (Rafnar et al., J. Biol. Chem. 226: 1229–1236 (1991))
in frame mit der H6-Leadersequenz als ein
EcoRI an PstI-Fragment subkloniert.
-
Um
die Allergene der Milbengruppe I zu exprimieren, wurde die Amb-a-I.1-cDNA
durch EcoRI/HindIII-Digestion ausgeschnitten und durch Adaptoren
mit ϕEcoRI/HindIII-Überhängen ersetzt
(zusammengesetzt aus einem Paar komplementärer Oligonucleotide). Diese
Adaptoren (2a) codierten die ersten fünf Aminosäuren bis
zur PstI-Stelle des reifen Der p I NH2-Terminus und die
ersten zehn Aminosäuren
bis zur HpaI-Stelle des reifen Der f 1 NH2-Terminus.
Nach Ligation des EcoRI-Ortes des Vektors und der ϕEcoRI-Stelle
in die Adaptoren wurde die EcoRI-Stelle im Vektor zerstört und ließ die EcoRI-Stelle
intern am Adapter als die einzige EcoRI-Stelle in den Zwischenkonstrukten
pTrc99A His6 5' p1 RRS und pTrc99A His6 5' f1 RRS zurück. Die
Der p I cDNA wurde als PstI/EcoRI-Fragment in PstI/EcoRI digeriertes
pTrc99A His6 5' p1 RRS eingefügt, wohingegen die Der f I
cDNA als HpaI/EcoRI-Fragment in HpaI/EcoRI-digeriertes pTrc99A His6 5' f1
RRS eingefügt wurde.
Die Sequenz am 5'-Ende
jedes Konstruktes, pTrc99a His6 5' f1 RRS und pTrc99A
His6 f1 RRS wurde durch Didesoxy-Kettenterminierungs-DNA-Sequenzierung
unter Verwendung eines SequenaseTM-II-Kits
(U.S. Biochemicals) verifiziert. Sowohl die H6pl-
als auch die H6f1-codierenden Kassetten
wurden durch NcoI/Nhel-Digestion ausgeschnitten (eine NheI-Stelle
existierte am 3'-Ende
des RRS-Adaptors)
und in NcoI/NheI-digeriertes pET11d eingefügt. Diese beiden Konstrukte,
nämlich
pET11d His6 p1 RRS und pEt11d His6 f1 RRS, wurden in kompetente BL21[DE3]-Bakterien
zur Expression der rekombinanten Proteine transformiert. BL21[DE3]
enthält
ein rekombinantes Phagen-λ-Lysogen,
nämlich
DE3, mit einem Phagen-T7-RNA-Polymerasegen unter der Transkriptionskontrolle
des lac-UVS-Promotors. Die Expression des T7-RNA-Polymerasegens
wird durch Zusatz von IPTG (Isopropyl-B-D-thiogalactopyranosid)
induziert, die wiederum zu einem höheren Expressionsniveau des
rekombinanten Gens führt,
subkloniert, 3' des
pET-Vektors T7-gn-10-Protomotors.
-
Die
cDNAs, die die Allergene der Gruppe II von D. pteronyssinus und
D. farinae codieren, waren ebenfalls von Dr. Wayne Thomas in Plasmidform
als Subklone von λgt11
erhältlich
(Chua et al., Int. Arch. Appl. Immun. 91: 118–123 (1990); Trudinger et al.,
Clin. Exp. Allergy 21: 33–37
(1991)). Die ursprüngliche
Der p II cDNA wurde aus einem M13RF-Plasmid in die pCA- und pGEX-Vektoren
durch Dr. Roland Buelow bei ImmuLogic (Palo Alto) subkloniert. Dr.
Thomas' Gruppe hatte
die Der fII cDNA als Subklon in pGEX geliefert. Beide pGEX-Plasmide,
die Gruppe II cDNAs enthielten, wurden als Matrizen zur PCR-Amplifikation
mit demselben 5'-Sense/3'-Antisense-Primerpaar
(2b) verwendet. Die Primer wurden verwendet, um
eine EcoRI-Stelle (GAATTC, das die Aminosäuren EF codiert) in Frame mit
dem NH2-Terminus der reifen Gruppe-II-Proteine
entwickelt und ordnen eines PstI-Stelle 3' der Gruppe-II-codierenden Region an.
Ein MJ Research Thermal Controller mit einem Programm von 30 × (94° C 1 min/55° C 1 min
30 sec/72° C
2 min) wurde in Verbindung mit den Reagenzien aus einem Perkin-Elmer
Cetus Gene Amp Kit zur PCR-Amplifikation verwendet. Die PCR-Produkte
wurden EcoRI/PstI-digeriert und in EcoRI/PstI-digeriertes M13mp19RF
subkloniert. Eine DNA-Sequenzanalyse
wurde durchgeführt,
um die Sequenz der PCR-Produkte zu verifizieren. Korrektes M13RF
wurde EcoRI/PstI-digeriert, ihre Gruppe-II-cDNA-Inserte isoliert
und in EcoRI/PstI-digeriertes pTrc99A His6 Amb
a I.1 RRS (das zum Austausch der Gruppe-II-cDNAs durch die Beifuß-blättrige Ambrosie
(Ragweed) cDNA (1) diente) subkloniert.
-
Die
Der f II cDNA besaß einen
Sequenzpolymorphismus an Position 54 (d. h. ein Threoninrest anstelle von
Isoleucin). Um diesen Polymorphismus zu verändern, wurde eine ortsgerichtete Mutagenese
des T54-Restes in der Der f II cDNA unter
Verwendung eines Muta-Gene-Kits von Bio-Rad Laboratories auf Grundlage
des Verfahrens von Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 448-492
(1985) durchgeführt.
Das ursprüngliche M13mp19RF
mit der T54 Der f II cDNA wurde in CJ236-Bakterien
transformiert, die den Einbau von Uracil anstelle von Thymidin während der
DNA-Replikation tolerieren, und eine Einstrang-Phagen-DNA wurde
als Matrize hergestellt. Ein mutagener 17-Basenpaar-Primer (2b) wurde an die Phagenmatrizen-DNA annealt. T4-DNA-Polymerase wurde
dazu verwendet, die Marizen-DNA, die durch das mutagene Oligonucleotid
geprimt war, zu kopieren, und T4-DNA-Ligase diente zum Verschließen von
Lücken
im DNA-Strang. Die
Reaktion wurde in MV1190-Bakterien transformiert, die Wildtyp sind,
für das
Editieren von Uracilresten aus DNA und replizieren deswegen den
mutagenisierten (nicht-Uracilenthaltenden) Strang selektiv, und
einsträngige
Phagen-DNA, hergestellt aus rekombinanten (weißen) Plaques. Mehrere Rekombinanten
wurden einer DNA-Sequenzanalyse unterworfen und Der f II cDNAs mit
der korrekten I54-Sequenz wurden als EcoRI/PstI-Fragmente in
EcoRI/PstI digerierte pTrc99A His6Amb a
I.1 RRS subkloniert.
-
Weil
eine frühere
Arbeit gezeigt hat, dass der pET11d-Vektor in den meisten Fällen dazu
in der Lage war, rekombinante Proteine in höheren Konzentrationen als der
pTrc99A-Vektor zu exprimieren, wurden die beiden Milben-Gruppe-II-cDNAs
als H6-Fusionsproteine in den T7-Vektor
subkloniert. pTrc ppA His6f II RRS und pTrc99A
His6 p II RRS wurden NcoI/NheI-digeriert,
die cDNA-Inserte isoliert und in NcoI/NheI-digeriertes pET11d His6 p1 (1) subkloniert.
Rekombinante Plasmide wurden in BL21 [DE3] Bakterien zur Expression transformiert.
-
BL21
DE3-Wirtsbakterien, die die pET11d-Milbenallergen-Expressionskonstrukte
beherbergten, wurden frisch auf eine BHI-Agarplatte (3,7 % G/V Difco
Brain Heart Infusion; 1,5 % G/V Difco Agar) als Streifen ausgebracht,
ergänzt
mit 200 μg/ml
Ampicillin und über
Nacht bei 37° inkubiert.
Die einzige Kolonie wurde in einem 2 ml 200 μg/ml Ampicillin/BH1-Medium (3,7
% G/V Difco Brain Heart Infusion) inokuliert und bei 300 Upm bei
37° C bis
zur Trübe
geschüttelt,
jedoch nicht gesättigt.
Die 2-ml-Kultur wurde dann 100 ml 200 μg/ml Ampicillin/BH1-Medien zugesetzt,
bei 3000 Upm bei 37° C
geschüttelt,
bis sie trüb,
jedoch nicht gesättigt
war, und bei diesem Punkt wurde die Kultur in 18 × 500 ml
(9 Liter) 200 μg/ml
Ampicillin/BH1-Medien aufgeteilt und bei 300 Upm bei 37° C geschüttelt. Wenn
die OD595 der Kultur 1,0 erreichte, wurde
die Expression der rekombinanten Moleküle durch Zusatz von IPTG zu
400 μM induziert
und für
2 Stunden fortlaufen gelassen.
-
Die
Bakterien wurden durch Zentrifugation bei 10.000 × g für 15 Minuten
geerntet und in 1/20stel Volumenlysepuffer (0,2 mg/ml Lysozym, 100
mM NaPO4 pH 8,0, 50 mM NaCl) resuspendiert,
auf Eis für
30 Minuten inkubiert und bei –70° C eingefroren.
Die eingefrorenen Bakterien wurden durch Schnelltauen auf 37° C aufgebrochen
und danach 5-mal für
20 Sekunden in 30-sekündigen
Intervallen beschallt. Die beschallten Proben wurden bei 15.000 × g zentrifugiert,
um lösliche
und teilchenförmige
Bakterienproteine abzutrennen. Die löslichen Proteine wurden abgegossen
und das pelletierte Protein in 6 M Guanidin HCl, 100 mM 2-Mercaptoethanol,
100 mM NaPO4, 10 mM Tris pH 8,0 resuspendiert.
Diese Suspension wurde einer Zentrifugation bei 15.000 × g unterworfen
und der Überstand
entfernt, mit 10 N NaOH auf pH 8,0 eingestellt und auf ein NTA-Agarosesäule aufgebracht,
die in 6 M Guanidin HCl, 100 mM NaPO4, 10
mM Tris pH 8,0 equilibriert wurde. Die Säule wurde in 6 M Guanidin HCl,
100 mM NaPO4, 10 mM Tris pH 8,0 gewaschen,
bis die OD280 des Effluenten Hintergrundniveau
erreichte. Der Säulenpuffer
wurde dann auf 8 M Urea, 100 mM NaPO4, 10
mM Tris pH 8,0 gewechselt. Nach der Equilibrierung wurde eine stringentere
Waschung in 8 M Urea, 100 mM NaOAc, 10 mM Tris pH 6,3 durchgeführt, bis
der OD280 des Effluenten Hintergrundniveau
erreichte. Rekombinantes Milbenprotein (als H6-Fusion)
wurde dann in 8 M Urea, 100 mM NaOAc, 100 mM Tris pH 4,5 eluiert
und in Teilmengen gesammelt, deren OD280-Profil überwacht
wurde. Der Proteinpeak wurde dreimal in 500 Volumina PBS bezüglich einer
humanen T-Zell-Analyse
dialysiert. Die Ausbeute bewegte sich von 10 bis 70 mg rekombinantem
Protein pro Liter mit einer Reinheit (wie durch densitometrisches
Scanning bestimmt wurde), die sich von 80 (Der f II) bis 95 % bewegte.
-
Um
das rekombinante Der f II Proteinallergen weiter aufzureinigen,
wurde eine Umkehrphasen-HPLC-Chromatographie
angewendet. Ungefähr
100 mg His6-Der f II-Protein wurden in 20
mM DTT bei 36° C
für 30
Minuten reduziert und danach auf eine Pharmacia PRO RPC HR 10/10
Säule in
0,1 % V/V TFA/H2O aufgebracht. Die Strömungsgeschwindigkeit
für die
Säule betrug
1,5 ml/min mit einem Gradienten von 0-70 % Acetonitril in 0,1 %
TFA über
40 Minuten, gefolgt von einem Gradienten von 70-100 % Acetonitril in
0,1 % TFA. His6-Der f II-Protein eluierte
zwischen 54-96 % Acetonitril. Fraktionen, detektiert bei 214 nm
und 280 nm, wurden bezüglich
ihrer Reinheit durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese/Densitometrie-Scanning
analysiert. Solche Fraktionen mit einem His6-Der
f II-Protein mit einer Reinheit von mehr als 95 % wurden anschließend für ein humanes
T-Zell-Kartieren des Allergens verwendet. Die Ausbeute aus dem präparativen Umkehrphasen-HPLC
betrug ungefähr
69 %.
-
Bestimmung der Nucleotidsequenzpolymorphismen
in den Der p I-, Der p II- und Der f II-Allergenen
-
Es
wurde erwartet, dass Sequenzpolymorphismen in der Nucleinsäuresequenz
zu finden waren, die für
Der p I, Der p II, Der f I und Der f II codierten, aufgrund einer
natürlichen
Allel-Variation
zwischen individuellen Milben. Mehrere Nucleotid- und die sich ergebenden
Aminosäuresequenzpolymorphismen
wurden während
des Sequenzierens unterschiedlicher Der p I-, Der p II- und Der
f II-Klone entdeckt. Die Aminosäuresequenzpolymorphismen
sind in den 22, 23 und 24 dargestellt.
-
Beispiel III
Synthese von überlappenden
Peptiden
-
Der
p I, Der f I, Der p II und Der f II überlappende Peptide, wie in
den 3 und 4 dargestellt, wurden unter
Verwendung einer Standard-Fmoc/tBoc-Synthesechemie synthetisiert
und durch Dialyse oder Umkehrphasen-HPLC aufgereinigt. Die Aminosäurereste
der synthetisierten Peptide sind in Klammern durch den Peptidnamen
angegeben und die Aminosäuresequenz
(im Ein-Buchstaben-Code)
ist neben dem Peptidnamen angegeben. Die Peptidnamen sind in den
gesamten Figuren konsistent. Die Der p I-, Der f I-, Der p II- und
Der f II-Proteine werden in überlappende
Peptide in einer solchen Weise aufgeteilt, dass die überlappenden
Peptide von Der p I und Der f I ebenso wie für Der p II und Der f II entsprechende
Aminosäurerestezahlen aufweisen,
beispielsweise DP I-1 und DF I-1 enthalten beide Aminosäurereste
1-20 der Der p I- und Der f I-Allergene.
Diese Übereinstimmung
in der Aminosäureposition
zwischen den Der p- und Der f-Peptiden
wurde zweckmäßigerweise
durchgeführt,
um einen optimalen Test bezüglich
einer Kreuzreaktivität
der Der p- und Der f-T-Zell-Epitope bereitzustellen und somit Peptide
zu bestimmen, die, nach Verabreichung an ein Individuum, das gegenüber Hausstaubmilben
empfindlich ist, eine Empfindlichkeit sowohl gegenüber Der
p- als auch Der f-Allergenen behandeln würde. Im Design der überlappenden
Peptide wurde das Verhältnis
der Gruppe-I- und Gruppe-II-Allergene
auf der Ebene der T-Zell-Kreuzreaktivität in Erwägung gezogen. Zusätzlich wurde
die Funktion der Gruppe-I-Allergene als Serinproteasen in Erwägung gezogen
und die Aminosäuresequenzen
anderer bekannter Serinproteasen, beispielsweise Papain, Actinidin,
wurden überprüft, um ähnliche
konservierte und variable Regionen innerhalb der Gruppe-I-Allergene
zu identifizieren. Es wurde erwartet, dass konservierte Regionen
innerhalb der Gruppe-I-Allergene „geteilte" T-Zell-Epitope enthalten würden.
-
Beispiel IV Milbenallergenpatienten-bezogene
primäre
T-Zell-Reaktionen gegenüber
Der p I- und Der
p II-Proteinen und -Peptiden
-
Periphere
mononukleäre
Blutzellen (Peripheral Blood Mononuclear Cells = PBMC) wurden durch
Ficoll-Hypaque-Zentrifugation einer peripheren Blutprobe von Milbenallergenpatient
R.B. aufgereinigt und bezüglich
einer Proliferation in Reaktion auf verschiedene Antigene untersucht,
d. h. Affinitäts-aufgereinigte
Der p I, Affinitäts-aufgereinigte
Der p II, verschiedene Der p I- und Der p II-Peptide. Für einen
Assay wurden 5 × 104 PBMC in Dreifach-Microwells für 7 Tage
bei 37° C
in Gegenwart verschiedener Konzentrationen an Antigen in 200 μl RPMI-1640
kultiviert, das 5 % humanes AB-Serum enthielt. Jedes Well erhielt
dann ein μCi-tritiiertes Thymidin
für 16
Stunden. Die Zähler
wurden auf Glasfaserfiltern gesammelt und für Flüssigkeitsszintiliationszählen verarbeitet.
Tabelle I zeigt die Ergebnisse dieses Assays. Die CPM +/– Standardabweichung
ist dargestellt. Der Stimulationsindex jeder Reaktion (S.I.) ist
das Verhältnis
des 3H-Thymidin-CPM,
eingebaut durch die Zellen in Reaktion auf Antigen, geteilt durch 3H-Thymidin-CPM, eingebaut durch Zellen in Nur-Medium.
Die Ergebnisse zeigen, dass dieser Patient mit einem S.I. von zumindest
2,0 auf die Peptid DP I-1, DP I-3, DP I-8, DP I-10, DP I-5,2, DP
II-4 und DP II-9 reagiert. Somit enthalten diese Peptide Der p I-
oder Der p II-T-Zell-Epitope, die von T-Zellen aus diesem speziellen
allergischen Patienten erkannt wurden.
-
-
-
Beispiel V T-Zell-Epitonstudien
mit Der p I
-
Periphere
mononukleäre
Blutzellen (PBMC) wurden durch Ficoll-Hypaque-Zentrifugation von
60 ml heparinisiertem Peripherblut aus Hausstaubmilben-allergischen
Individuen aufgereinigt, die klinische Symptome einer Milbenallergie
zeigten, und deren Hauttest bezüglich
Hausstaubmilben positiv getestet wurde.
-
107 PBMC aus Individuum 543 wurden in 10 ml
RPMI-1640, das 5 % gepooltes humanes AB-Serum enthielt, kultiviert und mit Glutamin,
Penicillin, Streptomycin und HEPES-Puffer in Gegenwart von 20 μg/ml aufgereinigtem
Der p I/ml bei 37° C
für 7 Tage
supplementiert. Lebensfähige
Zellen wurden dann durch Ficoll-Hypaque-Zentrifugation aufgereinigt
und für
zwei zusätzliche
Wochen in RPMI-16405 % AB-Serum, das 5 Einheiten rekombinantes humanes
IL-2/ml und 5 Einheiten rekombinantes humanes IL-4/ml enthielt,
kultiviert. Die ruhenden T-Zellen wurden dann in einem sekundären Proliferationsassay
getestet, um T-Zell-Reaktionen auf verschiedene Hausstaubmilbenproteine
und -peptide zu bestimmen. Für
einen Assay wurden 2 × 104 ruhende T-Zellen in 200 μl RPMI-1640/5
% AB-Serum für
3 Tage bei 37° C
in Gegenwart von 2 × 104 autologen Epstein-Barr-Virus-transformierten
B-Zellen (20.000 Rad) als Antigenpräsentierenden Zellen mit verschiedenen Konzentrationen
von aufgereinigten nativen Der p I- oder synthetischen Der p I-Peptiden
kultiviert. Jedes Well empfing dann 1 μCi-tritiiertes Thymidin für 16 Stunden.
Die eingebauten Zähler
wurden auf Glasfaserfiltern gezählt
und bezüglich
einer Flüssigkeitsszintillationszählung weiterverarbeitet.
Medium alleine, das als Negativkontrolle diente, enthielt kein Allergen
oder Peptid. Die Ergebnisse dieses Experiments zeigen, dass dieser spezielle
Patient mit einem S.I. von zumindest 2,5 auf mehrere Peptide reagiert,
die vom Der p I-Protein abgeleitet sind, einschließlich DP
I-1, DP I-2, DP I-4, DP I-11, DP I-5, DP I-13, DP I-15, DP I-6,1,
DP I-8, DP I-9, DP I-16, DP I-10 und DP I-17 (Daten nicht dargestellt).
Das obige Verfahren wurde für
mehrere andere gegen Hausstaubmilben allergische Individuuen befolgt,
außer
a) in individuellen Fällen
variierte die Länge
der Zeit der Kultivierung mit IL-2 und IL-4; b) in individuellen
Fällen
wurden die T-Zellen entweder mit aufgereinigtem nativen (N) oder
rekombinanten (R) Der p I-Protein zu entweder 20 μg/ml oder
10 μg/ml
geprimt; und c) in individuellen Fällen wurden mit Röntgenstrahlen
bestrahlte (3500 Rad) autologe PBMC als Antigen-präsentierende
Zellen im sekundären
Proliferationsassay verwendet. Zusätzlich wurden drei Peptide
(DP I-11 (SEQ ID NO:117), DP I-12 (SEQ ID NO:118) und DP II-3 (SEQ
ID NO:119) aufgefunden, die eine große Anzahl konservativer Veränderungen
aus der nativen Sequenz in ihrer Aminosäuresequenz aufwiesen. Drei
zusätzliche
Peptide (DP I-11,1 (SEQ ID NO:13), DP I-12,1 (SEQ ID NO:14) und
DP II-3,1 (SEQ ID NO:43) wurden ohne Veränderungen aus der nativen Sequenz
synthetisiert. Einige T-Zell-Analysen wurden mit den ursprünglichen Peptiden
durchgeführt,
d. h. DP I-11, DP I-12 und DP II-3). Im Anschluss an eine T-Zell-Analyse, die mit
zusätzlichen
Peptiden (d. h. DP I-11,1, DP I-12,1 und DP II-3,1) durchgeführt wurde,
wurde kein signifikanter Unterschied im durchschnittlichen S.I.
oder der Prozentzahl positiver Reaktionen zwischen den ursprünglichen Peptiden
und den zusätzlichen
Peptiden festgestellt. Somit wurden die Daten aus beiden Gruppen
von Peptiden gepoolt.
-
Individuelle
Ergebnisse wurden als positiv betrachtet und verwendet, wenn das
Individuum auf das Der p I-Protein und zumindest ein Peptid, abgeleitet
von Der p I bei einem S.I. von 2,0 oder mehr reagierte. Eine Zusammenfassung
der Ergebnisse von 33 positiven Experimenten ist in 5 dargestellt.
Die ruhenden T-Zell-Linien, die mit rekombinanten oder nativen Der
p I-stimulierten
PBMC geprimt wurden, wurden bezüglich einer
Reaktivität
gegenüber
synthetischen Der p I-Peptiden getestet. Die maximale Reaktion für jedes
Peptid in einer Tritiierung des Antigens ist als der T-Zell-Stimulationsindex
(S.I.) ausgedrückt.
Der S.I. ist der Zähler-pro-Minute (Counts Per
Minute = CPM), eingebaut von Zellen in Reaktion auf das Peptid,
geteilt durch den CPM, eingebaut durch Zellen in Nur-Medium. Ein
S.I.-Wert von mehr als Hintergrundniveau zeigt an, dass das Peptid
ein T-Zell-Epitop enthält.
Jedoch nur individuelle S.I.-Werte
von mehr als oder gleich 2,0 (eine Reaktion zweifach oder mehr gegenüber dem
Hintergrund) wird hierin als „positive" Ergebnisse bezeichnet,
und wurden bei der Berechnung der durchschnittlichen T-Zell-Stimulationsindizes
für jedes
Peptid des Patienten oder Gruppen von Patienten, die getestet wurden,
verwendet. In Klammer oberhalb jedes Balkens auf dem Histogramm
sind die durchschnittlichen T-Zell-Stimulationsindizes nach Verwerfen
der höchsten
und niedrigsten positiven Reaktionen für jedes Peptid berechnet worden,
um den Effekt extremer Ausreißer
zu minimieren. Der T-Zell-Stimulationsindex wird durch Folgendes
berechnet:
(CPM der T-Zelle + APC + Antigen)
CPM der T-Zelle
+ APC + Kontrolle
-
Der
Balken repräsentiert
den kumulativen Rang der Peptidreaktion in den Gruppen von Patienten.
Um den kumulativen Rang zu bestimmen, wurden die fünf Peptide
mit dem höchsten
S.I. in jedem Individuum bestimmt und einem numerischen Rang in
absteigender Reihenfolge zugeordnet, wobei 5 die stärkste Reaktion repräsentiert.
Die Ränge
für jedes
Peptid wurden dann in der Gruppe von Patienten aufsummiert, um den
kumulativen Rang für
das Peptid zu bestimmen. Oberhalb jedes Balkens befindet sich die
Prozentzahl positiver Reaktionen mit einem S.I. von zumindest 2
gegenüber
dem Peptid in der Gruppe von getesteten Patienten. Unter Vorgabe
des prozentualen positiven und des durchschnittlichen T-Zell-Stimulationsindex
kann der Positivitätsindex
(P.I.) für
jedes Peptid berechnet werden. Der P.I. für jedes Individuum wird durch
Multiplizieren des durchschnittlichen S.I. durch den Prozentsatz
von Individuen in einer Population von Individuen, die gegenüber Hausstaubmilben
empfindlich sind (beispielsweise vorzugsweise zumindest 15 Individuen,
besonders bevorzugt zumindest 30 Individuen oder mehr) bestimmt,
die mit einem S.I. von zumindest 2,0 gegenüber dem Peptid reagierten (beispielsweise
wäre für DP I-1
in 5 der P.I. ungefähr 343 (73 % × 4,7).
Der P.I. repräsentiert deswegen
sowohl die Stärke
einer T-Zell-Reaktion gegenüber
einem Peptid (S.I.) als auch die Häufigkeit einer T-Zell-Reaktion
gegenüber
einem Peptid in einer Population von Individuen, die gegenüber Hausstaubmilben empfindlich
sind. 5 demonstriert, dass die Peptide
DP I-1, DP I-2, DP I-3, DP I-4, DP I-5, DP I-6,1, DP I-7,1, DP I-8,
DP I-9, DP I-16 und DP I-10 signifikante Regionen einer T-Zell-Reaktivität in dieser
Gruppe von Patienten enthalten.
-
Beispiel VI
T-Zell-Epitopstudien mit Der f I
-
Experimente,
die denjenigen von Beispiel V ähnlich
waren, wurden durchgeführt,
um die T-Zell-reaktiven
Areale des Der f I-Proteins zu bestimmen. Beispielsweise wurden
PBMC aus dem Hausstaubmilben-allergischen Patienten 783 wie in Beispiel
5 beschrieben isoliert und in vitro mit dem rekombinant aufgereinigten Der
f I zu 20 μg/ml
stimuliert. Die Ergebnisse des Proliferationsassays mit Der f I-Peptiden
unter Verwendung von mit Röntgenstrahlung
bestrahlten (3500 Rad) autologen PBMC als Antigen-präsentierenden
Zellen zeigt, dass T-Zellen aus diesem Patienten gegenüber den
Peptiden DF I-8,1, DF I-9, DF I-6, DF I-10, DF I-2,1, DF I-3, DF
I-11, DF I-5, DF I-1 und DF I-17 (Daten nicht dargestellt) reagieren.
-
Das
obige Verfahren wurde bei mehreren Patienten befolgt, außer in individuellen
Fällen,
und die T-Zellen wurden mit Affinitäts-aufgereinigten DF I zu 20 μg/ml oder
zu 10 μg/ml
geprimt und mit Röntgenstrahlen
bestrahlte (25.000 Rad) autologe Epstein-Barr-Virus-transformierte
B- Zellen wurden
als Antigen-präsentierende
Zellen verwendet. Eine Zusammenfassung der Ergebnisse von 16 positiven
Experimenten ist in 6 dargestellt. Die Daten wurden
wie in Beispiel 5 beschrieben analysiert. Die Daten zeigen, dass
signifikante Areale der T-Zell-Reaktivität im Der f I-Protein in den
Peptiden DF I-1, DF I-2, DF I-3, DF I-4, DF I-11, DF I-5, DF I-6,
DF I-7, DF I-14, DF I-15, DF I-8,1 und DF I-9 zu finden sind.
-
Beispiel VII Eine Studie,
die die Kreuzreaktivität
von Der p I- und Der p I-T-Zell-Epitopen anzeigt
-
Die
Der p I- und Der f I-Proteine sind sehr stark homolog (81 % Identität). Somit
wurden Experimente, ähnlich
zu denjenigen von Beispiel V durchgeführt, um die T-Zell-Reaktionen
von Der p I-geprimten T-Zell-Linien zu bestimmen, wenn sie mit verschiedenen
Der p I-Peptiden und im Wesentlichen übereinstimmenden Der f I-Peptiden
konfrontiert wurden. T-Zell-Linien wurden in vitro wie in Beispiel
V beschrieben geprimt und bezüglich
einer Reaktion gegenüber
einem Satz im Wesentlichen übereinstimmender
Der p I- und Der f I-Peptide (beispielsweise DP I-1 (Aminosäurereste
1-20 von Der p I) oder DF I-1 (Aminosäurereste 1-20 von Der f I)
getestet. Die Daten wurden wie in Beispiel V beschrieben analysiert,
außer
den höchsten
und den niedrigsten S.I.-Werten der positiven Reaktionen gegenüber jedem
Peptid, die aus den durchschnittlichen S.I.-Berechnungen nicht weggelassen
wurden. Eine Zusammenfassung mehrerer derartiger Experimente ist
in 7 dargestellt. Die Ergebnisse von 14 positiven
Experimenten zeigen, dass Der p I-geprimte T-Zellen gegenüber verschiedenen
Der f I-Peptiden reagieren, was auf eine Kreuzreaktivität innerhalb
der Gruppe-I-Allergene hinweist. Die Der p I-geprimten T-Zellen
reagieren signifikant auf Peptid DF I-1, DF I-2, DF I-3, DF I-4,
DF I-11, DF I-12, DF I-15, DF I-8,
DF I-9, DF I-15 und DF I-6. Bei einigen Patienten war das Der f
I-Peptid ein wirkungsvollerer Stimulator von Der p I-geprimten T-Zellen
als das entsprechende Der p I-Peptid. 8 zeigt
die Ergebnisse von inversen Experimenten, bei denen T-Zellen aus
mehreren Patienten in vitro gegenüber dem Der f I-Protein geprimt
und bezüglich
einer Reaktion gegen verschiedene Der p I-Peptide und eine Reihe im Wesentlichen übereinstimmender
Der f I-Peptide analysiert wurden. Die Ergebnisse von acht positiven
Experimenten zeigen, dass Der f I-geprimte T-Zellen signifikant
auf die Peptide DP I-1, DP I-3, DP I-4, DP I-11/11,1, DP I-14, DP
I-5, DP I-15 und DP I-8 reagieren.
-
Beispiel VIII T-Zell-Epitopstudien
mit Der p II
-
Experimente,
die denjenigen von Beispiel 5 ähnlich
waren, wurden durchgeführt,
um die T-Zell-reaktiven
Areale des Der p II-Proteins zu bestimmen. Beispielsweise wurden
PBMC aus dem Hausstaubmilben-allergischen Patienten 348 wie in Beispiel
5 beschrieben isoliert und wurden in vitro mit 20 μg/ml aufgereinigtem nativen
Der p II stimuliert. Die Ergebnisse eines Proliferationsassays unter
Verwendung von mit Röntgenstrahlen
bestrahlen (25.000 Rad) Epstein-Barr-Virustransformierten autologen
B-Zellen als Antigen-präsentierenden
Zellen mit verschiedenen Der p II-Peptiden demonstriert, dass dieser
spezielle Patient gut gegenüber
den Peptiden DP II-1, DP II-7, DP II-8, DP II-2 und DP II-9 (Daten
nicht dargestellt) reagiert.
-
Das
obige Verfahren wurde mit mehreren Patienten befolgt, außer in individuellen
Fällen
wurden T-Zell-Linien mit rekombinanten Der p II zu 20 μg/ml oder
zu 30 μg/ml
geprimt und mit Röntgenstrahlen
bestrahlte (3500 Rad) autologe PBMC wurden als Antigen-präsentierende
Zellen verwendet. Eine Zusammenfassung der Ergebnisse von 26 positiven
Experimenten ist in 9 dargestellt. Die Daten wurden
wie in Beispiel 5 beschrieben ausgewertet, außer dass die Rangsumme der
Peptidreaktionen unter Zuordnung eines Wertes von 3, 2 oder 1 zu
den drei höchsten
S.I.-Reaktionen untersucht wurde. Die Areale einer signifikanten T-Zell-Reaktivität innerhalb
des Der p II-Proteins für
diese Gruppe von Patienten war in den Peptiden DP II-1, DP II-2,
DP II-3, DP II-4, DP II-7, DP II-8 und DP II-9 zu finden.
-
Beispiel IX
T-Zell-Epitopstudien mit Der f II
-
Experimente,
die solchen von Beispiel 5 ähnlich
waren, wurden durchgeführt,
um die T-Zell-reaktiven Areale
des Der f II-Proteins zu bestimmen. Beispielsweise wurde PBMC aus
Hausstaubmilbenallergie-Patient 384 in vitro mit aufgereinigtem
rekombinanten Der f II stimuliert und die T-Zell-Linie wurde in
Gegenwart von mit Röntgenstrahlen
bestrahlten (25.000 Rad) autologen Epstein-Barr-Virus-transformierten
B-Zellen als Antigen-präsentierenden
Zellen mit verschiedenen überlappenden
Der f II-Peptiden konfrontiert. Die Ergebnisse dieses Proliferationsassays
zeigen, dass T-Zellen von diesem speziellen Patienten gut mit den
Peptiden DF II-1, DF II-2, DF II-3,1, DF II-4,5, DF II-15, DF II-16
und DF II-19,1 (Daten nicht dargestellt) reagieren.
-
Das
obige Verfahren wurde mit 10 Patienten befolgt, außer dass
in individuellen Fällen
T-Zell-Linien durch
Stimulieren der Patienten PBMC mit 20 μg/ml oder 3 μg/ml aufgereinigter nativer
Der f II geprimt wurden und sie wurden in Gegenwart von mit Röntgenstrahlen
bestrahlten (3500 Rad) autologen PBMC als Antigen-präsentierenden
Zellen untersucht. Eine Zusammen fassung der Ergebnisse von 10 positiven
Experimenten ist in 10 dargestellt. Die Daten wurden
wie in Beispiel IX dargestellt analysiert, außer dass die höchsten und
niedrigsten S.I.-Werte der positiven Reaktionen gegenüber jedem
Peptid aus den Berechnungen nicht entfernt wurden. Die Daten zeigen,
dass signifikante Areale einer T-Zell-Reaktivität innerhalb des Der f II-Proteins in den Peptiden
DF II-1, DF II-2, DF II-13,1, DF II-4,5, DF II-15, DF II-17 und
DF II-19,1 zu finden
sind.
-
Beispiel X eine Studie,
die auf die Kreuzreaktivität
von Der p II- und Der f II-T-Zell-Epitopen hinweist
-
Eine
zur Studie von Beispiel VII ähnliche
Studie wurde durchgeführt,
um die T-Zell-Kreuzreaktivität der Der
p II- und Der f II-Proteine zu bestimmen. T-Zellen, die mit dem
Der f II-Protein geprimt wurden, wurden mit verschiedenen Der f
II-Peptiden und mit einer Reihe von im Wesentlichen übereinstimmender
Der p II-Peptide konfrontiert. Eine Zusammenfassung der Ergebnisse
von 10 positiven Experimenten ist in 11 dargestellt. Die
Ergebnisse zeigen, dass Der f II-geprimte T-Zellen signifikant mit
den Peptiden DP II-1, DP II-3/3,1, DP II-4 und DP II-7 reagieren. 12 zeigt die Ergebnisse von inversen Experimenten,
bei denen T-Zellen aus mehreren Patienten in vitro gegenüber dem
Der p II-Protein geprimt und bezüglich
einer Reaktion auf verschiedene Der f II-Peptide untersucht wurden.
Die Ergebnisse von 26 positiven Experimenten zeigen, dass Der p
II-geprimte T-Zellen signifikant gegenüber den Peptiden DF II-1, DF
II-4,5, DF II-15, DF II-17, DF II-18 und DF II-19,1 reagieren.
-
Beispiel XI
Synthese von dominanten Peptiden
-
Auf
Grundlage der in den Beispielen V bis X beschriebenen Analysen wurden
Hauptareale einer T-Zell-Reaktivität innerhalb von Der p I, Der
p II, Der f I und Der f II identifiziert. In jeder der Studien reagierten alle
der getesteten Patienten gegenüber
dem Proteinallergen (beispielsweise Der p I) und zumindest einem Peptid,
abgeleitet aus dem Hauptareal einer T-Zell-Reaktivität innerhalb
des Proteins. Sieben Regionen (Region 1, Region 2, Region 3, Region
4, Region 5, Region 6a und Region 6b) der Haupt-T-Zell-Reaktivität wurden in
den Der p I- und Der f I-Proteinen
identifiziert. Diese Regionen sind wie folgt definiert: Region 1,
Aminosäurereste
1-28 der Der p I- und Der f I-Proteine; Region 2, Aminosäurereste
36-68 der Der p I- und Der f I-Proteine;
Region 3, Aminosäurereste
74-109 der Der p I- und Der f I-Proteine; Region 4, Aminosäurereste
118-139 der Der p I- und Der f I-Proteine; Region 5, Aminosäurereste
141-146 der Der p I- und Der f I-Proteine; und Region 6a, Aminosäurereste
161-185 der Der p I- und Der f I-Proteine
und Region 6b, Aminosäurereste 173-201
der Der p I- und Der f I-Proteine.
-
In ähnlicher
Weise wurden vier Regionen einer Haupt-T-Zell-Reaktivität (Region
7, 8, 9 und 10) in Der p II- und Der f II-Proteinen identifiziert.
Diese Regionen sind wie folgt definiert: Region 7, Aminosäurereste
1-26 von Der p II- und Der f II-Proteinen; Region 8, Aminosäurereste
33-67 der Der p II- und Der f II-Proteine; Region 9, Aminosäurereste
79-104 der Der p II- und Der f II-Proteine; und Region 10, Aminosäurereste
107-129 der Der p II- und der f II-Proteine. Basierend teilweise
auf der 7-Zell-Reaktivität,
die in den Beispielen V bis X beschrieben wurde, wurden Peptide,
die von Der p I, Der f I, Der p II und Der f II abgeleitet waren,
ausgewählt und
durch Addition oder Deletion von Aminosäureresten am entweder 5'- oder 3'-Ende des Peptides
modifiziert. Bei der Entwicklung dieser ausgewählten Peptide wurden verschiedene
Faktoren in Erwägung
gezogen, einschließlich
der Rangsumme der überlappenden
Peptide, der Prozentzahl der Reaktionen mit einem S.I. von zumindest
2,0 gegenüber
den Peptiden, der potentiellen Kreuzreaktivität der Peptide, der Schwierigkeit
der Herstellung der Peptide etc. T-Zell-Studien, die solchen in
den Beispielen V bis X ähnlich
waren, wurden unter Verwendung dieser ausgewählten Peptide durchgeführt, um
die Hauptareale der T-Zell-Reaktion innerhalb der Regionen 1 bis
6a und 6b des Der p I- und Der f I-Proteins und der Regionen 7 bis
10 des Der p II- und Der f II-Proteins
präziser
zu definieren.
-
Die
Ergebnisse von T-Zell-Studien unter Verwendung ausgewählter Peptide,
die aus den Der p I-, Der f I-, Der p II- und Der f II-Proteinen
abgeleitet waren, sind in den 13 bis
18a/d dargestellt. Das in Beispiel 5 beschriebene Verfahren wurde
mit T-Zell-Linien von mehreren Patienten befolgt, die in vitro gegenüber dem Der
p I-Protein geprimt wurden, die danach bezüglich einer Reaktion auf ausgewählte Peptide
analysiert wurden, die aus der Der p I-Sequenz abgeleitet wurden.
Die Ergebnisse von 33 positiven Experimenten, die in 13 dargestellt sind, zeigen, dass die Der p I-geprimten
T-Zellen signifikant gegenüber
Peptiden reagieren, die in den Peptiden DP I-21,1, DP I-21,2, DP
I-22,2, DP I-25,2, DP I-22,1, DP I-23,1, DP I-23,2, DP I 26,1 und DP
I 28,1 zu finden sind.
-
In ähnlicher
Weise wurde das in Beispiel VI beschriebene Verfahren mit T-Zell-Linien
aus neun Patienten befolgt, die in vitro gegenüber dem Der f I-Protein geprimt
wurden, die dann bezüglich
einer Reaktion ausgewählter
Peptide, die von dem Protein abgeleitet wurden, analysiert wurden.
Die Daten wurden wie in Beispiel VI beschrieben analysiert. Die
Ergebnisse der neun Patienten, die in 14 dargestellt
sind, demonstrieren eine T-Zell-Reaktivität gegenüber ausgewählten Peptiden aus Der f I.
-
In
einem weiteren Experiment wurden die T-Zell-Linien aus mehreren
Patienten in vitro gegenüber dem
Der p I-Protein geprimt und bezüglich
einer Reaktion gegenüber
ausgewählten
Peptiden, die aus dem Der p I-Protein abgeleitet wurden, und einer
Reihe von im Wesentlichen übereinstimmender
Peptide, die aus dem Der f I-Protein gewonnen wurden, analysiert.
Die Daten aus 30 positiven Experimenten wurden wie in Beispiel V
beschrieben analysiert. Wie in 15a dargestellt
ist, reagieren die Der p I-geprimten T-Zellen signifikant gegenüber Peptiden
DF I-21,1, DF I-21,2,
DF I-23,1, DF I-22,2, DF I-22,3, DF I-22,4, DF I-23,2, DF I-25,1,
DF I-26,1 und DF I-27,1. 15b ist
eine Untergruppe der in 15a dargestellten
Daten und zeigt die Reaktion von Der p I-geprimten T-Zellen gegenüber Peptiden,
die durch Rangsumme analysiert wurden. 15b zeigt, dass
DP I-23,1 die höchste
Rangsumme dieser Gruppe von Peptiden in dieser Studie aufweist. 16a zeigt die Ergebnisse des inversen Experimentes,
bei dem T-Zellen
aus neun Patienten in vitro gegenüber dem Der f I-Protein geprimt
und mit ausgewählten
Der f I-Peptiden und einer Reihe im Wesentlichen übereinstimmender Der
p I-Peptid konfrontiert wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass Der
f I-geprimte T-Zellen aus neun Patienten gegenüber ausgewählten Peptiden aus Der p II
reagieren. 16a zeigt, dass DF I-22,1 und
DF I-25,1 die höchsten
Stimulationsindizes dieser Gruppe von Peptiden aufweisen. 16b ist eine Untergruppe derselben Daten, wie
sie in 16a dargestellt sind, und zeigt
die Reaktion bevorzugter Der f I- und Der p I-Peptide. 16b zeigt das DF I-22,2 den höchsten Stimulationsindex dieser
Gruppe von bevorzugten Peptiden in diesem Experiment aufweist.
-
Ein
weiteres Experiment folgend dem in Beispiel VIII beschriebenen Verfahren
analysierte die Reaktion von 29 Patienten, die in vitro gegenüber dem
Der p II-Protein geprimt und mit ausgewählten Peptiden konfrontiert
wurden, die aus der Der p II-Sequenz abgeleitet waren. 17a zeigt, dass Der p II-geprimte T-Zellen aus
einem Patienten gegenüber
ausgewählten
Peptiden von Der p II reagieren. 17b zeigt
die Ergebnisse aus einem Experiment, das dem in 17a gezeigten ähnlich
ist, mit einer Reihe von 30 Patienten und mit dem höchsten und
niedrigsten Wert, der vom Mittelwert ausgenommen ist. 17b zeigt, dass DP II-20,6 die höchste Rangsumme
dieser Gruppe bevorzugter Peptide in dieser Studie aufweist. 18a zeigt das inverse bzw. umgekehrte Experiment,
bei dem T-Zellen von einem Patient in vitro gegenüber dem
Der f II-Protein geprimt und mit ausgewählten Peptiden, die aus der
Der p II-Sequenz abgeleitet waren, konfrontiert wurden. 18a zeigt, dass die Der f II-geprimten T-Zellen
von 10 Patienten gegenüber
ausgewählten
Peptiden aus Der p II reagieren. Wie in 18a dargestellt
ist, weist DP II-25 den höchsten
Stimulationsindex auf. 18b ist
eine Untergruppe derselben Daten, die in 18a dargestellt
sind, und zeigt die Reaktion nativer Der f II-geprimter T-Zell-Linien
gegenüber
bevorzugten Der p II-Peptiden, die durch Rangsumme analysiert wurden.
Wie in 18b dargestellt ist, weist
DP II-25,2 die höchste
Rangsumme der bevorzugten Peptide in dieser Studie auf.
-
Beispiel XII
Studie die die Kreuzreaktivität
ausgewählter
Gruppe-I- und Gruppe-II-Epitope zeigt
-
Eine
Studie, die derjenigen in Beispiel 7 beschriebenen ähnlich ist,
wurde mit T-Zellen aus vier zusammenpassenden Patienten durchgeführt, die
in vitro mit Gruppe-I-Proteinen aus Der f und Der p geprimt wurden, danach
bezüglich
einer Reaktion auf ausgewählte
bevorzugte Peptide aus Der p I und Der f I analysiert. Die Ergebnisse
in 18c zeigen, dass die T-Zell-Reaktivität gegenüber mehreren
der ausgewählten
Der p I-Peptide im Wesentlichen bezüglich ihrem Der f I-Gegenstück und umgekehrt äquivalent
waren. 18d zeigt die Ergebnisse einer ähnlichen
Studie mit T-Zellen aus sechs zusammenpassenden bzw. gematchten
Patienten, die in vitro mit Gruppe-II-Proteinen aus Der p und Der
f geprimt wurden, danach bezüglich
einer Reaktion auf ausgewählte
bevorzugte Der p II- und Der f II-Proteine analysiert. Ähnlich den
Ergebnissen in 18c sind die T-Zell-Reaktivität gegenüber mehreren
der ausgewählten
bevorzugten Peptide von Der p II im Wesentlichen ihren Der f II-Gegenstücken und
umgekehrt äquivalent.
-
Beispiel XIII
Direkter Bindungsassay von IgE an Milbenallergenproteinen und -peptiden
-
Corning-Assayplatten
(Nr. 25882-96) wurden mit 5 μg/ml
von jedem Beschichtungsantigen beschichtet, das in den 19, 20 und 21 aufgelistet ist, zu 50 μl/100 ml/Well
und über
Nacht bei 4° C
inkubiert. Die Beschichtungsantigene wurden entfernt und die Wells
wurden mit 0,5 % Gelatine in PBS, 300 μl/Well für 2 Stunden beim Raumtemperatur
blockiert. Gepooltes humanes Plasma (ein Gemisch von Plasmaproben
aus 20 Patienten, die bezüglich
kommerziellem Milbenextrakt einem positiven Hauttest unterzogen
wurden) wurden seriell mit PBS/Tween 20 (PBS mit 0,05 % nicht-ionischem
Tensid Tween 20 Sigma, St. Louis, MO) verdünnt und 100 μl/Well wurden
zugesetzt und über
Nacht bei 4° C
inkubiert (Plasmaverdünnungen
wurden zweifach getestet). Der zweite Antikörper (biotinylierter Ziegen-anti-humaner-IgE
1:1000, Kirkegaard & Perry Laboratories
Inc., Gaithersburg, MD) wurden zu 100 μl/Well für 1 Stunde bei Raumtem peratur
zugesetzt. Diese Lösung
wurde entfernt und Streptavidin-HRPO 1:10.000 (Southern Biotechnology
Associates Inc., Birmingham, AL) wurden zu 100 μl/Well für 1 Stunde bei Raumtemperatur
zugesetzt (alle Wells wurden dreimal mit PBS-Tween zwischen jedem
Inkubationsschritt gewaschen). Ein TMB-Membranperoxidase-Substratsystem (Kirkegaard & Perry Laboratories)
wurde frisch geschnitten bzw. zerhackt und zu 100 ml/Well zugesetzt.
Man ließ die
Farbe für
2 bis 5 Minuten sich entwickeln. Die Reaktion wurde durch Zusatz
von 100 ml/Well 1 M Phosphorsäure
gestoppt. Die Platten wurden auf einem Mikroplatten IL310 Autoreader
(Biotech Instruments, Winooski, VT) mit einem 450-nm-Filter abgelesen.
Die Extinktionsniveaus von zweifachen Wells wurden gemittelt. Die
graphischen Ergebnisse (log der Verdünnung gegen Extinktion) der
ELISA-Assays sind in den 19a–b, 20a–b
und 21a–h dargestellt. Die Reihenfolge
der Beschichtungsantigene, die in diesen Figurlegenden vertikal
aufgelistet sind, entspricht in ihrer Reihenfolge von links nach
rechts den Beschichtungsantigenen, die für jedes Histogramm aufgelistet
sind.
-
Die
Ergebnisse des ELISA-Assays, dargestellt in 19b,
zeigen die gute Bindung sowohl von biochemisch aufgereinigtem Der
p II als auch rekombinantem Der p II (rDer p II) mit humanem IgE
und einer nicht-nachweisbaren Bindung an Der p II-Peptide. Die IgE-Bindung
an die Der p II-Reihe
von Peptiden und Proteinen (20a und 20b) zeigt dasselbe Muster einer Reaktivität wie die
Der f-Reihe. Das heißt,
keine nachweisbare Bindung an Der f I- oder Der f II-Peptide oder
rekombinantes Der f I mit einer Bindung an nur biochemisch aufgereinigtes
Der f I und rekombinantes und biochemisch aufgereinigtes Der f II.
In beiden Fällen scheint
eine bessere Bindung eines rekombinantes Der p II oder Der f II
als an die biochemisch aufgereinigten Formen stattzufinden. All
die Schlussfolgerungen, die aus den obigen ELISA-Assay-Daten abgeleitet
wurden, wurden durch ein anderes Assayverfahren bekräftigt, Dot
Blots auf Nitrocellulosepapier, unter Verwendung derselben Reihe
von Antikörpern
und Antigenreagenzien.
-
Die
Antigenpräparation,
die als positive Kontrolle verwendet wurde, war ein Gemisch aus
den vier biochemisch aufgereinigten Hauptmilbenallergenen (genannt
PMA für
aufgereinigtes Milbenallergen (Purified Mite Allergen)); Der f I,
Der f II, Der p I und Der p II. Der Ansatz wurde in einer Konzentration
von 100 μg
jedes Proteins pro ml oder 400 μg
Gesamtprotein/ml erzeugt. Diese Zubereitung wurde auf jeder beschichteten
ELISA-Platte verwendet. Die Ergebnisse aus diesen ELISA-Assays sind
in den 21a–h dargestellt. Es existiert eine
klare Bindung an entweder das aufgereinigte oder rekombinante Protein
der PMA-Antigenzubereitung auf jeder Platte, was auf ein gute IgE-Reaktivität hinweist.
Jedoch zeigt die PMA-Antigenzubereitung einen hohen Grad an unspezifischer
Reaktivität,
gezeigt in einer Hintergrundverdünnung,
bei der keine erste Antikörperlösung zugesetzt
wurde. Diese unspezifische Reaktivität tritt zwischen dem PMA-Antigen
und dem biotinylierten zweiten Antikörper auf und verschlechtert
die Auffindung spezifischer IgE-Reaktivität gegenüber dem Antigen nicht. Unter
Verwendung eines quantitativen zweifachen Volumens gegenüber dem
Hintergrund in der höchsten
Plasmakonzentration als positive Ablesung existiert keine nachweisbare
IgE-Reaktivität
gegenüber
einem der 56 Peptide, die durch dieses Assayverfahren gescreent
wurden.
-
Sequenzprotokoll:
-
-
- General information:
- allgemeine Information
- Title of invention:
- Titel der Erfindung
- Number of sequences:
- Anzahl der Sequenzen
- Information for SEQ
ID NO:
- Information für SEQ ID
NO:
- Sequence characteristics:
- Sequenzeigenschaften
- Length:
- Länge
- Typ:
- Typ
- Strandedness:
- Strängigkeit
- Topology:
- Topologie
- Molecule type:
- Molekültyp
- Feature:
- Merkmal
- Location:
- Ort
- Sequence description:
- Sequenzbeschreibung
- Amino acid:
- Aminosäure
- Single:
- einzeln
- Name/key:
- Name/Schlüssel
- Base pair:
- Basenpaar
- Nucleic acid:
- Nukleinsäure
- Peptide:
- Peptid
-
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