FI121670B

FI121670B - Dermatophagoidesista (huonepölypunkeista) peräisin olevien pääasiallisten allergeenien T-soluepitoopit

Info

Publication number: FI121670B
Application number: FI954895A
Authority: FI
Inventors: Richard D Garman; Mei-Chang Kuo; Julia L Greenstein; Bruce L Rogers; Henry M Franzen
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 1993-04-14
Filing date: 1995-10-13
Publication date: 2011-02-28
Also published as: NO316922B1; DE69333979D1; DE69333979T2; NO954095L; CA2160121C; AU4102693A; FI954895A0; AU680820B2; FI954895A; EP0694067A1; CA2160121A1; NO954095D0; JPH09501043A; EP0694067B1; KR960701995A

Description

Dermatophagoidesista (huonepölypunkeista) peräisin olevien pääasiallisten allergeenien T-soluepitoopit - T-cellepito-per av huvudsakliga allergener frän Dermatophagoides (rums-dammkvalster) 5

Viimeaikaisissa raporteissa on dokumentoitu ryhmän I (esim. Der p I ja Der f I) ja ryhmän II (esim. Der p II ja Der f II) proteiiniallergeenivasteiden tärkeys huonepölypunkkial-10 lergiassa. On dokumentoitu esimerkiksi, että yli 60 %:lla potilaista vähintään 50 % punkin vastaisista vasta-aineista on suuntautunut näitä proteiineja vastaan (esim. Lind, P. et ai., Allergy, 39:259-274), van der Zee, J.S. et ai., Journal Allergy and Clinical Immunology, 81:884-896 15 (1 988)). On mahdollista, että lapsien reaktiivisuusaste ryhmän I ja ryhmän II allergeeneihin on suurempi (Thompson, P.J. et ai, Immunology, 64^:301-314 (1988)). Allergisuuteen suvun Dermatofagoides (D) punkeille liittyy sellaisia tiloja kuin astma, nuha ja virhepaikkainen ihottuma. Kaksi la-20 jia, D. pteronyssinus ja D. farinae, ovat vallitsevia ja : siksi on ponnisteltu merkittävästi yrittäen identifioida näiden kahden lajin tuottamat allergeenit.

Sekä D. pteronyssinusista että D. farinaesta peräisin ole-; 25 via pääasiallisia allergeenejä on yritetty karakterisoida.

< · i ‘I’.* Näin ollen useissa julkaisuissa on raportoitu useiden al- ’ lergeenien mukaan lukien Der p I (Thomas, W.R. et ai., In ternational Archives of Allergy and Applied Immunology, 85:127-129 (1988) ja Chua, K.Y. et ai., Journal of Experi-30 mental Medicine, 167:175-182 (1988)), Der p II (Chua, K.Y.

j.j · et ai., International Archives of Allergy and Applied Im- munology, 9J_:1 1 8 — 1 23 (1 990)), Der f I (Dilworth, R.J. et ai., Clinical and Experimental Allergy, 21_:25-32 /1 981 ), ’*. Der f II (Yuuki, T. et ai., Japan Journal Allergol., 35 3_9: 557-461 ( 1 990) ja Trudinger, M. et ai., Clinical and • « · | * : Experimental Allergy, 21_:33-37 (1 991 )) ja alhaisen molekyy- ·;··: lipainon allergeenin (Ovey, E.R. et ai., Journal of Experi mental Medicine, 170:1457-1462 (1989)) täydellinen nukleo-tidisekvenssi.

2

Der p I:tä ja Der p II:ta koodaavien cDNAriden julkaistut nukleotidisekvenssit osoittavat, että nämä kaksi proteiinia ovat erittäin homologisia aminohappotasolla (81 %:n indent-tisyys) ja että kypsät proteiinituotteet koostuvat vastaa-5 vasti 222 ja 223 tähteestä (Chua, K.Y. et ai., Journal of Experimental Medicine, 167:175-182 (1988) ja Dilworth, R.J. et ai., supra)). Proteiiniallergeenit Der p I ja Der f II koostuvat kumpikin 129 tähteestä ja ne ovat myös erittäin homologisia (88 %:n identtisyys) aminohapposekvenssiltään 10 (Trudinger, M et ai., supra, Yuuki, T. et ai., supra, Chua, K.Y. et ai., International Archives of Allergy and Applied Immunology 91_: 1 1 8 — 1 23 (1990)).

Der p I:tä ja Der p II:ta koodaavien cDNA:iden eristäminen 15 on mahdollistanut vasta-aineiden sitoutumistutkimukset re-kombinanttisissa antigeeneissä (Green, W.K. et ai., International Archives of Allergy and Applied Immunology, 92:30-38 (1990), Chua, K.Y. et ai., International Archives of Allergy and Applied Immunology, 91_: 124-129 (1 990)). Der 20 p I:n komplementaarisia DNA-fragmentteja on ilmennetty E. * colissa ja yhdistetyillä ihmisen punkkiallergisilla IgE- • · · : seerumeilla suoritetut IgE-sitoutumistutkimukset ovat :V: osoittaneet sitoutuvia alueita ja sitoutumattomia alueita ··· kaikkialla molekyylissä (Thomas, W.R. et ai., Epitopes of : .·. 25 Atopic Allergens, Proceedings of Workshop from XIV Congress • · · · of the European Academy of Allergy and Clinical Immunology, Berlin, Sept. 1989, s. 77-82). Der p l:n T-soluepitoopit on raportoitu (O'Hehir, R.E. et al., Annual Review Immunology , 9.:67-95 (1991 ), Stewart, G.A. et al., Epitopes of 30 Atopic Allergens, Proceedings of Workshop from XIV Congress :.: : of the European Academy of Allergy and Clinical Immunology, ·.’ * Berlin, Sept. 1989, s. 41-47), Yessel, H. et al., T cell .**·. Activation in Health and Disease: Discrimination Between « • · « ....: Immunity and Tolerance, Conference 22-26 Sept., 1990, Tri- 35 nity College, Oxford, UK ja Hessel, H. et al., Journal of • · · : V Immunology, 148 (3):738-745 (1.2.1992).

Esillä oleva keksintö saa aikaan suvun Dermatophagoides pääasiallisten proteiiniallergeenien eristettyjä modifioi- 3 tuja peptidejä. Keksinnön piiriin kuuluvat peptidit käsittävät allergeeneistä Der p I, Der p II, Der f I tai Der f II valitun proteiiniallergeenin vähintään yhden T-soluepi-toopin, edullisesti vähintään kaksi T-soluepitooppia. Li-5 säksi keksintö sa aikaan peptidejä, jotka käsittävät punk-kiproteiiniallergeenin vähintään yhden T-soluepitoopin. Alueet johdetaan suvn Dermatophagoides samoista tai erilaisista proteiiniallergeeneistä.

10 Saadaan aikaan myös keksinnön mukaisia peptidejä, joita on lisäksi modifioitu ja joilla on samanlaisia tai parantuneita terapeuttisia ominaisuuksia kuin vastaavalla luontaisesti esiintyvällä allergeenilla tai sen osalla, mutta joiden sivuvaikutukset ovat vähentyneet, sekä modifioituja pepti-15 dejä, joiden ominaisuudet ovat parantuneet, kuten että niillä on lisääntynyt liukenevuus ja stabiilius. Keksinnön mukaiset peptidit kykenevät modifioimaan huonepölypunkki-herkissä ihmisissä, joille niitä annetaan, henkilön allergisen vasteen huonepölypunkkiallergeenille tai allergeenil-20 le, joka on immunologisesti ristireaktiivinen huonepöly-· punkkiallergeenin kanssae. Saadaan aikaan myös henkilön : : : huonepölypunkkiherkkyyden hoito- tai diagnosointimenetelmiä ja terapeuttisia koostumuksia, jotka käsittävät yhtä tai ·· useampaa keksinnön mukaista peptidiä.

:*!·. 25

Piirrustusten kuvaus

Kuvio 1 esittää D. pteronyssinusista ja D. farinaesta peräisin olevien ryhmän I ja ryhmän II allergeenien alakloo-naamista ja ilmentämistä.

30 • ·

Kuvio 2 esittää Der p i:n ja Der f I:n ilmentämisessä käy-·.· tettyjä adaptoreita ja kuvio 2b esittää Der f II ja Der p .··· II vahventamisen aloittajia ja Der f Ii:n mutageneesin aloittajaa.

35 t · · • · · #i : Kuvio 3 esittää erilaisia halutun pituisia peptidejä, jotka on johdettu Der p I- ja Der p II -proteiiniallergeeneistä.

4

Kuvio 4 esittää erilaisia halutun pituisia peptidejä, jotka on johdettu Der f I- ja Der f II -proteiiniallergeeneistä.

Kuvio 5 on graafinen esitys, joka kuvaa 33 potilaasta pe-5 räisin olevien T-solulinjojen vasteita, jotka on herätetty in vitro joko puhdistetulle luontaiselle (N) tai rekombi-nanttiselle (R) Der p I -proteiinille ja vaste erilaisille limittyville Der p I -peptideille on analysoitu vastepro-sentteina sekä T-stimulointi-indeksinä (S.I.) vähintään 2 10 testatussa henkilössä, positiivisten vasteiden peptidille keskimääräistä T-solustimulointi-indeksiä ja peptidivastei-den järjestykseen asetettua summaa.

Kuvio 6 on graafinen esitys, joka kuvaa 16 potilaasta pe-15 räisin olevien T-solulinjojen vasteita, jotka on herätetty in vitro Der f I -proteiinille ja vaste erilaisille limittyville Der f I -peptideille on analysoitu vasteprosenttei-na sekä (S.I.):nä vähintään 2 testatussa henkilössä, positiivisten vasteiden peptidille keskimääräistä T-solustimu-20 lointi-indeksiä ja peptidivasteiden järjestykseen asetettua • · : summaa.

• · · • ·

Kuvio 7 on graafinen esitys, joka kuvaa 14 potilaasta pe- • · räisin olevien T-solulinj oj en vasteita, jotka on herätetty • · · · ; .·. 25 in vitro Der p I -proteiinille ja vaste erilaisille limit- ”V tyville Der p I -peptideille ja oleellisesti yhdenvertai- • · · sille Der p I -peptideille on analysoitu vasteprosentteina sekä (S.I.):nä vähintään 2 testatussa henkilössä, positiivisten vasteiden peptidille keskimääräistä T-solustimuloin-30 ti-indeksiä ja peptidivasteiden järjestykseen asetettua • · summaa.

• ·♦ • · • · • · .··· Kuvio 8 on graafinen esitys, joka kuvaa 8 potilaasta peräi- ....· sin olevien T-solulinj oj en vasteita, jotka on herätetty in • · .. 35 vitro Der f I -proteiinille ja vaste erilaisille limitty- • · · : V ville Der f I -peptideille ja oleellisesti yhdenvertaisil- *:**· le Der f I -peptideille on analysoitu vasteprosentteina sekä (S.I.):nä vähintään 2 testatussa henkilössä, positiivisten vasteiden peptidille keskimääräistä T-solustimuloin- 5 ti-indeksiä ja peptidivasteiden järjestykseen asetettua summaa.

Kuvio 9 on graafinen esitys, joka kuvaa 29 potilaasta pe-5 räisin olevien T-solulinjojen vasteita, jotka on herätetty in vitro Der p II -proteiinille ja vaste erilaisille limittyville Der p II -peptideille on analysoitu vasteprosent-teina sekä (S.I.):nä vähintään 2 testatussa henkilössä, positiivisten vasteiden peptidille keskimääräistä T-solu-10 stimulointi-indeksiä ja peptidivasteiden järjestykseen asetettua summaa.

Kuvio 10 on graafinen esitys, joka kuvaa 10 potilaasta peräisin olevien T-solulinjojen vasteita, jotka on herätetty 15 in vitro Der f II -proteiinille ja vaste erilaisille limittyville Der f II -peptideille on analysoitu vasteprosent-teina sekä (S.I.):nä vähintään 2 testatussa henkilössä, positiivisten vasteiden peptidille keskimääräistä T-solu-stimulointi-indeksiä ja peptidivasteiden järjestykseen ase-20 tettua summaa.

• · • · • · • · ·

Kuvio 11 on graafinen esitys, joka kuvaa 10 potilaasta pe-räisin olevien T-solulinjojen vasteita, jotka on herätetty • · .: in vitro Der f II -proteiinille ja vaste erilaisille limit- *. 25 tyville Der f II -peptideille ja oleellisesti yhdenvertai- • · sille Der f I -peptideille on analysoitu vasteprosentteina • · sekä (S.I.):nä vähintään 2 testatussa henkilössä, positiivisten vasteiden peptidille keskimääräistä T-solustimuloin-ti-indeksiä ja peptidivasteiden järjestykseen asetettua 30 summaa.

• · • · • · • · · • · · ·.: Kuvio 12 on graafinen esitys, joka kuvaa 26 potilaasta pe- .··· räisin olevien T-solulinjojen vasteita, jotka on herätetty • in vitro Der p II -proteiinille ja vaste erilaisille limit- .. 35 tyville Der p II -peptideille on analysoitu vasteprosent- • · · • *.· teinä sekä (S.I.):nä vähintään 2 testatussa henkilössä, *”*· positiivisten vasteiden peptidille keskimääräistä T-solu- stimulointi-indeksiä ja peptidivasteiden järjestykseen asetettua summaa.

6

Kuvio 13 on graafinen esitys, joka kuvaa 33 potilaasta peräisin olevien T-solulinjojen vasteita, jotka on herätetty in vitro Der p I -proteiinille ja vaste valituille Der p I -proteiiniallergeenistä johdetuille halutun pituisille 5 peptideille on analysoitu vasteprosentteina sekä (S.I.):nä vähintään 2 testatussa henkilössä, positiivisten vasteiden peptidille keskimääräistä T-solustimulointi-indeksiä ja peptidivasteiden järjestykseen asetettua summaa.

10 Kuvio 14 on graafinen esitys, joka kuvaa 9 potilaasta peräisin olevien T-solulinjojen vasteita, jotka on herätetty in vitro Der f I -proteiinille ja vaste valituille Der f I -proteiiniallergeenistä johdetuille halutun pituisille peptideille on analysoitu vasteprosentteina sekä (S.I.):nä vä-15 hintään 2 testatussa henkilössä, positiivisten vasteiden peptidille keskimääräistä T-solustimulointi-indeksiä ja peptidivasteiden järjestykseen asetettua summaa.

Kuvio 15a on graafinen esitys, joka kuvaa 30 yhteensopivas-20 ta potilaasta peräisin olevien T-solulinj oj en vasteita, • · ·,· · jotka on herätetty in vitro Der p I -proteiinille ja vaste valituille Der p I ja Der f I -proteiiniallergeenistä joh- :*:*· detuille halutun pituisille peptideille on analysoitu vas- • · .j. teprosentteina sekä (S.I.):nä vähintään 2 testatussa hen- • · » · : .·. 25 kilössä, positiivisten vasteiden peptidille keskimääräistä .·.· T-solustimulointi-indeksiä ja peptidivasteiden järjestyk- • · seen asetettua summaa.

Kuvio 15b on graafinen esitys, joka on johdettu samoista 30 tiedoista kuin kuvion 15a tiedot ja joka esittää Der p 1:1-

i.: lä herätettyjen T-soluj en vastetta edullisille Der p I

• ·· ♦.· -peptideille analysoituna vasteprosentteina sekä (S.I.):nä • · .**· vähintään 2 testatussa henkilössä (kunkin pylvään yläpuo- • · · lella), keskimääräistä T-solustimulointi-indeksiä (jokaisen .. 35 pylvään yläpuolella suluissa) ja peptidivasteiden järjes- • · · ! *.· tykseen asetettua summaa.

• ···

Kuvio 16a on graafinen esitys, joka kuvaa 9 potilaasta peräisin olevien T-solulinjojen vasteita, jotka on herätetty 7 in vitro Der f I -proteiinille ja vaste valituille Der f I ja Der p I -proteiiniallergeenistä johdetuille halutun pituisille peptideille on analysoitu vasteprosentteina sekä (S.I.):nä vähintään 2 testatussa henkilössä, ja vasteiden 5 keskimääräistä T-solustimulointi-indeksiä sekä vähintään 2:n S.I.:tä peptidille.

Kuvio 16b on graafinen esitys, joka on johdettu samoista tiedoista kuin kuvion 16a tiedot ja joka esittää Der p I:Ι-ΙΟ lä herätettyjen T-solujen vastetta edullisille Der f I- ja Der p I -peptideille vasteprosentteina sekä (S.I.):nä vähintään 2 testatussa henkilössä ja vasteiden keskimääräistä T-solustimulointi-indeksiä sekä vähintään 2:n S.I.:tä peptidille.

15

Kuvio 17a on graafinen esitys, joka kuvaa 29 potilaasta peräisin olevien T-solujen vastetta, jotka on herätetty in vitro Der p II -proteiinille ja vaste valituille Der p II proteiinista johdetuille halutun pituisille peptideille on 20 analysoitu vasteen T-solustimulointi-indeksillä sekä vähin- ·.· . tään 2:n S.I.:llä peptidille.

• · · • « ·'·*· Kuvio 17b on graafinen esitys, joka kuvaa 30 Der p II -pro- • · teiinille herätetyn potilaan vastetta, ja vaste valituille • ·· · : .· 25 Der p II proteiinista johdetuille halutun pituisille pep- • · • · · #·,· tideille on analysoitu vasteprosenttina sekä S.I.rnä vähin- • · tään kahdessa testatussa henkilössä (kunkin pylvään yläpuolella), keskimääräistä T-solustimulointi-indeksiä (kunkin pylvään yläpuolella suluissa) sekä peptidivasteen järjes-30 tykseen sijoitettua summaa (X-akseli).

• · • · · • · ·*· • ··

Kuvio 18a on graafinen esitys, joka kuvaa 10 potilaasta • · .··· peräisin olevien T-solujen vasteita, jotka on herätetty in .”*· vitro Der f II -proteiinille, ja vaste valikoiduille Der p • * .. 35 II- ja Der f II -proteiinista johdetuille halutun pituisi- ·· · : *.* Ile peptideille on analysoitu vasteen T-solustimulointi-in- ’·**· deksillä sekä vähintään 2:n S.I.rllä peptidille.

8

Kuvio 18b on graafinen esitys, joka on johdettu samoista tiedoista kuin kuvion 18a tiedot ja joka esittää Der f Ilrllä herätettyjen T-solulinjojen vastetta edullisille Der p II -peptideille analysoituna vasteprosentteina sekä (S-5 .I.):nä vähintään 2 testatussa henkilössä (kunkin pylvään yläpuolella), keskimääräistä T-solust imuloint i-indeksiä (kunkin pylvään yläpuolella suluissa) sekä peptidivasteiden järjestykseen laitettua summaa (X-akseli).

10 Kuvio 18c on graafinen esitys, joka kuvaa 4 yhteensopivasta potilaasta peräisin olevien T-solulinjojen vasteita, jotka on herätetty in vitro punkkiryhmän I allergeenillä ja vaste edullisille Der p I- ja Der f I -peptideille on analysoitu vasteprosentilla sekä S.I.tllä vähintään 2 testatusssa hen-15 kilössä ja positiivisten vasteiden keskimääräisellä T-solust imulointi-indeksillä peptidille.

Kuvio 18d on graafinen esitys, joka kuvaa 6 yhteensopivasta potilaasta peräisin olevien T-solulinjojen vasteita, jotka 20 on herätetty in vitro punkkiryhmän II allergeenillä ja vas- • · . te edullisille Der p II -peptideille on analysoitu vaste- * · · ·,· prosentilla sekä S.I.:llä vähintään 2 testatusssa henkilös- ί J ' sä ja positiivisten vasteiden keskimääräisellä T-solustimu- ·· lointi-indeksillä peptidille.

··«· : .· 25 * · · .·,· Kuviot 19a-19b ovat graafisia esityksiä tuloksista, jotka • · on saatu testistä, jossa testataan IgE:n suoraa sitoutumista affiniteettipuhdistettuihin ja rekombinanttisiin Der p I- ja Der p II -proteiineihin ja tiettyihin limittyviin Der 30 p I- ja Der p II -proteiineihin.

• · .

« · ·«· • · · *.* Kuviot 20a-20b ovat graafisia esityksiä tuloksista, jotka • · ;*** on saatu testistä, jossa testataan IgE:n suoraa sitoutumis- • · · ... ta af f initeettipuhdistettuihin ja rekombinanttisiin Der f ..... 35 I- ja Der f II -proteiineihin ja tiettyihin limittyviin Der • · f I- ja Der f II -proteiineihin.

·«··

Kuviot 21a-21h ovat graafisia esityksiä tuloksista, jotka on saatu testistä, jossa testataan IgE:n suoraa sitoutumis— 9 ta seokseen, jossa on biokemiallisesti puhdistettuja punk-kiallergeenejä (PMA) ja erilaisia Der p l:stä, Der f I:stä, Der p ll:sta ja Der f IIrsta johdettuja peptidejä.

5 Kuvio 22 on viiden Der p I -kloonin (a)-(e) aminohapposekvenssin yhdistetty esitys, joka valaisee Der p I -proteiinissa olevaa polymorfismia. Numerointi viittaa Der p 1(a) -kloonin sekvenssiin. Merkkiä (-) käytetään osoittamaan sitä, että Der p I -kloonin aminohappotähde on identtinen 10 Der p 1(a):n vastaavien aminohapposekvenssien kanssa tässä asemassa. Näiden kloonien aminohapposekvenssit osoittavat, että Der p I:ssä voi olla merkittävää vaihtelua ja viisi polymorfista aminohappoa löydetään viidestä sekvenssistä.

15 Kuvio 23 on kolmen Der p II -kloonin (c), (1) ja (2) aminohapposekvenssin yhdistetty esitys, joka valaisee Der p II -proteiinissa olevaa polymorfismia. Numerointi viittaa Der p 11(c) -kloonin sekvenssiin. Merkkiä (.) käytetään osoittamaan sitä, että Der p II -kloonin aminohappotähde on 20 identtinen Der p 11(c):n vastaavan aminohappotähteen kanssa • · ;.· tässä asemassa.

* ♦ · • « A «

Kuvio 24 on kuuden Der f II -kloonin (so. pFLl , pFL2, MT3, • · •| MT5, MT1 8 ja MT16) aminohapposekvenssin yhdistetty esitys, ···« :.· 25 joka valaisee Der f II -proteiinissa olevaa polymorfismia.

• a • 1 « .·.· Numerointi viittaa Der f pLF1 -kloonin sekvensseihin. Merk kiä (.) käytetään osoittamaan sitä, että Der f II -kloonin aminohappotähde on identtinen Der f II pFL1 :n vastaavan aminohappotähteen kanssa tässä asemassa.

30 • ·

Kuvio 25 esittää modifioitujen peptidien aminohapposekvens- *.1 sejä.

• · ♦ ·· « • · · .... Kuvio 26 esittää keksinnön mukaisten modifioitujen pepti- · 35 dien aminohapposekvenssejä.

1 o tai proteiinifragmentti tarkoittaa aminohapposekvenssiä, jossa on vähemmän aminohappotähteitä kuin proteiinin kokonaisessa aminohapposekvenssissä. Tässä käytettynä modifioitu peptidi tarkoittaa peptidiä, joka on johdettu suvun Der-5 matophagoides proteiiniallergeenistä, jonka aminohapposekvenssi on muutettu aminohapposubstituutiolla, -deleetiolla tai -lisäyksellä. Keksinnön mukaiset peptidit käsittävät modifioidut peptidit, jotka on johdettu Der p I:stä (SEQ ID NO: 1 ja 2), Der p I:sta (SEQ ID NO: 3 ja 4), Der f l:s-10 tä (SEQ ID NO: 5 ja 6) ja Der f II:sta (SEQ ID NO: 7 ja 8), jotka käsittävät allergeenin vähintään yhden epitoopin.

Keksinnön piiriin kuuluvat myös peptidit, jotka käsittävät vähintään kaksi aluetta jokaisen alueen käsittäessä suvun 15 Dermatophagoides proteiiniallergeenin vähintään yhden T-so-luepitoopin. Tällaisten peptidien jokainen alue on johdettu samanlaisesta tai erilaisesta punkkiallergeenista. Eristetyt peptidit tai eristettyjen peptidien alueet, joista jokainen sisältää vähintään kaksi punkkiproteiiniallergeenin 20 T-soluepitooppia, ovat erityisen edullisia lisääntyneen • · :.· . terapeuttisen tehonsa takia. Peptidit, jotka ovat immunolo- :*:* gisesti samankaltaisia (esim. vasta-aineelta tai T-soluris- :V* tireaktiivisuudelta) kuin esillä olevan keksinnön mukaiset • « peptidit, kuuluvat myös keksinnön piiriin. Vasta-aineet, : .· 25 jotka ovat spesifisiä suvun Dermatophagoides proteiinial- » · ]·]· lergeenin peptidille, sitovat peptidit, jotka ovat saman- • ♦ kaltaisia vasta-aineristireaktiivisuudeltaan. T-soluristi-reaktiivisuudeltaan immunologisesti samankaltaiset peptidit kykenevät reagoimaan samojen T-solujen kanssa kuin keksin-30 nön mukainen peptidi.

• · • · ♦ ♦ # *♦ * « *

Keksinnön mukaisia eristettyjä peptidejä voidaan valmistaa • · .··· yhdistelmä-DNA-tekniikoilla isäntäsolussa, joka on trans- ·· · .... formoitu nukleiinihapolla, jossa on tällaista peptidiä koo- . . 35 daava sekvenssi. Keksinnön mukaiset eristetyt peptidit voi-«· « : . daan myös valmistaa kemiallisella synteesillä. Joissakin *·** rajoitetuissa tilanteissa eristetyt peptidit voidaan val mistaa pilkkomalla kemiallisesti proteiiniallergeeni. Kun peptidi valmistetaan yhdistelmätekniikoilla, isäntäsoluja.

11 jotka on transformoitu nukleiinihapolla, jossa on peptidiä tai nukleiinihpposekvenssin funktionaalista ekvivalenttia koodaava sekvenssi, viljellään väliaineessa, joka sopii soluille, ja peptidit voidaan puhdistaa soluviljelyväliai-5 neesta, isäntäsoluista tai molemmista käyttämällä peptidien ja proteiinien puhdistusalalla tunnettuja tekniikoita, kuten ioninvaihtokromatografiaa, geelisuodatuskromatografiaa, ultrasuodatusta, elektroforeesia tai immunopuhdistamista vasta-aineilla, jotka ovat spesifisiä peptidille, suvun 10 Dermatophagoides, nosta ne on johdettu, proteiiniallergee-nille tai sen osalle. Keksinnön mukaiset eristetyt peptidit ovat oleellisesti vapaita solumateriaalista tai viljelyvä-liaineesta, kun ne valmistetaan yhdistelmä-DNA-tekniikoil-la, tai ne ovat oleellisesti vapaita kemiallisista prekur-15 soreista tai muista kemikaaleista, kun ne syntetoidaan kemiallisesti .

Esillä oleva keksintö saa aikaan ilmennysvektoreita ja isäntäsoluja, jotka on transformoitu keksinnön mukaisten 20 nukleiinihapposekvenssien ilmentämiseksi. Punkkiallergeenia • · ί·! tai vähintään yhtä sen osaa koodaava nukleiinihapposekvens- ··« *.* si voidaan ilmentää bakteerisoluissa, kuten E. colissa, • · ·.·. hyönteissoluissa (baculovirus), hiiva- tai nisäkässoluissa, j! kuten kiinalaisen hamsterin munasarjan soluissa (CHO). So- • ;* 25 pivia ilmennysvektoreita, promoottoreita, tehostimia ja • · · ;V muita ilmentymisensäätöelementtejä voidaan löytää Sambrook et ai:n Molecular Cloning: A Laboratory Manualista, toinen painos, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring

Harbor, New York (1989). Alan ammattimiehet tuntevat muita . . 30 sopivia ilmennysvektoreita, promoottoreita, tehostimia ja • · • · *·*. muita ilmennyselementtejä. Ilmentäminen nisäkäs-, hiiva- • · ’·] ^ tai hyönteissoluissa johtaa yhdistelmämateriaalin osittai- seen tai täydelliseen glykosyloitumiseen ja kaikenlaisten ·· « ·;· ketjunsisäisten tai ketjunulkoisten disulfidisiltojen muo- 35 dostumiseen. Hiivassa ilmentämiseen sopivat vektorit käsit- • · : · tävät YepSed:n (Baldari et ai. (1987) Embo J. 6:229-234), pMFa:n (Kurjan ja Herskowitz (1982) Cell 30: 933-943), JRY88:n (Schultz et ai. (1987) Gene 54:113-123) ja oYES2:n (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Nämä vektorit ovat j 1 2 vapaasti saatavissa. Baculoviruksia ja nisäkäsilmennysjär-jestelmiä on myös saatavissa. Esimerkiksi baculovirusjär-jestelmä on kaupallisesti saatavissa (PharMingen, San Diego, CA) hyönteissoluissa ilmentämiseen, kun taas pMSG on 5 kaupallisesti saatavissa (Pharmacia, Piscataway, NJ) nisä-kässoluissa ilmentämiseen.

E. colissa ilmentämiseen sopivat ilmentämisvektorit käsittävät muun muassa pTRC:n (Amann et ai. (1988) Gene, 69, 10 301-315), pGEX:n (Amrad Corp., Melbourne, Australia), pMAL:n (N.E. Biolabs, Beverly, MA), pRIT5:n (Pharmacia, Piscataway, NJ), pEY-11d:n (Novagen, Madison, WI), Jameel et ai., (1990) J. Virol., 64:3963-3966 ja pSEM:n (Knapp et ai. (1990) BioTechniques, 8^: 280-281 ). pTRC:n ja pET-11d:n 15 käyttö esimerkiksi johtaa fuusioitumattoman proteiinin ilmentymiseen. pMAL:n, pRIT5:n, pSEM:n ja pGEX:n käyttö johtaa maltoosi E:hen sitoutuvaan proteiiniin (pMAL), proteiiniin A (pRIT5), typistyneeseen β-galaktosidaasiin (PSEM) tai glutationi-S-transferaasiin (pGEX) fuusioituneen aller-20 geenin ilmentymiseen. Kun keksinnön mukainen punkkiproteii- • · i · l.i niallergeeni, sen fragmentti tai fragmentteja ilmennetään * · · •t* fuusioproteiinina, on erityisen edullista viedä entsymaat- » · S tinen pilkkoutumispaikka kantajaproteiinin ja punkkiprote- ·· iiniallergeenin tai sen fragmentin välissä olevaan fuusio- ···· • ;* 25 liittymään. Punkkiproteiiniallergeeni tai sen fragmentti «·· ,·.· voidaan ottaa sitten talteen fuusioproteiinista pilkkomalla • « entsymaattisesti entsymaattisessa kohdassa ja puhdistamalla biokemiallisesti käyttäen konventionaalisia proteiinien ja peptidien puhdistustekniikoita. Sopivat entsymaattiset 30 pilkkomiskohdat käsittävät verenhyytymistekijä Xa:n tai • · ··· trombiinin pilkkomiskohdat, mihin tarkoitukseen sopivia «·* V pilkkomisentsyymeitä ja -protokollia on kaupallisesti saa- • · ·**' tavissa esimerkiksi Sigma Chemical Companystä, St Louis, »»· ... MO, ja N.E. Biolabsista, Beverly, MA. Erilaisilla vekto- tt*t* 35 reillä on myös erilaisia promoottorialueita, jotka mahdol-• » • · listavat konstitutiivisen tai indusoitavan ilmentämisen * esimerkiksi IPTG-induktion (PRTC, Amann et ai., (1988) sup ra, pET-11d, Novagen, Madison, WI) tai lämpötilainduktion (pRIT5. Pharmacia, Piscataway, NJ).

1 3

Esillä olevan keksinnön mukaisten edullisten peptidien saamiseksi punkkiallergeeni jaetaan esimerkissä III seloste-tusti halutun pituisiksi ei-limittyviksi peptideiksi tai halutun pituisiksi limittyviksi peptideiksi, jotka voidaan 5 valmistaa rekombinanttisesti, synteettisesti tai joissakin rajoitetuissa tilanteissa pilkkomalla allergeeni kemiallisesti. Vähintään yhden T-soluepitoopin sisältävät peptidit kykenevät saamaan esiin T-soluvasteen, kuten stimuloinnin (so. proliferaation tai lymfokiinin erittymisen) ja/tai ne 10 kykenevät indusoimaan T-soluanergiaa (so. sietäminen). Peptidien, jotka sisältävät vähintään yhden T-soluepitoopin, määrittämiseksi, eristetyt peptidit testataan esimerkiksi T-solubiologiatekniikoilla sen määrittämiseksi saavatko peptidit esiin T-soluvasteen vai indusoivatko ne T-solu-15 anergiaa. Ne peptidit, joiden havaitaan saavan aikaan T-soluvasteen tai indusoivan T-soluanergiaa, määritetään sellaisiksi, että niissä on T-soluja stimuloivaa aktiivisuutta.

20 Kuten esimerkeissä selostetaan, ihmisen T-soluja stimuloi- • · , vaa aktiivisuutta voidaan testata viljelemällä T-soluja, *·· V jotka on saatu henkilöistä, jotka ovat herkkiä punkkialler- geenille (so. henkilö, jolla on IgE-välitteinen immuunivas-·] punkkiallergeeniin), allergeenistä johdetun peptidin kans-

(»M

i .* 25 sa ja määrittämällä sitten esiintyykö T-solujen proliferaa- ··· ,V tio vasteena peptidille, kun mitataan esim. tritiumoidun tymidiinin soluotolla. T-solujen vasteen peptideihin stimulointi-indeksit voidaan laskea maksimi-CPM:nä vasteessa peptidiin, joka jaetaan verrokki-CPM:llä. T-solustimuloin-30 ti-indeksi (S.I.), joka on yhtä suuri tai suurempi kuin • * ··· kaksi kertaa taustataso, katsotaan "positiiviseksi". Posi- t·· *.· tiivisia tuloksia käytetään jokaisessa ryhmässä testatun • · ·’*’ jokaisen peptidin keskiarvostimulointi-indeksin laskemi- ·· · ... seen. Keksinnön mukaiset edulliset peptidit käsittävät vä- ββ»%· 35 hintään yhden T-soluepitoopin ja niiden keskimääräinen T- « 9 i » solustimulointi-indeksi on suurempi tai yhtä suuri kuin *’* 2,0. Peptidi, jonka keskimääräinen T-solustimulointi-indek- si on suurempi tai yhtä suuri kuin 2,0, katsotaan käyttökelpoiseksi terapeuttisena aineena. Edullisten peptidien 1 4 keskimääräinen T-solustimulaatioindeksi on vähintään 2,5, edullisemmin vähintään 3,5, edullisemmin vähintään 4,0, edullisimmin vähintään 5.

5 Lisäksi edullisilla peptideillä on positiivisuusindeksi (P.I.), joka on vähintään noin 100, edullisesti vähintään noin 150, vielä edullisemmin vähintään noin 200 ja edullisimmin vähintään noin 300. Peptidin positiivisuusindeksi määritetään kertomalla keskimääräinen T-solustimulointi-10 indeksi yksilöprosentilla yksilöpopulaatiossa, jotka ovat herkkiä huonepölypunkille (esim. edullisesti vähintään 9 henkilöä, edullisesti vähintään 16 henkilöä tai enemmän, edullisemmin vähintään 29 henkilöä tai enemmän tai vielä edullisemmin 30 henkilöä tai enemmän), joilla on T-soluja, 15 jotka vastaavat peptidiin. Täten positiivisuusindeksi edustaa sekä T-soluvasteen peptidiin voimakkuutta (S.I.) että T-soluvasteen peptidiin taajuutta yksilöpopulaatiossa, jotka ovat herkkiä huonepölypunkille.

20 Tarkkojen T-soluepitooppien määrittämiseksi esimerkiksi hienokartoitustekniikoilla peptidi, jossa on T-soluja sti- *·* ♦ muloivaa aktiivisuutta ja joka sisältää siten vähintään « « · *.* ’ yhden T-soluepitoopin määritettynä T-solubiologiateknii- • · :.V koilla, modifioidaan lisäämällä tai deletoimalla aminohap- 25 potähteitä joko peptidin amino- tai karboksiterminaalissa • ja ne testataan sen määrittämiseksi muuttuuko T-solureak- ;V: tiivisuus modifioituun peptidiin. Jos kahdessa tai useam massa peptidissä, joissa on limittymisalue luontaisessa proteiinisekvenssissä, havaitaan olevan ihmisen T-soluja 30 stimuloivaa aktiivisuutta määritettynä T-solubiologiatek- . . nilkoilla, voidaan valmistaa lisäpeptidejä, jotka käsittä- • · · • · · ·"/ vät tällaiset peptidit kokonaan tai niiden osan, ja nämä *·* ^ lisäpeptidit voidaan testata samankaltaisella menetelmällä.

Tämän tekniikan jälkeen peptidit valikoidaan ja valmiste- • · · ...·· 35 taan rekombinanttisesti tai synteettisesti. Peptidit vali- taan perustuen erilaisiin tekijöihin mukaan lukien T-solu- • · · : ·* vasteen peptidiin voimakkuus (esim. stimulointi-indeksi), • * T-soluvasteen peptidiin taajuus yksilöiden populaatiossa, jotka ovat herkkiä huonepölypunkille, ja peptidin potenti- 1 5 aalinen ristireaktiivisuus muiden suvun Dermatophagoides allergeenien kanssa. Näiden valikoitujen peptidien fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet (esim. liukenevuus, stabiilius) tutkitaan sen määrittämiseksi, sopivatko peptidit 5 käytettäviksi terapeuttisissa koostumuksissa vai pitääkö peptidejä modifioida tässä kuvatusti. Valikoitujen peptidien tai valikoitujen modifioitujen peptidien kyky stimuloida ihmisen T-soluja (esim. indusoida proliferaatiota, lymfokiinin eritystä) määritetään.

10

Keksinnön mukaiset edulliset peptidit eivät sitoudu immuno-globuliini E:hen (IgE) tai ne sitoutuvat IgE:hen oleellisesti pienemmässä laajuudessa kuin proteiiniallergeeni, josta peptidi on johdettu. Standardin immunoterapian pää-15 asialliset komplikaatiot ovat IgE-välitteiset vasteet, kuten anafylaksia. Immunoglobuliini E on anafylaktisten reaktioiden välittäjä, jotka reaktiot johtuvat antigeenin sitoutumisesta ja ristikytkeytymisestä IgErhen syöttösoluissa tai basofiileissä ja välittäjien (esim. histamiini, sero-20 toniini, eosinofiiliset kemotaktiset tekijät) vapautumises- . . ta. Anafylaksia voidaan välttää huonepölypunkille herkkien • · « *;!/· yksilöiden populaatiossa oleellisena prosenttina käyttämäl- • ♦ *·* ’ lä immunoterapiassa peptidiä tai peptidejä, jotka eivät • · :.V sitoudu IgE:hen oleellisena prosenttina (esim. vähintään 25 noin 75 X) yksilöpopulaatiosta, jotka ovat herkkiä huonepö-; lypunkkiallergeenille, tai jos peptidi sitoutuu IgErhen, tällainen sitoutuminen ei saa aikaan välittäjien vapautumista syöttösoluista tai basofiileistä. Anafylaksian riskiä voidaan vähentää käyttämällä immunoterapiassa peptidiä tai 30 peptidejä, jotka sitoutuvat vähemmän IgErhen. Lisäksi pep- . tidit, joissa on minimaalinen IgErtä stimuloiva aktiivi- • ♦ *11.* suus, ovat toivottuja terapeuttisen tehon takia. Minimaali- • · • · *. . nen IgE:ta stimuloiva aktiivisuus tarkoittaa IgE-tuotantoa, »»» joka on vähemmän kuin luontaisen proteiiniallergeenin *:·*: 35 (esim. Der p I) stimuloima IgE-tuotannon ja/tai IL-4-tuo- tannon määrä.

• · • ·

Keksinnön mukainen peptidi, kun sitä annetaan huonepölypunkille herkälle henkilölle, kykenee modifioimaan henkilön 1 6 allergista vastetta allergeeniin. Erityisesti keksinnön mukaiset peptidit, jotka käsittävät punkkiallergeenin vähintään yhden T-soluepitoopin tai vähintään kaksi aluetta, jotka on johdettu punkkiallergeenistä, jokaisen käsittäessä 5 vähintään yhden T-soluepitoopin, kykenevät, kun niitä annetaan henkilölle, joka on herkkä huonepölypunkille, modifioimaan henkilön T-soluvasteen allergeenille. Tässä käytettynä henkilön allergisen vasteen huonepölypunkkialler-geenille modifiointi voidaan määrittää ei-vasteisuutena tai 10 oireiden vähenemisenä altistuttaessa punkkiallergeenille määritettynä standardeilla kliinisillä menetelmillä (katso esim. Varney et ai, British Medical Journal, 302:265-269 (1990)) mukaan lukien punkkipoteiiniallergeenien indusoi-mien astmaoireiden väheneminen. Tässä käytettynä oireiden 15 väheneminen käsittää henkilön allergisen vasteen allergeeniin kaikenlaista vähenemistä sen jälkeen, kun yksilön hoito keksinnön mukaisella peptidillä tai proteiinilla on päättynyt. Tämä väheneminen voi olla subjektiivista (so. potilas tuntee voivansa paremmin allergeenin läsnäollessa). 20 Oireiden väheneminen voidaan määrittää myös kliinisesti käyttämällä alalla tunnettuja standardeja ihotestejä.

• · » • · · · • · * ' Tässä kuvatun työn tuloksena on valmistettu modifioituja :.V peptidejä, jotka on johdettu punkkiallergeeneistä ja jotka 25 käsittävät vähintään yhden T-soluepitoopin. T-soluepitoop- • :”· pien uskotaan olevan osallisena immuunivasteen punkkialler- gian kliinisistä oireista vastuussa oleviin punkkiallergee-neihin (-allergeeneihin) aloittamisesta ja jatkamisesta. Näiden T-soluepitooppien on ajateltu laukaisevan varhaiset 30 toimintavaiheet T-auttajasolutasolla sitoutumalla sopivaan . . HLA-molekyyliin antigeenin pinnalla, joka edustaa solua, ja stimuloivan relevanttia T-solualapopulaatiota. Nämä ta-'·* _ pahtumat johtavat T-soluproliferaatioon, lymfokiinin erit- :*** tymiseen, paikallisiin tulehdusreaktioihin, lisäimmuuni- ·:··; 35 solujen rekrytoinnin kohtaan ja B-solukaskadin aktivoitu- miseen, mikä johtaa vasta-aineiden tuottamiseen. Näiden • · · • · vasta-aineiden eräs isotyyppi, IgE, on olennaisesti tärkeä • * · · · allergisten oireiden kehittymisessä ja sen tuotantoon vaikuttaa varhain tapahtumaka skadissa T-auttaj asolutasolla 17 erittyneiden lymfokiinien luonne. T-soluepitooppi on peruselementti tai T-solureseptorin tunnistaman alueen pienin yksikkö, jolloin epitooppi käsittää aminohappotähteitä, jotka ovat oleellisia reseptoritunnistukselle ja jotka voi-5 vat olla vierekkäisiä tai ei-vierekkäisiä proteiinin aminohapposekvenssissä. Keksinnön piiriin kuuluvat myös aminohapposekvenssit, jotka mimikoivat T-soluepitooppien sekvenssiä ja jotka kykenevät modifioimaan allergista vastetta suvun Dermatophagoides proteiiniallergeeneihin.

1 0

Punkille allergisten potilaiden altistaminen esillä olevan keksinnön mukaisille peptideille voi tehdä sietokykyisem-mäksi tai heikentää sopivia T-solupopulaatioita siten, että niistä tulee ei-vasteellisia punkkiallergeenille ja että 15 ne eivät osallistu immuunivasteen aikaansaamiseen tällaisessa altistuksessa. Lisäksi esillä olevan keksinnön mukaisen peptidin antaminen voi modifioida lymfokiinierityspro-fiilia verrattuna luontaisesti esiintyvälle punkkiproteii-niallergeenille tai sen osalle altistumiseen (esim. saa 20 aikaan IL-4:n vähentymisen ja/tai IL-2:n lisääntymisen).

. . Lisäksi tällaiselle keksinnön mukaiselle peptidille altis- • · *" 1· taminen voi vaikuttaa T-solualapopulaatioihin, jotka osal- » « · '·1 ‘ listuvat normaalisti vasteeseen punkkiallergeen(e)ille, si- • · • · · .1. ten, että nämä T-solut vetäytyvät pois normaalista aller- 25 geenille altistumisen kohdasta (kohdista) (esim. nenän li- • 1 il ' malvot, iho ja keuhkot) kohti peptidin terapeuttisen anta- misen kohtaa (kohtia). Tämä T-solualapopulaatioiden uudel-leenjakautuminen voi olla vaikuttaa siten, että se parantaa tai vähentää yksilön immuunijärjestelmän kykyä saada 30 aikaan immuunivaste normaalissa punkkiallergeen(e)ille al- ; tistumiskohdassa saaden aikaan allergiaoireiden vähenemi- • · *11. sen.

· • · ·

Keksinnön mukaiset edulliset eristetyt peptidit käsittävät *:1·! 35 suvun Dermatophagoides proteiiniallergeenin vähintään yhden ..V T-soluepitoopin ja näin ollen peptidi käsittää vähintään • · suunnilleen seitsemän proteiiniallergeenin aminohappotähdettä. Terapeuttisen tehon takia keksinnön mukaiset terapeuttiset koostumukset käsittävät edullisesti vähintään 18 kaksi punkkiallergeenin T-soluepitooppia. Nain ollen keksinnön mukaiset eristetyt peptidit käsittävät edullisesti vähintään kaksi T-soluepitooppia ja näin ollen peptidi käsittää vähintään suunnilleen kahdeksan aminohappotähdettä 5 ja edullisesti viisitoista aminohappotähdettä. Lisäksi keksinnön mukaiset terapeuttiset koostumukset käsittävät edullisesti riittävän prosenttimäärän kokonaisen proteiinial-lergeenin T-soluepitooppeja siten, että koostumuksen terapeuttinen antoalue huonepölypunkille herkälle henkilölle 10 saa aikaan sen, että henkilön T-solut sietävät proteiinial-lergeeniä. Keksinnön mukaiset synteettisesti valmistetut peptidit, jotka käsittävät korkeintaan noin 45 aminohappotähdettä pituudeltaan ja edullisimmin noin 30 aminohappotähdettä pituudeltaan, ovat erityisen toivottavia, koska 15 pituuden lisäykset voivat vaikeuttaa peptidisynteesiä sekä ei-toivottavan ominaisuuden (esimerkiksi immunoglubuliinia sitovan tai entsymaattisen aktiivisuuden) retentiota, joka johtuu peptidin ja proteiiniallergeenin, josta se on johdettu, välisen konformationaalisen samakaltaisuuden ylläpi-20 tämisestä. Kaikissa kuvioissa 3 ja 4 esitetyissä peptideis-. . sä havaittiin olevan ihmisen T-soluja stimuloivaa aktiivi- suutta.

Eräs esillä olevan keksinnön suoritusmuoto saa aikaan suvun 25 Dermatophagoides proteiiniallergeenin modifioidun peptidin.

; Peptidi tai sen osa käsittää proteiiniallergeenin vähintään yhden T-soluepitoopin ja sillä on kaava Xn-Y-Zm. Kaavan mukaisesti Y on aminohapposekvenssi, joka on valittu ryhmästä, joka koostuu: DP I-21.7:stä, DP I-23.10:stä, DP I-30 23.1 1 :stä, DP I-23.12:sta, DP I-23.5:stä, DP I-23.6:sta, . . DP 1-23.7:stä, DP 1-23.8:sta, DP I-23.9:stä, DP I-26.2:sta,

DP 11-20.7:stä, DP 11-22.6:sta, DP 11-22.3:sta, DP

• * . 11-22.4:stä, DP 11-22.5:stä, DP 11-25.3:sta, DP 11-25.4:s-

tä, DP 1-23.13:sta, DP 1-23.14:stä, DP 1-23.15:stä, DP I-35 23.16:sta, DP I-23.17:stä, DP l-26.3:sta, DP I-26.4:stä, DP

1-26.5:stä, DP 11-22.7:stä, DP 11-22.8:sta, DP 11-22.9:stä, * · · DP 11-22.10:stä ja DP 11-22.11:stä, jotka kaikki on esitetty kuviossa 26.

19

Lisäksi Xn ovat aminohappotähteitä, jotka ovat Y:n amino-terminaalin vieressä proteiiniallergeenin aminohapposekvenssissä, ja Zm ovat aminohappotähteitä, jotka ovat Y:n karboksiterminaalin vieressä proteiiniallergeenin aminohap-5 posekvenssissä.

Esillä olevan keksinnön mukainen toinen suoritusmuoto saa aikaan peptideitä, jotka käsittävät vähintään kaksi aluetta jokaisen alueen käsittäessä suvun Dermatophagoides pro-10 teiiniallergeenin vähintään yhden T-soluepitoopin, jokainen alue käsittää vähintään suunnilleen seitsemän aminohappotähdettä. Nämä peptidit, jotka käsittävät vähintään kaksi aluetta, voivat käsittää niin monta aminohappotähdettä kuin halutaan ja ne käsittävät edullisesti vähintään noin 14, 15 viedä edullisemmin vähintään noin 30 ja edullisemmin vähintään noin 40 punkkiallergeenin aminohappotähdettä. Jokainen tällaisen peptidin alue voi käsittää korkeintaan 45 aminohappotähdettä pituudeltaan ja edullisemmin korkeintaan 40 tähdettä pituudeltaan ja edullisimmin korkeintaan 30 amino-20 happotähdettä pituudeltaan, koska alueen pituuden muutokset . . voivat vaikeuttaa peptidisynteesiä sekä ei-toivottavan omi- • · * naisuuden (esimerkiksi immunoglubuliinia sitovan tai entsy- • « maattisen aktiivisuuden) retentiota, joka johtuu peptidin • · ja proteiiniallergeenin, josta se on johdettu, välisen kon-..)· 25 formationaalisen samankaltaisuuden ylläpitämisestä. Halutin ; taessa alueiden aminohapposekvenssit voidaan valmistaa ja :V liittää yhteen liittäjällä, jotta parannetaan antigeeniä edustavien solujen käsittelyn herkkyyttä. Tällainen liit-täjä voi olla mikä tahansa ei-epitooppiaminohapposekvenssi 30 tai jokin muu sopiva liittävä tai yhdistävä aine. Jotta : .· saadaan edullisia peptidejä, jotka käsittävät vähintään • · kaksi aluetta, joista jokainen käsittää vähintään yhden T- • « . soluepitoopin, alueet järjestetään konfiguraatioon, joka on erilainen kuin alueiden luontaisesti esiintyvä konfigu-35 raatio allergeenissä tai erilaisten punkkiproteiinialler-geenien yhdistelmässä. Esimerkiksi alueet, jotka sisältävät • ] [ T-soluepitoopin (-epitooppeja), voidaan järjestää ei-vie- rekkäiseen konfiguraatioon ja ne voidaan johtaa edullisesti samasta proteiiniallergeenistä tai proteiiniallergeenien 20 yhdistelmästä. Ei-vierekkäisyys on määritetty T-soluepitoo-pin (-epitooppeja) sisältävien alueiden järjestelyksi, joka on erilainen kuin proteiiniallergeenissä olevan luontaisen aminohapposekvenssin, josta alueet on johdettu. Lisäksi T-5 soluepitooppeja sisältävät ei-vierekkäiset alueet voidaan järjestää ei-jaksoittaiseen järjestykseen (esim. järjestykseen, joka on erilainen kuin luontaisen proteiiniallergee-nin aminohappojen järjestys, joista T-soluepitoopin (-epitooppej a) sisältävä alue on johdettu, jossa aminohapot on 10 järjestyneet aminoterminaalista karboksiterminaaliin). Peptidi voi käsittää vähintään 15 %, vähintään 30 %, vähintään 50 % tai korkeintaan 100 % punkkiallergeenin T-soluepitoop-peja.

15 Yksittäiset peptidialueet voidaan valmistaa ja testata sen määrittämiseksi, mitkä alueet sitoutuvat punkkiallergeenil-le spesifiseen immunoglobuliini E:hen ja mitkä tällaisista alueista aiheuttavat välittäjien (esim. histamiinin) vapautumisen syöttösoluista tai basofiileistä. Tällaiset pepti-20 dialueet, joiden havaittiin sitoutuvan immunoglobuliini . . E:hen ja aiheuttavan välittäjien vapautumista syöttösoluis- • · *** ta tai basof iileistä enemmän kuin suunnilleen 10-15 %:sta 4·« ' • * testattuja allergisia seerumeja, eivät sisälly peptidialu- • · eisiin, jotka on järjestetty keksinnön edullisten peptidien ..*· 25 muodostamiseksi.

• · • · • · · :*:* Keksinnön mukaiset edulliset peptidit voivat sisältää kaksi tai useampia alueita, jotka on johdettu samasta tai erilaisista punkkiallergeeneistä (esim. Dep I, Der p II, Der f I 30 ja Der f II). Esimerkiksi yksi alue voidaan johtaa Der p . I:stä ja toinen alue voidaan johtaa Der p II:sta, yksi alue • · *11. voidaan johtaa Der p l:stä ja toinen alue voidaan johtaa ·. . Der f I:stä, yksi alue voidaan johtaa Der p II:sta ja toi- • · · nen alue voidaan johtaa Der f l:stä, yksi alue voidaan joh-*:*·.’ 35 taa Der p Il:sta ja toinen alue voidaan johtaa Der f II:s- ta, yksi alue voidaan johtaa Der p l:stä ja toinen alue voidaan johtaa Der f li:sta ja yksi alue voidaan johtaa Der • · · · f I:sta ja toinen alue voidaan johtaa Der f II:sta. Lisäksi 21 alueet voidaan johtaa samasta proteiiniallergeenistä, esim Der p Iistä ja Der p I:stä jne.

Edulliset peptidit käsittävät erilaisia kahden tai useamman 5 alueen yhdistelmiä jokaisen alueen käsittäessä suvun Der-matophagoides proteiiniallergeenin vähintään yhden T-solu-epitoopin, alueet voidaan johtaa suvun Dermatofagoides samoista tai erilaisista proteiiniallergeeneistä, jolloin vähintään yksi alue käsittää aminohapposekvenssin, joka on 10 valittu seuraavasta ryhmästä: DP 1-21.1 (SEQ ID NO: 27), DP 1-21.2 (SEQ ID NO: 28), DP 1-22.1 (SEQ ID NO: 29), DP 1-23.1 (SEQ ID NO: 33), DP 1-25.2 (SEQ ID NO: 36), DP

I- 26.1 (SEQ ID NO: 37), DP 1-28.1 (SEQ ID NO: 39), DP 1-1 (SEQ ID NO: 9), DF-I-1 (SEQ ID NO: 72), DF-I-21.1 (SEQ ID

15 NO: 90), DF-I-22.1 (SEQ ID NO: 92), DF-I-23.1 (SEQ ID NO: 95), DF-I-25.1 (SEQ ID NO: 97), DP II-1 (SEQ ID NO: 41), DP II-1.2 (SEQ ID NO: 58), DP II-2.0 (SEQ ID NO: 56), DP

II- 20.3 (SEQ ID NO: 53), DP 11-21 (SEQ ID NO: 62), DP 11-22

(SEQ ID NO: 63), DP 11-25 (SEQ ID NO: 69), DP 11-25.2 (SEQ

20 ID NO: 71) DF II-2 (SEQ ID NO: 104), DF II-4.5 (SEQ ID NO: : 107), DF-II-1 5 (SEQ ID NO: 109), DF 11-17 (SEQ ID NO: 111 ), :*:* DF II-19.1 (SEQ ID NO: 114), DF 1-22.2 (SEQ ID NO: 93) ja :*;*· DP 11-20.6 (SEQ ID NO: 56), jotka kaikki on esitetty kuvi- • .

.: oissa 3-4 ja joissa vähintään yksi alue käsittää aminohap- **·· pc;

• .· 3 posekvenssin, joka on valittu ryhmästä, joka koostuu: DP

;V 1-21 .7 : stä, DP 1-23.10: stä, DP I23.11:stä, DP I-23.12:sta, DP I-23.5:stä, DP 1-23.6:sta, DP 1-23.7:stä, DP I-23.8:sta, DP 1-23.9:Stä, DP 1-26.2:sta, DP 11-20.7:stä, DP 11-22.6:s- ta, DP 11-22.3:sta, DP 11-22.4:stä, DP 11-22.5:stä, DP II- 30 25.3:sta, DP Il-25.4:stä, DP l-23.13:sta, DP l-23.14:stä,

DP 1-23.1 5 : stä , DP I -2 3.1 6 : s ta , DP 1-2 3.1 7 : stä , DP

I-26.3:sta, DP I-26.4:stä, DP I-26.5:stä, DP 11-22.7:stä, :*··’ Dp 11-22.8:sta, DP II-22.9:stä, DP 11-22.10:stä ja DP II- 22.11 :stä, jotka kaikki on esitetty kuviossa 26.

35 • · :v * · Edulliset peptidit käsittävät kahden tai useamman alueen *··« yhdistelmän (jokaisella alueella on kuvioissa 3, 4 ja 5 esitetty aminohapposekvenssi) mukaan lukien: DP 1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.13, DP 1-26.1, DP 11-20.6, DP 11-22.3 ja 22

DP 11-25.2; DP 1-21.2, DF 1-22.2, DP 1-23.10, DP 1-26.2, DP 1-20.6, DP 11-22.4 ja DP 11-25.3, DP 1-21.7, DF 1-22.2, DP

I- 23.11, DP 1-26.3, DP 11-20.7, DP 11-22.5 ja DP H-25.4; DP 1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.12, DP 1-26.4, DP H-20.6, 5 DP 11-22.6 ja DP 11-25.2; DP 1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.5, DP 1-26.5, DP 11-20.7, DP 11-22.7 ja DP 11-25.3; DP 1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.6, DP 1-26.2, DP 11-20.6, DP 11-22.8 ja

DP 11-25.4; DP 1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.7, DP 1-26.3, DP

II- 20.7, DP 11-22.9 ja DP 11-25.3; DP 1-21.7, DF 1-22.2, 10 DP 1-23.8, DP 1-26.4, DP 11-20.6, DP 11-22.3 ja DP 11-25.4;

DP 1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.9, DP 1-26.1, DP 11-20.7, DP

11-22.4 ja DP 11-25.3; DP 1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.13, DP

I- 26.2, DP 11-20.6, DP 11-22.5 ja DP 11-25.4; DP 1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.14, DP 1-26.3, DP 11-20.7, DP 11-22.6 ja

15 DP 11-25.3; DP 1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.15, DP 1-26.4, DP

II- 20.6, DP 11-22.6 ja DP 11-25.3; DP 1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.16, DP 1-26.5, DP 11-20.6, DP 11-22.3 ja DP 11-25.4; DP 1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.17, DP 1-26.2, DP 11-20.6, DP 11-22.4 ja DP 11-25.3; DP 1-21.7, DF 1-22.2, DP

20 1-23.8, DP 1-26.3, DP 11-20.6, DP 11-22.5 ja DP 11-25.4;

DP 1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.9, DP 1-26.4, DP 11-20.6, DP

“I. 11-22.6 ja DP 11-25.3 ja DP 1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.5, * » ’l\ DP 1-26.1, DP 11-20.6, DP 11-22.7 ja DP 11-25.4.

• · • · • · ..!! 25 Muut edulliset peptidit käsittävät vähintään kaksi seuraa- • · :.· vaa alueiden yhdistelmää missä tahansa järjestyksessä:

!.·' X, Y, Z, A,B,C,D, jossa X on DP 1-21.2 tai DP 1-21.7, Y on DF

1-22.2, Z on DP 1-23.1, DP 1-23,10, DP 1-23.11, DP 1-23.12,

DP 1-23.13, DP 1-23.14, DP 1-23.15, DP 1-23.16, DP

30 1-23,17, DP 1-23.5, DP 1-23.6, DP 1-23.7, DP 1-23.8 tai DP

j .· 1-23.9; A on DP 1-26.1, DP 1-26.2, DP 1-26.3, DP 1-26.4 tai % ·

DP 1-26.5, B on DP 1-20.6 tai DP 11-20.7, C on DP 11-22, . DP 11-22.6, DP 11-22.7, DP 11-22.8, DP 11-22,9, DP

···

:... 11-22.10, DP 11-22.11, DP 11-22.3, DP 11-22.4 tai DP

*:*· 35 11-22.5 ja D on DP 11-25.2, DP 11-25.3 tai DP 11-25.4, ;·.· edellyttäen, että X, Y, Z, A, B, C, D ei ole alueiden seu- ♦ raava yhdistelmä: DP 1-21.2, DF 1-22.2, DP 1-23.1, DP I- 26.1, DP 11-20.6, DP 11-22 ja DP 11-25.2.

23

Toinen edullinen peptidi käsittää aminohappojen spesifisen sekvenssijärjestyksen mainitun sekvenssijärjestyksen kaavan ollessa seuraava:

ADYCZBX

5 jossa X on DP 1-21.2 tai DP 1-21.7, Y on DF 1-22.2, Z on DP 1-23.1, DP 1-23,10, DP 1-23.11, DP 1-23.12, DP 1-23.13, DP 1-23.14, DP 1-23.15, DP 1-23.16, DP 1-23,17, DP 1-23.5, DP 1-23.6, DP 1-23.7, DP 1-23.8 tai DP 1-23.9; A on DP I- 26.1, DP 1-26.2, DP 1-26.3, DP 1-26.4 tai DP 1-26.5, B on 10 DP 1-20.6 tai DP 11-20.7, C on DP 11-22, DP 11-22.6, DP II- 22.7, DP 11-22.8, DP 11-22,9, DP 11-22.10, DP 11-22.11, DP 11-22.3, DP 11-22.4 tai DP 11-22.5 ja D on DP 11-25.2, DP 11-25.3 tai DP 11-25.4, edellyttäen, että ADYCZBX ei ole DP 1-26.1, DP 11-25.2, DF 1-22.2, DP 11-22, DP 1-23.1, DP 15 11-20.6 eikä DP 1-21.2 vastaavasti.

20 DYZCABX

. . jossa X on DP 1-21.2 tai DP 1-21.7, Y on DF 1-22.2, Z on • · :*|t DP 1-23.1, DP 1-23,10, DP 1-23.11, DP 1-23.12, DP 1-23.13, V DP 1-23.14, DP 1-23.15, DP 1-23.16, DP 1-23,17, DP 1-23.5, • 4 \\ DP 1-23.6, DP 1-23.7, DP 1-23.8 tai DP 1-23.9; A on DP I- 25 26.1 , DP 1-26.2, DP 1-26.3, DP 1-26.4 tai DP 1-26.5, B on I t* DP 1-20.6 tai DP 11-20.7, C on DP 11-22, DP 11-22.6, DP II-

:Y 22.7, DP 11-22.8, DP 11-22,9, DP 11-22.10, DP 11-22.11, DP

11-22.3, DP 11-22.4 tai DP 11-22.5 ja D on DP 11-25.2, DP

11-25.3 tai DP 11-25.4, edellyttäen, että DYZCAXB ei ole

30 DP 11-25.2, DF 1-22.2, DP 1-23.1, DP 11-22, DP 1-26,1, DP

; ,· 1-21.2 eikä DP 11-20.6 vastaavasti.

• · ··· «Il • · • · *.. Vielä eräs edullinen peptidi käsittää aminohapposekvenssien

IM

spesifisen sekvenssijärjestyksen mainitun sekvenssijärjes-·;· 35 tyksen kaavan ollessa seuraava:

DXZACBY

• · * * jossa X on DP 1-21.2 tai DP 1-21.7, Y on DF 1-22.2, Z on DP 1-23.1, DP 1-23,10, DP 1-23.11, DP 1-23.12, DP 1-23.13, DP 1-23.14, DP 1-23.15, DP 1-23.16, DP 1-23,17, DP 1-23.5, 24 DP 1-23.6, DP 1-23.7, DP 1-23.8 tai DP 1-23.9; A on DP I- 26.1, DP 1-26.2, DP 1-26.3, DP 1-26.4 tai DP 1-26.5, B on DP 1-20.6 tai DP 11-20.7, C on DP 11-22, DP 11-22.6, DP II-

22.7, DP 11-22.8, DP 11-22,9, DP 11-22.10, DP 11-22.11, DP 5 11-22.3, DP 11-22.4 tai DP 11-22.5 ja D on DP 11-25.2, DP

11-25.3 tai DP 11-25.4, edellyttäen, että DXZACBY ei ole DP 11-25.2, DP 1-21.2, DP 1-23.1, DP 11-26.1, DP 1-22, DP 11-20.6 eikä DF 1-22.2 vastaavasti.

10 Keksinnön mukaisia suvun Dermatophagoides proteiinialler-geenien peptidejä voidaan käyttää punkkiallergeeneistä johtuvien allergisten reaktioiden hoito- ja estomenetelmiin. Täten esillä olevan keksinnön eräs kohde saa aikaan terapeuttisia koostumuksia, jotka käsittävät Der p I:n, Der p 15 II :n, Der f l:n tai Der f Il:n peptidin tai modifioidun peptidin, jossa on vähintään kaksi T-soluepitooppia, ja farmaseuttisesti hyväksyttävän kantoaineen tai laimentimen. Eräässä kohteessa terapeuttinen koostumus käsittää farmaseuttisesti hyväksyttävän kantoaineen tai laimentimen ja 20 peptidin, joka käsittää vähintään kaksi aluetta jokaisen . , alueen käsittäessä punkkiallergeenin vähintään yhden T-so- • · •••# luepitoopin ja joka on johdettu samoista tai erilaisista « Λ *·* punkkiallergeeneistä.

• · * * 9 9 25 Edulliset terapeuttiset koostumukset käsittävät suvun Der- • · ·,· matophagoides vähintään yhden proteiiniallergeenin vähin- iV tään yhden peptidin tai modifioidun peptidin. Koostumus käsittää riittävän prosenttimäärän vähintään yhden proteiiniallergeenin T-soluepitooppeja siten, että koostumuksen 30 terapeuttinen antoalue huonepölypunkkiallergeenille herkäl- •,· le henkilölle saa aikaan sen, että henkilön T-solut sietä- • · ”1. vät proteiiniallergeeniä. Koostumus käsittää edullisesti r · *. , riittävän prosenttimäärän yhden tai useamman proteiinial- t·· lergeenin T-soluepitooppeja siten, että vähintään 40 % ja ‘S’ 35 edullisemmin vähintään noin 60 % kunkin proteiinin T-solu- ••V aktiivisuudesta sisältyy koostumukseen. Tällaisia koostu- « * | muksia voidaan antaa henkilölle herkkyyden huonepölypunkil le tai allergeenille, joka on immunologisesti ristireaktii-vinen huonepölypunkin kanssa, hoitamiseksi tai estämiseksi.

25

Esillä olevan keksinnön mukaisten terapeuttisten koostumusten antaminen henkilölle henkilön herkkyyden vaimentamiseksi voidaan suorittaa tunnetuilla tekniikoilla. Peptidi, joka on johdettu punkkiallergeenista ja käsittää vähintään 5 yhden T-soluepitoopin, voidaan antaa esimerkiksi yhdessä sopivan laimentimen, kantoaineen ja/tai apuaineen kanssa. T-soluanergian indusoimiseksi ihmisessä terapeuttinen koostumus annetaan edullisesti ei-immunogeenisessä muodossa, esim. se ei sisällä apuainetta. Farmaseuttisesti hyväksyt-10 tävät laimentimet käsittävät suolaliuokset ja vesipuskuri-liuokset. Farmaseuttisesti hyväksyttävät kantoaineet käsittävät polyetyleeniglykolin (Wie et ai., International Archives of Allergy and Applied Immunology, 64: 84-99 (1981)) ja liposomit (Strejan et ai., J. Neuroimmunol. , Tj.21 15 (1984)). Tällaiset koostumukset annetaan tavallisesti in jektoimalla (subkutaanisti, suonensisäisesti jne.), antamalla oraalisesti (esim. kapselin muodossa), sisäänhengit-tämällä, transdermaalisella välityksellä tai antamalla rek-taalisesti. Keksinnön mukaiset terapeuttiset koostumukset 20 annetaan huonepölypunkille herkille henkilöille annoksina ja ajanjaksoina, jotka ovat tehokkaita vähentämään henkilön : herkkyyttä (so. vähentämään allergista vastetta) huonepöly- ·’ punkkiallergeenille. Terapeuttisesti tehokas määrä yhtä tai : : : useampaa samanlaista tai erilaista terapeuttista koostumus- ··· 25 ta voidaan antaa samanaikaisesti tai peräkkäin huonepöly- I · · » • punkille herkälle henkilölle. Tehokkaat määrät terapeuttis- • * · · .·.·. ta koostumusta vaihtelevat sellaisten tekijöiden, kuten henkilön huonepölypunkeille herkkyyden tason, iän, sukupuolen ja painon sekä peptidin kyvyn stimuloida T-soluvastetta 30 henkilössä, mukaan.

• · • · ·

Esillä olevan keksinnön mukainen edullinen terapeuttinen • · » *·* koostumus käsittää vähintään yhden seuraavista keksinnön ♦ · :***· mukaisista peptideistä, joka käsittää vähintään yhden T-so-

35 luepitoopin ja farmaseuttisesti hyväksyttävän kantoaineen ·· tai laimentimen: DP 1-21.7, DP 1-23.10, DP 1-23.11, DP

ϊ ·: 1-23.12, DP 1-23.5, DP 1-23.6, DP 1-23.7, DP 1-23.8, DP

I- 23.9, DP 1-26.2, DP 11-20.7, DP 11-22.6, DP 11-22.3, DP

II- 22.4, DP 11-22.5, DP 11-25.3, DP 11-25.4, DP 1-23.13, 26 DP 1-23.14, DP 1-23.15, DP 1-23.16, DP 1-23.17, DP 1-26.3, DP 1-26,4, DP 1-26.5, DP 11-22.7, DP 11-22.8, DP 11-22.9, DP 11-22.10 ja DP 11-22.11, jotka kaikki on esitetty kuviossa 26.

5

Vielä eräässä esillä olevan keksinnön kohteessa saadaan aikaan koostumus, joka käsittää vähintään kaksi peptidiä (esim. vähintään kahden peptidin fysikaalisen seoksen) jokaisen käsittäessä suvun Dermatophagoides proteiinialler-10 geenin vähintään yhden T-soluepitoopin. Peptidit tai modifioidut peptidit johdetaan samoista tai erilaisista punkki-allergeeneistä. Tällaisia koostumuksia voidaan antaa terapeuttisen koostumuksen muodosssa yhdessä farmaseuttisesti hyväksyttävän kantoaineen tai laimentimen kanssa. Terapeut-15 tisesti tehokas määrä yhtä tai useampaa tällaista koostumusta voidaan antaa samanaikaisesti tai peräkkäin huonepö-lypunkille herkälle henkilölle.

Edulliset terapeuttiset koostumukset, jotka käsittävät far- 20 maseuttisesti hyväksyttävää kantoainetta tai laimenninta ja vähintään kahta peptidiä kunkin käsittäessä vähintään '-· · yhden T-soluepitoopin, käsittävät vähintään yhden peptidin, • · · · joka on valittu ryhmästä, joka koostuu: DP 1-1 (SEQ ID NO: 9) , DP 1-2 (SEQ ID NO: 10), DP 1-3 (SEQ ID NO: 11), DP 1-4

·:· 25 (SEQ ID NO: 12), DP 1-11.1 (SEQ ID NO: 13), DP 1-12.1. (SEQ

* · * · ; ID NO: 14), DP 1-5 (SEQ ID NO: 15), DP 1-13 (SEQ ID NO: • · · ·

;y; 17), DP 1-14 (SEQ ID NO: 18), DP 1-15 (SEQ ID NO: 19), DP

1-6.1 (SEQ ID NO: 20), DP 1-7.1 (SEQ ID NO: 21), DP 1-8 (SEQ ID NO: 22), DP 1-9 (SEQ ID NO: 23), DP 1-16 (SEQ ID

30 NO: 24), DP 1-10 (SEQ ID NO: 25), DP 1-17 (SEQ ID NO: 26),

. . DP 1-21.1 (SEQ ID NO: 27), DP 1-21.2 (SEQ ID NO: 28), DP

1-22.1 (SEQ ID NO: 29), DP 1-22.2 (SEQ ID NO: 30), DP

_ 1-22.3 (SEQ ID NO: 31), DP 1-22.4 (SEQ ID NO: 32), DP

1-23.1 (SEQ ID NO: 33), DP 1-23.2 (SEQ ID NO: 34), DP

*· ·

....: 35 1-25.1 (SEQ ID NO: 35), DP 1-25.2 (SEQ ID NO: 36), DP

1-26.1 (SEQ ID NO: 37), DP 1-27.1 (SEQ ID NO: 38), DP

♦ · · : \ 1-28.1 (SEQ ID NO: 39), DP 1-28.2 (SEQ ID NO: 40), DF 1-1 (SEQ ID NO: 72), DF 1-2.1 (SEQ ID NO: 73), DF 1-3 (SEQ ID NO: 74), DF 1-4 (SEQ ID NO: 75), DF 1-11 (SEQ ID NO: 76), 27

DF 1-12 (SEQ ID NO: 77), DF 1-5 (SEQ ID NO: 78), DF 1-13 (SEQ ID NO: 79), DF 1-14 (SEQ ID NO: 80), DF 1-15 (SEQ ID NO: 81), DF 1-6 (SEQ ID NO: 82), DF 1-7 (SEQ ID NO: 83), DF 1-8.1 (SEQ ID NO: 84), DF 1-8 (SEQ ID NO: 85), DF 1-9 5 (SEQ ID NO: 86), DF 1-16 (SEQ ID NO: 87), DF 1-10 (SEQ ID NO: 88), DF 1-17 (SEQ ID NO: 89), DF 1-21.1 (SEQ ID NO: 90), DF 1-21.2 (SEQ ID NO: 91), DF 1-22.1 (SEQ ID NO: 92), DF 1-22.2 (SEQ ID NO: 93), DF 1-22.4 (SEQ ID NO: 94), DF 1-23.1 (SEQ ID NO: 95), DF 1-23.2 (SEQ ID NO: 96), DF

10 1-25.1 (SEQ ID NO: 97), DF 1-25.2 (SEQ ID NO: 98), DF

1-26.1 (SEQ ID NO: 99), DF 1-27.1 (SEQ ID NO: 100), DF

I- 28.1 (SEQ ID NO: 101), DF 1-28.2 (SEQ ID NO: 102), DP

II- 20 (SEQ ID NO: 50), DP 11-20.1 (SEO ID NO: 51), DP

11-20.2 (SEQ ID NO: 52), DP 11-20.3 (SEQ ID NO: 53), DP

15 11-20.4 (SEQ ID NO: 54), DP 11-20.5 (SEQ ID NO: 55), DP

11-20.6 (SEQ ID NO: 56). DP II-1 (SEO ID NO: 41), DP II-2 (SEQ ID NO: 42), DP II-3.1 (SEQ ID NO: 43), 4 (SEQ ID NO: 44), DP II-5 (SEO ID NO: 45), DP II-6 (SEO ID NO: 46), DP II-7 (SEQ ID NO: 47), DP II-8 (SEQ ID NO: 48), DP II-9 (SEQ 20 ID NO: 49), DP II-1.1 (SEQ ID NO: 57), DP II-1.2 (SEQ ID NO: 58). DP II-2.1 (SEO id NO; 59), DP II-2.2 (SEQ ID NO; *·”/· 60), DP II-2.3 (SEQ ID NO: 61), DP 11-21 (SEQ ID NO: 62),

' DP 11-22 (SEO ID NO: 63), DP 11-26 (SEQ ID NO: 64), DP

11-26.1 (SEQ ID NO: 65), DP 11-23 (SEQ ID NO: 66), DP

25 11-23.1 (SEQ ID NO: 67), DP 11-24 (SEQ ID NO: 68), DP 11-25 : (SEO ID NO: 69). DP 11-25.1 (SEO ID NO: 70), DP 11-25.2 (SEQ ID NO: 71), DF II-1 (SEQ ID NO: 103), DF II-2 (SEQ ID NO; 104). DF II-13.1 (SEO id NO: 105). DF II-3.1 (SEO ID NO: 106), DF II-4.5 (SEQ ID NO: 107), DF II-4.3 (SEQ ID NO: 30 108), DF 11-15 (SEQ ID NO: 109), DF 11-16 (SEQ ID NO: 110),

. . DF 11-17 (SEO ID NO; 111), DF 11-18 (SEO ID NO: 112). DF

11-19 (SEQ ID no: 113), DF 11-19.1 (SEQ ID NO: 114), DF

* ·

. 11-21 (SEO ID NO: 115) ja DF 11-22 (SEO ID NO: 116), DP

1-23.1.1, DP 1-23.1.2, DP 1-23.1.3, DP I 7-23.1.4, DP ..... 35 TI-22.1, DP 11-22.2 (jotka kaikki on esitety kuvioissa 3, 4 ja 25' ^ vähintään yksi alue käsittää modifioidun amino- • « · • · happosekvenssin, joka on valittu seuraavasta ryhmästä: DP 1-21.7- DP 1-23.10- DP 1-23.11- DP 1-23.12. DP 1-23.5. DP 1-23.6 DP 1-23.7, DP 1-23.8, DP 1-23.9, DP 1-26.2, DP II- 28 20.7, DP 11-22.6, DP 11-22.3, DP 11-22.4, DP 11-22.5, DP 11-25.3, DP 11-25.4- DP 1-23.13, DP 1-23.14. DP 1-23.15, DP 1-23,16; DP 1-23.17, DP 1-26.3, DP 1-26.4, DP 1-26.5, DP 11-22 - 7, DP 11-22.8, DP 11-22.9, DP 11-22.10 ja DP 5 11-25.11, jotka kaikki on esitetty kuviossa 26.

Vielä edullisemmat terapeuttiset koostumukset, jotka käsittävät farmaseuttisesti hyväksyttävää kantoainetta tai lai-menninta ia vähintään kahta peptidiä kunkin käsittäessä 10 vähintään yhden T-soluepitoopin, käsittävät vähintään yhden peptidin- joka on valittu ryhmästä, joka koostuu; DP 1-21.1 (SEQ ID NO: 27), DP 1-21.2 (SEQ ID NO; 28), DP 1-22.1 (SEQ

ID NO: 29), DP 1-22.2 (SEO ID NO: 30), DP 1-22.3 (SEO ID NO; 31), DP 1-22.4 (SEQ ID NO: 32), DP 1-23.1 (SEQ ID NO: 15 33), DP 1-23.2 (SEQ ID NO: 34), DP 1-25.1 (SEQ ID NO: 35),

DP 1-25.2 (SEO ID NO: 36), DP 1-26.1 (SEQ ID NO: 37), DP 1-27.1 (SEQ ID NO: 38), DP 1-28.1 (SEQ ID NO: 39), DP

I- 28.2 (SEQ ID NO: 40), DP 1-1 (SEQ ID NO: 9), DF 1-1 (SEQ ID NO: 72), DF 1-21.1 (SEQ ID NO: 90), DF 1-21.2 (SEQ ID

20 NO: 91), DF 1-22.1 (SEQ ID NO: 92), DF 1-22.2 (SEQ ID NO: 93), DF 1-22.4 (SEQ ID NO: 94), DF 1-23.1 (SEQ ID NO: 95), • ♦

:.: :. DF 1-23.2 (SEQ ID NO: 96), DF 1-25.1 (SEQ ID NO: 97), DF

• · ·

· 1-25.2 (SEQ ID NO: 98), DF 1-26.1 (SEQ ID NO: 99), DF

:V· 1-27.1 (SEQ ID NO: 100), DF 1-28.1 (SEQ ID NO: 101), DF

·:· 25 1-28.2 (SEQ ID NO: 102), DP 11-20 (SEQ ID NO: 50), DP

·«·«

: ;*: 11-20.1 (SEO ID NO: 51), DP 11-20.2 (SEO ID NO: 52), DP

♦ · · ♦

.*.* 11-20.3 (SEQ ID NO: 53), DP 11-20.4 (SEQ ID NO: 54), DP

II- 20.5 (SEO ID NO: 55), DP 11-20.6 (SEO ID NO: 56), DP

II-1 (SEQ ID NO: 41), DP II-1.1 (SEQ ID NO: 57), DP II-1.2

30 (SEQ ID NO: 58), DP II-2.1 (SEQ ID NO: 59), DP II-2.2 (SEQ

. . ID NO: 60). DP II-2.3 (SEO ID NO: 61), DP 11-21 (SEO ID NO: 62), DP 11-22 (SEQ ID NO: 63), DP 11-26 (SEQ ID NO: 64), DP 11-26.1 (SEn ID NO: 65). DP 11-23 (SEQ ID NO: 66), DP 11-23.1 (SEQ ID NO: 67), DP 11-24 (SEQ ID NO: 68), DP 11-25 ·»» ...·’ 35 (SEQ ID NO: 69), DP 11-25.1 (SEQ ID NO: 70), DP 11-25.2

(SEQ ID NO: 71), DF II-1 (SEQ ID NO: 103), DF II-2 (SEQ ID * ·* NO: 104), DF II-13.1 (SEQ ID NO: 105), DF II-3.1 (SEQ ID

NO: 106), DF II-4.5 (SEO ID NO: 107), DF II-4.3 (SEQ ID NO: 108), DF 11-15 (SEQ ID NO: 109), DF 11-16 (SEQ ID NO: 110), 29

DF 11-17 (SEQ ID NO: 111), DF 11-18 (SEQ ID NO: 112), DF 11-19 (SEO ID NO: 113), DF II-19.1 (SEQ ID NO: 114), DF 11-21 (SEQ ID NO: 115) ja DF 11-22 (SEQ ID NO: 116), ja vähintään yksi modifioitu peptidi valitaan ryhmästä, i oka 5 koostuu: DP 1-21.7, DP 1-23.10, DP T-23.11, DP 1-23.12, DP

1-23.5- DP 1-23.* DP 1-23.7. DP 1-23.8, DP 1-23.9, DP

I- 26.2, DP 11-20.7, DP 11-22.6, DP 11-22.3, DP 11-22.4, DP

II- 22.5. DP 11-25.3, DP 11-25.4, DP 1-23.13. DP 1-23-14, DP 1-23.15, DP 1-23,16; DP 1-23.17, DP 1-26.3, DP 1-26.4, 10 DP 1-26.5, DP 11-22.7, DP 11-22.8, DP 11-22.9, DP 11-22.10 ja DP 11-25.11, jotka kaikki on esitetty kuviossa 26, nolloin mainittu koostumus käsittää riittävän prosenttimäärän vähintään yhden proteiiniallergeenin T-soluepitooppeja siten, että annettaessa koostumusta huonepölypunkille herkäl-15 le henkilölle, henkilön T-solut alkavat sietää mainittua vähintään yhtä proteiiniallergeeniä.

Muut edulliset keksinnön mukaiset koostumukset käsittävät peptidien ja/tai modifioitujen peptidien seuraavan yhdis-20 telmän ja farmaseuttisesti hyväksyttävää kantoainetta tai laimenninta: DP 1-21.7. DF 1-22.2. DP 1-23.13, DP 1-26.1, • · DP 11-20.6, DP 11-22.3 ja DP 11-25.2; DP 1-21.2, DF 1-22.2, 4»« · DP 1-23.10- DP 1-26.2, DP 1-20.6, DP 11-22.4 ja DP 11-25.3, 0/ DP 1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.11, DP 1-26.3, DP 11-20.7,

·: 25 DP 11-22.5 ja DP 11-25.4; DP T-21.7, DF 1-22.2, DP

; 1-23.12. DP 1-26.4. DP 11-20.6, DP 11-22.6 ja DP 11-25.2; • « ·

DP 1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.5, DP 1-26.5, DP 11-20.7, DP 11-22.7 ja DP 11-25.3; DP 1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.6, DP

I- 26.2, DP 11-20.6, DP 11-22.8 ja DP 11-25.4; DP 1-21.7, 30 DF 1-22.2, DP 1-23.7, DP 1-26.3, DP 11-20.7, DP 11-22.9 ja

. . DP 11-25.3; DP 1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.8, DP 1-26.4. DP

• · · II- 20.6, DP 11-22.3 ja DP 11-25.4; DP 1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.9- DP 1-26.1. DP 11-20.7. DP 11-22.4 ja DP 11-25.3; DP 1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.13, DP 1-26.2, DP 11-20.6, 35 DP 11-22.5 ja DP 11-25.4; DP 1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.14, DP 1-26.3- DP 11-20.7. DP 11-22.6 ja DP 11-25.3; DP 1-21.7, : * DF 1-22.2, DP 1-23.15, DP 1-26.4, DP 11-20.6, DP 11-22.6 ja DP 11-25.3; DP 1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.16. DP 1-26.5, DP 11-20.6, DP 11-22.3 ja DP 11-25.4; DP 1-21.7, DF 1-22.2, 30

DP 1-23.17, DP 1-26.2, DP 11-20.6, DP 11-22.4 ja DP II — 25.3; DP 1-21.7- DF 1-22.2. DP 1-23.8. DP 1-26.3. DP II-20.6, DP 11-22.5 ja DP 11-25.4; DP 1-21.7, DF 1-22.2, DP

I- 23.9, DP 1-26.4, DP 11-20.6, DP 11-22.6 ja DP 11-25.3 ja 5 DP 1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-^3.5, DP 1-26.1, DP 11-20.6, DP

II- 22.7 ja DP 11-25.4.

Vielä eräässä keksinnön kohteessa saadaan aikaan koostumus, joka käsittää farmaseuttisesti hyväksyttävää kantoainetta 10 tai laimenninta ja vähintään kahta, edullisesti vähintään neljää, edullisemmin vähintään kuutta, vielä edullisemmin vähintään seitsemää peptidien seuraavaa yhdistelmää: X,Y,Z,A,B,C,D, jossa X on DP 1-21.2 tai DP 1-21.7, Y on DF 1-22.2, Z on DP 1-23.1, DP 1-23,10, DP 1-23.11, DP 1-23.12, 15 DP 1-23.13, DP 1-23.14, DP 1-23.15, DP 1-23.16, DP

1-23,17, DP 1-23.5, DP 1-23.6, DP 1-23.7, DP 1-23.8 tai DP

I- 23.9; A on DP 1-26.1, DP 1-26.2, DP 1-26.3, DP 1-26.4 tai

DP 1-26.5, B on DP 1-20.6 tai DP 11-20.7, C on DP 11-22, DP 11-22.6, DP 11-22.7, DP 11-22.8, DP 11-22,9, DP

20 11-22.1 0 , DP 11-22.11, DP 11-22.3, DP 11-22.4 tai DP

II- 22.5 ja D on DP 11-25.2, DP 11-25.3 tai DP 11-25.4, :.· edellyttäen, että X, Y, Z, A, B, C, D ei ole alueiden seu- :T raava yhdistelmä: DP 1-21.2, DF 1-22.2, DP 1-23.1, DP I- 26.1, DP 11-20.6, DP 11-22 ja DP 11-25.2.

• 1 2 3 4 5 25 • · · · : .1 Esillä oleva keksintö kohdistuu myös menetelmiin henkiliden « · · .·,· herkkyyden huonepölypunkille havaitsemiseksi, joka käsittää • · henkilöstä saadun verinäytteen yhdistämisen esillä olevan keksinnön mukaiseen peptidiin olosuhteissa, jotka ovat so-30 pivia verikomponenttien sitoumiselle peptidiin, laajuuden, jossa tällaista sitoutumista tapahtuu, määrittämisen. Laa- • · · ϊ.ί juus, jossa sitoutuminen tapahtuu, määritetään arvioimalla • ·· :.· T-solutoiminta, T-soluproliferaatio tai niiden yhdistelmä.

• 1 • · « • · · ... · 35 Keksinnön mukaisen peptidin rakennetta on myös mahdollista · modifioida tai lisämodifioida lisääntyneen liukenevuuden, 2 • · · 3 • · 4 : . parantuneen terapeuttisen tai estävän tehon tai lisäänty- 5 neen stabiiliuden saavuttamiseksi (esim. varastointi-ikä ex vivo tai proteolyyttisen hajoamisen vastustuskyky in vivo).

31

Voidaan valmistaa modifioitu peptidi, jossa aminohapposekvenssi on muutettu, esim. aminohapposubsitituutiolla. -de-leetiolla tai -lisäyksellä, jotta modifioidaan immunogeeni-syys ja/tai vähennetään allergeenisyyttä, tai siihen voi-5 daan lisätä samasta syystä komponentti.

Peptidi voidaan modifioida esimerkiksi siten, että se säilyttää kyvyn indusoida T-soluanergiaa ja sitoa MHC-proteii-neja ilman kykyä indusoida voimakasta proliferatiivista 10 vastetta tai mahdollisesti mitään proliferatiivista vastetta, kun sitä annetaan immunogeenisessä muodossa. Tässä tapauksessa kriittiset T-solureseptoriin sitoutumispisteet voidaan määrittää käyttämällä tunnettuja tekniikoita (esim. jokaisen tähteen substituutio ja T-solureaktiivisuuden läs-15 näolon tai puuttumisen määrittäminen). Ne tähteet, joiden on osoitettu olevan oleellisia vuorovaikuttamaan T-solure-septorin kanssa, voidaan modifioida korvaamalla oleellinen aminohappo toisella edullisesti samanlaisella aminohappotähteellä ("konservatiinen substituutio"), jonka läsnäolon 20 on osoitettu parantavan, vähentävän muttei eliminoivan tai olevan vaikuttamatta T-solureaktiivisuuteen. Lisäksi ne V · ·.· aminohappotähteet, jotka eivät ole oleellisia T-soluresep- :*:* torivuorovaikutukselle, voidaan modifioida korvaamalla « toisella aminohappotähteellä, jonka sisällyttäminen voi pa- • · .! 25 rantaa, vähentää tai olla vaikuttamatta T-solureaktiivisuu- • · · · : .· teen, mutta joka ei eliminoi sitoutumista relevanttiin • * ’·*. MHC:hen.

• · • ·

Lisäksi keksinnön mukaisia peptidejä voidaan modifioida 30 korvaamalla aminohappo, joka on osoittautunut olevan oleellinen vuorovaikuttamaan MHC-oroteiinikompl»ksin kanssa, • · toisella, edullisesti samanlaisella aminohappotähteellä • · · :.· (konservatiinen substituutio), jonka läsnäolo on osoittau- • · .··· tunut parantavan, vähentävän muttei eliminoivan tai olevan 35 vaikuttamatta T-solureaktiivisuuteen. Lisäksi aminohappo- . . tähteet, jotka eivät ole oleellisia vuorovaikutukselle MHC- • · · : ’. proteiinikompleksin kanssa vaan jotka sitoutuvat yhä MHC- *·*' proteiinikompleksiin, voidaan modifioida korvaamalla toi sella aminohapolla, jonka sisällyttäminen voi parantaa, 32 olla vaikuttamatta tai vähentää muttei voi eliminoida T-solureaktiivisuutta. Edulliset ei-oleellisten aminohappojen aminohapposubstituutiot käsittävät mutteivät rajoitu niihin substituutiot alaniinilla, glutamiinihapolla tai metyyli-5 aminohapolla.

Toinen esimerkki peptidin substituoinnista on kysteiinitäh-teiden substituointi edullisesti seriinillä, treoniinillä, leusiinilla tai glutamiinihapolla disulfidikytkösten kautta 10 tapahtuvan dimerisaation minimoimiseksi. Jommankumman allergeenin ensimmäiset kymmenen aminohappotähdettä sisältävän Der p II:n tai Der f II:n peptidin stabiiliutta voidaan esimerkiksi parantaa korvaamalla 8:nnessa aminohappotähteessä sijaitseva kysteiini edullisesti alaniinilla tai 15 glutamiinihapolla tai vaihtoehtoisesti seriinillä tai treoniinillä.

Stabiiliuden ja/tai reaktiivisuuden parantamiseksi peptidit voidaan myös modifioida yhden tai useamman polymorfismin 20 sisällyttämiseksi proteiiniallergeenin aminohapposekvenssiin tuloksena luonnollisesta alleelisesta vaihtelusta.

• · ·.· Lisäksi D-aminohapot, ei-luonnolliset aminohapot tai ei- »·· aminohappoanalogit voidaan substituoida tai lisätä keksin-non mukaisen modifioidun peptidin valmistamiseksi. Lisäksi • · ·· 25 esillä olevan keksinnön mukaiset peptidit voidaan modifioi- • · t · : .· da käyttämällä A. Sehonin ja yhteistyökumppaneiden polyety- • · · .·.· leeniglykoli (PEG) menetelmää, (Wie et el., supra), PEGrhen • · konjugoidun peptidin muodostamiseksi. Lisäksi PEG voidaan lisätä keksinnön mukaisen peptidin kemiallisen synteesin 30 aikana. Peptidien tai niiden osien modifioinnit voivat myös käsittää reduktion/alkylaation (Tarr: Methods of Protein • · * · i.J Microcharacterization, J.E. Silver, toim. Humana Press, ··1 ·.· Clifton, NJ, sivut 155-194 (1986)), asyloinnin (Tarr, sup- • · .·2 3 4 ra), esteröinnin (Tarr, supra), kemiallisen kytkemisen so- ·· · ... 35 pivaan kantoaineeseen (Mishell ja Shiigi, toim., Selected · Methods in Cellular Immunology, WH Freeman, San Fransisco, 2 • · · 3 : . CA (1989), US-patentti 4 939 239), tai laimean formaliini- 4 käsittelyn (Marsh, International Archives of Allergv and

Applied Immunology, 41:199—215 (1971)).

33

Toisessa suoritusmuodossa allergeeniryhmään (esim Der p I tai Der p II) kuuluvat peptidit voidaan modifioida T-solu-reaktiivisuuden parantamiseksi. Annettuaan ristireaktiivi-suuden ryhmän I ja ryhmän II allergeeneihin, yhden ryhmän 5 allergeenin peptidissä, joka voi olla vähemmän reaktiivinen kuin toisen ryhmän allergeenin peptidi, joka vastaa amino-happoasemassa, voi olla yksi tai useampia aminohappoja, jotka on substituoitu yhdellä tai useammalla aminohapolla, jotka ovat peräisin vastaavasta peptidistä. Lisäksi pepti-10 dit voidaan modifioida polymorfismin sisällyttämiseksi pro-teiiniallergeenin aminohapposekvenssiin tuloksena luonnollisesta alleelisesta variaatiosta. Peptidien modifiointi yhden tai useamman tällaisen polymorfismin sisällyttämiseksi parantaa stabiiliutta ja/tai reaktiivisuutta.

15

Keksinnön mukaisten peptidien puhdistamisen helpottamiseksi ja liukenevuuden lisäämiseksi potentiaalisesti on mahdollista lisätä peptidirunkoon reportteriryhm(i)ä. Esimerkiksi polyhistidiiniä voidaan lisätä peptidiin peptidin puhdis-20 tamiseksi immobilisoidulla metalli-ioniaff initeettikromato- • ·* grafialla (Hochuli, E. et ai., Bio/Technology, 6_; 1 321 —1 325 .*:· (1988)). Lisäksi haluttaessa voidaan sisällyttää spesifisiä .·,· endoproteaasipilkontakohtia reportteri ryhmän ja peptidin ♦ · * ** aminohapposekvenssien väliin irrelevanteista sekvensseistä **** 25 vapaiden peptidien eristämisen helpottamiseksi. Yksilön • · herkkyyden proteiiniantigeenille vähentämiseksi menestyk- • · sekkäästi voi olla tarpeen lisätä peptidin liukenevuutta lisäämällä peptidiin funktionaalisia ryhmiä tai olla sisällyttämättä peptideihin hydrofobisia T-soluepitooppeja tai 30 alueita, jotka sisältävät hydrofobisia T-soluepitooppeja.

• · • » • «

• M

T-soluepitooppien sopivan antigeenikäsittelyn auttamiseksi potentiaalisesti peptidissä, kanoniset proteaasiherkät koh- **· dat voidaan käsitellä rekombinanttisesti tai synteettisesti • · · 35 alueiden välillä, jotka alueet kukin käsittävät vähintään • · * -* :*'* yhden T-soluepitoopin. Esimerkiksi varautuneita aminohap- ·;»· popareja, kuten KK tai RR, voidaan viedä peptidissä olevien alueiden väliin peptidin rekombinanttikonstruktion aikana. Saatu peptidi voidaan tehdä herkäksi katepsiini- ja/tai 34 muulle trypsiinin kaltaisten entsyymien pilkonnalle pepti-diosuuksien generoimiseksi, jotka sisältävät yhtä tai useampaa T-soluepitooppia. Lisäksi tällaiset varautuneet aminohappotähteet voivat saada aikaan peptidin liukenevuuden 5 lisääntymisen.

Keksinnön mukaista peptidiä koodaavan DNA:n paikkasuunnattua mutageneesia voidaan käyttää peptidin rakenteen modifi-oimiseksi. Tällaiset menetelmät käsittävät muun muassa 10 PCR:n (Ho et ai.. Gene, 77:51-59 (1989)) tai mutatoitujen geenien totaalisen synteesin (Hostomsky, Z. et ai., Bio-chem. Biophys, Res. Comm. , 161^:1056-1063 (1989)). Bakteeri-ekspression parantamiseksi voidaan edellä mainittuja menetelmiä käyttää yhdessä muiden menetelmien kanssa keksinnön 15 mukaisia peptidejä koodaavissa DNA-rakenteissa olevien eu-karyoottisten kodonien muuttamiseksi sellaisiksi, joita käytetään ensisijaisesti E. colissa.

Spesifiset esimerkit keksinnön mukaisista peptideistä, jot- 20 ka on modifioitu yhden tai useamman edellä kuvatun modifi- : ·’ ointimenetelmän mukaisesti, käsittävät, mutteivät rajoitu ··· · .•J* niihin, kuvioissa 25 esitetyn peptidin DPI-23.1:n ja kuvi- ,V, ossa 25 esitetyn peptidin DPII-22 modifikaatioihin. Erityi- sesti peptidien 23.1 modifikaatiot käsittävät varautuneiden 1**1 25 aminohappojen (DP 1-23.7) ja varautuneiden aminohappoparien • i *’*, (DP 1-23.5) lisäämisen liukenevuuden lisäämiseksi ja kys- « · teiinitähteen korvaamisen seriinillä (DP 1-23.6) tai glut-amiinihapolla liukenevuuden parantamiseksi. Peptidin DP 11-22 muutokset käsittävät varautuneiden aminohappoparien 30 (22.6 ja 22.3) lisäämisen liukenevuuden parantamiseksi, • · t ϊ kuten kuviossa 25 esitetään.

• » · % * • ·

Esillä oleva keksintö saa aikaan myös nukleiinihappoja, *** joissa on keksinnön mukaisia peptidejä koodaavia sekvens- ··« s t 35 sejä. Tämän keksinnön missä tahansa suoritusmuodossa käy-·· · • ^ tetyt nukleiinihapposekvenssit voivat olla cDNA, kuten täs- *;·· sä kuvataan, tai ne voivat olla vaihtoehtoisesti mikä ta hansa tässä esitetty sekvenssi kokonaisuudessaan tai sen osa tai niiden funktionaalisia ekvivalentteja. Tällaisia 35 oligodeoksinukleotidisekvenssejä voidaan valmistaa kemiallisesti tai mekaanisesti käyttämällä tunnettuja tekniikoita.

5 Tätä keksintöä valaistaan lisäksi seuraavilla ei-rajoitta-villa esimerkeillä.

Esimerkki I

Luontaisen punkkiallergeenin puhdistaminen 10 Nyt seuraa kuvaus työstä, joka tehtiin huonepölypunkkien Dermatophagoides pteronyssinus ja Dermatophagoides farinae ryhmän I ja ryhmän II allergeenien puhdistamiseksi luontaisessa muodossaan primaarisina antigeeneinä ihmisen T-solu-epitooppien kartoitukseen.

15

Kaikki neljä proteeiniallergeeniä, Der f I, Der p I, Der f II ja Der p II, immunoaffiniteettipuhdistetttiin käytetyistä punkkiviljelyväliaineista, jotka saatiin joko Commonwealth Sera Laboratoiresista, Melbournesta Australiasta, 20 tai tri Larry G. Arlianilta Wright State Universitystä, ::: Daytonista Ohiosta. Valmistettiin 10-%:inen (paino/til.) kuivattujen käytettyjen punkkiviljelyväliaineiden vesiuute PBS:ään (Phosphate Buffered Saline) sekoittamalla yön ajan 4 °C:ssa. Liukenematon materiaali poistettiin sentrifugoi-25 maila 10000 x g:ssä 1 tunti 4 °C:ssa. Sitten supernatantti * · · *’V suodatettiin tyhjÖputkessa Whatman #1 -paperin läpi ja sen- • · · ' trifugoitiin uudelleen 15000 x g:ssä 1 tunti 4 °C:ssa. Lo pullinen suodattaminen suoritettiin 0,45 m:n selluloo-sa-asetaattisuodattimen läpi.

30 • · ! Ryhmän I tai vastaavasti ryhmän II punkkiallergeenin immu- • · · * noaffiniteettipuhdistamiseen käytettiin monoklonaalisia ,···. vasta-aineita 4 Cl ja 6 D6 (Chapman et ai., J. Allergy . Clin. Immunol. 8_3: 1 055-1 067 (1 989)). Monoklonaalinen vas- • · . . 35 ta-aine 4C1 reagoi epitoopin kanssa, jota on sekä Der f I- • · · i V että Der p I -proteiineissa. Monoklonaalinen vasta-aine 6 D6 reagoi samaten sekä Der f II- että Der p II -proteiinien kanssa.

36

Jokaista monoklonaalista vasta-ainetta varten leikattiin vesivatsaa 50-&:iseen aramoniumsulfaattiin ja vasta-aineet kytkettiin CNBr-aktivoituun Seoharose 4B:hen (Pharmacia) 100 mM:ssa NaHC03, 500 mM:ssa NaCl, pH 8,3, yön ajan 4 5 °C:ssa.

Monoklonaalisen vasta-aineen pylväät tasapainotettiin PBS:ssä ja suodatettuja uutteita panostettiin 15 ml tunnissa. Sitten pylväs pestiin 20 tilavuudessa PBS:ää, minkä 10 jälkeen suoritettiin 20 pylvästilavuuden ankarampi pesu PBS:llä, jota oli täydennetty 500 mM:lla NaCl. Proteiinit eluoitiin 500 mM:iin NaCl, 100 mM:iin glysiiniä, pH 11,0 ja fraktioiden proteiinipitoisuus arvioitiin spektrofoto-metrisella absorbanssilla 280 nmrssä. Huippufraktiot yhdis-15 tettiin ja dialysoitiin laajasti PBS:ää vasten, ne konsentroitiin negatiivisen paineen dialyysilaitteella (saatiin Amiconista, Beverlystä, MA) ja niitä käytettiin punkkiryh-män I ja ryhmän II allergeenien T-solueopitooppikartoitus-tutkimuksissa. Talteenotetut proteiinit saatiin puhtausas-20 teinä 80 % (ryhmä II) - 90 % (ryhmä I).

• I

• · • · « * : Käänteisfaasi-HPLC-kromatografia suoritettiin immunoaffini- :V: teettipuhdistetun ryhmän II punkkiproteiiniallergeenin li- « · · säpuhdistamiseksi olosuhteiden mukaan, jotka ovat kuvanneet * · · · : .·. 25 Heymann et ai., J. Allergy Clin. Immunol. 83: 1 055-1 067 • · · • · · · (1 989 ). Immunoaf f initeettipuhdistettua proteiinia levitettiin 5 pm:n 300 Ä C-8 -pylvääseen (Applied Biosystems Inc.) 0,1 %>:na /til./til. TFA/H2O. Pylvään virtausnopeus oli 1 ml/min. gradientin ollessa 0-60 % asetonitriiliä / 0,1 % 30 TFA 60 minuuttia. Ryhmän II proteiinit eluoituivat noin 45 • · • · · · % asetonitriiliä / 0,1 % TFA. Fraktioiden puhtaus analysoi- • · · ·.· tiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla, mitä seu- • · .*·· rasi densitometrinen skannaus. Niitä ryhmän II proteiineja, joiden puhtaus oli yli 90 %, käytettiin sitten allergeenin • · •· 35 ihmisen T-solukartoitukseen.

• · · • · · • » • · 37

Esimerkki II

Rekombinanttinen punkkiallergeenin ilmentäminen Nyt seuraa kuvaus työstä, joka tehtiin huonepölypunkkien Dermatophagoides pteronyssinus ja Dermatophagoides farinae 5 ryhmän I ja ryhmän II allergeenien valmistamiseksi rekom-binanttiproteiineina E. colissa.

Kaikkiin neljään proteiiniallergeeniin, Der f I, Der p I, Der f II ja Der p II, fuusioitiin niiden kypsässä aminoter-10 minaalissa ohjaussekvenssi MGHHHHHHEF (jossa aminohapot EF ovat EcoR I -restriktiokohdan GAATTC koodaamia). Koska aminohappojen H5~alue koordinoi N++-ioneita NTA-agaroosipyl-väissä (Diagen GmbH), tätä aktiivisuutta käytettiin yhdis-telmäproteiinien puhdistamisessa (Hochuli et ai., Biotech-15 nology 86^: 1 321-1 325 (1988)). Lopuksi kaikki neljä allergeeniä alakloonattiin ekspressiovektoriin pET 11d (Studier et ai., Methods in Enzymology 185: 60-88 (1989)) faagi T7 gn 10 -promoottorin transkriptionaalisen kontrollin alaisena .

20 : cDNA:t, jotka koodaavat D. pteronyssinusista ja D. fari- :T: naesta peräisin olevia ryhmän I allergeenejä, saatiin tri

Wayne Thomasilta plasmidimuodossa lambdagtl 1 : stä peräisin • · olevina alaklooneina (Chua et ai., J. Exp. Med 167: 175-182 ; .·, 25 (1 988 ), Dilworth et ai., Clin. Exp. Allergy 21_: 25-32 » · ·

”V (1991)). Tri Roland Buelow oli alakloonannut Der p I cDNA

M13 RF -plasmidista ECOR I -fragmenttina pUCl8:aan Immuno-Logicissa (Palo Aito), kun taas Der f I cDNA manipuloitiin suoraan M13mp19 RF -plasmidista Df 1(1).

30 • · :,· ' Aluksi cDNA:t alakloonattiin ilmennysvektoriin pTrc99A Hisö • · ·

Insert RRRS, joka on pTrc99A:n modifioitu versio (Aman et ,♦·· ai., Gene 6j): 301 -31 5 (1 988). Alkuperäinen vektori modifi- oitiin lisäämällä synteettinen adaptori (koostuu kahdesta .. 35 komplementaarisesta oligonukleotidistä), joka koodaa oh- • · · • '.· j aussekvenssiä MGHHHHHHEF sen Ncol- (MG) ja EcoRI- (EF) '·"· -kohtien välissä polyliittäjän 51-päässä ja RRS (Retro Re gulatory Sequence) sen Hind III -kohtaan polyliittäjän 3'-päässä, kun taas RRS lisättiin rekombinanttivälittäjä- 38 stabiiliuden parantamiseksi ja siten yhdistelmäproteiinin saannon lisäämiseksi (Skoglund et ai., Gene 88.: 1-5 (1990)). Lopuksi insertti, tässä tapauksessa Amb A 1.1 cDNA, joka koodaa lyhytvillakon (shot ragweed) pääasiallis-5 ta allergeeniä (Rafnar et ai., J. Biol. Chem. 226: 1229-1236 (19919)) alakloonattiin kehykseen Hg-ohjaajan kanssa

EcoRI:na Pstl-fragmenttiin.

Punkkiryhmän I allergeenien ilmentämiseksi Amb a 1.1 cDNA 10 leikattiin pois EcoRl/Hindlll-hajotuksella ja korvattiin adaptoreilla 0EcoRl/HindIII-ulokkeilla (koostuvat parista komplementaarisia oligonukleotidejä). Nämä adaptorit (kuvio 2a) koodaavat kypsän Der p I NH2 -terminaalin ensimmäistä 5 aminohappoa Pst I -kohtaan ja kypsän Der f I:n ensimmäis-15 tä 10 aminohappoa NH2 -terminaalin Hpal-kohtaan. Vektorin EcoRI-kohdan ja 0EcoRI-kohdan adaptoreihin ligatoinnin jälkeen vektorissa oleva EcoRI-kohta tuhottiin jättäen koodattu EcoRI-kohta adaptorin sisäpuolelle pelkkänä EcoRi-koh-tana välituoterakenteissa pTrc99A Hisg5' pl RRS ja pTrc99A 20 His g 5' fl RRS. Der p I cDNA insertoitiin Pstl/EcoRi-frag- t · ; menttina PstI/EcoRI:1la hajotettuun pTrc99A Hisg 5' pl « · · RRSrään, kun taas Der f I cDNA insertoitiin Hpal/EcoRI- :V· fragmenttina Hpal/EcoRI:11a hajotettuun pTrc99A Hisg 5'fl ··1 RRSrään. Jokaisen rakenteen pTrc99A Hisg 5'pl RRS ja • · · « j 25 pTrc99A Hisg fl RRS, 5'-pään sekvenssi vahvistettiin dide- • · · · .2.1 oksiketjuterminaatio-DNA-sekvennoinnilla käyttämällä Sequa- • · nase™ III -välinesarjaa (U.S. Biochemicals). Sekä Hg piettä Hg fl-koodaavat kasetit leikattiin pois Ncol/Nhel-ha-jotuksella (Nhel-kohta oli RRS-adaptorin 3'-päässä) ja lii-30 tettiin Ncol/Nhel-hajotettuun pETl1d:hen. Nämä kaksi rakensi netta, pET11d Hisg pl RRS ja pETl1d Hisg fl RRS, transfor- ·.2 moitiin kompetentteihin BL21 [DE3] -bakteereihin yhdistel- • · .3 mäproteiinien ilmentämiseksi. K21 [DE3] sisältää rekombi- • · · ,...· nanttisen faagi lambda -lysogeenin, DE3, faagi T7 RNA -po- · 35 lymeraasigeenin ollessa lac UV5 -promoottorin transkriptio- t 1 · 2 ' ·“ naalisen kontrollin alaisena. T7 RNA -polymeraasigeenin 3 ’1’1· ilmentyminen indusoidaan lisäämällä IPTG:tä (isopropyyli- B-D-tiogalaktopyranosidia), joka puolestaan johtaa yhdis- 39 telmägeenin, joka on alakloonattu pET vektorin T7 gn 10 -promoottorin 3', ilmentymiseen.

cDNArt, jotka koodaavat D. pteronyssinusista ja D. fari-5 naesta peräisin olevia ryhmän II allergeenejä, saatiin myös tri Wayne Thomasilta plasmidimuodossa lambdagtl 1:stä peräisin olevina alaklooneina (Chua et ai., Int Arch. Immun. 91 : 1 1 8-1 23 (1 990), Trudinger et ai., Clin. Exp. Allergy 21 : 33-37 (1991). Tri Roland Buelow oli alakloonannut alkupe-10 räisen Der p II cDNA:n M13 RF -plasmidista pCA- ja pGEX-vektoreihin ImmunoLogicissa (Palo Aito). Tri Thomasin ryhmä välitettiin Der f II cDNAzn alakloonina pGEX. Kumpaakin pGEX-plasmidia, joissa on ryhmän II cDNArita, käytettiin templaatteina PRC-vahvennukseen saman 5'-merkitykselli-15 sen/3'-merkityksettömän aloittajaparin kanssa (kuvio 2b). Aloittajat suunniteltiiin EcoRI-kohdan (GAATTC, joka kodaa aminohappoja EF) fuusioimiseksi lukujärjestykseen kypsien ryhmän II proteiinien NH2-terminaalin kanssa ja ryhmää II koodaavan alueen PstI-kohta-3':n sijoittamiseksi. MJ Rese-20 arch Thermal Controlleria ohjelmalla 30 X (94 °C 1 min/55°1 • · : min. 30 sek./72°C 2 min) käytettiin yhdessä reagenssien • · · kanssa, jotka ovat Perkin Elmer -Cetus Gene Amp -välinesar- : ί · jasta PCR-vahventamiseen. PCR-tuotteet olivat EcoRl/PstI- • · ·1 hajotettuja ja alakloonattuja EcoRl/Pstl-hajotettuun • · · · • ;2· 25 M1 3mp1 9RF:ään. DNA-sekvenssianalyysi suoritettiin PCR-tuot- • · · · .·.· teiden sekvenssin vahvistamiseksi. Oikeat Ml3RF:t olivat • ·

EcoRl/PstI:llä hajotettuja, niiden ryhmän II cDNA-insertit eristettiin ja alakloonattiin EcoRl/Pstl-hajotettuun pTrc99A Hisg Amb a 1.1 RRSrään (jota käytettiin ryhmän II 30 cDNAziden vaihtamiseen villakko-cDNAzhan (kuvio 1)).

♦ ♦ • · ··· ♦ ·· • ·

Der f II cDNAzssa oli sekvenssipolymorfismi asemassa 54 • · :3 (so. treoniinitähde isoleusiinin asemasta). Tämän polymor- • · · ....· fismin muuttamiseksi suoritettiin T54:n paikkasuunnattu 35 mutaqeneesi Der f II cDNAzssa käyttämällä BioRad Laborato- • · 2 : · riesin Muta-Gene-välinesarjaa perustuen Kunkelin menetel- 3 * mään, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 488-492 (1985). Alku peräinen M13mp 19RF transformoitiin T54 Der f II cDNArn kanssa CJ236-bakteereihin, jotka sietävät urasiilin sisäl- 40 lyttämisen tymidiinin asemasta DNA-replikaation aikana ja yksijuosteinen faagi-DNA valmistettiin templaattina. Muta-geeninen 17 emäsparin aloittaja (2b) lämpöliitettiin faagi-templaatti-DNArhan. T4 DNA -polymeraasia käytettiin muta-5 geenisellä oliqonukleotidillä herätetyn templaatti-DNA:n kopioimiseen ja T4 DNA -ligaasia käytettiin DNA-juosteessa olevien aukkojen tiivistämiseen. Reaktio transformoitiin MV1190-bakteereihin, jotka ovat villintyyppisiä, urasiili-tähteiden leikkaamiseksi ja siten mutagenisoidun (ei-ura-10 siiliä sisältävän) juosteen replikoimiseksi selektiivisesti ja yksijuosteinen faagi-DNA valmistettiin rekombinanttisis-ta (valkoisista) plakeista. Useita rekombinantteja alistettiin DNA-sekvenssianalyysiin ja Der f II cDNA:ita, joissa on korjattu 154-sekvenssi, alakloonattiin EcoRl/Pstl-frag-15 mentteina EcoRl/Pstl-hajotettuun pTrc99A Hisg Amb a 1.1 RRS:ään.

Koska aiempi työ oli osoittanut, että pET11d vektori oli useimmissa tapauksissa kykenevä ilmentämään yhdistelmäpro-20 teiineja korkeammilla tasoilla kuin pTrc99A-vektori, kaksi • · • · . punkkiryhmän II cDNA:ta alakloonattiin Hg-fuusioproteiinei- ··1 na T7-vektoriin. pTrc ppA Hisg f II RRS ja pTrc99A Hisg p II RRS hajotettiin Ncol/Nhel:llä , cDNA-insertit eristettiin •| ja alakloonattiin NcoI/Nhel-hajotettuun pET11d Hisg pliään • 25 (kuvio 1). Yhdistelmaplasmidit transformoitiin BL21 [DE3] • · · j'·1 -bakteereihin ilmentämistä varten.

BL21 D3 -isäntäbakteerit, joissa on pET1 1d-punkkiallergee- ni-ilmennysrakenteet, viirutettiin tuoreena BHI-agarlevylle . . 30 (3,7 % paino/til. Difco Brain Heart Infusionia, 1,5 % pai- • 1 no/til. Difco-agaria), jota oli täydennetty 200 μg/ml:lla • · ‘S' ampisilliinia ja inkuboitu yön ajan 37 °C:ssa. Yksittäinen :1’1 pesäke inokuloitiin 2 ml:aan 200 wg/ml ampisilliini/BHl - • · · ····1 väliainetta (3,7 % paino/til Difco Brain Heart Infusion) 35 ja ravistettiin 300 rpmrssä 37 °C:ssa kunnes se oli sameaa • · 1 muttei kyllästynyttä. 2 ml viljelmää lisättiin sitten 100 • · · · ml:aan ampisilliini/BH1-väliainetta, ravistettiin 300 rpmrssä 37 °C:ssa kunnes se oli sameaa muttei kyllästynyttä, jolloin viljelmä jaettiin 18 x 500 ml:aan (9 litraa) 41 200 pg/ml ampisilliini/BHl-väliainetta ja ravistettiin 300 rpm:ssä 37 °C:ssa. Kun viljelmän 00595 saavutti 1,0, yhdis-telmämolekyylien ilmentyminen indusoitiin lisäämällä IPTG:-tä 400 μΜ:ϋη ja annettiin jatkua kaksi tuntia.

5

Bakteerit kerättiin sentrifugoimalla 10000 x g:ssä 15 minuuttia ja ne suspendoitiin uudelleen 1/20-tilavuuteen lyy-sipuskuria (0,2 mg/ml lysotsyymiä, 100 mM NaP04, pH 8,0, 50 mM NaCl), inkuboitiin jäällä 30 minuuttia ja jäädytet-10 tiin -70 °C:ssa. Jäätyneet bakteerit murrettiin sulattamalla nopeasti 37 °C:ssa ja sitten niitä sonikoitiin 5 kertaa 20 sekuntia 30 sekunnin välein. Sonikoidut näytteet sentri-fugoitiin 15000 x g:ssä liukenevien ja partikkelimaisten bakteeriproteiinien erottamiseksi. Liukenevat proteiinit 15 kaadettiin pois ja pelletoitunut proteiini suspendoitiin uudelleen 6 M:iin guanidiini-HCl:a, 100 mM:iin 2-merkapto-nolia, 100 mM:iin NaP04, 10 mM:iin Tris pH 8,0. Tämä suspensio alistettiin sentrifugointiin 15000 x g:ssä ja super-natantti poistettiin, säädettiin pH:hon 10 N NaOHrlla ja 20 levitettiin NTA-agaroosipylvääseen, joka oli tasapainotettu • · • ♦ϊ · 6 M: iin guanidiini-HCl :a, 100 mM:iin NaPCM. 10 mM:iin Tris pH 8,0. Pylväs pestiin 6 mM:ssa guanidiini-HCl, 100 mM:ssa • ·

NaP04, 10 mM:ssa Tris pH 8,0, kunnes effluentin OD28O saa->#*[ vutti taustan. Pylväspuskuri vaihdettiin sitten 8 M: iin 25 ureaa, 100 mM:iin NaP04, 10 mM:iin Tris pH 8,0. Tasapainot-;*:* tamisen jälkeen suoritettiin ankarampi pesu 8 M:ssa ureaa, 100 mMtssa NaOAc, 10 mMrssa Tris pH 6,3, kunnes effluentin od280 saavutti taustan. Sitten yhdistelmäpunkkiproteiini (Hg-fuusiona) eluoitiin 8 M:iin ureaa, 100 M:iin NaOAc, 10 . . 30 mM Tris pH 4,5 ja kerättiin alikvootteina, joiden OD280- • · profiilia tarkkailtiin. Proteiinihuippu dialysoitiin 3 ker- • · , taa 500 tilavuuteen PBS:ää ihmisen T-soluanalysointia var- • · · ϊ ten. Saanto oli 10-70 mg yhdistelmäproteiinia litraa kohti *:· puhtauden ollessa (määritetty densitometrisellä skannauk- 35 sella) 80 (Der f II) - 95 %.

» · • · »···

Rekombinanttisen Der f II -proteiiniallergeenin puhdistamiseksi edelleen käytettiin käänteisfaasi-HPLC-kromatografi-aa. Suunnilleen 100 mg Hisg-Der f TI -proteiinia pelkistet- 42 tiin 20 mM:ssa DTT 36 °C:ssa 30 minuuttia ja sitten se levitettiin Pharmacia PRO RPC HR 10/10 -pylvääseen 0,1 %:iin til/til. TFA/H2O. Pylvään virtausnopeus oli 1,5 ml/min gradientin ollessa 0-70 % asetonitriiliä 0,1 %:ssa TFA 40 mi-5 nuuttia, mitä seurasi gradientti 70-100 % asetonitriiliä 0,1 ?>:ssa TFA. Hisg-Der f II -proteiini eluoitui 54-96 % asetonitriiliä. 214 nm:ssä ja 280 nmrssä havaittujen fraktioiden puhtaus analysoitiin SDS-polyakryyliamidigeelielek-troforeesi/densitometrisellä skannauksella. Ne fraktiot, 10 joissa Hisg-Der f II -proteiinin puhteus oli yli 95 %, käytettiin seuraavaksi allergeenin ihmisen T-solukartoituk-seen. Saanto valmistavasta käänteisfaasi-HPLC:stä oli suunnilleen 69 %.

15 Nukleotidisekvenssipolymorfismien määrittäminen Der p I-, Der p II- ja Der f II -allergeeneissä

Odotettiin, että Der p I:tä, Der p II:ta, Der f l:tä ja Der f II:ta koodavassa nukleiinihapposekvenssissä on sekvens-sipolymorfismeja johtuen yksittäisten punkkien luontaisesta 20 alleelisesta vaihtelusta. Useita nukleotidin ja saatujen • « - aminohapposekvenssien polymorfismeja on havaittu erilaisten • · · ·.·' Der p I-, Der p II- ja Der f II -kloonien sekvennoinnin • 1 aikana. Aminohapposekvenssipolymorfismit on esitetty kuvi-·; oissa 22, 23 ja 24.

: 25 «»· ·

•V Esimerkki III

f » — - — —.

Limittyvien peptidien synteesi

Kuvioissa 3 ja 4 esitetyt limittyvät Der p I-, Der f I-, Der p II- ja Der f II -peptidit syntetoitiin käyttäen stan-, , 30 dardia Fmoc/tBoc-synteettistä kemiaa ja ne puhdistettiin • 1 ··· dialysoimalla tai käänteisfaasi-HPLC: llä . Syntetoituj en « · *·* ^ peptidien aminohappotähteet ovat suluissa peptidinimien ja ·**' aminohappotähdesekvenssin (yksittäinen kirjainkoodi) mukaan

• M

peptidin nimen jälkeen. Peptidien nimet ovat vakioita kai-35 kissa kuvioissa. Der p I-, Der f I-, Der p II- ja Der f II

« « • · -proteiinit jaettiin limittyviin peptideihin siten, että M«| ’ Der p i:n ja Der f I:n sekä Der p li:n ja Der f II:n limit tyvillä peptideillä on vastaavat aminohappotähdeluvut, esim. DP 1-1 ja DF 1-1 sisältävät kumpikin Der f I- ja Der 43 f I -allergeenien aminohappotähteet 1-20 vastaavasti. Der p I- ja Der f I -peptidien välinen aminohappoaseman yhdenmukaisuus tehtiin tarkoituksella Der P- ja Der f T-soluepi-tooppien ristireaktiivisuuden testaamiseksi parhaiten ja 5 siten peptidien määrittämiseksi, jotka annettaessa pölypun-kille herkälle henkilölle hoitavat herkkyyttä sekä Der p-että Der f -allergeeneille. Tehtäessä limittyviä peptideitä ryhmän I ja ryhmän II allergeenien suhde otettiin huomioon T-soluristireaktiivisuuden tasolla. Lisäksi ryhmän I aller-10 geenien funktio seriiniproteaaseina otettiin huomioon ja muiden tunnettujen seriiniproteaasien, esim. papaiinin, aktinidiinin, aminohapposekvenssit tutkittiin samanlaisten säilyneiden ja muuttuvien alueiden identifioimiseksi ryhmän I allergeeneissä. Odotettiin, että ryhmän I allergeenien 15 säilyneet alueet sisältävät "yhteisiä" T-soluepitooppeja.

Esimerkki IV

Punkkiallergisen potilaan primaariset T-soluvasteet Der p I- ja Der p II -proteiineihin ja peptideihin 20 Periferaaliveren yksitumaisia soluja (PBMC) puhdistettiin : Ficoll-Hypaque sentrifugoimalla periferaaliverinäyte pun- :.· · kille allergisesta potilaasta R.B ja testattiin eritys vas- teenä erilaisiin antigeeneihin, so. affiniteettipuhdistettu ··· Der p I, af f initeettipuhdistettu Der p II, erilaiset Der p • · « ·

l 25 I- ja Der p II -peptidit. Testaamista varten 5x104 PBMC

viljeltiin triplikaatteina mikrokoloissa 7 päivää 37 °C:ssa erilaisten konsentraatioiden antigeeniä läsnäollessa 200 plrssa RPMI-1640:tä, joka sisältää 5 % ihmisen AB-seerumia. Sitten jokaiseen koloon välitettiin 1 pCi tritiumoitua ty-30 midiiniä 16 tuntia. Sisällytetyt lukemat kerättiin lasikui- ♦ ♦ * · tuputkiin ja niitä käsiteltiin nestetuikelaskentaa varten.

• * · *.* Taulukossa I esitetään tämmän testin tulos. CPM+/—standar- ;***· dipoikkeamat on esitetty. Kunkin vasteen stimulointi-indek- ·· · ....: si (S.I.) on solujen sisällyttämän ^H-tymidiini-cpmin vas- ##·/ 35 teenä antigeeniin jaettuna solujen sisältämän ^H-tymidiinin • ·* cpm väliaineessa. Tulokset osoittavat, että tämä potilas

' * reagoi S.I.:n ollessa vähintään 2,0 peptideihin DP 1-1. DP

1-3, DP 1-8, DP 1-10, DP 1-5.2, DP II-4 ja DP II-9. Täten nämä peptidit sisältävät T-solujen tunnistamia T-soluepi- 44 tooppeja, jotka ovat peräisin tästä allergisesta potilaasta.

Taulukko I

5 Antigeeni Konsentraatio cpm ± S.D. S. I

ug/ml Väliaine -- 1071 ± 30

Der p I 10 920 ±15 0,9 10 30 2122 ± 93 2,0 100 1492 ±13 1,4 DP 1-1 1 0 1 099 ±48 1,0 30 3527 ± 73 3,3 15 100 2746 ± 81 2,6 DP 1-2 10 1395 ±47 1,3 30 1283 ± 34 1,5 100 1486 ±38 1,4 20 DP 1-3 10 2608 ± 52 2,4 30 1 561 ±13 1,5 100 5252 ± 67 4,9 25 DP 1-8 10 1439 ±32 1,3 30 1045 ±32 1,0 100 2272 ± 40 2,1 : DP 1-10 10 1 936 ±50 1,8 30 30 3042 ± 89 2,8 '•y 1 00 2644 ± 63 2,5 • · ♦ • · DP 1-5.2 10 1374 ± 20 1,3 ..’Γ 30 2241 ± 87 2,1 : 35 1 00 31 32 ± 111 2,9 « · · • · · ·

Der p II 10 1113 ± 35 1,0 30 2104 ± 43 2,0 100 1057 ±27 1,0 40 DP II-4 10 2126 ± 25 2,0 30 1979 ±94 1,8 ; 1 00 2314 ± 116 2,2 • · • · · · :*;· 45 DP II-9 3970 ± 87 3,7 \ . 4464 ± 86 4,2 2237 ± 53 2,1 • · ·

Esimerkki V

50 T-soluepitooppitutkimukset Der p l:llä • · • ···· Periferaaliveren yksitumaisia soluja (PBMC) puhdistettiin

Ficoll-Hypaque sentrifugoimalla 60 ml heparinisoitua verta, joka oli peräisin pölypunkille allergisista henkilöistä.

45 joilla oli punkkiallercrian kliinisiä oireita ja joiden iho-testi oli pölypunkkipositiivinen.

107 pbmC, jotka olivat peräisin henkilöistä, 543 viljeltiin 5 10 mlrssa RPMI-1640, joka sisältää 5 % yhdistettyä ihmisen AB-seerumia ja täydennettiin glutamiinilla, penisilliinillä, streptomysiinillä ja HEPES-puskurilla 20 vg/ml:n puhdistettua luontaista Der p i/ml läsnäollessa. Elinkykyiset solut puhdistettiin Fiooll-Hypaque-sentrifuqoinnilla ja 10 niitä viljeltiin lisäksi 2 viikkoa RPMI-1640/5 % AB-seeru-missa, joka sisältää 5 yksikköä rekombinanttista ihmisen IL-2/ml ja 5 yksikköä rekombinanttista ihmisen IL-4/ml. Lepo-T-solut testattiin sitten sekundaarisessa proliferaa-tiotestissä T-soluvasteiden erilaisiin huonepölypunkkipro-15 teiineihin ja -peptideihin testaamiseksi. Testiä varten 2 x 104 lepo-T-solua viljeltiin 200 yl:ssa RPMI-1640/5 ¾ AB-seerumia 3 päivää 37 °C:ssa 2x1 04 autoloaisella Epstein-Barr-viruksella transformoitujen B-solujen läsnäollessa (20000 radia) antigeeniä esittävinä soluina erilaisilla 20 konsentraatioilla puhdistettuja luontaisia Der p I- tai » · : synteettisiä Der p I -peptidejä. Sitten jokaiseen koloon • · · ·.· · välitettiin 1 μ(3ί tritiumoitua tymidiiniä 16 tuntia. Sisäl- • · lytetyt lukemat kerättiin lasikuituputkiin ja niitä käsi- ·;· teltiin nestetuikelaskentaa varten. Pelkkä väliaine, joka «··» ♦ 25 oli negatiivisena verrokkina, ei sisältänyt mitään aller-·«· · geeniä tai peptidiä. Tämän kokeen tulokset osoittavat, että tämä erityinen potilas reagoi S.I.:n ollessa vähintään 2,0 peptideihin, jotka on johdettu DP I-1:stä, DP I-2:sta, DP I-4:stä, DP 1-11:sta, DP I-5:stä, DP l-13:sta, DP -15:stä, . 30 DP 1-6.1:stä, DP I-8:sta, DP I-9:stä, DP I-16:sta, DP I— 10:stä ja DP I-17:sta (Tietoja ei ole esitetty).

• ♦ • · ♦ · :*** Edellä olevaa menetelmää käytettiin lukuisissa muissa huo- • Φ * ·...; nepölypunkkiallergisissa henkilöissä paitsi että a) yksit- 35 täisissä tapauksissa IL-2:n ja IL-4:n kanssa viljelemisen • · · • ·* ajan pituus vaihteli, b) yksittäisissä tapauksissa T-solut * ' herätettiin joko puhdistetulla luontaisella (N) tai rekom- binanttisella (R) Der p I -proteiinilla joko 20 vg/ml tai 10 μg/ml ja c) yksittäisissä tapauksissa käytettiin rönt- 46

gensäteilytettyä (3500 radia) autoloqista PBMC:tä antigeeniä esittävinä soluina sekundaarisessa proliferaatiotestis-sä. Lisäksi kolmen peptidin (DP 1-11 (SEQ ID NO: 117), DP 1-12 (SEO ID NO: 118) ja DP II-3 (SEQ ID NO: 119) havait-5 tiin sisältävän alhaisia lukumääriä konservatiivisia muutoksia aminohapposekvenssistä olevasta luontaisesta sekvenssistä. Lisäksi syntetoitiin kolme muuta peptidiä (DP

I- 11.1 (SEQ ID NO: 13), DP 1-12.1 (SEQ ID NO: 14) ja DP

II- 3.1 (SEQ ID NO: 43), joissa ei ollut mitään muutoksia 10 luontaisesta sekvenssistä. Joitakin T-soluanalyysejä tehtiin alkuperäisillä peptideillä (so. DP 1-11, DP 1-12 ja DP II-3). Seuraavassa T-soluanalyysissä, joka suoritettiin lisäpeptideillä (so. DP 1-11.1, DP 1-12.1 ja DP II-3.1), ei havaittu mitään merkittävää alkuperäisten peptidien ja 15 lisäpeptidien välistä positiivisen vasteen keskimääräisen S.I.:n tai prosenttimäärän eroa. Täten kummastakin peptidi-ryhmästä peräisin olevat tiedot yhdistettiin.

Yksittäiset tulokset katsottiin positiivisiksi ja niitä 20 käytettiin, jos ihminen reagoi Der p I -proteiiniin ja vä- • · · · hintään yhteen Der p I:stä johdettuun proteiiniin S.I.:ssä * · · *.· · 2,0 tai sen yli. 33 positiivisen kokeen tulosten yhteenveto • i ·.·.* on esitetty kuviossa 5. Lepo-T-solulinjat, jotka herätet- *:· tiin rekombinanttisella tai luontaisella Der p I-stimuloi- i :*· 25 dulla PBMC:llä, testattiin synteettisiin Der p I -peptidei- • V. hin reaktiivisuudeltaan. Kunkin peptidin maksimaalinen vas te antigeenin titrauksessa on ilmaistu T-solustimulaatioin-deksinä (S.I.). S.I. on jaksoja minuutissa (cpm), jotka solut sisällyttävät vasteena peptidiin jaettuna cpm:llä, jon- . . 30 ka solut sisällyttävät pelkässä väliaineessa. S.I.-arvo, • · · • · joka on suurempi kuin taustataso, osoittaa, että peptidi • · sisältää T-soluepitoopin. Kuitenkin vain yksittäisiä S.I.-: -arvoja, jotka ovat suurempia tai yhtä suuria kuin 2,0 ·;··* (vaste on kaksinkertainen tai enemmän verrattuna taustaan) 35 ja joita nimitetään tässä "positiivisiksi" tuloksiksi, käy- • · · tettiin laskettaessa kunkin peptidin keskimääräistä T-solu- • · · · stimulaatioindeksiä testatussa potilaassa tai potilasryhmässä. Histogrammissa kunkin pylvään yläpuolella on esitetty suluissa keskimääräiset T-solustimulaatioindeksit, jotka 47 on laskettu jättämällä pois suurimmat ja pienimmät positiiviset vasteet kunkin peptidin osalta äärimmäisyyksien vaikutuksen minimoimiseksi. T-solustimulaatioindeksi lasketaan: 5 (T-solun cpm + APC + antigeeni) T-solun cpm + APC + verrokki

Pylväs esittää peptidin vasteen kumulatiivista järjestystä potilasryhmässä. Kumulatiivisen järjestyksen määrittämisek-10 si määritettiin 5 peptidiä, joiden S.I. on suurin kussakin henkilössä, ja ne testattiin numerojärjestyksessä laskevassa järjestyksessä 5:n vastatessa voimakkainta vastetta. Kunkin peptidin järjestykset on laskettu sitten yhteen potilasryhmässä kunkin peptidin kumulatiivisen järjestyksen 15 määrittämiseksi. Jokaisen pylvään yläpuolella on positiivisten vasteiden prosentti S.I:n ollessa peptidille vähintään 2 testattujen potilaisden ryhmässä. Antamalla prosentti ja keskimääräinen T-solustimulointi-indeksi voidaan laskea kunkin peptidin positiivisuusindeksi (P.I.). Kunkin 20 henkilön P.I. määritetään kertomalla keskimääräinen S.I. henkilöprosentilla huonepölypunkkiherkkien henkilöiden po-·*·* pulaatiossa (esim. edullisesti vähintään 15 henkilöä, edul- lisemmin vähintään 30 henkilöä tai enemmän), jotka reagoi- • · vat peptidiin S.I.:n ollessa vähintään 2,0 (esim. DP 1-1:n Y" 25 osalta kuviossa 5, P.I. olisi noin 343 (73 % x 4,7). Siksi • · T. P.I. edustaa sekä T-soluvasteen peptidiin voimakkuutta • · • ·

* (S.I.) että T-soluvasteen peptidiin taajuutta huonepölypun-kille herkkien henkilöiden populaatiossa. Kuvio 5 esittää, että peptidit DP 1-1, DP 1-2, DP 1-3, DP 1-4, DP 1-5, DP

30 1-6.1, DP 1-7.1, DP 1-8, DP 1-9, DP 1-16 ja DP 1-10 sisäl- • · tävät T-solureaktiivisuuden merkittäviä alueita näissä po- : Γ tilaissa.

• · • · ·

***. Esimerkki VI

• · · · . . 35 T-solututkimukset Der f Iillä • · · • Suoritettiin samanlaisia kokeita kuin esimerkissä V Der f *:·*· I -proteiinin T-solureaktiivisten alueiden määrittämiseksi.

Esimerkiksi PBMC, joka peräisin huonepölypunkkiallergisesta potilaasta, 783 eristettiin esimerkissä 5 kuvatusti ja sti- 48 muloitiin in vitro rekombinanttisesti puhdistetulla Der f I:llä 20 pg/ml:na. Proliferaatiotestin tulokset Der f I -peptideillä käyttämällä röntgensäteilytettyä (3500 radia) autogista PBMC antigeeniä edustavina soluina, osoittavat, 5 että tästä potilaasta reagoivat peptideihin DF 1-8.1, DF 1-9, DF 1-6, DF 1-10, DF 1-2.1, DF 1-3, DF 1-11, DF 1-5, DF 1-1 ja DF 1-17 (tietoja ei ole esitetty).

Edellä olevaa menetelmää käytettiin lukuisissa potilaissa 10 paitsi että yksittäisissä tapauksissa T-solut herätettiin affiniteettipuhdistetulla Der f I:llä 20 μg/ml:na tai 10 μg/ml:na ja röntgensäteilytettyjä (25000 radia) autologi-sia Epstein-Barrviruksella transformoituja B-soluja käytettiin antigeeniä esittävinä soluina. 16 positiivisen kokeen 15 tulosten yhteenveto on esitetty kuviossa 6. Tiedot analysoitiin kuten esimerkissä V kuvataan. Tiedot osoittavat, että Der f I -proteiinin merkittäviä T-solureaktiivisuuden alueita on löydettävissä peptideistä DF 1-1, DF 1-2, DF 1-3, DF 1-4, DF 1-11, DF 1-5, DF 1-6, DF 1-7, DF 1-14, DF . . 20 1-15, DF 1-8.1 ja DF 1-9.

• I

• · .

• · · · • · · • ·

*·* Esimerkki VII

• · " * · · *.*. Tutkimus, joka osoittaa Der p I- ja Der f I -T-soluepitoop- pien ristireaktiivisuuden t · J#: ' 25 Der p I- ja Der f I -proteiinit ovat hyvin homologisia (81 : :* %:n identtisyys). Täten suoritettiin kokeita, jotka ovat samanlaisia kuin esimerkin V kokeet, Der p l:llä herätettyjen T-solulinjojen T-soluvasteiden määrittämiseksi, kun ne on stimuloitu erilaisilla Der p I -peptideillä ja oleel- :.· 30 lisesti yhteneväisillä Der f II -peptideillä. T-solulinjat • · herätettiin in vitro, kuten esimerkissä V kuvataan, ja nii-• · ' -* • «

*. . den vaste oleellisesti samanlaisten Der p I- ja Der f I

• · · ·... -peptidien (esim. DP 1-1 (Der p I:n aminohappotähteet 1-20) *:*·" tai DF 1-1 (Der f i:n aminohappotähteet 1-20) sarjaan tes- ..V 35 tattiin. Tiedot analysoitiin kuten esimerkissä V kuvataan paitsi että kuhunkin peptidiin positiivisten vasteiden suu- • · · · rimpia ja pienimpiä S.I-arvoja ei jätetty pois keskimääräisistä S.I.-laskelmista. Tällaisten kokeiden lukumäärän yhteenveto on esitetty kuviossa 7. 14 positiivisen kokeen 49 tulokset osoittavat, että Der p Iillä herätetyt T-solut reagoivat erilaisiin Der f I -peptideihin, mikä osoittaa ristireaktiivisuuden ryhmän I allergeeneissä. Der p Iillä herätetyt T-solut reagoivat merkittävästi peptideihin DF 5 1-1, DF 1-2, DF 1-3, DF 1-4, DF 1-11, DF 1-12, DF 1-15, DF 1-8, DF 1-9, DF 1-15 ja DF 1-6. Joissakin potilaissa Der f I -peptidi oli voimakkaampi Der p Iillä herätettyjen T-so-lujen stimulaattori kuin vastaava Der p I -peptidi. Kuviossa 8 esitetään käänteiskokeiden tulokset, joissa lukuisista 10 potilaista peräisin olevat T-solut harätettiin in vitro Der f I -proteiinille ja vaste erilaisiin Der p I -peptideihin ja oleellisesti samankaltaisten Der f I -peptidien sarjaan analysoitiin. 8 positiivisen kokeen tulokset osoittavat, että Der f Iillä herätetyt T-solut reagoivat merkittävästi 15 peptideihin DP 1-1, DP 1-3, DP 1-4, DP 1-11/11, DP 1-14, DP 1-15, ja DP 1-8.

Esimerkki VIII

T-soluepitooppitutkimukset Der p Hilla 20 Suoritettiin samanlaisia kokeita kuin esimerkissä V Der p t i ~ • ♦ *·· II -proteiinin T-solureaktiivisten alueiden määrittämisek- • · · *·1 si. Esimerkiksi PBMC, joka peräisin huonepölypunkkialler- • · *.·. gisesta potilaasta, 348 eristettiin esimerkissä 5 kuvatusti e>1{ ja stimuloitiin in vitro 20 pg/ml puhdistetulla Der p IIil- 25 la. Proliferaatiotestin tulokset käyttämällä röntgensätei- :1:1 lytettyä (25000 radia) Epstein-Barr viruksella transformoi- tuja autologisia B-soluja antigeeniä edustavina soluina erilaisten Der p II -peptidien kanssa, osoittavat, että tämä erityinen potilas reagoi hyvin peptideihin DP II-8.1, . . 30 DP II-9, DP II-6, DP 11-10, DP II-2.1, DP II-3, DP 11-11, *’!. DP II-5, DP II-1 ja DP 11-17 (tietoja ei ole esitetty).

• · • · · • ··

Edellä olevaa menetelmää käytettiin lukuisissa potilaissa ·:·1.' paitsi että yksittäisissä tapauksissa T-solut herätettiin 35 rekombinanttisella Der p Ilillä 20 pg/ml:na tai 3 pg/ml:na • · « * 1 ja röntgensäteilytettyjä (3500 radia) autologista PBMC käy-

MM

tettiin antigeeniä esittävinä soluina. 26 positiivisen kokeen tulosten yhteenveto on esitetty kuviossa 9. Tiedot analysoitiin kuten esimerkissä V kuvataan paitsi että pep- 50 tidivasteiden summa analysoitiin ilmoittamalla arvo 3, 2 tai 1 kolmeen korkeimpaan S.I.-vasteeseen. Der p II -proteiinin merkittäviä T-solureaktiivisuuden alueita potilaissa on löydettävissä peptideistä DP II-1, DP II-2, DP II-3, DP 5 II-4, DP II-7, DP II-8 ja DP II-9.

Esimerkki IX

T-soluepitooppitutkimukset Der f II;11a

Suoritettiin samanlaisia kokeita kuin esimerkissä V Der f 10 II -proteiinin T-solureaktiivisten alueiden määrittämiseksi. Esimerkiksi PBMC, joka peräisin huonepölypunkkialler-gisesta potilaasta, 384 stimuloitiin in vitro puhdistetulla rekombinanttisella Der f II:11a ja T-solulinja stimuloitiin sitten röntgensäteilytettyjen (25000 radia) autologisten 15 Epstein-Barr viruksella transformoitujen B-solujen läsnäollessa antigeeniä edustavina soluina erilaisten limittyvien Der f II -peptidien kanssa. Tämän proliferaatiotestin tulokset osoittavat, että tämä erityisen potilaan T-solut reagoivat hyvin peptideihin DF II-1 , DF II-2, DF II-3.1, DF 20 II-4.5, DF 11-15, DF 11-16 ja DF 11-17 (tietoja ei ole esi- '··'· tetty).

• · · • · • · • · V, Edellä olevaa menetelmää käytettiin 10 potilaassa paitsi * ,,’j että yksittäisissä tapauksissa T-solulinjat herätettiin : :* 25 stimuloimalla potilaan PBMC 20 μg:lla/ml tai 3 pg:lla/ml ··* :V puhdistettua luontaista Der f II:ta ja ne testattiin rönt- gensäteilytetyn (3500 radia) autologisen PBMC läsnäollessa antigeeniä esittävinä soluina. 10 positiivisen kokeen tulosten yhteenveto on esitetty kuviossa 10. Tiedot analysoi- . . 30 tiin yksityiskohtaisesti kuten esimerkissä IX kuvataan ♦ « ***. paitsi että kunkin peptidin positiivisten vasteiden kor- • · *\ . keimpia ja alhaisimpia arvoja ei jätetty pois laskennasta.

Tiedot osoittavat, että Der f II -proteiinin merkittäviä ··· T-solureaktiivisuuden alueita on löydettävissä peptideistä 35 DF II-1 , DF II-2, DF II-13.1, DF II-4.5, DF 11-15, DF 11-17 • · 1 * ja DF II-1 9.1 .

···· 51

Esimerkki X

Tutkimus, joka osoittaa Der p II- ja Der f II -T-soluepi-tooppien ristireaktiivisuuden

Suoritettiin tutkimus, joka on samanlainen kuin esimerkis-5 sä VII, Der p II- ja Der f II -proteiinien ristireaktiivisuuden määrittämiseksi. Der f II -proteiinilla herätettyjä T-solulinjoja stimuloitoitiin erilaisilla Der f II -peptideillä ja oleellisesti yhteneväisillä Der p II -peptideillä. 10 positiivisen kokeen tulokset on esitetty kuviossa 10 11. Tulokset osoittavat, että Der f Iljllä herätetyt T-so- lut reagoivat merkittävästi peptideihin DP II-1, DP II-3/3.1, DP II-4 ja DP II-7. Kuviossa 12 esitetään kään-teiskokeiden tulokset, joissa lukuisista potilaista peräisin olevat T-solut herätettiin in vitro Der p II -proteii-15 nille ja vaste erilaisiin Der f II -peptideihin analysoitiin. 26 positiivisen kokeen tulokset osoittavat, että Der p II:lla herätetyt T-solut reagoivat merkittävästi peptideihin DF II-1 , DF II-4.5, DF 11-15, DF 11-17, DF 11-18 ja DF II-19.1.

20 • · * ·

ϊ·ί Esimerkki XI

··· - *.* Dominanttien peptidien synteesi * ·

Der p I:n, Der p II:n, Der fl:n ja Der f II:n T-solureak- ♦ tiivisuuden pääalueet identifioitiin perustuen esimerkeissä Ϊ 25 V-X kuvattuihin analyyseihin. Jokaisessa tutkimuksessa ;*;* kaikki testatut potilaat reagoivat proteiiniallergeeneihin (esim. Der p I) ja vähintään yhteen peptidiin, joka on johdettu proteiinissa olevan T-solureaktiivisuuden pääalueelta. Pääasiallisen T-soluaktiivisuuden seitsemän aluetta . . 30 (alue 1, alue 2, alue 3, alue 4, alue 5, alue 6a ja alue Ψ % ***. 6b) identifioitiin Der p I- ja Der f I -proteiineissa. Nämä * « # alueet identifioitiin seuraaviksi: alue 1 , Der p I- ja Der f I -proteiinien aminohappotähteet 1-28, alue 2, Der p I-··· ja Der f I -proteiinien aminohappotähteet 36-38, alue 3, 35 Der p I- ja Der f I -proteiinien aminohappotähteet 74-109, ( * * * alue 4, Der p I- ja Der f I -proteiinien aminohappotähteet «··» 118-139, alue 5, Der p I- ja Der f I -proteiinien aminohappotähteet 141-166, ja alue 6a, Der p I- ja Der f I -prote- 52 iinien aminohappotähteet 161-185 ja alue 6b, Der p I- ja Der f I -proteiinien aminohappotähteet 173-201.

Samaten identifioitiin Der p II- ja Der f II -proteiinin 5 pääasiallisen T-soluaktiivisuuden neljä aluetta. Nämä alueet identifioitiin seuraaviksi: alue 7, Der p II- ja Der f II -proteiinien aminohappotähteet 1-26, alue 8, Der p Ilja Der f II -proteiinien aminohappotähteet 33-67, alue 9, Der p II- ja Der f II -proteiinien aminohappotähteet 10 79-1 04 ja alue 10, Der p II- ja Der f II -proteiinien aminohappotähteet 107-129. Perustuen osittain esimerkeissä V-X kuvattuun T-solureaktiivisuuteen peptidit, jotka on johdettu Der p I:stä, Der f I:stä, Der p II:sta ja Der f II:sta, valikoitiin ja modifioitiin lisäämällä tai poista-15 maila aminohappotähteitä peptidin joko 5'- tai 3'-päästä. Näiden valikoitujen peptidien suunnitteissa otettiin huomioon useita erilaisia tekijältä mukaan lukien limittyvien peptidien järjestykseen asetettu summa, vasteiden prosentti S.I.:n ollessa vähintään 2,0 peptidille, peptidien poten-20 tiaalinen ristireaktiivisuus, peptidien valmistamisen vaikeus jne. Suoritettiin samanlaisia T-solututkimuksia kuin · esimerkeissä V-X kuvataan käyttämällä näitä valikoituja ’·* ‘ peptideitä T-solureaktiivisuuden pääasiallisten alueiden määrittämiseksi Der p I- ja Der f I -proteiinin alueilla 25 1-6a ja 6b ja Der p II- ja Der f II -proteiinin alueilla : 7-10.

« · · · • · • · · • · ·

Der p I-, Der f I-, Der p II- ja Der f II -proteiineista johdettuja valikoituja peptidejä käyttämällä saatujen T-so- 30 lututkimusten tulokset on esitetty kuvioissa 13-18d, Esi- . ^ merkissä V kuvattua menetelmää käytettiin T-solulinjoissa, • · · jotka olivat peräisin Der p I -proteiinilla in vitro herä-. tetyistä potilaista ja sitten Der fp I -sekvenssistä joh- • · · : · dettujen valikoitujen peptidien vaste analysoitiin. 33 po- *:··· 35 sitiviisesta kokeesta peräisin olevat tulokset osoittavat, ..V että Der p i:llä herätetyt solut reagoivat merkittävästi • · peptideihin, joita on peptideissä DP 1-21.1, DP 1-21.2, DP 1-25.2, DP 1-22.2, DP 1-25.2, DP 1-22.1, DP 1-23.1, DP 1-23.2, DP 1-26.1 ja DP 1-28.1.

53

Samaten seurattiin esimerkissä VI kuvattua menetelmää käyttäen T-solulinjojar jotka ovat peräisin 9 potilaasta, jotka on herätetty in vitro Der f I -proteiineille. Tiedot analysoitiin kuten esimerkissä VI kuvataan. Kuviossa 14 5 esitetyt 9 potilaan tulokset osoittavat Der f I:stä peräisin olevan T-solureaktiivisuuden valikoituihin peptideihin.

Toisessa kokeessa useasta potilaasta peräisin olevat T-so-lulinjat herätetetiin in vitro Der p I -proteiineille ja 10 analysoitiin niiden vaste valikoituihin peptideihin, jotka on johdettu Der p I -proteiinista, ja oleellisesti yhtäläisiin peptideihin, jotka on johdettu Der f I -proteiinista. 30 positiivisesta kokeesta peräisin olevat tiedot analysoitiin kuten esimerkissä V kuvataan. Kuten kuviossa 15a esi-15 tetään, Der p Iillä herätetyt T-solut reagoivat merkittävästi peptideihin DF 1-21.1, DF 1-21.2, DF 1-22.2, DF 1-22.3, DF 1-22.4, DF 1-23.2, DF 1-25.1, DF 17-26.1 ja DF I 27.1. Kuvio 15b on kuviossa 15a esitettyjen tietojen ala-järjestely ja esittää Der p i:llä herätettyjen T-solujen 20 vastetta peptideihin, jotka on analysoitu järjestykseen . . asetetulla summalla. Kuvio 15b esittää, että DP I 23.1:llä • · · ·”/· on suurin tämän tutkimuksen peptidien tämän ryhmän järjes- ’·’ ' tykseen asetettu summa. Kuvio 16a esittää käänteiskokeen • · ·.·,* tulokset, joissa 9 potilaasta peräisin olevat T-solut herä- ..]·* 25 tettiin in vitro Der f I -proteiinille ja stimuloitiin va- • · l [ : likoiduilla Der f I -peptideillä ja sarjalla oleellisesti :V: yhteneväisiä Der p I -peptidejä. Tulokset osoittavat, että

Der f I:llä herätetyt T-solut, jotka ovat peräisin 9 potilaasta, reagoivat valikoituihin peptideihin, jotka ovat 30 peräisin Der p i:stä. Kuvio 16a esittää, että DF 1-22.1:n . ja DF 1-25.1 :n stimulointi-indeksi on tämän peptidiryhmän • · suurin. Kuvio 16b on alajärjestely samoista tiedoista kuin • · ·.. kuviossa 16a esitetään ja esittää edullisten Der f I- ja

:*’* Der p I -peptidien vasteen. Kuvio 16b esittää, että DF

·;··· 35 1-22.2 :n stimulointi-indeksi on korkein tässä edullisten • ·>·> peptidien ryhmässä tässä kokeessa.

• ·

Toisesssa kokeessa analysoitiin seuraten esimerkissä VIII kuvattua menetelmää 29 potilaan vasteet, jotka oli herätet- 54 ty in vitro Der p II -proteiineille ja stimuloitu valikoiduilla peptideillä, jotka on johdettu Der p II -sekvensis-tä. Kuviossa 17a esitetään, että Der p II:11a herätetyt T-solut, jotka ovat peräisin yhdestä potilaasta, reagoivat 5 valikoituihin Der p lista peräisin oleviin peptideihin. Kuvio 17b esittää tuloksia, jotka on saatu kokeesta, joka on samanlainen kuin kuviossa 1 7a esitetty potilaita ollessa 30 ja korkean ja matalan arvon ollessa jätetty pois keskiarvosta. Kuvio 17b esittää, että DP II 20.6:11a on suurin 10 tämän tutkimuksen peptidien tämän ryhmän järjestykseen asetettu summa. Kuvio 18a esittää käänteiskokeen tulokset, joissa 1 potilaasta peräisin olevat T-solut herätettiin in vitro Der f II -proteiinille ja stimuloitiin valikoiduilla peptideillä, jotka on johdettu Der p II -sekvenssistä. Ku-15 vio 18a esittää, että Der f Ii:llä herätetyt T-solut, jotka ovat peräisin 10 potilaasta, reagoivat valikoituihin peptideihin, jotka ovat peräisin Der p II:stä. Kuten kuviossa 18a esitetään, DF 1-25:n stimulointi-indeksi on suurin. Kuvio 18b on alajärjestely samoista tiedoista kuin 20 kuviossa 18a esitetään ja esittää luonteisella Der f II;11a herätettyjen T-solulinjojen vasteen edullisiin Der p II- * · · 5·ϊ '· -peptideihin analysoituna järjestetyllä summalla. Kuten • ·· ‘ kuviossa 18b esitetään DF 11-25.2:llä on suurin edullisten • · peptidien järjestetty summa ryhmässä tässä tutkimuksessa.

·: 25 • ·· ·

: :*: Esimerkki XII

• · · · ^__-

Tutkimus, joka osoittaa valikoidun ryhmän I ja ryhmän II epitooppien ristireaktiivisuuden

Suoritettiin samanlainen tutkimus kuin esimerkissä VII ku- 30 vataan T-soluilla, jotka olivat peräisin 4 yhteneväisestä . . potilaasta, jotka oli herätetty in vitro ryhmän I proteii- ♦ · · neilla, jotka olivat peräisin Der f:stä ja Der p:stä ja * · *·[# sitten analysoitiin vaste valikoituihin edullisiin pepti- :’** deihin, jotka olivat peräisin Der p l:stä ja Der f l:stä.

·· ♦ ·;··· 35 Kuvion 18c tulokset osoittavat, että T-solureaktiivisuus lukuisiin valikoituihin edullisiin Der p I -peptideihin oli • ♦ · * ·’ oleellisesti yhtäläinen niiden Der f I -vastaparin kanssa ja päinvastoin.

55

Kuvio 18d esittää samanlaisen tutkimuksen tuloksia, joka suoritettiin T-soluilla, jotka olivat peräisin 6 yhteensopivasta potilaasta, jotka oli herätetty in vitro ryhmän II proteiineilla, jotka olivat peräisin Der p:stä ja Der f:s-5 tä, sitten vaste valikoituihin edullisiin Der p II ja Der f II -peptideihin analysoitiin. Samoin kuin kuvion 18c tuloksissa T-solureaktiivisuus Der p II:n valikoituihin edullisiin lukuisiin peptideihin on oleellisesti samanlainen kuin niiden Der f II -vastaparien ja päinvastoin.

10

Esimerkki XIII

IqE:n suoran punkkiallergeeniproteiineihin ja -peptideihin sitoutumisen testaaminen

Corning-testilevyt (#25882) päällystettiin 5 μ9/ιη1:1ΐ3 ku-15 takin kuvioissa 19, 20 ja 21 lueteltua päällystysantigeeniä 50 μ1/1 OOml/kolo ja niitä inkuboitiin yön ajan 4 °C:ssa. Päällystysantigeenit poistettiin ja kolot suojattiin 0,5 %:lla gelatiinia PBS:ssa, 300 μΐ/kolo 2 tuntia huoneenlämpötilassa. Yhdistetty ihmisen plasma (plasmanäytteiden se-20 koitus, näytteet 20 potilaasta, jotka olivat ihotestiposi-tiivisia kaupalliselle punkkiuutteelle) laimennettiin » « * ί·! : PBS-Tweenillä (PBS ja 0,05 % ei-ionista pesuainetta Tween- • · · *.· 20, Sigma, St. Louis, MO) ja 100 μΐ/kolo a\lisättiin ja • · V,* inkuboitiin yön ajan 4°C:ssa (plasmanäytteet testattiin *: 25 duplikaattina). Toista vasta-ainetta (biotinoitu vuohen • anti-ihmisen IgE, 1 :1 000, Kirkegaard & Perry Laboratories • · · ·

Inc., Gaithersburg, MD) lisättiin 100 μΐ/kolo yhden tunnin m ajan huoneenlämpötilassa. Tämä liuos poistettiin ja strept- avidiini-HRPO:ta, 1:10000 (Southern Biotechnology Associa- 30 tes, Inc., Birmingham, Ai) lisättiin sitten 100 μΐ/kolo . . yhden tunnin ajan huoneenlämpötilassa (kaikki kolot pestiin • « · **· kolme kertaa PBS-Tweenillä kunkin inkubaatiovaiheen välil- • · · * · lä). TMB Membrane Peroxidase Substrate -järjestelmää (Kir- • · :’** kegaard & Perry Laboratories) sekoitettiin juuri ja lisät- • · · ·..·) 35 tiin 100 μΐ/kolo. Värin annettiin kehittyä 2-5 minuuttia.

..Y Reaktio pysäytettiin lisäämällä 100 ml/kolo 1 M fosforihap- : * poa. Levyt luettiin Microplate IL310 Autoreaderissa (Bio- • · · · tech Instruments, Winooski, VT) 450 nm: n suodattimena. Duplikaattikolojen absorbanssitasojen keskiarvo laskettiin.

56 ELISA-testien graafisesti esitetyt tulokset (laimeneminen versus absorbanssi log) esitetään kuvioissa 19a-b, 20a-b ja 21a-h. Näiden kuvioiden selityksissä pystysuoraan lueteltujen päällystysantigeenien järjestys vastaa vasemmalta 5 oikealle päällystysantigeenejä, jotka on lueteltu jokaisen histogrammin osalta.

Kuviossa 1 9b esitetyt ELISA-testin tulokset osoittavat sekä biokemiallisesti puhdistetun Der p II:n että rekombinantti-10 sen Der p II:n (eDer p II) hyvää sitoutumista ihmisen IgE:-hen eikä mitään havaittavaa sitoutumista Der p II -pepti-deihin. IgE-sitoutuminen peptidien ja proteiinien Der p -sarjaan (kuviot 20a ja 20b) osoittavat samaa reaktiivisuuden kaavaa kuin Der f -sarja. Se tarkoittaa, ettei ole mi-15 tään havaittavaa sitoutumista Der f I- tai Der f II -pep-tideihin tai rekombinanttiseen Der f I:een sitoutumisen tapahtuessa pelkästään biokemiallisesti puhdistettuun Der f I:een ja rekombinanttiseen ja biokemiallisesti puhdistettuun Der f II:een. Kummassakin tapauksessa näyttää esiin-20 tyvän parempi sitoutuminen rekombinanttiseen Der p II:een tai Der f II:een kuin biokemiallisesti puhdistettuihin muo- ♦ * · töihin. Kaikki edellä mainitun ELISA-testin tiedoista joh- • ·· ·.· detut johtopäätökset vahvistettiin toisella testimenetel- • » ·,*,* mällä, pistetäplät nitroselluloosapaperilla, käyttäen samaa •J 25 vasta-ainetta ja antigeenireagenssien sarjaa.

• ♦ * · « · * · · · .·.* Antigeenivalmiste, jota käytettiin positiivisena verrokki- na, oli neljän pääasiallisen biokemiallisesti puhdistetun punkkiallergeenin (Der f I, Der f I, Der p I ja Der p II) 30 seos (termi PMA tarkoittaa puhdistettua punkkiallergeeniä).

. . Varasto generoitiin konsentraatiossaa 100 pg kutakin prote- • · ’“m\t iinia millimetriä kohti tai 400 pg kokonaisproteiinia/ml.

• · ’·’ < Valmistetta käytettiin kullakin päällystetyllä ELISA-levyl- lä. Näiden ELISA-testien tulokset on esitetty kuvioissa • · · ..··* 35 21a-h. Jokaisella levyllä esiintyy selvää sitoutumista joko puhdistettuun tai rekombinanttiseen proteiiniin tai PMA-an- • f * • · tigeenivalmisteeseen, mikä osoittaa hyvää IgE-reaktiivi- « · · · suutta. Kuitenkaan PMA-antigeenivalmisteessa ei esiinny ei-spesifisen reaktiivisuuden korkeaa tasoa, joka esiintyy 57 taustalaimennuksessa, johon ei lisätty mitään ensimmäistä vasta-aineliuosta. Tämä ei-spesifinen reaktiivisuus esiintyy PMA-antigeenin ja biotinoidun toisen antigeenin kesken eikä se sovi spesifisen IgE-reaktiivisuuden antigeeniin 5 löytöön. Käyttämällä kaksinkertaista kvantitatiivista arvoa verrattuna taustaan korkeimmassa plasmakonsentraaatiossa positiivisena lukemana ei esiinny mitään havaittavaa IgE-reaktiivisuutta minhinkään 65:stä peptidistä, jotka seulottiin tällä testausmenetelmällä.

1 0

Vaikka keksintöä on kuvattu viitaten sen edullisiin suoritusmuotoihin, muilla suoritusmuodoilla saadaan samat tulokset. Esillä olevan keksinnön variaatiot ja modifikaatiot ovat ilmeisiä alan ammattimiehelle ja oheisten patenttivaa-15 timusten on tarkoitettu kattavan tällaiset modifikaatiot ja ekvivalentit, jotka ovat keksinnön todellisen hengen mukaisia.

• * t · • · < • M · ··· • · • · • · * · ' f « • t • « ·

IMI

• »

• I

• * * ♦ · • · • · • · « • · • * f » 1*1 «M % « t « • • · M» » t ·· · ··· a a · a * * • · a a • taa 58

SEKVENSSILUETTELO

(1) YLEISTÄ TIETOA: 5 (i) HAKIJA: Kuo, Mei-chang

Garman, Richard Greenstein, Julia (ii) KEKSINNÖN NIMITYS: Dermatophagoidesista (huonepölypunkeista) 10 peräisin olevien pääasiallisten allergeenien T-soluepitoopit (iii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 119 (iv) KIRJEENVAIHTO-OSOITE:

15 (A) VASTAANOTTAJA: LAHIVE & OOCKFIELD

(B) KAIU: 60 State Street, suite #510 (C) KAUPUNKI: Boston (D) VALTIO: Massachusetts

(E) MAA: US

20 (F) ZIP: 02109 : (v) tietokoneella luettava muoto: • · · * (A) VÄLINETYYPPI: Levyke (B) TIETOKONE: IBM PC yhteensopiva

25 (C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: PC-DQS/MS-DQS

(D) OHJELMISTO: ASCII teksti • · · • · · · • · · (vi) HAKEMUKSEM TIEDOT: (A) HAKEMUSNUMERO: US 07/881 396 30 (B) JÄTTÖPÄIVÄ: 8.5.1992 (C) LUOKITUS: • * · • · · • · * · ' (viii) ASIAMIESTIEDOT: .···. (A) NIMI: Mandragouras, Amy E.

35 (B) REKISTERINUMERO: P36207

(C) VIITENUMERO: IMI-01 2/IPC01 7C

• · · • · · • · • · •f*': (ix) PUHELINYHTEYSTIEDOT: (A) PUHELIN: (617) 227-7400 59

(B) TELEFAX: (617) 227-5941 (2) SEQ ID N0:1: TIEDOT

5 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 834 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUQSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 10

(ii) MDLEKYYLITYYPPI: cDNA

(ix) PIIRRE:

(A) NIMI: CDS

15 (B) SIJAINTI: 1..738 (xi) SEQUENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:1: AAA AAC CGA TTT TTG ATG AGT GCA GAA GCT TTT GAA CAC CTC AAA ACT 20 48

Lys Asn Arg Phe Leu Met Ser Ala Glu Ala Phe Glu His Leu Lys Thr 15 10 15 ♦ · : caa ttc gat ttg aat gct gaa act aac gcc tgc agt atc aat gga aat 96 * Gin Phe Asp Leu Asn Ala Glu Thr Asn Ala Cys Ser Ile Asn Gly Asn .·.·. 20 25 30 *·** 25 GCT CCA GCT GAA ATC GAT TTG CGA CAA ATG CGA ACT GTC ACT CCC ATT ..·*· 144 : .“· Ala Pro Ala Glu Ile Asp Leu Arg Gin Met Arg Thr Vai Thr Pro Ile ’· 35 40 45 • » *

*·* CGT ATG CAA GGA GGC TGT GGT TCA TGT TGG GCT TTC TCT GGT G TT GCC

192

Arg Met Gin Gly Gly Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Gly Vai Ala 30 50 55 60

GCA ACT GAA TCA GCT TAT TTG GCT CAC CGT AAT CAA TCA TTG GAT CTT

240 • : · Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala His Arg Asn Gin Ser Leu Asp Leu *·* * 65 70 75 80 ··· ^ • ·

**. . GCT GAA CAA GAA TTA GTC GAT TGT GCT TCC CAA CAC GGT TGT CAT GGT

,···. 288 :... oc Ala Glu Gin Glu Leu Vai Asp Cys Ala Ser Gin His Gly Cys His Gly ....: 85 90 95 • · GAT ACC ATT CC A CGT GGT ATT GAA TAC ATC CAA CAT AAT GGT GTC GTC : */· 336

Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gin His Asn Gly Vai Vai ·:·*· loo 105 no 60

CAA GAA AGC TAC TAT CGA TAC GTT GCA CGA GAA CAA TCA TGC CGA CGA

384

Gin Glu Ser Tyr Tyr Arg Tyr Val Ala Arg Glu Gin Ser Cys Arg Arg 115 120 125 CCA AAT GCA CAA CGT TTC GGT ATC TCA AAC TAT TGC CAA ATT TAC CCA 5 432

Pro Asn Ala Gin Arg Phe Gly lie Ser Asn Tyr Cys Gin lie Tyr Pro 130 135 140

CCA AAT GCA AAC AAA ATT CGT GAA GCT TTG GCT CAA ACC CAC AGC GCT

480

Pro Asn Ala Asn Lys lie Arg Glu Ala Leu Ala Gin Thr His Ser Ala 145 150 155 160

10 ATT GCC GTC ATT ATT GGC ATC AAA GAT TTA GAC GCA TTC CGT CAT TAT

528 lie Ala Val lie life Gly lie Lys Asp Leu Asp Ala Phe Arg His Tyr 165 170 175

GAT GGC CGA ACA ATC ATT CAA CGC GAT AAT GGT TAC CAA CCA AAC TAT

576

Asp Gly Arg Thr Ile He Gin Arg Asp Asn Gly Tyr Gin Pro Asn Tvr 180 185 190 15

CAC GCT GTC AAC ATT GTT GGT TAC AGT AAC GCA CAA GGT GTC GAT TAT

624

His Ala Val Asn He Val Gly Tyr Ser Asn Ala Gin Gly Val Asp Tyr 195 200 205

TGG ATC GTA CGA AAC AGT TGG GAT ACC AAT TGG GGT GAT AAT GGT TAC

672

Trp He Val Arg Asn Ser Trp Asp Thr Asn Trp Gly Asp Asn Gly Tyr 20 210 215 220

GGT TAT TTT GCT GCC AAC ATC GAT TTG ATG ATG ATT GAA GAA TAT CCA

: 720 '· Gly Tyr Phe Ala Ala Asn He Asp Leu Met Met He Glu Glu Tyr Pro 225 230 235 240

."·*· TAT GTT GTC ATT CTC TAAACAAAAA GACAATTTCT TATATGATTG TCACTAATTT

*·** 775 .1· 25 <pyr val val ne Leu 245

• *· ' ATTTAAAATC AAAATTTTTT AGAAAATGAA TAAATTCATT CACAAAAATT AAAAAAAAA

834 30 (2) SEQ ID NO:2 TIEDOT: • : · (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: • · ♦ · ·’·' (A) PITUUS: 245 aminohappoa .1/ (B) TYYPPI: aminohappo "·*\ 35 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen ♦ · · · · ·***: (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini • · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:2: 61 L.ys Asn Arg Phe Leu Met Ser Ala Glu Ala Phe Glu His Leu Lys Thr 15 10 15

Gin Phe Asp Leu Asn Ala Glu Thr Asn Ala Cys Ser lie Asn Gly Asn 20 25 30

Ala Pro Ala Glu lie Asp Leu Arg Gin Met Arg Thr Val Thr Pro lie 5 35 40 45

Arg Met Gin Gly Gly Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Gly Val Ala 50 55 60

Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala His Arg Asn Gin Ser Leu Asp Leu 65 70 75 80

Ala Glu Gin Glu Leu Val Asp Cys Ala Ser Gin His Gly Cys His Gly 10 85 90 95

Asp Thr lie Pro Arg Gly;lie Glu Tyr lie Gin His Asn Gly Val Val 100 105 110

Gin Glu Ser Tyr Tyr Arg Tyr Val Ala Arg Glu Gin Ser Cys Arg Arg 115 120 125

Pro Asn Ala Gin Arg Phe Gly Ile Ser Asn Tyr Cys Gin He Tyr Pro Ί5 130 135 140

Pro Asn Ala Asn Lys He Arg Glu Ala Leu Ala Gin Thr His Ser Ala 145 150 155 160

Ile Ala Val He He Gly He Lys Asp Leu Asp Ala Phe Arg His Tyr 165 170 175 20 Asp Gly Arg Thr He He Gin Arg Asp Asn Gly Tyr Gin Pro Asn Tyr 180 185 190 : ·'· His Ala Val Asn He Val Gly Tyr Ser Asn Ala Gin Gly Val Asp Tyr ···1. · 195 200 205 I·1 « · 1 *·1 ’ Trp He Val Arg Asn Ser Trp Asp Thr Asn Trp Gly Asp Asn Gly Tyr 210 215 220 25 ·;· Gly Tyr Phe Ala Ala Asn He Asp Leu Met Met He Glu Glu Tyr Pro ··2 3 4 225 230 235 240 • · • · « *** ‘ Tyr Val Val He Leu 245 30 · 2 • · 1 • · 3 «»»

:1:1 (2) SEQ ID NO:3: TIEDOT

• ♦ ♦ ’··1. 35 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: 4 . . (A) PITUUS: 588 emäsparia : (B) TYYPPI: nukleiinihappo *:1·: (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 62

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(v) FRAGMENTTI TYYPPI: sisäinen 5 (ix) PIIRRE: (A) MINI/AVAIN; CDS (B) SIJAINTI: 69..509 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:3: 10 CACAAATTCT TCTTTCTTCC TTACTACTGA TCATTAATCT GAAAACAAAA CCAAACAAAC 60 CATTCAAA ATG ATG TAC AAA ATT TTG TGT CTT TCA TTG TTG GTC GCA GCC 15 110

Met Met Tyr Lys lie Leu Cys Leu Ser Leu Leu Val Ala Ala 15 10 GTT GCT CGT GAT CAA GTC GAT GTC AAA GAT TGT GCC AAT CAT GAA ATC 158

Val Ala Arg Asp Gin Val Asp Val Lys Asp. Cys Ala Asn His Glu lie 15 20 25 30 20 AAA AAA GTT TTG GTA CCA GGA TGC CAT GGT TCA GAA CCA TGT ATC ATT 206

Lys Lys Val Leu Val Pro Gly Cys His Gly Ser Glu Pro Cys lie lie : .·. 35 40 45 • · CAT CGT GGT AAA CCA TTC CAA TTG GAA GCC GTT TTC GAA GCC AAC CAA *.* ' 254

His Arg Gly Lys Pro Phe Gin Leu Glu Ala Val Phe Glu Ala Asn Gin *.*.· 50 55 63 ·· · 25

-••ί AAC ACA AAA ACG GCT AAA ATT GAA ATC AAA GCC TCA ATC GAT GGT TTA

: 302 ϊ·· · Asn Thr Lys Thr Ala Lys lie Glu lie Lys Ala Ser lie Asp Gly Leu .·.* 65 70 75 • · GAA GTT GAT GTT CCC GGT ATC GAT CCA AAT GCA TGC CAT TAC ATG AAA 350

Glu Val Asp Val Pro Gly lie Asp Pro Asn Ala Cys His Tyr Met Lys 30 80 85 90

TGC CCA TTG GTT AAA GGA CAA CAA TAT GAT ATT AAA TAT ACA TGG AAT

: 398 ··· Cys Pro Leu Val Lys Gly Gin Gin Tyr Asp lie Lys Tyr Thr Trp Asn 95 100 105 no GTT CCG AAA ATT GCA CCA AAA TCT GAA AAT GTT GTC GTC ACT GTT AAA 446 ’··· Val Pro Lys lie Ala Pro Lys Ser Glu Asn Val Val Val Thr Val Lys 35 115 120 125

..V GTT ATG GGT GAT GAT GGT GTT TTG GCC TGT GCT ATT GCT ACT CAT GCT

• 494 . Val Met Gly Asp Asp Gly Val Leu Ala Cys Ala lie Ala Thr His Ala · 130 135 140 63 AAA ATC CGC GAT TAAATAAACA AAATTTATTG ATTTTGTAAT CACAAATGAT 546

Lys lie Arg Asp 145 TGATTTTCTT TCCAAAAAAA AAATAAATAA AATTTTGGGA AT 588 5

(2) SBQ ID NO:4: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 146 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 10 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:4: 15

Met Met Tyr Lys Ile Leu Cys Leu Ser Leu Leu Vai Ala Ala Vai Ala 15 10 15

Arg Asp Gin Vai Asp Vai Lys Asp Cys Ala Asn His Glu Ile Lys Lys 20 25 30

Vai Leu Vai Pro Gly Cys~His Gly Ser Glu Pro Cys Ile Ile His Arg 35 40 45 20

Gly Lys Pro Phe Gin Leu Glu Ala Vai Phe Glu Ala Asn Gin Asn Thr . . 50 55 60 • · • · **.!. Lys Thr Ala Lys Ile Glu Ile Lys Ala Ser Ile Asp Gly Leu Glu Vai : : · 65 70 75 80 • · ' · Asp Vai Pro Gly Ile Asp Pro Asn Ala Cys His Tyr Met Lys Cys Pro 85 90 95 25 • · · · : Leu Vai Lys Gly Gin Gin Tyr Asp Ile Lys Tyr Thr Trp Asn Vai Pro ***.· 100 105 110 • · • · • Lys Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Vai Vai Vai Thr Vai Lys Vai Met 115 120 125

Gly Asp Asp Gly Vai Leu Ala Cys Ala Ile Ala Thr His Ala Lys Ile 30 130 135 140

Arg Asp : .·· 145 • · • * ·

(2) SEQ ID NO:5: TIEDOT

• · · ·:··: 35 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: • · * : ‘ (A) PITUUS: 1072 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen 64 (D) ΊΌΡΟΙ/DGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

5 (ix) (A) NIMI/AVAIN: CCS

(B) SIJAINTI: 36..1001 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:5:

CGTTTTCTTC CATCAAAATT AAAAATTCAT CAAAA ATG AAA TTC GTT TTG GCC

10 53

Met Lys Phe Val Leu Ala 1 5 ATT GCC TCT TTG TTG GTA TTG AGC ACT GTT TAT GCT CGT CCA GCT TCA 101 lie Ala Ser Leu Leu Val Leu Ser Thr Val Tyr Ala Arg Pro Ala Ser 10 15 20 1 5

J ATC AAA ACT TTT GAA GAA TTC AAA AAA GCC TTC AAC AAA AAC TAT GCC

149 lie Lys Thr Phe Glu Glu Phe Lys Lys Ala Phe Asn Lys Asn Tyr Ala 25 30 35 ACC GTT GAA GAG GAA GAA GTT GCC CGT AAA AAC TTT TTG GAA TCA TTG 197

Thr Val Glu Glu Glu Glu Val Ala Arg Lys Asn Phe Leu Glu Ser Leu 2Q 40 45 50 AAA TAT-G-TT GAA GCT AAC AAA GGT GCC ATC AAC CAT TTG TGC GAT TTG 245 • : . Lys Tyr Val Glu Ala Asn Lys Gly Ala lie Asn His Leu Ser Asp Leu 55 60 65 70 • ·

\ . TCA TTG GAT GAA TTC AAA AAC CGT TAT TTG ATG AGT GCT GAA GCT TTT

: ; · 293 * 25 Ser Leu AsP G^u phe Lys Asn Ar9 Tyr Leu Met Ser Ala Glu Ala Phe •I 75 80 «c • ···

' ·1 2· GAA CAA CTC AAA ACT CAA TTC GAT TTG AAT GCC GAA ACA AGC GCT TGC

341

Glu Gin Leu Lys Thr Gin Phe Asp Leu Asn Ala Glu Thr Ser Ala Cys * 90 95 100

CGT ATC AAT TCG GTT AAC GTT CCA TCG GAA TTG GAT TTA CGA TCA CTG

30 385

Arg lie Asn Ser Val Asn Val Pro Ser Glu Leu Asp Leu Arg Ser Leu 105 110 115

:1 CGA ACT GTC ACT CCA ATC CGT ATG CAA GGA GGC TGT GGT TCA TGT TGG

437 ; : Arg Thr Val Thr Pro lie Arg Met Gin Gly Gly Cys Gly Ser Cys Trp *. . 120 125 130 ···

:... ,,- GCT TTC TCT GGT GTT GCC GCA ACT GAA TCA GCT TAT TTG GCC TAC CGT

....· 35 «85 * ‘ Ala Phe Ser Gly Val Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg *.1 135 140 145 150 2 · • · 4

* 1 AAC ACG TCT TTG GAT CTT TCT GAA CAG GAA CTC GTC GAT TGC GCA TCT

·:·1'· 533

Asn Thr Ser Leu Asp Leu Ser Glu Gin Glu Leu Val Asp Cys Ala Ser 155 160 165 65 CAA CAC GGA TGT CAC GGC GAT ACA ATA CCA AGA GGC ATC GAA TAC ATC 581

Gin His Gly Cys His Gly Asp Thr lie Pro Arg Gly lie Glu Tyr lie 170 175 180

CAA CAA AAT GGT GTC GTT GAA GAA AGA AGC TAT CCA TAC GTT GCA CGA

629 5 Gin Gin Asn Gly Vai Val Glu Glu Arg Ser Tyr Pro Tyr Val Ala Arg 185 190 195

GAA CAA CGA TGC CGA CGA CCA AAT TCG CAA CAT TAC GGT ATC TCA AAC

677

Glu Gin Arg Cys Arg Arg Pro Asn Ser Gin His Tyr Gly lie Ser Asn 200 205 210

TAC TGC CAA ATT TAT CCA CCA GAT GTG AAA CAA ATC CGT GAA GCT TTG

10 725

Tyr Cys Gin lie Tyr Pro Pro Asp Val Lys Gin lie Arg Glu Ala Leu 215 220 225 230

ACT CAA ACA CAC ACA GCT ATT GCC GTC ATT ATT GGC ATC AAA GAT TTG

773

Thr Gin Thr His Thr Ala Ile Ala Val He He Gly He Lys Asp Leu 235 240 245

15 AGA GCT TTC CAA CAT TAT GAT GGA CGA ACA ATC ATT CAA CAT GAC AAT

821 _ --- _

Arg Ala Phe Gin His Tyr Asp Gly Arg Thr He He Gin His Asp Asn 250 , 255 260 GGT TAT CAA CCA AAC TAT CAT GCC GTC AAC ATT GTC GGT TAC GGA AGT 869

Gly Tyr Gin Pro Asn Tyr His Ala Val Asn He Val Gly Tyr Gly Ser 20 265 270 275

ACA CAA GGC GAC GAT TAT TGG ATC GTA CGA AAC AGT TGG GAT ACT ACC

: 917 ··* * Thr Gin Gly Asp Asp Tyr Trp He Val Arg Asn Ser Trp Asp Thr Thr 280 285 290

:*:*· TGG GGA GAT AGC GGA TAC GGA TAT TTC CAA GCC GGA AAC AAC CTC ATG

• ; 965 ·: 25 Trp Gly Asp Ser Gly Tyr Gly Tyr Phe Gin Ala Gly Asn Asn Leu Met ·/*; 295 300 305 310 • · • ·

**V ATG ATC GAA CAA TAT CCA TAT GTT GTA ATC ATG TGAACATTTG AAATTGAATA

: : 1018 * Met He Glu Gin Tyr Pro Tyr Val Val He Met 315 320 TATTTATTTG TTTTCAAAAT AAAAACAACT ACTCTTGCGA GTATTTTTTA CTCG 30 1072 • ♦ • · • t ·«« /· • · • · • · # ♦ • * · ···* 35

,.γ (2) SEQ ID NO:6: TIEDOT

• · * * · • · *’·** (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 321 aminohappoa 66 (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEYYLITYYPPI: proteiini 5 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:6:

Met Lys Phe Vai Leu Ala Ile Ala Ser Leu Leu Vai Leu Ser Thr Vai 15 10 15

Tyr Ala Arg Pro Ala Ser Ile Lys Thr Phe Glu Glu Phe Lys Lys Ala 1Q 20 25 30

Phe Asn Lys Asn Tyr Ala Thr Vai Glu Glu Glu Glu Vai Ala Arg Lys 35 40 45

Asn Phe Leu Glu Ser Leu Lys Tyr Vai Glu Ala Asn Lys Gly Ala Ile 50 55 60

Asn His Leu Ser Asp Leu Ser Leu Asp Glu Phe Lys Asn Arg Tyr Leu 15 65 70 75 80

Met Ser Ala Glu Ala Phe Glu Gin Leu Lys Thr Gin Phe Asp Leu Asn 85 90 95

Ala Glu Thr Ser Ala Cys Arg Ile Asn Ser Vai Asn Vai Pro Ser Glu 100 105 110

Leu Asp Leu Arg Ser Leu Arg Thr Vai Thr Pro Ile Arg Met Gin Gly 20 115 120 125

Gly Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Gly Vai Ala Ala Thr Glu Ser : .* 130 135 140 « I • · · .*;* Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg Asn Thr Ser Leu Asp Leu Ser Glu Gin Glu *· 145 150 155 160 m · « · ***· Leu Vai Asp Cys Ala Ser Gin His Gly Cys His Gly Asp Thr Ile Pro ·: 25 165 170 175 ··♦· : :* Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gin Gin Asn Gly Vai Vai Glu Glu Arg Ser *;*. 180 185 190 • · • ·

Tyr Pro Tyr Vai Ala Arg Glu Gin Arg Cys Arg Arg Pro Asn Ser Gin 195 200 205

His Tyr Gly Ile Ser Asn Tyr Cys Gin Ile Tyr Pro Pro Asp Vai Lys 30 210 215 220 . · Gin Ile Arg Glu Ala Leu Thr Gin Thr His Thr Ala Ile Ala Vai Ile ·.· 225 230 235 240 ·.· Ile Gly Ile Lys Asp Leu Arg Ala Phe Gin His Tyr Asp Gly Arg Thr • · 245 250 255 ··· • *··· Ile Ile Gin His Asp Asn Gly Tyr Gin Pro Asn Tyr His Ala Vai Asn ...·' 35 260 265 270 • · ·· · ♦ · · • · ···· 67

Ile Vai Gly Tyr Gly Ser Thr Gin Gly Asp Asp Tyr Trp Ile Vai Arg 275 280 285

Asn Ser Trp Asp Thr Thr Trp Gly Asp Ser Gly Tyr Gly Tyr Phe Gin 290 295 300 5 Ala Gly Asn Asn Leu Met Met Ile Glu Gin Tyr Pro Tyr Vai Vai Ile 305 310 315 320

Met

(2) SBQ ID N0:7: TIEDOT

10 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 491 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUQSTEISUUS: yksijuosteinen 15 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA (ix) PIIRRE:

20 (A) NIMI/AVAIN: CDS

(B) SIJAINTI: 1..390 • · • · ·♦· :*:* (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:7: • · • · * ·

25 GAT CAA GTC GAT G TT AAA GAT TGT GCC AAC AAT GAA ATC AAA AAA GTA

...: 48 ; ,· Asp Gin Vai Asp Val-Lys Asp Cys Ala Asn Asn Glu Ile Lys Lys Val- i s ίο is • ·

*.* ATG GTC GAT GGT TGC CAT GGT TCT GAT CC A TGC ATA ATC CAT CGT GGT

95

Met Vai Asp Gly Cys His Gly Ser Asp Pro Cys Ile Ile His Arg Gly 20 25 30 30 AAA CCA TTC ACT TTG GAA GCC TTA TTC GAT GCC AAC CAA AAC ACT AAA . . 144 ; ; Lys Pro Phe Thr Leu Glu Ala Leu Phe Asd Ala Asn Gin Asn Thr Lys •f.. 35 40 ' 45 • « • ·

ACC GCT AAA ACT GAA ATC AAA GCC AGC CTC GAT GGT CTT GAA ATT GAT

192 *** o,- Tnr Ala Lys Thr Glu Ile Lys Ala Ser Leu Asp Gly Leu Glu Ile Asp •J·* J:> 50 55 60 ♦ · G TT CCC GGT ATT GAT ACC AAT GCT TGC CAT TTT ATG AAA TGT CC A TTG *. · 240 .... Vai Pro Gly Ile Asp Thr Asn Ala Cys His Phe Met Lys Cys Pro Leu 65 70 75 80 68

G TT AAA GGT CAA CAA TAT GAT GCC AAA TAT ACA TGG AAT GTG CCC AAA

288

Vai Lys Gly Gin Gin Tyr Asp Ala Lys Tyr Thr Trp Asn Vai Pro Lys 85 90 95

5 ATT GCA CCA AAA TCT GAA AAC G TT GTC G TT ACA GTC AAA CTT G TT GGT

336

Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Vai Vai Vai Thr Vai Lys Leu Vai Gly 100 105 110 GAT AAT GGT GTT TTG GCT TGC GCT ATT GCT ACC CAC GCT AAA ATC CGT 384

Asp Asn Gly Vai Leu Ala Cys Ala Ile Ala Thr His Ala Lys Ile Arg 115 120 125 10

GAT TAAAAAAAAA AAATAAATAT GAAAATTTTC ACCAACATCG AACAAAATTC

437

Asp 130 AATAACCAAA ATTTGAATCA AAAACGGAAT TCCAAGCTGA GCGCCGGTCG CTAC 491 15

(2) SEQ ID NO:8: TIEDOT

20 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: • · , (A) PITUUS: 129 aminohappoa ··« (B) TYYPPI: aminohappo ;1;1 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · ·· 25 ·«·· : .· (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini • · ·1· I · • · • · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:8

Asp Gin Vai Asp Vai Lys Asp Cys Ala Asn Asn Glu Ile Lys Lys Vai 30 1 5 10 15

Met Vai Asp Gly Cys His Gly Ser Asp Pro Cys Ile Ile His Arg Gly : .1 20 25 30 • · *·1 ·2' Lys Pro Phe Thr Leu Glu Ala Leu Phe Asp Ala Asn Gin Asn Thr Lys *·' iS- 40 45 — * · • · ·

Thr Ala Lys Thr Glu Ile Lys Ala Ser Leu Asp Gly Leu Glu Ile Asp k 50 ' 55 60 · Vai Pro Gly Ile Asp Thr Asn Ala Cys His Phe Met Lys Cys Pro Leu :1.1 65 70 75 80 « • · 2 ···» Vai Lys Gly Gin Gin Tyr Asp Ala Lys Tvr Thr Tm Asn Vai Pro Lvs 85 90 95 69

Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Vai Vai Vai Thr Vai Lys Leu Vai Glv 1°° 105 110

Asp Asn Gly Vai Leu Ala Cys Ala Ile Ala Thr His Ala Lys Ile Aro H5 120 125 ^ Asp

(2) SEQ ID NO:9: TIEDOT

10 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 20 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 15 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen 20 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ 3D NO:9: • · * » • · ***, Thr Asn Ala Cys Ser Ile Asn Gly Asn Ala Pro Ala Glu Ile Asp Leu i J 1 5 10 15 ;*ϊ Arg Gin Met Arg ’ ' 20 • j 25 *»·· • · • « • ·

;*V (2) SEQ ID NO:10: TIEDOT

f * (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: 30 (A) PITUUS: 27 aminohappoa (B) TIEDOT: aminohappo ί.ϊ (D) TOPOLOGIA: lineaarinen f * > * · /** (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi ... 35 • · (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen »« · • * (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:10: 70

Glu Ile Asp Leu Arg Gin Mec Arg Thr Vai Thr Pro Ile Arg Met Gin 15 10 15

Gly Gly cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Gly 20 25 5

(2) SEQ ID NO:11: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 29 aminohappoa -ΙΟ (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MQLEKYYLITYYPPI: peptidi 15 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 11 :

Thr Vai Thr Pro Ile Arg Met Gin Gly Gly Cys Gly Ser Cys Trp Ala 15 10 15 20 Phe Ser Gly Vai Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala 20 25 ♦ · · • · * • · · • » (2) SEQ ID NO:12: TIEDOT 25 \t\\ (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 210 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 30 : (ii) MQLEKYYLITYYPPI: peptidi • · · * · · · • · · • · · . (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen • · ♦ • · • · * *:·*: 35 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:12: • · · 1 * · Vai Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala His Arg Asn Gin Ser Leu 15 10 15

Asp Leu Ala Glu Gin 20 i 71

(2) SEQ ID N0:13: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: 5 (A) PITUUS: 22 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 10 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:13: 15 His Arg Asn Gin Ser Leu Asp Leu Ala Glu Gin Glu Leu Vai Asp Cys 1 5 10 15

Ala Ser Gin His Gly Cys 20 20

(2) SEQ ID NO:14: TIEDOT

: (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: :V: (A) PITUUS: 21 aminohappoa ··· 25 (B) TYYPPI: aminohappo : (D) TOPOLOGIA: lineaarinen « « « · (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 30 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen • · '••j : (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:14: .***. Glu Leu Vai Asp Cys Ala Ser Gin His Gly Cys His Gly Asp Thr Ile 15 10 15 35

Pro Arg Gly Ile Glu 20 • · • ·

(2) SEQ ID NO: 1 5: TIEDOT

72 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 28 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 5 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen 10 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:15: 15 Gly ASp Thr He Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gin His Asn Gly Vai 1 5 10 15

Vai Gin Glu Ser Tyr Tyr Arg Tyr Vai Ala Arg Glu 20 25 20

. ^ (2) SEQ ID NO:16: TIEDOT

• · * • · f ' (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: '**·' (A) PITUUS: 20 aminohappoa 25 (B) TYYPPI: aminohappo : (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 30 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen • · • · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:16: .*** Glu Tyr Ile Gin His Asn Gly Vai Vai Gin Glu Ser Tyr Tyr Arg Tyr 15 10 15 35 Vai Ala Arg Glu :**.·*. 20 • · • ·

(2) SEQ ID NO:17: TIEDOT

73 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 25 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 5 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) ERAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen 10 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:17:

His Asn Gly Vai Vai Gin Glu Ser Tyr Tyr Arg Tyr Vai Ala Arg Glu 15 10 15

Gin Ser Cys Arg Arg Pro Asn Ala Gin 15 20 25

(2) SEQ ID NO:18: TIEDOT

20 . . (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: **·/ (A) PITUUS: 19 aminohappoa • » · *·* ' (B) TYYPPI: aminohappo *.*. (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 25 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) ERAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen 30 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:18: ' °ln Ser CYS Arg Arg Pro Asn Ala Gin Arg Phe Gly Ile Ser Asn Tyr 1 5 10 15 . Cys Gin Ile • · · • · · ·:··: 35 • · · • · • ·

(2) SEQ ID NO:19: TIEDOT

74 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 22 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 5 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) ERAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:19: 10

Arg Phe Gly Ile Ser Asn Tyr Cys Gin Ile Tyr Pro Pro Asn Ala Asn 15 10 15

Lys Ile Arg Glu Ala Leu 20 15

(2) SEQ TD NO:20: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: 20 (A) PITUUS: 24 aminohappoa . . (B) TYYPPI: aminohappo *(D) TOPOLOGIA: lineaarinen • « · • · (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi t 25 \\[ (v) ERAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:20: _n Tyr Pro Pro Asn Ala Asn Lys Ile Arg Glu Ala Leu Ala Gin Thr His JU 1 5 10 15 : : Ser Ala Ile Ala Vai Ile Ile Gly **· 20 (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 75 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 5 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:21: 10

Ala Gin Thr His Ser Ala Ile Ala Vai Ile Ile Gly He Lys Asp Leu 15 10 is

Asp Ala Phe Arg His Tyr Asp Gly Arg Thr 20 25 15

(2) SEQ ID 10:22: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: 20 (A) PITUUS: 260 aminohappoa . . (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen t · :·:· (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi * 25 » · :.· · (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen • · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:22: 30 Ile Lys Asp Leu Asp Ala Phe Arg His Tyr Asp Gly Thr Arg Ile Ile 15 10 15 • ·

Gin Arg Asp Asn Gly Tyr Gin Pro Asn Tyr .*;· 20 25 • · ··· • 35

:·[·’ (2) SEQ ID NO:23: TIEDOT

* (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 230 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 76 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 5 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:23: 10 He Ile Gin Arg Asp Asn Gly Tyr Gin Ero Asn -Tyr- His Ala Vai Asn 15 10 15

Ile Vai Gly Tyr Ser Asn Ala 20 15

(2) SEQ 3D NO:24: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 22 aminohappoa 20 (B) TYYPPI: aminohappo . (D) TOPOLOGIA: lineaarinen t · e · • · · (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi • * * • · • · 25 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen • · • · « « · • · · :Y (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:24:

His Ala Vai Asn Ile Vai Gly Tyr Ser Asn Ala Gin Gly Vai Asp Tyr 30 1 5 10 15

Trp Ile Vai Arg Asn Ser I .* 20 • · • · · • · · « * • · • · · • · ·

·:*·.' 35 (2) SEQ ID NO:25: TIEDOT

• * • · · • · · : * (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: • · · · (A) PITUUS: 24 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 77 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 5 (v) FEIAGMENTTTTYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:25:

Gin Gly Vai Asp Tyr Trp Ile Vai Arg Asn Ser Trp Asp Thr Asn Trp 1 5 10 15 10

Gly Asp Asn Gly Tyr Gly Tyr Phe 20 15

(2) SEQ ID NO:26: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 26 aminohappoa 20 (B) TYYPPI: aminohappo , , (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · « · • · · • · · ’·’ (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi • · * · * • « • · ..*· 25 (v) FEIAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen • · « « « * · · · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:26:

Gly Asp Asn Gly Tyr Gly Tyr Phe Ala Ala Asn Ile Asp Leu Met Met 15 10 15 30

Ile Glu Glu Tyr Pro Tyr Vai Vai Ile Leu . . 20 25 * % • · • · · • · · • · • · • · • · · • · ·

·;··* 35 (2) SEQ ID NO:27: TIEDOT

• · • · · • ♦ · : * (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: • · · · (A) PITUUS: 28 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 78 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 5 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:27:

Thr Asn Ala Cys Ser Ile Asn Gly Asn Ala Pro Ala Glu Ile Asp Leu 10 1 S 10 15

Arg Gin Met Arg Thr Vai Thr Pro Ile Arg Met Gin 20 25

15 (2) SEQ ID NO:28: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 28 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 20 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen * · ··· (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi • · · • · • I ♦ • · *.·. (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen *: 25 • · · · : (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ Π) NO:28: ft · · • · • · • «

Ser Ile Asn Gly Asn Ala Pro Ala Glu Ile Asp Leu Arg Gin Met Arg 1 5 10 15 30 Thr Vai Thr Pro Ile Arg Met Gin 20 • · • · • ft • · · • · · • · • ·

:’** (2) SEQ ID NO:29: TIEDOT

• · · ·;··. 35 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: · (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 79 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen 5 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:29:

Ala Phe Ser Gly Val Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu A.la His Arg 15 10 15 10

Asn Gin Ser Leu Asp Leu Ala Glu Gin Glu Leu Val Asp 20 25 (2) SEQ ID NO:30: TIEDOT 15 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 25 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 20 . . (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi » · e e • · · * IM • · '·* (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen • 4 e · • · • « 25 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:30: • * • · * · • · · • · • «

Vai Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala His Arg Asn Gin Ser Leu 15 10 15

Asp Leu Ala Glu Gin Glu Leu Vai Asp 30 20 25 • · • e • · e · · ··· • ·

(2) SEQ ID NO:31: TIEDOT

• M

* ·*♦ *:* 35 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: ··/* (A) PITUUS: 25 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohapon («Il (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 80 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen 5 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ Π) NO:31:

Ala Phe Ser Gly Val Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala His Arg 15 10 15

Asn Gin Ser Leu Asp Leu Ala Glu Gin 20 25 10

(2) SEQ ID NO:32: TIEDOT

15 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 29 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 20 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi !»! ’ (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen ·»* • « • · :V (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:32: *· 25 ”** Vai Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala His Arg Asn Gin Ser Leu :: i 5 io is ♦ #·

Asp Leu Ala Glu Gin Glu Leu Vai Asp Cys Ala Ser Gin * 20 25 30 • · • <»

*···. (2) SEQ ID NO:33: TIEDOT

• » 0 0 * • · ·*' (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: • 0* .·· J 35 (A) PITUUS: 28 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo • · * ' (D) TOPOLOGIA: lineaarinen « · ·· 1 MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) ERAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen 81 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:33: 5

Glu Tyr Ile Gin His Asn Gly Vai Vai Gin Glu Ser Tyr Tyr Arg Tyr 15 10 15

Vai Ala Arg Glu Gin Cys Arg Arg Pro Asn Ala Gin 20 25 10

(2) SEQ ID NO:34: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: 15 (A) PITUUS: 29 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MQLEKYYLITYYPPI: peptidi 20 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen ··« · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:34: • · ·.*.* Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gin His Asn Gly Vai Vai 25 1 5 10 15 • · · · : .·. Gin Glu Ser Tyr Tyr Arg Tyr Vai Ala Arg Glu Gin Ser : 20 25 • * *

30 (2) SEQ ID NO:35: TIEDOT

• * : (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: : : (A) PITUUS: 29 aminohappoa #···, (B) TYYPPI: aminohappo ***. 35 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · • * :*·*· (ii) MQLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:35: 82

Gin lie Tyr Pro Pro Asn Ala Asn Lys lie Arg Glu Ala Leu Ala Gin 1 5 10 15 ^ Thr His Ser Ala Ile Ala Vai Ile He Gly He Lys Asp 20 25

(2) SEKVENSSIN ID NO:36: TIEDOT

10 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PIUJUS: 22 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 15 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENITITYYPPI: N-terminaalinen 20 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:36: :.: : Gln τ1<* Tyr Pro Pro Asn Ala Asn Lys He Arg Glu Ala Leu Ala Gin 15 ίο is - · Thr His Ser Ala He Ala :.V 20 ..‘.I* 25 • · * ··· · • · (2) SEQ ID NO:37: TIEDOT 30 . . (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PIUJUS: 26 aminohappoa *·* ’ (B) TYYPPI: aminohappo :***· (D) TOPOLOGIA: lineaarinen ··« ....: 35 • · 1 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen MOLEKYYLITYYPPI: peptidi • · * • · • · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:37: 83 lie Ile Gly He Lys Asp Leu Asp Ala Phe Arg His Tyr Asp Gly Ara 1 5 10 15

Thr He He Gin Arg Asp Asn Gly Tyr Gin 5 20 25

(2) SEQ ID NO:38: TIEDOT

10 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 25 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 15 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen 20 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:38: : Arg Asp Asn Gly Tyr Gin Phe Asn Tyr His Ala Vai Asn He Vai Gly -is io 15 ’·* * Tyr Ser Asn Ala Gin Gly Vai Asp Tyr :Y: 20 25 25

(2) SEQ ID NO:39: TIEDOT

30 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 29 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo Y (D) TOPOLOGIA: lineaarinen ///.. 35 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi • · * • (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:39: 84

Asn Ile Vai Gly Tyr Ser Asn Ala Gin Gly Vai Asp iyr Trp Ile Vai 15 10 15

Arg Asn Ser Trp Asp Thr Asn Trp Gly Asp Asn Gly Tyr 20 25 5

(2) SEQ ID NO:40: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 23 aminohappoa ΊΟ (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 15 (v) FRAGMENTHTYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:40:

Asn Ile Vai Gly Tvr Ser Asn Ala Gin Gly Vai Asp Tyr Trp Ile Vai 1 5* 10 15 20

Arq Asn Ser Trp Asp Thr Asn 20 • · • * * • · · » • · · ♦ ·

(2) SEQ ID NO:41: TIEDOT

• · 25 ·**·. (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: '1'· (A) PITUUS: 20 aminohappoa • · (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 30 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi • * • · · • ♦ • · · ·.· (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen 35 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:41: • · * • · · • · 85

Asp Gin Vai Asp Vai Lys Asp Cys Ala Asn His Glu Ile Lys Lys Vai

Leu Vai Pro Gly 20

5 (2) SEQ ID NO:42: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PIHJUS: 25 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 10 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen 15 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:42:

His Glu Ile Lys Lys Vai Leu Vai Pro Gly Cys His Gly Ser Glu Pro 15 10 15

Cys Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe 20 20 25 « · · * ·

25 (2) SEQ ID NO:43: TIEDOT

• · · (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: • · * (A) PITUUS: 29 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 30 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 0 * ' (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi .··* (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen 35 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:43: • · · • * 86

His Gly Ser Glu Pro Cys lie lie His Arg Gly Lys Pro Phe Gin Leu 15 10 15

Glu Ala Val Phe Glu Ala Asn Gin Asn Thr Lys Thr Ala 20 25 5

(2) SEQ ID NO:44: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITOUS: 25 aminohappoa 10 (B) TYYPPI; aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MQLEKYYLITYYPPI: peptidi 15 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ Π) NO:44:

Gin Leu Glu Ala Val Phe Glu Ala Asn Gin Asn Thr Lys Thr Ala Lys 15 10 15 20 lie Glu lie Lys Ala Ser lie Asp Gly 20 25 • · • « • · • · · *·* * · ·

.:. 25 (2) SEQ ID NO:45: TIEDOT

• ·· · • « • · (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITOUS: 27 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 30 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen L: ’ (ii) MOLEKYYLITYYPPi: peptidi • · · • * • · ··· (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen 35 • · · * (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:45: • · · • · • * 87

Lys Ile Glu Ile Lys Ala Ser Ile Asp Gly Leu Glu Vai Asp Vai Pro 1 5 10 15

Gly Ile Asp Pro Asn Ala Cys His Tyr Met Lys 20 25

5 (2) SEQ ID NO:46: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 26 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 10 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen 15 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:46:

Leu Glu Vai Asp Vai Pro Gly Ile Asp Pro Asn Ala Cys His Tyr~Met 15 10 15

Lys Cys Pro Leu Vai Lys Gly Gin Gin Tyr 20 25 20 ♦ · * ♦ · · • · · *

:*:* (2) SEQ ID NO:47: TIEDOT

• · • · * • · • · 25 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: : .·. (A) PITUUS: 27 aminohappoa • · · · (B) TYYPPI: aminohappo • · (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 30 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi • · (v) FRAGMEMtiTYYPPI: N-terminaalinen • « · • · • · « · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:47: ·· · 35 • ' Cys Pro Leu Vai Lys Gly Gin Gin Tyr Asp Ile Lys Tyr Thr Trp Asn • · 1 5 10 15 ♦ ♦ ♦ • · • * Vai Pro Lys Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Vai 20 25

(2) SEQ ID NO:48: TIEDOT

88 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 26 aminohappoa 5 (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 10 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:48:

Asp Ile Lys Tyr Thr Trp Asn Vai Pro Lys Ile Ala Pro Lys Ser Glu 15 1 5 10 15

Asn Vai Vai Vai Thr Vai Lys Vai Met Gly 20 25 20

: (2) SEQ ID NO:49: TIEDOT

• · v · • · · t * * « ’ « (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: • · • · (A) PITUUS: 25 aminohappoa j*#·. 25 (B) TYYPPI: aminohappo . (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · • * (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 30 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen • · • · • · • · · :T (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:49: • * • · · • *·* Vai Vai Thr Vai Lys Vai Met Gly Asp Asp Gly Vai Leu Ala Cys Ala ·:·· 15 10 15 . . 35

Ile Ala Thr His Ala Lys Ile Arg Asp : 20 25 • · · · 89

(2) SEQ ID NO:50: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: 5 (A) PITUUS: 26 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 10 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:50: 15 Asp Gin Vai Asp Vai Lys Asp Cys Ala Asn His Glu Ile Lys Lys Vai 15 10 15

Leu Vai Pro Gly Cys His Gly Ser Glu Pro 20 25 20

: :1· (2) SEQ ID NO:51 : TIEDOT

• · · • · · « · • · (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: • · « · 25 (A) PITUUS: 26 aminohappoa ♦ j**· (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · • · (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 30 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen • · • · • · • · · :T (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:51 : • · • · · • *··· oc Asp Gin Vai Asp Vai Lys Asp Glu Ala Asn His Glu Ile Lys Lys Vai

Jp 1 5 10 15

Leu Vai Pro Gly Cys His Gly Ser Glu Pro : 1 20 25 • · · · ·

(2) SEQ ID NO:52: TIEDOT

90 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: 5 (A) PITUUS: 26 aminohappoas (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 10 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:52:

Asp Gin Vai Asp Val Lys Asp Ser Ala Asn His Glu Ile Lys Lys Val 15 10 15 1 j. Leu Val Pro Gly Cys His Gly Ser Glu Pro 20 25

20 (2) SEQ ID NO:53: TIEDOT

: :’ (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: • · · :*;* (A) PITUUS: 26 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo • · .: 25 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen ···« • · • * • « ‘Γ. (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi • « * (v) ERAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen 30 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:53: : .* Asp Gin Vai Asp Vai Lys Asp Cys Ala Asn His Glu Ile Lys Lys Vai i 5 io 15 • · · • ·

Leu Vai Pro Gly Glu His Gly Ser Glu Pro 20 25 • · · 35 • # · · • · • · · • · * • ·

*:·· (2) SEQ ID NO:54: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: 91 (A) PITUUS: 26 aminohappo (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 5 (ii) MOLEKYYLITYYPPl: peptidi (v) FE^AGMENTTITYYPPI: N - terminaal inen 10 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:54:

Asp Gin Vai Asp Vai Lys Asp Cys Ala Asn His Glu Ile Lys Lys Vai 15 10 15

Leu Vai Pro Gly Ser His Gly Ser Glu Pro 20 25 15

(2) SEQ ID NO:55: TIEDOT

20 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 26 aminohappoa • · (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · • « • · • · ·; 25 (ii) MOLEKYYLITYYPPl: peptidi • · · * • · • · • · • · · .*.* (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen * · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:55: 30

Asp Gin Vai Asp Vai Lys Asp Glu Ala Asn His Glu Ile Lys Lys Vai . . 1 5 10 15 » ·

Leu Vai Pro Gly Glu His Gly Ser Glu Pro : : 20 25 # · • · · • · · 35 • · • · · : · (2) SEQ ID no:56: tiedot *♦·· (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: 92 (A) PITUUS: 26 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 5 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) ERAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:56: m Asp Gin Vai Asp Vai Lvs Asp Ser Ala Asn His Glu Ile Lys Lys Vai IU i 5 10 15

Leu Vai Pro Gly Ser His Gly Ser Glu Pro 20 25 15

(2) SEQ ID NO:57: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: 20 (A) PITUUS: 20 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo * (D) TOPOLOGIA: lineaarinen * · · • ·· • · • · 9 .V (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi • · 25 ”’· (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen « · • ·· • 1 • ♦ (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:57:

Asp Gln Val AsP val Lys Asp Glu Ala Asn His Glu Ile Lys Lys Vai JU 1 5 10 15 , . Leu Vai Pro Gly : : 20 «1· «n • · 9 · • · • · · (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: · · 35 ·#1· 9 I ·

: 1. (2) SEQ ID NO:58: TIEDOT

«··» 93 (A) PITUUS: 20 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 5 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:58: 10

Asp Gin Vai Asp Vai Lys Asp Ser Ala Asn His-Glu Ile Lys Lys Vai 1 5 10 15

Leu Vai Pro Gly 20 15

(2) SEQ ID NO:59: TIEDOT

20 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 16 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo :T (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · « · • · • · .· 25 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi

• •M

• * • · • · (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen « · ' ' « · * (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:59: 30

His Glu Ile Lys Lys Vai Leu Vai Pro Gly Cys His Gly Ser Glu Pro :1 5 10 15.

··· • · » k * 9 · 9 • · l»l ·»· 35

. . (2) SEQ ID NO:60: TIEDOT

• * · » · 9 • * (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 16 aminohappoa 94 (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 5 (v) FRAGMENTITTYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:60: 10 His Glu Ile Lys Lys Vai Leu Vai Pro Gly Glu His Gly Ser Glu Pro

15 10 IS

(2) SEQ ID NO:61 : TIEDOT 15 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 16 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 20 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMEHTTITYYPPI: N-terminaalinen Y:. 25 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:61: • · · · • · '· His Glu Ile Lys Lys Vai Leu Vai Pro Gly Ser His Gly Ser Glu Pro 15 10 15 30

(2) SEQ ID NO:62: TIEDOT

• · (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 28 aminohappoa 35 (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · · • · ·:··: (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 95 (v) HlAGMENiTTTYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:62:

Lys Pro Phe Gin Leu Glu Ala Val Phe Glu Ala Asn Gin Asn Thr Lys 5 15 10 15

Thr Ala Lys lie Glu lie Lys Ala Ser Thr Asp Gly 20 25 10

(2) SEQ ID NO:63: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 28 aminohappoa 15 (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI : peptidi 20 (v) ERAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen : .*; (Xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:63: • · · * • · · ·.* ‘ Gin Leu Glu Ala Vai Phe Glu Ala Asn Gin Asn Thr Lys Thr Ala Lys 15 10 15 • · 25 Ile Glu Ile Lys Ala Ser Ile Asp Gly Leu Glu Vai 20 25 • · • · · • · · *♦· * ♦ · *

30 (2) SEQ ID NO:64: TIEDOT

• (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: ··· · (A) PITUUS: 27 aminohappoa .1/ (B) TYYPPI: aminohappo ***. 35 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · * · Y\: (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) ERAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID N0:64: 96

Phe Glu Ala Asn Gin Asn Thr Lys Thr Ala Lys Ile Glu He Lys Ala 15 10 15 5 Ser He Asp Gly Leu Glu Vai Asp .Val Pro Gly 20 25

10 (2) SEQ ID NO:65: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 23 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 15 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FEIAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen 20 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:65: • · · • · · • · » *

Gin Asn Thr Lys Thr Ala Lys He Glu He Lys Ala Ser Ile Asp Gly ‘ 1 5 10 15 • · • · · *·*· Leu Glu Vai Asp Vai Pro Gly .*:· 25 20 I··· • · (2) SEQ ID NO:66: TIEDOT 30 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: • · • · · '··· (A) PITUUS: 26 aminohappoa • · · ·.· (B) TYYPPI: aminohappo .*·* (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 35 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi • · · • · · • · • · (v) FRAGM2NTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:66: 97

Pro Leu Vai Lys Gly Gin Gin Tyr Asp Ile Lys Tyr Thr Trp Asn Val 15 10 15

Pro Lys He Ala Pro Lys Ser Glu Asn Val 5 20 25

(2) SEQ ID NO:67: TIEDOT

10 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 27 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 15 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) ERAGMEMTITYYPPI: N-terminaalinen 20 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:67: • ·’· Pro Leu Vai Lys Gly Gin Gin Tyr Asp He Lys Tyr Thr Tyr Asn Vai ’··*· 1 5 10 15 • · · • ·

Pro Lys He Ala Pro Lys Ser Glu Asn Vai 20 25 25 • ·· · • · · • * · · • · « ·

(2) SEQ ID NO:68: TIEDOT

30 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 13 aminohappoa • * (B) TYYPPI: aminohappo • .· (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • » 35 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi • · • · · : (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:68: 98

Lys Ser Glu Asn Vai Vai Vai Thr Vai Lys Val Met Gly 1 5 10

5 (2) SEQ ID NO:69: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 23 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 10 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen 15 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:69:

Thr Vai Lys Vai Met Gly Asp Asp Gly Vai Leu Ala Cys Ala Ile Ala 15 10 15

Thr His Ala Lys Ile Arg Asp 20 20 • · • · • · · • · · • · • ·

:Y* (2) SEQ 3D NO:70: TIEDOT

·:· 25 • · · · : .· (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: • · « ,·.· (A) PITUUS: 230 aminohappoa • · * (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 30 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi • · • · • * · • · · (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen • · • · · 35 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:70: • · • · ' Thr Vai Lys Vai Met Gly Asp Asp Gly Vai Leu Ala Glu Ala Ile Ala ' ' 1 5 10 15

Thr His Ala Lys Ile Arg Asp 20 99

(2) SEQ ID NO:71: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 23 aminohappoa 5 (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 10 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-teminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:71:

Thr Vai Lys Vai Leu Gly Asp Asp Gly Vai Leu Ala Ser Ala Ile Ala 15 10 15 15

Thr His Ala Lys Ile Arg Asp 20

(2) SEQ ID NO:72: TIEDOT

20 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: • · • · · (A) PITUUS: 21 aminohappoa ··» ·.· (B) TYYPPI: aminohappo ·,·' (D) TOPOLOGIA: lineaarinen ·:* 25 • ·· · : (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi • · • · (v) ERAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen 30 (Xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:72: • · • * * ··* Thr Ser Ala Cys Arg Ile Asn Ser Vai Asn Vai Pro Ser Glu Leu Asp .*:* 15 10 15 • · •

Leu Arg Ser Leu Arg *. 20 • · · ·:··· 35 • · • · · • · • · • ·

(2) SEQ ID no:73: TIEDOT

100 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 27 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 5 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen 10 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SBQ ID NO;73:

Glu Leu Asp Leu Arg Ser Leu Arg Thr Vai Thr Pro Ile Arg Met Gin 1 5 10 is

Oly Gly Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Gly 20 25 15

(2) SEQ ID NO:74: TIEDOT

20 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 29 aminohappoa • · . (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · • · • « 25 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi ···1 • 1 • · • 1 ’·,· (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen t · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:74: 30

Thr Vai Thr Pro Ile Arg Met Gin Gly Gly Cys Gly Ser Cys Trp Ala . . 1 5 10 15 • · “I. Phe Ser Gly Vai Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala : : 20 25 • · ··1 • · · • 35 ···♦ (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: · • · ·

: ’· (2) SEQ ID NO:75: TIEDOT

• « · · 101 (A) PITUUS: 21 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 5 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) ERAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:75: 10

Vai Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg Asn Thr Ser Leu 1 5 .10 15

Asp Leu Ser Glu Gin 20 15

(2) SEQ ID NO:76: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: 20 (A) PITUUS: 22 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo , (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · · • · • 4 « •Y (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 9 · 25 ; .· (v) ERAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen * · • · · « · • · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:76: TY1" Arg Asn Thr Ser Leu Asp Leu Ser Glu Gin Glu Leu Vai Asp Cys 30 1 5 10 15

Ala Ser Gin His Gly Cys r 20 • » · • « · • · • · « • · ··· *·'* 35 • M·

(2) SEQ ID NO:77: TIEDOT

• · · 9 · • · ·:*· (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 21 aminohappoa 102 (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 5 (v) EEIAGME3SITTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:77:

Glu Leu Vai Asp Cys Ala Ser Gin His Gly Cys His Gly Asp Thr Ile 10 1 5 10 15

Pro Arg Gly Ile Glu 20 15

(2) SEQ ID NO:78: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 28 aminohappoa 20 (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • « * t 9 · • * * · (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi * t • · fl · * * • ί 25 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen « 6 · · • * $ t • · ‘ V* (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:78: • ·

Gly Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gin Gin Asn Gly Vai 15 10 15 30 Vai Glu Glu Arg Ser Tyr Pro Tyr Vai Ala Arg Glu 20 25 • 4 * * « · • « · • » f · * * · ··> $ • · · .· 35 *·*♦

• · (2) SEQ ID NO:79: TIEDOT

• » · • · « • * (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 25 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 103 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 5 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:79: 1f) Gin Asn Gly Vai Vai Glu Glu Arg Ser Tyr Pro Tyr Vai Ala Arg Glu 1 5 10 15

Gin Arg Cys Arg Arg Pro Asn Ser Gin 20 25 15

(2) SEQ ID NO:80: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: 20 (A) PITUUS: 19 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 25 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen .**·'. (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:80: 30 Gin Arg Cys Arg Arg Pro Asn Ser Gin His Tyr Gly Ile Ser Asn Tyr 15 10 15

Cys Gin Ile • « .··**. 35 • « * • ·

(2) SEQ ID NO:81: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: 104 (A) PITUUS: 22 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 5 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FTLAGMEOTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:81 : 10

His Tyr Gly Ile Ser Asa Tyr Cys Gin Ile Tyr Pro Pro Asp Vai Lys 15 10 15

Gin Ile Arg Glu Ala Leu 20 15

(2) SEQ ID NO:82: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: 20 (A) PITUUS: 24 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · • · · 0 : (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi :Y; 25 ··· (v) ERAGMEMTITYYPPI: N-terminaalinen • · · · • · • · • · · · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:82: 30 Tyr Pro Pro Asp Vai Lys Gin Ile Arg Glu Ala Leu Phe Gin Thr His 15 10 15

Thr Ala Ile Ala Vai Ile Ile Gly : 20 • · · · • · · • · · • · 35 • · *

./.· (2) SEQ ID NO:83: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: 105 (A) PITUUS: 26 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 5 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:83: 10

Thr Gin Thr His Thr Ala Ile A.la Vai Ile Ile Gly Ile Lys Asp Leu 1-5 10 15

Arg Ala Phe Gin His Tyr Asp Gly Arg Thr 20 25 15

(2) SEQ ID NO:84: TIEDOT

20 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 26 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 25 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi • · · • · · · : (v) FRAGMEOTTITYYPPI: N-terminaalinen • # · · • · · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:84: 30

Ile Lys Asp Leu AYg Ala Phe Gin His Tyr Asp Gly Arg Thr Ile Ile 1 5 10 15 : :'· Gln His Asp Asn Gly Tyr Gin Pro Asn Tyr 20 25 35 • · « ·« · • · 106

(2) SEQ ID NO:85: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 15 aminohappoa 5 (B) TYYPPI: aminohappo (D) ΊΌΡΟΙ/DGIA: lineaarinen (ii) MQLEKYYLITYYPPI: peptidi 10 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:85:

Asp Gly Arg Thr Ile Ile Gin His Asp Asn Gly Tyr Gin Pro Asn 1 5 .10 15

(2) SEQ ID NO:86: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 23 aminohappoa 20 (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · :.· · (ii) MQLEKYYLITYYPPI: peptidi • · · • · 25 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen • · • · t : (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:86: • · · · ·.· Ile Ile Gin His Asp Asn Gly Tyr Gin Pro Asn Tyr His Ala Vai Asn 15 10 15 30 Ile Vai Gly Tyr Gly Ser Thr 20 • · · • · · (2) SEQ ID NO:87: TIEDOT 35 « «·« (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: • (A) PITUUS: 22 aminohappoa : (B) TYYPPI: aminohappo ’· ' (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 107 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen 5 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:87:

His Ala Vai Asn Ile Val Gly Tyr Gly Ser Thr Gin Gly Asp Asp Tyr 15 10 15

Trp lie Val Arg Asn Ser 10 20

15 (2) SEQ ID NOI88: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 24 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 20 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi • · · • · · 1 ··· (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen :‘.V 25 l (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:88: • · * · • · · · ;1·’ Gin Gly Asp Asp Tyr Trp Ile Vai Arg Asn Ser Trp Asp Thr Thr Trp 1 5 10 15

Gly Asp Ser Gly Tyr Gly Tyr Phe 20 • 1 • « · • · • · · • · · • · • » ·/2’ 35 • · ·

...·; (2) SEQ ID NO:89: TIEDOT

* (A) PITUUS: 26 aminohappoa · · 2 • · : · (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: • · · · 108 (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MDLEKYYLITYYPPI: peptidi 5 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:89:

Gly Asp Ser Gly Tyr Gly Tyr Phe Gin Ala Gly Asn Asn Leu Met Met 10 χ 5 10 15

Ile Glu Gin Tyr Pro Tyr Vai Vai Ile Met 20 25 15

(2) SEQ ID NO:90: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: 20 (A) PITUUS: 29 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · • · II» :*:* (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi :Y' 25 • · ··· (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen ···« • · • · • · .·.· (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:90: • ·

Thr Ser Ala Cys Arg Ile Asn Ser Vai Asn Vai Pro Ser Glu Leu Asp 30 l 5 10 15

Leu Arg Ser Leu Arg Thr Vai Thr Pro Ile Arg Met Gin 20 25 • · • * • « ··« • ♦ · • · • · :**** 35 ··· ··»«

„Y (2) SEQ ID NO:91 : TIEDOT

• · * • · ’** ' (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: 109 (A) PITUUS: 25 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 5 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ Π) NO:91: 10

Arg Ile Asn Ser Vai Asn Vai Pro Ser Glu Leu Asp Leu Arg Ser Leu· 15 10 15

Arg Thr Vai Thr Pro Ile Arg Met Gin 20 25 15

(2) SEQ ID NO:92: TIEDOT

20 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 29 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo i (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · · ♦ • · · » ·

• I

25 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi • ♦ • * ; #· (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen * · ♦ ·· ♦ • ♦ • · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:92: 30

Ala Phe Ser Gly Vai Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg 15 10 15

Asn Thr Ser Leu Asp Leu Ser Glu Gin Glu Leu Vai Asp : :* 20 25 • · · • · · • · • · • ♦ 35 ·»♦ *··« • · • · ·

: (2) SEQ ID NO:93: TIEDOT

• · · · 110 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 25 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 5 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen 10 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:93:

Vai Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg Asn Thr Ser Leu 15 10 15

Asp Leu ser Glu Gin Glu Leu Vai Asp 20 25 15

(2) SEQ ID NO:94: TIEDOT

20 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 29 aminohappoa • · ·,· (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen :V1 25 t · (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi ···♦ • · • « • · ,·.♦ (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen • · 30 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:94:

Vai Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg Asn Thr Ser Leu 1 5 10 15 » · ***. Asp Leu Ser Glu Gin Glu Leu Vai Asp Cys Ala Ser Gin \\ 20 25 :1·1 35 ♦ ·· • · Φ ♦ I » ·· 1 • ·

(2) SEQ ID NO:95: TIEDOT

· 111 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 29 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 5 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen 10 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:95:

Glu Tyr He Gin Gin Asn Gly Vai Vai Glu Glu Arg Ser Tyr Pro Tyr 15 10 15 1 c Vai Ala Arg Glu Gin Arg Cys Arg Arg Pro Asn Ser Gin 13 20 25

(2) SEQ ID NO:96: TIEDOT

20 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 29 aminohappoa • ♦ ; (B) TYYPPI: aminohappo V (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • « : : 25 # ♦ >: (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi • 1 • · I ♦ ··« ' (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen • · 30 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:96:

Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gin Gin Asn Gly Vai Vai ; 1 5 10 15 »I» ·**·’ Glu Glu Arg Ser Tyr Pro Tyr Vai Ala Arg Glu Gin Arg *· 20 25 35 • •a ··«· • · • · 1 • 1 « m ·

'’***' (2) SEQ ID NO:97: TIEDOT

112 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 29 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 5 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) ERAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen 10 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:97:

Gin Ile Tyr Pro Pro Asp Vai Lys Gin Ile Arg Glu Ala Leu Thr Gin 1 5 10 15

Thr His Thr Ala Ile Ala Vai Ile Ile Gly Ile Lys Asp 15 20 25

20 (2) SEQ ID NO:98: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: ! . (A) PITUUS: 22 aminohappoa ' ; (B) TYYPPI: aminohappo •••j 25 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen * ♦ · : (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) ERAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen 30 : (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:98: • · · · • · ·

Gin Ile Tyr Pro Pro Asp Vai Lys Gin Ile Arg Glu Ala Leu Thr Gin .1.' 15 10 15

Thr His Thr Ala Ile Ala ·:··: 35 20 1

(2) SEQ ID NO:99: TIEDOT

· • · 113 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 26 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 5 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen 10 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:99:

Ile Ile Gly Ile Lys Asp Leu Arg Ala Phe Gin His Tyr Asp Gly Arg 15 10 15

Thr Ile Ile Gin His Asp Asn Gly Tyr Gin 20 25 15

(2) SEQ ID NO:100: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: 20 (A) PITUUS: 252 aminohappoa ; ·_ (B) TYYPPI: aminohappo • · · ' (D) TOPOLOGIA: lineaarinen « · · '·*·’ (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 25 ·.: · (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 100: •5n His Asp Asn Gly Tyr Gin Pro Asn Tyr His Ala Vai Asn Ile Vai Gly 1 5 10 15 • · : Tyr Gly Ser Thr Gin Gly Asp Asp Tyr 20 25 • tt • · · ·:*·: 35

(2) SEQ ID NO:101: TIEDOT

» · • · (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 29 aminohappoa 114 (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 5 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 101: .. Asn Ile Vai Gly Tyr Gly Ser Thr Gin Gly Asp Asp Tyr Trp Ile Vai 10 i 5 !0 15

Arg Asn Ser Trp Asp Thr Thr Trp Gly Asp Ser Gly Tyr 20 25 15

(2) SEQ ID NO:102: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 23 aminohappoa 20 (B) TYYPPI: aminohappo . . (D) TOPOLOGIA: lineaarinen * · « • · · • · · · • · · • · (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi • · · • · * • · 25 (v) ERAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen • · • · * • · · • · · · :*/. (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:102:

Asn Ile Vai Gly Tyr Gly Ser Thr Gin Gly Asp Asp Tyr Trp Ile Vai 15 10 15 30

Arg Asn Ser Trp Asp Thr Thr • · 20 • · • · · · • · · • · « • · • · · t · • · · ···"· 35 • · • · · * · · * ·

(2) SEQ ID NO: 103: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: 115 (A) PITUUS: 20 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 5 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAG4ENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 103: 10

Asp Gin Vai Asp Vai Lys Asp Cys Ala Asn Asn Glu Ile Lys Lys Vai 15 10 15

Met Vai Asp Gly 20 15

(2) SEQ ID NO:104: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: 20 (A) PITUUS: 25 aminohappoa . . (B) TYYPPI: aminohappo • · '·' * (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · · ' ' • · • · :.V (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 25 || | (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen • « * · • · · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 104:

Asn Glu Ile Lys Ly^ Vai Met Vai Asp Gly Cys His Gly Ser Asp Pro 30 1 5 10 15 ; : · | Cys Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe *”.* 20 25 • · • · • · · ♦ • · · *:*·: 35 • · • · · • · ·

j ‘ (2) SEQ ID N0:105: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: 116 (A) PITUUS: 29 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 5 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-teminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 105: 10

His Gly Ser Asp Pro Cys lie lie His Arg Gly Lys Pro Phe Thr Leu 1 5 10 15

Glu Ala Leu Phe Asp Ala Asn Gin Asn Thr Lys Thr Ala 20 25 15

(2) SEQ ID N0:106: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: 20 (A) PITUUS: 19 aminohappoa . (B) TYYPPI: aminohappo :;i.' (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · φ · 4 * '·*· (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi .··: 25 • · i.i (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen • · • · 9 · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 106: 30 : ·* His Arg Gly Lys Pro Phe Thr Leu Glu Ala Leu Phe Asp Ala Asn Gin ··* 15 10 15 • · · • · **# , Asn Thr Lys ··· ««· 35 • ·

:*.· (2) SEQ ID N0:107: TIEDOT

• · • · « ··· (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 25 aminohappoa 117 (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 5 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 107:

Thr Leu Glu Ala Leu Phe Asp Ala Asn Gin Asn Thr Lys Thr Ala Lys 10 1 5 10 15

Ile Glu Ile Lys_Al-a- Ser Leu Asp Gly 20 * 25 15

(2) SEQ ID NO:108: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 26 aminohappoa 20 (B) TYYPPI: aminohappo . . (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • » > » · ··· · • · · • · '·*_ (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi • · 9 * * · 25 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen • · • i » · / • * · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 108: f

Gin Asn Thr Lys Thr Ala Lys Ile Glu Ile Lys Ala Ser Leu Asp Gly 1 5 10 15 30

Leu Glu Ile Asp Vai Pro Gly Ile Asp Thr : / 20 25 9 * 9·· · • · · • 9 « 9

Mt 9 • t 9 35

(2) SEQ ID NO:109: TIEDOT

• v • 9 • 99« (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 27 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 118 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 5 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:109: 1Q Lys Ile Glu Ile Lys Ala Ser Leu Asp Gly Leu Glu Ile Asp Vai Pro 1 5 10 15

Gly Ile Asp Thr Asn Ala Cys His Phe Met Lys 20 25 15

(2) SEQ ID NO:110: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 26 aminohappoa 20 (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen ·;·_ (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi ; 25 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:110: • · ·

Leu Glu Ile Asp Vai Pro Gly Ile Asp Thr Asn Ala Cys His Phe Met 15 10 15 30

Lys Cys Pro Leu Vai Lys Gly Gin Gin Tyr 20 25 • · • · · : — ’ 35

(2) SEQ ID NO:111: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 27 aminohappoa 119 (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 5 (v) ERAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 111:

Cys Pro Leu Vai Lys Gly Gin Gin Tyr Asp Ala Lys Tyr Thr 'tvd A<?n 1° 1 5 10 2 5

Vai Pro Lys Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Vai 20 25 15

(2) SEQ ID NO: 112: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 26 aminohappoa 20 (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · • · · *.··.·’ (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi • · • · · ' I 25 (v) ERAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen • · · · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:112: • · ·

Asp Ala Lys Tyr Thr Trp Asn Vai Pro Lys Ile Ala Pro Lys Ser Glu 15 10 15 30 , ,

Asn Vai Vai Vai Thr Vai Lys Leu Vai Gly 20 25 • · • · · • · · 1 ....j (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 35 aminohappoa · · 35

(2) SEQ ID NO:113: TIEDOT

» · t · · • · (Β) ΊΎΥΡΡΙ: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen.

120 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 5 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 113:

Pro Lys Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Vai Vai Vai Thr Vai Lys Leu 10 1 5 10 15

Vai Gly Asp Asn Gly Vai Leu Ala Cys Ala Ile Ala Thr His Ala Lys 20 25 30

Ile Arg Asp 35 15

(2) SEQ ID NO:114: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 25 aminohappoa 20 (Β) ΊΎΥΡΡΙ: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · # i 1 • · · *'j.‘ (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi • · 1 • · • · · ’**; 25 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen • · · »·1· • · i-j ϊ (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:114: • · ♦ · · ♦ « ♦

Vai vai Thr Vai Lys Leu Vai Gly Asp Asn Gly Vai Leu Ala Cys Ala 1 5 10 15 30

Ile Ala Thr His Ala Lys Ile Arg Asp 20 25 • · • · · • · 1 ··· · • · · • · ♦ » · e • » • · ♦ :·1· 35

(2) SEQ ID NO:101: TIEDOT

• · • · · • · · • · • · ···.: (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: • · 1 ' (A) PITUUS: 28 aminohappoa 121 (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 5 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:115: 10 Lys Pro Phe Thr Leu Glu Ala Leu Phe Asp Ala Asn Gin Asn Thr Lys 15 10 15

Thr Ala Lys Ile Glu Ile Lys Ala Ser Leu Asp Gly 20 25 15

(2) SEQ ID NO:116: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 28 aminohappoa 20 (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · • » ^ • · · (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi * · i e * · ♦ · * • · ’ I 25 (v) FRA3MENTTTTYYPPI: N-terminaalinen 4« * «»·· • · • · t ··· ; (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:116: • · • · • ·

Thr Leu Glu Ala Leu Phe Asp Ala Asn Gin Asn Thr Lys Thr Ala Lys 15 10 15 30 Ile Glu Ile Lys Ala Ser Leu Asp Gly Leu Glu Ile 20 25 • · • · · « · »it · • · · ♦. · * · * · • · · 35

(2) SEQ ID NO:117: TIEDOT

• · • · · • # * • » • · (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 22 aminohappoa 122 (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MDLEKYYLITYYPPI: peptidi 5 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:117: in His Arg Asn Gin Ser Leu Asp Leu Ala Gin Gin Asp Leu Vai Asp Cys ιυ 1 5 - 10 15

Ala Ser Gin His Gly Cys 20 15

(2) SEQ ID NO:118: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 21 aminohappoa 20 (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · « * % • « » /;·’ (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi « · · » « 4 · · • 4 25 (v) FRAGMENITITYYPPI: N-terminaalinen * « • · · · • « • · > : (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:118: • · • · * »

Asp Leu Vai Asp Cys Ala Ser Gin His Gly Cys His Gly Asp Thr Ile 15 10 15 30

Pro Arg Gly Ile Glu 20 • · • · • t • t · • · · • i * · a · » » *’·· 35

(2) SEQ ID NO: 119: TIEDOT

• « • · · * » ♦ r * · (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 29 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 123 (ii) MDLEKYYLITYYPPI: peptidi 5 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 11 9: 10 His Gly Ser Glu Pro Cys Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe Gin Leu 15 10 15

Glu Ala Vai Phe Glu Ala Vai Gin Asn Thr Lys Thr Ala 20 25 15 • · · • · · · • · · « « « « « · • · · · • · · • · · • · ·

Claims

1. Menetelmä suvun Dermatophagoides proteiiniallergeenin eristetyn modifioidun peptidin valmistamiseksi, joka peptidi kasit-5 tää mainitun proteiiniallergeenin vähintään yhden T-soluepitoo-pin, mainitun peptidin ollessa valittu ryhmästä, joka koostuu kuviossa 26 esitetyistä: a) DP 1-21.7:stä, b) DP 1-23.10:Stä, 10 c) DP 1-23.11:Stä, d) DP 1-23.12:sta, e) DP 1-23.5:Stä, f) DP 1-23.6:Sta, g) DP 1-23.7:stä, 15 h) DP 1-23.8:sta, i) DP 1-23.9:stä, j) DP 1-26.2:Sta, k) DP 11-20.7:Stä, l) DP 11-22.6:Sta, 20 m) DP 11-22.3:sta, n) DP 11-22.4:stä, . . o) DP 11-22.5:stä, p) DP 11-25.3: Sta, • · · *.**.* q) DP 11-25.4: stä, • · · *·*;* 25 r) DP 1-23.13: sta, ...’Γ S) DP 1-23.14: Stä, • · :.: : t) dp 1-23.15:stä, »«· : U) DP I- 23.16: sta, v) DP 1-23.17:stä, :***: 30 w) DP 1-26.3: Sta, ·»» ·:♦·; x) DP 1-26.4: stä, / . y) DP 1-26.5:Stä, • ♦ · z) DP 11-22.7:Stä, • · a') DP 11-22.8:sta, :T: 35 b') DP 11-22.9:Stä, • · • « ·#♦ C') DP 11-22.10:Stä ja d') DP 11-22.11:stä, jotka kaikki on esitetty kuviossa 26, tunnettu siitä, että peptidi valmistetaan synteettisellä menetelmällä tai yhdistelmä-DNA-tekniikalla. 5

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että peptidi ei sitoudu suvun Dermatophagoides proteiinille spesifiseen immunoglobuliini E:hen vähintään noin 75 %:lla yksilöiden populaatiosta, jotka ovat herkkiä mainitulle 10 proteiiniallergeenille, tai jos peptidi tai sen osa sitoutuu mainittuun immunoglobuliini E:hen, tällainen sitoutuminen ei saa aikaan välittäjien vapautumista syöttösoluista tai basofiileistä vähintään noin 75 %:lla yksilöiden populaatiosta, jotka ovat herkkiä mainitulle proteiiniallergeenille. 15

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että peptidi modifioi huonepölypunkkiherkässä ihmisessä, jolle sitä annetaan, henkilön allergisen vasteen huonepölypunkkialler-geenille. 20

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, . . että peptidiä edelleen modifioidaan lisäämällä varautuneita ami- • · · nohappoja tai varautuneita aminohappopareja mainittuun peptidiin • · · *·* * liukenevuuden lisäämiseksi . 25 t

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, • · :.· · että peptidiä edelleen modifioidaan korvaamalla vähintään yksi • · · : mainitussa peptidissä oleva kysteiinitähde seriinillä tai gluta- miinihapolla liukenevuuden lisäämiseksi. 30 • · ·

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, ,· . että vähintään yksi aminohappotähteistä, joka sitoutuu MHC- • · · proteiinikompleksiin, mutta ei ole oleellinen tällaiselle si- • · *···* toutumiselle, substituoidaan ja jossa T-solu-reaktiivisuutta ei 35 ole eliminoitu. • · · • · • · ···

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitut aminohappotähteet on substituoitu aminohap potähteillä, jotka on valittu ryhmästä, joka koostuu alanii-nista, glutamiinihaposta ja metyyliaminohaposta. 5

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vähintään yksi aminohappotähteistä, joka sitoutuu T-solu-reseptoriin, mutta ei ole oleellinen tällaiselle sitoutumiselle, substituoidaan ja jossa sitoutumista relevanttiin MHC-pro- 10 teiinikompleksiin ei ole eliminoitu.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitut aminohappotähteet on substituoitu aminohap potähteillä, jotka on valittu ryhmästä, joka koostuu metyyli- 15 aminohaposta, glutamiinihaposta ja alaniinista.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vähintään yksi aminohappotähteistä, joka on oleellinen T-solureseptoriin sitoutumiselle, on substituoitu ja jossa si- 20 toutumista relevanttiin MHC-proteiinikompleksiin ei ole eliminoitu. • · • · · • · · *“.* 11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, • · · *·* * että se on modifioitu menetelmällä, joka käsittää vaiheet: 25 • · · a) mainitun peptidin aminohappotähteiden, jotka ovat oleellisia • · i.i : T-solureseptoritunnistukselle, määrittämisen, ja • · · • · · • « · b) vähintään yhden aminohappotähteen, joka ei ole oleellinen 30 T-solureseptorivuorovaikutukselle aminohappotähteen kanssa, joka ··· ei ole oleellinen T-solureseptorivuorovaikutukselle, korvaamisen .* . aminohappotähteellä, joka on valittu ryhmästä, joka koostuu • · · metyyliaminohaposta, alaniinista ja glutamiinihaposta, jolloin • · ’···* sitoutuminen relevanttiin MHC-proteiinikompleksiin ei ole :*·*: 35 eliminoitu. • · · • · • · ·»·

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se käsittää vaiheen, jossa vähintään yksi aminohappotähde, joka on oleellinen T-soluvuorovaikutukselle, korvataan samankaltaisella aminohappotähteellä. 5

13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se on modifioitu menetelmällä, joka käsittää vaiheet: a) mainitun peptidin aminohappotähteiden, jotka ovat oleelli-10 siä T-solureseptoritunnistukselle, määrittämisen ja b) vähintään yhden aminohappotähteen, joka ei ole oleellinen T-solureseptorivuorovaikutukselle, substituoimisen samankaltaisella aminohappotähteellä, jolloin sitoutuminen relevanttiin

15 MHC-proteiinikompleksiin ei ole eliminoitu.

14. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se on modifioitu menetelmällä, joka käsittää vaiheet: 20 a) mainitun peptidin aminohappotähteiden, jotka ovat oleellisia T-solureseptoritunnistukselle, määrittämisen ja • · • · I • · · **.* b) vähintään yhden aminohappotähteen, joka ei ole oleellinen T- • · · * / solureseptorivuorovaikutukselle, substituoimisen saman- • · · *·*·* 25 kaltaisella aminohappotähteellä, jolloin sitoutuminen • · · relevanttiin MHC-proteiinikompleksiin ei ole eliminoitu. • · • · · • · · • · · · ··· · 15. Eristetty nukleiinihappo, tunnettu siitä, että siinä on sekvenssi, joka koodaa patenttivaatimuksen 1 mukaista peptidiä. 30 • · · ·;·♦· 16. Menetelmä eristetyn peptidin valmistamiseksi, joka peptidi .* . käsittää vähintään kaksi aluetta jokaisen alueen käsittäessä • · · l// suvun Dermatophagoides proteiiniallergeenin vähintään yhden • · *···’ T-soluepitoopin, mainittujen alueiden ollessa johdettu suvun :|Γ: 35 Dermatofagoides samoista tai erilaisista proteiiniallergeeneis- • · m • · • * • · · tä, jolloin vähintään yksi alue käsittää aminohapposekvenssin, joka on valittu seuraavasta ryhmästä: a) DP 1-21.1 (SEQ ID NO: 27), b) DP 1-21.2 (SEQ ID NO: 28),

5 C) DP 1-22.1 (SEQ ID NO: 29), d) DP 1-23.1 (SEQ ID NO: 33), e) DP 1-25.2 (SEQ ID NO: 36), f) DP 1-26.1 (SEQ ID NO: 37), g) DP 1-28.1 (SEQ ID NO: 39), 10 h) DP 1-1 (SEQ ID NO: 9), i) DF-I-1 (SEQ ID NO: 72), j) DF-I-21.1 (SEQ ID NO: 90), k) DF-I-22.1 (SEQ ID NO: 92), l) DF-I-23.1 (SEQ ID NO: 95), 15 m) DF-I-25.1 (SEQ ID NO: 97), n) DP II-l (SEQ ID NO: 41), O) DP 11-1,2 (SEQ ID NO: 58), p) DP II-2.0 (SEQ ID NO: 56), q) DP 11-20.3 (SEQ ID NO: 53), 20 r) DP 11-21 (SEQ ID NO: 62), s) DP 11-22 (SEQ ID NO: 63), ; t) DP 11-25 (SEQ ID NO: 69), •'li/ U) DP 11-25.2 (SEQ ID NO: 71), • · · *.**.1 v) DF II-2 (SEQ ID NO: 104), • · · 25 w) DF II-4.5 (SEQ ID NO: 107), x) DF-II-15 (SEQ ID NO: 109), • · :.: : y) df 11-17 (seq id NO: 111), ·* z) DF 11-19.1 (SEQ ID NO: 114), a·) DF 1-22.2 (SEQ ID NO: 93) ja :***: 30 b’) DP 11-20.6 (SEQ ID NO: 56), jolloin vähintään yksi alue kä- sittää aminohapposekvenssin, joka on valittu ryhmästä, joka .1 . koostuu: • · · • ·· • · • · · • m *·;·1 a) DP 1-21.7: stä, :T: 35 b) DP 1-23.10 : stä, « ' « · • · • · • 0 · C) DP 1-23.11:stä, d) DP 1-23.12:sta, e) DP 1-23.5:stä, f) DP 1-23.6:sta, 5 g) DP 1-23.7:stä, h) DP 1-23.8:sta, i) DP I-23.9:stä, j) DP 1-26.2:sta, k) DP 11-20.7:stä, 10 1) DP 11-22.6:sta, m) DP 11-22.3:sta, n) DP 11-22.4:sta, O) DP 11-22.5:stä, p) DP 11-25.3:sta, 15 q) DP 11-25.4:stä, r) DP I-23.13:sta, s) DP 1-23.14:stä, t) DP 1-23.15:stä, u) DP 1-23.16:sta, 20 v) DP 1-23.17:stä, w) DP I-26.3:sta, . . x) DP 1-26.4:stä, ::i.; y) DP 1-26.5: stä, • · · z) DP 11-22.7:stä, • · · *·*;' 25 a1 ) DP 11-22.8: sta, .»Γ b1) DP 11-22.9:stä, • · :.:: c) dp 11-22.i0:stä ja • · · \· · d1) DP 11-22.11: stä, jotka kaikki on esitetty kuviossa 26, tun nettu siitä, että peptidi valmistetaan synteettisellä menetel- :***: 3 0 mällä tai yhdistelmä-DNA-tekniikalla. • · · • · . 17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, • · ♦ että vähintään yksi alue käsittää aminohapposekvenssin, joka on • · ’•y’ valittu ryhmästä: :T: 35 a) DP 1-21.1 (SEQ ID NO: 27), • · · • · • · • · · b) DP 1-23.1 (SEQ ID NO: 33), C) DP 1-26.1 (SEQ ID NO: 37), d) DP II-2.0 (SEQ ID NO: 56), e) DP 11-22 (SEQ ID NO: 63) , 5 f) DP 11-25.2 (SEQ ID NO: 71) ja g) DF 1-22.2 (SEQ ID NO: 93, jotka kaikki on esitetty kuvioissa 3 ja 4 ja jolloin vähintään yksi aminohapposekvenssi on valittu ryhmästä, joka koostuu: 10 a) DP 1-21.7:stä, b) DP 1-23.10:stä, C) DP 1-23.11:Stä, d) DP 1-23.12:Sta, e) DP 1-23.5:stä, 15 f) DP 1-23.6:Sta, g) DP 1-23.7:stä, h) DP 1-23.8:sta, i) DP I-23.9:Stä, j) DP 1-26.2:sta, 20 k) DP 11-20.7:Stä,

1. DP 11-22.6:Sta, • . m) DP 11-22.3:Sta, • · · *.*:.*’ n) DP 11-22.4: stä, • · · *;Y o) DP 11-22.5:Stä, • · · ’•'f 25 p) DP 11-25.3:Sta, ♦ q) DP 11-25.4: Stä, • · : r) DP I-23.13:Sta, • · · : S) DP 1-23.14 :Stä, t) DP 1-23.15:Stä, 30 u) DP 1-23.16: sta, ··· ·:··: v) DP 1-23.17 : stä, . w) DP 1-26.3: sta, • · · X) DP 1-26.4: stä, • · y) DP 1-26.5: stä, :T: 35 z) DP 11-22.7:Stä, • · · • · • « • · · a') DP 11-22.8:Sta, b') DP 11-22.9:stä, C') DP 11-22.10:Stä ja d') DP 11-22.11:stä, jotka kaikki on esitetty kuviossa 26, tun-5 nettu siitä, että peptidi valmistetaan synteettisellä menetelmällä tai yhdistelmä-DNA-tekniikalla.

18. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu peptidi käsittää alueiden yhdistelmiä, jotka alu-10 eet on valittu ryhmästä: a) DP 1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.13, DP 1-26.1, DP 11-20.6, DP 11-22.3 ja DP 11-25.2; b) DP 1-21.2, DF 1-22.2, DP 1-23.10, DP 1-26.2, DP 1-20.6, DP 11-22.4 ja DP 11-25.3,

15 C) DP 1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.11, DP 1-26.3, DP 11-20.7, DP 11-22.5 ja DP 11-25.4; d) DP 1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.12, DP 1-26.4, DP 11-20.6, DP 11-22.6 ja DP 11-25.2; e) DP 1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.5, DP 1-26.5, DP 11-20.7, DP 20 11-22.7 ja DP 11-25.3; f) DP 1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.6, DP 1-26.2, DP 11-20.6, DP . . 11-22.8 ja DP 11-25.4; : q) DP 1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.7, DP 1-26.3, DP 11-20.7, DP :·: : 11-22.9 ja DP 11-25.3; m · \V 25 h) DP 1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.8, DP 1-26.4, DP 11-20.6, DP ...1!2 11-22.3 ja DP 11-25.4; i) dp 1-21.7, df 1-22.2, dp 1-23.9, dp 1-26.1, dp 11-20.7, dp 11-22.4 ja dp 11-25.3,· j) DP 1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.13, DP 1-26.2, DP 11-20.6, DP :3; 30 11-22.5 ja DP 11-25.4; k) DP 1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.14, DP 1-26.3, DP 11-20.7, DP • · 11-22.6 ja DP 11-25.3; :·2Σ 1) DP 1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.15, DP 1-26.4, DP 11-20.6, DP ··· 11-22.6 ja DP 11-25.3; ··· • · · • · « · · • · 2 • · 3 • · « m) DP 1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.16, DP 1-26.5, DP 11-20.6, DP 11-22.3 ja DP 11-25.4; n) DP 1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.17, DP 1-26.2, DP 11-20.6, DP 11-22.4 ja DP 11-25.3; 5 o) DP 1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.8, DP 1-26.3, DP 11-20.6, DP 11-22.5 ja DP 11-25.4; p) DP 1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.9, DP 1-26.4, DP 11-20.6, DP 11-22.6 ja DP 11-25.3 ja q) DP 1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.5, DP 1-26.1, DP 11-20.6, DP 10 11-22.7 ja DP 11-25.4.

19. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu peptidi käsittää alueiden seuraavia yhdistelmiä, jotka alueet on valittu ryhmästä: X,Y,Z,A,B,C,D, jossa X on DP 15 1-21.2 tai DP 1-21.7, Y on DF 1-22.2, Z on DP 1-23.1, DP I- 23,10, DP 1-23.11, DP 1-23.12, DP 1-23.13, DP 1-23.14, DP I- 23.15, DP 1-23.16, DP 1-23,17, DP 1-23.5, DP 1-23.6, DP 1-23.7, DP 1-23.8 tai DP 1-23.9; A on DP 1-26.1, DP 1-26.2, DP 1-26.3, DP 1-26.4 tai DP 1-26.5, B on DP 1-20.6 tai DP 11-20.7, C on DP 20 11-22, DP 11-22.6, DP 11-22.7, DP 11-22.8, DP 11-22,9, DP II- 22.10, DP 11-22.11, DP 11-22.3, DP 11-22.4 tai DP 11-22.5 ja ; . D on DP 11-25.2, DP 11-25.3 tai DP 11-25.4, edellyttäen, että X, • ♦ * ***** Y, Z, A, B, C, D ei ole alueiden seuraava yhdistelmä: DP 1-21.2, ♦ · ♦ Y/ DF 1-22.2, DP 1-23.1, DP 1-26.1, DP 11-20.6, DP 11-22 ja DP II-- ί·:·ί 25 25.2. • · · • ♦ : 20. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, ··· · että mainitun peptidin aminohappojen sekvenssijärjestys on spesifinen mainitun järjestyksen kaavan ollessa ADYCZBX, jossa X :***: 30 on DP 1-21.2 tai DP 1-21.7, Y on DF 1-22.2, Z on DP 1-23.1, DP ··· 1-23,10, dp 1-23.11, dp 1-23.12, dp 1-23.13, dp 1-23.14, dp i- / . 23.15, DP 1-23.16, DP 1-23,17, DP 1-23.5, DP 1-23.6, DP 1-23.7, • · · DP 1-23.8 tai DP 1-23.9; A on DP 1-26.1, DP 1-26.2, DP 1-26.3, • · *···* DP 1-26.4 tai DP 1-26.5, B on DP 1-20.6 tai DP 11-20.7, C on DP :T: 35 11-22, DP 11-22.6, DP 11-22.7, DP 11-22.8, DP 11-22,9, DP ··· • · • · ··· 11-22.10, DP 11-22.11, DP 11-22.3, DP 11-22.4 tai DP 11-22.5 ja D on DP 11-25.2, DP 11-25.3 tai DP 11-25.4, edellyttäen, että ADYCZBX ei ole DP 1-26.1, DP 11-25.2, DF 1-22.2, DP 11-22, DP I- 23.1, DP 11-20.6 eikä DP 1-21.2 vastaavasti. 5

21. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitun peptidin aminohappojen sekvenssijärjestys on spesifinen mainitun järjestyksen kaavan ollessa DYZCABX, jossa X on DP 1-21.2 tai DP 1-21.7, Y on DF 1-22.2, Z on DP 1-23.1, DP 10 1-23,10, DP 1-23.11, DP 1-23.12, DP 1-23.13, DP 1-23.14, DP I-23.15, DP 1-23.16, DP 1-23,17, DP 1-23.5, DP 1-23.6, DP 1-23.7, DP 1-23.8 tai DP 1-23.9; A on DP 1-26.1, DP 1-26.2, DP 1-26.3, DP 1-26.4 tai DP 1-26.5, B on DP 1-20.6 tai DP 11-20.7, C on DP II- 22, DP 11-22.6, DP 11-22.7, DP 11-22.8, DP 11-22,9, DP 15 11-22.10, DP 11-22.11, DP 11-22.3, DP 11-22.4 tai DP 11-22.5 ja D on DP 11-25.2, DP 11-25.3 tai DP 11-25.4, edellyttäen, että DYZCAXB ei ole DP II-25.2, DF 1-22.2, DP 1-23.1, DP 11-22, DP I- 26,1, DP 1-21.2 eikä DP 11-20.6 vastaavasti.

22. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitun peptidin aminohapposekvenssien järjestys on βρει .·. sifinen mainitun järjestyksen kaavan ollessa DXZACBY, jolloin X • · · "I.1 2 3 on DP 1-21.2 tai DP 1-21.7, Y on DF 1-22.2, Z on DP 1-23.1, DP • · · V. 1-23,10, DP 1-23.11, DP 1-23.12, DP 1-23.13, DP 1-23.14, DP I- • » · **V 25 23.15, DP 1-23.16, DP 1-23,17, DP 1-23.5, DP 1-23.6, DP 1-23.7, • 0 · DP 1-23.8 tai DP 1-23.9; A on DP 1-26.1, DP 1-26.2, DP 1-26.3, • · ·1·: : DP 1-26.4 tai DP 1-26.5, B on DP 1-20.6 tai DP 11-20.7, C on DP • · · : 11-22, DP 11-22.6, DP 11-22.7, DP 11-22.8, DP 11-22,9, DP II- 22.10, DP 11-22.11, DP 11-22.3, DP 11-22.4 tai DP 11-22.5 ja 30 D on DP II-25.2, DP 11-25.3 tai DP 11-25.4, edellyttäen, että ·:··: DXZACBY ei ole DP 11-25.2, DP 1-21.2, DP 1-23.1, DP 11-26.1, DP j 1-22, DP 11-20.6 ja DF 1-22.2, vastaavasti. • · · • · • ·· • · • · • · · • · · • · · • · · · · • · 2 • · 3

23. Eristetty nukleiinihappo, tunnettu siitä, että siinä on sekvenssi, joka koodaa patenttivaatimuksen 16 mukaista peptidiä tai sen osaa.

24. Menetelmä eristetyn peptidin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että se valmistetaan isäntäsolussa, joka on transformoitu patenttivaatimuksen 23 mukaisella nukleiinihapolla.

25. Menetelmä suvun Dermatophagoides proteiiniallergeenin 10 eristetyn peptidin valmistamiseksi, joka peptidi käsittää mainitun proteiiniallergeenin vähintään yhden T-soluepitoopin mainitun peptidin kaavan ollessa Xn-Y-Zm, jossa Y on aminohappo, joka on valittu ryhmästä, joka koostuu: a) DP 1-21.7:stä, 15 b) DP 1-23.10:Stä, c) DP 1-23.11:stä, d) DP 1-23.12:sta, e) DP 1-23.5:Stä, f) DP 1-23.6:sta, 20 g) DP 1-23.7:Stä, h) DP 1-23.8:Sta, : i) DP 1-23.9: stä, • · · j) DP 1-26.2: Sta, .* . k) DP 11-20.7:stä, • · · 25 1) DP 11-22.6:sta, • · · •/•j m) DP II-22.3: sta, ·*·· i n) DP 11-22.4: stä, • · · V : o) DP 11-22.5:stä, p) DP 11-25.3:sta, 30 q) DP II-25.4: stä, *:**: r) DP 1-23.13: sta, X; s) DP I-23.14:stä, t) DP 1-23.15: stä, • · ’*:·* u) DP I- 23.16: Sta, •V#: 35 v) DP 1-23.17: stä, • · · • · • · • · · w) DP 1-26.3:sta, x) DP 1-26.4:Stä, y) DP 1-26.5:Stä, z) DP 11-22.7:stä, 5 a') DP 11-22.8:Sta, b') DP 11-22.9:Stä, c') DP 11-22.10:stä ja d') DP 11-22.11:stä, jotka kaikki on esitetty kuviossa 26, jolloin Xn ovat aminohappotähteitä, jotka ovat Y:n aminotermi-10 naalin vieressä mainitun proteiiniallergeenin aminohapposekvenssissä, jolloin Zm ovat aminohappotähteitä, jotka ovat Y:n kar-boksiterminaalin vieressä mainitun proteiiniallergeenin aminohapposekvenssissä, jolloin n on 0-30 ja m on 0, tunnettu siitä, että peptidi valmistetaan synteettisellä menetelmällä tai 15 yhdistelmä-DNA-tekniikalla.

26. Patenttivaatimuksen 25 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että n on 0 ja m on 0. • · • · · • · * • · · · • · · • · · • · · • · • · · • · · • · ··· ···· • ♦ • · · • · « • · · · ··♦ • · · • · · ··· • · • · • · » ♦ • · • · • · « • ·· • · ··· · • · ··· • · · • · · • · · ··· • · • · ···