FI104906B - Menetelmä henkilön huonepölypunkkiherkkyyden havaitsemiseksi - Google Patents

Description

104906

Menetelmä henkilön huonepölypunkkiherkkyyden havaitsemiseksi Tämä hakemus on jakamalla erotettu hakemuksesta 9S4895.

«

Viimeaikaisissa raporteissa on dokumentoitu ryhmän I (esim. Der p I ja Der f 1) ja 5 ryhmän Π (esim. Der p Π ja Der f Π) proteiiniallergeenivasteiden tärkeys huonepöly- punkkiallergiassa. On dokumentoitu esimerkiksi, että yli 60 %:lla potilaista vähintään 50 % punkin vastaisista vasta-aineista on suuntautunut näitä proteiineja vastaan (esim. Lind, P. et ai., Allergy, 39:259-2741. van der Zee, J.S. et ai., Journal Allergy and Clinical Immunology, 81:884-896 (1988)). On mahdollista, että lapsien reaktii-10 visuusaste ryhmän I ja ryhmän Π allergeeneihin on suurempi (Thompson, P.J. et ai, Immunology, 64:301-314 (1988)). Allergisuuteen suvun Dermatofagoides (D) punkeille liittyy sellaisia tiloja kuin astma, nuha ja virhepaikkainen ihottuma. Kaksi lajia, D. pteronyssinus ja D. farinae, ovat vallitsevia ja siksi on ponnisteltu merkittävästi yrittäen identifioida näiden kahden lajin tuottamat allergeenit.

15 Sekä D. pteronyssinusista että D. farinaesta peräisin olevia pääasiallisia allergeenejä on yritetty karakterisoida. Näin ollen useissa julkaisuissa on raportoitu useiden allergeenien mukaan lukien Der p I (Thomas, W.R. et ai., International Archives of Allergy and Applied Immunology, 85:127-129 (1988) ja Chua, K.Y. et ai., Journal of Experimental Medicine, 167:175-182 (1988)), Der p Π (Chua, K.Y. et ai., Intema-20 tional Archives of Allergy and Applied Immunology, 91:118-123 (1990)), Der f I (Dilworth, R.J. et ai., Clinical and Experimental Allergy, 21:25-32 /1981), Der f II (Yuuki, T. et ai., Japan Journal Allergol., 39:557-461 (1990) ja Trudinger, M. et al., : ' - Clinical and Experimental Allergy, 21:33-37 (1991)) ja alhaisen molekyylipainon allergeenin (Ovey, E.R. et ai., Journal of Experimental Medicine, 170:1457-1462 25 (1989)) täydellinen nukleotidisekvenssi.

Der p I:tä ja Der p H:ta koodaavien cDNA:iden julkaistut nukleotidisekvenssit osoittavat, että nämä kaksi proteiinia ovat erittäin homologisia aminohappotasolla (81 %:n identtisyys) ja että kypsät proteiinituotteet koostuvat vastaavasti 222 ja 223 * tähteestä (Chua, K.Y. et ai., Journal of Experimental Medicine, 167:175-182 (1988) -- 30 ja Dilworth, R.J. et ai., supra)). Proteiiniallergeenit Der p I ja Der f Π koostuvat kumpikin 129 tähteestä ja ne ovat myös erittäin homologisia (88 %:n identtisyys) aminohapposekvenssiltään (Trudinger, M et ai., supra, Yuuki, T. et ai., supra, Chua, K.Y. et ai., International Archives of Allergy and Applied Immunology 91:118-123 (1990)).

2 104906

Der p I.tä ja Der p Uta koodaavien cDNA.iden eristäminen on mahdollistanut vasta-aineiden sitoutumistutkimukset rekombinanttisissa antigeeneissä (Green, W.K. et ai., International Archives of Allergy and Applied Immunology, 92:30-38 (1990), Chua, K.Y. et ai., International Archives of Allergy and Applied Immunology, 5 91:124-129 (1990)). Der p I:n komplementaarisia DNA-fragmentteja on ilmennetty £. colissa ja yhdistetyillä ihmisen punkkiallergisilla IgE-seerumeilla suoritetut IgE-sitoutumistutkimukset ovat osoittaneet sitoutuvia alueita ja sitoutumattomia alueita kaikkialla molekyylissä (Thomas, W.R. et ai., £pitopes of Atopic Allergens, Proceedings of Workshop from XIV Congress of the European Academy of Allergy and 10 Clinical Immunology, Berlin, Sept. 1989, s. 77-82). Der p I:n T-soluepitoopit on raportoitu (O'Hehir, R.E. et al., Annual Review Immunology, 9:67-95 (1991), Stewart, G.A. et al., Epitopes of Atopic Allergens, Proceedings of Workshop from XIV Congress of the European Academy of Allergy and Clinical Immunology, Berlin, Sept. 1989, s. 41-47), Yessel, H. et al., T cell Activation in Health and Disease: 15 Discrimination Between Immunity and Tolerance, Conference 22-26 Sept., 1990, Trinity College, Oxford, UK ja Hessel, H. et al., Journal of Immunology, 148 (3):738-745 (1.2.1992).

Esillä oleva keksintö saa aikaan henkilön huonepölypunkkiherkkyyden diagnosoin-timenetelmiä ja terapeuttisia koostumuksia, jotka käsittävät yhtä tai useampaa kek-20 sinnön mukaista peptidiä.

Piirustusten kuvaus

Kuvio 1 esittää D. pteronyssinusista ja D. farinaesta peräisin olevien ryhmän I ja Γ ryhmän Π allergeenien alakloonaamista ja ilmentämistä.

Kuvio 2 esittää Der p I:n ja Der f I:n ilmentämisessä käytettyjä adaptoreita ja kuvio 25 2b esittää Der f Π ja Der p Π vahventamisen aloittajia ja Der f Π:η mutageneesin aloittajaa.

Kuvio 3 esittää erilaisia halutun pituisia peptidejä, jotka on johdettu Der p I- ja Der p Π -proteiiniallergeeneistä.

Kuvio 4 esittää erilaisia halutun pituisia peptidejä, jotka on johdettu Der f I- ja Der f 30 Π -proteiiniallergeeneistä.

Kuvio 5 on graafinen esitys, joka kuvaa 33 potilaasta peräisin olevien T-solulinjojen vasteita, jotka on herätetty in vitro joko puhdistetulle luontaiselle (N) tai rekombi-nanttiselle (R) Der p I -proteiinille ja vaste erilaisille limittyville Der p I -peptideille 3 104906 on analysoitu vasteprosentteina sekä T-stimulointi-indeksinä (S.I.) vähintään 2 testatussa henkilössä, positiivisten vasteiden peptidille keskimääräistä T-solustimulointi-indeksiä ja peptidivasteiden järjestykseen asetettua summaa.

Kuvio 6 on graafinen esitys, joka kuvaa 16 potilaasta peräisin olevien T-solulinjojen 5 vasteita, jotka on herätetty in vitro Der f I -proteiinille ja vaste erilaisille limittyville

Der f I -peptideille on analysoitu vasteprosentteina sekä (S.I.):nä vähintään 2 testatussa henkilössä, positiivisten vasteiden peptidille keskimääräistä T-solustimulointi-indeksiä ja peptidivasteiden järjestykseen asetettua summaa.

Kuvio 7 on graafinen esitys, joka kuvaa 14 potilaasta peräisin olevien T-solulinjojen 10 vasteita, jotka on herätetty in vitro Der p I -proteiinille ja vaste erilaisille limittyville Der p I -peptideille ja oleellisesti yhdenvertaisille Der p I -peptideille on analysoitu vasteprosentteina sekä (S.I.):nä vähintään 2 testatussa henkilössä, positiivisten vasteiden peptidille keskimääräistä T-solustimulointi-indeksiä ja peptidivasteiden järjestykseen asetettua summaa.

15 Kuvio 8 on graafinen esitys, joka kuvaa 8 potilaasta peräisin olevien T-solulinjojen vasteita, jotka on herätetty in vitro Der f I -proteiinille ja vaste erilaisille limittyville Der f I -peptideille ja oleellisesti yhdenvertaisille Der f I -peptideille on analysoitu vasteprosentteina sekä (S.I.):nä vähintään 2 testatussa henkilössä, positiivisten vasteiden peptidille keskimääräistä T-sohistimulointi-indeksiä ja peptidivasteiden jär-20 jestykseen asetettua summaa.

Kuvio 9 on graafinen esitys, joka kuvaa 29 potilaasta peräisin olevien T-solulinjojen vasteita, jotka on herätetty in vitro Der p Π -proteiinille ja vaste erilaisille limittyville Der p Π -peptideille on analysoitu vasteprosentteina sekä (S.I.):nä vähintään 2 testatussa henkilössä, positiivisten vasteiden peptidille keskimääräistä T-solustimuloin-25 ti-indeksiä ja peptidivasteiden järjestykseen asetettua summaa.

Kuvio 10 on graafinen esitys, joka kuvaa 10 potilaasta peräisin olevien T-solulinjo-.· jen vasteita, jotka on herätetty in vitro Der f Π -proteiinille ja vaste erilaisille limit- tyville Der f Π -peptideille on analysoitu vasteprosentteina sekä (S.I.):nä vähintään 2 testatussa henkilössä, positiivisten vasteiden peptidille keskimääräistä T-solustimu-30 lointi-indeksiä ja peptidivasteiden jäijestykseen asetettua summaa.

Kuvio 11 on graafinen esitys, joka kuvaa 10 potilaasta peräisin olevien T-solulin-jojen vasteita, jotka on herätetty in vitro Der f Π -proteiinille ja vaste erilaisille limittyville Der f Π -peptideille ja oleellisesti yhdenvertaisille Der f I -peptideille on 4 104906 analysoitu vasteprosentteina sekä (S.I.):nä vähintään 2 testatussa henkilössä, positiivisten vasteiden peptidille keskimääräistä T-solustimulointi-indeksiä ja peptidivas-teiden järjestykseen asetettua summaa.

Kuvio 12 on graafinen esitys, joka kuvaa 26 potilaasta peräisin olevien T-solulinjo-5 jen vasteita, jotka on herätetty in vitro Der p Π -proteiinille ja vaste erilaisille limittyville Der p Π -peptideille on analysoitu vasteprosentteina sekä (S.I.):nä vähintään 2 testatussa henkilössä, positiivisten vasteiden peptidille keskimääräistä T-solustimulointi-indeksiä ja peptidivasteiden jäijestykseen asetettua summaa.

Kuvio 13 on graafinen esitys, joka kuvaa 33 potilaasta peräisin olevien T-solulinjo-10 jen vasteita, jotka on herätetty in vitro Der p I -proteiinille ja vaste valituille Der p I -proteiiniallergeenistä johdetuille halutun pituisille peptideille on analysoitu vaste-prosentteina sekä (S.I.):nä vähintään 2 testatussa henkilössä, positiivisten vasteiden peptidille keskimääräistä T-solustimulointi-indeksiä ja peptidivasteiden järjestykseen asetettua summaa.

15 Kuvio 14 on graafinen esitys, joka kuvaa 9 potilaasta peräisin olevien T-solulinjojen vasteita, jotka on herätetty in vitro Der f I -proteiinille ja vaste valituille Der f I -proteiiniallergeenistä johdetuille halutun pituisille peptideille on analysoitu vasteprosentteina sekä (S.I.):nä vähintään 2 testatussa henkilössä, positiivisten vasteiden peptidille keskimääräistä T-solustimulointi-indeksiä ja peptidivasteiden jäijestyk-20 seen asetettua summaa.

Kuvio 15a on graafinen esitys, joka kuvaa 30 yhteensopivasta potilaasta peräisin olevien T-solulinjojen vasteita, jotka on herätetty in vitro Der p I -proteiinille ja vaste valituille Der p I ja Der f I -proteiiniallergeenistä johdetuille halutun pituisille peptideille on analysoitu vasteprosentteina sekä (S.I.):nä vähintään 2 testatussa hen-25 kilössä, positiivisten vasteiden peptidille keskimääräistä T-solustimulointi-indeksiä ja peptidivasteiden jäijestykseen asetettua summaa.

Kuvio 15b on graafinen esitys, joka on johdettu samoista tiedoista kuin kuvion 15a tiedot ja joka esittää Der p Iillä herätettyjen T-solujen vastetta edullisille Der ρ I -peptideille analysoituna vasteprosentteina sekä (S.I.)inä vähintään 2 testatussa hen-30 kilössä (kunkin pylvään yläpuolella), keskimääräistä T-solustimulointi-indeksiä (jokaisen pylvään yläpuolella suluissa) ja peptidivasteiden jäijestykseen asetettua summaa.

5 104m

Kuvio 16a on graafinen esitys, joka kuvaa 9 potilaasta peräisin olevien T-solulinjo-jen vasteita, jotka on herätetty in vitro Der f I -proteiinille ja vaste valituille Der f I ja Der p I -proteiiniallergeenistä johdetuille halutun pituisille peptideille on analysoitu vasteprosentteina sekä (S.I.)mä vähintään 2 testatussa henkilössä, ja vasteiden 5 keskimääräistä T-solustimulointi-indeksiä sekä vähintään 2:n S.I.itä peptidille.

Kuvio 16b on graafinen esitys, joka on johdettu samoista tiedoista kuin kuvion 16a tiedot ja joka esittää Der p Iillä herätettyjen T-solujen vastetta edullisille Der f I- ja Der p I -peptideille vasteprosentteina sekä (S.I.):nä vähintään 2 testatussa henkilössä ja vasteiden keskimääräistä T-solustimulointi-indeksiä sekä vähintään 2:n S.I.itä 10 peptidille.

Kuvio 17a on graafinen esitys, joka kuvaa 29 potilaasta peräisin olevien T-solujen vastetta, jotka on herätetty in vitro Der p Π -proteiinille ja vaste valituille Der p Π proteiinista johdetuille halutun pituisille peptideille on analysoitu vasteen T-solu-stimulointi-indeksillä sekä vähintään 2:n S.I.illä peptidille.

IS Kuvio 17b on graafinen esitys, joka kuvaa 30 Der p Π -proteiinille herätetyn potilaan vastetta, ja vaste valituille Der p Π proteiinista johdetuille halutun pituisille peptideille on analysoitu vasteprosenttina sekä S.I.:nä vähintään kahdessa testatussa henkilössä (kunkin pylvään yläpuolella), keskimääräistä T-solustimulointi-indeksiä (kunkin pylvään yläpuolella suluissa) sekä peptidivasteen järjestykseen sijoitettua 20 summaa (X-akseli).

Kuvio 18a on graafinen esitys, joka kuvaa 10 potilaasta peräisin olevien T-solujen ' vasteita, jotka on herätetty in vitro Der f Π -proteiinille, ja vaste valikoiduille Der p «a Π- ja Der f Π -proteiinista johdetuille halutun pituisille peptideille on analysoitu vasteen T-solustimulointi-indeksillä sekä vähintään 2:n S.I.illä peptidille.

25 Kuvio 18b on graafinen esitys, joka on johdettu samoista tiedoista kuin kuvion 18a tiedot ja joka esittää Der f Elliä herätettyjen T-solulinjojen vastetta edullisille Der p .. Π -peptideille analysoituna vasteprosentteina sekä (S.I.)inä vähintään 2 testatussa henkilössä (kunkin pylvään yläpuolella), keskimääräistä T-solustimulointi-indeksiä (kunkin pylvään yläpuolella suluissa) sekä peptidivasteiden järjestykseen laitettua 30 summaa (X-akseli).

Kuvio 18c on graafinen esitys, joka kuvaa 4 yhteensopivasta potilaasta peräisin olevien T-solulinjojen vasteita, jotka on herätetty in vitro punkkiiyhmän I allergeenillä ja vaste edullisille Der p I-ja Der f I -peptideille on analysoitu vasteprosentilla 6 104906 sekä S.I.:llä vähintään 2 testatusssa henkilössä ja positiivisten vasteiden keskimääräisellä T-solustimulointi-indeksillä peptidille.

Kuvio 18d on graafinen esitys, joka kuvaa 6 yhteensopivasta potilaasta peräisin olevien T-solulinjojen vasteita, jotka on herätetty in vitro punkkiryhmän Π allergee-5 nillä ja vaste edullisille Der p Π -peptideille on analysoitu vasteprosentilla sekä S.I.:llä vähintään 2 testatusssa henkilössä ja positiivisten vasteiden keskimääräisellä T-solustimulointi-indeksillä peptidille.

Kuviot 19a-19b ovat graafisia esityksiä tuloksista, jotka on saatu testistä, jossa testataan IgEin suoraa sitoutumista affiniteettipuhdistettuihin ja rekombinanttisiin Der p 10 I-ja Der p Π -proteiineihin ja tiettyihin limittyviin Der p I-ja Der p Π -proteiineihin.

Kuviot 20a-20b ovat graafisia esityksiä tuloksista, jotka on saatu testistä, jossa testataan lgE:n suoraa sitoutumista affiniteettipuhdistettuihin ja rekombinanttisiin Der f I-ja Der f Π -proteiineihin ja tiettyihin limittyviin Der f I-ja Der f Π -proteiineihin.

Kuviot 21a-21h ovat graafisia esityksiä tuloksista, jotka on saatu testistä, jossa testa-15 taan IgE:n suoraa sitoutumista seokseen, jossa on biokemiallisesti puhdistettuja punkkiallergeenejä (PMA) ja erilaisia Der p Iistä, Der f Iistä, Der p II:sta ja Der f II:sta johdettuja peptidejä.

Kuvio 22 on viiden Der p I -kloonin (a)-(e) aminohapposekvenssin yhdistetty esitys, joka valaisee Der p I -proteiinissa olevaa polymorfismia. Numerointi viittaa Der p 20 1(a) -kloonin sekvenssiin. Merkkiä (-) käytetään osoittamaan sitä, että Der p I -kloo nin aminohappotähde on identtinen Der p I(a):n vastaavien aminohapposekvenssien ’ kanssa tässä asemassa. Näiden kloonien aminohapposekvenssit osoittavat, että Der p

Iissä voi olla merkittävää vaihtelua ja viisi polymorfista aminohappoa löydetään viidestä sekvenssistä.

25 Kuvio 23 on kolmen Der p Π -kloonin (c), (1) ja (2) aminohapposekvenssin yhdistetty esitys, joka valaisee Der p Π -proteiinissa olevaa polymorfismia. Numerointi viittaa Der p 11(c) -kloonin sekvenssiin. Merkkiä (.) käytetään osoittamaan sitä, että Der p Π -kloonin aminohappotähde on identtinen Der p II(c):n vastaavan aminohappotähteen kanssa tässä asemassa.

30 Kuvio 24 on kuuden Der f Π -kloonin (so. pFLl, pFL2, MT3, MT5, MT18 ja MT16) aminohapposekvenssin yhdistetty esitys, joka valaisee Der f Π -proteiinissa olevaa polymorfismia. Numerointi viittaa Der f pLFl -kloonin sekvensseihin. Merk 7 104906 kiä (.) käytetään osoittamaan sitä, että Der f Π -kloonin aminohappotähde on identtinen Der f Π pFLl:n vastaavan aminohappotähteen kanssa tässä asemassa.

Kuvio 25 esittää modifioitujen peptidien aminohapposekvenssejä.

Kuvio 26 esittää keksinnön mukaisten modifioitujen peptidien aminohapposekvens-5 sejä.

Tässä hakemuksessa on esitetty eristettyjä modifioituja peptidejä, jotka on johdettu suvun Dermatophagoides pääasiallisista proteiiniallergeeneistä. Tässä käytettynä peptidi tai proteiinifiagmentti tarkoittaa aminohapposekvenssiä, jossa on vähemmän aminohappotähteitä kuin proteiinin kokonaisessa aminohapposekvenssissä. Tässä 10 käytettynä modifioitu peptidi tarkoittaa peptidiä, joka on johdettu suvun Deimato-phagoides proteiiniallergeenistä, jonka aminohapposekvenssi on muutettu amino-happosubstituutiolla, -deleetiolla tai -lisäyksellä. Hakemuksen mukaiset peptidit käsittävät modifioidut peptidit, jotka on johdettu Der p I:stä (SEQ ID NO: 1 ja 2), Der p lista (SEQ ID NO: 3 ja 4), Der f I:stä (SEQ ID NO: 5 ja 6) ja Der f E:sta (SEQ ID 15 NO: 7 ja 8), jotka käsittävät aUeigeenin vähintään yhden epitoopin.

Hakemuksen piiriin kuuluvat myös peptidit, jotka käsittävät vähintään kaksi aluetta jokaisen alueen käsittäessä suvun Dermatophagoides proteiiniallergeenin vähintään yhden T-soluepitoopin. Tällaisten peptidien jokainen alue on johdettu samanlaisesta tai erilaisesta punkkiallergeenista. Peptidit, jotka ovat immunologisesti samankaltai-20 siä (esim. vasta-aineeltaan tai T-soluristireaktiivisuudeltaan) kuin esillä olevat peptidit, kuuluvat myös keksinnön piiriin. Vasta-aineet, jotka ovat spesifisiä suvun Dermatophagoides proteiinialleigeenin peptidille, sitovat peptidit, jotka ovat samankaltaisia vasta-aineristireaktiivisuudeltaan. T-soluristireaktiivisuudeltaan immunologisesti samankaltaiset peptidit kykenevät reagoimaan samojen T-solujen kanssa kuin 25 esillä oleva peptidi.

, Hakemuksen mukaisia eristettyjä peptidejä voidaan valmistaa yhdistelmä-DNA-tek- *: nilkoilla isäntäsolussa, joka on transformoitu nukleiinihapolla, jossa on tällaista pep tidiä koodaava sekvenssi. Eristetyt peptidit voidaan myös valmistaa kemiallisella synteesillä. Joissakin rajoitetuissa tilanteissa eristetyt peptidit voidaan valmistaa 30 pilkkomalla kemiallisesti proteiiniallergeeni. Kun peptidi valmistetaan yhdistelmä-tekniikoilla, isäntäsoluja, jotka on transformoitu nukleiinihapolla, jossa on peptidiä tai nukleiinihpposekvenssin funktionaalista ekvivalenttia koodaava sekvenssi, viljellään väliaineessa, joka sopii soluille, ja peptidit voidaan puhdistaa soluviljelyväliai-neesta, isäntäsoluista tai molemmista käyttämällä peptidien ja proteiinien puhdis- g 104906 tusalaUa tunnettuja tekniikoita, kuten ioninvaihtokromatografiaa, geelisuodatuskro-matografiaa, ultrasuodatusta, elektroforeesia tai immunopuhdistamista vasta-aineilla, jotka ovat spesifisiä peptidille, suvun Dermatophagoides, josta ne on johdettu, proteiiniallergeenille tai sen osalle. Hakemuksen mukaiset eristetyt peptidit ovat 5 oleellisesti vapaita solumateriaalista tai viljelyväliaineesta, kun ne valmistetaan yh-distelmä-DNA-tekniikoilla, tai ne ovat oleellisesti vapaita kemiallisista prekursoreis-ta tai muista kemikaaleista, kun ne syntetoidaan kemiallisesti.

Esillä olevassa hakemuksessa esitetään ilmennysvektoreita ja isäntäsoluja, jotka on transformoitu hakemuksen mukaisten nukleiinihapposekvenssien ilmentämiseksi. 10 Punkkiallergeenia tai vähintään yhtä sen osaa koodaava nukleiinihapposekvenssi voidaan ilmentää bakteerisoluissa, kuten E. colissa, hyönteissoluissa (baculovirus), hiiva- tai nisäkässoluissa, kuten kiinalaisen hamsterin munasarjan soluissa (CHO). Sopivia ilmennysvektoreita, promoottoreita, tehostimia ja muita ilmentymisensäätö-elementtejä voidaan löytää Sambrook et al:n Molecular Cloning: A Laboratory Ma-15 nualista, toinen painos, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989). Alan ammattimiehet tuntevat muita sopivia ilmennysvektoreita, promoottoreita, tehostimia ja muita ilmennyselementtejä. Ilmentäminen nisäkäs-, hiiva- tai hyönteissoluissa johtaa yhdistelmämateriaalin osittaiseen tai täydelliseen glykosyloitumiseen ja kaikenlaisten ketjunsisäisten tai ketjunulkoisten disulfidisilto-20 jen muodostumiseen. Hiivassa ilmentämiseen sopivat vektorit käsittävät YepSeclin (Baldari et ai. (1987) Embo J. 6:229-234), pMFa:n (Kurjan ja Herskowitz (1982) Cell 30: 933-943), JRY88:n (Schultz et ai. (1987) Gene M: 113-123) ja pYES2:n (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Nämä vektorit ovat vapaasti saatavissa. Baculoviruksia ja nisäkäsilmennysjärjestelmiä on myös saatavissa. Esimerkiksi 25 baculovirusjärjestelmä on kaupallisesti saatavissa (PharMingen, San Diego, CA) hyönteissoluissa ilmentämiseen, kun taas pMSG on kaupallisesti saatavissa (Pharmacia, Piscataway, NJ) nisäkässoluissa ilmentämiseen.

E. colissa ilmentämiseen sopivat ilmentämisvektorit käsittävät mm. pTRC:n (Amann et ai. (1988) Gene, 69, 301-315), pGEX:n (Amrad Corp., Melbourne, Australia), 30 pMAL:n (N.E. Biolabs, Beverly, MA), pRIT5:n (Pharmacia, Piscataway, NJ), pEY-1 ld:n (Novagen, Madison, WI), Jameel et ai., (1990) J. Virol., 64:3963-3966 ja pSEM:n (Knapp et ai. (1990) BioTechniques, 8: 280-281). pTRC:n ja pET-lld:n käyttö esimerkiksi johtaa fuusioitumattoman proteiinin ilmentymiseen. pMAL:n, pRTT5:n, pSEM:n ja pGEX:n käyttö johtaa maltoosi E:hen sitoutuvaan proteiiniin 35 (pMAL), proteiiniin A (pRIT5), typistyneeseen β-galaktosidaasiin (PSEM) tai glu-tationi-S-transferaasiin (pGEX) fuusioituneen allergeenin ilmentymiseen. Kun hake- 9 104906 muksen mukainen punkkiproteiiniallergeeni, soi fragmentti tai fragmentteja ilmennetään fuusioproteiinina, on erityisen edullista viedä entsymaattinen pilkkoutumis-paikka kantajaproteiinin ja puniddproteiiniallergeenin tai sen fragmentin välissä olevaan fuusioliittymään. Punkkiproteiiniallergeeni tai sen fragmentti voidaan ottaa 5 sitten talteen fuusioproteiinista pilkkomalla entsymaattisesti entsymaattisessa kohdassa ja puhdistamalla biokemiallisesti käyttäen konventionaalisia proteiinien ja peptidien puhdistustekniikoita. Sopivat entsymaattiset pilkkomiskohdat käsittävät verenhyytymistekijä Xa:n tai trombiinin pilkkomiskohdat, mihin tarkoitukseen sopivia pilkkomisentsyymeitä ja -protokollia on kaupallisesti saatavissa esimerkiksi 10 Sigma Chemical Companystä, St Louis, MO, ja N.E. Biolabsista, Beverly, MA. Erilaisilla vektoreilla on myös erilaisia promoottorialueita, jotka mahdollistavat konstitutiivisen tai indusoitavan ilmentämisen esimerkiksi IPTG-induktion (PRTC, Amann et ai., (1988) supra, pET-lld, Novagen, Madison, WI) tai lämpötilainduk-tion (pRIT5. Pharmacia, Piscataway, NJ).

15 Esillä olevan hakemuksen mukaisten edullisten peptidien saamiseksi punkkialler-geeni jaetaan esimerkissä ΙΠ selostetusti halutun pituisiksi ei-limittyviksi peptideiksi tai halutun pituisiksi limittyviksi peptideiksi, jotka voidaan valmistaa rekombinantti-sesti, synteettisesti tai joissakin rajoitetuissa tilanteissa pilkkomalla allergeeni kemiallisesti. Vähintään yhden T-soluepitoopin sisältävät peptidit kykenevät saamaan 20 esiin T-soluvasteen, kuten stimuloinnin (so. proliferaation tai lymfokiinin erittymisen) ja/tai ne kykenevät indusoimaan T-soluanergiaa (so. sietäminen). Peptidien, jotka sisältävät vähintään yhden T-soluepitoopin, määrittämiseksi, eristetyt peptidit testataan esimerkiksi T-solubiologiatekniikoilla sen määrittämiseksi, saavatko pep-. ' tidit esiin T-soluvasteen vai indusoivatko ne T-soluanergiaa. Ne peptidit, joiden ha- 25 valtaan saavan aikaan T-soluvasteen tai indusoivan T-soluanergiaa, määritetään sellaisiksi, että niissä on T-soluja stimuloivaa aktiivisuutta.

Tässä kuvatun työn tuloksena on valmistettu modifioituja peptidejä, jotka on johdettu punkkiallergeeneistä ja jotka käsittävät vähintään yhden T-soluepitoopin. T-solu-... epitooppien uskotaan olevan osallisena immuunivasteen punkkiallergian kliinisistä 30 oireista vastuussa oleviin punkkiaUetgeeiieihin(-aUergeeneihin) aloittamisesta ja jatkamisesta. Näiden T-soluepitooppien on ajateltu laukaisevan varhaiset toimintavaiheet T-auttajasolutasolla sitoutumalla sopivaan HLA-molekyyliin antigeenin pinnalla, joka edustaa solua, ja stimuloivan relevanttia T-solualapopulaatiota. Nämä tapahtumat johtavat T-soluproliferaatioon, lymfokiinin erittymiseen, paikallisiin tulehdus-35 reaktioihin, lisäimmuunisolujen rekrytoinnin kohtaan ja B-solukaskadin aktivoitumiseen, mikä johtaa vasta-aineiden tuottamiseen. Näiden vasta-aineiden eräs isotyyppi, >0 104906

IgE, on olennaisesti tärkeä allergisten oireiden kehittymisessä ja sen tuotantoon vaikuttaa varhain tapahtumakaskadissa T-auttajasolutasolla erittyneiden lymfokiinien luonne. T-soluepitooppi on peruselementti tai T-solureseptorin tunnistaman alueen pienin yksikkö, jolloin epitooppi käsittää aminohappotähteitä, jotka ovat oleellisia 5 reseptoritunnistukselle ja jotka voivat olla vierekkäisiä tai ei-vierekkäisiä proteiinin aminohapposekvenssissä.

Eräs esillä olevan hakemuksen peptidi tai sen osa käsittää proteiiniallergeenin vähintään yhden T-soluepitoopin ja sillä on kaava Χ,,-Υ-Ζ,η. Kaavan mukaisesti Y on aminohapposekvenssi, joka on valittu ryhmästä, joka koostuu: DP I-21.7:stä, DP Ι-ΙΟ 23.10:stä, DP 123.1 l:stä, DP 1-23.12:sta, DP I-23.5:stä, DP I-23.6:sta, DP I-23.7:stä, DP I-23.8:sta, DP I-23.9:stä, DP I-26.2:sta, DP II-20.7:stä, DP II-22.6:sta, DP n-22.3:sta, DP D-22.4:stä, DP H-22.5:stä, DP 11-25.3 :sta, DP II-25.4:stä, DP I-23.13:sta, DP I-23.14:stä, DP I-23.15:stä, DP I- 23.16:sta, DP I-23.17:stä, DP 1-26.3 :sta, DP I-26.4:stä, DP I-26.5:stä, DP n-22.7:stä, DP II-22.8:sta, DP 15 H-22.9:stä, DP 11-22.10:stä ja DP Π-22.11 :stä, jotka kaikki on esitetty kuviossa 26.

Lisäksi Xn ovat aminohappotähteitä, jotka ovat Y:n aminotenninaalin vieressä pro-teiiniallergeenin aminohapposekvenssissä, ja Zm ovat aminohappotähteitä, jotka ovat Y:n karboksiterminaalin vieressä proteiiniallergeenin aminohapposekvenssissä.

Hakemuksen mukaisesti saadaan aikaan myös peptideiä, jotka käsittävät vähintään 20 kaksi aluetta jokaisen alueen käsittäessä suvun Dermatophagoides proteiiniallergeenin vähintään yhden T-soluepitoopin, jokainen alue käsittää vähintään suunnilleen seitsemän aminohappotähdettä. Nämä peptidit, jotka käsittävät vähintään kaksi ··. . aluetta, voivat käsittää niin monta aminohappotähdettä kuin halutaan ja ne käsittävät edullisesti vähintään noin 14, viedä edullisemmin vähintään noin 30 ja edullisemmin 25 vähintään noin 40 punkkiallergeenin aminohappotähdettä. Jokainen tällaisen peptidin alue voi käsittää korkeintaan 45 aminohappotähdettä pituudeltaan ja edullisemmin korkeintaan 40 tähdettä pituudeltaan ja edullisimmin korkeintaan 30 aminohappotähdettä pituudeltaan, koska alueen pituuden muutokset voivat vaikeuttaa peptidi- •.

v synteesiä sekä ei-toivottavan ominaisuuden (esimerkiksi immunoglubuliinia sitovan 30 tai entsymaattisen aktiivisuuden) retentiota, joka johtuu peptidin ja proteiiniallergee nin, josta se on johdettu, välisen konformationaalisen samankaltaisuuden ylläpitämisestä. Haluttaessa alueiden aminohapposekvenssit voidaan valmistaa ja liittää yhteen liittäjällä, jotta parannetaan antigeeniä edustavien solujen käsittelyn herkkyyttä. Tällainen liittäjä voi olla mikä tahansa ei-epitooppiaminohapposekvenssi tai 35 jokin muu sopiva liittävä tai yhdistävä aine. Jotta saadaan edullisia peptidejä, jotka 1049©!$ π käsittävät vähintään kaksi aluetta, joista jokainen käsittää vähintään yhden T-soluepitoopin, alueet järjestetään konfiguraatioon, joka on erilainen kuin alueiden luontaisesti esiintyvä konfiguraatio allergeenissä tai erilaisten punkkiproteiiniallergee-nien yhdistelmässä. Esimerkiksi alueet, jotka sisältävät T-soluepitoopin (-epitooppe-. S ja), voidaan jäljestää ei-vierekkäiseen konfiguraatioon ja ne voidaan johtaa edulli sesti samasta proteiiniallergeenistä tai proteiiniallergeenien yhdistelmästä. Ei-vie-rekkäisyys on määritetty T-soluepitoopin (-epitooppeja) sisältävien alueiden järjestelyksi, joka on erilainen kuin proteiiniallergeenissä olevan luontaisen aminohappo-sekvenssin, josta alueet on johdettu. Lisäksi T-soluepitooppeja sisältävät ei-vierek-10 käiset alueet voidaan järjestää ei-jaksoittaiseen järjestykseen (esim. järjestykseen, joka on erilainen kuin luontaisen proteiinialleigeenm aminohappojen järjestys, joista T-soluepitoopin (-epitooppeja) sisältävä alue on johdettu, jossa aminohapot on järjestyneet aminoterminaalista karboksiterminaaliin). Peptidi voi käsittää vähintään 15 %, vähintään 30 %, vähintään 50 % tai korkeintaan 100 % punkkiallergeenin ΤΙ 5 soluepitooppeja.

Yksittäiset peptidialueet voidaan valmistaa ja testata sen määrittämiseksi, mitkä alueet sitoutuvat punkkiallergeenille spesifiseen immunoglobuliini E:hen ja mitkä tällaisista alueista aiheuttavat välittäjien (esim. histamiinin) vapautumisen syöttösoluista tai basofiileistä. Tällaiset peptidialueet, joiden havaittiin sitoutuvan immunoglo-20 buliini E:hen ja aiheuttavan välittäjien vapautumista syöttösoluista tai basofiileistä enemmän kuin suunnilleen 10-15 %:sta testattuja allergisia seerumeja, eivät sisälly peptidialueisiin, jotka on järjestetty keksinnön edullisten peptidien muodostamiseksi.

• »

Edulliset peptidit voivat sisältää kaksi tai useampia alueita, jotka on johdettu samas-25 ta tai erilaisista punkkiallergeeneistä (esim. Dep I, Der p Π, Der f I ja Der f Π). Esimerkiksi yksi alue voidaan johtaa Der p I:stä ja toinen alue voidaan johtaa Der p IEsta, yksi alue voidaan johtaa Der p I.stäja toinen alue voidaan johtaa Der f I:stä, yksi alue voidaan johtaa Der p IEsta ja toinen alue voidaan johtaa Der f Estä, yksi ·:· alue voidaan johtaa Der p IEsta ja toinen alue voidaan johtaa Der f IEsta, yksi alue 30 voidaan johtaa Der p Estä ja toinen alue voidaan johtaa Der f IEsta ja yksi alue voidaan johtaa Der f Estä ja toinen alue voidaan johtaa Der f IEsta. Lisäksi alueet voidaan johtaa samasta proteiiniallergeenistä, esim Der p Estäjä Der p Estä jne.

Edulliset peptidit käsittävät erilaisia kahden tai useamman alueen yhdistelmiä jokaisen alueen käsittäessä suvun Dermatophagoides proteiiniallergeenin vähintään yh-35 den T-soluepitoopin, alueet voidaan johtaa suvun Dermatofagoides samoista tai eri- 12 104906

laisista proteiiniallergeeneistä, jolloin vähintään yksi alue käsittää aminohapposekvenssin, joka on valittu seuraavasta ryhmästä: DP 1-21.1 (SEQ ID NO: 27), DP

1-21.2 (SEQ ID NO: 28), DP 1-22.1 (SEQ ID NO: 29), DP 1-23.1 (SEQ ID NO: 33), DP 1-25.2 (SEQ ID NO: 36), DP 1-26.1 (SEQ ID NO: 37), DP 1-28.1 (SEQ ID NO: 5 39), DP 1-1 (SEQ ID NO: 9), DF-I-1 (SEQ ID NO: 72), DF-I-21.1 (SEQ ID NO: 90), DF-I-22.1 (SEQ ID NO: 92), DF-I-23.1 (SEQ ID NO: 95), DF-I-25.1 (SEQ ID NO: 97), DP Π-l (SEQ ID NO: 41), DP Π-1.2 (SEQ ID NO: 58), DP Π-2.0 (SEQ ID NO: 56), DP Π-20.3 (SEQ ID NO: 53), DP Π-21 (SEQ ID NO. 62), DP Π-22 (SEQ ID NO: 63), DP Π-25 (SEQ ID NO: 69), DP Π-25.2 (SEQ ID NO: 71) DF Π-2 (SEQ 10 ID NO: 104), DF Π-4.5 (SEQ ID NO: 107), DF-H-15 (SEQ ID NO: 109), DF Π-17 (SEQ ID NO: 111), DF Π-19.1 (SEQ ID NO: 114), DF 1-22.2 (SEQ ID NO: 93) ja DP Π-20.6 (SEQ ID NO: 56), jotka kaikki on esitetty kuvioissa 3-4 ja joissa vähintään yksi alue käsittää aminohapposekvenssin, joka on valittu ryhmästä, joka koostuu: DP I-21.7:stä, DP I-23.10:stä, DP I23.11:stä, DP I-23.12:sta, DP I-23.5:stä, DP 15 I-23.6:sta, DP I-23.7:stä, DP I-23.8:sta, DP I-23.9:stä, DP I-26.2:sta, DP II-20.7:stä,

DP n-22.6:sta, DP II-22.3:sta, DP II-22.4:stä, DP II-22.5:stä, DP Π- 25.3:sta, DP n-25.4:stä, DP I-23.13:sta, DP I-23.14:stä, DP I-23.15:stä, DP I-23.16:sta, DP

I-23.17:stä, DP I-26.3:sta, DP I-26.4:stä, DP I-26.5:stä, DP II-22.7:stä, DP II-22.8:s-ta, DP II-22.9:stä, DP D-22.10:stä ja DP II22.11:stä, jotka kaikki on esitetty kuvios-20 sa 26.

Edulliset peptidit käsittävät kahden tai useamman alueen yhdistelmän (jokaisella alueella on kuvioissa 3, 4 ja 5 esitetty aminohapposekvenssi) mukaan lukien: DP I- 21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.13, DP 1-26.1, DP Π-20.6, DP Π-22.3 ja DP Π-25.2; DP I-.. 21.2, DF 1-22.2, DP 1-23.10, DP 1-26.2, DP 1-20.6, DP Π-22.4 ja DP Π-25.3, DP I-

25 21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.11, DP 1-26.3, DP Π-20.7, DP Π-22.5 ja DP Π-25.4; DP

1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.12, DP 1-26.4, DP Π-20.6, DP Π-22.6 ja DP Π-25.2; DP

1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.5, DP 1-26.5, DP Π-20.7, DP Π-22.7 ja DP Π-25.3; DP

1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.6, DP 1-26.2, DP Π-20.6, DP Π-22.8 ja DP Π-25.4; DP

1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.7, DP 1-26.3, DP Π-20.7, DP Π-22.9 ja DP Π-25.3; DP 30 1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.8, DP 1-26.4, DP Π-20.6, DP Π-22.3 ja DP Π-25.4; DP

1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.9, DP 1-26.1, DP Π-20.7, DP Π-22.4 ja DP Π-25.3; DP

1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.13, DP 1-26.2, DP Π-20.6, DP Π-22.5 ja DP Π-25.4; DP

1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.14; DP 1-26.3, DP Π-20.7, DP Π-22.6 ja DP Π-25.3; DP

1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.15, DP 1-26.4, DP Π-20.6, DP Π-22.6 ja DP Π-25.3; DP

35 1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.16, DP 1-26.5, DP Π-20.6, DP Π-22.3 ja DP Π-25.4; DP

1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.17, DP 1-26.2, DP Π-20.6, DP Π-22.4 ja DP Π-25.3; DP

1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.8, DP 1-26.3, DP Π-20.6, DP Π-22.5 ja DP Π-25.4; DP

13 104906

1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.9, DP 1-26.4, DP Π-20.6, DP Π-22.6 ja DP Π-25.3 ja DP

1-21.7, DF 1-22.2, DP 1-23.5, DP 1-26.1, DP Π-20.6, DP Π-22.7 ja DP Π-25.4.

Muut edulliset peptidit käsittävät vähintään kaksi seuraavaa alueiden yhdistelmää missä tahansa jäijestyksessä: X,Y,Z,A,B,C,D, jossa X on DP 1-21.2 tai DP 1-21.7, Y 5 on DF 1-22.2, Z on DP 1-23.1, DP 1-23,10, DP 1-23.11, DP 1-23.12, DP 1-23.13, DP 1-23.14, DP 1-23.15, DP 1-23.16, DP 1-23,17, DP 1-23.5, DP 1-23.6, DP 1-23.7, DP 1-23.8 tai DP 1-23.9; A on DP 1-26.1, DP 1-26.2, DP 1-26.3, DP 1-26.4 tai DP 1-26.5, B on DP 1-20.6 tai DP Π-20.7, C on DP Π-22, DP Π-22.6, DP Π-22.7, DP Π-22.8, DP Π-22,9, DP Π-22.10, DP Π-22.11, DP Π-22.3, DP Π-22.4 tai DP Π-22.5 ja D on 10 DP Π-25.2, DP Π-25.3 tai DP Π-25.4, edellyttäen, että X, Y, Z, A, B, C, D ei ole alueiden seuraava yhdistelmä: DP 1-21.2, DF 1-22.2, DP 1-23.1, DP 1-26.1, DP Π-20.6, DP Π-22 ja DP Π-25.2.

Toinen edullinen peptidi käsittää aminohappojen spesifisen sekvenssijäijestyksen mainitun sekvenssijäijestyksen kaavan ollessa seuraava:

15 ADYCZBX

jossa X on DP 1-21.2 tai DP 1-21.7, Y on DF 1-22.2, Z on DP 1-23.1, DP 1-23,10, DP 1-23.11, DP 1-23.12, DP 1-23.13, DP 1-23.14, DP 1-23.15, DP 1-23.16, DP 1-23,17, DP 1-23.5, DP 1-23.6, DP 1-23.7, DP 1-23.8 tai DP 1-23.9; A on DP 1-26.1, DP 1-26.2, DP 1-26.3, DP 1-26.4 tai DP 1-26.5, B on DP 1-20.6 tai DP Π-20.7, C on 20 DP Π-22, DP Π-22.6, DP Π-22.7, DP Π-22.8, DP Π-22,9, DP Π-22.10, DP Π-22.11, DP Π-22.3, DP Π-22.4 tai DP Π-22.5 ja D on DP Π-25.2, DP Π-25.3 tai DP Π-25.4, . ; edellyttäen, että ADYCZBX ei ole DP 1-26.1, DP Π-25.2, DF 1-22.2, DP Π-22, DP

1-23.1, DP Π-20.6 eikä DP 1-21.2 vastaavasti.

Toinen edullinen peptidi käsittää aminohappojen spesifisen sekvenssijäijestyksen 25 mainitun sekvenssijäijestyksen kaavan ollessa seuraava:

DYZCABX

• jossa X on DP 1-21.2 tai DP 1-21.7, Y on DF 1-22.2, Z on DP 1-23.1, DP 1-23,10, DP 1-23.11, DP 1-23.12, DP 1-23.13, DP 1-23.14, DP 1-23.15, DP 1-23.16, DP 1-23,17, DP 1-23.5, DP 1-23.6, DP 1-23.7, DP 1-23.8 tai DP 1-23.9; A on DP 1-26.1, 30 DP 1-26.2, DP 1-26.3, DP 1-26.4 tai DP 1-26.5, B on DP 1-20.6 tai DP Π-20.7, C on DP Π-22, DP Π-22.6, DP Π-22.7, DP Π-22.8, DP Π-22,9, DP Π-22.10, DP Π-22.11, DP Π-22.3, DP Π-22.4 tai DP Π-22.5 ja D on DP Π-25.2, DP Π-25.3 tai DP Π-25.4, 14 104906 edellyttäen, että DYZCAXB ei ole DP Π-25.2, DF 1-22.2, DP 1-23.1, DP Π-22, DP 1-26,1, DP 1-21.2 eikä DP Π-20.6 vastaavasti.

Vielä eräs edullinen peptidi käsittää aminohapposekvenssien spesifisen sekvenssijär-jestyksen mainitun sekvenssijäijestyksen kaavan ollessa seuraava:

5 DXZACBY

jossa X on DP 1-21.2 tai DP 1-21.7, Y on DF 1-22.2, Z on DP 1-23.1, DP 1-23,10, DP 1-23.11, DP 1-23.12, DP 1-23.13, DP 1-23.14, DP 1-23.15, DP 1-23.16, DP 1-23,17, DP 1-23.5, DP 1-23.6, DP 1-23.7, DP 1-23.8 tai DP 1-23.9; A on DP 1-26.1, DP 1-26.2, DP 1-26.3, DP 1-26.4 tai DP 1-26.5, B on DP 1-20.6 tai DP Π-20.7, C on 10 DP Π-22, DP Π-22.6, DP Π-22.7, DP Π-22.8, DP Π-22,9, DP Π-22.10, DP Π-22.11, DP Π-22.3, DP Π-22.4 tai DP Π-22.5 ja D on DP Π-25.2, DP Π-25.3 tai DP Π-25.4, edellyttäen, että DXZACBY ei ole DP Π-25.2, DP 1-21.2, DP 1-23.1, DP Π-26.1, DP 1-22, DP Π-20.6 eikä DF 1-22.2 vastaavasti.

Esillä oleva keksintö kohdistuu menetelmiin henkilöiden huonepölypunkkiherkkyy-15 den havaitsemiseksi, joka käsittää henkilöstä saadun verinäytteen yhdistämisen esillä olevan hakemuksen mukaiseen peptidiin olosuhteissa, jotka ovat sopivia veri-komponenttien sitoutumiselle peptidiin, ja laajuuden, jossa tällaista sitoutumista tapahtuu, määrittämisen. Laajuus, jossa sitoutuminen tapahtuu, määritetään arvioimalla T-solutoiminta, T-soluproliferaatio tai niiden yhdistelmä.

20 Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

·. Keksinnön mukaisen peptidin rakennetta on myös mahdollista modifioida tai lisä- modifioida lisääntyneen liukenevuuden tai lisääntyneen stabiiliuden saavuttamiseksi (esim. varastointi-ikä ex vivo tai proteolyyttisen hajoamisen vastustuskyky in vivo). Voidaan valmistaa modifioitu peptidi, jossa aminohapposekvenssi on muutettu, 25 esim. aminohapposubsitituutiolla, -deleetiolla tai -lisäyksellä, jotta modifioidaan immunogeenisyys ja/tai vähennetään allergeenisyyttä, tai siihen voidaan lisätä sa-masta syystä komponentti.

Peptidi voidaan modifioida esimerkiksi siten, että se säilyttää kyvyn indusoida T-soluanergiaa ja sitoa MHC-proteiineja ilman kykyä indusoida voimakasta proli-30 feratiivista vastetta tai mahdollisesti mitään proliferatiivista vastetta, kun sitä annetaan immunogeenisessä muodossa. Tässä tapauksessa kriittiset T-solureseptoriin si-toutumispisteet voidaan määrittää käyttämällä tunnettuja tekniikoita (esim. jokaisen tähteen substituutio ja T-solureaktiivisuuden läsnäolon tai puuttumisen määrittämi- 15 104906 nen). Ne tähteet, joiden on osoitettu olevan oleellisia vuorovaikutteinaan T-solure-septorin kanssa, voidaan modifioida korvaamalla oleellinen aminohappo toisella edullisesti samanlaisella aminohappotähteellä ("konservatiinen substituutio"), jonka läsnäolon on osoitettu parantavan, vähentävän muttei eliminoivan tai olevan vaikut-5 tamatta T-solureaktiivisuuteen. Lisäksi ne aminohappotähteet, jotka eivät ole oleellisia T-solureseptorivuorovaikutukselle, voidaan modifioida korvaamalla toisella aminohappotähteellä, jonka sisällyttäminen voi parantaa, vähentää tai olla vaikuttamatta T-solureaktiivisuuteen, mutta joka ei eliminoi sitoutumista relevanttiin MHC:hen.

10 Lisäksi esillä olevia peptidejä voidaan modifioida korvaamalla aminohappo, joka on osoittautunut olevan oleellinen vuorovaikuttamaan MHC-proteiinikompleksin kanssa, toisella, edullisesti samanlaisella aminohappotähteellä (konservatiinen substituutio), jonka läsnäolo on osoittautunut parantavan, vähentävän muttei eliminoivan tai olevan vaikuttamatta T-solureaktiivisuuteen. Lisäksi aminohappotähteet, jotka eivät 15 ole oleellisia vuorovaikutukselle MHC-proteiinikompleksin kanssa vaan jotka sitoutuvat yhä MHC-proteiinikompleksiin, voidaan modifioida korvaamalla toisella aminohapolla, jonka sisällyttäminen voi parantaa, olla vaikuttamatta tai vähentää muttei voi eliminoida T-solureaktiivisuutta. Edulliset ei-oleellisten aminohappojen amino-happosubstituutiot käsittävät mutteivät rajoitu niihin substituutiot alaniinilla, glu-20 tamiinihapolla tai metyyliaminohapolla.

Toinen esimerkki peptidin substituoinnista on kysteiinitähteiden substituointi edullisesti seriinillä, treoniinillä, leusiinilla tai glutamiinihapolla disulfidikytkösten kautta tapahtuvan dimerisaation minimoimiseksi. Jommankumman allergeenin ensimmäiset kymmenen aminohappotähdettä sisältävän Der p Π:η tai Der f Π:η peptidin stabii-25 liutta voidaan esimerkiksi parantaa korvaamalla 8:nnessa aminohappotähteessä sijaitseva kysteiini edullisesti alaniinilla tai glutamiinihapolla tai vaihtoehtoisesti seriinillä tai treoniinillä.

Stabiiliuden ja/tai reaktiivisuuden parantamiseksi peptidit voidaan myös modifioida yhden tai useamman polymorfismin sisällyttämiseksi proteiiniallergeenin aminohap-30 posekvenssiin tuloksena luonnollisesta alleelisesta vaihtelusta. Lisäksi D-aminoha-pot, ei-luonnolliset aminohapot tai ei-aminohappoanalogit voidaan substituoida tai lisätä modifioidun peptidin valmistamiseksi. Lisäksi esillä olevat peptidit voidaan modifioida käyttämällä A. Sehonin ja yhteistyökumppaneiden polyetyleeniglykoli-(PEG)menetelmää, (Wie et el., supra), PEGihen konjugoidun peptidin muodos-35 tautiseksi. Lisäksi PEG voidaan lisätä peptidin kemiallisen synteesin aikana. Pepti- 16 104906 dien tai niiden osien modifioinnit voivat myös käsittää reduktion/alkylaation (Tarr: Methods of Protein Microcharacterization, J.E. Silver, toim. Humana Press, Clifton, NJ, sivut 155-194 (1986)), asyloinnin (Tarr, supra), esteröinnin (Tarr, supra), kemiallisen kytkemisen sopivaan kantoaineeseen (Mishell ja Shiigi, toim., Selected 5 Methods in Cellular Immunology, WH Freeman, San Fransisco, CA (1989), US-patentti 4 939 239), tai laimean formaliinikäsittelyn (Marsh, International Archives of Allergy and Applied Immunology, 41:199-215 (1971)).

Toisessa suoritusmuodossa allergeeniryhmään (esim Der p I tai Der p Π) kuuluvat peptidit voidaan modifioida T-solureaktiivisuuden parantamiseksi. Annettuaan risti-10 reaktiivisuuden ryhmän I ja ryhmän Π allergeeneihin, yhden ryhmän allergeenin peptidissä, joka voi olla vähemmän reaktiivinen kuin toisen ryhmän allergeenin peptidi, joka vastaa aminohappoasemassa, voi olla yksi tai useampia aminohappoja, jotka on substituoitu yhdellä tai useammalla aminohapolla, jotka ovat peräisin vastaavasta peptidistä. Lisäksi peptidit voidaan modifioida polymorfismin sisällyttämiseksi 15 proteiiniallergeenin aminohapposekvenssiin tuloksena luonnollisesta alleelisesta variaatiosta. Peptidien modifiointi yhden tai useamman tällaisen polymorfismin sisällyttämiseksi parantaa stabiiliutta ja/tai reaktiivisuutta.

Hakemuksen mukaisten peptidien puhdistamisen helpottamiseksi ja liukenevuuden lisäämiseksi potentiaalisesti on mahdollista lisätä peptidirunkoon reportteriryhm(i)ä. 20 Esimerkiksi polyhistidiiniä voidaan lisätä peptidiin peptidin puhdistamiseksi immo-bilisoidulla metalti-ioniaffimteettikromatografialla (Hochuli, E. et ai., Bio/Techno-logy, 6:1321-1325 (1988)). Lisäksi haluttaessa voidaan sisällyttää spesifisiä endo-, . proteaasipilkontakohtia reportteriryhmän ja peptidin aminohapposekvenssien väliin irrelevanteista sekvensseistä vapaiden peptidien eristämisen helpottamiseksi.

25 T-soluepitooppien sopivan antigeenikäsittelyn auttamiseksi potentiaalisesti peptidissä, kanoniset proteaasiherkät kohdat voidaan käsitellä rekombinanttisesti tai synteettisesti alueiden välillä, jotka alueet kukin käsittävät vähintään yhden T-soluepi-toopin. Esimerkiksi varautuneita aminohappopareja, kuten KK tai RR, voidaan vie- • · dä peptidissä olevien alueiden väliin peptidin rekombinanttikonstruktion aikana. 30 Saatu peptidi voidaan tehdä herkäksi katepsiini- ja/tai muulle trypsiinin kaltaisten entsyymien pilkonnalle peptidiosuuksien generoimiseksi, jotka sisältävät yhtä tai useampaa T-soluepitooppia. Lisäksi tällaiset varautuneet aminohappotähteet voivat saada aikaan peptidin liukenevuuden lisääntymisen.

Esillä olevaa peptidiä koodaavan DNA:n paikkasuunnattua mutageneesia voidaan 35 käyttää peptidin rakenteen modifioimiseksi. Tällaiset menetelmät käsittävät muun 104906 17 muassa PCR:n (Ho et ai., Gene, 77:51-59 (1989)) tai mutatoitujen geenien totaalisen synteesin (Hostomsky, Z. et ai., Biochem. Biophys, Res. Comm., 161:1056-1063 (1989)). Bakteeriekspression parantamiseksi voidaan edellä mainittuja menetelmiä käyttää yhdessä muiden menetelmien kanssa peptidejä koodaavissa DNA-raken-5 teissä olevien eukaiyoottisten kodonien muuttamiseksi sellaisiksi, joita käytetään ensisijaisesti £. colissa.

Spesifiset esimerkit peptideistä, jotka on modifioitu yhden tai useamman edellä kuvatun modifiointimenetelmän mukaisesti, käsittävät, mutteivät rajoitu niihin, kuvioissa 25 esitetyn peptidin DPI-23.1:n ja kuviossa 25 esitetyn peptidin DPII-22 mo-10 difikaatioihin. Erityisesti peptidien 23.1 modifikaatiot käsittävät varautuneiden aminohappojen (DP 1-23.7) ja varautuneiden aminohappoparien (DP 1-23.5) lisäämisen liukenevuuden lisäämiseksi ja kysteiinitähteen korvaamisen seriinillä (DP 1-23.6) tai glutamiinihapolla liukenevuuden parantamiseksi. Peptidin DP Π-22 muutokset käsittävät varautuneiden aminohappoparien (22.6 ja 22.3) lisäämisen liukenevuuden pa-15 rantamiseksi, kuten kuviossa 25 esitetään.

Tätä keksintöä valaistaan lisäksi seuraavilla ei-rajoittavilla esimerkeillä.

Esimerkki I

Luontaisen punkkiallergeenin puhdistaminen

Nyt seuraa kuvaus työstä, joka tehtiin huonepölypunkkien Dermatophagoides pte-20 ronyssinus ja Dermatophagoides farinae ryhmän I ja ryhmän Π allergeenien puhdistamiseksi luontaisessa muodossaan primaarisina antigeeneinä ihmisen T-soluepi-tooppien kartoitukseen.

Kaikki neljä proteeiniallergeeniä, Der f I, Der p I, Der f Π ja Der p Π, immunoaffini-teettipuhdistetttiin käytetyistä punkkiviljelyväliaineista, jotka saatiin joko Common-25 wealth Sera Laboratoiresista, Melbournesta Australiasta, tai tri Larry G. Arlianilta Wright State Universitystä, Daytonista Ohiosta. Valmistettiin 10-%:inen (paino/til.) kuivattujen käytettyjen punkktviljefyväliaineiden vesiuute PBSiään (Phosphate Buffered Saline) sekoittamalla yön ajan 4 °C:ssa. Liukenematon materiaali poistettiin sentrifugoimalla 10000 x g.ssä 1 tunti 4 °C:ssa. Sitten supematantti suodatettiin tyh-30 jöputkessa Whatman #1 -paperin läpi ja sentrifugoitiin uudelleen 15000 x g.ssä 1 tunti 4 °C:ssa. Lopullinen suodattaminen suoritettiin 0,45 m:n selluloosa-asetaatti-suodattimen läpi.

,. 104906 Ιο

Ryhmän I tai vastaavasti ryhmän Π punkkiallergeenin immunoaffiniteettipuhdistami-seen käytettiin monoklonaalisia vasta-aineita 4 Cl ja 6 D6 (Chapman et ai., J. Allergy Clin. Immunol. 83: 1055-1067 (1989)). Monoklonaalinen vasta-aine 4C1 reagoi epitoopin kanssa, jota on sekä Der f I- että Der p I -proteiineissa. Monoklonaalinen 5 vasta-aine 6 D6 reagoi samaten sekä Der f Π- että Der p Π -proteiinien kanssa.

Jokaista monoklonaalista vasta-ainetta varten leikattiin vesivatsaa 50-%:iseen am-moniumsulfaattiin ja vasta-aineet kytkettiin CNBr-aktivoituun Sepharose 4B:hen (Pharmacia) 100 mM:ssa NaHC03, 500 mM:ssa NaCl, pH 8,3, yön ajan 4 °C:ssa.

Monoklonaalisen vasta-aineen pylväät tasapainotettiin PBS.ssä ja suodatettuja uut-10 teitä panostettiin 15 ml tunnissa. Sitten pylväs pestiin 20 tilavuudessa PBSiää, minkä jälkeen suoritettiin 20 pylvästilavuuden ankarampi pesu PBS:llä, jota oli täydennetty 500 mMrlla NaCl. Proteiinit eluoitiin 500 mM:iin NaCl, 100 mM:iin gly-siiniä, pH 11,0 ja fraktioiden proteiinipitoisuus arvioitiin spektrofotometrisella ab-sorbanssilla 280 nm:ssä. Huippufraktiot yhdistettiin ja dialysoitiin laajasti PBS:ää 15 vasten, ne konsentroitiin negatiivisen paineen dialyysilaitteella (saatiin Amiconista, Be vedystä, MA) ja niitä käytettiin punkkiryhmän I ja ryhmän Π allergeenien T-solu-epitooppikartoitustutkimuksissa. Talteenotetut proteiinit saatiin puhtausasteina 80 % (ryhmä Π) - 90 % (ryhmä I).

Käänteisfaasi-HPLC-kromatografia suoritettiin immunoaffiniteettipuhdistetun ryh-20 män Π punkkiproteiiniallergeenin lisäpuhdistamiseksi olosuhteiden mukaan, jotka ovat kuvanneet Heymann et ai., J. Allergy Clin. Immunol. 83: 1055-1067 (1989). Immunoaffiniteettipuhdistettua proteiinia levitettiin 5 pm:n 300 A C-8 -pylvääseen (Applied Biosystems Inc.) 0,1 %:na /til./til. TFA/H20. Pylvään virtausnopeus oli 1 ml/min. gradientin ollessa 0-60 % asetonitriiliä / 0,1 % TFA 60 minuuttia. Ryhmän 25 Π proteiinit eluoituivat noin 45 % asetonitriiliä / 0,1 % TFA. Fraktioiden puhtaus analysoitiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla, mitä seurasi densitometri-nen skannaus. Niitä ryhmän Π proteiineja, joiden puhtaus oli yli 90 %, käytettiin sitten allergeenin ihmisen T-solukartoitukseen.

«

Esimerkki Π 30 Rekombinanttinen punkkiallergeenin ilmentäminen

Nyt seuraa kuvaus työstä, joka tehtiin huonepölypunkkien Dermatophagoides pte-ronyssinus ja Dermatophagoides farinae ryhmän I ja ryhmän Π allergeenien valmistamiseksi rekombinanttiproteiineina E. colissa.

19 104506

Kaikkiin neljään proteiiniallergeeniin, Der f I, Der p I, Der f Π ja Der p Π, fuusioitiin niiden kypsässä aminoterminaalissa ohjaussekvenssi MGHHHHHHEF (jossa aminohapot EF ovat EcoR 1 -restriktiokohdan GAATTC koodaamia). Koska aminohappojen Ηβ-alue koordinoi -ioneija NTA-agaroosipylväissä (Diagen GmbH), 5 tätä aktiivisuutta käytettiin yhdistelmäproteiinien puhdistamisessa (Hochuli et ai., Biotechnology 86: 1321-1325 (1988)). Lopuksi kaikki neljä allergeeniä alakloonat-tiin ekspressiovektoriin pET 1 Id (Studier et ai., Methods in Enzymology 185: 60-88 (1989)) faagi T7 gn 10 -promoottorin transkriptionaalisen kontrollin alaisena.

cDNA:t, jotka koodaavat D. pteronyssinusista ja D. farinaesta peräisin olevia ryh-10 män I allergeenejä, saatiin tri Wayne Thomasilta plasmidimuodossa lambdagtl l.stä peräisin olevina alaklooneina (Chua et ai., J. Exp. Med 167: 175-182 (1988), Dil-worth et ai., Clin. Exp. Allergy 21: 25-32 (1991)). Tri Roland Buelow oli alakloo-nannut Der p I cDNA M13 RF -plasmidista ECOR I -fragmenttina pUC18:aan Im-munoLogicissa (Palo Aito), kun taas Der f I cDNA manipuloitiin suoraan M13mpl9 15 RF-plasmidista Df 1(1).

Aluksi cDNA.t alakloonattiin ilmennysvektoriin pTrc99A Hise Insert RRRS, joka on pTrc99A:n modifioitu versio (Aman et ai., Gene 69: 301-315 (1988). Alkuperäinen vektori modifioitiin lisäämällä synteettinen adapteri (koostuu kahdesta komplementaarisesta oligonukleotidistä), joka koodaa ohjaussekvenssiä MGHHHHHHEF sen 20 Ncol- (MG) ja EcoRI- (EF) -kohtien välissä polyliittäjän 5'-päässä ja RRS (Retro Regulatory Sequence) sen Hind ΙΠ -kohtaanpolyliittäjän 3-päässä, kun taas RRS lisättiin rekombinanttivälittäjästabiiliuden parantamiseksi ja siten yhdistelmäproteii-. . . nin saannon lisäämiseksi (Skoglund et ai., Gene 88: 1-5 (1990)). Lopuksi insertti, tässä tapauksessa Amb AI.1 cDNA, joka koodaa lyhytvillakon (shot ragweed) pää-25 asiallista allergeeniä (Rafiiar et ai., J. Biol. Chem. 226: 1229-1236 (19919)) ala-kloonattiin kehykseen H^-ohjaajan kanssa EcoRT.na Pstl-fragmenttiin.

Punkkiryhmän I allergeenien ilmentämiseksi Amb a 1.1 cDNA leikattiin pois Eco-RI/Hmdm-hajotuksellaja korvattiin adaptoreU^EcoRI/Hindlll-ulokkeilla (koostu-.* vat parista komplementaarisia oligonukleotidejä). Nämä adaptorit (kuvio 2a) koo- 30 daavat kypsän Der p INH2 -terminaalin ensimmäistä 5 aminohappoa Pst I -kohtaan ja kypsän Der f I:n ensimmäistä 10 aminohappoa NH2 -terminaalin Hpal-kohtaan. Vektorin EcoRI-kohdan ja <|>EcoRI-kohdan adaptoreihin ligatoinnin jälkeen vektorissa oleva EcoRI-kohta tuhottiin jättäen koodattu EcoRI-kohta adaptorin sisäpuolelle pelkkänä EcoRi-kohtana välituoterakenteissa pTrc99A His65' pl RRS ja pTrc99A 35 His 6 5' fl RRS. Der p I cDNA insertoitiin Psfi/EcoRi-fragmentdna Pstl/EcoRT.lla 20 104906 hajotettuun pTrc99A His6 5' pl RRS.ään, kun taas Der f I cDNA insertoitiin Hpal/EcoRI-fragmenttina Hpal/EcoRI:lla hajotettuun pTrc99A Hise 5'fl RRS.ään. Jokaisen rakenteen pTrc99A Hise 5'pl RRS ja pTrc99A His6 fl RRS, 5-pään sekvenssi vahvistettiin dideoksiketjuterminaatio-DNA-sekvennoinnilla käyttämällä Se-5 quanase™ m -välinesarjaa (U.S. Biochemicals). Sekä H* pl- että 1¾ fl-koodaavat kasetit leikattiin pois NcoI/Nhel-hajotuksella (Nhel-kohta oli RRS-adaptorin 3'-päässä) ja liitettiin NcoI/Nhel-hajotettuun pETlldihen. Nämä kaksi rakennetta, pETl Id His6 pl RRS ja pETl Id Hise fl RRS, transformoitiin kompetentteihin BL21 [DE3] -bakteereihin yhdistelmäproteiinien ilmentämiseksi. K21 [DE3] sisältää re-10 kombinanttisen faagi lambda -lysogeenin, DE3, faagi T7 RNA -polymeraasigeenin ollessa lac UV5 -promoottorin transkriptionaalisen kontrollin alaisena. T7 RNA -polymeraasigeenin ilmentyminen indusoidaan lisäämällä IPTG:tä (isopropyyli-B-D-tiogalaktopyranosidia), joka puolestaan johtaa yhdistelmägeenin, joka on ala-kloonattu pET vektorin T7 gn 10 -promoottorin 3', ilmentymiseen.

15 cDNArt, jotka koodaavat D. pteronyssinusista ja D. farinaesta peräisin olevia ryhmän Π allergeenejä, saatiin myös tri Wayne Thomasilta plasmidimuodossa lam-bdagtl l:stä peräisin olevina alaklooneina (Chua et ai., Int Arch. Immun. 91: 118-123 (1990), Trudinger et ai., Clin. Exp. Allergy 21: 33-37 (1991). Tri Roland Buelow oli alakloonannut alkuperäisen Der p Π cDNA:n M13 RF -plasmidista pCA-20 ja pGEX-vektoreihin ImmunoLogicissa (Palo Aito). Tri Thomasin ryhmä välitettiin Der f Π cDNA.n alakloonina pGEX. Kumpaakin pGEX-plasmidia, joissa on ryhmän Π cDNA:ita, käytettiin templaatteina PRC-vahvennukseen saman 5'-merkitykselli-sen/3'-merkityksettömän aloittajaparin kanssa (kuvio 2b). Aloittajat suunniteltiiin ·* ' EcoRI-kohdan (GAATTC, joka kodaa aminohappoja EF) fuusioimiseksi lukujär- 25 jestykseen kypsien ryhmän Π proteiinien NH2-terminaalin kanssa ja ryhmää Π koo-daavan alueen PstI-kohta-3':n sijoittamiseksi. MJ Research Thermal Controlleria ohjelmalla 30 X (94 °C 1 min/55°l min 30 s/72°C 2 min) käytettiin yhdessä reagens-sien kanssa, jotka ovat Perkin Elmer - Cetus Gene Amp -välinesaijasta PCR-vah-ventamiseen. PCR-tuotteet olivat EcoRI/Pstl-hajotettuja ja alakloonattuja EcoRI/-30 Pstl-hajotettuun M13mpl9RF:ään. DNA-sekvenssianalyysi suoritettiin PCR-tuottei-den sekvenssin vahvistamiseksi. Oikeat M13RF:t olivat EcoRI/PstI:llä hajotettuja, niiden ryhmän Π cDNA-insertit eristettiin ja alakloonattiin EcoRI/Pstl-hajotettuun pTrc99A His6 Amb a 1.1 RRS:ään (jota käytettiin ryhmän Π cDNA:iden vaihtamiseen villakko-cDNA:han (kuvio 1)).

35 Der f Π cDNA:ssa oli sekvenssipolymorfismi asemassa 54 (so. treoniinitähde iso- leusiinin asemasta). Tämän polymorfismin muuttamiseksi suoritettiin T$4:n paikka- 21 104906 suunnattu mutageneesi Der f Π cDNA:ssa käyttämällä BioRad Laboratoriesin Muta-Gene-välinesaijaa perustuen Kunkelin menetelmään, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 488-492 (1985). Alkuperäinen M13mp 19RF transfonnoitiin T54 Der f Π cDNA:n kanssa CJ236-bakteereihin, jotka sietävät urasiilin sisällyttämisen tymidiinin ase-5 masta DNA-replikaation aikana ja yksijuosteinen faagi-DNA valmistettiin templaat-tina. Mutageeninen 17 emäsparin aloittaja (2b) lämpöliitettiin faagitemplaatti-DNA:han. T4 DNA -polymeraasia käytettiin mutageenisella oligonukleotidillä herätetyn templaatti-DNA:n kopioimiseen ja T4 DNA -ligaasia käytettiin DNA-juos-teessa olevien aukkojen tiivistämiseen. Reaktio transformoitiin MV1190-bakteerei-10 hin, jotka ovat villintyyppisiä, urasiilitähteiden leikkaamiseksi ja siten mutageni-soidun (ei-urasiilia sisältävän) juosteen replikoimiseksi selektiivisesti ja yksijuosteinen faagi-DNA valmistettiin rekombinanttisista (valkoisista) plakeista. Useita re-kombinantteja alistettiin DNA-sekvenssianalyysiin ja Der f Π cDNAiita, joissa on koijattu I$4-sekvenssi, alakloonattiin EcoRI/PstJ-fragmentteina EcoRI/Pstl-hajotet-15 tuun pTrc99A Hisö Amb a 1.1 RRSrään.

Koska aiempi työ oli osoittanut, että pETlld vektori oli useimmissa tapauksissa kykenevä ilmentämään yhdistelmäproteiineja korkeammilla tasoilla kuin pTrc99A-vektori, kaksi punkkiryhmän Π cDNArta alakloonattiin H6-fuusioproteiineina 17-vektoriin. pTrc ppA His6 f Π RRS ja pTrc99A Hise p Π RRS hajotettiin 20 NcoI/NheI:llä, cDNA-insertit eristettiin ja alakloonattiin NcoI/Nhel-hajotettuun pETlld His6 plrään (kuvio 1). Yhdistelmäplasmidit transformoitiin BL21 [DE3] -bakteereihin ilmentämistä varten.

. . BL21 D3 -isäntäbakteerit, joissa on pETlld-punkkiallergeeni-ilmennysrakenteet, viirutettiin tuoreena BHI-agarlevylle (3,7 % paino/til. Difco Brain Heart Infusionia, 25 1,5 % paino/til. Difco-agaria), jota oli täydennetty 200 pg/ml:lla ampisilliinia ja in- kuboitu yön ajan 37 °C:ssa. Yksittäinen pesäke inokuloitiin 2 ml.aan 200 pg/ml ampisilliini/BH 1 -väliainetta (3,7 % paino/til Difco Brain Heart Infusion) ja ravistettiin 300 rpmissä 37 °C:ssa kunnes se oli sameaa muttei kyllästynyttä. 2 ml viljelmää lisättiin sitten 100 ml:aan ampisilliini/BH 1-väliainetta, ravistettiin 300 rpm:ssä • - 30 37 °C:ssa kunnes se oli sameaa muttei kyllästynyttä, jolloin viljelmä jaettiin 18 x 500 ml:aan (9 litraa) 200 pg/ml ampisilliini/BH 1 -väliainetta ja ravistettiin 300 rpm:ssä 37 °C:ssa. Kun viljelmän OD595 saavutti 1,0, yhdistelmämolekyylien ilmentyminen indusoitiin lisäämällä IPTG:tä 400 pM:iin ja annettiin jatkua kaksi tuntia.

22 104906

Bakteerit kerättiin sentrifugoimalla 10000 x g:ssä 15 minuuttia ja ne suspendoitiin uudelleen 1/20-tilavuuteen lyysipuskuria (0,2 mg/ml lysotsyymiä, 100 mM NaP04, pH 8,0, 50 mM NaCl), inkuboitiin jäällä 30 minuuttia ja jäädytettiin -70 °C:ssa. Jäätyneet bakteerit murrettiin sulattamalla nopeasti 37 °C:ssa ja sitten niitä sonikoi-5 tiin 5 kertaa 20 sekuntia 30 sekunnin välein. Sonikoidut näytteet sentrifugoitiin 15000 x g:ssä liukenevien ja partikkelimaisten bakteeriproteiinien erottamiseksi. Liukenevat proteiinit kaadettiin pois ja pelletoitunut proteiini suspendoitiin uudelleen 6 M:iin guanidiini-HClia, 100 mM:iin 2-merkaptonolia, 100 mM:iin NaP04, 10 mM:iin Tris pH 8,0. Tämä suspensio alistettiin sentrifugointiin 15000 x g.ssä ja 10 supematantti poistettiin, säädettiin pHrhon 10 N NaOH.lla ja levitettiin NTA-agaroosipylvääseen, joka oli tasapainotettu 6 M.iin guanidiini-HCl:a, 100 mM:iin NaP04, 10 mM:iin Tris pH 8,0. Pylväs pestiin 6 mM:ssa guanidiini-HCl, 100 mM:ssa NaP04, 10 mM:ssa Tris pH 8,0, kunnes effluentin OD280 saavutti taustan. Pylväspuskuri vaihdettiin sitten 8 M:iin ureaa, 100 mM:iin NaP04, 10 mM:iin 15 Tris pH 8,0. Tasapainottamisen jälkeen suoritettiin ankarampi pesu 8 M:ssa ureaa, 100 mMissa NaOAc, 10 mM:ssa Tris pH 6,3, kunnes effluentin OD28o saavutti taustan. Sitten yhdistelmäpunkkiproteiini (He-fuusiona) eluoitiin 8 M:iin ureaa, 100 M.iin NaOAc, 10 mM Tris pH 4,5 ja kerättiin alikvootteina, joiden OD280-profhlia tarkkailtiin. Proteiinihuippu dialysoitiin 3 kertaa 500 tilavuuteen PBS:ää ih-20 misen T-soluanalysointia varten. Saanto oli 10-70 mg yhdistelmäproteiinia litraa kohti puhtauden ollessa (määritetty densitometrisellä skannauksella) 80 (Der f Π) -95 %.

Rekombinanttisen Der f Π -proteiiniallergeenin puhdistamiseksi edelleen käytettiin :· käänteisfaasi-HPLC-kromatografiaa. Suunnilleen 100 mg His6-Der f Π -proteiinia 25 pelkistettiin 20 mM:ssa DTT 36 °C:ssa 30 minuuttia ja sitten se levitettiin Pharmacia PRO RPC HR 10/10 -pylvääseen 0,1 %:iin til/til. TFA/H20. Pylvään virtausnopeus oli 1,5 ml/min gradientin ollessa 0-70 % asetonitriiliä 0,1 %:ssa TFA 40 minuuttia, mitä seurasi gradientti 70-100 % asetonitriiliä 0,1 %:ssa TFA. His6-Der f Π -proteiini eluoitui 54-96 % asetonitriiliä. 214 nm:ssä ja 280 nm.ssä havaittujen frak-30 tioiden puhtaus analysoitiin SDS-polyakiyyliamidigeelielektroforeesi/densitometri-sellä skannauksella. Ne fraktiot, joissa His6-Der f Π -proteiinin puhtaus oli yli 95 %, käytettiin seuraavaksi allergeenin ihmisen T-solukartoitukseen. Saanto valmistavasta käänteisfaasi-HPLC:stä oli suunnilleen 69 %.

23 104906

Nukleotidisekvenssipolymorfismien määrittäminen Der p I-, Der p Π- ja Der f Π -allergeeneissä

Odotettiin, että Der p Iita, Der p Eitä, Der f I:tä ja Der f Eitä koodavassa nukleiini-happosekvenssissä on sekvenssipolymorfismeja johtuen yksittäisten punkkien luon-5 täisestä alleelisesta vaihtelusta. Useita nukleotidin ja saatujen aminohapposekvenssien polymorfismeja on havaittu erilaisten Der p I-, Der p E- ja Der f E -kloonien sekvennoinnin aikana. Aminohapposekvenssipolymorfismit on esitetty kuvioissa 22, 23 ja 24.

Esimerkki ΓΠ 10 Limittyvien peptidien synteesi

Kuvioissa 3 ja 4 esitetyt limittyvät Der p I-, Der f I-, Der p E- ja Der f E -peptidit syntetoitiin käyttäen standardia Fmoc/tBoc-synteettistä kemiaa ja ne puhdistettiin dialysoimalla tai käänteisfaasi-HPLCillä. Syntetoitujen peptidien aminohappotähteet ovat suluissa peptidinimien ja aminohappotähdesekvenssin (yksittäinen kirjainkoo-15 di) mukaan peptidin nimen jälkeen. Peptidien nimet ovat vakioita kaikissa kuvioissa. Der p I-, Der f I-, Der p E- ja Der f E -proteiinit jaettiin limittyviin peptideihin siten, että Der p linja Der f Iin sekä Der p E:n ja Der f E:n limittyvillä peptideillä on vastaavat aminohappotähdeluvut, esim. DP 1-1 ja DF1-1 sisältävät kumpikin Der f I- ja Der f I -allergeenien aminohappotähteet 1-20 vastaavasti. Der p I- ja Der f I -pepti-20 dien välinen aminohappoaseman yhdenmukaisuus tehtiin taikoituksella Der P- ja Der f T-soluepitooppien ristireaktiivisuuden testaamiseksi parhaiten ja siten peptidi-: 1 en määrittämiseksi, jotka annettaessa pölypunkille herkälle henkilölle hoitavat herk kyyttä sekä Der p- että Der f -allergeeneille. Tehtäessä limittyviä peptideitä ryhmän I ja ryhmän E allergeenien suhde otettiin huomioon T-sohiristireaktiivisuuden tasol-25 la. Lisäksi ryhmän I allergeenien funktio seriiniproteaaseina otettiin huomioon ja muiden tunnettujen seriiniproteaasien, esim. papaiinin, aktinidiinin, aminohapposekvenssit tutkittiin samanlaisten säilyneiden ja muuttuvien alueiden identifioimiseksi ryhmän 1 allergeeneissä. Odotettiin, että tyhmän I allergeenien säilyneet alueet sisältävät "yhteisiä" T-soluepitooppeja.

24 104906

Esimerkki IV

Punkkiallergisen potilaan primaariset T-soluvasteet Der p I- ja Der p Π -proteiineihin ja peptideihin

Periferaaliveren yksitumaisia soluja (PBMC) puhdistettiin Ficoll-Hypaque -sentrifu-5 goimalla periferaaliveiinäyte punkille allergisesta potilaasta R.B ja testattiin eritys vasteena erilaisiin antigeeneihin, so. afimiteettipuhdistettu Der p I, affiniteettipuh-distettu Der p Π, erilaiset Der p 1- ja Der p Π -peptidit. Testaamista varten 5xl04 PBMC viljeltiin triplikaatteina mikrokoloissa 7 päivää 37 °C:ssa erilaisten konsent-raatioiden antigeeniä läsnäollessa 200 piissä RPMI-1640:tä, joka sisältää 5 % ihmi-10 sen AB-seerumia. Sitten jokaiseen koloon välitettiin 1 pCi tritiumoitua tymidiiniä 16 tuntia. Sisällytetyt lukemat kerättiin lasikuituputkiin ja niitä käsiteltiin nestetuike-laskentaa varten. Taulukossa I esitetään tämän testin tulos. CPM+/—standardipoik-keamat on esitetty. Kunkin vasteen stimulointi-indeksi (S.I.) on solujen sisällyttämän 3H-tymidiini-cpm:n vasteena antigeeniin jaettuna solujen sisältämän 3H-tymi-15 diinin cpm väliaineessa. Tulokset osoittavat, että tämä potilas reagoi S.l.in ollessa vähintään 2,0 peptideihin DP 1-1. DP 1-3, DP 1-8, DP 1-10, DP 1-5.2, DP Π-4 ja DP Π-9. Täten nämä peptidit sisältävät T-solujen tunnistamia T-soluepitooppeja, jotka ovat peräisin tästä allergisesta potilaasta. 1 I ' 104906 25

Taulukko I

Antigeeni Konsentraatio cpm±S.D. S.I.

Mfi/ml Väliaine - 1071 ±30 5 DerpI 10 920 ±15 0,9 30 2122 ± 93 2,0 100 1492 ±13 1,4 DPI-1 10 1099 ±48 1,0 30 3527 ± 73 3,3 10 100 2746 ±81 2,6 DP 1-2 10 1395 ±47 1,3 30 1283 ± 34 1,5 100 1486 ± 38 1,4 DP 1-3 10 2608 ±52 2,4 15 30 1561 ±13 1,5 100 5252 ± 67 4,9 DP 1-8 10 1439 ±32 1,3 30 1045 ± 32 1,0 100 2272 ±40 2,1 20 DPI-10 10 1936 ±50 1,8 30 3042 ± 89 2,8 100 2644 ± 63 2,5 DP 1-5.2 10 1374 ±20 1,3 30 2241 ±87 2,1 25 100 3132 ±111 2,9

Derp Π 10 1113 ±35 1,0 30 2104 ±43 2,0 100 1057 ± 27 1,0 DPH-4 10 2126 ±25 2,0 30 30 1979 ±94 1,8 100 2314 ±116 2,2 DP Π-9 3970 ±87 3,7 4464 ± 86 4,2 2237 ±53 2,1 35

Esimerkki V

26 104906 T-soluepitooppitutkimukset Der p I:lla

Periferaaliveren yksitumaisia soluja (PBMC) puhdistettiin Ficoll-Hypaque -sentrifu-goimalla 60 ml heparinisoitua verta, joka oli peräisin pölypunkille allergisista henki-5 Idistä, joilla oli punkkiallergian kliinisiä oireita ja joiden ihotesti oli pölypunkki-positiivinen.

107 PBMC, jotka olivat peräisin henkilöistä, 543 viljeltiin 10 ml:ssa RPMI-1640, joka sisältää 5 % yhdistettyä ihmisen AB-seerumia ja täydennettiin glutamiinilla, penisilliinillä, streptomysiinillä ja HEPES-puskurilla 20 pg/ml:n puhdistettua luon-10 täistä Der p I/ml läsnäollessa. Elinkyltyiset solut puhdistettiin Ficoll-Hypaque-sentrifugoinnilla ja niitä viljeltiin lisäksi 2 viikkoa RPMI-1640/5 % AB-seerumissa, joka sisältää 5 yksikköä rekombinanttista ihmisen IL-2/ml ja 5 yksikköä rekombinanttista ihmisen IL-4/ml. Lepo-T-solut testattiin sitten sekundaarisessa proliferaa-tiotestissä T-soluvasteiden erilaisiin huonepölypunkkiproteiineihin ja -peptideihin 15 testaamiseksi. Testiä varten 2 x 104 lepo-T-solua viljeltiin 200 pl.ssa RPMI-1640/5 % AB-seerumia 3 päivää 37 °C:ssa 2xl04 autologisella Epstein-Barr-viruk-sella transformoitujen B-solujen läsnäollessa (20000 radia) antigeeniä esittävinä soluina erilaisilla konsentraatioilla puhdistettuja luontaisia Der p I- tai synteettisiä Der p 1 -peptidejä. Sitten jokaiseen koloon välitettiin 1 pCi tritiumoitua tymidiiniä 20 16 tuntia. Sisällytetyt lukemat kerättiin lasikuituputkiin ja niitä käsiteltiin neste-

tuikelaskentaa varten. Pelkkä väliaine, joka oli negatiivisena verrokkina, ei sisältänyt mitään allergeeniä tai peptidiä. Tämän kokeen tulokset osoittavat, että tämä eri-* tyinen potilas reagoi S.I.:n ollessa vähintään 2,0 peptideihin, jotka on johdettu DP

I-l:stä, DP I-2:sta, DP l-4:stä, DP 1-1 lista, DP I-5:stä, DP I-13:sta, DP -15:stä, DP 25 I-6.1:stä, DP I-8:sta, DP I-9:stä, DP I-16:sta, DP I-10:stä ja DP I-17:sta (Tietoja ei ole esitetty).

Edellä olevaa menetelmää käytettiin lukuisissa muissa huonepölypunkkiallergisissa henkilöissä paitsi että a) yksittäisissä tapauksissa IL-2:n ja IL-4:n kanssa viljelemisen ajan pituus vaihteli, b) yksittäisissä tapauksissa T-solut herätettiin joko puhdiste-30 tulla luontaisella (N) tai rekombinanttisella (R) Der p I -proteiinilla joko 20 pg/ml tai 10 pg/ml ja c) yksittäisissä tapauksissa käytettiin röntgensäteilytettyä (3500 radia) autologista PBMCitä antigeeniä esittävinä soluina sekundaarisessa proliferaatio-testissä. Lisäksi kolmen peptidin (DP 1-11 (SEQ ID NO: 117), DP 1-12 (SEQ ID NO: 118) ja DP Π-3 (SEQ ID NO: 119) havaittiin sisältävän alhaisia lukumääriä 35 konservatiivisia muutoksia aminohapposekvenssistä olevasta luontaisesta sekvens- 104906 27 sistä. Lisäksi syntetoitiin kolme muuta peptidiä (DP 1-11.1 (SEQ E) NO: 13), DP 1-12.1 (SEQ ID NO: 14) ja DP Π-3.1 (SEQ Π) NO: 43), joissa ei ollut mitään muutoksia luontaisesta sekvenssistä. Joitakin T-soluanalyysejä tehtiin alkuperäisillä peptideillä (so. DP 1-11, DP 1-12 ja DP Π-3). Seuraavassa T-soluanalyysissä, joka suori-5 tetdin lisäpeptideillä (so. DP 1-11.1, DP 1-12.1 ja DP Π-3.1), ei havaittu mitään merkittävää alkuperäisten peptidien ja lisäpeptidien välistä positiivisen vasteen keskimääräisen S.I.:n tai prosenttimäärän eroa. Täten kummastakin peptidiiyhmästä peräisin olevat tiedot yhdistettiin.

Yksittäiset tulokset katsottiin positiivisiksi ja niitä käytettiin, jos ihminen reagoi Der 10 p I -proteiiniin ja vähintään yhteen Der p I:stä johdettuun proteiiniin S.I.:ssä 2,0 tai sen yli. 33 positiivisen kokeen tulosten yhteenveto pn esitetty kuviossa 5. Lepo-T-solulinjat, jotka herätettiin rekombinanttisella tai luontaisella Der p I-stimuloidulla PBMC:llä, testattiin synteettisiin Der p I -peptideihin reaktiivisuudeltaan. Kunkin peptidin maksimaalinen vaste antigeenin titrauksessa on ilmaistu T-solustimulaatio-15 indeksinä (S.I.). S.I. on jaksoja minuutissa (cpm), jotka solut sisällyttävät vasteena peptidiin jaettuna cpm:llä, jonka solut sisällyttävät pelkässä väliaineessa. S.l.-arvo, joka on suurempi kuin taustataso, osoittaa, että peptidi sisältää T-soluepitoopin. Kuitenkin vain yksittäisiä S.L-arvoja, jotka ovat suurempia tai yhtä sumia kuin 2,0 (vaste on kaksinkertainen tai enemmän venattuna taustaan) ja joita nimitetään tässä 20 "positiivisiksi" tuloksiksi, käytettiin laskettaessa kunkin peptidin keskimääräistä T-solustimulaatioindeksiä testatussa potilaassa tai potilasryhmässä. Histogrammissa kunkin pylvään yläpuolella on esitetty suluissa keskimääräiset T-solustimulaatio-indeksit, jotka on laskettu jättämällä pois suurimmat ja pienimmät positiiviset vas-: teet kunkin peptidin osalta äärimmäisyyksien vaikutuksen minimoimiseksi T-solu- 25 stimulaatioindeksi lasketaan: (T-solun cpm + APC + antigeeni! T-solun cpm + APC + verrokki

Pylväs esittää peptidin vasteen kumulatiivista järjestystä potilasryhmässä. Kumula-·' - 30 tiivisen järjestyksen määrittämiseksi määritettiin 5 peptidiä, joiden S.I. on suurin kussakin henkilössä, ja ne testattiin numerojärjestyksessä laskevassa järjestyksessä 5:n vastatessa voimakkainta vastetta. Kunkin peptidin järjestykset on laskettu sitten yhteen potilasryhmässä kunkin peptidin kumulatiivisen järjestyksen määrittämiseksi Jokaisen pylvään yläpuolella on positiivisten vasteiden prosentti S.I:n ollessa pep-35 tidille vähintään 2 testattujen potilaiden ryhmässä. Antamalla prosentti ja keskimääräinen T-solustimulointi-indeksi voidaan laskea kunkin peptidin positiivisuusindeksi 28 104906 (P.I.). Kullkin henkilön P.I. määritetään kertomalla keskimääräinen S.I. henkilöpro-sentilla huonepölypunkkiherkkien henkilöiden populaatiossa (esim. edullisesti vähintään IS henkilöä, edullisemmin vähintään 30 henkilöä tai enemmän), jotka reagoivat peptidiin S.I.:n ollessa vähintään 2,0 (esim. DP I-l:n osalta kuviossa 5, P.I. 5 olisi noin 343 (73 % x 4,7). Siksi P.I. edustaa sekä T-soluvasteen peptidiin voimakkuutta (S.I.) että T-soluvasteen peptidiin taajuutta huonepölypunkille herkkien henkilöiden populaatiossa. Kuvio S esittää, että peptidit DP 1-1, DP 1-2, DP 1-3, DP 1-4, DP 1-5, DP 1-6.1, DP 1-7.1, DP 1-8, DP 1-9, DP 1-16 ja DP 1-10 sisältävät T-solureaktiivisuuden merkittäviä alueita näissä potilaissa.

10 Esimerkki VI

T-solututkimukset Der f I:lla

Suoritettiin samanlaisia kokeita kuin esimerkissä V Der f I -proteiinin T-solureak-tiivisten alueiden määrittämiseksi. Esimerkiksi PBMC, joka peräisin huonepöly-punkkiallergisesta potilaasta, 783 eristettiin esimerkissä 5 kuvatusti ja stimuloitiin in 15 vitro rekombinanttisesti puhdistetulla Der f Iillä 20 pg/ml:na. Proliferaatiotestin tulokset Der f I -peptideillä käyttämällä röntgensäteilytettyä (3500 radia) autologista PBMC antigeeniä edustavina soluina, osoittavat, että tästä potilaasta reagoivat pepti-deihin DF 1-8.1, DF 1-9, DF1-6, DF 1-10, DF 1-2.1, DF 1-3, DF1-11, DF 1-5, DF 1-1 ja DF 1-17 (tietoja ei ole esitetty).

20 Edellä olevaa menetelmää käytettiin lukuisissa potilaissa paitsi että yksittäisissä tapauksissa T-solut herätettiin affiniteettipuhdistetulla Der f I:llä 20 pg/ml:na tai : · 10 μg/ml:na ja röntgensäteilytettyjä (25000 radia) autologisia Epstein-Barrviruksella transformoituja B-soluja käytettiin antigeeniä esittävinä soluina. 16 positiivisen kokeen tulosten yhteenveto on esitetty kuviossa 6. Tiedot analysoitiin kuten esimerkis-25 sä V kuvataan. Tiedot osoittavat, että Der f I -proteiinin merkittäviä T-solureaktiivi-suuden alueita on löydettävissä peptideistä DF 1-1, DF 1-2, DF 1-3, DF 1-4, DF 1-11, DF 1-5, DF 1-6, DF 1-7, DF 1-14, DF 1-15, DF 1-8.1 ja DF 1-9.

Esimerkki VH

Tutkimus, joka osoittaa Der p I- ja Der f I -T-soluepitooppien ristireaktiivisuu-30 den

Der p I- ja Der f I -proteiinit ovat hyvin homologisia (81 %:n identtisyys). Täten suoritettiin kokeita, jotka ovat samanlaisia kuin esimerkin V kokeet, Der p I:llä herätettyjen T-solulinjojen T-soluvasteiden määrittämiseksi, kun ne on stimuloitu erilai- 29 104906 silla Der p I -peptideillä ja oleellisesti yhteneväisillä Der f Π -peptideillä. T-solulin-jat herätettiin in vitro, kuten esimerkissä V kuvataan, ja niiden vaste oleellisesti samanlaisten Der p I-ja Der f I -peptidien (esim. DP 1-1 (Der p I:n aminohappotähteet 1-20) tai DF1-1 (Der f I.n aminohappotähteet 1-20) sarjaan testattiin. Tiedot analy-5 soitiin kuten esimerkissä V kuvataan paitsi että kuhunkin peptidiin positiivisten vasteiden suurimpia ja pienimpiä S.I-arvoja ei jätetty pois keskimääräisistä S.I.-las-kelmista. Tällaisten kokeiden lukumäärän yhteenveto on esitetty kuviossa 7. 14 positiivisen kokeen tulokset osoittavat, että Der p Iillä herätetyt T-solut reagoivat erilaisiin Der f I -peptideihin, mikä osoittaa ristireaktiivisuuden ryhmän I allergeeneis-10 sä. Der p Iillä herätetyt T-solut reagoivat merkittävästi peptideihin DF 1-1, DF 1-2, DF 1-3, DF 1-4, DF 1-11, DF 1-12, DF 1-15, DF 1-8, DF 1-9, DF 1-15 ja DF 1-6. Joissakin potilaissa Der f I -peptidi oli voimakkaampi Der p Iillä herätettyjen T-solujen stimulaattori kuin vastaava Der p I -peptidi. Kuviossa 8 esitetään käänteiskokeiden tulokset, joissa lukuisista potilaista peräisin olevat T-solut herätettiin in vitro Der f I 15 -proteiinille ja vaste erilaisiin Der p I -peptideihin ja oleellisesti samankaltaisten Der f I -peptidien Saijaan analysoitiin. 8 positiivisen kokeen tulokset osoittavat, että Der f Iillä herätetyt T-solut reagoivat merkittävästi peptideihin DP 1-1, DP 1-3, DP 1-4, DP 1-11/11, DP1-14, DP1-15, ja DP 1-8.

Esimerkki VIII

20 T-soluepitooppitutkimukset Der p 11:11a

Suoritettiin samanlaisia kokeita kuin esimerkissä V Der p Π -proteiinin T-solureak-tiivisten alueiden määrittämiseksi. Esimerkiksi PBMC, joka peräisin huonepöly-: . punkkiallergisesta potilaasta, 348 eristettiin esimerkissä 5 kuvatusti ja stimuloitiin in vitro 20 pg/ml puhdistetulla Der p 11:11a. Proliferaatiotestin tulokset käyttämällä 25 röntgensäteilytettyä (25000 radia) Epstein-Barr viruksella transformoituja autologi-sia B-soluja antigeeniä edustavina soluina erilaisten Der p Π -peptidien kanssa, osoittavat, että tämä erityinen potilas reagoi hyvin peptideihin DP Π-8.1, DP Π-9, DP Π-6, DP Π-10, DP Π-2.1, DP Π-3, DP Π-l 1, DP Π-5, DP Π-l ja DP Π-17 (tietoja ei ole esitetty).

. 30 Edellä olevaa menetelmää käytettiin lukuisissa potilaissa paitsi että yksittäisissä ta pauksissa T-solut herätettiin rekombinanttisella Der p Elliä 20 pg/mlina tai 3 pg/ml:na ja röntgensäteilytettyä (3500 radia) autologista PBMC käytettiin antigeeniä esittävinä soluina. 26 positiivisen kokeen tulosten yhteenveto on esitetty kuviossa 9. Tiedot analysoitiin kuten esimerkissä V kuvataan paitsi että peptidivastei-35 den summa analysoitiin ilmoittamalla arvo 3, 2 tai 1 kolmeen korkeimpaan S.I.-vas- 30 104906 teeseen. Der p Π -proteiinin merkittäviä T-solureaktiivisuuden alueita potilaissa on löydettävissä peptideistä DP Π-l, DP Π-2, DP Π-3, DP Π-4, DP Π-7, DP Π-8 ja DP Π-9.

Esimerkki IX

5 T-soluepitooppitutkimukset Der f 11:11a

Suoritettiin samanlaisia kokeita kuin esimerkissä V Der f Π -proteiinin T-solureaktii-visten alueiden määrittämiseksi. Esimerkiksi PBMC, joka peräisin huonepölypunk-kiallergisesta potilaasta, 384 stimuloitiin in vitro puhdistetulla rekombinanttisella Der f 11:11a ja T-solulinja stimuloitiin sitten röntgensäteilytettyjen (25000 radia) au-10 tologisten Epstein-Barr-viruksella transformoitujen B-solujen läsnäollessa antigeeniä edustavina soluina erilaisten limittyvien Der f Π -peptidien kanssa. Tämän proli-feraatiotestin tulokset osoittavat, että tämä erityisen potilaan T-solut reagoivat hyvin peptideihin DF Π-l, DF Π-2, DF Π-3.1, DF Π-4.5, DF Π-15, DF Π-16 ja DF Π-17 (tietoja ei ole esitetty).

15 Edellä olevaa menetelmää käytettiin 10 potilaassa paitsi että yksittäisissä tapauksissa T-solulinjat herätettiin stimuloimalla potilaan PBMC 20 pg:lla/ml tai 3 |ig:lla/ml puhdistettua luontaista Der f H:ta ja ne testattiin röntgensäteilytetyn (3500 radia) autologisen PBMC läsnäollessa antigeeniä esittävinä soluina. 10 positiivisen kokeen tulosten yhteenveto on esitetty kuviossa 10. Tiedot analysoitiin yksityiskohtaisesti 20 kuten esimerkissä IX kuvataan paitsi että kunkin peptidin positiivisten vasteiden korkeimpia ja alhaisimpia arvoja ei jätetty pois laskennasta. Tiedot osoittavat, että ; Der f II -proteiinin merkittäviä T-solureaktiivisuuden alueita on löydettävissä pepti deistä DF Π-l, DF Π-2, DF Π-13.1, DF Π-4.5, DF Π-15, DF Π-17 ja DF Π-19.1.

Esimerkki X

25 Tutkimus, joka osoittaa Der p Π- ja Der f Π -T-soluepitooppien ristireaktiivi-suuden * •

Suoritettiin tutkimus, joka on samanlainen kuin esimerkissä VH, Der p Π- ja Der f Π -proteiinien ristireaktiivisuuden määrittämiseksi. Der f Π -proteiinilla herätettyjä T-solulinjoja stimuloitoitiin erilaisilla Der f Π -peptideillä ja oleellisesti yhteneväisillä 30 Der p Π -peptideillä. 10 positiivisen kokeen tulokset on esitetty kuviossa 11. Tulokset osoittavat, että Der f ILllä herätetyt T-solut reagoivat merkittävästi peptideihin DP Π-l, DP Π-3/3.1, DP Π-4 ja DP Π-7. Kuviossa 12 esitetään käänteiskokeiden tulokset, joissa lukuisista potilaista peräisin olevat T-solut herätettiin in vitro Der p 104906 31 Π -proteiinille ja vaste erilaisiin Der f Π -peptideihin analysoitiin. 26 positiivisen kokeen tulokset osoittavat, että Der p II:lla herätetyt T-solut reagoivat merkittävästi peptideihin DF Π-l, DF Π-4.5, DF Π-15, DF Π-17, DF Π-18 ja DF Π-19.1.

Esimerkki XI

5 Dominanttien peptidien synteesi

Der p I:n, Der p Un, Der fl:n ja Der f Π:η T-solureaktiivisuuden pääalueet identifioitiin perustuen esimerkeissä V-X kuvattuihin analyyseihin. Jokaisessa tutkimuksessa kaikki testatut potilaat reagoivat proteiiniallergeeneihin (esim. Der p I) ja vähintään yhteen peptidiin, joka on johdettu proteiinissa olevan T-solureaktiivisuuden 10 pääalueelta. Pääasiallisen T-soluaktiivisuuden seitsemän aluetta (alue 1, alue 2, alue 3, alue 4, alue 5, alue 6a ja alue 6b) identifioitiin Der p I- ja Der f I -proteiineissa. Nämä alueet identifioitiin seuraaviksi: alue 1, Der p I-ja Der f I -proteiinien aminohappotähteet 1-28, alue 2, Der p I-ja Der f I -proteiinien aminohappotähteet 36-38, alue 3, Der p I-ja Der f I -proteiinien aminohappotähteet 74-109, alue 4, Der p I-ja 15 Der f I -proteiinien aminohappotähteet 118-139, alue 5, Der p I- ja Der f I -proteiinien aminohappotähteet 141-166, ja alue 6a, Der p I- ja Der f I -proteiinien aminohappotähteet 161-185 ja alue 6b, Der p I-ja Der f I -proteiinien aminohappotähteet 173-201.

Samaten identifioitiin Der p Π- ja Der f Π -proteiinin pääasiallisen T-solu-20 aktiivisuuden neljä aluetta. Nämä alueet identifioitiin seuraaviksi: alue 7, Der p Ilja Der f Π -proteiinien aminohappotähteet 1-26, alue 8, Der p Π- ja Der f Π -proteii-: nien aminohappotähteet 33-67, alue 9, Der p Π- ja Der f Π -proteiinien aminohappo tähteet 79-104 ja alue 10, Der p Π- ja Der f n -proteiinien aminohappotähteet 107-129. Perustuen osittain esimerkeissä V-X kuvattuun T-solureaktiivisuuteen pep-25 tidit, jotka on johdettu Der p I:stä, Der f Irstä, Der p n.sta ja Der f Ilrsta, valikoitiin ja modifioitiin lisäämällä tai poistamalla aminohappotähteitä peptidin joko 5 - tai 3-päästä. Näiden valikoitujen peptidien suunnittelussa otettiin huomioon useita erilaisia tekijöitä mukaan lukien limittyvien peptidien järjestykseen asetettu summa, vasteiden prosentti S.I.:n ollessa vähintään 2,0 peptidille, peptidien potentiaalinen risti-30 reaktiivisuus, peptidien valmistamisen vaikeus jne. Suoritettiin samanlaisia T-solu-tutkimuksia kuin esimerkeissä V-X kuvataan käyttämällä näitä valikoituja peptideijä T-solureaktiivisuuden pääasiallisten alueiden määrittämiseksi Der p 1- ja Der f 1 -proteiinin alueilla l-6a ja 6b ja Der p Π- ja Der f Π -proteiinin alueilla 7-10.

104906 32

Der p I-, Der f I-, Der p Π- ja Der f Π -proteiineista johdettuja valikoituja peptidejä käyttämällä saatujen T-solututkimusten tulokset on esitetty kuvioissa 13-18d, Esimerkissä V kuvattua menetelmää käytettiin T-solulinjoissa, jotka olivat peräisin Der p I -proteiinilla in vitro herätetyistä potilaista ja sitten Der fp I -sekvenssistä johdet-5 tujen valikoitujen peptidien vaste analysoitiin. 33 positiivisesta kokeesta peräisin olevat tulokset osoittavat, että Der p Iillä herätetyt solut reagoivat merkittävästi peptideihin, joita on peptideissä DP 1-21.1, DP 1-21.2, DP 1-25.2, DP 1-22.2, DP 1-25.2, DP 1-22.1, DP 1-23.1, DP 1-23.2, DP 1-26.1 ja DP 1-28.1.

Samaten seurattiin esimerkissä VI kuvattua menetelmää käyttäen T-solulinjoja, jotka 10 ovat peräisin 9 potilaasta, jotka on herätetty in vitro Der f I -proteiineille. Tiedot analysoitiin kuten esimerkissä VI kuvataan. Kuviossa 14 esitetyt 9 potilaan tulokset osoittavat Der f Iistä peräisin olevan T-solureaktiivisuuden valikoituihin peptideihin.

Toisessa kokeessa useasta potilaasta peräisin olevat T-solulinjat herätettiin in vitro Der p I -proteiineille ja analysoitiin niiden vaste valikoituihin peptideihin, jotka on 15 johdettu Der p I -proteiinista, ja oleellisesti yhtäläisiin peptideihin, jotka on johdettu Der f I -proteiinista. 30 positiivisesta kokeesta peräisin olevat tiedot analysoitiin kuten esimerkissä V kuvataan. Kuten kuviossa 15a esitetään, Der p Iillä herätetyt T-solut reagoivat merkittävästi peptideihin DF 1-21.1, DF 1-21.2, DF 1-22.2, DF 1-22.3, DF 1-22.4, DF 1-23.2, DF 1-25.1, DF 17-26.1 ja DF I 27.1. Kuvio 15b on ku-20 viossa 15a esitettyjen tietojen alajäijestely ja esittää Der p Iillä herätettyjen T-solujen vastetta peptideihin, jotka on analysoitu jäijestykseen asetetulla summalla. Kuvio 15b esittää, että DP I 23.Iillä on suurin tämän tutkimuksen peptidien tämän , ryhmän jäijestykseen asetettu summa. Kuvio 16a esittää käänteiskokeen tulokset, joissa 9 potilaasta peräisin olevat T-solut herätettiin in vitro Der f I -proteiinille ja 25 stimuloitiin valikoiduilla Der f I -peptideillä ja sarjalla oleellisesti yhteneväisiä Der p I -peptidejä. Tulokset osoittavat, että Der f Iillä herätetyt T-solut, jotka ovat peräisin 9 potilaasta, reagoivat valikoituihin peptideihin, jotka ovat peräisin Der p Iistä. Kuvio 16a esittää, että DF 1-22.1 in ja DF 1-25.1 in stimulointi-indeksi on tämän v peptidiryhmän suurin. Kuvio 16b on alajäijestely samoista tiedoista kuin kuviossa • - 30 16a esitetään ja esittää edullisten Der f I- ja Der p I -peptidien vasteen. Kuvio 16b esittää, että DF I-22.2:n stimulointi-indeksi on korkein tässä edullisten peptidien ryhmässä tässä kokeessa.

Toisesssa kokeessa analysoitiin seuraten esimerkissä Vm kuvattua menetelmää 29 potilaan vasteet, jotka oli herätetty in vitro Der p Π -proteiineille ja stimuloitu vali-35 koiduilla peptideillä, jotka on johdettu Der p Π -sekvenssistä. Kuviossa 17a esi- 33 104906 tetään, että Der p 11:11a herätetyt T-solut, jotka ovat peräisin yhdestä potilaasta, reagoivat valikoituihin Der p I:sta peräisin oleviin peptideihin. Kuvio 17b esittää tuloksia, jotka on saatu kokeesta, joka on samanlainen kuin kuviossa 17a esitetty potilaita ollessa 30 ja korkean ja matalan arvon ollessa jätetty pois keskiarvosta. Kuvio 17b 5 esittää, että DP Π 20.6:11a on suurin tämän tutkimuksen peptidien tämän ryhmän jäijestykseen asetettu summa. Kuvio 18a esittää käänteiskokeen tulokset, joissa 1 potilaasta peräisin olevat T-solut herätettiin in vitro Der f Π -proteiinille ja stimuloitiin valikoiduilla peptideillä, jotka on johdettu Der p Π -sekvenssistä. Kuvio 18a esittää, että Der f II:llä herätetyt T-solut, jotka ovat peräisin 10 potilaasta, reagoivat 10 valikoituihin peptideihin, jotka ovat peräisin Der p II:stä. Kuten kuviossa 18a esitetään, DF 1-25 :n stimulointi-indeksi on suurin. Kuvio 18b on alajäijestely samoista tiedoista kuin kuviossa 18a esitetään ja esittää luonteisella Der f Ulla herätettyjen T-solulinjojen vasteen edullisiin Der p Π -peptideihin analysoituna järjestetyllä summalla. Kuten kuviossa 18b esitetään DF II-25.2:llä on suurin edullisten peptidien 15 järjestetty summa ryhmässä tässä tutkimuksessa.

Esimerkki ΧΠ

Tutkimus, joka osoittaa valikoidun ryhmän I ja ryhmän Π epitooppien risti reaktiivisuuden

Suoritettiin samanlainen tutkimus kuin esimerkissä VII kuvataan T-soluilla, jotka 20 olivat peräisin 4 yhteneväisestä potilaasta, jotka oli herätetty in vitro ryhmän I proteiineilla, jotka olivat peräisin Der f:stä ja Der pistä ja sitten analysoitiin vaste valikoituihin edullisiin peptideihin, jotka olivat peräisin Der p I:stä ja Der f I:stä. Kuvi-: . on 18c tulokset osoittavat, että T-solureaktiivisuus lukuisiin valikoituihin edullisiin

Der p I -peptideihin oli oleellisesti yhtäläinen niiden Der f I -vastaparin kanssa ja 25 päinvastoin.

Kuvio 18d esittää samanlaisen tutkimuksen tuloksia, joka suoritettiin T-soluilla, jotka olivat peräisin 6 yhteensopivasta potilaasta, jotka oli herätetty in vitro ryhmän Π ’· proteiineilla, jotka olivat peräisin Der pistä ja Der fistä, sitten vaste valikoituihin edullisiin Der p Π ja Der f Π -peptideihin analysoitiin. Samoin kuin kuvion 18c tu-30 loksissa T-solureaktiivisuus Der p Π:η valikoituihin edullisiin lukuisiin peptideihin on oleellisesti samanlainen kuin niiden Der f Π -vastaparien ja päinvastoin.

34 104906

Esimerkki ΧΙΠ

IgE:n suoran punkkiallergeeniproteiineihin ja -peptideihin sitoutumisen testaaminen

Coming-testilevyt (#25882) päällystettiin 5 jig/ml:lla kutakin kuvioissa 19, 20 ja 21 5 lueteltua päällystysantigeeniä 50 μΙ/lOOml/kolo ja niitä inkuboitiin yön ajan * - · 4 °C:ssa. Päällystysantigeenit poistettiin ja kolot suojattiin 0,5 %:lla gelatiinia PBS:ssä, 300 μΐ/kolo 2 tuntia huoneenlämpötilassa. Yhdistetty ihmisen plasma (plasmanäytteiden sekoitus, näytteet 20 potilaasta, jotka olivat ihotestipositiivisia kaupalliselle punkkiuutteelle) laimennettiin PBS-Tweenillä (PBS ja 0,05 % ei-10 ionista pesuainetta Tween-20, Sigma, St. Louis, MO) ja 100 μΐ/kolo lisättiin ja inku-oitiin yön ajan 4°C:ssa (plasmanäytteet testattiin duplikaattina). Toista vasta-ainetta (biotinoitu vuohen anti-ihmisen IgE, 1:1000, Kirkegaard & Peity Laboratories Inc., : Gaithersburg, MD) lisättiin 100 μΐ/kolo yhden tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Tämä liuos poistettiin ja streptavidiini-HRPOrta, 1:10000 (Southern Biotechnology 15 Associates, Inc., Birmingham, AI) lisättiin sitten 100 μΐ/kolo yhden tunnin ajan huoneenlämpötilassa (kaikki kolot pestiin kolme kertaa PBS-Tweenillä kunkin inkubaa-tiovaiheen välillä). TMB Membrane Peroxidase Substrate -järjestelmää (Kirkegaard & Perry Laboratories) sekoitettiin juuri ja lisättiin 100 μΐ/kolo. Värin annettiin kehittyä 2-5 minuuttia. Reaktio pysäytettiin lisäämällä 100 ml/kolo 1 M fosforihappoa.

20 Levyt luettiin Microplate IL310 Autoreaderissa (Biotech Instruments, Winooski, VT) 450 nm:n suodattimella. Duplikaattikolojen absorbanssitasojen keskiarvo laskettiin. ELISA-testien graafisesti esitetyt tulokset (laimeneminen versus absorbanssi log) esitetään kuvioissa 19a-b, 20a-b ja 21a-h. Näiden kuvioiden selityksissä pystysuoraan lueteltujen päällystysantigeenien järjestys vastaa vasemmalta oikealle pääl-25 lystysantigeenejä, jotka on lueteltu jokaisen histogrammin osalta.

Kuviossa 19b esitetyt ELISA-testin tulokset osoittavat sekä biokemiallisesti puhdistetun Der p Π:η että rekombinanttisen Der p Π:η (eDer p Π) hyvää sitoutumista ihmisen IgE:hen eikä mitään havaittavaa sitoutumista Der p Π -peptideihin. IgE-si- •« .. toutuminen peptidien ja proteiinien Der p -sarjaan (kuviot 20a ja 20b) osoittavat sa- 30 maa reaktiivisuuden kaavaa kuin Der f -sarja. Se tarkoittaa, ettei ole mitään havaittavaa sitoutumista Der f I- tai Der f Π -peptideihin tai rekombinanttiseen Der f I:een sitoutumisen tapahtuessa pelkästään biokemiallisesti puhdistettuun Der f I:een ja rekombinanttiseen ja biokemiallisesti puhdistettuun Der f ILeen. Kummassakin tapauksessa näyttää esiintyvän parempi sitoutuminen rekombinanttiseen Der p ILeen tai ·1 35 Der f ILeen kuin biokemiallisesti puhdistettuihin muotoihin. Kaikki edellä mainitun 104906 35 ELISA-testin tiedoista johdetut johtopäätökset vahvistettiin toisella testimenetel- . mällä, pistetäplät nitroselluloosapaperilla, käyttäen samaa vasta-ainetta ja antigeeni-reagenssien sarjaa.

Antigeenivalmiste, jota käytettiin positiivisena verrokkina, oli neljän pääasiallisen 5 biokcmiallisesti puhdistetun punkkiallergeenin (Der f I, Der f I, Der p I ja Der p Π) seos (termi PMA tarkoittaa puhdistettua punkkiallergeeniä). Varasto generoitiin konsentraatiossa 100 pg kutakin proteiinia millimetriä kohti tai 400 pg kokonaispro-teiinia/ml. Valmistetta käytettiin kullakin päällystetyllä ELISA-levyllä. Näiden ELI-SA-testien tulokset on esitetty kuvioissa 21a-h. Jokaisella levyllä esiintyy selvää si-10 toutumista joko puhdistettuun tai rekombinanttiseen proteiiniin tai PMA-antigee-nivalmisteeseen, mikä osoittaa hyvää IgE-reaktiivisuutta. Kuitenkaan PMA-antigee-nivalmisteessa ei esiinny ei-spesifisen reaktiivisuuden korkeaa tasoa, joka esiintyy . taustalaimennuksessa, johon ei lisätty mitään ensimmäistä vasta-aineliuosta. Tämä ei-spesifmen reaktiivisuus esiintyy PMA-antigeenin ja biotinoidun toisen antigeenin 15 kesken eikä se sovi spesifisen IgE-reaktiivisuuden antigeeniin löytöön. Käyttämällä kaksinkertaista kvantitatiivista arvoa verrattuna taustaan korkeimmassa plasmakon-sentraaatiossa positiivisena lukemana ei esiinny mitään havaittavaa IgE-reaktiivisuutta mihinkään 65:stä peptidistä, jotka seulottiin tällä testausmenetelmällä.

Vaikka keksintöä on kuvattu viitaten sen edullisiin suoritusmuotoihin, muilla suori-20 tusmuodoilla saadaan samat tulokset. Esillä olevan keksinnön variaatiot ja modifikaatiot ovat ilmeisiä alan ammattimiehelle ja oheisten patenttivaatimusten on tarkoitettu kattavan tällaiset modifikaatiot ja ekvivalentit, jotka ovat keksinnön todellisen hengen mukaisia.

• > 1 • l « • · 36 104906

SEKVENSSILUETTELO

(1) YLEISTÄ TIETOA: (1) HAKUA: Kuo, Mei-chang

Garman, Richard 5 Greenstein, Julia (ii) KEKSINNÖN NIMITYS: Dennatophagoidesista (huonepölypunkeista) peräi-; : sin olevien pääasiallisten allergeenien T-soluepitoopit (iii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 119 (iv) KIRJEENVAIHTO-OSOITE:

10 (A) VASTAANOTTAJA: LAHIVE & COCKFIELD

(B) KATU: 60 State Street, suite #510 (C) KAUPUNKI: Boston (D) VALTIO: Massachusetts

(E) MAA: US

15 (F) ZIP: 02109 (v) TIETOKONEELLA LUETTAVA MUOTO: (A) VÄL1NETYYPPI: Levyke (B) TIETOKONE: IBM PC yhteensopiva

(C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: PC-DOS/MS-DOS

20 (D) OHJELMISTO: ASCII teksti (vi) HAKEMUKSEN TIEDOT: (A) HAKEMUSNUMERO: US 07/881 396 (B) JÄTTÖPÄIVÄ: 8.5.1992 : (C) LUOKITUS: 25 (viii) ASIAMIESTIEDOT: (A) NIMI: Mandragouras, Amy E.

(B) REKISTERINUMERO: P36207 (C) VIITENUMERO: IMI-012/IPC017C (ix) PUHELINYHTEYSTIEDOT: 30 (A) PUHELIN: (617) 227-7400 (B) TELEFAX: (617) 227-5941

(2) SEQ ID NO: 1: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 834 emäsparia 35 (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 37 104906 (ii) MOLEKYYUTYYPPI: cDNA (ix) PIIRRE:

(A) NIMI: CDS

(B) SIJAINTI: 1..738 5 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 1: AAA AAC CGA TTT TTG ATG AGT GCA GAA GCT TTT GAA CAC CTC AAA ACT . , 48

Lys Asn Arg Phe Leu Met Ser Ala Glu Ala Phe Glu His Leu Lys Thr 10 1 5 10 15 CAA TTC GAT TTG AAT GCT GAA ACT AAC GCC TGC AGT ATC AAT GGA AAT 96

Gin Phe Asp Leu Asn Ala Glu Thr Asn Ala Cys Ser lie Asn Gly Asr· 15 20 25 30 GCT CCA GCT GAA ATC GAT TTG CGA CAA ATG CGA ACT GTC ACT CCC ATT 144

Ala Pro Ala Glu lie Asp Leu Arg Gin Met Arg Thr Val Thr Pro lie 20 35 40 45

CGT ATG CAA GGA GGC TGT GGT TCA TGT TGG GCT TTC TCT GGT GTT GCC

192

Arg Met Gin Gly Gly Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Gly Val Ala 25 50 55 60 GCA ACT GAA TCA GCT TAT TTG GCT CAC CGT AAT CAA TCA TTG GAT CTT 240

Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala His Arg Asn Gin Ser Leu Asp Leu 30 65 70 75 80 GCT GAA CAA GAA TTA GTC GAT TGT GCT TCC CAA CAC GGT TGT CAT GGT 288

Ala Glu Gin Glu Leu Val Asp Cys Ala Ser Gin His Gly Cys His Gly 35 85 90 95 GAT ACC ATT CCA CGT GGT ATT GAA TAC ATC CAA CAT AAT GGT GTC GTC 336

Asp Thr lie Pro Arg Gly lie Glu Tyr lie Gin His Asn Gly Val Val 40 100 105 110

CAA GAA AGC TAC TAT CGA TAC GTT GCA CGA GAA CAA TCA TGC CGA CGA

/ 384

Gin Glu Ser Tyr Tyr Arg Tyr Val Ala Arg Glu Gin Ser Cys Arg Arg 45 115 120 125

CCA AAT GCA CAA CGT TTC GGT ATC TCA AAC TAT TGC CAA ATT TAC CCA

432

Pro Asn Ala Gin Arg Phe Gly lie Ser Asn Tyr Cys Gin lie Tyr Pro 50 130 135 140

CCA AAT GCA AAC AAA ATT CGT GAA GCT TTG GCT CAA ACC CAC AGC GCT

480 104906 38

Pro Asn Ala Asn Lys lie Arg Glu Ala Leu Ala Gin Thr His Ser Ala 145 150 155 160.-^

ATT GCC GTC ATT ATT GGC ATC AAA GAT TTA GAC GCA TTC CGT CAT TAT

5 528

Ile Ala Val lie lie Gly lie Lys Asp Leu Asp Ala Phe Arg His Tyr.

165 170 175 GAT GGC CGA ACA ATC ATT CAA CGC GAT AAT GGT TAC CAA CCA AAC TAT 10 576 . . ;

Asp Gly Arg Thr lie lie Gin Arg Asp Asn Gly Tyr Gin Pro Asn Tyr'" 180 185 190 CAC GCT GTC AAC ATT GTT GGT TAC AGT AAC GCA CAA GGT GTC GAT TAT 15 624

His Ala Val Asn lie Val Gly Tyr Ser Asn Ala Gin Gly Val Asp Tyr 195 200 205 TGG ATC GTA CGA AAC AGT TGG GAT ACC AAT TGG GGT GAT AAT GGT TAC 20 672 !

Trp lie Val Arg Asn Ser Trp Asp Thr Asn Trp Gly Asp Asn Gly Tyr 210 215 220 GGT TAT TTT GCT GCC AAC ATC GAT TTG ATG ATG ATT GAA GAA TAT CCA 25 720

Gly Tyr Phe Ala Ala Asn lie Asp Leu Met Met lie Glu Glu Tyr Pro 225 230 235 240 TAT GTT GTC ATT CTC TAAACAAAAA GACAATTTCT TATATGATTG TCACTAATTT 30 775

Tyr Val Val lie Leu 245 ATTTAAAATC AAAATTTTTT AGAAAATGAA TAAATTCATT CACAAAAATT AAAAAAAAA 35 834 (2) SEQ ID NO:2 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 245 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 40 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:2:

Lys Asn Arg Phe Leu Met Ser Ala Glu Ala Phe Glu His Leu Lys Thr 45 1 5 10 15

Gin Phe Asp Leu Asn Ala Glu Thr Asn Ala Cys Ser Ile Asn Gly Asn 20 25 30 ·* 50 Ala Pro Ala Glu Ile Asp Leu Arg Gin Met Arg Thr Vai Thr Pro Ile 35 40 45 104906 39

Arg Met Gin Gly Gly Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Gly Val Ala' 50 55 60 5 Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala His Arg Asn Gin Ser Leu Asp Leu 65 70 75 80

Ala Glu Gin Glu Leu Val Asp Cys Ala Ser Gin His Gly Cys His Gly 85 90 95 10 . . . Asp Thr He Pro Arg Gly He Glu Tyr He Gin His Asn Gly Val Val 100 105 110

Gin Glu Ser Tyr Tyr Arg Tyr Val Ala Arg Glu Gin Ser Cys Arg Arg 15 115 120 125

Pro Asn Ala Gin Arg Phe Gly He Ser Asn Tyr Cys Gin He Tyr Pro 130 135 140 20 Pro Asn Ala Asn Lys He Arg Glu Ala Leu Ala Gin Thr His Ser Ala · 145 150 155 160

He Ala Val He He Gly He Lys Asp Leu Asp Ala Phe Arg His Tyr 165 170 175 25

Asp Gly Arg Thr He He Gin Arg Asp Asn Gly Tyr Gin Pro Asn Tyr 180 185 190

His Ala Val Asn He Val Gly Tyr Ser Asn Ala Gin Gly Val Asp Tyr 30 195 200 205

Trp He Val Arg Asn Ser Trp Asp Thr Asn Trp Gly Asp Asn Gly Tyr 210 215 220 35 Gly Tyr Phe Ala Ala Asn He Asp Leu Met Met He Glu Glu Tyr Pro 225 230 235 240

Tyr Val Val He Leu 245

40 (2) SEQ ID NO:3: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 588 emäsparia :* (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen 45 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA (v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen 104906 40 (ix) PIIRRE:

(A) MINI/AVAIN; CDS

(B) SIJAINTI: 69..509 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:3: 5 CACAAATTCT TCTTTCTTCC TTACTACTGA TCATTAATCT GAAAACAAAA CCAAACAAAC 6° « - Ϊ CATTCAAA ATG ATG TAC AAA ATT TTG TGT CTT TCA TTG TTG GTC GCA GCC 10 110

Met Met Tyr Lys lie Leu Cys Leu Ser Leu Leu Val Ala Ala 15 10 GTT GCT CGT GAT CAA GTC GAT GTC AAA GAT TGT GCC AAT CAT GAA ATC 15 158

Val Ala Arg Asp Gin Val Asp Val Lys Asp Cys Ala Asn His Glu lie 15 20 25 30 , $ AAA AAA GTT TTG GTA CCA GGA TGC CAT GGT TCA GAA CCA TGT ATC ATT 20 206

Lys Lys Val Leu Val Pro Gly Cys His Gly Ser Glu Pro Cys lie lie 35 40 45 CAT CGT GGT AAA CCA TTC CAA TTG GAA GCC GTT TTC GAA GCC AAC CAA 25 254

His Arg Gly Lys Pro Phe Gin Leu Glu Ala Val Phe Glu Ala Asn Gin 50 55 60

AAC ACA AAA ACG GCT AAA ATT GAA ATC AAA GCC TCA ATC GAT GGT TTA

30 302

Asn Thr Lys Thr Ala Lys lie Glu lie Lys Ala Ser lie Asp Gly Leu 65 70 75

GAA GTT GAT GTT CCC GGT ATC GAT CCA AAT GCA TGC CAT TAC ATG AAA

35 350

Glu Val Asp Val Pro Gly lie Asp Pro Asn Ala Cys His Tyr Met Lys 80 85 90 TGC CCA TTG GTT AAA GGA CAA CAA TAT GAT ATT AAA TAT ACA TGG AAT 40 398

Cys Pro Leu Val Lys Gly Gin Gin Tyr Asp lie Lys Tyr Thr Trp Asn 95 100 105 110

GTT CCG AAA ATT GCA CCA AAA TCT GAA AAT GTT GTC GTC ACT GTT AAA

45 446

Val Pro Lys lie Ala Pro Lys Ser Glu Asn Val Val Val Thr Val Lys 115 120 125 GTT ATG GGT GAT GAT GGT GTT TTG GCC TGT GCT ATT GCT ACT CAT GCT 50 494

Val Met Gly Asp Asp Gly Val Leu Ala Cys Ala lie Ala Thr His Ala 130 135 140 104906 41 AAA ATC CGC GAT TAAATAAACA AAATTTATTG ATTTTGTAAT CACAAATGAT 546

Lys lie Arg Asp 145 5 TGATTTTCTT TCCAAAAAAA AAATAAATAA AATTTTGGGA AT 588 (2) SEQ ID NO:4: TIEDOT . . , (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: 10 (A) PITUUS: 146 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:4: 15 ·' :

Met Met Tyr Lys Ile Leu Cys Leu Ser Leu Leu Vai Ala Ala Vai Ala 15 10 15

Arg Asp Gin Vai Asp Vai Lys Asp Cys Ala Asn His Glu Ile Lys Lys 20 20 25 30

Vai Leu Vai Pro Gly Cys His Gly Ser Glu Pro Cys Ile Ile His Arg 35 40 45 25 Gly Lys Pro Phe Gin Leu Glu Ala Vai Phe Glu Ala Asn Gin Asn Thr 50 55 60

Lys Thr Ala Lys Ile Glu Ile Lys Ala Ser Ile Asp Gly Leu Glu Vai 65 70 75 80 30 - - Asp Vai Pro Gly Ile Asp Pro Asn Ala Cys His Tyr Met Lys Cys Pro 85 90 95

Leu Vai Lys Gly Gin Gin Tyr Asp Ile Lys Tyr Thr Trp Asn Vai Pro 35 100 105 110

Lys Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Vai Vai Vai Thr Vai Lys Vai Met 115 120 125 40 Gly Asp Asp Gly Vai Leu Ala Cys Ala Ile Ala Thr His Ala Lys Ile . 130 135 140

Arg Asp 145 45 104906 * 42

(2) SEQ Π) NO:5: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 1072 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo 5 (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA (ix) (A) NIMI/AVAIN: CDS

(B) SIJAINTI: 36..1001 10 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:5: CGTTTTCTTC CATCAAAATT AAAAATTCAT CAAAA ATG AAA TTC GTT TTG GCC 53

Met Lys Phe Vai Leu Ala · .

15 1 5 ' ATT GCC TCT TTG TTG GTA TTG AGC ACT GTT TAT GCT CGT CCA GCT TCA 101

Ile Ala Ser Leu Leu Vai Leu Ser Thr Vai Tyr Ala Arg Pro Ala Ser 20 10 15 20 ATC AAA ACT TTT GAA GAA TTC AAA AAA GCC TTC AAC AAA AAC TAT GCC 149

Ile Lys Thr Phe Glu Glu Phe Lys Lys Ala Phe Asn Lys Asn Tyr Ala 25 25 30 35 ACC GTT GAA GAG GAA GAA GTT GCC CGT AAA AAC TTT TTG GAA TCA TTG 197

Thr Vai Glu Glu Glu Glu Vai Ala Arg Lys Asn Phe Leu Glu Ser Leu 30 40 45 50 AAA TAT GTT GAA GCT AAC AAA GGT GCC ATC AAC CAT TTG TCC GAT TTG 245

Lys Tyr Vai Glu Ala Asn Lys Gly Ala Ile Asn His Leu Ser Asp Leu 35 55 60 65 70 TCA TTG GAT GAA TTC AAA AAC CGT TAT TTG ATG AGT GCT GAA GCT TTT 293

Ser Leu Asp Glu Phe Lys Asn Arg Tyr Leu Met Ser Ala Glu Ala Phe 40 75 80 85 GAA CAA CTC AAA ACT CAA TTC GAT TTG AAT GCC GAA ACA AGC GCT TGC 341

Glu Gin Leu Lys Thr Gin Phe Asp Leu Asn Ala Glu Thr Ser Ala Cys 45 90 95 100 CGT ATC AAT TCG GTT AAC GTT CCA TCG GAA TTG GAT TTA CGA TCA CTG 389 . Arg Ile Asn Ser Vai Asn Vai Pro Ser Glu Leu Asp Leu Arg Ser Leu 50 105 110 115 104906 43

CGA ACT GTC ACT CCA ATC CGT ATG CAA GGA GGC TGT GGT TCA TGT TGG

. _ ··*·»*» 437

Arg Thr Val Thr Pro lie Arg Met Gin Gly Gly Cys Gly Ser Cys Τη.) 120 125 130 5 GCT TTC TCT GGT GTT GCC GCA ACT GAA TCA GCT TAT TTG GCC TAC CGT 485

Ala Phe Ser Gly Val Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg 135 140 145 150 10 AAC ACG TCT TTG GAT CTT TCT GAA CAG GAA CTC GTC GAT TGC GCA TCT: 533

Asn Thr Ser Leu Asp Leu Ser Glu Gin Glu Leu Val Asp Cys Ala Ser 155 160 165 15 CAA CAC GGA TGT CAC GGC GAT ACA ATA CCA AGA GGC ATC GAA TAC ATC 581

Gin His Gly Cys His Gly Asp Thr lie Pro Arg Gly lie Glu Tyr lie 170 175 180 20 : *: CAA CAA AAT GGT GTC GTT GAA GAA AGA AGC TAT CCA TAC GTT GCA CGA 629

Gin Gin Asn Gly Val Val Glu Glu Arg Ser Tyr Pro Tyr Val Ala Arg 185 190 195 25 GAA CAA CGA TGC CGA CGA CCA AAT TCG CAA CAT TAC GGT ATC TCA AAC 677

Glu Gin Arg Cys Arg Arg Pro Asn Ser Gin His Tyr Gly lie Ser Asn 200 205 210 30 TAC TGC CAA ATT TAT CCA CCA GAT GTG AAA CAA ATC CGT GAA GCT TTG 725

Tyr Cys Gin lie Tyr Pro Pro Asp Val Lys Gin lie Arg Glu Ala Leu 215 220 225 230 35

ACT CAA ACA CAC ACA GCT ATT GCC GTC ATT ATT GGC ATC AAA GAT TTG

773

Thr Gin Thr His Thr Ala lie Ala Val lie lie Gly lie Lys Asp Leu 235 240 245 40 AGA GCT TTC CAA CAT TAT GAT GGA CGA ACA ATC ATT CAA CAT GAC AAT 821

Arg Ala Phe Gin His Tyr Asp Gly Arg Thr lie lie Gin His Asp Asn 250 255 260 45

., GGT TAT CAA CCA AAC TAT CAT GCC GTC AAC ATT GTC GGT TAC GGA AGT

: 869

Gly Tyr Gin Pro Asn Tyr His Ala Vai Asn He Val Gly Tyr Gly Ser 265 270 275 50 ACA CAA GGC GAC GAT TAT TGG ATC GTA CGA AAC AGT TGG GAT ACT ACC 917

Thr Gin Gly Asp Asp Tyr Trp He Val Arg Asn Ser Trp Asp Thr Thr 280 285 290 . 55 104906 44 TGG GGA GAT AGC GGA TAC GGA TAT TTC CAA GCC GGA AAC AAC CTC ATG 965

Trp Gly Asp Ser Gly Tyr Gly Tyr Phe Gin Ala Gly Asn Asn Leu Met 295 300 305 310 5 ATG ATC GAA CAA TAT CCA TAT GTT GTA ATC ATG TGAACATTTG AAATTGAATA 1018

Met lie Glu Gin Tyr Pro Tyr Vai Val lie Met 315 320 10 TATTTATTTG TTTTCAAAAT AAAAACAACT ACTCTTGCGA GTATTTTTTA CTCG * ’ 1072

(2) SEQ ID NO:6: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: 15 (A) PITUUS: 321 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo . : (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:6: 20

Met Lys Phe Vai Leu Ala Ile Ala Ser Leu Leu Vai Leu Ser Thr Vai 15 10 15

Tyr Ala Arg Pro Ala Ser Ile Lys Thr Phe Glu Glu Phe Lys Lys Ala 25 20 25 30

Phe Asn Lys Asn Tyr Ala Thr Vai Glu Glu Glu Glu Vai Ala Arg Lys 35 40 45 30 Asn Phe Leu Glu Ser Leu Lys Tyr Vai Glu Ala Asn Lys Gly Ala Ile 50 55 60

Asn His Leu Ser Asp Leu Ser Leu Asp Glu Phe Lys Asn Arg Tyr Leu 65 70 75 80 35

Met Ser Ala Glu Ala Phe Glu Gin Leu Lys Thr Gin Phe Asp Leu Asn 85 90 95

Ala Glu Thr Ser Ala Cys Arg Ile Asn Ser Vai Asn Vai Pro Ser Glu 40 100 105 110 •'

Leu Asp Leu Arg Ser Leu Arg Thr Vai Thr Pro Ile Arg Met Gin Gly 115 120 125 45 Gly Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Gly Vai Ala Ala Thr Glu Ser 130 135 140

Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg Asn Thr Ser Leu Asp Leu Ser Glu Gin Glu 145 150 155 160 50 104906 45

Leu Vai Asp Cys Ala Ser Gin His Gly Cys His Gly Asp Thr Ile Pro 165 170 175

Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gin Gin Asn Gly Vai Vai Glu Glu Arg Ser 5 180 185 190

Tyr Pro Tyr Vai Ala Arg Glu Gin Arg Cys Arg Arg Pro Asn Ser Gin 195 200 205 10 His Tyr Gly Ile Ser Asn Tyr Cys Gin Ile Tyr Pro Pro Asp Vai Lys ... 210 215 220 * * 9

Gin Ile Arg Glu Ala Leu Thr Gin Thr His Thr Ala Ile Ala Vai Ile 225 230 235 240 15

Ile Gly Ile Lys Asp Leu Arg Ala Phe Gin His Tyr Asp Gly Arg Thr 245 250 255

Ile Ile Gin His Asp Asn Gly Tyr Gin Pro Asn Tyr His Ala Vai Asu 20 260 265 270 V.:

Ile Vai Gly Tyr Gly Ser Thr Gin Gly Asp Asp Tyr Trp Ile Vai Arg 275 280 285 25 Asn Ser Trp Asp Thr Thr Trp Gly Asp Ser Gly Tyr Gly Tyr Phe Gin 290 295 300

Ala Gly Asn Asn Leu Met Met Ile Glu Gin Tyr Pro Tyr Vai Vai Ile 305 310 315 320 30

Met

(2) SEQ ID NO:7: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: 35 (A) PITUUS: 491 emäspaiia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA 40 (ix) PIIRRE:

(A) NIMI/AVAIN: CDS

(B) SIJAINTI: 1..390 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:7: 45 GAT CAA GTC GAT GTT AAA GAT TGT GCC AAC AAT GAA ATC AAA AAA GTA 48 .. Asp Gin Vai Asp Vai Lys Asp Cys Ala Asn Asn Glu Ile Lys Lys Vai 15 10 15 104906 46 ATG GTC GAT GGT TGC CAT GGT TCT GAT CCA TGC ATA ATC CAT CGT GGT 96 .♦··.

Met Val Asp Gly Cys His Gly Ser Asp Pro Cys lie lie His Arg Gly 20 25 30 5 AAA CCA TTC ACT TTG GAA GCC TTA TTC GAT GCC AAC CAA AAC ACT AAA 144

Lys Pro Phe Thr Leu Glu Ala Leu Phe Asp Ala Asn Gin Asn Thr Lys 35 40 45 10 ACC GOT AAA ACT GAA ATC AAA GCC AGC CTC GAT GGT CTT GAA ATT GAT' 192

Thr Ala Lys Thr Glu lie Lys Ala Ser Leu Asp Gly Leu Glu lie Asp 50 55 60 15 GTT CCC GGT ATT GAT ACC AAT GOT TGC CAT TTT ATG AAA TGT CCA TTG 240

Val Pro Gly lie Asp Thr Asn Ala Cys His Phe Met Lys Cys Pro Lea 65 70 75 80 20 : GTT AAA GGT CAA CAA TAT GAT GCC AAA TAT ACA TGG AAT GTG CCC AAA 288

Val Lys Gly Gin Gin Tyr Asp Ala Lys Tyr Thr Trp Asn Val Pro Lys 85 90 95 25 ATT GCA CCA AAA TCT GAA AAC GTT GTC GTT ACA GTC AAA CTT GTT GGT 336 lie Ala Pro Lys Ser Glu Asn Val Val Val Thr Val Lys Leu Val Gly 100 105 110 30 GAT AAT GGT GTT TTG GCT TGC GOT ATT GOT ACC CAC GOT AAA ATC CGT 384

Asp Asn Gly Val Leu Ala Cys Ala lie Ala Thr His Ala Lys lie Arg 115 120 125 35

GAT TAAAAAAAAA AAATAAATAT GAAAATTTTC ACCAACATCG AACAAAATTC

; 437 * ' Asp 130 40 AATAACCAAA ATTTGAATCA AAAACGGAAT TCCAAGCTGA GCGCCGGTCG CTAC 491

(2) SEQ ID NO:8: TIEDOT

Z (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: 45 (A) PITUUS: 129 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini •« (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:8 47 104506

Asp Gin Vai Asp Vai Lys Asp Cys Ala Asn Asn Glu Ile Lys Lys Vai 15 10 15 5

Met Val Asp Gly Cys His Gly Ser Asp Pro Cys lie lie His Arg G3y 20 25 30

Lys Pro Phe Thr Leu Glu Ala Leu Phe Asp Ala Asn Gin Asn Thr Lys. 10 35 40 45 V

Thr Ala Lys Thr Glu lie Lys Ala Ser Leu Asp Gly Leu Glu lie Asp 50 55 60 15 Val Pro Gly lie Asp Thr Asn Ala Cys His Phe Met Lys Cys Pro Leu 65 70 75 80

Val Lys Gly Gin Gin Tyr Asp Ala Lys Tyr Thr Trp Asn Val Pro Ly§ 85 90 95 : 20 lie Ala Pro Lys Ser Glu Asn Val Val Val Thr Val Lys Leu Val Gly 100 105 110

Asp Asn Gly Val Leu Ala Cys Ala lie Ala Thr His Ala Lys lie Arg 25 115 120 125

Asp (2) SEQ ID NO:9: TIEDOT 30 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 20 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 35 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-tenninaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:9:

Thr Asn Ala Cys Ser Ile Asn Gly Asn Ala Pro Ala Glu Ile Asp Leu 15 10 15 40

Arg Gin Met Arg 20 •« 104906 48

(2) SEQ TD NO: 10: TIEDOT

(1) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 27 aminohappoa (B) TIEDOT: aminohappo 5 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTOTYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 10: 10 Glu Ile Asp Leu Arg Gin Met Arg Thr Vai Thr Pro Ile Arg Met Gin 15 10 15

Gly Gly Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Gly 20 25 15

(2) SEQ ID NO: 11: TIEDOT

(1) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 29 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 20 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTIT YYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 11: 25 I Thr Vai Thr Pro Ile Arg Met Gin Gly Gly Cys Gly Ser Cys Trp Ala * 1 5 10 15

Phe Ser Gly Vai Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala 30 20 25

(2) SEQ ID NO: 12: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 210 aminohappoa 35 (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen 104906 49 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:12:

• A

Val Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala His Arg Asn Gin Ser Leu 15 10 15 5

Asp Leu Ala Glu Gin 20 • c • * (2) SEQ ID NO: 13-.TIEDOT 10 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 22 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi .. .

15 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-tenninaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ Π) NO: 13:

His Arg Asn Gin Ser Leu Asp Leu Ala Glu Gin Glu Leu Vai Asp Cys 15 10 15 20

Ala Ser Gin His Gly Cys 20 (2) SEQ ID NO: 14: TIEDOT 25 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 21 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 30 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N -terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 14: ** Glu Leu Vai Asp Cys Ala Ser Gin His Gly Cys His Gly Asp Thr Ile 1 5 10 15 35

Pro Arg Gly Ile Glu 20 104906 50

(2) SEQ YD NO:15: TIEDOT

(1) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 28 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 5 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 15: 10 Gly Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gin His Asn Gly Vai 15 10 15

Vai Gin Glu Ser Tyr Tyr Arg Tyr Vai Ma Arg Glu 20 25 15

(2) SEQ ID NO: 16: TIEDOT

(1) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 20 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 20 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 16: 25 Glu Tyr Ile Gin His Asn Gly Vai Vai Gin Glu Ser Tyr Tyr Arg Tyr .1 5 10 15

Vai Ala Arg Glu 20 30

(2) SEQ ID NO: 17: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: .. (A) PITUUS: 25 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 35 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen 51 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:17: 104906

His Asn Gly Vai Vai Gin Glu Ser Tyr Tyr Arg Tyr Val Ala Arg Glu 1 5 10 15

Gin Ser Cys Arg Arg Pro Asn Ala Gin 20 25 ** ** · (2) SEQ ID NO: 18: TIEDOT 10 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 19 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 15 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ Π) NO:18:

Gin Ser Cys Arg Arg Pro Asn Ala Gin Arg Phe Gly Ile Ser Asn Tyr 15 10 15 20

Cys Gin Ile

(2) SEQ ID NO: 19: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: 25 (A) PITUUS: 22 aminohappoa . . (B) TYYPPI: aminohappo ·* (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen 30 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 19:

Arg Phe Gly Ile Ser Asn Tyr Cys Gin Ile Tyr Pro Pro Asn Ala Asn l 5 10 15 ·· 35 Lys Ile Arg Glu Ala Leu 20 104906 52

(2) SEQ ID NO.20: TIEDOT

(1) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 24 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 5 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen .

(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:20: 10 Tyr Pro Pro Asn Ala Asn Lys Ile Arg Glu Ala Leu Ala Gin Thr His 15 10 15

Ser Ala Ile Ala Vai Ile Ile Gly 20 is : ;

(2) SEQ ID NO:21: TIEDOT

(1) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 26 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 20 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:21 : 25 Ala Gin Thr His Ser Ala Ile Ala Vai Ile Ile Gly Ile Lys Asp Leu - - 1 5 10 15

Asp Ala Phe Arg His Tyr Asp Gly Arg Thr 20 25 30

(2) SEQ ID NO:22: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: .. (A) PITUUS: 260 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 35 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen 104906 53 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:22:

Ile Lys Asp Leu Asp Ala Phe Arg His Tyr Asp Gly Thr Arg Ile He 15 10 15 5

Gin Arg Asp Asn Gly Tyr Gin Pro Asn Tyr 20 25 • (2) SEQ ID NO:23: TIEDOT 10 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 230 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITΥΎΡΡΙ: peptidi .· : 15 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-tenninaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:23:

Ile Ile Gin Arg Asp Asn Gly Tyr Gin Pro Asn Tyr His Ala Vai Asn 15 10 15 20

Ile Vai Gly Tyr Ser Asn Ala 20 (2) SEQ ID NO:24: TIEDOT 25 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 22 aminohappoa .· (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 30 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-tenninaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:24:

His Ala Vai Asn Ile Vai Gly Tyr Ser Asn Ala Gin Gly Vai Asp Tyr 1 5 10 15 35 . . Trp Ile Vai Arg Asn Ser 20 104906 54

(2) SEQ ID NO:25: TIEDOT

(1) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 24 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 5 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen : : (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:25: 10 Gin Gly Vai Asp Tyr Trp Ile Vai Arg Asn Ser Trp Asp Thr Asn Trp 15 10 15

Gly Asp Asn Gly Tyr Gly Tyr Phe 20 15

(2) SEQ ID NO:26: TIEDOT

(1) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 26 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 20 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:26: 25 Gly Asp Asn Gly Tyr Gly Tyr Phe Ala Ala Asn Ile Asp Leu Met Met - . 1 5 10 15 L.

Ile Glu Glu Tyr Pro Tyr Vai Vai Ile Leu 20 25 30

(2) SEQ ID NO:27: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: ·· I V / .. (A) PITUUS: 28 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 35 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen 104906 55 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:27:

Thr Asn Ala Cys Ser lie Asn Gly Asn Ala Pro Ala Glu lie Asp Leu 15 10 15 5

Arg Gin Met Arg Thr Val Thr Pro lie Arg Met Gin 20 25 (2) SEQ ID NO:28: TIEDOT 10 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 28 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 15 (v) FRAGMENTOTYYPPI: N-tenninaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:28:

Ser Ile Asn Gly Asn Ala Pro Ala Glu Ile Asp Leu Arg Gin Met Arg 15 10 15 20

Thr Vai Thr Pro Ile Arg Met Gin 20 (2) SEQ ID NO:29: TIEDOT 25 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 29 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 30 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-tenninaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:29:

Ala Phe Ser Gly Vai Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala His Arg " 1 5 10 15 35

Asn Gin Ser Leu Asp Leu Ala Glu Gin Glu Leu Vai Asp 20 25 « 104906

(2) SEQ ID ΝΟ:30: TIEDOT

(1) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 25 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 5 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:30: 10 Vai Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala His Arg Asn Gin Ser Leu 15 10 15

Asp Leu Ala Glu Gin Glu Leu Vai Asp 20 25 15

(2) SEQ ID NO:31: TIEDOT

(1) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 25 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 20 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:31: 25 Ala Phe Ser Gly Vai Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala His Arg 1 5 10 15

Asn Gin Ser Leu Asp Leu Ala Glu Gin 20 25 30

(2) SEQ ID NO:32: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: .. (A) PITUUS: 29 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 35 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen • > (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ Π) ΝΟ:32: : .

104906 57

Vai Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala His Arg Asn Gin Ser Leu 15 10 15 5

Asp Leu Ala Glu Gin Glu Leu Vai Asp Cys Ala Ser Gin 20 25 (2) SEQ ID NO:33 : TIEDOT 10 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 28 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 15 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:33:

Glu Tyr Ile Gin His Asn Gly Vai Vai Gin Glu Ser Tyr Tyr Arg Tyr 15 10 15 20

Vai Ala Arg Glu Gin Cys Arg Arg Pro Asn Ala Gin 20 25 (2) SEQ ID NO:34: TIEDOT 25 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 29 aminohappoa . (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 30 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:34:

Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gin His Asn Gly Vai Vai 15 10 15 35 „ Gin Glu Ser Tyr Tyr Arg Tyr Vai Ala Arg Glu Gin Ser 20 25 104906 58 (2) SEQ ID NO:35: TIEDOT .

(1) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 29 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 5 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:35: 10 Gin Ile Tyr Pro Pro Asn Ala Asn Lys Ile Arg Glu Ala Leu Ala Gin 15 10 15

Thr His Ser Ala Ile Ala Vai Ile Ile Gly Ile Lys Asp 20 25 15 :*

(2) SEKVENSSIN ID NO:36: TIEDOT

(1) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 22 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 20 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:36: 25 Gin Ile Tyr Pro Pro Asn Ala Asn Lys Ile Arg Glu Ala Leu Ala Gin ... 1 5 10 15

Thr His Ser Ala Ile Ala 20 30

(2) SEQ ID NO:37: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: .. (A) PITUUS: 26 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 35 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen 104906 59 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:37:

Ile Ile Gly Ile Lys Asp Leu Asp Ala Phe Arg His Tyr Asp Gly Arg 1 5 10 15 5

Thr Ile Ile Gin Arg Asp Asn Gly Tyr Gin 20 25 (2) SEQ ID NO:38: TIEDOT 10 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 25 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 15 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ Π) NO:38:

Arg Asp Asn Gly Tyr Gin Phe Asn Tyr His Ala Vai Asn Ile Vai Gly 15 10 15 20

Tyr Ser Asn Ala Gin Gly Vai Asp Tyr 20 25 (2) SEQ ID NO:39: TIEDOT 25 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 29 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 30 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:39:

Asn Ile Vai Gly Tyr Ser Asn Ala Gin Gly Vai Asp Tyr Trp Ile Vai . 1 5 10 15 35

Arg Asn Ser Trp Asp Thr Asn Trp Gly Asp Asn Gly Tyr 20 25 104906 60 (2) SEQ ID NO:40: TIEDOT .

(1) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 23 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 5 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-tenninaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:40: 10 Asn Ile Vai Gly Tyr Ser Asn Ala Gin Gly Vai Asp Tyr Trp Ile Vai 15 10 15

Arg Asn Ser Trp Asp Thr Asn 20 15

(2) SEQ ID NO:41: TIEDOT

(1) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 20 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 20 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-tenninaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:41: 25 Asp Gin Vai Asp Vai Lys Asp Cys Ala Asn His Glu Ile Lys Lys Vai 15 10 15 ' '· Leu Vai Pro Gly 20 30

(2) SEQ ID NO:42: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 25 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo .. 35 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:42: 104906 61

His Glu Ile Lys Lys Val Leu Val Pro Gly Cys His Gly Ser Glu Pro 15 10 15 5

Cys lie lie His Arg Gly Lys Pro Phe 20 25 (2) SEQ ID NO:43: TIEDOT 10 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 29 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 15 (v) FRAGMEN ΤΠΤ YYPPI: N-terminaalinen : (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:43:

His Gly Ser Glu Pro Cys Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe Gin Leu 15 10 15 20

Glu Ala Vai Phe Glu Ala Aan Gin Asn Thr Lys Thr Ala 20 25 (2) SEQ ID NO:44: TIEDOT 25 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 25 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 30 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-tenninaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:44:

Gin Leu Glu Ala Vai Phe Glu Ala Asn Gin Asn Thr Lys Thr Ala Lys 15 10 15 35

Ile Glu Ile Lys Ala Ser Ile Asp Gly 20 25 (2) SEQ ID NO:45: TIEDOT 40 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 27 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 104906 62 (n) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-tenninaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:45: 5 Lys Ile Glu Ile Lys Ala Ser Ile Asp Gly Leu Glu Vai Asp Vai Pro 15 10 15

Gly Ile Asp Pro Asn Ala Cys His Tyr Met Lys 20 25 10

(2) SEQ ID NO:46: TIEDOT

(1) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 26 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 15 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:46: 20 Leu Glu Vai Asp Vai Pro Gly Ile Asp Pro Asn Ala Cys His Tyr Met 15 10 15

Lys Cys Pro Leu Vai Lys Gly Gin Gin Tyr 20 25 25

(2) SEQ ID NO:47: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: V (A) PITUUS: 27 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 30 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N -terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:47: 35 Cys Pro Leu Vai Lys Gly Gin Gin Tyr Asp Ile Lys Tyr Thr Trp Asn 15 10 15

Vai Pro Lys Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Vai 20 25 40 • 104906 63 (2) SEQ ID NO:48: TIEDOT : ; (1) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 26 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 5 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:48: 10 Asp Ile Lys Tyr Thr Trp Asn Vai Pro Lys Ile Ala Pro Lys Ser Glu 15 10 15

Asn Vai Vai Vai Thr Vai Lys Vai Met Gly 20 25 15

(2) SEQ ID NO:49: TIEDOT

(1) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 25 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 20 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:49: 25 Vai Vai Thr Vai Lys Vai Met Gly Asp Asp Gly Vai Leu Ala Cys Ala 15 10 15

Ile Ala Thr His Ala Lys Ile Arg Asp 20 25 30

(2) SEQ ID NO:50: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 26 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo ·· . 35 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-tenninaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:50: . ·.

104906 64

Asp Gin Vai Asp Val Lys Asp Cys Ala Asn His Glu Ile Lys Lys Val 15 10 15 5

Leu Val Pro Gly Cys His Gly Ser Glu Pro 20 25 (2) SEQ ID NO:51: TIEDOT 10 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 26 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi ·.

15 (v) FRAGMENTTIT YYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ Π) NO:51:

Asp Gin Vai Asp Vai Lys Asp Glu Ala Asn His Glu Ile Lys Lys Vai 15 10 15 20

Leu Vai Pro Gly Cys His Gly Ser Glu Pro 20 25 (2) SEQ ID NO:52: TIEDOT 25 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 26 aminohappoas (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 30 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:52:

Asp Gin Vai Asp Vai Lys Asp Ser Ala Asn His Glu Ile Lys Lys Vai 15 10 15 »·· 35 Leu Vai Pro Gly Cys His Gly Ser Glu Pro 20 25 104906 65

(2) SEQ ID NO:53: TIEDOT

(1) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 26 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 5 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-tenninaalinen ' (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:53: 10 Asp Gin Vai Asp Vai Lys Asp Cys Ala Asn His Glu Ile Lys Lys Vai 15 10 15

Leu Vai Pro Gly Glu His Gly Ser Glu Pro 20 25 15 .·'

(2) SEQ ID NO:54: TIEDOT

(1) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 26 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 20 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-tenninaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:54: 25 Asp Gin Vai Asp Vai Lys Asp Cys Ala Asn His Glu Ile Lys Lys Vai 15 10 15 .*< Leu Vai Pro Gly Ser His Gly Ser Glu Pro 20 25 30

(2) SEQ ID NO:55: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 26 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 35 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-tenninaalinen * · 104906 66 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:55: : ; • -

Asp Gin Vai Asp Val Lys Asp Glu Ala Asn His Glu Ile Lys Lys Val 15 10 15 5

Leu Val Pro Gly Glu His Gly Ser Glu Pro 20 25 (2) SEQ ID NO:56: TIEDOT 10 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 26 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 15 (v) FRAGMEN l Γ1ΤΥΥΡΡΙ: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:56:

Asp Gin Vai Asp Vai Lys Asp Ser Ala Asn His Glu Ile Lys Lys Vai 15 10 15 20

Leu Vai Pro Gly Ser His Gly Ser Glu Pro 20 25 (2) SEQ IDNO:57: TIEDOT 25 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 20 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (n) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 30 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:57:

Asp Gin Vai Asp Vai Lys Asp Glu Ala Asn His Glu Ile Lys Lys Vai 1 5 10 15 35

Leu Vai Pro Gly 20 104906 67 (2) SEQ ID NO:58: TIEDOT . .

(1) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 20 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 5 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:58: 10 Asp Gin Vai Asp Vai Lys Asp Ser Ala Asn His Glu Ile Lys Lys Vai 15 10 15

Leu Vai Pro Gly 20 15

(2) SEQ ID NO:59: TIEDOT

(1) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 16 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 20 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:59: 25 His Glu Ile Lys Lys Vai Leu Vai Pro Gly Cys His Gly Ser Glu Pro ... 1 5 10 15 • t

(2) SEQ ID NO:60: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: 30 (A) PITUUS: 16 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen 35 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:60:

His Glu Ile Lys Lys Vai Leu Vai Pro Gly Glu His Gly Ser Glu Pro 15 10 15 * · 104906 68

(2) SEQ ID NO:61: TIEDOT

(1) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 16 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 5 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen ; : (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:61: 10 His Glu Ile Lys Lys Vai Leu Vai Pro Gly Ser His Gly Ser Glu Pro 15 10 15

(2) SEQ ID NO:62: TIEDOT

(1) SEKVENSSIN PIIRTEET: 15 (A) PITUUS: 28 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen 20 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:62:

Lys Pro Phe Gin Leu Glu Ala Vai Phe Glu Ala Asn Gin Asn Thr Lys 15 10 15 25 Thr Ala Lys Ile Glu Ile Lys Ala Ser Thr Asp Gly 20 25 > · •

(2) SEQ ID NO:63: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: 30 (A) PITUUS: 28 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen 35 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:63:

Gin Leu Glu Ala Vai Phe Glu Ala Asn Gin Asn Thr Lys Thr Ala Lys 15 10 15 1 40 Ile Glu Ile Lys Ala Ser Ile Asp Gly Leu Glu Vai 20 25 104906 69 •

(2) SEQ ID NO:64: TIEDOT

(1) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 27 aminohappoa 5 (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 1 (v) FRAGMENTOTYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:64: 10

Phe Glu Ala Asn Gin Asn Thr Lys Thr Ala Lys Ile Glu Ile Lys Ale. 15 10 15

Ser Ile Asp Gly Leu Glu Vai Asp Vai Pro Gly 15 20 25

(2) SEQ ID NO:65: TIEDOT

(1) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 23 aminohappoa 20 (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:65: 25

Gin Asn Thr Lys Thr Ala Lys Ile Glu Ile Lys Ala Ser Ile Asp Gly 15 10 15

Leu Glu Vai Asp Vai Pro Gly 30 20

(2) SEQ ID NO:66: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 26 aminohappoa 35 (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTIT YYPPI: N-terminaalinen ' « * (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:66: ..

104906 70

Pro Leu Vai Lys Gly Gin Gin Tyr Asp Ile Lys Tyr Thr Trp Asn Val 15 10 15 5

Pro Lys He Ala Pro Lys Ser Glu Asn Val 20 25 (2) SEQ ID NO:67: TIEDOT 10 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 27 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 15 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:67:

Pro Leu Vai Lys Gly Gin Gin Tyr Asp He Lys Tyr Thr Tyr Asn Vai 15 10 15 20

Pro Lys He Ala Pro Lys Ser Glu Asn Vai 20 25 (2) SEQ ID N0.68: TIEDOT 25 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 13 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 30 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:68:

Lys Ser Glu Asn Vai Vai Vai Thr Vai Lys Vai Met Gly 15 10 35 (2) SEQ ID NO:69: TIEDOT (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 23 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 40 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 104906 71 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi » (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:69: 5 Thr Vai Lys Val Met Gly Asp Asp Gly Val Leu Ala Cys Ala lie Ala 15 10 15

Thr His Ala Lys lie Arg Asp 20 10

(2) SEQ ID NO:70: TIEDOT

(1) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 230 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 15 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:70: 20 Thr Vai Lys Vai Met Gly Asp Asp Gly Vai Leu Ala Glu Ala Ile Ala 15 10 15

Thr His Ala Lys Ile Arg Asp 20 25

(2) SEQ ID NO:71: TIEDOT

V (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 23 aminohappoa (B) ΤΥΎΡΡΙ: aminohappo 30 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:71: 35 Thr Vai Lys Vai Leu Gly Asp Asp Gly Vai Leu Ala Ser Ala Ile Ala 15 10 15

Thr His Ala Lys Ile Arg Asp 20 40 72 104906 (2) SEQ ID NO:72: TIEDOT '! (1) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 21 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 5 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTIT YYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:72: 10 Thr Ser Ala Cys Arg Ile Asn Ser Vai Asn Vai Pro Ser Glu Leu Asp 15 10 15

Leu Arg Ser Leu Arg 20 15

(2) SEQ ID NO:73: TIEDOT

(1) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 27 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 20 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTIT YYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:73: 25 Glu Leu Asp Leu Arg Ser Leu Arg Thr Vai Thr Pro Ile Arg Met Gin .1 5 10 15

Gly Gly Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Gly 20 25 30

(2) SEQ ID NO:74: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 29 aminohappoa ·· (B) TYYPPI: aminohappo 35 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen 104906 73 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:74:

Thr Val Thr Pro lie Arg Met Gin Gly Gly Cys Gly Ser Cys Trp Ala 15 10 15 5

Phe Ser Gly Val Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala 20 25 (2) SEQ ID NO:75: TIEDOT 10 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 21 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 15 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:75:

Vai Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg Asn Thr Ser Leu 15 10 15 20

Asp Leu Ser Glu Gin 20 (2) SEQ ID NO:76: TIEDOT 25 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 22 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo - (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 30 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:76:

Tyr Arg Asn Thr Ser Leu Asp Leu Ser Glu Gin Glu Leu Vai Asp Cys 15 10 15 35

Ala Ser Gin His Gly Cys 20 (2) SEQ ID NO:77: TIEDOT 40 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 21 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 74 104906 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N -terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ JD NO:77: 5

Glu Leu Vai Asp Cys Ala Ser Gin His Gly Cys His Gly Asp Thr Ile 15 10 15

Pro Arg Gly Ile Glu 10 20

(2) SEQ ID N0.78: TIEDOT

(1) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 28 aminohappoa 15 (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:78: 20

Gly Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gin Gin Asn Gly Vai 15 10 15

Vai Glu Glu Arg Ser Tyr Pro Tyr Vai Ala Arg Glu 25 20 25

(2) SEQ ID N0.79: TIEDOT

V (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 25 aminohappoa 30 (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:79: 35

Gin Asn Gly Vai Vai Glu Glu Arg Ser Tyr Pro Tyr Vai Ala Arg Glu 15 10 15

Gin Arg Cys Arg Arg Pro Asn Ser Gin 40 20 25 104906 75

(2) SEQ ID NO:80: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 19 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 5 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMEN ΤΠΤΥΎΡΡΙ: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:80: 10 Gin Arg Cys Arg Arg Pro Aan Ser Gin His Tyr Gly Ile Ser Asn Tyr 15 10 15

Cys Gin Ile

15 (2) SEQ ID NO:81: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 22 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 20 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTItYYPPI: N-tenninaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:81:

His Tyr Gly Ile Ser Asn Tyr Cys Gin Ile Tyr Pro Pro Asp Vai Lys 25 l 5 10 15

Gin Ile Arg Glu Ala Leu •V 20

30 (2) SEQ ID NO:82: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 24 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 35 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen ·« 104906 76 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:82:

Tyr Pro Pro Asp Val Lys Gin lie Arg Glu Ala Leu Phe Gin Thr His 15 10 15 5

Thr Ala lie Ala Val lie lie Gly 20 (2) SEQ ID NO:83: TIEDOT 10 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 26 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 15 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:83:

Thr Gin Thr His Thr Ala Ile Ala Vai Ile Ile Gly Ile Lys Asp Leu 15 10 15 20

Arg Ala Phe Gin His Tyr Asp Gly Arg Thr 20 25 (2) SEQ ID NO:84: TIEDOT 25 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 26 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 30 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:84:

Ile Lys Asp Leu Arg Ala Phe Gin His Tyr Asp Gly Arg Thr Ile Ile 15 10 15 35

Gin His Asp Asn Gly Tyr Gin Pro Asn Tyr 20 25 104906 77

(2) SEQ ID NO:85: TIEDOT

(1) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 15 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 5 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (n) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENi Γ11ΥΥΡΡΙ: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:85: 10 Asp Gly Arg Thr Ile Ile Gin His Asp Asn Gly Tyr Gin Pro Asn 15 10 15

(2) SEQ ID NO:86: TIEDOT

(1) SEKVENSSIN PIIRTEET: 15 (A) PITUUS: 23 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen 20 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:86:

Ile Ile Gin His Asp Asn Gly Tyr Gin Pro Asn Tyr His Ala Vai Asn 15 10 15 25 He Vai Gly Tyr Gly Ser Thr 20 • « «

(2) SEQ ID NO:87: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: 30 (A) PITUUS: 22 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen 35 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:87:

His Ala Vai Asn Ile Vai Gly Tyr Gly Ser Thr Gin Gly Asp Asp Tyr 15 10 15 40 Trp Ile Vai Arg Asn Ser 20 104906 78 • r

(2) SEQ ID NO:88: TIEDOT

(1) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 24 aminohappoa 5 (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:88: 10

Gin Gly Asp Asp Tyr Trp Ile Vai Arg Asn Ser Trp Asp Thr Thr Trp 15 10 15

Gly Asp Ser Gly Tyr Gly Tyr Phe 15 20

(2) SEQ ID NO:89: TIEDOT

(1) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 26 aminohappoa 20 (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ED NO:89: 25

Gly Asp Ser Gly Tyr Gly Tyr Phe Gin Ala Gly Asn Asn Leu Met Met 15 10 15

Ile Glu Gin Tyr Pro Tyr Vai Vai Ile Met 30 20 25

(2) SEQ ID NO:90: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 29 aminohappoa 35 (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen 104906 79 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:90:

Thr Ser Ala Cys Arg Ile Asn Ser Vai Asn Val Pro Ser Glu Leu Aso 1 5 10 15 5

Leu Arg Ser Leu Arg Thr Val Thr Pro lie Arg Met Gin 20 25 (2) SEQ ID NO:91: TIEDOT 10 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 25 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI·. peptidi 15 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:91:

Arg Ile Asn Ser Vai Asn Vai Pro Ser Glu Leu Asp Leu Arg Ser Leu 15 10 15 20

Arg Thr Vai Thr Pro Ile Arg Met Gin 20 25 (2) SEQ ID NO:92: TIEDOT 25 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 29 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo " V (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 30 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:92:

Ala Phe Ser Gly Vai Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg 15 10 15 .. . 35

Asn Thr Ser Leu Asp Leu Ser Glu Gin Glu Leu Vai Asp 20 25 • 9 ' 104906 80 (2) SEQ Π) NO:93: TIEDOT -:- (1) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 25 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 5 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENT! 1ΤΥΎΡΡΙ: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:93: 10 Vai Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg Asn Thr Ser Leu 15 10 15

Asp Leu Ser Glu Gin Glu Leu Vai Asp 20 25 15

(2) SEQ ID NO:94: TIEDOT

(1) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 29 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 20 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTIT YYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:94: 25 Vai Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg Asn Thr Ser Leu ... 1 5 10 15

Asp Leu Ser Glu Gin Glu Leu Vai Asp Cys Ala Ser Gin 20 25 30

(2) SEQ ID NO:95: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 29 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 35 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen ’ i ’ (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:95: 104906 81

Glu Tyr Ile Gin Gin Asn Gly Vai Val Glu Glu Arg Ser Tyr Pro Tyr 15 10 15 5

Val Ala Arg Glu Gin Arg Cys Arg Arg Pro Asn Ser Gin 20 25 (2) SEQ ID NO:96: TIEDOT 10 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 29 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (u) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 15 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:96:

Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gin Gin Asn Gly Vai Vai 15 10 15 20

Glu Glu Arg Ser Tyr Pro Tyr Vai Ala Arg Glu Gin Arg 20 25 (2) SEQ ID NO:97: TIEDOT 25 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 29 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 30 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:97:

Gin Ile Tyr Pro Pro Asp Vai Lys Gin Ile Arg Glu Ala Leu Thr Gin 15 10 15 35

Thr His Thr Ala Ile Ala Vai Ile Ile Gly Ile Lys Asp 20 25 ' ♦ 104906 82

(2) SEQ ID NO:98: TIEDOT

(1) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 22 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 5 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMEN111ΓΥΥΡΡΙ: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:98: 10 Gin Ile Tyr Pro Pro Asp Vai Lys Gin Ile Arg Glu Ala Leu Thr Gin 15 10 15

Thr His Thr Ala Ile Ala 20 15

(2) SEQ ID NO:99: TIEDOT

(1) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 26 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 20 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMEN1ΙΊΤΥΎΡΡΙ: N -terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:99: 25 Ile Ile Gly Ile Lys Asp Leu Arg Ala Phe Gin His Tyr Asp Gly Arg 15 10 15 " '· Thr Ile Ile Gin His Asp Asn Gly Tyr Gin 20 25 30

(2) SEQ ID NO: 100: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 252 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 35 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTOTYYPPI: N-terminaalinen 104906 83 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 100:

His Asp Asn Gly Tyr Gin Pro Asn Tyr His Ala Vai Asn Ile Val Gly 15 10 15 5

Tyr Gly Ser Thr Gin Gly Asp Asp Tyr 20 25 (2) SEQ ID NO: 101: TIEDOT 10 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 29 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 15 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 101:

Asn Ile Vai Gly Tyr Gly Ser Thr Gin Gly Asp Asp Tyr Trp Ile Vai 15 10 15 20

Arg Asn Ser Trp Asp Thr Thr Trp Gly Asp Ser Gly Tyr 20 25 (2) SEQ ID NO: 102: TIEDOT 25 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 23 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 30 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 102:

Asn Ile Vai Gly Tyr Gly Ser Thr Gin Gly Asp Asp Tyr Trp Ile Vai 15 10 15 35

Arg Asn Ser Trp Asp Thr Thr 20 (2) SEQ ID NO: 103: TIEDOT 40 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 20 aminohappoa .. (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 104906 84 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) . FRAGMENTOTYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 103: 5 Asp Gin Vai Asp Vai Lys Asp Cys Ala Asn Asn Glu Ile Lys Lys Vai 15 10 15

Met Vai Asp Gly 20 10

(2) SEQ ID NO: 104: TIEDOT

(1) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 25 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 15 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTOTYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 104: 20 Asn Glu Ile Lys Lys Vai Met Vai Asp Gly Cys His Gly Ser Asp Pro 15 10 15

Cys Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe 20 25 25

(2) SEQ ID NO: 105: TIEDOT

*: (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 29 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 30 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTOTYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 105: 35 His Gly Ser Asp Pro Cys Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe Thr Leu 15 10 15

Glu Ala Leu Phe Asp Ala Asn Gin Asn Thr Lys Thr Ala 20 25 · · 40 104906 85

(2) SEQ K) NO: 106: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 19 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 5 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTT1T YYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 106: 10 His Arg Gly Lys Pro Phe Thr Leu Glu Ala Leu Phe Asp Ala Asn Gin 15 10 15

Asn Thr Lys 15 (2) SEQ ID NO: 107: TIEDOT . .

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 25 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 20 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTIT YYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 107:

Thr Leu Glu Ala Leu Phe Asp Ala Asn Gin Asn Thr Lys Thr Ala Lys 25 1 5 10 15

Ile Glu Ile Lys Ala Ser Leu Asp Gly : 20 25

30 (2) SEQ ID NO: 108: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 26 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 35 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENT ΠΤYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 108: . ; 104906 86 y

Gin Asn Thr Lys Thr Ala Lys lie Glu lie Lys Ala Ser Leu Asp Gly 15 10 15 5

Leu Glu Ile Asp Val Pro Gly lie Asp Thr 20 25 (2) SEQ ID NO: 109: TIEDOT 10 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 27 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 15 (v) FRAGMENTTIT YYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 109:

Lys Ile Glu Ile Lys Ala Ser Leu Asp Gly Leu Glu Ile Asp Vai Pro 15 10 15 20

Gly Ile Asp Thr Asn Ala Cys His Phe Met Lys 20 25 (2) SEQ ID NO: 110: TIEDOT 25 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 26 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 30 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 110:

Leu Glu Ile Asp Vai Pro Gly Ile Asp Thr Asn Ala Cys His Phe Met “ 1 5 10 15 35

Lys Cys Pro Leu Vai Lys Gly Gin Gin Tyr 20 25 104906 87

(2) SEQ ID NO: 111: TIEDOT

(1) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 27 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 5 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENllTlYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 111: 10 Cys Pro Leu Vai Lys Gly Gin Gin Tyr Asp Ma Lys Tyr Thr Trp Asn 15 10 15

Vai Pro Lys Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Vai 20 25 15

(2) SEQ ID NO: 112: TIEDOT

(1) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 26 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 20 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 112: 25 Asp Ala Lys Tyr Thr Trp Asn Vai Pro Lys Ile Ala Pro Lys Ser Glu 1 5 10 15

Asn Vai Vai Vai Thr Vai Lys Leu Vai Gly 20 25 30

(2) SEQ ID NO: 113: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 35 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 35 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-tenninaalinen 104906 88 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 113:

Pro Lys lie Ala Pro Lys Ser Glu Asn Vai Vai Vai Thr Val Lys Leu 15 10 15 5

Val Gly Asp Asn Gly Val Leu Ala Cys Ala lie Ala Thr His Ala Lys 20 25 30 lie Arg Asp 10 35

(2) SEQ ID NO: 114: TIEDOT

(1) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 25 aminohappoa 15 (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 114: 20

Vai Vai Thr Vai Lys Leu Vai Gly Asp Asn Gly Vai Leu Ala Cys Ala 15 10 15

Ile Ala Thr His Ma Lys Ile Arg Asp 25 20 25

(2) SEQ ID NO: 101: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 28 aminohappoa 30 (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ Π) NO: 115: 35

Lys Pro Phe Thr Leu Glu Ala Leu Phe Asp Ala Asn Gin Asn Thr Lys 1 5 10 15

Thr Ala Lys Ile Glu Ile Lys Ala Ser Leu Asp Gly 40 20 25 89 104906

(2) SEQ ID NO: 116: TIEDOT

(1) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 28 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 5 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTT1TYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 116: 10 Thr Leu Glu Ala Leu Phe Asp Ala Asn Gin Asn Thr Lys Thr Ala Ly s 15 10 15

Ile Glu Ile Lys Ala Ser Leu Asp Gly Leu Glu Ile 20 25 15

(2) SEQ ID NO: 117: TIEDOT

(1) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 22 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 20 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTOT ΥΎΡΡΙ: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 117: 25 His Arg Asn Gin Ser Leu Asp Leu Ala Glu Gin Asp Leu Vai Asp Cys 15 10 15 * Ala Ser Gin His Gly Cys 20 30

(2) SEQ ID NO: 118: TIEDOT

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 21 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo :1: 35 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 118: 104906 90

Asp Leu Val Asp Cys Ala Ser Gin His Gly Cys His Gly Asp Thr lie 15 10 15 5

Pro Arg Gly lie Glu 20 (2) SEQ ID NO: 119: TIEDOT 10 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: (A) PITUUS: 29 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 15 (v) FRAGMENTOTYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 119:

His Gly Ser Glu Pro Cys Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe Gin Leu 15 10 15 20

Glu Ala Vai Phe Glu Ala Vai Gin Asn Thr Lys Thr Ala 20 25 1 . ,

Claims (2)

104906 91

1. Menetelmä henkilön huonepölypunkkiherkkyyden havaitsemiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää henkilöstä saadun verinäytteen yhdistämisen vähintään yhden peptidin kanssa, joka peptidi on valittu ryhmästä, joka koostuu: 5 a) DP I-21.7:stä, b) DP I-23.10:stä, c) DP 1-23.11 :stä, d) DP I-23.12:sta, e) DP I-23.5:stä, 10 f) DP I-23.6:sta, g) DP I-23.7:stä, h) DP I-23.8:sta, i) DP I-23.9:stä, j) DP I-26.2:sta, 15 k) DP n-20.7:stä, ; · 1) DP n-22.6:sta, • · m) DP II-22.3:sta, n) DP II-22.4:stä, o) DP II-22.5:stä, • · 20 p)DPn-25.3:sta, q) DPn-25.4:stä, r) DP I-23.13:sta, s) DP I-23.14:stä, 92 104906 t) DP I-23.15:stä, u) DP I- 23.16:sta, v) DP I-23.17:stä, w) DP 1-26.3 :sta, 5 x) DP 1-26.4 :stä, y) DP I-26.5:stä, z) DP II-22.7:stä, a’) DP n-22.8:sta, b') DP H-22.9:stä, 10 c')DPn-22.10:stäja d') DP n-22.11:stä, jotka kaikki on esitetty kuviossa 26, olosuhteissa, jotka ovat sopivia verikomponenttien sitoutumiselle peptidiin ja huonepölypunkkiherkkyyden osoittamiseksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sitoutumisen 15 määrä määritetään arvioimalla T-solutoiminta, T-soluproliferaatio tai niiden yhdistelmä. . Patentkrav