NO316073B1

NO316073B1 - Isolert peptid, anvendelse derav, nukleinsyresekvens, terapeutisk sammensetning, fremgangsmåte for utforming av peptid og fremgangsmåte for åbestemme i individer tilstedev¶relse av immunoglobulin spesifikt for etproteinantigen

Info

Publication number: NO316073B1
Application number: NO19941370A
Authority: NO
Inventors: Bruce L Rogers; Jay P Morgenstern; Julian F Bond; Richard D Garman; Mei-Chang Kuo; Malcolm Morville; Julia Greenstein
Original assignee: Immulogic Pharma Corp
Priority date: 1991-10-16
Filing date: 1994-04-15
Publication date: 2003-12-08
Also published as: PT100978A; NO941370L; EP0610335B1; ES2300100T3; FI109809B; FI941758A0; NZ244782A; ATE382699T1; KR100271417B1; PT100978B; HU9401109D0; IL103456A; IL103456A0; HUT70263A; EP0610335A1; NO941370D0; CA2121498C; FI941758A; WO1993008280A1; JP4246794B2

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører isolert peptid, anvendelse derav, nukleinsyresekvens, terapeutisk sammensetning, fremgangsmåte for utforming av peptid og fremgangsmåte for å bestemme i individer tilstedeværelse av immunoglobulin spesifikt for et protein-antigen

Denne patentsøknad er en delvis videreføring av US-patentsøknad nr 662,276 med tittelen "A human T Cell Reactive Cat Protem Isolated from House Dust and Uses Therefor," inngitt 28 februar 1991, som er en delvis videreføring av US-patentsøknad 431,565 med tittelen "A Human T Cell Reactive Cat Protein Isolated from House Dust and Uses Therefor," inngitt 3 november 1989, hvis beskrivelser er medtatt i det foreliggende som referanse

T-lymfocytter kan formidle og regulere både de spesifikke og ikke-spesifikke effektor-mekanismer ved immunresponser CD4+-T-lymfocytter gir hjelp ved antistoffdannelse og utsondrer cytokiner som modulerer veksten av andre T-celler og vekst og differensiering av andre immunceller så som monocytter og granulocytter Funksjonelle og biokjemiske undersøkelser har vist at dannelsen av cellulær immunresponser avhenger av antigen-reseptorer på T-celler som oppfatter peptidfragmenter av fremmede proteiner knyttet til produkter av hoved-histokompatibilitetskomplekset (MHC) som uttrykkes på antigen-presenterende hjelperceller De siste fremskritt ved teknologien har gjort det mulig effektivt å dyrke antigen-spesifikke humane og muse-T-cellehnjer og -kloner in vitro Dessuten er det nå mulig å fremstille store mengder proteinantigener eller deres fragmenter under anvendelse av rekombinant DNA-teknologi eller fastfase-peptidsyntese I de siste få år har således flere forskningsgrupper begynt å bestemme de lineære aminosyresekvenser hos antigene proteiner som oppfattes av T-celler i tilknytning til MHC (T-celle-epitoper)

Peptider som stammer fra forskjellige proteinantigener, innbefattende bakterie- og viruspatogener, autoantigener, allergener og andre forsøksantigener så som hønseegglysozym (HEL), ovalbumin (OVA) og lambda-undertrykker (cl) er blitt undersøkt med hensyn til evnen til stimulering av antigenspesifikke T-celler Et bredt størrelses-spektrum av peptider er blitt rapportert å tjene som T-celleepitoper For eksempel er OVA-aminosyrerestene 324-339 (R Shimonkevitz et al, J Immunol 133 2167 (1984)), HEL-aminosyrerestene 74-96 (N Shastn et al, J Exp Med 164 882-896 (1986), og lambda-undertrykker-(cl)-arninosyrerestene 12-26 (M -Z Lai et al, J Immunol, 139 3973-3980 (1987)) blitt vist å utløse effektivt hel-protein-pnmede T-celler Et peptid som stammer fra hepatitt B-overflateantigen (HBsAg-aminosyre-restene 19-33) er nylig blitt vist å stimulere T-celleresponser i hovedandelen av humane individer som var blitt immunisert med en rekombinant hepatitt B-vaksine (V C Schad et al, Seminars in Immunol, 3 217-224 (1991)) Et hoved-mykobakteneantigen-65 kD-protein er også blitt epitopekartlagt (J R Lamb et al, EMBO J , 6(5) 1245-1249 (1987)) T-celle-epitoper er blitt identifisert i peptidene som består av aminosyrerestene 112-132 og 437-459165-kD-proteinet Myehn-basisk protein (MBP), et autoantigen som gir eksperimentell autoimmun-encefalomyehtt (EAE) og det antatte autoantigen ved multippel sklerose (MS) er også blitt epitope-kartlagt både i humane (K Ota et al, Nature, 346 183-187 (1990)) og gnager-(Zamvil et al, Nature 324 258-260(1986))-systemer Ota et al har identifisert en hoved-T-celle-epitope som oppfattes av MS-pasienter, MBP-aminosyrerestene 84-102 Små-epitoper (MBP-aminosyrerestene 143-168,61-82, 124-42 og 31-50) som oppfattes av T-celler fra MS-pasienter, er også blitt beskrevet Zamvil et al har vist at MBP-aminosyrerestene 1-11 inneholder hoved-T-celle-epitopen(e) som forårsaker EAE, hos mottakelige gnagerstammer

T-celle-epitoper som finnes i allergene proteiner, er i det aller siste blitt beskrevet (R 0'Hehir et al, Ann Rev Immunol, 9 67-95 (1991)) Flere peptider som stammer fra husstøv-midd-allergenet Der p I, er blitt vist å være T-cellereaktive (W R Thomas et al, i Epitopes of Atopic Allergens Proceedings of Workshop from XIV Congress of the European Academy of Allergy and Clinical Immunology, Berlin (sept 1989) s 77-82, R R OHemr, Annual Review Immunology 9 67-95 (1991), G A Stewart et al i Epitopes of Atopic Allergens Proceedings of Workshop from XIV Congress of the European Academy of Allergy and Clinical Immunology, Berlin (sept 1989) s 41-47, og H Yesseletal i T Cell Activation in Health and Disease Discnmination Between bnmunity and Tolerance, Conference 22-26 (sept 1990) Tnnity College, Oxford UK) Et T-cellestimulerende peptid som stammer fra "short ragweed"-allergenet Amb a I-aminosyrerestene 54-65, er også blitt rapportert (J B Rothbard et al, Cell, 52 515-523 (1988)) Ved anvendelse av en plate av T-cellekloner som stammer fra et raigress-allergisk individ, viste Perez et al at T-celle-epitoper finnes inne i aminosyrerestene 191-2101protem-allergenet Loi p I (M Perez et al, J Biol Chem, 265(27) 16210-16215 (1990))

WO 91/06571 beskriver renset allergen, human T-cellereaktivt fehnprotein (TRFP), cDNA kodende derav og anvendelser for behandling og diagnostisering av human allergi

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer isolerte peptider med T-cellestimulerende virkning og kan betegnes rekombitope® peptider Peptider ifølge oppfinnelsen har fortrinnsvis stimulerende virkning på humane T-celler Dessuten omfatter peptidene ifølge oppfinnelsen fortrinnsvis minst to T-celleepitoper som stammer fra de samme eller fra forskjellige proteinantigener, og omfatter mer foretrukket mmst to områder, idet hvert område omfatter minst én T-celleepitop som stammer fra et protein-antigen, og hvert område fortrinnsvis har stimulerende virkning på humane T-celler Rekombitope peptider kan omfatte tre slike områder som stammer fra det samme eller fra forskjellige proteinantigener Et område av et rekombitopt peptid kan omfatte minst 5, og fortrinnsvis minst 7, aminosyrerester Typisk omfatter rekombitope peptider områder som er anordnet i en konfigurasjon som er forskjellig fra en naturlig forekommende konfigurasjon av områdene i et protein-antigen, for utelukkelse av uønskede egenskaper som er forbundet med den sekundære eller tertiære struktur av proteinantigenet mens den pnmærstrukturavhengige stimulerende virkning på humane T-celler opprettholdes For eksempel kan områdene stamme fra det samme protemantigen og være anordnet i en ikke-sammenhengende konfigurasjon og en ikke-sekvensiell rekkefølge

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig isolert peptid med primær strukturavhengig human T-cellestimulerende aktivitet, kjennetegnet ved at det omfatter minst to områder som hvert har human T-cellestimulerende aktivitet, idet hvert område omfatter minst én T-celle-epitop av et proteinallergen, og de er arrangert i en konfigurasjon forskjellig fra en naturlig forekommende konfigurasjon av områdene i proteinallergenet, idet nevnte områder er avledet fra samme proteinallergen, unntatt Fel d I, eller fra forskjellige proteinallergener, hvori proteinallergenet er valgt fra gruppen bestående av Dermatophagoides proteinallergener, Felts proteinallergener, Ambrosia proteinallergener, Lokum proteinallergener, Cryptomeria protein-allergener, Alternana proteinallergener, Alder proteinallergener, Betula proteinallergener, Quercus proteinallergener, Olea proteinallergener, Artemisia proteinallergener, Plantago proteinallergener, Parietaria proteinallergener, Camne proteinallergener, Blattella protein-allergener, Apis proteinallergener og Penplaneta proteinallergener, hvor det rekombinante peptidet binder immunoglobulin E i en vesentlig mindre grad enn proteinallergenene som områdene er avledet fra binder nevnte immunoglobulin E, og hvor det rekombinante peptidet omfatter minst 15% av T-celleepitopene til et proteinallergen

Det er videre beskrevet peptid, kjennetegnet ved at det omfatter minst to regioner som hver har human T-celleshmulerende aktivitet, idet nevnte regioner hver består vesentlig av minst én T-celleepitop av et proteinallergen, idet nevnte regioner er valgt fra gruppen bestående av peptid X, peptid Y, peptid Z, peptid A, peptid B og peptid C, hver som vist i fig 1 og for eksempel regioner omfattende peptid X, peptid Y og peptid Z, hver som vist i fig 4

Peptidene ifølge oppfinnelsen kan stamme fra proteinallergener Disse rekombitope peptider har fortrinnsvis minimal immunglobulin E-stimulerende virkning og binder immunoglobulin E i vesentlig mindre omfang enn proteinallergener som de rekombitope peptider stammer fra, binder immunglobulin E Mer foretrukket binder ikke rekombitope peptider som stammer fra proteinallergener, immunglobulin E som er spesifikt for proteinallergenene, hos noen vesentlig prosentandel (minst ca 75%) av individene som er følsomme for proteinallergenene, eller hvis slik binding finner sted, resulteter ikke denne i frigjøring av mediator, f eks histamin, fra mastceller eller basofile celler Dessuten kan rekombitope peptider stamme fra autoantigener, så som insulin, myehn-basisk protein og acetychohnreseptorer Disse rekombitope peptider binder fortrinnsvis ikke immunglobulin som er spesifikt for autoantigenet i noen vesentlig prosentandel (minst ca 75%) av en befolkningsgruppe av individer som er følsomme overfor autoantigenet Videre kan rekombitope peptider som stammer fra protein-allergener eller andre protein-antigener, utformes slik at en uønsket egenskap hos det naturlige protein (f eks enzymatisk aktivitet) kan utelukkes for terapeutiske formål

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre nukleinsyresekvens, kjennetegnet ved at den koder for et peptid ifølge et hvilket som helst av foregående krav eller funksjonell ekvivalent av nevnte nukleinsyresekvens

Det er videre beskrevet terapeutisk sammensetning, kjennetegnet ved at den omfatter omfatter et peptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 14 og en farmasøytisk akseptabel bærer eller et fortynningsmiddel

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre sammensetning, kjennetegnet ved at den omfatter mmst to peptider ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 13

Det er videre vedskrevet anvendelse av et peptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 14 eller en sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 16 eller 17, for fremstilling av et medikament for behandling av sensitivitet overfor et proteinallergen i et individ

Det er også beskrevet anvendelse av to peptider ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 14 eller forskjellige sammensetninger ifølge et hvilket som helst av kravene 16 eller 17, for fremstilling av to komplementære medikamenter for behandling av sensitivitet overfor et proteinallergen i et individ ved sekvensiell administrering av nevnte medikamenter

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåte for utforming av peptid ifølge krav 3, kjennetegnet ved at den omfatter følgende trinn

a) den kjente proteinstruktur av et antigen gjennomgås,

b) antigenet deles teoretisk i minst to peptidområder med ønskede lengder,

c) de minst to peptidområder anordnes teoretisk under dannelse av minst ett peptid hvor peptidområdene omordnes i enlkke-sammenhengende rekkefølge, d) det fremstilles minst ett peptid med konfigurasjon som det minst ene peptid fra trinn (c)> og e) det bestemmes hvorvidt det minst ene peptidet fra trinn (d) har stimulerende virkning på humane T-celler

Oppfinnelsen vedrører også fremgangsmåte for å bestemme i individer tilstedeværelse av immunoglobulin spesifikt for et proteinantigen og evnen som T-cellene til individene har til å reagere overfor T-celleisotop(er) til nevnte proteinantigen, kjennetegnet ved at den omfatter trinnene

a) kombinenng av en første blodprøve eller minst én del av en første blodprøve oppnådd fra et individ med nevnte proteinantigen, eller en del derav, eller en modifisert form av

nevnte proteinantigen eller en del derav, idet hver binder immunoglobulin spesifikt for nevnte proteinantigen, under betingelser hensiktsmessig for binding av blodkomponenter med nevnte proteinantigen, modifiserte proteinantigen eller en del av

hvilke som helst av nevnte antigener,

b) bestemme om binding oppstår,

c) kombinenng av en andre blodprøve eller en andre del av nevnte første blodprøve oppnådd fra et individ funnet å ha binding av blodkomponenter i tnnn (b), med et

rekombinant peptid omfattende minst to regioner avledet fra nevnte proteinantigen, idet nevnte peptid har humant T-cellestimulerende aktivitet til nevnte proteinantigen og som ikke binder immunoglobulin spesifikt for nevnte proteinantigen i en vesentlig

prosentandel av en populasjon av individer sensitive overfor antigenet, og

d) bestemme om T-cellestimulenng oppstår

Det er som angitt ovenfor også tilveiebrakt fremgangsmåter for utforming av

rekombitope peptider ifølge oppfinnelsen hvor protein-antigenet som individet er følsomt overfor, har ukjente eller dårlig definerte T-celle-epitoper (f eks er noen av, eller alle peptidområdene i protem-antigenet som har stimulerende virkning på humane T-celler overfor

protein-antigenet, ikke blitt definert ved hjelp av standard-T-celle-biologiteknikker, f eks Current Protocols in Immunology, redigert av J E Cohgan et al, volum 1, (1991), eller de nøyaktige humane T-celle-epitoper på proteinantigenet er ikke blitt definert ved finkart-leggin<g>steknikker) Den kjente proteinstruktur gjennomgås hos et allergen eller annet protein-antigen, og allergenet eller det annet antigen deles teoretisk i minst to peptid-områder med ønskede lengder Med teoretisk menes noe som ikke virkelig finner sted, men som snarere er en tenkt prosess, f eks den skjer på papiret eller i hodet Denne inndeling kan være vilkårlig, den kan utføres ifølge en algontme eller den kan være fullstendig eller delvis basert på områder av proteinantigenet som er kjent for å ha T-cellestimulerende virkning, fortrinnsvis stimulerende virkning på humane T-celler Når det bare er kjent noen få områder av et proteinantigen som har T-cellestimulerende virkning, eller når alle områdene på protein-antigenet som har stimulerende virkning på humane T-celler, er ukjent, deles fortrinnsvis minst 50%, og mer foretrukket hele proteinet, i peptidområder med ønskede lengder Peptidområdene anordnes så teoretisk under dannelse av minst ett rekombitopt peptid hvor områdene omordnes i en ikke-sammenhengende rekkefølge Deretter fremstilles minst ett rekombitopt peptid med omordnet konfigurasjon, og det rekombitope peptids evne til stimulering av humane T-celler bestemmes

Det vises nå til tegningene

Fig 1 er nukleinsyresekvensen og den avdelede aminosyresekvens av kjede 1 av det humane T-cellereaktive fehn-protein (TRFP) innbefattende ledersekvensene A (SEKV ID NR 1 og 2) ogB (SEKV ID NR 3 og 4) Fig 2 er nukleinsyresekvensen og den utledede aminosyresekvens av kjede 2 av TRFP innbefattende en ledersekvens (SEKV ID NR 5 og 6) Fig 3 er en grafisk fremstilling som angir responsen av T-celler isolert fra katte-allergjske pasienter og pnmet med affinitetsrenset TRFP til overlappende TRFP-peptider analysert ved den graderte sum av peptid-responser Fig 4 er aminosyresekvensene av peptid X (SEKV ID NR 7), peptid Y (SEKV ID NR 8), peptid Z (SEKV ID NR 9), peptid A (SEKV DD NR 10) og peptid B (SEKV ID NR 11) og peptid C (SEKV ID NR 77) av TRFP, som hver inneholder minst én T-celle-epitop av

TRFP

Fig 5 er en skjematisk fremstilling av konstruksjonen av et rekombitopt peptid YZX under anvendelse av polymerasekjedereaksjons-(PCR)-tekmkker Fig 6 er en skjematisk fremstilling av konstruksjonen av et rekombitopt peptid AYZXB under anvendelse av PCR-teknikker Fig 7 er nukleinsyresekvensen og den utledede aminosyre-sekvens av ohgonukleotidene C (SEKV DD NR 12 og 13), D (SEKV DD NR 14 og 15), E (SEKV DD NR 16 og 17), F (SEKV DD NR 18 og 19), G (SEKV DD NR 20 og 21), H (SEKV DD NR 22 og 23) og I (SEKV DD NR 24 og 25) anvendt ved konstruksjonen av det rekombitope peptid YZX og ohgonukleotidene J (SEKV DD NR 26 og 27), K (SEKV DD NR 28 og 29), L (SEKV DD NR 30 og 31), M (SEKV DD NR 32 og 33), N (SEKV DD NR 34 og 35) og O (SEKV DD NR 36 og 37) anvendt ved konstruksjonen av det rekombitope peptid AYZXB Fig 8 er nukleinsyresekvensen (hvor det anvendes E coli-ekspresjonskodoner) og den utledede aminosyresekvens omfattende rekombitopt peptid YZX (SEKV DD NR 38 og 39) Et trombin-spaltingssted er vist Fig 9 er en skjematisk fremstilling av konstruksjonen av et rekombitopt peptid YZX under anvendelse av PCR-teknikker med cDNA isolert fra TRFP som templat Fig 10 er nukleinsyresekvensene og de utledede aminosyresekvenser av primere anvendt ved konstruksjonen av rekombitope peptider XZY (SEKV DD NR 40-51), YXZ (SEKV DD NR 52-63) og ZXY (SEKV DD NR 64-71) Fig 11 er en grafisk fremstilling av aminosyresekvensen av de individuelle primere anvendt til konstruenng av de rekombitope peptider XZY, YXZ og ZXY Fig 12 er en skjematisk fremstilling av konstruksjonen av et rekombitopt peptid utledet fra fosfohpase A2, som har dårlig definerte T-celle-epitoper Fig 13 er en representasjon av resultatene av SDS/P AGE Westem-"immunoblot"-analyse som påviser binding av humant IgE tatt fra et katte-allergisk individ, til forskjellige proteinprøver, innbefattende rekombitope peptider XYZ, XZY, YXZ, YZX, ZXY og ZYX Fig 14 er en grafisk fremstilling av resultatene av ELISA-analyse, som illustrerer binding av humant IgE tatt fra et katte-allergisk individ, til forskjellige proteinprøver, innbefattende rekombitope peptider XYZ, XZY, YXZ, YZX, ZXY og ZYX Fig 15a, 15b og 15c er grafiske fremstillinger som viser responsene hos T-cellelinjer fra tre pasienter primet m vitro, overfor TRFP, rekombitopt peptid YXZ eller rekombitopt peptid YZX, og analysert med hensyn til respons overfor forskjellige peptider Fig 16 er en grafisk fremstilling som viser responser hos muse-T-celler immunisert med rekombitopt peptid YZX og analysert med hensyn til respons in vitro overfor dyrkning med det rekombitope peptid YZX ifølge måling ved IL-2-dannelse

Den foreliggende oppfinnelse angår isolerte peptider, også betegnet rekombitope peptider, med T-cellestimulerende virkning, så som bevirkmng av T-celleformenng, lymfokin utsondring og/eller T-celle-allergi/toleranse Peptidene ifølge oppfinnelsen har fortrinnsvis stimulerende virkning på humane T-celler og er egnet ved diagnostisering og behandling av følsomhet hos et individ overfor et proteinallergen, autoantigen eller annet proteinantigen Vanligvis omfatter foretrakkede peptider innenfor oppfinnelsens ramme minst to områder som stammer fra det samme eller fra forskjellige proteinallergener eller andre protein-antigener, idet hvert område fortrinnsvis har stimulerende virkning på humane T-celler ifølge bestemmelse ved standard-T-cellebiologiteknikker, og således omfatter minst én T-celle-epitop For bestemmelse av nøyaktige T-celle-epitoper ved for eksempel finkartleggings-tekmkker, kan peptidområdene som omfatter minst én T-celle-epitop som er blitt definert ved hjelp av standard-T-cellebiologitekmkker, modifiseres ved tilføying eller utelukkelse av aminosyrerester enten ved den amino- eller karboksyterminale ende av peptidområdene og undersøkes for bestemmelse av en forandring i T-cellereaktiviteten overfor det modifiserte peptid Hvis videre to eller flere peptidområder som deler et overlappingsområde, finnes å ha stimulerende virkning på humane T-celler, ifølge bestemmelse ved standard-T-celle-biologiteknikker, kan det fremstilles ytterligere peptider som omfatter alle, eller en del av, slike peptidområder, og disse ytterligere peptider kan undersøkes ved hjelp av den ovennevnte finkartleggingsmetode Som et resultat av finkartlegging, kan det fremstilles et sett av humane T-celle-epitoper omfattende aminosyrerester som er nødvendige for T-celleoppfat-telse

Peptider ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved rekombinante DNA-teknikker i en vertscelle transformert med en nukleinsyresekvens som koder for et slikt rekombitopt peptid, eller ved kjemisk syntetisering, eller i visse begrensede situasjoner ved kjemisk spalting av et protein-allergen eller annet protein-antigen Ved fremstilling ved hjelp av rekombinante teknikker, dyrkes vertsceller transformert med nukleinsyre som koder for et rekombitopt peptid, i et medium som er egnet for cellene, og rekombitope peptider kan renses fra celle-dyrkningsmedium, vertsceller eller begge, under anvendelse av teknikker som er kjent på området for rensing av peptider eller proteiner, innbefattendelonebytterkromatografenng,lsoelektnsk fokusering, gelfiltrenngskromatografenng, ultrafiltrenng, elektroforese ellerlmmunrensing med antistoffer som er spesifikke for det rekombitope peptid, protein-allergenet eller annet antigen som det rekombitope peptid stammer fra, eller en del derav Det rekombitope peptid blir fremstilt i en vertscelle transformert med en nukleinsyresekvens som koder for et rekombitopt peptid, eller den funksjonelle ekvivalent til nukleinsyresekvensen De isoleres slik at det rekombitope peptid er hovedsakelig fritt for cellematenale eller dyrk-mngsmedium ved fremstilling ved hjelp av rekombinante DNA-teknikker, eller hovedsakelig fritt for kjemiske forløpere eller andre kjemikalier ved kjemisk syntetisering eller ved dannelse ved kjemisk spalting av et proteinallergen eller annet proteinantigen

Peptidene ifølge den foreliggende oppfinnelse omfattende minst to T-celle-epitoper av et proteinallergen eller annet proteinantigen eller minst to områder som hvert omfatter minst en T-celle-epitop av et proteinallergen eller annet antigen, oppnås ved anordning av T-celle-epitopene eller områdene som inneholder T-celle-epitopen(e), i en konfigurasjon som er forskjellig fra en naturlig forekommende konfigurasjon av T-celle-epitopene eller områdene i allergenet eller antigenet For eksempel kan T-celle-epitopene eller områdene som inneholder T-celle-epitopen(e), anordnes i en ikke-sammenhengende konfigurasjon og kan fortrinnsvis fås fra det samme proteinallergen eller annet antigen Ikke-sammenhengende er definert som en anordning av aminosyrer omfattende T-celle-epitoper eller områder som inneholder T-celle-epitop(er) som er annerledes enn for en aminosyresekvens som finnes i protein-allergenet eller annet protein-antigen som epitopene eller områdene stammer fra Videre kan de ikke-sammenhengende T-celle-epitoper eller områder som inneholder T-celle-epitoper, anordnes i en ikke-sekvensiell rekkefølge (f eks i en rekkefølge som er annerledes enn rekkefølgen av aminosyrene i det naturlige protein-allergen eller annet protein-antigen som T-celle-epitopene eller området som inneholder T-celle-epitopen(e), stammer fra, og hvor aminosyrene er anordnet fra en aminoterminal ende til en karboksyterminal ende)

I den situasjon hvor T-celle-epitopene av et proteinallergen eller annet proteinantigen er ukjente eller dårlig definerte (f eks noen av, eller alle, peptidområdene av proteinantigenet som har stimulerende virkning på humane T-celler, er ikke blitt definert ved standard-T-celle-biologiteknikker, eller de nøyaktige humane T-celle-epitoper av protein-antigenet er ikke blitt definert ved finkartleggingsteknikker), kan et rekombitopt peptid fås ved at man gjennomgår den kjente proteinstruktur hos et allergen eller annet antigen og teoretisk deler allergenet eller antigenet i minst to peptidområder med ønskede lengder For eksempel kan proteinsekvensen av allergenet eller annet antigen deles systematisk i minst to ikke-overlappende peptidområder med ønskede lengder, eller mmst to overlappende peptidområder med ønskede lengder og teoretisk anordnet under dannelse av mmst ett rekombitopt peptid hvor minst to områder er omordnet i en ikke-sammenhengende og fortrinnsvis ikke-sekvensiell rekkefølge Denne deling i peptidområder kan være vilkårlig, den kan utføres ifølge en algoritme eller den kan være fullstendig eller delvis basert på områder av proteinantigenet som er kjent for å omfatte minst én T-celle-epitop

Når bare noen få av peptidområdene i proteinallergenet eller annet proteinantigen som omfatter minst én T-celle-epitop, er kjent, eller når alle områder av protem-allergenet eller andre proteinantigener som har stimulerende virkning på humane T-celler, er ukjente, deles fortrinnsvis minst 50% av hele proteinsekvensen av proteinallergenet eller annet protein-antigen, og mer foretrukket hele proteinsekvensen av proteinallergenet eller annet protein-antigen, og omordnes til ett eller flere rekombitope peptider Formålet ved anvendelse av en slik stor prosentandel av proteinsekvensen av protein-antigenet ved dannelsen av det rekombitope peptid, er at det resulterende rekombitope peptid skal omfatte minst 15%, mer foretrukket minst 30%, enda mer foretrukket minst 50% og mest foretrukket minst 100% av T-celle-epitopene av proteinantigenet Hvis de få peptidområder av protein-antigenet som hvert er kjent for å omfatte minst én T-celle-epitop, utgjør den ovenfor angitte prosentandel av T-celle-epitopene av protein-antigenet og slike peptidområder ikke utgjør minst 50% av hele proteinsekvensen av protein-antigenet, er det ikke nødvendig å anvende en så stor prosentandel av hele proteinsekvensen til dannelse av det rekombitope peptid Ifølge denne fremgangsmåte kan rekombitope peptider så fremstilles rekombinant eller syntetisk, og evnen hos det rekombitope peptid til stimulering av humane T-celler kan bestemmes Når det rekombitope peptid omfatter områder som stammer fra et protein-allergen, kan de individuelle peptidområder fremstilles og undersøkes for bestemmelse av hvilke områder som binder immunglobulin E som er spesifikt for allergenet, og hvilke av slike områder som vil bevirke frigjøring av mediatorer (f eks histamin) fra mastceller eller basofile celler De peptidområder som finnes å bmde immunglobulin E og bevirke frigjøring av mediatorer fra mastceller eller basofile celler hos mer enn ca 10-15% av de undersøkte innlemmes fortrinnsvis ikke i peptidområdene som er anordnet under dannelse av rekombitope peptider

Konstruenng av et rekombitopt peptid som stammer fra fosfohpase A2, et hoved-allergen fra honningbiegift, kan anvendes som et illustrerende eksempel på konstruksjon av et rekombitopt peptid når proteinstrukturen av et proteinantigen er kjent, men T-celle-epitopene er ukjente eller dårlig definerte Fosfohpase A2består av 134 aminosyre, som definert ved cDNA-klomng (K Kuchleretal Eur J Biochem 184 249-254) Denne aminosyresekvens kan deles1områder som hvert fortrinnsvis inneholder 20-35 aminosyrerester, idet hvert område fortrinnsvis overlapper et annet område med ca 10 aminosyrer (se fig 12) Skjønt fig 12 viser hele proteinsekvensen av proteinet delt1områder, kan den totale sekvens som anvendes til dannelse av minst ett rekombitopt peptid, være vesentlig mmdre enn hele proteinsekvensen For maksimalisenng av potensialet ved innlemming av T-celle-epitoper1det konstruerte rekombitope peptid, kan områder med overlapping og lengden av hvert område utformes slik at tilstedeværelsen av de forutsagte T-celle-epitoper opprettholdes under anvendelse av algoritmer (J Rothbard og W R Taylor, EMBO J 7 93-100 (1988), J A Berzofsky, Philos Trans R Soc Lond 323 535-544(1989)) Humane T-celle-epitoper innenfor et proteinallergen kan fortrinnsvis forutsies under anvendelse av kjente HLA klasse Il-spesifikt bindende spesifikke aminosyrerester For minimalisering av sannsynligheten for at det konstruerte rekombitope peptid vil binde humant allergi-IgE, kan videre aminosyre-sekvensen av det resulterende rekombitope peptid gjøres forskjellig fra aminosyresekvensen av den naturlige struktur av fosfohpase A2ved omkasting av områdene og/eller ved ombytting av aminoterminale områder eller karboksyterminale områder til den motsatte ende av molekylet (dvs at aminosyrerester som befinner seg1den aminoterminale ende av det naturlige protein, kan anbringes1den karboksyterminale ende av det rekombitope peptid) En liknende fremgangsmåte kan anvendes til konstruenng av et rekombitopt peptid som stammer fra et autoantigen med kjent proteinstruktur, men med udefinerte T-celle-epitoper, så som glutaminsyre-dekarboksylase (f eks J P Samama og J Mallet, Journal of Neurochemistry 54 703-705 (1990)), insulin (Joshns Diabetes Melhtus, 12 utgave, Red A Marble et al, Lea & Febiger, Philadelphia, s 67 (1985)) osv I denne situasjon anordnes peptidområdene1en konfigurasjon som er forskjellige fra en naturlig forekommende konfigurasjon av områdene1autoantigenet under utelukkelse av en uønsket egenskap hos autoantigenet så somlmmun-globuhn-binding eller enzymatisk aktivitet

Rekombitope peptider som omfatter minst to områder som stammer fra et allergen eller annet antigen, undersøkes for bestemmelse av de rekombitope peptider som har T-celle-stimulerende virkning (dvs formering, lymfokin-utsondnng og/eller induksjon av T-celle-anergi/toleranse), og omfatter således minst én T-celle-epitop For eksempel kan stimulerende virkning på humane T-celler undersøkes ved dyrking av T-celler som fås fra et individ som er følsomt overfor et proteinallergen eller proteinantigen (dvs et individ som har immunrespons overfor proteinallergenet eller proteinantigenet), med et rekombitopt peptid som stammer fra proteinallergenet eller -antigenet, og bestemmelse av tilstedeværelse av formering ved T-cellene som svar på det rekombitope peptid Som beskrevet detaljert i eksemplene, kan stimulenngsmdekser for responser ved T-celler overfor rekombitope peptider, beregnes som maksimale CPM (tellinger pr minutt) som svar på rekombitopt peptid, delt med middel-kontroll-CPM Som anvendt gjennom hele denne patentsøknad, er stimulerende virkning på humane T-celler definert som en stimulenngs-indeks på minst 2,0 En stimulenngsindeks på minst 2,0 anses som positiv for de formål å definere rekombitope peptider som er egnet som immunterapeutiske midler Foretrakkede rekombitope peptider har en stimulenngsindeks på minst 2,5, mer foretrukket minst 3,5 og mest foretrukket minst 5,0

Dessuten binder ikke rekombitope peptider som stammer fra proteinallergener, immunglobulin E (IgE), eller de binder IgE i en vesentlig mindre utstrekning enn protein-allergenet (-allergenene) som peptidene stammer fra, bmder IgE Hoved-komphkasjonene ved standard immunterapi er systemiske responser så som anafylakse Immunglobulin E er en mediator av anafylaktiske reaksjoner som er et resultat av binding og tverrbinding av antigen til IgE på mastceller eller basofile celler og fngjønng av mediatorer (f eks histamin, serotonin, eosinofil-kjemotaktiske faktorer) Anafylakse kan således unngås ved anvendelse av et rekombitopt peptid som ikke binder IgE, eller hvis det rekombitope peptid binder IgE, resulterer ikke slik binding i fngjønng av mediatorer (f eks histamin o s v) fra mastceller eller basofile celler Dessuten er rekombitope peptider som har minimal IgE-stimulerende virkning, spesielt ønskelige på grunn av terapeutisk effektivitet Mmimal IgE-stimulerende virkning angir IgE-dannelse som er mindre enn mengden av IgE-dannelse og/eller IL-4-dannelse stimulert av hel-protein-allergenet

Et rekombitopt peptid ifølge oppfinnelsen som stammer fra et proteinallergen, kan, når det administreres til et individ som er følsomt overfor proteinallergenet, modifisere den allergiske respons hos individet overfor allergenet Spesielt kan rekombitope peptider som omfatter minst to T-celle-epitoper av et proteinallergen eller minst to områder som stammer fra et protein-allergen, idet hvert område fortrinnsvis omfatter minst én T-celle-epitop, når de administreres til et individ som er følsomt overfor allergenet, modifisere T-celle-responsen hos individet overfor allergenet Som anvendt i det foreliggende, kan modifisenng av den allergiske respons hos et individ som er følsomt overfor et protein-allergen, defineres somlkke-responsivitet eller formmskning av symptomer overfor allergenet, ifølge bestemmelse ved kliniske standardmetoder (se f eks Varney et al, British Medical Journal 302 265-269

(1990))

Som et resultat av arbeidet beskrevet i det foreliggende, er det blitt fremstilt rekombitope peptider som stammer fra protein-allergener eller andre protein-antigener og som har T-celle-stimulerende virkning eller som fortrinnsvis omfatter to områder som hvert har minst en T-celle-epitop T-celle-epitoper antas å inngå ved starting og opprettholdelse av immunresponsen overfor et protein-allergen eller annet protein-antigen som er ansvarlig for henholdsvis de kliniske symptomer ved allergi eller andre sykdommer Disse T-celle-epitoper antas å utløse tidlige aktiviteter på nivået for T-hjelpercellen ved binding til et hensiktsmessig HLA-molekyl på overflaten av en antigen-presenterende celle og stimulering av den aktuelle T-celle-underpopulasjon Disse aktiviteter fører til T-celleformenng, lymfokin-utsondnng, lokalelnflammatonske reaksjoner, rekruttering av ytterligere immunceller til stedet og aktivering av B-celle-kaskaden som fører til dannelse av antistoffer Énlsotype av disse antistoffer, IgE, er fundamentalt viktig for utviklingen av allergiske symptomer, og dannelsen av det påvirkes tidlig i aktivitetskaskaden, på mvået for T-hjelpercellen, ved beskaffenheten av de utsondrede lymfokiner En T-celle-epitop er grunnelementet eller den minste enhet for oppfattelse hos en T-cellereseptor, hvor epitopen omfatter aminosyrer som er essensielle for reseptoroppfattelse, og kan være sammenhengende og/eller ikke sammenhengende i aminosyre-sekvensen i proteinet En T-celle-epitop, som anvendt i det foreliggende, har en stimulenngs-indeks på minst 2,0, mer foretrukket minst 2,5, enda mer foretrukket minst 3,5 og mest foretrukket mmst 5,0

Når pasienter utsettes for rekombitope peptider ifølge den foreliggende oppfinnelse som stammer fra proteinallergener eller andre proteinantigener, kan de tolerere eller mangle evne til å reagere på hensiktsmessige T-celle-underpopulasjoner slik at de ikke svarer på protein-allergenet eller annet antigen og ikke deltar ved stimulering av en immunrespons ved slik utsettelse Dessuten kan administrering av et rekombitopt peptid ifølge den foreliggende oppfinnelse som stammer fra et protein-allergen, modifisere lymfokin-utsondnngsprofilen sammenliknet med utsettelse for det naturlig forekommende protein-allergen eller en del derav (f eks resultere i en minskning av IL-4 og/eller en økning av H-2) Videre kan utsettelse for det rekombitope peptid innvirke på T-celle-underpopulasjoner som normalt deltar i responsen overfor allergenet slik at disse T-celler trekkes bort fra stedet (stedene) med normal utsettelse for allergenet (f eks neseshmhinner, hud og lunger) mot stedet (stedene) for terapeutisk administrering av det rekombitope peptid Denne omfordeling av T-celle-underpopulasjonene kan mildne eller redusere evnen hos et individs immunsystem til stimulering av den vanlige immunrespons på stedet for normal utsettelse for allergenet, hvilket resulterer i en minskning i allergiske symptomer

Peptider ifølge oppfinnelsen omfatter fortrinnsvis minst to T-celle-epitoper (f eks omfatter det rekombitope peptid minst ca 8 aminosyrerester, og fortrinnsvis mmst 15 aminosyrerester) Andre rekombitope peptider ifølge oppfinnelsen omfatter minst to områder som stammer fra det samme eller fra forskjellige proteinallergener eller andre proteinantigener, idet de rekombitope peptider har T-cellestimulerende virkning og hvert område fortrinnsvis har stimulerende virkning på humane T-celler, og følgelig omfatter minst én T-celle-epitop av et proteinallergen eller annet proteinantigen Vanligvis omfatter hvert slikt område av et rekombitopt peptid minst ca 7 aminosyrerester av mmst ett proteinallergen Hvert slikt område av et rekombitopt peptid omfatter fortrinnsvis minst to T-celle-epitoper (f eks omfatter det rekombitope peptid minst ca 8 aminosyrerester og fortrinnsvis minst 15 aminosyrerester) Rekombitope peptider kan omfatte så mange aminosyrerester som ønskelig, og omfatter fortrinnsvis minst ca 7, mer foretrukket minst ca 15, enda mer foretrukket minst ca 30 og mest foretrukket minst ca 40 aminosyrerester av et proteinallergen eller annet protein-antigen Et område av et rekombitopt peptid utgjør fortrinnsvis en lengde på opp til 45 aminosyrerester, mer foretrukket en lengde på opp til 40 aminosyrerester, og mest foretrukket en lengde på opp til 30 aminosyrerester, siden økninger i lengden av et område av et rekombitopt peptid kan resultere i vanskelighet ved peptidsyntetisering så vel som bibeholdelse av en uønsket egenskap (f ekslmmunglobuhnbinding eller enzymatisk aktivitet) på grunn av opprettholdelse av konformasjonshkhet mellom området og proteinallergenet eller annet proteinantigen som det stammer fra Hvis ønskelig, kan ammosyresekvensene av områdene dannes og sammenknyttes ved hjelp av en kopler under økning av følsomheten overfor bearbeidelse ved antigenpresenterende celler En slik kopler kan være hvilken som helst ikke-epitop-aminosyresekvens eller annet hensiktsmessig koplings- eller sammenføyingsmiddel

Når rekombitope peptider stammer fra proteinallergener, kan de omfatte mmst to områder som stammer fra forskjellige proteinallergener fra den samme slekt, så som slekten Dermatophagoides, slekten Fehs, slekten Ambrosia, slekten Lolium, slekten Cryptomena, slekten Alternana, slekten Alder, slekten Betula, slekten Quercus, slekten Olea, slekten Artemisia, slekten Plantago, slekten Panetana, slekten Canine, slekten Blattella, slekten Apis, og slekten Penplaneta Dessuten kan rekombitope peptider omfatte minst to områder som stammer fra kryssreaktive arter, for eksempel ett område som stammer fra Dermatophagoides pteronyssinus, og ett område som stammer fra Dermatophagoides fannae Ved en annen utførelsesform kan områdene stamme fra den samme art (f eks ett område som stammer fra Der p I og ett område som stammer fra Der p II, ett område som stammer fra Der f I, og ett område som stammer fra Der f TT, ett område som stammer fra Amb a I, og ett område som stammer fra Amb a n, ett område som stammer fra Loi p I, og ett område som stammer fra Loi p IX, og ett område som stammer fra Cryj I, og ett område som stammer fra Cryj U) Videre kan rekombitope peptider omfatte minst to områder som stammer fra forskjellige protem-allergener fra den samme gruppe, så som ett område som stammer fra et protein-allergen i gruppe I av Dermatophagoides pteronyssinus (dvs Der p I), og ett område som stammer fra et protein-allergen i gruppe I av Dermatophagoides fannae (dvs Der fl) Alternativt kan områdene stamme fra forskjellige proteinallergener fra samme familie (f eks Amb all, Amb a 12, Amb a 13 og Amb a 14) Spesielt foretrakkede rekombitope peptider for behandling av følsomhet overfor Felis domesticus, stammer fra slekten Fehs og omfatter områder valgt blant peptidene X, Y, Z, A og B, av TRFP, aminosyresekvensene av hvert peptid som vist på fig 4 og representert i SEKV ID NR 7-11, og modifisennger av disse, så som peptid C (SEKV ID NR 12), som er en en-aminosyretilføyelse til peptid A som vist på fig 4 Foretrakkede rekombitope peptider omfatter peptid YZX og peptid AYZXB Gjennom hele patentsøknaden angir bokstavene X, Y, Z, A, B og C henholdsvis peptid X, peptid Y, peptid Z, peptid A, peptid B og peptid C, og når bokstavene anvendes sammen (f eks YZX), angir de et rekombitopt peptid som omfatter peptid Y, peptid Z og peptid X i den spesifiserte sekvensielle rekkefølge (dvs at YZX angir et rekombitopt peptid som omfatter aminosyre-sekvensen av peptid Y, umiddelbart fulgt av, uten at noen aminosyrerester kommer imellom, aminosyresekvensen av peptid Z, umiddelbart fulgt av, uten at noen aminosyrerester kommer imellom, aminosyresekvensen av peptid X) De rekombitope peptidene, f eks YZX, kan omfatte ytterligere aminosyrerester av enten den amino- eller karboksyterminale ende av det rekombitope peptid

Rekombitope peptider kan stamme fra andre proteinantigener enn proteinallergener hvor forøking eller undertrykkelse av en antigenspesifikk immunrespons er ønskelig For eksempel kan områder av et kjent auto-antigen som inngår ved patogenesen av en autoimmun-sykdom, og som har stimulerende virkning på humane T-celler, eller T-celle-epitoper av et kjent autoantigen, identifiseres og kombineres i et rekombitopt peptid under nedsettelse av antistofrfesponsen overfor auto-antigenet, under innvirkning på effektiviteten og/eller nedsettelse avlmmunkompleks-tilknyttede bivirkninger For bevaring av T-cellereaktiviteten av autoantigenet, kan områder på autoantigenet med stimulerende virkning på humane T-celler, defineres ved hjelp av standard-T-cellebiologitekmkker, eller hvis ønskelig, kan nøyaktige T-celle-epitoper deineres ved finkartleggingsteknikker og et rekombitopt peptid som omfatter minst to områder som hvert har stimulerende virkning på humane T-celler og omfatter minst én fremstilt T-celle-epitop Hvis for eksempel tre områder med stimulerende virkning på humane T-celler, eller tre T-celle-epitoper ble funnet i et autoantigen i sekvensiell og sammenhengende rekkefølge 1, 2,3 fra en aminoterminal ende til en karboksyterminal ende, kunne det dannes seks mulige rekombitope peptider som anvender hvert område eller hver T-celle-epitop en gang, omfattende de tre områder eller T-celle-epitoper i forskjellige rekke-følger (f eks 213, 312,132, 321, 123,231) De seks rekombitope peptider kunne undersøkes med hensyn til evnen til stimulering av T-celle-aktiviteten, og med hensyn til fråvær av en uønsket egenskap som fantes hos autoantigenet, f eks manglende evne hos det rekombitope peptid (de rekombitope peptider) til å binde autoantistoffer Alternativt kan rekombitope peptider, som beskrevet tidligere, konstrueres ut fra et autoantigen uten at man vet hvilke områder som har T-cellestimulerende virkning eller hva de nøyaktige T-celle-epitoper er De rekombitope peptider som stimulerer T-celler og ikke har uønskede egenskaper fra auto-antigenet (f eks ikke binder autoantistoffer i noen vesentlig prosentandel av individer som er følsomme overfor autoantigenet), velges for anvendelse som immunterapeutiske eller diagnostiske midler I form av en terapeutisk blanding vil det rekombitope peptid bh avgitt i en fysiologisk akseptabel bærer i fravær av hjelpestoff for at det rekombitope peptid skal få bevirke antigen-spesifikk toleranse hos autoantigenet som det rekombitope peptid stammer fra, og regulere en eventuell potensielt ødeleggende immunrespons Blant autoantigener som er egnet ved fremstilling av rekombitope peptider, er insulin, glutammsyre-dekarboksylase (64K), PM-1 og karboksypeptidase ved diabetes, myehn-basisk protein ved multippel sklerose, rh-faktor ved erythroblastosis fetahs, acetylkohn-reseptorer ved myasthema gravis, skjoldbruskkjertel-reseptorer ved Graves<1>sykdom, basalmembran-proteiner ved Good Patures syndrom, og skjoldbruskkjertel-proteiner ved skjoldbruskkjertel-betennelse For eksempel kan områder av myehn-basisk protein (MBP) med stimulerende virkning på humane T-celler, f eks et område som omfatter alle, eller en del av, aminosyre-restene 84-106 og mer foretrukket 84-102 og mer foretrukket 89-101 av humant MBP, og et område som omfatter alle, eller en del av, ammosyre-restene 140-172 og mer foretrukket 143-168 av humant MBP, omfatte et rekombitopt peptid ifølge oppfinnelsen for anvendelse ved behandling av multippel sklerose

Rekombitope peptider kan anvendes ved fremgangsmåter for behandling og diagnostisering av følsomheten hos et individ overfor et proteinallergen eller annet protein-antigen Ved ett aspekt ved oppfinnelsen tilveiebringes det således terapeutiske blandinger som omfatter et peptid og en farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynmngsmiddel Administrering av de terapeutiske blandinger ifølge den foreliggende oppfinnelsen for å gjøre et individ ufølsomt overfor et protein-allergen eller annet protein-antigen kan utføres under anvendelse av kjente teknikker For eksempel kan et rekombitopt peptid administreres i kombinasjon med et hensiktsmessig fortynmngsmiddel, en bærer og/eller et hjelpestoff, hvor hensiktsmessig Farmasøytisk akseptable fortynningsmidler innbefatter saltholdige og van-dige bufferløsninger Farmasøytisk akseptable bærere innbefatter polyetylenglykol (Wie et al, International Archives of Allergy and Applied Immunology 64 84-99 (1981)) og hposomer (Strejan et al, Journal of Neuroimmunology 7 27 (1984)) Farmasøytisk akseptable hjelpestoffer innbefatter alun Slike blandinger vil vanligvis administreres ved injeksjon (subkutant, intravenøst osv), ved oral administrering (f eks så som i form av en kapsel), ved inhalering, ved transdermal påfønng eller ved rektal administrering De terapeutiske blandinger ifølge oppfinnelsen administreres hl individer som er følsomme overfor et allergen eller annet proteinantigen som det rekombitope peptid stammer fra, i doseringer og tidsleng-der som er effektive til redusering av individets følsomhet overfor allergenet eller annet antigen En terapeutisk effektiv mengde av én eller flere av den samme eller forskjellige blandinger kan administreres samtidig eller sekvensielt til et individ som er følsomt overfor et allergen eller annet protein-antigen Effektive mengder av de terapeutiske blandinger vil vanere ifølge faktorer så som graden av følsomhet hos individet, individets alder, kjønn og vekt og peptidets evne til stimulenng av en T-cellerespons hos individet Ved enda et annet aspekt ved den foreliggende oppfinnelse er det tilveiebrakt en blanding som omfatter minst to peptider (f eks en fysisk blanding av minst to rekombitope peptider), som hvert omfatter minst to T-celle-epitoper som stammer fra det samme eller fra forskjellige proteinallergener eller andre proteinantigener

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også fremgangsmåter for påvisning av følsomhet hos individer overfor et protein-antigen, og fremgangsmåter for bestemmelse av tilstedeværelse av immunglobulin som er spesifikt for et protein-antigen, og evnen hos T-celler hos individer til å svare på antigenet For påvisning av følsomheten, blandes en blodprøve som fås fra individet, eller minst én del av prøven, med et protein-antigen, en modifisert form av protein-antigenet, eller en del av hvert av antigenene, som hvert binder immunglobulin som er spesifikt for antigenet, under betingelser som er hensiktsmessige for binding av blodkomponenter med antigenet, det modifiserte antigen eller en del derav En andre blodprøve som tas fra et individ som er funnet å ha binding av blodkomponenter, med protein-antigenet, det modifiserte antigen eller en del derav, eller en andre del av den første blodprøve fra et individ som er funnet å ha binding av blodkomponenter, med protein-antigenet, det modifiserte antigen eller en del derav, blandes med et rekombitopt peptid omfattende minst to områder som stammer fra et protein-antigen, idet det rekombitope peptid har T-celle-stimulerende virkning, eller et rekombitopt peptid omfattende minst to områder som stammer fra et protein-antigen, idet hvert område har stimulerende virkning på humane T-celler, eller en modifisert form av protein-antigenet eller en del derav, eller protein-antigenet fremstilt rekombinant, som hvert ikke binder immunglobulin spesifikt for protein-antigenet i noen vesentlig prosentandel av befolkningsgruppen av individer som er følsomme overfor protein-antigenet (f eks minst ca 75%), for bestemmelse av om hvorvidt T-cellestimulenng finner sted Hvis protein-antigenet er et protein-allergen, binder ikke den modifiserte form av protein-allergenet eller en del derav, det rekombinant fremstilte protein-allergen eller det rekombitope peptid som stammer fra protein-allergenet, IgE som er spesifikt for protein-allergenet, eller hvis binding av IgE finner sted, resulterer ikke slik binding i fngjønng av mediatorer fra mastceller eller basofile celler i en vesentlig prosentandel av en befolkningsgruppe av individer som er følsomme overfor allergenet Hvis individet finnes å ha binding av blodkomponenter til antigenet, det modifiserte antigen eller en del derav, og T-cellestimulenng som svar på det rekombitope peptid, det modifiserte protein-antigen eller en del derav eller rekombinant fremstilt protein-antigen, kan det til individet administreres en terapeutisk effektiv mengde av en terapeutisk blanding som omfatter det rekombitope peptid, det rekombinant fremstilte protein-antigen eller den modifiserte form av protein-antigenet eller en del derav, og en farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynmngsmiddel, for å gjøre individet ufølsomt overfor proteinantigenet

For påvisning av spesifikk forsinket overfølsomhet hos et individ overfor minst ett proteinallergen, administreres det til et individ en test for forsinket overfølsomhet (se f eks Immunology (1985) IM Roitt, J Brostoff, D K Male (red), C V Mosby Co, Gower Medical Publishing, London, NY, s 19 2-19 18, s 22 1-22 10) under anvendelse av en modifisert form av protein-allergenet eller annet protein-antigen eller en del derav, eller et protein-allergen eller annet protein-antigen fremstilt rekombinant, eller et rekombitopt peptid som stammer fra det mmst ene protein-allergen eller annet protein-antigen, som hvert har stimulerende virkning på humane T-celler og som hvert ikke binder immunglobulin som er spesifikt for protein-allergenet eller annet protein-antigen i noen vesentlig prosentandel (f eks minst ca 75%) hos individer som er følsomme overfor protein-allergenet eller annet protein-antigen Hvis protein-antigenet er et protein-allergen, binder ikke den modifiserte form av protein-allergenet eller en del derav, det rekombinant fremstilte protein-allergen eller det rekombitope peptid som stammer fra protein-allergenet, IgE som er spesifikt for protein-allergenet, eller hvis binding av IgE finner sted, resulterer ikke slik binding i fngjønng av mediatorer fra mastceller eller basofile celler i noen vesentlig prosentandel av en befolkningsgruppe av individer som er følsomme overfor allergenet Det er blitt funnet at rekombinant kjede 1 av TRFP i dimer form har markert redusert IgE-binding, men opprettholder T-celle-reaktiviteten (dvs at rekombinant dimer kjede 1 inneholder peptidene X og Y, som begge er kjent for å inneholde minst én T-celle-epitop), og at mildt alkali-behandlet TRFP har markert redusert IgE-binding, men opprettholder T-cellereaktiviteten Følgelig kan rekombinant kjede 1 av TRFP i dimer form eller alkali-behandlet TRFP anvendes ved testen for forsinket overfølsomhet beskrevet ovenfor, eller ved andre diagnostiske analyser for bestemmelse av følsomheten hos et individ overfor T-celle-epitop(er) av TRFP, og/eller de kan anvendes i terapeutiske blandinger for å gjøre individer ufølsomme overfor TRFP Etter admimstrenng av testen for forsinket overfølsomhet, bestemmes det i hvilket omfang en spesifikk forsinket overfølsomhets-reaksjon finner sted hos individet overfor proteinallergenet eller annet protein-antigen, hvilket viser tilstedeværelse hos individet av T-celler som er spesifikke overfor T-celle-epitop(er) av proteinallergenet eller annet proteinantigen

Det er mulig å påvise og behandle følsomhet hos et individ overfor minst ett protein-allergen Tilstedeværelse hos individer av IgE som er spesifikt for minst ett proteinallergen, og evnen hos T-celler hos individene til å svare på T-celle-epitop(er) av proteinallergenet, kan bestemmes ved at det til individene administreres en test for øyeblikkelig overfølsomhet og en test for forsinket overfølsomhet Individene får administrert en test for øyeblikkelig overføl-somhet (se f eks Immunology (1985) IM Roitt, J Brostoff, D K Male (red ), C V Mosby Co , Gower Medical Publishing, London, NY, s 19 2-19 18, s 22 1-22 10) under anvendelse av proteinallergenet eller en del derav, eller en modifisert form av proteinallergenet eller en del derav, som hvert binder IgE som er spesifikt for allergenet De samme individer får administrert en test for forsinkelt overfølsomhet før, samtidig med eller etter administrering av testen for øyeblikkelig overfølsomhet Hvis testen for øyeblikkelig overfølsomhet administreres før testen for forsinket overfølsomhet, vil selvfølgelig testen for forsinket overfølsomhet bli gitt til de individer som viser en spesifikk øyeblikkelig overfølsomhets-reaksjon Ved testen for forsinket overfølsomhet anvendes det en modifisert form av protein-allergenet eller en del derav, protein-allergenet fremstilt rekombinant eller et rekombitopt peptid som stammer fra protein-allergenet, som hvert har stimulerende virkning på humane T-celler og som hvert ikke binder IgE som er spesifikt for allergenet i noen vesentlig prosentandel av befolkningsgruppen av individer som er følsomme overfor allergenet (f eks minst ca 75%) De individer som finnes å ha både en spesifikk øyeblikkelig overfølsomhets-reaksjon og en spesifikk forsinket overfølsomhets-reaksjon, får administrert en terapeutisk effektiv mengde av en terapeutisk blanding Den terapeutiske blanding omfatter den modifiserte form av proteinet eller en del derav, det rekombinant fremstilte proteinallergen eller det rekombitope peptid, hvert som anvendt ved testen for forsinket overfølsomhet, og en farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynmngsmiddel

Det er også mulig å modifisere strukturen av rekombitope peptider for slike formål

som øking av løselighet, forbednng av terapeutisk eller forebyggende effektivitet, eller stabili-tet (f eks lagnngsstabihtet utenfor organismen, og resistens overfor proteolytisk nedbrytning i organismen) Det kan fremstilles et modifisert rekombitopt peptid hvor aminosyre-sekvensen er blitt forandret, så som ved aminosyre-substitusjon, -utelukkelse eller -tilføying, for modifisering av immunogeniteten og/eller redusering av allergeniteten, eller til hvilket en komponent er blitt tilsatt for det samme formål For eksempel kan aminosyre-restene som er essensielle for T-celle-epitopfunksjonen, bestemmes under anvendelse av kjente teknikker (f eks substitusjon av hver rest og bestemmelse av tilstedeværelse eller fravær av T-celle-reaktivitet) De rester som viser seg å være essensielle, kan modifiseres (f eks erstattes av en

annen aminosyre hvis tilstedeværelse er vist å forøke T-celle-reaktiviteten), likesom de som ikke er nødvendige for T-celle-reaktivitet (f eks ved at de erstattes med en annen aminosyre hvis innlemming forøker T-celle-reaktiviteten, men ikke minsker bindingen til aktuell MHC) Et annet eksempel på en modifisering av rekombitope peptider er substitusjon av cystein-rester, fortrinnsvis med alanin, eller glutammsyre, eller alternativt med senn eller treonin for minimalisering av dimensenng via disulfidbmdinger For forbednng av stabiliteten og/eller reaktiviteten, kan rekombitope peptider også modifiseres til innarbeidelse av én eller flere polymorfismer i aminosyresekvensen av et protein-allergen som skyldes naturlig allel vanasjon Dessuten kan D-aminosyrer, ikke-naturlige aminosyrer ellerlkke-aminosyre-analoger erstattes eller tilføyes under fremstilling av et modifisert peptid innenfor denne oppfinnelses ramme Videre kan rekombitope peptider modifiseres under anvendelse av polyetylenglykol-(PEG)-metoden ifølge A Sehon og medarbeidere (Wie et al, som ovenfor) under fremstilling av et peptid konjugert med PEG Modifisennger av rekombitope peptider kan også innbefatte reduksjon/alkylenng (Tan* i Methods of Protein Microcharactenzation, JE Silver red Humana Press, Chfton, NJ, s 155-194(1986)), acylenng (Tarr, som ovenfor), forestnng (Tarr, som ovenfor), kjemisk kopling til en hensiktsmessig bærer (Mishell og Shngi, red , Selected Methods m Cellular Immunology, WH Freeman, San Francisco, CA

(1980), US-patent 4 939 239), eller mild formalinbehandling (Marsh Internationa] Archives of Allergy and Applied Immunology 41 199-215 (1971))

For å lette rensingen og potensielt øke løseligheten av rekombitope peptider, er det mulig å tilføye rapportenngsgruppe(r) til peptidskjelettet For eksempel kan polyhistidin tilføyes til et rekombitopt peptid for rensing av det rekombitope peptid ved immobilisert metall-ioneaffinitetskromatografi (E Hochuh et al, Bio/Technology, 6 1321-1235 (1988)) Dessuten kan spesifikke endoprotease-spaltmngssteder innføres, hvis ønskelig, mellom en rapportenngsgruppe og aminosyresekvenser av et rekombitopt peptid for å lette isolenngen av rekombitope peptider fri for uvedkommende sekvenser For at et individ på en vellykket måte skal bh gjort ufølsomt overfor et protein-antigen, kan det være nødvendig å øke løseligheten av et rekombitopt peptid ved tilføyelse av funksjonelle grupper til peptidet eller ved at man ikke innarbeider hydrofobe T-celle-epitoper eller områder som inneholder hydrofobe epitoper, i de rekombitope peptider

For potensiell understøttelse av passende antigen-bearbeidelse av T-celle-epitoper i et rekombitopt peptid, kan faste protease-følsomme steder rekombinant eller syntetisk fremstilles ved gen-teknologi mellom områder, idet hvert omfatter minst én T-celle-epitop For eksempel kan ladede aminosyre-par, så som KK eller RR, innføres mellom områder i et rekombitopt peptid under rekombinant konstruksjon av det rekombitope peptid Det resulterende rekombitope peptid kan gjøres følsomt overfor spalting med katepsin og/eller andre trypsinliknende enzymer under dannelse av deler av det rekombitope peptid som inneholder én eller flere T-celle-epitoper Dessuten kan slike ladede aminosyre-rester resultere i en øking av løseligheten av et rekombitopt peptid

Stedrettet mutagenese av DNA som koder for et rekombitopt peptid, kan anvendes til modifisering av strukturen av det rekombitope peptid Slike fremgangsmåter kan innbefatte PCR (Ho et al, Gene 77 51-59 (1989)) eller total syntese av muterte gener (Z Hostomsky et al, Biochem Biophys Res Comm 161 1056-1063(1989)) For forbedring av baktene-ekspresjon, kan de forannevnte metoder anvendes sammen med andre fremgangsmåter for forandring av de eukaryote kodoner i DNA-konstruksjoner som koder for rekombitope peptider, til slike som fortrinnsvis anvendes i E coli

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer følgelig også nukleinsyresekvenser som koder for peptider ifølge oppfinnelsen Nukleinsyresekvenser som anvendes ved hvilken som helst utførelsesform av denne oppfinnelse, kan være cDNA som beskrevet i det foreliggende, eller kan alternativt være hvilken som helst oligodeoksynukleotid-sekvens som har hele, eller en del av, en sekvens representert i det foreliggende, eller deres funksjonelle ekvivalenter Slike oligodeoksynukleotid-sekvenser kan fremstilles kjemisk eller mekanisk under anvendelse av kjente teknikker En funksjonell ekvivalent av en ohgonukleotidsekvens er en som er 1) en sekvens som kan hybndiseres til et komplementært ohgonukleotid til hvilket ohgonukleotidsekvensen (eller tilsvarende sekvens-deler) eller fragmenter derav hybndiseres, eller 2) sekvensen (eller tilsvarende sekvens-del) som er komplementær til ohgonukleotid-sekvensen og/eller 3) en sekvens som koder for et produkt (f eks et protein, et polypeptid eller et peptid) som har de samme funksjonelle egenskaper som hos produktet som kodes for ved ohgonukleotid-sekvensen (eller tilsvarende sekvens-del) Hvorvidt en funksjonell ekvivalent må oppfylle ett eller flere kntener, vil avhenge av dens anvendelse (hvis den f eks skal anvendes bare som en probe for hybndisenng, behøver den bare oppfylle det første eller annet kntenum, og hvis den skal anvendes for fremstilling av et peptid ifølge den foreliggende oppfinnelse, behøver den bare oppfylle det tredje kntenum)

Som beskrevet i eksemplene som følger, er kjedene 1 og 2 av det humane T-cellereaktive fehn-protein (TRFP) (fig 1 (SEKV ID NR 1-4) og 2 (SEKV ID NR 5-6)) blitt rekombinant uttrykt i E coh og renset T-celle-epitop-undersøkelser med anvendelse av overlappende peptid-områder som stammer fra TRFP-aminosyresekvensen, ble anvendt til identifisering av multiple T-celle-epitoper i hver kjede av TRFP Som beskrevet detaljert i eksempel 2, ble det sammensatt DNA-konstruksjoner hvor tre områder (betegnet peptid X, peptid Y og peptid Z), som hvert inneholdt minst én human hoved-T-celle-epitop av TRFP, koplet i seks mulige kombinasjoner under dannelse av seks DNA-konstruksjoner som kodet for rekombitope peptider omfattende de tre områder i seks forskjellige konfigurasjoner Siden peptid X deler 5 aminosyrer i sin karboksyterminale ende med 5 aminosyrer i den aminoterminale ende av peptid Y, kunne rekombitope peptider XYZ og ZXY være blitt konstruert med eller uten duphsenng av de nevnte 5 aminosyrer (se fig 11 hvor ZXY er konstruert uten duphsenng av 5-aminosyresekvensen) I de følgende eksempler ble de rekombitope peptider sammensatt sammenhengende, uten duphsenng av 5-aminosyre-sekvensen I tillegg til de tre områder X, Y og Z, kunne også andre områder, som hvert inneholdt minst én human T-celle-epitop, innlemmes i de rekombitope peptider, og DNA-konstruksjoner med fire eller flere områder (med N' konfigurasjoner, hvor N = antall områder) fremstilles Alternativt kan ett eller flere områder innføres i stedet for peptid X, peptid Y eller peptid Z, så som peptid A eller B, som vist på fig 4, under fremstilling av for eksempel rekombitopt peptid AXY

Det er beskrevet detaljerte protokoller for spalting og fjerning av uvedkommende sekvenser tilføyd til rekombitope peptider som et hjelpemiddel ved rensing Rensede rekombitope peptider er blitt undersøkt med hensyn til binding av humane katte-allergiske pasienters IgE ved Western blot, og sammenliknet med IgE-binding av rekombinante kjeder 1 og 2 av TRFP Det ble utført ELISA for undersøkelse av allergisk IgE-binding til rekombitope peptider i forhold til naturlig TRFP, rekombinant kjede 1 og rekombinant kjede 2 Arbeidet som er beskrevet i det foreliggende, viser at rekombitope peptider ifølge den foreliggende oppfinnelse har T-celle-stimulerende virkning, selv om deres epitop-konifgurasjon generelt er forskjellig fra konfigurasjonen som finnes i den naturlige TRFP-proteinsekvens Anvendelse av de rekombitope peptider som forebyggende midler er videre blitt vist å gjøre at mus ikke svarer på antigen-angrep med naturlig TRFP, rekombinant kjede 1, eller kjede 2 av TRFP, eller det anvendte rekombitope peptid

Denne oppfinnelse er ytterligere illustrert ved de følgende eksempler

Eksempel 1 T-celle-epitop-undersøkelser med overlappende TRFP-peptider

Mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) ble renset ved Ficoll-Hypaque-sentnfugenng av 60 ml hepanmsert perifert blod fra katte-allergiske pasienter, som viste kliniske symptomer på katte-allergi og som ga positiv hud-test med katte-ekstrakt Ti millioner PBMC fra en individuell pasient ble dyrket110 ml RPMI-1640 (Gibco) som inneholdt 5% blandet humant AB-serum og som var supplert med glutamin, penicillin, streptomycin og Hepes-buffer (komplett RPMI-1640) i nærvær av 20 fig naturlig affimtetsrenset TRFP pr ml kultur ved 37°C17 dager Levedyktige celler ble deretter renset ved hjelp av Ficoll-Hypaque-sentnfugenng og dyrket12 ytterligere uker i komplett RPMI-1640 inneholdende S enheter rekombinant humant IL-2 pr ml og 5 enheter rekombinant humant DL-4 pr ml De hvilende T-celler man fikk ved dyrkningen, ble deretter undersøkt ved en sekundær-formenngsanalyse under anvendelse av en 96-brønns mikrotiterplate under vurdering av T-celleresponser overfor de forskjellige TRFP-peptider eller -proteiner (TRFP-antigener) som vist på fig 3 For analyse ble 2 x 10<4>hvilende T-celler dyrket i komplett RPMI-16401 3 dager ved 37°C i nærvær av 5 x 10<4>autologe PBMC (3500 Rad) som antigen-presenterende celler med forskjellig konsentrasjon av ett av TRFP-antigenene i hver brønn i en mengde på 200 fil pr brønn Hver brønn fikk så 1 fiCi tntiert tymidin116 timer De innarbeidede verdier ble oppsamlet på glassfiberfiltre og bearbeidet for væskescintillasjonstellmg Stimulenngsindeksene for responser overfor hvert peptid ble så beregnet som maksimale CPM som svar på antigen, delt med middel-kontroll-CPM En stimulenngsindeks på 2,5 ble ansett for å være en positiv T-celle-respons (Anvendt gjennom hele denne patentsøknad er stimulerende virkning på humane T-celler definert som en stimulenngsindeks på minst 2,0 Stimulenngsindeksen for T-celle-epitopene eller -områdene for anvendelse ved fremstilling av et rekombitopt produkt ifølge oppfinnelsen, er imidlertid minst 2,0, fortrinnsvis minst 2,5, mer foretrukket minst 3,5 og mest foretrukket minst 5,0) En oppsummering av resultatene av 34 slike forsøk er vist på fig 3 De fem topp-peptidresponser overfor det overlappende sett av TRFP-peptider som dekker kjede 1 og kjede 2 av TRFP, hos T-cellelinjen som stammer fra hver pasient, ble gradert, idet den høyeste positive respons fikk poengtall 5, den nest høyeste positive 4, o s v Summen av poengene oppnådd for hvert peptid ble så beregnet og er vist på histogrammet på fig 3 Denne analysetype belyser den relative betydning av forskjellige områder av TRFP-moIekylet ved T-celle-responsen overfor det intakte protein Resultatene viser at hovedområdene for T-celle-reaktivitet i denne pasientgruppe omfattes (i rekkefølge etter betydmngsfullhet) av Fel-14,2 (kjede 1, aminosyrerester 29-42), Fel-3,1 (kjede 1, aminosyrerester 18-32), Fel-2 (kjede 1, aminosyrerester 9-25), Fel-21 (kjede 1, aminosyre-rester 56-70), Fel-29 (kjede 1, aminosyrerester 56-70), Fel-1,2 (kjede 1, aminosyrerester 1-17), Fel-4 (kjede 1, aminosyrerester 37-55), Fel-18 (kjede 2, aminosyrerester 23-48), Fel-25 (kjede 2, aminosyrerester 49-68), Fel-16 (kjede 2, aminosyrerester 1-22) og Fel 23 (kjede 1, aminosyrerester 51 -66) Et sett av peptider ble så utformet for å dekke disse områder Deler av Fel-1,2, Fel-2, Fel-3,1 og Fel-14,2 omfatter peptid X (kjede 1, aminosyrerester 7-33) Deler av Fel-3,1, Fel-14,2 og Fel-4 omfatter peptid Y (kjede 1, aminosyrerester 29-55) Deler av Fel-16, Fel-17 og Fel-18 omfatter peptid Z (kjede 2, aminosyrerester 14-39) Deler av Fel-4, Fel-21 og Fel-23 omfatter peptid A Deler av Fel-29 omfatter peptid B Peptidene X, Y, Z, A og B er vist på fig 4

Esempel 2 Konstruksjon og ekspresjon av rekombitope peptider

PCR-metoder (polymerase-kjedereaksjon) med anvendelse av syntetiske oligonukleotider ble anvendt til konstruenng av DNA-molekyler som koder for sekvensene av peptidene X, Y og Z For forøking av ekspresjonen i E coh, ble kodonene i ohgonukleotidene valgt fra en tabell over de kodoner som var fremherskende i sterkt uttrykte E coh-proteiner P M Sharp et al, Nucl Acids Res 16 8207 (1988) Ohgonukleotidene og PCR-metodene som ble anvendt til konstruenng av rekombitope peptider, er beskrevet detaljert nedenfor

Oligonukleotider ble utformet med E coli-foretrukkede kodoner som vist skjematisk på fig 5 og 6 Disse oligonukleotider (C, D, E, F, G, H, I, J, K, L, M, N og 0 vist på fig 7)

(SEKV ED NR 12-37) ble forøket under anvendelse av et Perkin Elmer/Cetus GeneAmp-sett, i to atskilte PCR-reaksjoner (henholdsvis PCR nr 1 og PCR nr 2, hvor PCR nr 1 resulterte i syntetisenng av 5-delen av DNA-molekylet som koder for det rekombitope peptid, og PCR nr 2 resulterte i syntetisenng av 3'-deIen av DNA-molekylet som koder for det rekombitope peptid) Denne fremgangsmåte ble anvendt på grunn av tilstedeværelse av en sekvens (KALPV (ammosyre-rester 1-5 av SEKV DD NR 8)) både i peptid X og peptid Y som ble funnet å innvirke på den nktige PCR-dannelse av rekombitopt YZX når en enkelt PCR-reaksjon ble utført med ohgonukleotidene ( C- T) Ved fremstilling av rekombitopt peptid

AYZXB, som vist på fig 6, var ohgonukleotidene anvendt i PCR nr 1, N, J, K og C-I, og ohgonukleotidene anvendt i PCR nr 2, var C-I og L, M, O Ved fremstilling av rekombitopt peptid YZX, som vist på fig 5, var ohgonukleotidene anvendt i PCR nr 1, C, D, E og F, mens ohgonukleotidene anvendt i PCR nr 2, var F, G, H og I Hver reaksjonsblanding (10 mg) dannet henholdsvis 5'- og 3'-halvdelen av den påtenkte YZX-struktur (fig 5) Disse PCR-blandinger ble, etter tilsetting av Taq-polymerase, underkastet følgende program med denaturenngs-, koplmgs- og polymensenngssykluser

Etter fullførelse av reaksjonene PCR nr 1 og PCR nr 2 ved konstruksjonen av YZX-strukturen, ble porsjoner fra hver (100 p-mol av den totale reaksjonsblanding på 10 mg, 1/100 volumdeler) tilsatt til en tredje PCR-reaksjonsblanding som inneholdt et sett av 5 - og 3'-pnmere (100 p-mol av primere C og I) En tredje PCR-reaksjon (PCR nr 3) ble utført under anvendelse av denne tredje PCR-reaksjonsblanding som beskrevet tidligere for PCR-reaksjonene nr 1 og 2, bortsett fra at kophngstemperaturen i trinn 6 ble øket til 65°C Fullførelse av PCR nr 3 ga DNA som kodet for rekombitopt peptid YZX Reaksjonsmetoden PCR nr 3 er hk den som er beskrevet i R M Horton et al, Gene 77 61 (1989) Hele reaksjonsblandingen anvendt ved PCR nr 3 ble fraksjonert på en 2% agarose-gel, og båndet med den riktige størrelse (230 bp) ble elektro-eluert fra gelstnmmelen og utfelt Den isolerte DNA som koder for rekombitopt peptid YZX, ble underkastet en ytterligere PCR-reaksjon under anvendelse av overskudd av 5'- og 3'-forøkings-pnmere (C og I) Dette sluttprodukt ble nedbrutt med restnksjonsenzymene BamHI og deretter klonet i vektoren pETl ld under transkri<p>sjonen regulering av fag T7 gn 10 lac O-koplingspromotoren F W Studier et al, Methods in Enzymol 185 60 (1990)

En polykopler som koder for seks sekvensielle histidiner, (CAC)é, ble klonet i ramme på 5'-enden av DNA som koder for det rekombitope peptid YZX Seks-histidin-(H6eller HiS6)-ledersekvensen gjorde mulig rensing av det uttrykte rekombitope peptid under anvendelse av QIAGEN NTA-agarose (Diagen GmbH, Dusseldorf, Tyskland), en Ni - chelaterende bærer E Hochuh et al, BioTechnology 6 1321 (1988) DNA som koder for stedspesifikke enzymatiske spaltmgssteder (f eks trombm, faktor Xao s v) kan innføres under anvendelse av PCR-metoder mellom den polyhistidm-kodende (He) sekvens og DNA som koder for det rekombitope peptidskjelett Når det gjaldt rekombitopt peptid YZX, ble det innført et trombinoppfattelsessted (LVPRGS) (SEKV ID NR 72) M Utilen og T Moks, Methods in Enzymol 185 129 (1990), J-Y Chang,Eur J Biochem 151 217(1985)

En liknende fremgangsmåte som den beskrevet ovenfor for konstruenng av DNA som koder for det rekombitope peptid YZX, ble anvendt til konstruenng av DNA som koder for de rekombitope peptider XYZ og ZYX Dessuten kan andre peptider inneholdende T-celle-epitoper tilføyes til en eksisterende rekombitop skjelettstruktur så som YZX (som fremstilt ovenfor), hvilket var tilfellet ved konstruksjonen av rekombitopt peptid AYZXB (se fig 6 og 7) Alternativt kan peptider som inneholder T-celle-epitoper, fremstilles uten anvendelse av et eksisterende rekombitopt skjelett under anvendelse av fremgangsmåter skissert i det foreliggende For fremstilling av rekombitopt peptid AYZXB, ble det fremstilt ohgonukleohd-pnmere (J-M) med overlappende områder for hver ende av rekombitopt peptid YZX og en 5'-og 3'-forøkmngs-pnmer (N og O) (Som vist på fig 6, er den mørkgjorte del av molekylet den overlappende sekvens) PCR-reaksjoner ble utført som beskrevet ovenfor Det resultelrende AYZXB-fragment ble isolert og subklonet i pET 11 DH6TH-vektoren

En alternativ fremgangsmåte ble anvendt til konstruenng av DNA som koder for rekombitope peptider XZY, YXZ og ZXY Hver av DNA-konstruksj onene som koder for rekombitope peptider XZY, YXZ og ZXY, ble ligert ved kodonet som koder for den mest N-terminale aminosyre av det rekombitope peptid, med DNA som koder for ledersekvensen MGHHHHHHEF, representert i (SEKV DD NR 73) (hvor aminosyrene EF kodes for ved EcoRI-restnksjonsstedet GAATTC representert i SEKV DD NR 74) DNA-segmenter som koder for de tre rekombitope peptider, ble sammensatt via etter hverandre følgende PCR hovedsakelig som beskrevet av Horton et al, (1989) Gene 77 61-68 DNA-segmentene som koder for peptider X, Y og Z (vist på fig 4), ble forøket fra Fel d I-cDNA-molekylene beskrevet iMorgenstern et al ,(1991) Proe Nati Acad Sei USA 88 9690-9694 Som vist på fig 9, som viser konstruksjonen av kodingssekvensen for det rekombitope peptid XZY som et spesifikt eksempel, ble oligonukleotid-pnmere syntetisert med en DNA-sekvens som ikke bare ville forøke et spesifikt DNA-segment som koder for peptid X, Y eller Z, men som også ville bmde kovalent et lite segment (9-18 basepar) av DNA-segmentet som koder for det tilstøtende peptid X, Y eller Z PCR ble utført under anvendelse av Vent6-polymerase ifølge New England Biolabs' instruksjoner med et forøkningsprogram på 30 x [94°C 1 min /60°C 1 min 30 sek /72°C 1 min ] Primerne anvendt for PCR-forøkninger er vist på fig 10 Individuelle rekombitopt peptid-kodende/kopler-DNA-rfagmenter fra PCR-forøkninger ble renset ved hjelp av preparativ gel-elektroforese13 vekt/volum% NuSieve-(FMC)-agarose Disse individuelle PCR-fragmenter ble deretter koplet i en andre PCR-reaksjon under dannelse av en DNA-konstruksjon som koder for XZY, som vist på fig 9 og 11 For kopling av disse PCR-fragmenter, ble 3% NuSieve-gelstnmler inneholdende begynnelses-PCR-produktene smeltet ved 70°C, og 1 fil av hver ble tilsatt ved en Vent,», PCR-polymerasereak-sjon hvor man anvendte 5'RI (NH2-termmal)- og 3'Bam-(COOH-termmal)-pnmerne

På grunn av restnksjonsstedene som fantes i ekspresjonsvektoren, pETl ld (Studier et al, 1990), hadde alle ekstreme 5'-pnmere EcoRI-kodende steder [GAATTC], respresentert som SEKV ID NR 74, i ramme med DNA som koder for de NH2-terminale aminosyrer av den spesielle rekombitop, mens endene av de ekstreme 3-pnmere hadde BamHI-kodende steder [GGATCC] representert i SEKV ID NR 75 DNA-konstruksjoner som koder for rekombitope peptider XZY, YXZ og ZXY fremstilt ut fra den sekundære PCR, ble EcoRl/- BamHI-nedbrutt og kjørt i elektroforese gjennom en 0,5 vekt/volum% SeaPlaque(FMC)-agarose-gel Gelstnmler som inneholdt DNA-konstruksjonene, ble smeltet ved 70°C og tilsatt ved en hgenngsreaksjon med EcoRI/BamHI-nedbrutt Bluescnpt KS-plasmid (Stratagene) Ligenngen ble transformert til kompetente XL-1 Blue-baktener (Stratagene), og rekombinante plasmider med innførte deler identifisert ved diagnostiske restnksjonsnedbrytninger etter isolering under anvendelse av Qiatop-sett (Diagen GmbH) Sekvensen av innførte deler ble bekreftet ved hjelp av dideoksy-kjedeavslutnings-sekvensanalyse under anvendelse av et Sequenase II-sett (United States Biochemicals) Bluescnpt KS-plasmider hvor det befant seg DNA-konstruksjoner som koder for rekombitope peptider XZY-, YXZ- og ZXY-innskudd med nktig nukleotid-sekvens, ble EcoRI/BamHI-nedbrutt og DNA-konstruksjonene isolert fra en 0,6% SeaPlaque-gel for subkloning i ekspresjonsvektoren pETl 1 d i ramme med DNA som koder for den NH2-terminale leder MGHHHHHHEF representert i SEKV ID NR 73 som nevnt ovenfor Konstruksjonene ble subklonet i det EcoRI/BamHI-nedbrutte pETl 1 d Hisg Amb all HR Denne ligenng tjente til utskifting av en innskutt del med DNA-konstmk-sjonen, i dette tilfelle cDNA i hoved-ambrosia-("ragweed")-allergenet, Amb a 11 (Rafhar et al, (1991) J Biol Chem 226 1229-1236) Man fikk pETl 1 d His Amb a 11 DHR fra pETl ld i to tnnn Først ble pETl ld EcoRI/HinDUI-nedbrutt, gjort stumpt med Klenow-fragment av E coli-DNA-polymerase, og ligert tilbake til det opprinnelige under frembringelse av pETl ld DHR et pETl ld-plasmid som manglet HindUI- og EcoRI-steder Deretter ble pETl ld HiseAmb all DHR dannet ved fjerning av HeAmb al 1-kassetten fra ekspresjonsvektoren pETl ld HisgAmb al 1 som et NcoI/BamHI-fragment og ligenng av det i NcoI/BamHI-nedbrutt pETl ld DHR Rekombinante plasmider ble identifisert ved diagnostiske restnksjonsnedbrytninger etter isolenng via et Qiatip-sett, og positive plasmider ble transformert i kompetente BL21-[DE3]-baktener for ekspresjon BL21 [DE3] inneholder et rekombinant fag 1-lysogen, DE3, med et fag T7 RNA-polymerase-gen under transknpsjonell kontroll av lac UV5-promotoren T7 RNA-polymerase-gen-ekspresjon bevirkes ved tilsetting av IPTG, som i sin tur fører til høymvå-ekspresjon av det rekombinante gen subklonet 3' av pET-vektorens T7 gn 10 lac 0-koplingsmotor

PCR-avledede DNA-fragmenter som koder for (H6)-kophnger av fullt utviklede kjeder 1 og 2 av TRFP subklonet i pSEM (US-patentsøknad 662 276 inngitt 28 februar 1991), ble fjernet og ligert i pETl ld Dette ble oppnådd ved tilknytting av Bel I-koplere til Pstl-stedene i 3-endene av de to kjeder, Ncol-nedbryting i 5-enden av kjedene og innfønng av SWcoWBcl-fragmentet i 57vfcoI/3BamHI-nedbrutt pETl ld

De rekombinante peptid-kjeder 1 og 2 av TRFP så vel som de rekombitope peptider XYZ, XZY, YZX, ZYX, ZXY og YXZ ble uttrykt i E coh og renset hovedsakelig som skissert nedenfor BL21 DE3-vertsbaktener hvor pETl ld-ekspresjons-DNA-konstruksjoner befant seg, ble ny-utstrøket på en BHI-agarplate (3,7 vekt/volum% Difco Brain Heart Infusion, 1,5 vekt/volum% Difco-agar) supplert med 200 tig/ml ampicilhn og inkubert over natten ved 37°C En enkelt koloni ble inokulert12 ml av 200 ilg/ml ampicilhn/BHI-medium (3,7 vekt/volum% Difco Brain Heart Infusion) og rystet ved 300 omdreininger pr minutt ved 37°C inntil mediet var uklart, men ikke mettet Kulturen på 2 ml ble deretter tilsatt til 100 ml 200 /xg/ml ampicilhn/BHI-medium, rystet ved 300 omdr pr minutt ved 37°C inntil mediet var uklart, men ikke mettet, på hvilket punkt kulturen ble delt118 x 250 ml (4,5 liter) 200fig/ml ampicilhn/BHI-medium og rystet ved 300 omdr pr minutt ved 37°C Når OD595for kulturen nådde 1,0, ble ekspresjon av de rekombinante peptider som (His)6-kophngspeptider innført ved tilsetting av D?TG til 400 fiM, og dyrkingen fikk fortsette1to timer

Bakteriene ble høstet ved sentnfugenng ved 10 000 X g115 minutter, og suspendert på nytt11/50-dels volum av 6 M guanidin-HCl, 100 mM 2-merkaptoetanol, 100 mM NaPCU og 10 mM Tns med pH 8,0 Rekombinant kjede 1 og kjede 2 og rekombitope peptider (rekombinante peptider) ble ekstrahert ved kraftig rystmg av de gjenoppslemmede bakterier11 time ved 25°C Denne suspensjon ble underkastet sentnfugenng ved 15 000 X g, supernatanten ble fjernet, justert til pH 8,0 med 10N NaOH og påsatt på en NTA-agarose-kolonne som var blitt ekvihbrert 16 M guamdin-HCl, 100 mM NaPCvog 10 mM Tns med pH 8,0 inntil OD280for utløpsstrømmen nådde bakgrunnsverdien Kolonnebufferen ble så forandret til 8 M urea, 100 mM NaP04og 10 mM Tns med pH 8,0 Etter ekvihbrenng, ble det utført en sterkere vask 1 8 M urea, 100 mM NaOAc og 10 mM Tns pH 6,3 inntil OD280for utløpsstrømmen nådde bakgrunnsverdi Hvert rekombinant peptid (som en HiS6-sammen-smelting) ble deretter eluert 18 M urea, 100 mM NaOAc og 10 mM Tns med pH 4,5 og oppsamlet1porsjoner hvis OD2go-profil ble overvåket Peptid-toppen ble dialysert 3 ganger1500 volumdeler PBS (fosfatbufret saltløsning) for analyse Utbyttet var1området fra 2 til 25 mg rekombinant peptid-(HiS6)-kophng pr liter, med en renhet (ifølge bestemmelse ved densitometnsk scanmng av SDS-polyakrylamid-geler) som generelt oversteg 90%

De rekombinante peptider (TRFP kjede 1, TRFP kjede 2, XYZ, YZX og ZYX) skissert ovenfor har alle en N-terminal sekvens tilføyd som et hjelpemiddel ved rensing og ekspresjon (f eks MGHHHHHHLVPRGS-) representert1SEKV ID NR 76 Denne uvedkommende N-terminale sekvens kan fjernes ved proteolytisk nedbryting siden sekvensen inneholder et trombinoppfattelsessted (LVPRGS) representert1SEKV ID NR 72 innført mellom poly-histidinsekvensen og den rekombitope sekvens (Se fig 8, pilen viser trombinspalhngs-stedet) Trombin ble anvendt til spalting av den uvedkommende sekvens, idet det ble tilbake bare to ekstra aminosyre-rester, GS, på den N-terminale ende av TRFP-kjedene 1 og 2 og de rekombitope peptider XYZ, YZX og ZYX (J -Y, Chang, Eur Biochem 151 217-224 (1985)) Effektiv spalting av kophngsproteinet kan oppnås ved anvendelse av et forhold mellom protein og trombin på 1000 11 2 timer ved 25°C Spaltings- og renseskjemaet anvendt til konstruenng av rekombitopt peptid YZX, er skissert nedenfor

1) rekombitopt peptid MGHHHHHHLVPRGS - YZX

2) Dialyser i PBS, pH 8,0

3) Trombinspalting peptid trombin = 1000 1

25°C, 2 timer

4) Reduksjon med 100 mM ditiotreitol i

5 M guamdin-HCl

37°C, 30 minutter

5) C4reversert fase-HPLC, pH 2,0

6) Frysetørking

Analytisk reversert-fase-HPLC ble utført på en V YD AC 214 TP 54-kolonne med et sjiktvolum på 42 ml Kolonnen ble påsatt 340 fig rekombitopt peptid YZX Halvpreparativ HPLC ble utført under anvendelse av en kolonne av typen V YD AC 214 TP 1022 med et sjiktvolum på 95 ml påsatt 90 mg protein Gradienten startet med 0-30% acetonitnl inneholdende 0,1% tnfluoreddiksyre i løpet av de første 10 minutter, fulgt av fra 30 til 40% acetonitnl i løpet av 15 minutter Den mobile fase ble så holdt på 43% acetonitnl 110 minutter Det rensede rekombitope peptid YZX ble eluert ved 43% acetonitnl Spaltingen og rensingen ble overvåket ved SDS-PAGE Identifisenngen og renheten av det rekombitope peptid YZX ble bestemt ved proteinsekvens-analyse under anvendelse av et apparat av typen Applied Biosystem Inc Protein Sequenator modell 477 A

Eksempel 3

Direktebindings-analyse av IgE overfor TRFP-proteiner og rekombitope forbindelser

Det ble utført Western "immunblof-analyse av de rekombitope peptider fremstilt i eksempel 2 Konsentrasjonen av alle proteinprøver (f eks TRFP, rekombinant kjede 1 av TRFP, rekombinant kjede 2 av TRFP, rekombitopt peptid XYZ, rekombitopt peptid XZY, rekombitopt peptid YXZ, rekombitopt peptid YZX, rekombitopt peptid ZXY og rekombitopt peptid ZYX) for gel-elektroforese ble bestemt ved BCA-metoden (Pierce Co) Alle protein-prøver ble påsatt på gelen med 5 fig pr felt, bortsett fra TRFP med 10 ptg pr felt Protein-separasjon ble utført på en 15% akrylamid-gel, og overfønng ble utført ved elektro-"blotting" ved 1,5 ampere11 1/2 time på nitrocellulose-papir (Schleicher og Schuell, 0,1/un) i et Hoeffer-apparat i henhold til protokollen ifølge H Towbin, T Stachhn og J Gordon, PNAS 76 4350 (1979) Proteinene ble skyllet i "blot"-løsmng (25 mM Tns-HCl 7,5, 0,171 M NaCl og 0,5 ml pr liter av Tween 20) "Blot"-stedet ble så blokkert11 time i blokkenngsløsning (1% melk i "blot"-løsning) Plasma fra pasient nr 417, anvendt som primær antistoff-kilde, ble fortynnet i blokkenngsløsning til 10% og for-absorbert11 1/2 time med ubrukt nitrocellulose (2 cm x 15 cm) Det preparerte humane plasma ble så inkubert over natten på en orbital-ryster med den aktuelle protein-"blot"-del Etter inkubenng av det første antistoff, ble "blot"-delen vasket tre ganger, idet hver vasking innbefattet en 15 minutters inkubenng i blot-løsmng Det annet antistoff, spesifikt for humant IgE (biotinylert geite-anti-humant IgE, KPL Inc), ble fortynnet 1 25001 blot-løsmng, og mkubenngen foregikk i to timer Overskudd av det annet antistoff ble deretter fjernet ved hjelp av tre 15 minutters inkubennger med blot-løsning I-jodert streptavidin (Amersham) ble fortynnet 1 25001blot-løsmng og inkubert med blot11 time med 2 fiCi i et inkubenngsvolum på 50 ml Blot-delene ble deretter vasket med blot-løsmng inntil den påvisbare radioaktivitet i den brukte løsning minket til bakgrunns-lvåer Blot-delen ble deretter innpakket i "saran"-innpakning og eksponert for film over natten med en cronex-forsterkmngsskjerm ved -80°C IgE-bindingsmønsteret vist på fig 13 viser reaktiviteten overfor affinitetsrenset TRFP (felt 1) kjede 1, molekylvekt 6 KD, og kjede 2, > 16 KD Den rekombinante kjede 1 viser sterk IgE-binding (felt 2), mens reaktiviteten av rekombinant kjede 2 er redusert sammenliknet med kjede 1 (felt 3) De rekombitope peptider som viser IgE-binding, er rekombitope peptider XYZ og ZXY (henholdsvis felt 4 og 8) Alle andre rekombitope peptider er negative når det gjelder IgE-binding ved denne analysemetode

Spesifikk binding av IgE til rekombitope peptider ble også vist ved ELISA-analyser Analyseplater av typen Corning (nr 25882-96) ble belagt med 10/lg/ml av hvert belegmngs-anhgen (dvs TRFP, kjede 1 (rekombinant kjede 1 av TRFP), kjede 2 (rekombinant kjede 2 av TRFP), rekombitopt peptid XYZ, rekombitopt peptid XZY, rekombitopt peptid YXZ, rekombitopt peptid YZX, rekombitopt peptid ZXY og rekombitopt peptid ZYX) oppregnet på fig 14, med 50 fig pr brønn og inkubert over natten ved 4°C Belegnings-antigene ble fjernet, og brønnene ble blokkert med 0,5% gelatin i PBS, 200 fil pr brønn12 timer ved romtemperatur Plasma fra pasient nr 669 ble senefortynnet med PBS-Tween 20 (PBS med 0,05% ikke-ionisk detergens Tween-20 (Sigma, St Louis MO)), og 100 fil pr brønn ble tilsatt, og det ble inkubert over natten ved 4°C (plasmafotrynningene undersøkes in duplo) Det annet antistoff (biotinylert geite-anti-humant IgE, 1 1000, Kirkegaard & Perry Laboratories Inc, Gaithersburg, MD), ble tilsatt med 100/ti pr brønn11 time ved romtemperatur Denne løsning ble fjernet, og streptavidin-HRPO, 1 10 000 (Southern Biotechnology Assicoates, Inc, Birmingham, AL) ble deretter tilsatt med 100 fil pr brønn i

1 time ved romtemperatur (alle brønner ble vasket tre ganger med PBS-Tween mellom hvert mkubenngstnnn) TMB-membran-peroksydasesubstrat-system (Kirkegaard & Perry Laboratories) ble nyblandet og tilsatt med 100 fil pr brønn Fargen fikk utvikles12-5 minutter Reaksjonen ble stoppet ved tilsetting av 100 fil pr brønn av 1 M fosforsyre Platene ble avlest på en Microplate EL 310 Autoreader (Biotek Instruments, Winooski, VT) med et 450 nm filter Gjennomsnitt ble beregnet for absorbans-mvåene for to parallelle brønner Grafisk fremstilling av resultatene (logaritmen til fortynningen sammenstilt med absorbans) av ELISA-analysene er vist på fig 14

Resultatene av ELISA vist på fig 14 viser et høyt nivå av IgE-binding til TRFP med noe lavere binding til rekombinant TRFP kjede 1 (kjede 1) og kjede 2 (kjede 2) De to rekombinante kjeder viser ekvivalent binding med denne spesielle pasients IgE Bare det rekombitope peptid ZXY viser klar reaktivitet med IgE Bindingen av de andre rekombitope peptider er ved, eller nær, bakgrunnsnivået med et svakt signal fra rekombitopt peptid XYZ For påvisning av at rekombitope peptider var tilstede i like mengder både ved ELISA- og Westem-analysen, ble det anvendt anh-peptid-antisera som positiv kontroll, og dette ga ganske ekvivalente signaler for alle felter og brønner med rekombitope peptider

Eksempel 4 Respons hos humane T-celle-epitoper overfor rekombitope peptider

Responsen hos humane katte-allergi-T-celler overfor rekombitope peptider ble undersøkt Mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) ble renset ved Ficoll-Hypaque-sentnfugenng av 60 ml hepanmsert perifert blod fra katte-allergiske pasienter, som viste kliniske symptomer på katte-allergi og som ga positiv hudtest med katte-ekstrakt Ti millioner PBMC fra en individuell pasient ble dyrket110 ml RPMI-1640 som inneholdt 5% blandet humant AB-serum og var supplert med glutamin, penicillin, streptomycin og HEPES-buffer i nærvær av 10 fig naturlig affinitetsrenset TRFP pr ml kultur, eller med 25 fig renset uspaltet rekombitopt peptid YXZ pr ml kultur, eller med 25 ug renset spaltet rekombitopt peptid YZX pr ml kultur ved 37°C17 dager Rekombitopt peptid YZX ble spaltet med trombin som beskrevet i eksempel 2 Levedyktige celler ble deretter renset ved Ficoll-Hypaque-sentnfiigenng og dyrket12 ytterligere uker i RPMI-1640/5% AB-serum som inneholdt 5 enheter rekombinant humant 1L-2 pr ml og 5 enheter rekombinant humant 1L-4 pr ml De hvilende T-celler ble deretter undersøkt ved en sekundær-formenngs-analyse under anvendelse av en 96 brønns mikrotiterplate for bedømmelse av T-celle-responser overfor forskjellige TRFP-proteiner eller -peptider (TRFP-antigener) For analysering ble 2 x IO<4>hvilende T-celler dyrket13 dager ved 37°C i nærvær av 2 x IO<4>autologe Epstein-Barr-virus-transformerte B-celler (25 000 Rad) som antigen-presenterende celler med forskjellige konsentrasjoner av antigen1200 fil pr brønn Hver brønn fikk så 1 itCi tntiert tymidin116 timer De innlemmede telle-verdier ble oppsamlet på glassfiberfiltere og bearbeidet for væskescintillasjonstelling Stimulenngs-indeksene for responser overfor hvert antigen ble så beregnet som de maksimale CPM som svar på antigen, delt med middel-kontroll-CPM En stimulenngs-indeks på 2,5 ble betraktet som en positiv T-celle-respons En oppsummering av resultatene fra 3 slike forsøk (pasienter 522,519 og 386) er vist på fig 15a, fig 15b og fig 15c Sammenliknet med forsøkene vist på fig 15a og 15b, ble Fel-1,2 (kjede 1, aminosyre-rester 1-17), i forsøket vist på fig 15c, erstattet med Fel-1,4 (kjede 1, aminosyre-rester 6-17), og Fel-18 (kjede 2, aminosyre-rester 23-48) ble erstattet med Fel-33,3 (kjede 2, aminosyre-rester 26-40) for at det skulle være mer likt aminosyrene som utgjør peptidene X og Z Ved dette forsøk ble dessuten ett peptid som stammet fra Y-Z-forbindelsen av rekombitopt peptid YZX (aminosyre-restene 50-55 fra kjede 1 av TRFP og aminosyre-restene 14-19 fra kjede 2 av TRFP) og ett peptid som stammet fra Z-X-forbindelsen av rekombitopt peptid YZX (aminosyre-restene 34-39 fra kjede 2 av TRFP og aminosyre-restene 7-12 fra kjede 1 av TRFP) syntetisert og undersøkt Disse forbindelses-peptider ble fremstilt for bestemmelse av om hvorvidt disse områder av rekombitopt peptid YZX danner enlkke-naturhg epitop ved dannelse i det rekombitope peptid

Resultatene viser at T-celler fra pasient 522, primet med naturlig TRFP, svarer positivt på naturlig TRFP, rekombitopt peptid YXZ, peptid Y, Fel-14,2 og Fel-17 I motsetmng til dette, svarer T-celler pnmet med rekombitopt YXZ mindre godt på naturlig TRFP, men svarer med et liknende nivå, eller bedre, på en rekke syntetiske peptider som svarer til deler av TRFP-molekylet, innbefattende peptid X, peptid Y, peptid Z, Fel-4, Fel-3,1, Fel-2, Fel-14,2, Fel-17 og Fel-18 Liknende resultater av et forsøk med T-celler fra pasient 519 er vist på fig 15b Naturlige TRFP-pnmede T-celler fra denne pasient svare på naturlig renset TRFP, rekombitopt peptid YXZ og peptid Y Når den samme pasients celler ble pnmet med rekombitopt peptid YXZ, viste de positive responser overfor naturlig TRFP, rekombitopt peptid YXZ, peptid X, peptid Y, peptid Z, Fel-3, l, Fel-4 og Fel-17 Fig 15c viser et liknende forsøk som innbefatter renset spaltet rekombitopt YXZ som pnmings-antigen Resultatene viser at T-celler fra pasient 386, pnmet med naturlig TRFP, svarer positivt på naturlig TRFP, rekombitopt peptid YZX, peptid X, peptid Y, Fel 3,1 og Fel-14,2 I motsetning til dette, svarer T-celler pnmet med rekombitopt YZX med et liknende nivå eller bedre, på naturlig TRFP, rekombitopt peptid YZX, peptid X, peptid Y, peptid Z, Fel-2, Fel-3,1, Fel-14,2 og Fel-17 Disse data viser at T-celler, i det minste hos disse tre pasienter, effektivt kan oppfatte TRFP-T-celle-epitoper når de presenteres som et rekombitopt peptid Ingen epitoper som finnes i det naturlige TRFP-molekyl undersøkt i disse forsøk, ødelegges i forbindelse med det rekombitope YXZ-peptid Evnen hos de rekombitope peptider YXZ eller YZX til presentenng av TRFP-epitoper ved disse forsøk viser seg å være større sammenliknet med det naturlige molekyl Resultatene fra pasient 386 viser at peptider som stammer fra forbindelsesområdene i det rekombitope YZX (YZ-forbindelsespeptid og ZX-forbindelsespeptid), ikke oppfattes av T-celler når de presenteres i et rekombitopt peptid, derfor dannes det ingenlkke-naturhge epitoper i forbindelsesområdene

Eksempel 5 Muse-T-celle-respons overfor rekombitope peptider

Mus ble immunisert med rekombitopt peptid YZX for bestemmelse av om hvorvidt T-celle-epitoper som finnes i det rekombitope peptid som stammer fra TRFP, kan stimulere en T-celle-respons Analysen bestemte evnen hos lymfeknute-celler til å svare på de individuelle rekombitope peptider så vel som det immuniserende antigen

10 mus av typen B6CBAF1 ble immunisert subkutant i halebasis-området og i lår-området med 100 fig rekombitopt peptid YXZ i komplett Freunds adjuvans Etter 10 dager ble lyske-, paraaorta- og kne-lymfeknutene hos immuniserte mus uttatt og blandet Lymfeknutecellene ble suspendert i kald RPMI 1640 med 1% føtalt bovint serum (FBS) ved passasje gjennom trådduk av rustfritt stål Cellene ble vasket 2 ganger med kald RPMI-1640 som inneholdt 1% FBS, og holdt ved 4°C

Lymfeknutecellene ble utplatet med 4 x IO<6>celler pr ml i RPMI 1640 med 10% FBS, 250 fig penicillin G pr ml, 100 fig streptomycin pr ml og 5 x IO"<5>M 2-merkaptoetanol Cellene ble dyrket med antigen (dvs rekombitopt peptid YZX, rekombitopt peptid ZYX, rekombitopt peptid XZY, peptid X, peptid Y, peptid Z, peptidene X, Y og X og Amb a I) som angitt (fig 16) Etter 24 timer, ble 50 fil supematant fjernet fra hver kultur og frosset over natten under fjerning av overførte levende celler Supernatanten ble oppvarmet til 37°C og vasket CTLL-2-indikatorceller (ATCC nr T1B 214) ble tilsatt (5 x IO<3>celler pr brønn) Denne indikator-cellelinje fordrer IL-2 for fortsatt vekst Etter 24 timer ble 3H-tymidin (1fiCi pr brønn) tilsatt, og cellene ble inkubert i ytterligere 4 timer Platene ble frosset og tint, høstet på et brønnhøstingsapparat av typen Tomtec 96 (Tomtec, Orange, Conn ) og tellet på en Betaplate-betateller (Pharmacia, Gaithersburg, MD)

De blandede lymfeknuteceller svarer godt in vitro som svar på kultur med rekombitopt peptid YZX, ifølge målmg ved IL-2-dannelse (fig 16) Bakgrunnen for mediet alene var gjennomsnittlig 1500 tellinger pr minutt T-celleresponsen overfor rekombitopt peptid YZX kan fremkomme ved én, eller en kombinasjon av, responser overfor det individuelle peptid inneholdende epitoper anvendt til konstruenng av det rekombitope peptid (dvs peptidene X, Y og Z) Andre rekombitope peptider så vel som de individuelle peptider X, Y og Z ble dyrket med lymfeknuteceller, og responsen hos T-celler ble bestemt Det var en betydelig respons overfor hvert av peptidene X, Y og Z, peptid-bestanddelene Det var sterke T-celle-responser overfor flere andre rekombitope peptider ZYX og XZY Det var en liten, men betydelig, T-cellerespons overfor et rekombinant Amb a I-preparat som har de samme aminoterminale ledersekvenser som de rekombitope peptider

Eksempel 6

Anvendelse av rekombitope peptider ved diagnostisering av allergiske sykdommer

De rekombitope peptider kan være egnet som en ny diagnostisenngform for følsomhet overfor et protein-allergen eller et protein-antigen Skjønt for eksempel foretrakkede rekombitope peptider ifølge oppfinnelsen ikke binder IgE, kan noen rekombitope peptider som stammer fra protein-allergener, være i stand til å binde IgE hos allergiske pasienter Disse rekombitope peptider kan anvendes ved hudundersøkelse som en nøyaktig analyse for spesifikk umiddelbar overfølsomhet (ITH) hos et invidid overfor protein-allergenet som det rekombitope peptid stammer fra Allergenene for frembnngelse av ITH-responsen kan også være rekombinant dannede allergener eller biokjemisk rensede allergener fra naturlig kilder, i tillegg hl rekombitope peptider hvor det eneste krav er høy grad av spesifikk IgE-reaktivitet Rekombitope peptider som viser ingen, eller meget liten, reaktivitet med humant IgE, men som omfatter T-celle-epitoper som er reaktive med et protein-allergen, kan anvendes for frembnngelse av en forsinket overfølsomhets-(DTH)-reaksjon hos et individ som er følsomt overfor allergenet som epitopene stammer fra Allergen-formene for frembnngelse av DTH-responsen kan være isolerte rekombitope peptider, rekombinante allergener eller kjemisk modifiserte naturlige eller rekombinante allergener (f eks KOH-behandlet TRFP) Igjen er et hovedkrav når det gjelder det DTH-fremkallende allergen/antigen, mangel av IgE-bindende reaktivitet, eller hvis slik binding finner sted, mangel av mediator-fngjønng fra mastceller eller basofile celler og evnen til stimulenng av T-celler hos et individ ved administrenng En positiv DTH angir T-celler hos individet som er spesifikke for epitopene i det rekombitope peptid Vanligvis er rekombitope peptider større molekyler enn peptider som omfatter en individuell T-celle-epitop, og er således fordelaktige ved DTH-undersøkelse Siden de rekombitope peptider er større molekyler, antas det at de bør finnes i huden (injeksjonssted), idet innstramming av T-lymforcytter og andre celler som bidrar til DTH-hudresponsen, blir mulig

ITH-rekasjonen, som finner sted innen 15-30 minutter ved hud-undersøkelse, kan anvendes i kombinasjon med en DTH-reaksjon, idet DTH-reaksjonen fremkommer 48-72 timer senere Det er kombinasjonen av disse analyser, når det gjelder to forskjellige typer reaktiviteter knyttet til allergiske sykdommer, som representerer en ny diagnostisk utformning Påfønngen på huden under hudundersøkelse med et rekombitopt peptid kan kreve et annet format for frembnngelse av én respons sammenliknet med en annen (ITH sammenliknet med DTH) ITH-reaksjonen kan for eksempel fremkalles hos et individ ved pnkk-undersøkelse med en meget liten mengde av en terapeutisk blanding som omfatter et rekombitopt peptid (i dette tilfelle et IgE-reaktivt rekombitopt peptid) og en farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynmngsmiddel For frembnngelse av en DTH-reaksjon påføres en stor mengde av en terapeutisk blanding omfattende et rekombitopt peptid (i dette tilfelle etlkke-IgE-reaktivt rekombitopt peptid) og en farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynmngsmiddel, ved hjelp av intradermal injeksjons- eller spiss-undersøkelsesform (begge anvendes for TB-undersøkelse ved DTH) Se Immunology (1985) IM Roitt, J Brostoff, D K Male (red), C V Mosby Co, Gower Medical Publishing, London, NY, s 19 2-19 18, s 22 1-22 10 Etter diagnostisenng med peptider ifølge oppfinnelsen, kan individer utvelges for spesifikk behandling hvor de gjøres ufølsomme, ved at man i ett forsøkssett bestemmer IgE-reaktiviteten og T-epitop-reaktiviteten

Claims

1 Isolert peptid med primær strukturavhengig human T-cellestimulerende aktivitet,karakterisert vedat det omfatter minst to områder som hvert har human T-celle-stimulerende aktivitet, idet hvert område omfatter minst en T-celleepitop av et protein-allergen, og de er arrangert i en konfigurasjon forskjellig fra en naturlig forekommende konfigurasjon av områdene i proteinallergenet, idet nevnte områder er avledet fra samme proteinallergen, unntatt Fel d I, eller fra forskjellige proteinallergener, hvori proteinallergenet er valgt fra gruppen bestående av Dermatophagoides proteinallergener, Fehs protein-allergener, Ambrosia proteinallergener, Lohum proteinallergener, Cryptomeria protein-allergener, Alternaria proteinallergener, Alder proteinallergener, Betula proteinallergener, Quercus proteinallergener, Olea proteinallergener, Artemisia proteinallergener, Plantago proteinallergener, Panetaria proteinallergener, Camne proteinallergener, Blattella protein-allergener, Apis proteinallergener og Penplaneta proteinallergener, hvor det rekombinante peptidet binder immunoglobulin E i en vesentlig mindre grad enn proteinallergenene som områdene er avledet fra binder nevnte immunoglobulin E, og hvor det rekombinante peptidet omfatter minst 15% av T-celleepitopene til et proteinallergen

2 Isolert peptid ifølge krav 1,karakterisert vedat minst to av regionene er avledet fra forskjellige proteinallergener fra samme slekt, hvori slekten er valgt fra gruppen bestående av slekten Dermatophagoides, slekten Fehs, slekten Ambrosia, slekten Lohum, slekten Cryptomeria, slekten Alternaria, slekten Alder, slekten Betula, slekten Quercus, slekten Olea, slekten Artemisia, slekten Plantago, slekten Panetaria, slekten Canine, slekten Blattella, slekten Apis, og slekten Penplaneta

3 Peptid ifølge krav 1,karakterisert vedat regionene er avledet fra samme proteinallergen, og hvori regionene er arrangert i en ikke-sammenhengende konfigurasjon, og for eksempel de ikke-sammenhengende områdene er definert ved aminosyrer og at protein-allergenet som områdene stammer fra omfatter aminosyrer anordnet i en sekvensiell rekke-følge fra en aminoterminal til en karboksyterminal ende, og hvon nevnte ikke-sammenhengende områder i peptidet er anordnet i ikke-sekvensiell rekkefølge

4 Peptid ifølge krav 1,karakterisert vedat minst to regioner er avledet fra kryssreaktive arter, peptidet omfatter for eksempel minst én region avledet fra Dermatophagoides pteronyssinus og minst én region avledet fra Dermatophagoides fannae

5 Peptid ifølge krav 1,karakterisert vedat minst to av regionene er avledet fra forksjellige proteinallergener fra samme art, inkludert et peptid valgt fra gruppen bestående av et peptid omfattende a) ett område som stammer fra Der p I og ett område som stammer fra Der p II, b) ett område som stammer fra Der fl og ett område som stammer fra Der fU, c) ett område som stammer fra Amb a I og ett område som stammer fra Amb a II, d) ett område som stammer fra Loip I og ett område som stammer fra Loi p IX, og e) ett område som stammer fra Cryj I og ett område som stammer fra Cryj U

6 Peptid ifølge krav 1,karakterisert vedat minst to av regionene er avledet fra forskjellige proteinallergener av den samme gruppen, peptidet omfatter for eksempel mmst én region avledet fra Der p log én region avledet fra Der fl

7 Peptid ifølge krav 1,karakterisert vedat minst to av regionene er avledet fra forskjellige proteinallergener av samme familie, for eksempel minst to av regionene er hver avledet fra gruppen bestående av Amb a 1 1, Amb al 2, Amb a 13 og Amb al A

8 Peptid ifølge et hvilket som helst foregående krav,karakterisert vedat det har minimal immunoglobulin E-aktivitet

9 Peptid ifølge et hvilket som helst foregående krav,karakterisert vedat det ikke binder immunoglobulin E spesifikt for et proteinallergen, eller dersom binding av peptidet til nevnte immunoglobulin E forekommer, resulterer en slik binding ikke i fngjønng av mediatorer fra mastceller eller basofiler i en vesentlig prosentandel av individer sensitive for nevnte proteinallergen

10 Peptid ifølge et hvilket som helst foregående krav,karakterisert vedat ved administrenng til et individ som er allergisk overfor nevnte proteinallergen eller allergener som peptidet er avledet fra, modifiserer den allergiske responsen hos individet overfor nevnte proteinallergen eller allergener

11 Peptid ifølge et hvilket som helst foregående krav,karakterisert vedat det omfatter et proteolytisk sete skutt mn mellom mmst to av nevnte regioner

12 Peptid,karakterisert vedat det omfatter minst to regioner som hver har human T-cellestimulerende aktivitet, idet nevnte regioner hver består vesentlig av minst én T-celleepitop av et proteinallergen, idet nevnte regioner er valgt fra gruppen bestående av peptid X, peptid Y, peptid Z, peptid A, peptid B og peptid C, hver som vist i fig 1 og for eksempel regioner omfattende peptid X, peptid Y og peptid Z, hver som vist i fig 4

13 Peptid ifølge krav 12,karakterisert vedat det består vesentlig av peptid Y, peptid Z og peptid X, i sekvensiell rekkefølge, idet hvert peptid er som vist i fig 4, eller et isolert peptid bestående vesentlig av peptid A, peptid Y, peptid Z, peptid X og peptid B i sekvensiell rekkefølge, idet hvert peptid er som vist i fig 4

14 Peptid ifølge krav 12,karakterisert vedat det omfatter et proteinallergen fra slekten Felis, idet nevnte peptid omfatter minst én T-celleepitop av nevnte proteinallergen, idet nevnte peptid omfatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av aminosyre-sekvensen som vist i fig 4 til peptid A og peptid B

15 Nukleinsyresekvens,karakterisert vedat den koder for et peptid ifølge et hvilket som helst foregående krav eller funksjonell ekvivalent av nevnte nukleinsyresekvens

16 Terapeutisk sammensetning,karakterisert vedat den omfatter et peptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 14 og en farmasøytisk akseptabel bærer eller et fortynmngsmiddel

17 Sammensetning,karakterisert vedat den omfatter minst to peptider ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 13

18 Sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 16 eller 17,karakterisert vedat sammensetningen anvendes i medisin

19 Anvendelse av et peptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 14 eller en sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 16 eller 17, for fremstilling av et medikament for behandling av sensitivitet overfor et proteinallergen i et individ

20 Anvendelse av to peptider ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 14 eller forskjellige sammensetninger ifølge et hvilket som helst av kravene 16 eller 17, for fremstilling av to komplementære medikamenter for behandling av sensitivitet overfor et proteinallergen i et individ ved sekvensiell administrering av nevnte medikamenter

21 Anvendelse ifølge krav 20, hvon peptidene eller sammensetningene omfatter minst to forskjellige rekombinante peptider valgt fra gruppen bestående av peptid X, peptid Y, peptid Z, peptid A, peptid B og peptid C, idet hver er som vist i fig 4 for fremstilling av sekvensielle administrerbare medikamenter for behandling av sensitivitet overfor Fehs domesticus i et individ

22 Anvendelse ifølge krav 19, omfattende anvendelse av minst to forskjellige rekombinante peptider valgt fra gruppen bestående av peptid X, peptid Y, peptid Z, peptid A, peptid B og peptid C, hver som vist i fig 4 for fremstilling av et medikament for behandling av sensitivitet overfor Fehs domesticus i et individ

23 Fremgangsmåte for utforming av peptid ifølge krav 3,karakterisert vedat den omfatter følgende trinn a) den kjente proteinstruktur av et antigen gjennomgås, b) antigenet deles teoretisk i minst to peptidområder med ønskede lengder, c) de minst to peptidområder anordnes teoretisk under dannelse av minst ett peptid hvor peptidområdene omordnes i en ikke-sammenhengende rekkefølge, d) det fremstilles minst ett peptid med konfigurasjon som det minst ene peptid fra trinn c), og e) det bestemmes hvorvidt det minst ene peptidet fra trinn (d) har stimulerende virkning på humane T-celler

24 Fremgangsmåte ifølge krav 23,karakterisert vedat den videre omfatter følgende trinn f) det bestemmes om peptidet som er funnet å ha humane T-cellestimulerende aktivitet i tnnn (e), binder immunglobulin E som er spesifikt for antigenet fra trinn (a) I

25 Fremgangsmåte ifølge krav 23 eller 24,karakterisert vedati trinn (b) blir antigenet delt inn i overlappende regioner med ønskede lengder

26 Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst kravene 23 eller 25, karakterisert vedat det er kjent minst én T-celleepitop av antigenene eller mmst én region av antigenene som har human T-cellestimulerende aktivitet, og hvon i tnnn (b), nevnte region med human T-cellestimulerende aktivitet eller nevnte T-celleepitop blir anvendt som minst én av nevnte peptidregioner

27 Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 23 til 26,karakterisert vedat i tnnn (b) blir antigenene delt inn i regioner ifølge en algontme

28 Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 23 til 27,karakterisert vedat proteinantigenet omfatter et proteinallergen og hvon tnnn (b) videre omfatter produsering av nevnte peptidregioner og bestemmer om peptidregioner binder immunglobulin E spesifikt for allergenene ifølge tnnn (a), og om slike peptid-regioner binder IgE, om slik binding forårsaker fngjønng av mediatorer fra mastceller eller basofiler, og hvon i tnnn (c) peptidregioner som binder immunglobulin E spesifikt for allergenet i tnnn (a) og forårsaker fngjønng av mediatorer fra mastceller eller basofiler, ikke er inkludert i peptid-regionene arrangert for å danne det minst ene peptidet

29 Fremgangsmåte for å bestemme i individer tilstedeværelse av immunoglobulin spesifikt for et proteinantigen og evnen som T-cellene til individene har til å reagere overfor T-celleepitop(er) til nevnte proteinantigen,karakterisert vedat den omfatter hinnene a) kombinenng av en første blodprøve eller minst én del av en første blodprøve oppnådd fra et individ med nevnte proteinantigen, eller en del derav, eller en modifisert form av nevnte proteinantigen eller en del derav, idet hver binder immunoglobulin spesifikt for nevnte proteinantigen, under betingelser hensiktsmessig for binding av blodkomponenter med nevnte proteinantigen, modifiserte proteinantigen eller en del av hvilke som helst av nevnte antigener, b) bestemme om binding oppstår, c) kombinenng av en andre blodprøve eller en andre del av nevnte første blodprøve oppnådd fra et individ funnet å ha binding av blodkomponenter i tnnn (b), med et rekombinant peptid omfattende minst to regioner avledet fra nevnte proteinantigen, idet nevnte peptid har humant T-cellestimulerende aktivitet til nevnte proteinantigen og som ikke binder immunoglobulin spesifikt for nevnte proteinantigen i en vesentlig prosentandel av en populasjon av individer sensitive overfor antigenet, og d) bestemme om T-cellestimulenng oppstår