PT100978B

PT100978B - Peptidos recombitope, sequencias de acidos nucleicos que os codificam, composicoes terapeuticas que os contem, processo para a sua concepcao e sue uso.

Info

Publication number: PT100978B
Application number: PT100978A
Authority: PT
Inventors: Bruce L Rogers; Jay P Morgenstern; Julian F Bond; Richard D Garman; Julia L Greenstein; Mei-Chang Kuo; Malcom Morville
Original assignee: Immulogic Pharma Corp
Priority date: 1991-10-16
Filing date: 1992-10-16
Publication date: 1999-10-29
Also published as: AU2794092A; EP0610335B1; HUT70263A; FI941758A; NO941370D0; HU227959B1; NO941370L; PT100978A; ES2300100T3; KR100271417B1; CA2121498C; HU9401109D0; ATE382699T1; WO1993008280A1; FI109809B; JPH07503362A; IL103456A0; FI941758A0; AU682658B2; NZ244782A

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

Pedidos Relacionados

Este pedido é uma continuação em parte da U.S.S.N. 662 276 intitulada ”A Human T Cell Reactive Cat Protein isolated from House Dust and Uses Therefor, apresentado em 28 de Fevereiro de 1991, que é uma continuação em parte de U.S.S.N. 431 565 intitulada A Human T Cell Reactive Cat Protein Isolated from House Dust and Uses Therefor¹, apresentado em 3 de Novembro, 1989, cujos ensinamentos são aqui incorporados para referência.

Antecedentes do Invento

Os linfócitos T podem mediar e regular tanto os mecanismos efectores específicos da resposta imune como os não específicos. Os linfócitos T CD4+ proporcionam ajuda para a produção de anticorpos e secreção de citoquinas que modulam o crescimento de outras células T e o crescimento e diferenciação de outras células imunitárias como os monócitos e granulócitos. Estudos funcionais e bioquímicos demonstraram que a geração de respostas imunitárias celulares depende dos receptores de antigénio nas células T que reconhecem fragmentos peptídicos de proteínas estranhas associadas com produtos do complexo de histocompatibilidade principal (MHC), que são expressos em células acessórias apresentadoras de antigénio. Recentes avanços na tecnologia possibilitaram cultivar eficientemente linhas de células T humanas e de ratinho e clones in vitro, específicos para antigénio. Adicionalmente, é agora possível produzir grandes quantidades de antigénios proteicos ou seus fragmentos, utilizando a tecnologia do ADN recombinante ou síntese peptídica em fase sólida. Assim, nos últimos anos, vários grupos de pesquisa começaram a determinar as sequências de aminoácidos lineares de antigénios proteicos que são reconhecidas por células T em associação com MHC (epitopos de células T).

Pêptidos derivados de uma variedade de antigénios proteicos, incluindo patogénios bacterianos e virais, autoantigénios, alergenos e outros antigénios experimentais como a lizozima do ovo de galinha (HEL), ovalbumina (OVA) e o

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J / _a*..w^r ’ -x⁴'*' jL, Li repressor de lambda cl), foram examinados quanto à capacidade de estimularem células T específicas para antigênio. Um vasto espectro de péptidos foi relatado como servindo como epitopos de células T. Por exemplo, demonstrou-se que os resíduos de aminoácido 324-339 de OVA (Shimonkevitz, R. et al. J. Immunol

133:2167 (1984)), resíduos de aminoácido 74-96 de HEL (Shastri, N. et al. J. Exp. Med. 164:882-896 (1986); e os resíduos de aminoácido 12-26 de repressor de lambda (cl) (Lai, M-Z et al. J.

Immunol 139:3973-3980 (1987), desencadeiam eficientemente células T iniciadas com proteína completa. Foi recentemente apresentado um péptido derivado do antigênio de superfície da Hepatite B (resíduos de aminoácido 19-33 de HBsAg), que estimula as respostas das células T numa maioria de sujeitos humanos que foram imunizados com uma vacina recombinante da hepatite B (Schad, V.C. et al. Seminars in Immunol. 3:217-224 (1991). Um antigênio principal proteico de 65 kD de micobactéria foi também mapeado com epitopos (Lamb, J.R. et al. EMBO 6(5):1245-1249 (1987)). Os epitopos de células T foram identificados nos péptidos compreendidos entre os resíduos de aminoácido 112-132 e 437-459 da proteína de 65 kD. A proteínas mielina básica (MBP), um autoantigénio que induz experimentalmente encefalomielite auto-imune (EAE) e o presumido autoantigénio na esclerose múltipla (MS) foi também mapeado por epitopo tanto no sistema humano (Ota, K. et al. Nature 346:183-187 (1990)) como no dos roedores (Zamvil et al Nature 324:258-260 (1986)). Ota et al identificaram um epitopo principal de célula T reconhecido pelos pacientes MS, os resíduos de aminoácido 84-102 de MBP. Foram também descritos os epitopos menores (resíduos de aminoácido MBP 143-168, 61-82, 124-42 e 31-50) reconhecidos por células T de pacientes MS. Zamvil et al. mostraram que os resíduos de aminoácido 1-11 de MBP contêm o(s) epitopo(s) de célula T principais que causam EAE em estirpes de roedores susceptíveis.

Os epitopos de células T presentes em proteínas alergénicas foram descritos muito recentemente (0'Hehir, R. et al. Ann. Rev. Immunol. 9:67-95 (1991)). Verificou-se que vários péptidos derivados do alergeno Der ρ I de ácaros de pó doméstico eram

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IPC-027 reactivos com as células T (Thomas, W.R. et al. In Epitopes of Atopic Allergens Proceedings of Workshop from XIV Conqress of the European Academy of Allerqy and Clinicai Immunology, Ber 1 in (Set. 1989) pp. 77-82; 0'Hehir, R.E. Annual Review Immunoloqy 9:67-95(1991); Stewart, G.A. et al. In Epitopes of atopic Allergens Proceedings of Workshop from XIV Conqress of the European Academy of Allerqy and Clinicai Immunoloqy, Ber1in (Set. 1989) pp. 41-47; e Yessel, H. et al. In T Cell activation in Health and Didease: Discrimination Between Immunity and Tolerance, Conference 22-26 (Set. 1990) Trinity College, Oxford U.K.). Foi também relatado um péptido estimulador de célula T dos resíduos de aminoácido 54-65, derivado do alergeno curto de erva de Santiago Amb a I (Rothbard, J.B. et al. , Cell, 52:515-523 (1988). Perez et al. demonstraram que epitopos de célula T estavam contidos nos resíduos de aminoácido 191-210 do alergeno proteico Lol pl utilizando um painel de clones de células T derivados de um indivíduo alérgico a azevém (Perez et al. J.Biol.Chem.265(271:16210-16215 (1990)).

Sumário do Invento

O presente invento proporciona péptidos isolados possuindo actividade estimuladora de célula T, denominados péptidos recombitope^MR. Os péptidos recombitope do invento possuem preferivelmente actividade estimuladora de célula T humana. Adicionalmente, péptidos recombitope do invento compreendem preferivelmente pelo menos dois epitopos de células T derivados do mesmo ou de diferentes antigénios proteicos, e mais preferivelmente compreendem pelo menos duas regiões, compreendendo cada região pelo menos um epitopo de célula T derivado de um antigénio proteico, e cada região possuindo preferivelmente actividade estimuladora de célula T humana. Em alguns casos, péptidos recombitope compreendem três destas regiões derivadas do mesmo ou de diferentes antigénios proteicos. Como aqui utilizado, uma região de um péptido recombitope compreende pelo menos 5 e preferivelmente pelo menos 7 resíduos de aminoácido. Tipicamente, péptidos recombitope compreendem regiões que estão arranjadas numa configuração diferente de uma configuração, das regiões de um antigénio

-5proteico, que ocorre naturalmente, de modo a

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------..ts eliminar propriedades indesejáveis associadas à estrutura secundária ou terciária do antigénio proteico, enquanto mantém actividade estimuladora de célula T humana dependente da estrutura primária. Por exemplo, as regiões podem ser derivadas do mesmo antigénio proteico e arranjadas numa configuração não contígua ou numa configuração não contígua e uma ordem não sequencial.

Os péptidos recombitope do invento podem ser derivados de alergenos proteicos. Estes péptidos recombitope possuem preferivelmente uma actividade estimuladora mínima de imunoglobulina E e ligam imunoglobulina E numa extensão substancialmente menor do que os alergenos proteicos a partir dos quais os péptidos recombitope foram derivados. Mais preferivelmente, os péptidos recombitope derivados de alergenos proteicos não ligam imunoglobulina E específica para os alergenos proteicos numa percentagem substancial (pelo menos cerca de 75%) dos indivíduos sensíveis aos alergenos proteicos, ou se tal ligação ocorre, esta ligação não resulta na libertação de mediadores, por exemplo, histamina, de mastócitos ou basófilos. Adicionalmente, péptidos recombitope podem ser derivados de autoantigénios, como a insulina, proteína mielina básica e receptores de acetilcolina. Estes péptidos recombitope preferivelmente não ligam imunoglobulina específica para o autoantigénio numa percentagem substancial (pelo menos cerca de 75%) de uma população de indivíduos sensíveis ao autoantigénio. Além disso, péptidos recombitope derivados de alergenos proteicos ou outros antigénios proteicos, podem ser concebidos de tal forma que uma propriedade indesejável da proteína nativa (por exemplo, actividade enzimática) possa ser eliminada para propósitos terapêuticos.

invento proporciona também processos de diagnóstico da sensibilidade a um alergeno proteico num indivíduo, processos de tratamento desta sensibilidade e composições terapêuticas compreendendo um ou mais péptidos recombitope. Por exemplo, são revelados processos de detecção de Hipersensibilidade Tipo Retardada específica e/ou Hipersensibilidade Tipo Imediata

-6específica num indivíduo,

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IPC-027 ou outro antigénio proteico. De acordo com um processo, pode ser administrado a um indivíduo, um teste específico de

Hipersensibilidade Tipo Retardada utilizando um péptido recombitope do invento, e a extensão com que a reacção específica de Hipersensibilidade Tipo Retardada ocorre no indivíduo pode ser determinada. Num outro processo, pode ser determinada num indivíduo a presença de imunoglobulina E específica para pelo menos um alergeno proteico, e determinada a capacidade das células T do indivíduo para responder ao(s) epitopo(s) de células T do alergeno proteico. Nesta concretização, é administrado a indivíduos, um teste de Hipersensibilidade Tipo Imediata específico, utilizando um alergeno proteico ou uma sua porção, ou uma forma modificada de um alergeno proteico ou uma sua porção, ligando cada um deles imunoglobulina E específica para o alergeno proteico. Adicionalmente, é administrado aos mesmos indivíduos, previamente, simultaneamente com ou subsequente à administração do teste de Hipersensibilidade Tipo Imediata, um teste específico para Hipersensibilidade Tipo Retardada, utilizando uma forma modificada de um alergeno proteico ou uma sua porção, ou um alergeno proteico produzido recombinantemente, ou um péptido recombitope derivado de um alergeno proteico, possuindo cada um deles actividade estimuladora de célula T humana e cada um dos quais não liga imunoglobulina E (IgE) específica para o alergeno proteico, ou se tal ligação ocorrer, esta ligação não resulta na libertação de mediadores por mastócitos ou basófilos, numa percentagem substancial da população de indivíduos sensíveis ao alergeno (por exemplo, pelo menos cerca de 75%). É administrada a estes indivíduos que exibem tanto uma reacção específica de Hipersensibilidade Tipo Imediata como uma reacção específica de Hipersensibilidade Tipo Retardada, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição terapêutica compreendendo a forma modificada de um alergeno proteico ou uma sua porção, o alergeno proteico produzido recombinantemente, ou o péptido recombitope derivado de um alergeno proteico, e um portador ou diluente farmaceuticamente aceitavel, uma vez que se acredita que a administração a um indivíduo de tal composição

terapêutica servirá para dessensibilizar o indivíduo

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IPC-027 proteico.

Os péptidos recombitope derivados de antigénios proteicos e possuindo actividade estimuladora de célula T humana pode também ser utilizada em outros processos de determinação nos indivíduos, da presença de imunoglobulina específica para um antigénio proteico e a capacidade das células T de um indivíduo serem estimuladas pelo(s) epitopo(s) de célula T do antigénio proteico. Um destes processos compreende a combinação de uma primeira amostra de sangue ou pelo menos uma porção da amostra obtida de um indivíduo, com o antigénio proteico, uma forma modificada do antigénio proteico, ou uma porção de qualquer um deles, ligando cada um deles imunoglobulina específica para o antigénio proteico. A amostra e o antigénio são combinados em condições apropriadas para a ligação de componentes do sangue, por exemplo, imunoglobulina, na amostra ou numa sua porção, com o antigénio proteico, antigénio proteico modificado ou porção de qualquer dos antigénios. Se a ligação ocorrer, uma segunda amostra de sangue ou uma segunda porção da amostra original obtida do indivíduo , é combinada com um péptido recombitope compreendendo pelo menos duas regiões derivadas do antigénio proteico, uma forma modificada do antigénio proteico ou uma sua porção, ou o antigénio proteico produzido recombinantemente, possuindo cada um deles actividade estimuladora de célula T humana e preferivelmente cada um deles não ligando imunoglobulina específica para o antigénio proteico numa percentagem substancial da população de indivíduos sensíveis ao antigénio (por exemplo, pelo menos cerca de 75%), de modo a determinar se ocorre estimulação de célula T. Se ocorrer estimulação de célula T, é preferivelmente administrada ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição terapêutica compreendendo a forma modificada do antigénio proteico ou uma sua porção, o antigénio proteico produzido recombinantemente, ou o péptido recombitope, e um portador ou diluente farmaceuticamente aceitável, uma vez que se crê que a administração a um indivíduo de tal composição terapêutica dessensibilizará o indivíduo ao antigénio proteico.

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Processos para conceber péptidos recombitope do invento são também proporcionados, quando o antigénio proteico ao qual o indivíduo é sensível possui epitopos de célula T desconhecidos ou mal definidos (por exemplo, algumas ou todas as regiões peptídicas do antigénio proteico que possui actividade estimuladora de célula T para o antigénio proteico, não foram definidas por técnicas padrão de biologia de célula T, por exemplo, Currents Protocols in Immunology, editado por Coligan, J.E. et al., volume 1 (1991), ou os epitopos exactos de célula T humana do antigénio proteico não foram ainda definidos por técnicas de mapeamento fino). De acordo com um processo, a estrutura proteica conhecida de um alergeno ou outro antigénio proteico é revista, e o alergeno ou outro antigénio proteico é dividido teoricamente em pelo menos duas regiões peptídicas com o comprimento desejado. Teoricamente significa qualquer coisa que não acontece realmente, mas é antes um processo pensado, por exemplo, ocorre no papel ou na cabeça de cada um. Esta divisão pode ser arbitrária, pode ser feita de acordo com um algoritmo, ou pode ser totalmente ou ou parcialmente baseada em regiões do antigénio proteico conhecidas por possuírem actividade estimuladora de célula T, preferivelmente actividade estimuladora de célula T humana. Quando apenas algumas regiões de um antigénio proteico que possui actividade estimuladora de célula T são conhecidas, ou quando todas as regiões do antigénio proteico que possui actividade estimuladora de célula T humana são desconhecidas, preferivelmente, pelo menos 50%, e mais preferivelmente a proteína completa é dividida em regiões peptídicas com o comprimento desejado. As regiões peptídicas são então teoricamente arranjadas para formar pelo menos um péptido recombitope no qual as regiões estão rearranjadas numa ordem não contígua. Subsequentemente, pelo menos um péptido recombitope possuindo uma configuração rearranjada é produzido e a capacidade do péptido recombitope estimular células T humanas é determinada. Numa concretização adicional, é testada a capacidade de um péptido recombitope que se verifica possuir actividade estimuladora de célula T humana, para determinar a sua capacidade para ligar imunoglobulina específica para o alergeno ou outro antigénio, ou é testada quanto à ausência de

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outra propriedade indesejada (por exemplo, actividade de protease).

Breve Descrição dos desenhos

Fig.l é a sequência de ácido nucleico e a sequência de aminoácidos da cadeia 1 deduzida da Proteína Felina Reactiva com Células T (TRFP), incluindo as sequências de comando A e B.

Fig.2 é a sequência de ácido nucleico e a sequência de aminoácidos deduzida da cadeia 2 de TRFP, incluindo a sequência de comando.

Fig.3 é uma representação gráfica apresentando a resposta de células T isoladas dos pacientes alérgicos a gatos, e iniciadas com TRFP purificada por afinidade para sobrepor os péptidos analisados pelo somatório ordenado das respostas ao péptido.

Fig.4 é as sequências de aminoácidos do péptido X, péptido Y, péptido Z, péptido A e péptido B de TRFP, cada um dos quais contendo pelo menos um epitopo de célula T de TRFP.

Fig. 5 é uma representação esquemática da construção de um péptido recombitope YZX utilizando as técnicas de reacção em cadeia de polimerase (PCR).

Fig.6 é uma representação esquemática da construção de vum péptido recombitope AYZXB utilizando técnicas de PCR.

Fig. 7 é as sequência de ácido nucleico dos ooligonucleótidos C,D,E,F,G,H, e I utilizadas na construção do péptido recombitope YZX e oligonucleótidos J,K L,M,N e 0 utilizadas na construção de um péptido recombitope AYZXB.

Fig.8 é a sequência de ácido nucleico (utilizando codões de expressão de E. coli) e a sequência de aminoácidos deduzida compreendendo o péptido recombitope YZX. É apresentado um sítio

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IPC-027 de clivagem da trombina.

Fig.9 é a representação esquemática da construção do péptido recombitope YZX utilizando técnicas de PCR com ADNc isolado de TRFP como um molde.

Fig. 10 é as sequências de ácido nucleico dos iniciadores utilizados na construção dos péptidos recombitope ΧΖΥ,ΥΧΖ, e ZXY.

Fig. 11 é uma representação gráfica da sequência de aminoácidos dos iniciadores individuais utilizados para construir os péptidos recombitope XZY, YZX e ZXY.

Fig. 12 é uma representação esquemática da construção de um péptido recombitope derivado da fosfolipase A₂, que possui epitopos de célula mal definidos.

Fig. 13 é uma representação dos resultados da SDS/PAGE da análise por imunotransferência de Western, detectando a ligação de IgE humana obtida de um indivíduo alérgico a gatos para várias amostras proteicas, incluindo os péptidos recombitope XYZ, XZY, YXZ, YZX, ZXY e ZYX.

Fig.14 é uma representação gráfica dos resultados da análise de ELISA, ilustrando a ligação de IgE humana obtida de um indivíduo alérgico a gatos para várias amostras proteicas, incluindo os péptidos recombitope XYZ, XZY, YXZ, YZX, ZXY, e ZYX.

Fig 15a, 15b e 15c, são representações gráficas apresentando as respostas de linhas de células T de três pacientes, sensibilizados in vitro a TRFP, péptido recombitope YXZ ou péptido recombitope YZX, e analisadas quanto à resposta a vários péptidos.

Fig.16 é uma representação gráfica apresentando as respostas de células T de murino imunizadas com o péptido recombitope YZX e analisadas para a resposta in vitro à cultura

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IPC-027 com o péptido recombitope YZX como medido pela produção de IL-2.

Descrição detalhada do Invento presente invento refere-se a péptidos isolados, denominados péptidos recombitope, possuindo actividade estimuladora de célula T, como a indução da proliferação da célula T, secreção de linfoquina e/ou anergia/tolerância da célula T. Os péptidos recombitope do invento possuem preferivelmente actividade estimuladora de célula T humana e são úteis no diagnóstico e tratamento da sensibilidade num indivíduo a um alergeno proteico, autoantigénio ou outro antigênio proteico. Geralmente, os péptidos recombitope preferidos no âmbito do invento compreendem pelo menos duas regiões derivadas do mesmo ou de diferentes alergenos proteicos ou de outros antigénios proteicos, possuindo preferivelmente cada região actividade estimuladora de célula T, como determinado pelas técnicas comuns da biologia das células T, e compreendendo assim pelo menos um epitopo de célula T. De modo a determinar os epitopos exactos de célula T por, por exemplo, técnicas de mapeamento fino, as regiões peptídicas compreendendo pelo menos um epitopo de célula T, que foi definido por técnicas padrão da biologia das células T, podem ser modificadas pela adição ou delecção de resíduos de aminoácido, na extremidade amino ou carboxílica das regiões peptídicas, e testadas para determinar a alteração na reactividade da célula T para o péptido modificado. Além disso, se se verificar que duas ou mais regiões peptídicas que partilham uma área de sobreposição, possuem actividade estimuladora de célula T humana, como determinado pelas técnicas comuns de biologia das células T, podem ser produzidos péptidos adicionais compreendendo todas as regiões peptídicas ou uma porção das regiões peptídicas, e estes péptidos adicionais podem ser testados pelos procedimentos de mapeamento fino acima mencionados. Como resultado de um bom mapeamento, pode ser produzido um conjunto de epitopos de célula T humana compreendendo resíduos de aminoácido essenciais ao reconhecimento pela célula T.

Os péptidos recombitope do invento podem ser produzidos por

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IPC-027 técnicas de ADN recombinante numa célula hospedeira transformada com uma sequência de ácido nucleico que codifica este péptido recombitope, ou por síntese química, ou em certas situações limitadas por clivagem química de um alergeno proteico ou outro antigénio proteico. Quando produzido por técnicas recombinantes, as células hospedeiras transformadas com ácido nucleico que codifica um péptido recombitope, são cultivadas num meio adequado para as células e os péptidos recombitope podem ser purificados do meio de cultura da célula, de células hospedeiras, ou de ambos, utilizando técnicas conhecidas na arte para purificar péptidos ou proteínas, incluindo a cromatografia de permuta iónica, focagem isoeléctrica, cromatografia de filtração em gel, ultrafiltração, electroforese ou imunopurificação com anticorpos específicos para o péptido recombitope, o alergeno proteico ou outro antigénio ou uma sua porção, de que o péptido recombitope foi derivado. Assim, um aspecto deste invento proporciona um péptido recombitope produzido numa célula hospedeira transformada com uma sequência de ácido nucleico que codifica um péptido recombitope, ou o equivalente funcional da sequência de ácido nucleico. Os péptidos recombitope do invento são isolados de tal forma que o péptido recombitope está substancialmente isento de material celular ou de meio de cultura, quando produzido por técnicas de ADN recombinante, ou substancialmente isento de precursores químicos ou de outros compostos químicos, quando sintetizados quimicamente, ou obtidos por clivagem química de um alergeno proteico ou de outro antigénio proteico.

Para obter os péptidos recombitope preferidos do presente invento compreendendo pelo menos dois epitopos de célula T de um alergeno proteico ou outro antigénio proteico ou pelo menos duas regiões, cada uma das regiões, compreendendo pelo menos um epitopo de célula T de um alergeno proteico ou outro antigénio, os epitopos de célula T ou regiões contendo epitopo(s) de célula T, estão arranjadas numa configuração diferente de uma configuração dos epitopos ou regiões de célula T do alergeno ou antigénio que ocorre normalmente. Por exemplo, os epitopos de célula T ou regiões de célula T contendo epitopo(s) de célula T

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IPC-027 podem estar arranjados numa configuração não contígua e podem derivar preferivelmente do mesmo alergeno proteico ou de outro antigénio. Não contíguo é definido como um arranjo de aminoácidos compreendendo epítopos de células T ou regiões contendo epitopo(s) de célula T, que é diferente da sequência de aminoácidos presente no alergeno proteico ou outro antigénio proteico do qual derivaram os epítopos ou regiões. Além disso, os epítopos de célula T ou regiões contendo epítopos de célula T não contíguos, podem ser arranjados numa ordem não sequencial (por exemplo, numa ordem diferente da ordem dos aminoácidos do alergeno proteico nativo ou outro antigénio proteico do qual os epítopos de célula T ou regiões contendo epítopos de célula T derivaram, na qual os aminoácidos estão arranjados de uma extremidade amino até uma extremidade carboxílica). Um péptido recombitope preferido compreende pelo menos 15%, mais preferivelmente pelo menos 30%, ainda mais preferivelmente 50% e mais preferivelmente até 100% dos epítopos de célula T de um alergeno proteico ou de outro antigénio proteico.

Na situação na qual os epítopos de célula T de um alergeno proteico ou de outro antigénio proteico são desconhecidos ou mal definidos (por exemplo, todas ou algumas regiões peptídicas do antigénio proteico que possuem actividade estimuladora de célula T humana, não foram definidas por técnicas comuns de biologia de células T, ou os epítopos exactos de célula T humana do antigénio proteico não foram definidas por técnicas de mapeamento fino), pode ser obtido um péptido recombitope por revisão da estrutura proteica conhecida de um alergeno ou de outro antigénio e dividindo teoricamente o alergeno ou antigénio em pelo menos duas regiões peptídicas com os comprimentos desejados. Por exemplo, a sequência da proteína do alergeno ou de outro antigénio pode ser sistematicamente dividida em pelo menos duas regiões peptídicas não sobreponíveis com os comprimentos desejados, ou pelo menos duas regiões peptídicas sobreponíveis com os comprimentos desejados e teoricamente arranjados para formar pelo menos um péptido recombitope, no qual pelo menos duas regiões estão rearranjadas numa ordem não contígua e preferivelmente não sequencial. Esta divisão em

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TPC-027 regiões peptídicas pode ser arbitrária, pode ser feita de acordo com um algoritmo, ou pode ser baseada inteiramente ou em parte, em regiões do alergeno proteico que se sabe compreenderem pelo menos um epitopo de célula T.

Quando apenas são conhecidas algumas regiões peptídicas do alergeno proteico ou de outro antigénio proteico compreendendo pelo menos um epitopo de célula T, ou quando são desconhecidas todas as regiões do alergeno proteico ou de outros antigénios proteicos que possuem actividade estimuladora de célula T humana, preferivelmente pelo menos 50% da sequência completa da proteína do alergeno proteico ou de outro antigénio proteico e mais preferivelmente, a sequência completa da proteína do alergeno proteico ou de outro antigénio proteico, é dividida e rearranjada em um ou mais péptidos recombitope. 0 propósito anterior, utilizando uma tão grande percentagem da sequência da proteína do antigénio proteico na formação do péptido recombitope é tal que o péptido recombitope resultante compreende pelo menos 15%, mais preferivelmente 30%, ainda mais preferivelmente 50%, e mais preferivelmente pelo menos 100% dos epitopos de célula T do antigénio proteico. Claro que, se as poucas regiões peptídicas do antigénio proteico, cada uma conhecida por compreender pelo menos um epitopo de célula T, constituem a percentagem acima declarada dos epitopos de célula T do antigénio proteico e estas regiões peptídicas não constituem pelo menos 50% sequência completa da proteína do antigénio proteico, não é necessário utilizar uma tão grande percentagem da sequência completa da proteína na formação do péptido recombitope. De acordo com este processo, os péptidos recombitope podem assim ser produzidos recombinantemente ou sinteticamente, e a capacidade do péptido recombitope para estimular célula T humana pode ser determinada. Quando o péptido recombitope compreende regiões derivadas de um alergeno proteico, as regiões peptídicas individuais podem ser produzidas e testadas para determinar quais as regiões que ligam a imunoglobulina E específica para o alergeno e quais destas regiões causarão a libertação de mediadores (por exemplo, histamina) por mastócitos e basófilos. As regiões peptídicas em

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IPC-027 que se verifica a ligação à imunoglobulina E, e causam a libertação de mediadores por mastócitos e basófilos em mais do que aproximadamente 10-15% dos soros alérgicos testados, não estão preferivelmente incluídas nas regiões peptídicas arranjadas para formar os péptidos recombitope.

Na construção de um péptido recombitope derivado da fosfolipase A₂, pode ser utilizado um alergeno principal do veneno das abelhas como exemplo ilustrativo da construção de um péptido recombitope, quando a estrutura proteica de um antigénio proteico é conhecida, mas os epitopos de célula T são desconhecidas ou são mal definidos. A fosfolipase A₂ é composta por 134 aminoácidos, como definido por clonagem de ADNc (Kuchler, K. et al. Eur. J. Biochem. 184: 249-254). Esta sequência de aminoácidos pode ser dividida em regiões, cada uma contendo preferivelmente 20 a 35 resíduos de aminoácido, cada região sobrepondo-se preferivelmente com outra região em cerca de 10 aminoácidos (ver Figura 12). Embora a Figura 12 apresente a sequência proteica completa, da proteína dividida em regiões, a sequência total utilizada para formar pelo menos um péptido recombitope, pode ser substancialmente menor do que a sequência proteica completa. Para maximizar o potencial de incluir epitopos de célula T no péptido recombitope construído, podem ser concebidas áreas de sobreposição e comprimento de cada região podem ser concebidas para manter a presença de epitopos de célula T previstos utilizando algoritmos (Rothbard, J. e Taylor, W.R. EMBO J. 7:93-100 (1988); Berzofsky, J.A. Philos Trans. R. Soc. Lond. 323:535-544 (1989)). Preferencialmente, podem ser previstos epitopos de célula T humana num alergeno proteico, utilizando resíduos de aminoácido específicos que ligam especificamente HLA conhecidas da classe II . Além disso, para minimizar a probabilidade do péptido recombitope construído ligar IgE humana alérgica, a sequência de aminoácidos do péptido recombitope resultante pode ser tornada diferente da da estrutura nativa da fosfolipase A₂ por mistura das regiões e ou por transposição das regiões do terminal amino ou das regiões de terminal carboxilo com a extremidade oposta da molécula (isto é, resíduos de aminoácido localizados no terminal amino da proteína

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IPC-027 nativa podem ser colocados no terminal carboxilo do pêptido recombitope). Um procedimento semelhante pode ser utilizado para construir um pêptido recombitope derivado de um auto-antigénio com uma estrutura proteica conhecida, mas com epitopos de células T não definidos, como a ácido glutâmico-descarboxilase (por exemplo, Samama, J.P. e Mallet, J. Journal of Neurochemistrv 54:703-705 (1990)), insulina (Joslin^zs Diabetes Mellitus 12^a Edição, Eds. A. Marble et al., Lea & Febiger, Philadelphia, p.67 (1985)), etc. Nesta situação, as regiões peptídicas estão arranjadas numa configuração diferente de uma configuração das regiões que ocorre naturalmente no auto-antigénio, para eliminar uma propriedade indesejada do auto-antigénio como a ligação à imunoglobulina ou actividade enzimática.

Péptidos recombitope compreendendo pelo menos duas regiões derivadas de um alergeno ou de outro antigénio, são testados para determinar quais os péptidos recombitope que possuem actividade estimuladora de célula T (isto é, proliferação, secreção de linfoquina e/ou indução de anergia/tolerância de célula T), e assim compreendem pelo menos um epitopo de célula T. Por exemplo, a actividade estimuladora de célula T pode ser testada por cultura de células T obtidas de um indivíduo sensível a um alergeno proteico ou antigénio proteico (isto é, um indivíduo que possui uma resposta imunitária ao alergeno proteico ou do antigénio proteico), com um pêptido recombitope derivado do alergeno proteico ou do antigénio e determinando a presença da proliferação das células T em resposta ao pêptido recombitope. Como descrito em detalhe nos Exemplos, os índices de estimulação para as respostas de células T aos péptidos recombitope podem ser calculados como o CPM máximo em resposta ao pêptido recombitope dividido pelo CPM de controlo do meio. Como utilizado ao longo deste pedido, a actividade estimuladora de célula T humana é definida como um índice de estimulação de pelo menos 2,0. Um índice de estimulação de pelo menos 2,0 é considerado positivo para propósitos de definição de péptidos recombitope úteis como agentes imunoterapêuticos. Péptidos recombitope preferidos possuem um índice de estimulação de pelo

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IPC-027 menos 2,5, mais preferivelmente de pelo menos 3,5, e muito preferivelmente de pelo menos 5,0.

Para além disso, péptidos recombitope preferidos do invento, derivados dos alergenos proteicos, não ligam imunoglobulina E (IgE) ou ligam IgE numa extensão substancialmente menor do que o(s) alergeno(s) proteico(s) dos quais os péptidos são derivados ligam a IgE. As principais complicações da imunoterapia comum são as respostas sistémicas como a anafilaxia. A imunoglobulina E é um mediador das reacções anafiláticas que resultam da ligação e ligação cruzada do antigénio à IgE em mastócitos ou basófilos e da libertação de mediadores (por exemplo, histamina, serotonina, factores quimiotáticos eosinófilos). Assim, a anafilaxia pode ser evitada pela utilização de um péptido recombitope que não liga IgE, ou se o péptido recombitope liga IgE, essa ligação não resulta na libertação de mediadores(por exemplo, histamina, etc.) por mastócitos ou basófilos. Para além disso, péptidos recombitope que possuem uma actividade estimuladora de IgE mínima, são particularmente desejáveis para eficácia terapêutica. Actividade estimuladora de IgE mínima refere-se à produção de IgE que é menor do que a quantidade de IgE produzida e/ou produção de IL-4, estimulada pelo alergeno proteico completo.

Um péptido recombitope do invento, derivado de um alergeno proteico, quando administrado a um indivíduo sensível ao alergeno proteico, é capaz de modificar a resposta alérgica do indivíduo ao alergeno. Particularmente, péptidos recombitope compreendendo pelo menos dois epitopos de célula T de um alergeno proteico, ou pelo menos duas regiões derivadas de um alergeno proteico, cada região compreendendo preferivelmente pelo menos um epitopo de célula T, quando administrados a um indivíduo sensível ao alergeno, são capazes de modificar a resposta das células T do indivíduo ao alergeno. Como utilizado aqui, a modificação da resposta alérgica de um indivíduo sensível a um alergeno proteico pode ser definida como a não responsividade ou diminuição nos simtomas ao alergeno, como determinado por procedimentos clínicos comuns (ver por exemplo,

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IPC-027

Como resultado do trabalho aqui descrito, foram produzidos péptidos recombitope derivados de alergenos proteicos ou de outros antigênios proteicos e possuindo actividade estimuladora de célula T, ou preferivelmente compreendendo duas regiões, cada uma possuindo pelo menos um epitopo de célula T. Crê-se que os epitopos de célula T estão envolvidos na iniciação e perpetuação da resposta imunitária a um alergeno proteico ou a outro antigênio proteico que é responsável respectivamente pelos sintomas clínicos da alergia ou de outras doenças. Pensa-se que estes epitopos de célula T desencadeiam acontecimentos precoces ao nível da célula T auxiliar, por ligação a uma molécula apropriada de HLA na superfície de uma célula apresentadora de antigênio e estimulação relevante da subpopulação de células T. Estes acontecimentos levam à proliferação das células T, secreção de linfoquina, reacções de inflamação local, recrutamento para o local de células imunitárias adicionais e activação da cascata das células B levando à produção de anticorpos. Um isotipo destes anticorpos, IgE, é fundamentalmente importante para o desenvolvimento dos sintomas alérgicos e a sua produção é influenciada precocemente na cascata dos acontecimentos, ao nível da célula T auxiliar, pela natureza das linfoquinas segregadas. Um epitopo de célula T é o elemento básico ou a unidade menor de reconhecimento por um receptor de célula T, em que o epitopo compreende aminoácidos essenciais ao reconhecimento pelo receptor e pode ser contíguo e/ou não contíguo na sequência de aminoácidos da proteína. Um epitopo de célula T, como aqui utilizado possui um índice de estimulação de pelo menos 2,0, mais preferivelmente 2,5, ainda mais preferivelmente de pelo menos 3,5 e muito preferivelmente de pelo menos 5,0. As sequências de aminoácidos que mimetizam as dos epitopos de célula T e que modificam a resposta alérgica aos alergenos proteicos estão dentro do âmbito deste invento.

A exposição de pacientes aos péptidos recombitope do presente invento, derivados de alergenos proteicos ou de outros antigênios proteicos, pode tornar tolerantes ou anergizar

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IPC-027 subpopulações de células T apropriadas, de tal modo que elas se tornem não responsivas ao alergeno proteico ou a outro antigénio, e não participem na estimulação de uma resposta imunitária após esta exposição. Para além disso, a administração de um pêptido recombitope do presente invento, derivado de um alergeno proteico, pode modificar o perfil de secreção de linfoquina, como comparado com a exposição ao alergeno proteico que ocorre naturalmente, ou a uma sua porção (por exemplo, resulta num decréscimo de IL-4 e/ou aumento de IL-2). Além disso, a exposição ao pêptido recombitope pode influenciar as subpopulações de células T, que normalmente participam na resposta ao alergeno, de tal modo que estas células T são atraídas para fora do sítio(s) de exposição normal ao alergeno (por exemplo, mucosa nasal, pele e pulmões), para os sítio(s)de administração terapêutica do pêptido recombitope. Esta redistribuição das subpopulações de células T pode melhorar ou reduzir a capacidade do sistema imunitário de um indivíduo estimular a resposta imunitária usual no sítio normal de exposição ao alergeno, resultando numa diminuição nos sintomas alérgicos.

Os péptidos recombitope do invento compreendem preferivelmente pelo menos dois epitopos de células T (por exemplo, o pêptido recombitope compreende pelo menos aproximadamente oito resíduos de aminoácido, e preferivelmente pelo menos quinze resíduos de aminoácido). Outros péptidos recombitope do invento compreendem pelo menos duas regiões derivadas do mesmo ou de diferentes alergenos proteicos, ou de outros antigénios proteicos, possuindo os referidos péptidos recombitope actividade estimuladora de célula T e cada região possuindo preferivelmente actividade estimuladora de célula T humana e, desta forma, compreendendo pelo menos um epitopo de célula T de um alergeno proteico ou de outro antigénio proteico. Geralmente, cada uma destas regiões de um pêptido recombitope compreende pelo menos sete resíduos de aminoácido de pelo menos um alergeno proteico. Cada uma destas regiões de um pêptido recombitope compreende preferivelmente pelo menos dois epitopos de célula T (por exemplo, o pêptido recombitope compreende pelo

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IPC-027 menos oito resíduos de aminoácido e preferivelmente pelo menos quinze resíduos de aminoácido). Os pêptidos recombitope do invento podem compreender tantos resíduos de aminoácido quanto os desejados e preferivelmente compreendem pelo menos cerca de Ί, mais preferivelmente pelo menos 15, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 30 e muito preferivelmente pelo menos cerca de 40 resíduos de aminoácido de um alergeno proteico ou de outro antigénio proteico. A região de um péptido recombitope compreende preferivelmente até 45 resíduos de aminoácido de comprimento, mais preferivelmente até 40 resíduos de aminoácido de comprimento, e muito preferivelmente até 30 resíduos de aminoácido de comprimento, uma vez que o aumento do comprimento de uma região de um péptido recombitope pode resultar em dificuldade na síntese de peptídica, assim como a retenção de uma propriedade indesejável (por exemplo, ligação a imunoglobulina ou actividade enzimática), devido à manutenção da semelhança conformacional entre a região e o alergeno proteico ou outro antigénio proteico do qual é derivado. Se desejado, as sequências de aminoácidos das regiões podem ser produzidas e ligadas por um ligador para aumentar a sensibilidade ao processamento pelas células apresentadoras de antigénio. Tal ligador pode ser qualquer sequência de aminoácidos que não seja de epitopo ou outro ligador ou agente de ligação apropriado.

Quando os pêptidos recombitope são derivados de alergenos proteicos, podem compreender pelo menos duas regiões derivadas de diferentes alergenos proteicos do mesmo género, tais como: o género Dermatophagoides; o género Felis; o género Ambrósia; o género Lolium; o género Crvptomeria; o género Alternaria; o género Alder; o género Bétula; o género Quercus; o género Olea; o género Artemísia; o género Plantaqo; o género Parietaria; o género Canine; o género Blatella; o género Apis; e o género Periplaneta. Adicionalmente, os pêptidos recombitope podem compreender pelo menos duas regiões derivadas de espécies com reacções cruzadas, por exemplo, uma região derivada de Dermatophagoides pteronyssinus e uma região derivada de Dermatophagoides farinae. Em outra concretização, as regiões podem ser derivadas da mesma espécie (por exemplo, uma região

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IPC-027 derivada de Der p I e uma região derivada de Der f II; uma região derivada de Der f I e uma região derivada de Der f II;

uma região derivada de Amb a I e uma região derivada de Amb a

II; uma região derivada de Lol p I e uma região derivada de Lol p IX; e uma região derivada de Crv j I e uma região derivada de

Crv i II). Além disso, os péptidos recombitope podem compreender pelo menos duas regiões derivadas de diferentes alergenos proteicos do mesmo grupo, tais como uma região derivada de um alergeno proteico do grupo I de Dermatophagoides pteronvssinus (isto é. Der ρ I) e uma região derivada de um alergeno proteico do grupo I de Dermatophagoides farinae (isto é, Der f I). Alternativamente, as regiões podem ser derivadas de diferentes alergenos proteicos da mesma família (por exemplo, Amb a 1.1, Amb a 1.2, Amb a 1,3, Amb a 1,4) Péptidos recombitope particularmente preferidos para tratamento da sensibilidade a Felis domesticus são derivados do género Felis e compreendem regiões seleccionadas dos péptidos X, Y, Z, A e B, de TRFP, sendo a sequência de aminoácidos de cada péptido apresentada na Fig. 4 e suas modificações, tal como o péptido C que é uma adição de um aminoácido a um péptido A e é mostrado na Fig. 4. Os péptidos recombitope preferidos compreendem o péptido YZX e o péptido AYZXB. Ao longo do pedido, as letras X, Y, Z, A, B, eC, referem-se respectivamente ao péptido X, péptido Y, péptido Z, péptido A, péptido B e péptido C, e quando as letras são utilizadas juntas (por exemplo, YZX), estamo-nos a referir a um péptido recombitope compreendendo o péptido Y, o péptido Z e o péptido X na ordem sequencial especificada (isto é, YZX refere-se a um péptido recombitope compreendendo a sequência de aminoácidos do péptido Y seguida imediatamente, sem quaisquer resíduos de aminoácido interpostos, pela sequência de aminoácidos do péptido Z seguida imediatamente, sem quaisquer resíduos de aminoácido interpostos, pela sequência de aminoácidos do péptido X). Os péptidos recombitope do invento, por exemplo, YZX, podem compreender resíduos de aminoácido adicionais tanto no terminal amino como no carboxilo do péptido recombitope.

Os péptidos recombitope do invento podem ser derivados de

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IPC-027 outros antigénios proteicos para além dos alergenos proteicos, em que a estimulação ou depressão de uma resposta imunitária específica para um antigénio é desejada. Por exemplo, regiões de um auto-antigénio conhecido envolvido na patogénese de uma doença auto-imune possuindo actividade estimuladora de célula T humana, ou epitopos de célula T de um auto-antigénio conhecido podem ser identificadas e combinadas num péptido recombitope para diminuir a resposta do anticorpo ao auto-antigénio, para interferir com a eficácia e/ou decréscimo dos efeitos secundários relacionados com o complexo imunitário. De modo a conservar a réactividade de célula T do auto-antigénio, regiões do auto-antigénio possuindo actividade estimuladora de célula T podem ser definidas por técnicas comuns de biologia celular de célula T, ou se desejado, podem ser definidos por técnicas de mapeamento fino os epitopos exactos de célula T e um péptido recombitope compreendendo pelo menos duas regiões possuindo cada uma actividade estimuladora de célula T humana e compreendendo pelo menos um epitopo de célula T produzido. Por exemplo, se se encontraram três regiões possuindo actividade estimuladora de célula T ou três epitopos de célula T num auto-antigénio numa ordem sequencial e contígua, 1, 2, 3 de um terminal amino para um terminal carboxilo, podem então ser produzidos seis possíveis péptidos recombitope utilizando cada região ou cada epitopo de célula T, compreendendo as três regiões ou epitopos de célula T em várias ordens (por exemplo, 213, 312, 132, 321, 123, 231).

Estes seis péptidos recombitope podem ser testados quanto à capacidade para estimular a actividade da célula T e quanto à ausência de uma propriedade indesejada presente no auto-antigénio, por exemplo, a incapacidade do(s) péptido(s) recombitope(s) ligar(em) anticorpos. Alternativamente, como previamente descrito, os péptidos recombitope podem ser construídos a partir de um auto-antigénio sem se saber quais as regiões que possuem actividade estimuladora de célula T, ou quais são os epitopos de célula T exactos. Os péptidos recombitope que estimulam as células T e não possuem propriedades indesejáveis do auto-antigénio (por exemplo, não ligam auto-anticorpos numa percentagem substancial de indivíduos sensíveis ao auto-antigénio), são seleccionados para utilização

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IPC-027 como produtos para imunoterapia ou agentes de diagnóstico. Na forma de composição terapêutica, o péptido recombitope será distribuído num veículo fisiologicamente aceitável, na ausência de adjuvante para permitir que o péptido recombitope induza tolerância específica do antigénio para o auto-antigénio do qual o recombitope é derivado e regular qualquer resposta imunitária potencialmente danificante. Entre os vários auto-antigénios úteis na produção de péptidos recombitope estão a insulina, a ácido glutâmico descarboxilase (64 K), PM-1 e carboxipeptidase na diabetes: a proteína mielina básica na esclerose múltipla, o factor Rh nas eritroblastoses fetais; receptores de acetilcolina na miastenia gravis; receptores da tiroide na doença de Graves; proteínas basais de membrana no síndroma do Goodpasture; e proteínas da tiroide na tiroidite. Por exemplo, regiões possuindo actividade estimuladora de célula T humana da proteína mielina básica (MBP); por exemplo, uma região compreendendo toda ou uma porção de resíduos de aminoácido 84-106 e mais preferivelmente 84-102, e mais preferivelmente 89-101 de MBP humana e uma região compreendendo toda ou uma porção de resíduos de aminoácido 140-172 e mais preferivelmente, 143-168 de MBP humana, pode compreender um péptido recombitope do invento para utilização no tratamento da esclerose múltipla.

Os péptidos recombitope no âmbito deste invento podem ser utilizados em processos de tratamento e de diagnóstico de sensibilidade num indivíduo a um alergeno proteico ou a outro antigénio proteico. Assim, um aspecto do invento proporciona composições terapêuticas compreendendo um péptido recombitope e um portador ou diluente farmacêuticamente aceitável. A administração das composições terapêuticas do presente invento para dessensibilizar um indivíduo a um alergeno proteico ou a outro antigénio proteico, pode ser efectuada utilizando técnicas conhecidas. Por exemplo, um péptido recombitope pode ser administrado em combinação com um diluente apropriado, um portador, e/ou um adjuvante, quando apropriado. Diluentes farmacêuticamente aceitáveis incluem solução salina e soluções aquosas tamponadas. Portadores farmacêuticamente aceitáveis incluem o polietilenoglicol (Wie et al. International Archives

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IPC-027 of Allergv and Applied Immunology 64:84-99 (1981)) e lipossomas (Strejan et al. Journal of Neuroimmunology 7:27 (1984)). Adjuvantes farmacêuticamente aceitáveis incluem alúmen. Tais composições serão geralmente administradas por injecção (subcutâneas, intravenosas, etc.), administração oral (por exemplo, na forma de uma cápsula), inalação, aplicação transdérmica ou administração rectal. As composições terapêuticas do invento são administradas a indivíduos sensíveis a um alergeno ou a outro antigénio proteico do qual o péptido recombitope é derivado, em dosagens e durante períodos de tempo eficazes para reduzir a sensibilidade do indivíduo ao alergeno ou a outro antigénio. Uma quantidade terapêuticamente eficaz de uma ou mais, da mesma ou de diferentes composições terapêuticas, pode ser administrada simultânea ou sequencialmente a um indivíduo sensível a um alergeno ou a outro antigénio proteico. As quantidades eficazes das composições terapêuticas vão variar de acordo com factores como o grau de sensibilidade do indivíduo, a idade, sexo e peso do indivíduo, e a capacidade dos péptidos estimularem uma resposta da célula T no indivíduo. Ainda noutro aspecto do presente invento, é proporcionada uma composição compreendendo pelo menos dois péptidos recombitope (por exemplo, uma mistura física de pelo menos dois recombitope) cada um compreendendo pelo menos dois epitopos de célula T derivados do mesmo ou de diferentes alergenos proteicos ou de outros antigénios proteicos.

presente invento proporciona também processos de detecção de sensibilidade, em indivíduos, a um antigénio proteico e a processos de determinar a presença de imunoglobulina específica para um antigénio proteico e a capacidade de células T do indivíduo responderem ao antigénio. De modo a detectar a sensibilidade, uma amostra de sangue ou pelo menos uma porção da amostra obtida de um indivíduo, é combinada com um antigénio proteico, forma modificada do antigénio proteico, ou uma porção de qualquer um dos antigénios, cada um dos quais liga imunoglobulina específica para o antigénio, em condições apropriadas para a ligação de componentes do sangue com o antigénio, antigénio modificado ou uma sua porção. Uma segunda /Λ

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IPC-027

amostra de sangue obtida de um indivíduo em que se verificou haver ligação dos componentes do sangue ao antigénio proteico, antigénio modificado ou uma sua porção, ou uma segunda porção da primeira amostra de sangue de um indíviduo em que foi verificada a ligação de componentes do sangue com o antigénio proteico, antigénio modificado ou uma sua porção, é combinada com um péptido recombitope compreendendo pelo menos duas regiões derivadas de um antigénio proteico, possuindo o referido péptido recombitope actividade estimuladora de célula T; ou um péptido recombitope comprendendo pelo menos duas regiões derivadas de um antigénio proteico, cada uma das regiões possuindo actividade estimuladora de célula T humana; ou uma forma modificada do antigénio proteico ou uma sua porção; ou o antigénio proteico produzido recombinantemente, cada um dos quais não liga imunoglobulina específica para o antigénio proteico numa percentagem substancial da população de indivíduos sensíveis ao antigénio proteico (por exemplo, pelo menos 75%), de modo a determinar se ocorre estimulação de célula T. Se o antigénio proteico é um alergeno proteico, então a forma modificada do alergeno proteico ou uma sua porção, o alergeno proteico produzido recombinantemente, ou o péptido recombitope derivado do alergeno proteico não liga IgE especifica para o alergeno proteico, ou se ocorre a ligação a IgE, esta ligação não resulta na libertação de mediadores pelos mastócitos ou basófilos numa percentagem substancial de uma população de indivíduos sensíveis ao alergeno. Se se verificar que o indivíduo apresenta ligação de componentes do sangue ao antigénio, antigénio modificado ou uma sua porção e estimulação de célula T em resposta ao péptido recombitope, antigénio proteico modificado ou uma sua porção, ou antigénio proteico produzido recombinantemente, então pode ser administrado ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição terapêutica compreendendo o péptido recombitope, o antigénio proteico produzido recombinantemente, ou a forma modificada do antigénio proteico ou uma sua porção, e um portador ou diluente farmacêuticamente aceitável para dessensibilizar o indivíduo ao antigénio proteico.

presente invento proporciona também processos para a

víducT

detecção de Hipersensibilidade de Tipo Retardado num i

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IPC-027 para pelo menos um alergeno proteico. De acordo com o processo, é administrado a um indivíduo um teste de Hipersensibilidade de Tipo Retardado (ver por exemplo, Immunolocrv (1985) Roitt, I.M.,

Brostoff, J. Male, D.K. (eds), C.V. Mosby Co., Gower Medicai Publishing, London, N.Y. pp. 19.2-19.18; pp. 22.1-22.10) utilizando uma forma modificada do alergeno proteico ou de outro antigênio proteico ou de uma sua porção, ou um alergeno proteico ou outro antigênio proteico produzido recombinantemente, ou um péptido recombitope derivado do referido pelo menos um alergeno proteico ou de outro antigênio proteico, cada um dos quais possui actividade estimuladora de célula T humana e cada um dos quais não liga imunoglobulina especifica para o alergeno proteico ou a outro antigênio proteico numa percentagem substancial (por exemplo, pelo menos 75%) de indivíduos sensíveis ao referido alergeno proteico ou outro antigênio proteico. Se o antigênio proteico é um alergeno proteico, então a forma modificada do alergeno proteico ou uma sua porção, o alergeno proteico produzido recombinantemente ou o péptido recombitope derivado do alergeno proteico não liga IgE específica para o alergeno proteico, ou se a ligação de IgE ocorre, tal ligação não resulta na libertação de mediadores por mastócitos ou basófilos, numa percentagem substancial de uma população de indivíduos sensíveis ao alergeno. Verificou-se que a cadeia 1 recombinante de TRFP numa forma dimérica reduziu marcadamente a ligação à IgE, mas manteve a reactividade de célula T (isto é, a cadeia 1 dimérica recombinante contém os péptidos X e Y, sendo conhecido que ambos contêm pelo menos um epitopo de célula T) e que o TRFP moderadamente tratado com base reduziu marcadamente a ligação à IgE, mas manteve a reactividade de célula T. Da mesma forma, a cadeia 1 recombinante de TRFP na forma dimérica ou o TRFP tratado com base, podem ser utilizados no teste de Hipersensibilidade de Tipo Retardado acima descrito, ou em outros ensaios de diagnóstico, para determinar a sensibilidade num indivíduo ao(s) epitopo(s) de célula T de TRFP e/ou estes podem ser utilizados em composições terapêuticas para dessensibilizar indivíduos ao TRFP. Após administração do teste de Hipersensibilidade de Tipo

-27Retardado, é determinada a extensão com que ocorre uma reacção

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IPC-027

de Hipersensibilidade de Tipo Retardado no indivíduo para o alergeno proteico ou para outro antigénio proteico, indicando a presença no indivíduo de células T específicas para epitopo(s) de células T do alergeno proteico ou outro antigénio proteico.

O presente invento proporciona também processos de detecção e tratamento da sensibilidade num indivíduo para pelo menos um alergeno proteico. A presença em indivíduos de IgE específica para pelo menos um alergeno proteico e a capacidade das células T dos indivíduos responderem ao(s) epitopo(s) de células T do alergeno proteico, podem ser determinadas fazendo aos indivíduos um teste de Hipersensibilidade de Tipo Imediato e um teste de Hipersensibilidade de Tipo Retardado. É feito aos indivíduos, um teste de Hipersensibilidade de Tipo Imediato (ver por exemplo, Immunolocrv (1985) Roitt, I.M., Brostoff, J., Male, D.K. (eds), C.V. Mosby Co. Gower Medicai Publishing, London, N.Y., pp. 19.2-19.18; pp. 22.1-22.10) utilizando o alergeno proteico ou uma sua porção, ou uma forma modificada do alergeno proteico ou uma sua porção, cada um dos quais liga a IgE específica para o alergeno. Aos mesmos indivíduos é feito um teste de Hipersensibilidade de Tipo Retardado antes, ou em simultâneo com, ou subsequente à execução do teste de Hipersensibilidade de Tipo Imediato. Claro que, se o teste de Hipersensibilidade de Tipo Imediato é feito antes do teste de Hipersensibilidade de Tipo Retardado, o teste de Hipersensibilidade de Tipo Retardado será feito aos indivíduos que exibem uma reacção específica de Hipersensibilidade de Tipo Imediato. O teste de Hipersensibilidade de Tipo Retardado utiliza uma forma modificada do alergeno proteico ou uma sua porção, o alergeno proteico produzido recombinantemente, ou um péptido recombitope derivado do alergeno proteico, cada um dos quais possui actividade estimuladora de célula T humana e cada um dos quais não liga IgE específica para o alergeno numa percentagem substancial de uma população de indivíduos sensíveis ao alergeno (por exemplo, pelo menos 75%). A estes indivíduos em que se verificou haver tanto uma reacção específica de Hipersensibilidade de Tipo Imediato como uma reacção específica ./-28c £7-1»',·«· ' “ U7 foi administrada de uma composição compreende a forma o alergeno proteico de Hipersensibilidade de Tipo Retardado, quantidade terapeuticamente eficaz <

terapêutica. A composição terapêutica modificada da proteína ou de uma sua porção,

ΊΑ 488

IPC-027 uma produzido recombinantemente ou o péptido recombitope, como utilizado no teste de Hipersensibilidade de Tipo Retardado, e um portador ou diluente farmaceuticamente aceitável.

É também possível modificar a estrutura dos péptidos recombitope para propósitos tais como aumentar a solubilidade, melhorar a eficácia terapêutica ou preventiva, ou estabilidade (por exemplo, tempo de vida ex vivo, e resistência à degradação proteolítica in vivo). Pode ser produzido um péptido recombitope modificado em que a sequência de aminoácidos foi alterada, tal como por substituição, delecção ou adição de aminoácidos,para modificar a imunogenicidade e/ou reduzir a alergenicidade, ou ao qual foi adicionado um componente para o mesmo propósito. Por exemplo, os resíduos de aminoácido essenciais para a função de epitopo de célula T podem ser determinados por técnicas conhecidas (por exemplo, substituição de cada resíduo e determinação da presença ou ausência de reactividade de célula T). Os resíduos que se verificaram ser essenciais podem ser modificados (por exemplo, substituídos por um outro aminoácido cuja presença evidencia intensificar a reactividade de célula T), assim como aqueles que não são necessários para a reactividade da célula T (por exemplo, sendo substituídos por outro aminoácido cuja incorporação intensifica a reactividade de célula T mas não diminui a ligação a MHC relevante). Outro exemplo de uma modificação de péptidos recombitope, é a substituição de resíduos de cisteína preferivelmente por alanina, ou ácido glutâmico, ou alternativamente com serina ou treonina para minimizar a dimerização através de ligações dissulfureto. De modo a intensificar a estabilidade e/ou reactividade, os péptidos recombitope podem também ser modificados para incorporar um ou mais polimorfismos na sequência de aminoácidos de um alergeno proteico resultante de uma variação alélica natural. Adicionalmente, D-aminoácidos, aminoácidos não naturais ou análogos não aminoácidos podem ser

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IPC-027 substituídos ou adicionados para produzir um péptido modificado no âmbito deste invento. Além disso, os péptidos recombitope podem ser modificados utilizando o processo do polietilenoglicol (PEG) de A. Sehon e colaboradores (Wie et al.

supra) para produzir um péptido conjugado com o PEG.

Modificações de péptidos recombitope incluem também redução/alquilação (Tarr em: Methods of Protein

Microcharacterization, J.E, Silver Ed. Humana Press, Clifton, NJ, pp 155-194 (1986)); acilação (Tarr, supra1; esterificação (Tarr, supra); acoplamento químico a um portador apropriado (Mishell e Shiigi, eds, Selected Methods in Cellular Immunolocry. WH Freeman, San Francisco, CA (1980); patente U.S. 4 939 239); ou tratamento suave com formalina (Marsh International Archives of Allerqy and Applied Immunolocry 41:199-215 (1971)).

Para facilitar a purificação e aumentar potencialmente a solubilidade de péptidos recombitope, é possível adicionar grupos repórter à estrutura do péptido. Por exemplo, pode ser adicionada poli-histidina a um péptido recombitope para purificar o péptido recombitope por cromatografia de afinidade de ião metálico imobilizado (Hochuli, E. et al. , Bio/Thecnoloqy 6:1321-1235 (1988)). Adicionalmente, podem ser introduzidos sítios específicos de clivagem por endoprotease, se desejado, entre um grupo repórter e sequências de aminoácidos de um péptido recombitope para facilitar o isolamento de péptidos recombitope isentos de sequências irrelevantes. De modo a dessensibilizar com sucesso um indivíduo a um antigénio proteico, pode ser necessário aumentar a solubilidade de um péptido recombitope por adição de grupos funcionais ao péptido ou pela não inclusão de epitopos de célula T hidrofóbicos ou regiões contendo epitopos hidrofóbicos nos péptidos recombitope.

Para ajudar potencialmente o processamento antigénico adequado dos epitopos de célula T num péptido recombitope, sítios canónicos sensíveis a proteases podem ser recombinantemente ou sinteticamente construídos entre regiões, compreendendo cada uma pelo menos um epitopo de célula T. Por

-30ΊΑ 488

IPC-027 exemplo, pares de aminoácidos com carga, como KK ou RR, podem ser introduzidos entre regiões de um péptido recombitope durante a construção recombinante do péptido recombitope. 0 péptido recombitope resultante pode ser tornado sensível à clivagem por catepsina e/ou outras enzimas do tipo da tripsina, para criar porções do péptido recombitope contendo um ou mais epitopos de célula T. Adicionalmente, estes resíduos de aminoácido com carga pode resultar num aumento da solubilidade de um péptido recombitope.

A mutagénese dirigida ao sítio do ADN codificando um péptido recombitope pode ser utilizada para modificar a estrutura do péptido recombitope. Tais processos podem envolver PCR (Ho et al., Gene 77:51-59 (1989)), ou síntese total de genes mutados (Hostomsky, Z., et al., Biochem. Biophvs. Res. Comm. 161í1056-1063 (1989)). Para estimular a expressão bacteriana, os processos anteriormente mencionados podem ser utilizados em conjunção com outros procedimentos para modificar os codões eucariotas nas construções de ADN codificando os péptidos recombitope para os preferivelmente utilizados em E. coli .

O presente invento proporciona também sequências de ácido nucleico que codificam os péptidos recombitope do invento. As sequências de ácido nucleico utilizadas em qualquer das concretizações deste invento podem ser ADNc como aqui descrito, ou alternativamente, podem ser quaisquer sequências de oligodesoxinucleótidos possuindo toda ou uma porção da sequência aqui representada, ou os seus equivalentes funcionais. Tais sequências de oligodesoxinucleótidos podem ser produzidas quimicamente ou mecanicamente, utilizando técnicas conhecidas. Um equivalente funcional de uma sequência de oligonucleótidos é uma sequência que 1) é capaz de hibridar com um oligonucleótido complementar com o qual a sequência de oligonucleótidos (ou porções correspondentes da sequência) ou seus fragmentos hibridam, ou 2) é uma sequência (ou porções da sequência correspondentes) ou seus fragmentos, complementar à sequência de oligonucleótidos e/ou 3) uma sequência que codifica um produto (por exemplo, uma proteína, um polipéptido ou um péptido)

Λ. '

-3174 488

IPC-027 possuindo as mesmas caracteristicas funcionais do produto codificado pela sequência de oligonucleótidos (ou porção correspondente da sequência). Se um equivalente funcional deve preencher um ou mais critérios, vai depender da sua utilização (por exemplo, se é para ser utilizado apenas como sonda de hibridação, só necessita preencher o primeiro ou segundo critério e se é para ser utilizado para produzir um péptido do presente invento, necessita apenas preencher o terceiro critério).

Como descrito nos Exemplos que se seguem, as cadeias 1 e 2 da Proteína Felina Reactiva com célula T humana (TRFP) (Figs. 1 e 2) foram expressas recombinantemente em E. coli e purificadas. Estudos de epitopos de célula T utilizando regiões de péptido que se sobrepõem derivadas da sequência de aminoácidos de TRFP, foram utilizadas para identificar epitopos múltiplos de célula T em cada cadeia de TRFP. Como descrito em detalhe no Exemplo 2, foram montadas construções de ADN em que três regiões (designadas péptido X, péptido Y e péptido Z), cada uma contendo pelo menos um epitopo de célula T principal de TRFP, foram ligadas em seis combinações possíveis para produzir seis construções de ADN, codificando péptidos recombitope compreendendo as três regiões em seis configurações diferentes. Uma vez que o péptido X partilha 5 aminoácidos no seu terminal carboxilo com 5 aminoácidos no terminal amino do péptido Y, os péptidos recombitope XYZ e ZXY podiam ter sido construídos com ou sem duplicação dos referidos 5 aminoácidos (ver Fig. 11 onde ZXY é construído sem duplicação da sequência de 5 aminoácidos). Nos Exemplos seguintes, os péptidos recombitope foram montados contiguamente, sem duplicação da sequência de 5 aminoácidos. Para além das três regiões X, Y e Z, outras regiões, cada uma contendo pelo menos um epitopo de célula T, podem também ser incluídas nos péptidos recombitope e construções de ADN possuindo 4 ou mais regiões (de N! configurações, onde N= número de regiões) produzidas. Alternativamente, uma ou mais regiões podem ser substituídas pelo péptido X, péptido Y, ou péptido Z, como o péptido A ou B como apresentado na Fig. 4, para produzir por exemplo o péptido recombitope AXY.

-32Estão descritos protocolos detalhados para a

488

IPC-027

remoção de sequências estranhas adicionadas a péptidos recombitope como uma· ajuda na purificação. Péptidos recombitope purificados foram examinados quanto à ligação de IgE humana de pacientes alérgicos a gatos em transferências de Western e comparados com a ligação da IgE às cadeias recombinantes 1 e 2 de TRFP. Foi efectuada um ELISA para examinar a ligação de IgE alérgica aos péptidos recombitope relativos ao TRFP nativo, cadeia 1 recombinante e cadeia 2 recombinante. 0 trabalho aqui descrito demonstra que os péptidos recombitope do presente invento possuem actividade estimuladora de célula T, embora a sua configuração de epitopo difira geralmente da encontrada na sequência de proteína nativa do TRFP. Além disso,verificou-se que a utilização de péptidos recombitope como agentes profilácticos torna ratinhos não responsivos, após desafio antigénico com o TRFP nativo, cadeia 1 recombinante, ou cadeia 2 do TRFP, ou do pêptido recombitope utilizado.

Este invento é ilustrado pelos seguintes Exemplos não limitantes.

Exemplo 1. Estudos de Epitopos de Célula T com Péptidos TRFP que se sobrepõem.

Purificaram-se células mononucleares de sangue periférico (PBMC) por centrifugação com Ficoll-Hypaque de 60 ml de sangue periférico heparinizado de pacientes alérgicos a gatos, que exibiam sintomas clínicos de alergia a gatos e que eram positivos ao teste de pele com extracto de gato. Dez milhões de PBMC de um paciente individual foram cultivadas em 10 ml de RPMI-1640 (Gibco) contendo 5% de soro AB humano combinado e suplementado com glutamina, penicilina, estreptomicina e tampão HEPES (RPMI-1640 completo), na presença de 20 jug de TRFP nativo purificado por afinidade/ml de cultura, a 37°C durante 7 dias. As células viáveis foram então purificadas por centrifugação em Ficoll-Hypaque e cultivadas durante 2 semanas adicionais em meio RPMI-1640 completo contendo 5 unidades de IL-2 recombinante humana/ml e 5 unidades de IL-4 recombinante humana/ml. As células T em repouso resultantes da cultura foram então testadas

-3374 488

IPC-027 num ensaio de proliferação secundária utilizando uma placa de microtitulação de 96 poços, para avaliar as respostas de células T aos vários péptidos TRFP ou proteínas (antigénios TRFP) como apresentado na Fig. 3. Para o ensaio, 2xl0⁴ células T em repouso foram cultivadas em RPMI-1640 completo durante 3 dias a 37 °C na presença de 5xl0⁴ PBMC autologas (3500 rads) como células apresentadoras de antigénio, com várias concentrações de um dos antigénios de TRFP em cada poço, numa quantidade de 200 μΐ por poço. Cada poço recebia, então, 1 μΟΐ de timidina tritiada durante 16 horas. As contagens incorporadas foram recolhidas em filtros de fibra de vidro e processados para contagem de cintilação líquida. Os índices de estimulação para as respostas a cada péptido foram então calculadas como o CPM máximo em resposta ao antigénio, divididas pelo CPM de controlo do meio. Um índice de estimulação de 2,5 foi considerado como uma resposta positiva de célula T. (Como utilizado ao longo deste pedido, a actividade estimuladora de célula T humana é definida como um índice de estimulação de pelo menos 2,0. No entanto, o índice de estimulação dos epitopos ou regiões de célula T a ser utilizadas na produção de recombitope do invento, é pelo menos de 2,0, preferivelmente de pelo menos 2,5, mais preferivelmente de pelo menos 3,5 e muito preferivelmente de pelo menos 5,0). Um sumário dos resultados de 34 destas experiências é apresentado na Fig. 3. As 5 maiores respostas peptídicas, ao conjunto de péptidos de TRFP que se sobrepõem cobrindo a cadeia 1 e a cadeia 2 de TRFP pela linha de células T derivada de cada paciente foram ordenadas, fixando a resposta mais positiva a 5, a próxima mais positiva a 4, e assim sucessivamente. 0 somatório das ordens obtidas para cada péptido foi então calculado e é apresentado no histograma da Fig. 3. Este tipo de análise salienta a importância relativa de diferentes regiões da molécula de TRFP na resposta de célula T à proteína intacta. Os resultados indicam que as regiões principais da reactividade das células T neste painel de pacientes estão abarcadas (por ordem de importância) por Fel-14.2 (cadeia 1, resíduos de aminoácido 29-42), Fel-3.1 (cadeia 1, resíduos de aminoácido 18-32), Fel-2 (cadeia 1, resíduos de aminoácido 9-25), Fel-21 (cadeia 1, resíduos de aminoácido 56-70), Fel-29 (cadeia 1,

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IPC-027 resíduos de aminoácido 56-70), Fel 1.2 (cadeia 1, resíduos de aminoácido 1-17), Fel-4 (cadeia 1, resíduos de aminoácido 37-55), Fel-18 (cadeia 2, resíduos de aminoácido 23-48), Fel-25 (cadeia 2, resíduos de aminoácido 49-68), Fel-16 (cadeia 2, resíduos de aminoácido 1-22), e Fel-23 (cadeia 1, resíduos de aminoácido 51-66). Um conjunto de péptidos foi então concebido para cobrir estas regiões. Porções de Fel-1.2, Fel-2, Fel-3.1 e Fel-14.2 compreendem o péptido X (cadeia 1, resíduos de aminoácido 7-33). Porções de Fel-3.1, Fel-14.2, e Fel-4 compreendem o péptido Y (cadeia 1, resíduos de aminoácido

29-55). Porções de Fel-16, Fel-17 e Fel-18 compreendem o péptido Z (cadeia 2, resíduos de aminoácido 14-39). Porções de Fel-4, Fel-21 e Fel-23 compreendem o péptido A. Porções de Fel-29 compreendem o péptido B. Os péptido X, Y, Z, A e B são apresentados na Fig. 4.

Exemplo 2. Construção e Expressão de Péptidos Recombitope

Foram utilizados processos de PCR (Reacção em Cadeia de Polimerase) utilizando oligonucleótidos sintéticos para construir ADN codificando as sequências dos péptidos X, Y, e Z. Com o objectivo de intensificar a expressão em E. coli, os codões nos oligonucleótidos foram seleccionados de uma tabela dos prevalecentes em proteínas altamente expressas em E. coli. Sharp, P.M. et al, Nucl. Acid. Res. 16:8207 (1988). Os oligonucleótidos e os procedimentos de PCR utilizados para construir péptidos recombitope são descritos a seguir em detalhe.

Os oligonucleótidos foram concebidos com os codões preferidos de E. coli, como esquematicamente representado nas Figs. 5 e 6. Estes oligonucleótidos (C,D,E,F,G,H,I,J,K,L,M,N, e 0 apresentados na Fig. 7), foram amplificados utilizando um conjunto Perkin Elmer/Cetus GeneAmp, em duas reacções separadas de PCR (PCR#1 e PCR#2, respectivamente, em que PCR#1 resultou na síntese da porção 5' da molécula de ADN codificando o péptido recombitope e a PCR#2 resultou na síntese da porção 3' da molécula de ADN codificando o péptido recombitope). Esta abordagem foi utilizada devido à presença de uma sequência

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IPC-027

-35J O J¹·' A /r.

(KALPV) em ambos os péptidos X e Y, que se verificou interferir na produção correcta por PCR do recombitope YZX, quando uma única reacção de PCR foi efectuada com os oligonucleótidos (C-I). Na produção do péptido recombitope AYZXB, como apresentado na Fig. 6, os oligonucleótidos utilizados na PCR#1 foram N,J,K e C-I, e os oligonucleótidos utilizados na PCR#2 foram C-I e L,M e 0. Na produção do péptido recombitope YZX, como apresentado na Fig.5, os oligonucleótidos utilizados na

PCR#1 foram C,D,E e F, enquanto que os oligonucleótidos utilizados na PCR#2 foram F,G,H e I. Cada mistura de reacção (10 Mg) produziu a metade 5⁷ e a metade 3' respectivamente, da estrutura YZX pretendida (Fig. 5). Estas misturas de PCR, após a adição da Taq-polimerase, foram sujeitas ao seguinte programa com ciclos de desnaturação, desnaturação/renaturação (annealing) e polimerização:

PASSO#	TEMPERATURA	TIME
1	94°C	1 MINUTO
2	50°C	1,5 MINUTOS
3	75°C	2 MINUTOS
4	REPETIR OS PASSOS 1-3	(4 VEZES)
5	94°C	1 MINUTO
6	60°C	1,5 MINUTOS
7	75°C	2 MINUTOS
8	REPETIR OS PASSOS 5-7	(20 VEZES)
9	MANTER A 4°C

Após se completarem as reacções de PCR#1 e PCR#2 na construção da estrutura YZX, foram adicionadas alíquotas de cada uma delas (100 pmol dos 10 pg da mistura total de reacção; 1/100 volume) a uma terceira mistura de reacção de PCR contendo um conjunto de iniciadores 5' e 3' (100 pmol dos iniciadores- C e

I). Uma terceira reacção de PCR (PCR#3) foi efectuda utilizando esta terceira mistura de reacção de PCR, como previamente descrito para as reacções de PCR #1 e #2, com a excepção da temperatura de desnaturação/renaturação no Passo 6 ter sido aumentada para 65°C. A PCR# 3 completa produziu o ADN que codifica o péptido recombitope YZX. 0 processo da reacção de

488

IPC-027

-36PCR#3 é semelhante ao descrito por

Horton, R.M. et al., Gene

77:61 (1989). Toda a mistura de reacção utilizada em PCR# 3 foi fraccionada num gel de agarose a 2% e a banda de tamanho apropriado (230 pb) foi electroeluída do pedaço do gel e precipitada. O ADN isolado codificando o pêptido recombitope YZX foi sujeito a outra reacção de PCR utilizando um excesso de iniciadores de amplificação 5^Z e 3' (C e I). Este produto final foi digerido com as enzimas de restrição BamH I e depois clonado no vector pETlld sob o controlo de transcrição do promotor de fusão gn 10 lac 0 do fago T7. Studier, F.W., et al. Methods in

Enzimol. 185:129 (1990).

Um poliligador codificando seis histidinas sequenciais, (CAC)g foi clonado em fase na extremidade 5' do ADN codificando o pêptido recombitope YZX. A sequência de comando de seis histidinas (Hg ou Hisg) permitiu a purificação do pêptido recombitope expresso utilizando QUIAGEN NTA-Agarose (Diagen Gmbh, Dusseldorf, Germany), um suporte quelante de Ni²⁺. Hochuli et al. BioTechnology 6:1321 (1988). O ADN codificando sítios específicos de clivagem enzimática (por exemplo, Trombina, Factor Xa, etc.) pode ser inserido entre a sequência que codifica as poli-histidinas (Hg) e o ADN codificando a estrutura do pêptido recombitope, utilizando processos de PCR. No caso do pêptido recombitope YZX, foi inserido um sítio de reconhecimento da trombina (LVPRGS). Uhlen, M. e Moks, T. Methods in Enzimologv 185:129 (1990), Chang, J.-Y. Eur. J. Biochem. 151:217 (1985).

Um procedimento semelhante ao acima descrito para construir ADN codificando o pêptido recombitope YZX foi utilizado para construir o ADN codificando os péptidos recombitope XYZ e ZYX. Adicionalmente, outros péptidos contendo epitopos de célula T podem ser adicionados a uma estrutura esqueleto de um recombitope existente como o YZX (como produzido acima), como foi o caso com a construção do pêptido recombitope AYZXB (ver Figs. 6 e 7). Alternativamente, péptidos contendo epitopos de célula T podem ser produzidos sem utilização de um esqueleto de recombitope existente utilizando processos aqui delineados. Para produzir o pêptido recombitope AYZXB, foram produzidos

-3774 488

IPC-027 oligonucleótidos iniciadores (J-M) com regiões que se sobrepõem para cada extremidade do péptido recombitope YZX e um iniciador de amplificação 5' e 3' (N e 0) (tal como mostrado na Fig. 6, a parte a escuro da molécula é a sequência de sobreposição). As reacções de PCR foram efectuadas como acima descrito. 0 fragmento AYZBX resultante foi isolado e subclonado no vector pETUDHgTH.

Um procedimento alternativo foi utilizado para construir o ADN codificando os péptidos recombitope XYZ, YXZ, e ZXY. Cada uma das construções de ADN codificando os péptidos recombitope XZY, YXZ, e ZXY, foram ligadas ao codão codificando o aminoácido mais N-terminal do péptido recombitope, com o ADN codificando a sequência de comando MGHHHHHHEF (em que os aminoácidos EF são codificados pelo sítio de restrição de EcoR I GAATTC). Os segmentos de ADN codificando os três péptidos recombitope foram montados através de PCR consecutivas, essencialmente como descrito por Horton et al., (1989) Gene 77:61-68. Os fragmentos de ADN codificando os péptidos X, Y e Z (apresentados na Fig. 4) foram amplificados a partir dos ADNc de Fel d I descrito em Morgenstern et al. (19 91) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:9690-9694. Como apresentado na Fig. 9, que apresenta como exemplo específico a construção da sequência de codificação do péptido recombitope XZY, os oligonucleótidos iniciadores foram sintetizados com uma sequência de ADN que não só amplifica um segmento de ADN específico codificando o péptido X, Y ou Z, mas liga também covalentemente um pequeno segmento (9-18 pares de bases) do segmento de ADN codificando o péptido adjacente X, Y, ou Z. A PCR foi efectuada utilizando Vent¹® polimerase de acordo com as instruções da New England Biolabs, com um programa de amplificação de 30 X [94°C 1 min./ 60°C 1 min. 30 s/72°C 1 min.]. Os iniciadores utilizados para as amplificações por PCR são mostradas na Fig. 10. Os péptidos recombitope individuais codificando fragmentos de ADN/ligador das amplificações de PCR, foram purificados por electroforese preparativa em gel de agarose NuSieve (FMC) a 3% (peso/volume). Estes fragmentos individuais de PCR foram então ligados numa segunda reacção de PCR para formar uma construção de ADN codificando XZY como

-3874 488

IPC-027 apresentado nas Figs. 9 e 11. De modo a ligar estes fragmentos de PCR, pedaços de gel NuSieve contendo os produtos do PCR inicial, foram fundidos a 70 °C, e 1 μ,Ι de cada for adicionado a uma reacção com a Vent^MR polimerase de PCR que empregou os iniciadores 5' RI (terminal NH₂) e 3' Bam (terminal COOH).

Devido aos sítios de restrição presentes no vector de expressão pETlld (Studier et al.. 1990), todos os extremos iniciadores 5' possuiam sítios codificando EcoR I [GAATTC] em fase com o ADN codificando os aminoâcidos do terminal NH₂ do recombitope particular, enquanto as extremidades dos iniciadores do extremo 3' possuiam sítios codificando BamH I [GGATCC]. As construções de ADN codificando os péptidos recombitope XZY, YXZ e ZXY produzidos na segunda PCR foram digeridos com EcoR Ι/BamH I e sujeitos a electroforese através de um gel de agarose SeaPlaque (FMC) a 0,5% (peso/volume). Os pedaços de gel contendo as construções de ADN foram fundidos a 70°C e adicionados a uma reacção de ligação com o plasmídeo Bluescript KS (Stratagene) digerido com EcoR Ι/BamH I. A ligação foi transformada em bactérias competentes XL-1 Blue (Stratagene) e os plasmídeos recombinantes com inserções identificados por digestões de restrição de diagnóstico, após isolamento, utilizando o conjunto Qiatop (Diagen GmbH). A sequência das inserções foi verificada por análise de sequência por terminação de cadeia didesoxi, utilizando um conjunto Sequenase II (United States Biochemicals).

Os plasmídeos Bluescript KS contendo as construções das construções de ADN codificando péptidos recombitope XZY, YXZ e ZXY com a sequência de nucleotidos correcta, foram digeridos com EcoR Ι/BamH I e as construções de ADN isoladas de um gel SeaPlaque a 0,6%, para subclonagem no vector de expressão pETll em fase com o ADN codificando a sequência de comando do terminal-NH₂, MGHHHHHHEF, como acima mencionado. As construções foram subclonadas no pETll d HisgAmb a 1.1 HR digerido com EcoR Ι/BamH I. Esta ligação serve para trocar a construção de ADN por uma inserção, neste caso o ADNc do alergeno principal da erva de Santiago, Amb a 1.1 (Rafnar et al. , (1991) J. Biol. Chem.

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226:1229-1236). 0 pETlld HisgAmb a 1.1 HR derivou do pETlld em dois passos. Primeiro, o pETlld foi digerido com EcoR I/HinD III, as extremidades coesivas foram eliminadas com o fragmento Klenow da ADN polimerase de E. coli, e ligadas a si mesmas para criar o pETlldZSHR: um plasmídeo pETlld a que faltam os sítios Hind III e EcoR I. Então o pETlld HisgAmb a Ι.1Δ HR foi formado por excisão da cassete HgAmb a 1.1 do vector de expressão pETlld HisgAmb a 1.1 como um fragmento Nco I/BamH I e ligando-o ao pETlld Δ HR digerido com Nco I/BamH I. Os plasmideos recombinantes foram identificados por digestões de restrição de diagnóstico, após isolamento através de um conjunto Qiatip, e os plasmideos positivos foram transformados em bactérias competentes BL21[DE3] para expressão. A BL21[DE3] contém um fago recombinante 1 lisogénico, DE3, com um gene da ARN-polimerase do fago T7 sob o controlo de transcrição do promotor lac UV5. A expressão do gene da ARN polimerase de T7 é induzida pela adição de IPTG, que por sua vez leva a um elevado nível de expressão do gene recombinante subclonado 3' do promotor de fusão T7 gn 10 lac 0 do vector pET.

Os fragmentos de ADN derivados do PCR codificando fusões (Hg) das cadeias maduras 1 e 2 do TRFP, subclonados no pSEM (U.S.S.N. 662 276 depositado em 28 de Fevereiro, 1991) foram excisados e ligados no pETlld. Isto foi conseguido por ligação de ligadores Bcl I aos sítios Pst I nas extremidades 3' das duas cadeias, digestção com Nco I na extremidade 5' das cadeias e inserção do fragmento 5' Nco 1/3' Bcl I no p ETlld digerido com 5^Z Nco 1/3'Bam Hl.

As cadeias 1 e 2 do péptido recombitope do TRFP, assim como os pêptidos recombitope XYZ,XZY,YZX,ZYX,ZXY e YZX, foram expressos em E. coli e purificados essencialmente como delineado a seguir. Bactérias hospedeiras BL21 DE3 contendo as construções de ADN de pETlld de expressão, foram espalhadas de fresco numa placa de ágar BHI (3,7% (peso/volume) de Infusão de Cérebro e Coração da Difco; 1,5% (peso/volume) de ágar Difco), suplementada com 200 /zg/ml de ampicilina e incubada durante a noite a 37°C. Uma única colónia foi inoculada num frasco de 2 ml

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IPC-027 de meio BHI(3,7% (peso/volume) de Infusão de Cérebro e Coração da Difco)/200 ^g/ml de ampicilina, e agitada a 300 rpm a 37^eC até à turbidez, mas não à saturação. Os 2 ml de cultura foram então adicionados a íoo ml de meio bhi/200 /xg/ml de ampicilina, agitados a 27*C até à túrbidas, mas não à saturação, ponto am que a cultura foi dividida em 18 x 250 ml (4,5 litros) de meio BHI/200 gg/ml de ampicilina e agitada a 300 rpm a 37 °C. Quando a DO _5Ô5 da cultura atingiu 1,0, a expressão dos péptidos recombitope como péptidos de fusão (His)g foi induzida pela adição de IPTG até 400 μΜ, e deixada continuar durante duas horas.

As bactérias foram colhidas por centrifugação a 10 000 x g durante 15 minutos e ressuspensas em 1/50 do volume de guanidina HC1 6 M, 2-mercaptoetanol 100 mM, NaPO₄ 100 mM, Tris 10 mM, pH 8,0. A cadeia 1 e cadeia 2 recombinantes e os péptidos recombitope (péptidos recombinantes) foram extraídos por agitação vigorosa das bactérias ressuspensas durante 1 hora a 25°C. Esta suspensão foi sujeita a centrifugação a 15 000 x g, o sobrenadante removido, o pH ajustado a 8,0 com NaOH 10 N, e aplicado a uma coluna de agarose NTA que tinha sido equilibrada em guanidina HC1 6 M, NaP0₄ 100 mM, Tris 10 mM a pH 8,0, até a D0₂so d° efluente chegar à linha de base. O tampão da coluna foi então alterado para ureia 8 M, NaP0₄ 100 mM, Tris 10 mM pH 8,0. Após equilíbrio, foi efectuada uma lavagem mais severa com ureia 8 M, NaOAc 100 mM, Tris 10 mM pH 6,3 até a DO₂₈₀ do efluente chegar à linha de base. Cada péptido recombinante (como uma fusão His₆ ), foi então eluído em ureia 8 M, NaOAc 100 mM, Tris 10 mM pH 4,5, e recolhido em alíquotas cujo perfil a DO₂₈₀ foi monitorizado. 0 pico do péptido foi dializado três vezes em 500 volumes de PBS (Solução Salina Tamponada com Fosfato) para análise. 0 intervalo foi de 2 a 25 mg de péptido recombinante de fusão (Hisg) por litro, com uma pureza geralmente excedendo os 90% (como determinado por varrimento densitométrico dos geles de SDS-poliacrilamida).

Os péptidos recombinantes (cadeia 1 de TRFP, cadeia 2 de TRFP, XYZ, YZX e ZYX) acima delineados, possuem todos uma

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IPC-027 sequência N-terminal adicionada como ajuda para a purificação e expressão (por exemplo, MGHHHHHHLVPRGS). Esta sequência N-terminal irrelevante pode ser removida por digestão proteolítica, uma vez que a sequência contém um sítio de reconhecimento da trombina (LVPRGS) inserido entre a sequência de poli-histidinas e a sequência do recombitope. (ver Fig. 8, a seta indica o sitio de clivagem da trombina). A trombina foi utilizada para clivar a sequência irrelevante, levando apenas dois resíduos extra de aminoácido, GS, no terminal-N das cadeias 1 e 2 do TRFP e os péptidos recombitope XYZ,YZX e ZXY (Chang, J.-Y. Eur. Biochem. 151:217-224 (1985)). A clivagem eficiente da proteína de fusão pode ser conseguida utilizando uma razão de proteína para trombina de 1000 para 1, durante 2 horas a 25°C. A clivagem e o esquema de purificação utilizado para construir o péptido recombitope YZX está delineado a seguir:

1) péptido recombitope MGHHHHHHLVPRGS-YZX

2) Diálise em PBS, pH 8,0

3) Clivagem pela trombina péptido:trombina = 1000:1 25°C, 2 horas

4) redução com ditiotreitol 100 mM em guanidina HCL 5 M

37°C, 30 minutos

5) HPLC de Fase Inversa em C4, pH 2,0

6) Liofilização.

A HPLC analítica de fase inversa, foi efectuada numa coluna VYDAC 214 TP54 com 42 ml de volume de leito. A coluna foi carregada com 340 /xg de péptido recombitope YZX. Foi efectuada uma HPLC semi-preparativa utilizando uma coluna VYDAC 214 TP 1022 com um volume de leito de 95 ml, carregada com 95 mg de proteína. 0 gradiente começou com 0% a 30% de acetonitrilo contendo 0,1% de ácido trifluoroacético nos primeiros 10

74 488	.Λ ff
IPC-027	Λ 9 7^7 ». * 2
minutos, seguido por	30% a 43% de acetonitrilo durante 15

minutos. A fase móvel foi então mantida a 43% de acetonitrilo durante 10 minutos. O péptido recombitope purificado YZX eluiu a 43% de acetonitrilo. A clivagem e purificação foram monitorizadas por SDS-PAGE. A identificação e pureza do péptido recombitope YZX foi determinada por análise de sequência de proteínas utilizando um Applied Biosystem Inc. Protein Sequenator Model 477A.

Exemplo 3. Ensaio de Ligação Direeta da IgE a Proteínas do TRFP e Recombitope

Foi efectuada a análise de transferência de Western dos péptidos recombitope produzidos no Exemplo 2. A concentração de todas as amostras proteicas (por exemplo, TRFP, cadeia 1 recombinante de TRFP, cadeia 2 recombinante de TRFP, péptido recombitope XYZ, péptido recombitope XZY, péptido recombitope YXZ, péptido recombitope YZX, péptido recombitope ZXY e péptido recombitope ZYX),para electroforese em gel foi determinada pelo processo BCA (Pierce Co.). Todas as amostras proteicas foram aplicadas no gel a 5 ^g/faixa, excepto o TRFP a 10 gg/faixa. A separação de proteína foi efectuada num gel de poliacrilamida a 15%, e a transferência foi efectuada por electrotransferência a

1,5 Amps durante 1,5 horas em papel de nitrocelulose (Schleicher e Schuell, 0,1 gm) num aparelho Hoeffer de acordo com o protocolo de Towbin, Η., T. Stachlin, e J. Gordon, PNAS 76:4350 (1979), As proteínas foram lavadas em solução de transferência (Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, NaCl 0,171 M e Tween 20 0,5ml/litro). A transferência foi então bloqueada durante uma hora em solução de bloqueamento (leite a 1% em solução de transferência). Plasma do paciente #417, utilizado como fonte primária de anticorpos, foi diluído em solução de bloqueamento a 10% e pré-absorvido durante

1,5 horas com papel de nitrocelulose novo (2 cm x 15 cm). 0 plasma humano preparado foi então incubado durante a noite num agitador orbital com a secção da proteína transferida de interesse. A seguir à incubação com o primeiro anticorpo, a secção de transferência foi lavada três vezes, cada lavagem envolvendo uma incubação de quinze minutos na solução de transferência. 0 segundo anticorpo, específico para a IgE humana

488

IPC-027

(IgE de cabra anti-humana biotinada, KPL, Inc.), foi diluída a 1:2500 em solução de transferência, e a incubação foi efectuada durante duas horas. 0 excesso de segundo anticorpo foi subsequentemente removido por três incubações de 15 minutos com solução de transferência. Estreptavidina iodada com 125j (Amersham) foi diluída a 1:2500 em solução de transferência e incubada com as transferências durante 1 hora, a 2 μθί num volume de incubação de 50 ml. As secções de transferência foram subsequentemente lavadas com solução de transferência até que a radioactividade detectada na solução descartada diminua até ao nível da linha de base. A secção de transferência foi então revestida com papel celofane e exposta ao filme durante a noite com um ecran de intensificação de cronex a -80 °C. 0 padrão de ligação da IgE apresentado na Fig. 13 demonstra reactividade para a cadeia 1 de TRFP purificada por afinidade (faixa 1), com uma massa molecular de 6 KD e cadeia 2, > 16 KD. A cadeia 1 recombinante apresenta uma forte ligação à IgE (faixa 2), enquanto que a reactividade da cadeia 2 recombinante é reduzida comparada com a cadeia 1 (faixa 3). Os péptidos recombitope que apresentam ligação à IgE são os péptidos recombitope XYZ e ZXY (faixas 4 e 8 respectivamente). Todos os outros péptidos recombitope são negativos para a ligação à IgE por este processo de análise.

A ligação específica de IgE a péptidos recombitope, foi também demonstrada em ensaios ELISA. Placas de ensaio corning (#25882-96) foram revestidos com 10 /zg/ml de cada antigénio de revestimento (isto é, TRFP, cadeia 1 (cadeia recombinante de TRFP), cadeia 2 (cadeia 2 recombinante de TRFP), péptido recombitope XYZ, péptido recombitope XZY, péptido recombitope YXZ, péptido recombitope ZXY e péptido recombitope ZYX), listados na Fig. 14 a 50 μΐ/poço, e foram incubadas durante a noite a 4°C. Os antigénios de revestimento foram removidos e os poços bloqueados com gelatina a 0,5% em PBS, 200 μΐ/poço durante 2 horas à temperatura ambiente. O plasma do paciente #669 foi diluído em série com PBS-Tween 20 (PBS com 0,05% do detergente não iónico Tween-20, Sigma, St. Louis, MO), e foram adicionados 100 μΐ/poço e incubados durante a noite a 4°C (as diluições de

4474 488

IPC-027 plasma foram testadas em duplicado). O segundo anticorpo (IgE anti-humana de cabra, biotinada, 1:1000, Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., Gaithersburg, MD), foi adicionado a 100 μΐ/poço durante 1 hora à temperatura ambiente. Esta solução foi removida, e foi então adicionada estreptavidina-HPRO, 1:10 000 (Southern Biothecnology Associates, Inc., Birmingham, AL), a 100 μΐ/poço durante uma hora à temperatura ambiente (todos os poços foram lavados três vezes com PBS-Tween entre cada passo de incubação). 0 sistema Substrato de Peroxidade em Membrana TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories) foi misturado a fresco, e adicionado a 100 μΐ/poço. Deixou-se desenvolver a cor durante 2-5 minutos. A reacção foi interrompida pela adição de 100 μΐ/poço de ácido fosfórico 1 M. As placas foram lidas num leitor Microplate EL 310 Autoreader (Biotek Instruments, Winooski, VT) com um filtro de 450 nm. Foi determinada a média dos níveis de absorvância dos poços em duplicado. Os resultados apresentados em gráfico (log da diluição vs absorvância) dos ensaios ELISA são apresentados na Fig. 14.

Os resultados do ELISA apresentados na Fig. 14 demonstraram um elevado nível de ligação da IgE ao TRFP, com ligação algo inferior às cadeia 1 (cadeia 1) e cadeia 2 (cadeia 2) de TRFP recombinantes. As duas cadeias recombinantes demonstram ligação equivalente com a IgE particular deste paciente. Apenas o péptido recombitope ZXY apresenta uma reactividade clara com a IgE. A ligação dos outros péptidos recombitope está ao nível ou próxima do nível da linha de fundo, com um leve sinal para péptido recombitope XYZ. Para demonstrar que os péptidos recombitope estavam presentes em quantidades iguais em ambos os ensaios ELISA e Western, foram utilizados antissoros anti-péptido como controlo positivo e produziram sinais aproximadamente equivalentes para todas as faixas e poços com péptidos recombitope.

Exemplo 4. Resposta de Epitopos de Célula T Humana a Péptidos Recombitope

Foi examinada a resposta de célula T humana alérgica a gatos a péptidos recombitope. Células mononucleares do sangue

-4574 488

IPC-027 periférico (PBMC) foram purificadas por centrifugação em Ficoll-Hypaque, de 60 ml de sangue periférico heparinizado de pacientes alérgicos a gatos, que exibiam sintomas clínicos de alergia a gatos e que eram positivos ao teste de pele com extrato de gato. Dez milhões de PBMC de um paciente individual foram cultivadas em 10 ml de RPMI-1640 contendo 5% de soro humano AB combinado e suplementado com glutamina, penicilina, estreptomicina e tampão HEPES na presença de 10 ^g/ml de cultura de TRFP nativo purificado por afinidade, ou 25 /xg/ml de cultura de pêptido recombitope YXZ purificado e não clivado, ou 25 /xg/ml de cultura de pêptido recombitope YZX clivado purificado, a 37°C durante 7 dias. 0 pêptido recombitope YZX foi clivado com trombina como descrito no Exemplo 2. As células viáveis foram então purificadas por cent-tifugação em Ficoll-Hypaque e cultivadas durante 2 semanas adicionais em RPMI-1640/5% de soro AB contendo 5 unidades de IL-2 humana recombinante/ml e 5 unidades de IL-4 humana recombinante/ml. As células T em repouso foram então testadas num segundo ensaio de proliferação utilizando uma placa de microtitulação de 96 poços para determinar as respostas de célula T às várias proteínas TRFP ou péptidos (antigénios TRFP). Para o ensaio, 2 x 10^ células T em repouso foram cultivadas durante 3 dias a 37°C, na presença de 2 x 10⁴ células transformadas por vírus autólogo de Epstein-Barr (25 000 Rads) como células apresentando antigénio, com várias concentrações de antigénio em 200 μΐ por poço. Cada poço recebeu então 1 μθί de timidina tritiada durante 16 horas. As contagens incorporadas foram recolhidas em filtros de fibra de vidro e processadas para contagem de cintilação líquida. Os índices de estimulação para as respostas para cada antigénio foram então calculadas como o CPM máximo em resposta ao antigénio, dividido pelo CPM do meio de controlo. Um índice de estimulação de 2,5 foi considerado ser uma resposta positiva de célula T. Um resumo dos resultados de 3 destas experiências (pacientes 522, 519 e 386 são apresentados nas Fig. 15a, Fig. 15b e Fig. 15c. Como comparado com as experiências apresentadas nas Fig.15a e 15b, na experiência apresentada na Fig. 15c, Fel-1.4 (cadeia 1, resíduos de aminoácidos 6-17) foi substituído por Fel-1.2 (cadeia 1, resíduos de aminoácido 1-17) e Fel-33.3 (cadeia 2, resíduos de

aminoácido 26-40) foi substituído por Fel-18 (cadeia

488

IPC-027 de aminoácido 23-48) de modo a se parecer mais com os aminoácidos constituintes dos péptidos X e Z. Adicionalmente, nesta experiência um péptido derivado da junção Y-Z do péptido recombitope YZX (resíduos de aminoácido 50-55 da cadeia 1 de

TRFP e resíduos de aminoácido 14-19 da cadeia 2 de TRFP), e um péptido derivado da junção Z-X do péptido recombitope YZX (resíduos de aminoácido 34-39 da cadeia 2 do TRFP e resíduos de aminoácido 7-12 da cadeia 1 de TRFP) foram sintetizados e testados. Estes péptidos de junção foram produzidos de modo a determinar se estas áreas do péptido recombitope YZX produzem um epitopo não nativo quando formado no péptido recombitope.

Os resultados indicam que as células T do paciente 522 iniciadas com TRFP nativo, respondem positivamente ao TRFP nativo, péptido recombitope YXZ, péptido Y, Fel-14.2 e Fel-17. Em contraste, as células T iniciadas com o recombitope YXZ respondem menos bem ao TRFP nativo, mas respondem a um nível semelhante ou melhor a um número de péptidos sintéticos correspondentes a porções da molécula TRFP, incluindo o péptido X, o péptido Y, o péptido Z, Fel-4, Fel-3.1, Fel-2, Fel-14.2, Fel-17 e Fel-18. Resultados semelhantes de uma experiência com células T do paciente 519 estão apresentados na Figura 15b. Células T deste paciente iniciadas com TRFP nativo respondem ao TRFP nativo purificado, péptido recombitope YXZ e péptido Y. Quando as mesmas células do paciente foram iniciadas com o péptido recombitope YXZ foram apresentadas respostas positivas ao TRFP nativo, péptido recombitope YXZ, péptido X, péptido Y, péptido Z, Fel-3.1, Fel-4 e Fel-17. A Figura 15c apresenta uma experiência semelhante, envolvendo o recombitope YZX clivado purificado como antigénio de iniciação. Os resultados indicam que as células T do paciente 386 iniciadas com TRFP nativo respondem positivamente ao TRFP nativo, péptido recombitope YZX, péptido X, péptido Y, Fel-3.1 e Fel-14.2. Em contraste, as células T iniciadas com o recombitope YZX respondem com um nível semelhante ou melhor ao TRFP nativo, péptido recombitope YZX, péptido X, péptido Y, péptido Z, Fel-2, Fel-3.1, Fel-14.2 e Fel-17. Estes dados indicam que, pelo menos nestes três

-47pacientes as células T podem reconhecer eficientement

488

IPC-027 de células T de TRFP quando apresentadas como um péptido recombitope. Nenhuns epítopos presentes na molécula de TRFP nativo examinada nestas experiências foram destruídos no contexto do péptido recombitope YXZ. A capacidade dos péptidos recombitope YXZ ou YZX apresentarem epítopos de TRFP nestas experiências, parece ser maior comparada com a molécula nativa. Os resultados do paciente 386 demonstram que os péptidos derivados das áreas de junção do recombitope YZX (péptido de junção YZ e péptido de junção ZX) não são reconhecidos por células T quando apresentados num péptido recombitope; desta forma nenhuns epitopos não nativos são criados nas áreas de junção.

Exemplo 5. Resposta de Célula T de Murino a Péptidos Recombitope

Foram imunizados ratinhos com péptido recombitope YZX para determinar se os epitopos de célula T contidos no péptido recombitope derivado do TRFP são capazes de estimular uma resposta de célula T. 0 ensaio determinou a capacidade das células dos nódulos linfáticos responderem aos péptidos recombitope individuais assim como ao antigénio de imunização.

Imunizaram-se subcutaneamente na base da cauda e na região das coxas, 10 Ratinhos B6CBAFI com 100 pg do péptido recombitope YZX em adjuvante de Freund completo. Após 10 dias, os nódulos inguinais, paraaórticos e popliteais dos ratinhos imunizados foram removidos e combinados. As células dos nódulos linfáticos foram suspensas em RPMI-1640 frio com 1% de soro bovino fetal (FBS) por passagem através de uma malha de aço inoxidável. As células foram lavadas duas vezes com RPMI-1640 frio contendo 1% de FBS e mantidas a 4°C.

As células de nódulos linfáticos foram plaquadas a 4 χ 10⁶células /ml em RPMI-1640 com 10% de FBS, penicilina G 250 /xg/ml, estreptomicina a 100 gg/ml, e 2-mercaptoetanol 5 x 10“^ M. As células foram cultivadas com antigénio (isto é, péptido recombitope YZX, péptido recombitope ZYX, péptido recombitope /F i

-4874 488

IPC-027

XZY, péptido X, péptido Y, péptido Z, péptidos X,Y e Z e Amb a

I) como indicado (Fig. 16). Após 24 horas, foram removidos 50 μΐ do sobrenadante de cada cultura e congelados durante a noite para evitar a continuação da vida celular. 0 sobrenadante foi aquecido a 37°C e lavado. As células indicadoras CTLL-2 (ATCC#T1B 214) foram adicionadas (5 x 10³ células/poço). Esta linha de células indicadoras necessita de IL-2 para crescimento continuado. Após 24 horas, foi adicionada H³-timidina (1 /íCi/poço) e as células foram ainda incubadas durante 4 horas. As placas foram congeladas e descongeladas, recolhidas mum colector Tomtec de 96 poços (Tomtec, Orange, Conn.), e contadas num contador beta Betaplate (Pharmacia, Gaithersburg, MD).

As células de nódulos linfáticos combinadas respondem bem in vitro, em resposta à cultura com o péptido recombitope YZX, como medido pela produção de IL-2 (Fig. 16). 0 meio apresenta um valor de base de apenas 1500 cpm. A resposta de célula T ao péptido recombitope YZX pode resultar de uma ou de várias combinações de respostas ao péptido individual contendo os epitopos utilizados para construir o péptido recombitope (isto é, péptidos X, Y e Z). Outros péptidos recombitope, assim como os péptidos individuais X, Y, e Z, foram cultivados com células de nódulos linfáticos e a resposta de células T foi determinada. Existiu uma resposta significativa para cada um dos péptidos X, Y e Z, os péptidos constituintes. Existiram fortes respostas de célula T para vários outros péptidos recombitope ZYX e XZY. Existiu uma pequena, mas significativa resposta de célula T a uma preparação Amb a I recombinante que possui as mesmas sequências de comando amino-terminais que os péptidos recombitope.

Exemplo 6. Aplicação de Recombitopos ao Diagnóstico de Doenças Alérgicas

Os péptidos recombitope podem ser úteis como uma nova forma de diagnóstico da sensibilidade a um alergeno proteico ou antigénio proteico. Por exemplo, embora os péptidos recombitope preferidos do invento não liguem igE, certos péptidos recombitope derivados de alergenos proteicos podem ser capazes

488

IPC-027

ligar

pacientes alérgicos. Estes péptidos

podem ser utilizados em testes de pele, como um ensaio preciso para a Hipersensibilidade de Tipo Imediato (ITH) num indivíduo, ao alergeno proteico do qual o péptido recombitope é derivado.

Os alergenos para originar a resposta de ITH podem também ser alergenos produzidos recombinantemente, alergenos purificados bioquimicamente a partir de fontes naturais em adição aos péptidos recombitope com a única condição de possuírem um elevado grau de reactividade específica de IgE. Péptidos recombitope que não apresentam, ou apresentam reactividade muito baixa com a IgE humana, mas compreendem epitopos de célula T reactivos com um alergeno proteico, podem ser utilizados para originar uma reacção de Hipersensibilidade do Tipo Retardado (DTH) num indivíduo sensível, ao alergeno de que os epitopos são derivados. As formas alergénicas para produzir a resposta de DTH podem ser péptidos recombitope isolados, alergenos recombinantes ou alergenos naturais ou recombinantes quimicamente modificados (por exemplo, TRFP tratado com KOH). De novo, uma condição principal do alergeno/antigénio que provoca a DTH, é a ausência de reactividade de ligação com a IgE, ou se tal ligação ocorre, a ausência da libertação de mediadores por mastócitos ou basófilos e a capacidade de estimular as células T do indivíduo após administração. Uma DTH positiva é indicativa de células T do indivíduo específicas para os epitopos do péptido recombitope. Em geral, os péptidos recombitope são moléculas maiores do que os péptidos que compreendem um epitopo de célula T individual, e são assim vantajosos para o teste de DTH. Uma vez que os péptidos recombitope são moléculas maiores, crê-se que devem residir na pele (sítio da injecção) permitindo o influxo de linfócitos T e outras células que contribuem para a resposta de pele de DTH.

A reacção de ITH, que ocorre dentro de 15 a 30 minutos após o teste de pele, pode ser utilizada em combinação com uma reacção de DTH, com a reacção de DTH aparecendo 48-72 horas mais tarde. É a combinação destes ensaios, para dois tipos diferentes de reactividades relacionadas com doença alérgica, que representa uma nova formulação de diagnóstico. A aplicação à

-5074 488

IPC-027 pele durante o teste de pele com um péptido recombitope pode necessitar de um formato diferente para originar uma resposta versus outra (ITH vs DTH). Por exemplo, a reacção de ITH pode ser estimulada num indivíduo por teste de picada com uma muito pequena quantidade de uma composição terapêutica compreendendo um péptido recombitope (neste caso, um péptido recombitope reactivo com IgE), e um portador ou diluente farmaceuticamente aceitável. Para originar uma reacção de DTH, uma grande quantidade de uma composição terapêutica compreendendo um péptido recombitope (neste caso, um péptido recombitope não reactivo com IgE) e um portador ou diluente farmaceuticamente aceitável, é aplicada por injecção intradérmica ou na forma de teste de ponta (ambos são utilizados teste de TB por DTH). Ver Immunology (1985) Roitt, I.M.; Brostoff, J.; Male, D.K. (eds), C.V. Mosby Co., Gower Medicai Publishing, London, NY, pp. 19.2-19.18; pp. 22.1-22.10. A seguir ao diagnóstico com péptidos recombitope do invento, os indivíduos podem ser seleccionados para terapia de dessensibilização específica por definição, num único conjunto de teste, da reactividade de IgE e reactividade de epitopo T.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1 - Pêptido recombitope isolado caracterizado por compreender pelo menos duas regiões possuindo actividade estimuladora de célula T humana, compreendendo cada uma das referidas regiões pelo menos um epítopo de célula T de um alergeno proteico, sendo as referidas regiões derivadas dos mesmos alergenos proteicos ou de diferentes alergenos proteicos.
2 - Pêptido recombitope isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender pelo menos três regiões, possuindo cada uma delas actividade estimuladora de célula T humana.
3 - Pêptido recombitope isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as regiões estarem arranjadas numa configuração diferente de uma configuração que ocorre naturalmente das regiões num alergeno proteico.
4 - Pêptido recombitope isolado, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por as regiões serem derivadas do mesmo alergeno proteico.
5 - Pêptido recombitope isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as regiões serem derivadas do mesmo alergeno proteico e por as regiões estarem arranjadas numa configuração não contígua.
6 - Pêptido recombitope isolado, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por as regiões não contíguas serem definidas por aminoácidos e por o alergeno proteico do qual as regiões são derivadas compreender aminoácidos arranjados numa ordem sequencial desde um terminal amino até um terminal carboxi e por as referidas regiões não contíguas do recombitope estarem arranjadas numa ordem não sequencial.
7 - Pêptido recombitope isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por pelo menos duas das regiões

-52serem derivadas de diferentes alergenos proteicos

74 488

IPC-027 género.
8 - Péptido recombitope isolado, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o género ser seleccionado de entre o grupo constituído por: o género Dermatophagoides; o género Felis; o género Ambrósia; o género Lolium; o género Cryptomeria; o género Alternaria; o género Alder; o género bétula; o género Quercus; o género Olea; o género Artemisia; o género Plantago; o género Parietaria; o género Canine; o género Blattella; o género Apis; e o género Periplaneta.
9 - Péptido recombitope isolado, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por pelo menos duas regiões serem derivadas de espécies cruzadamente reactivas.
10 - Péptido recombitope isolado, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o péptido recombitope compreender pelo menos uma região derivada de Dermatophagoides pteronvss inus e pelo menos uma região derivada de Dermatophagoides farinae.
11 - Péptido recombitope isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por pelo menos duas das regiões serem derivadas de diferentes alergenos proteicos da mesma espécie.
12 - Péptido recombitope isolado, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por o péptido recombitope ser seleccionado de entre o grupo consistindo num péptido recombitope compreendendo:

a) uma região derivada de Der -P. I e uma região derivada de Der J2 II; b) uma região derivada de Der f I e uma região derivada de Der f II; c) uma região derivada de Amb a I e uma região derivada de Amb a II; d) uma região derivada de Lol I e uma região derivada de

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Lol p IX; e

e) uma região derivada de Crv ί I e uma região derivada de Crv i II.
13 - Péptido recombitope isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por pelo menos duas das regiões serem derivadas de diferentes alergenos proteicos do mesmo grupo.
14 - Péptido recombitope isolado, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o péptido recombitope compreender pelo menos uma região derivada de Der ρ I e uma região derivada de Der f I.
15 - Péptido recombitope isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por pelo menos duas das regiões serem derivadas de diferentes alergenos proteicos da mesma família.
16 - Péptido recombitope isolado, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por pelo menos duas das regiões serem cada uma derivada do grupo constituído por Amb a 1.1, Amb a 1.2, Amb a 1.3 e Amb a 1.4.
17 - Péptido recombitope isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por possuir actividade mínima estimuladora de imunoglobulina E.
18 - Péptido recombitope isolado, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por possuir actividade mínima estimuladora de imunoglobulina E.
19 - Péptido recombitope isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o péptido se ligar a imunoglobulina E numa extensão substancialmente menor do que aquela em que os alergenos proteicos, dos quais as regiões são derivadas, se ligam à referida imunoglobulina E.

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20 - Péptido recombitope isolado, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o péptido se ligar a imunoglobulina E numa extensão substancialmente menor do que aquela em que os alergenos proteicos, dos quais as regiões são derivadas, se ligam à referida imunoglobulina E.
21 - Péptido recombitope isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por não se ligar a imunoglobulina E específica para um alergeno proteico, ou se a ligação do péptido recombitope à referida imunoglobulina E ocorrer, essa ligação não resultar na libertação de mediadores a partir de mastócitos ou basófilos numa percentagem substancial de indivíduos sensíveis ao referido alergeno proteico.
22 - Péptido recombitope isolado, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por não se ligar a imunoglobulina E específica para um alergeno proteico, ou se a ligação do péptido recombitope à referida imunoglobulina E ocorrer, essa ligação não resultar na libertação de mediadores a partir de mastócitos ou basófilos numa percentagem substancial de indivíduos sensíveis ao referido alergeno proteico.
23 - Péptido recombitope isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por após administração a um indivíduo alérgico ao referido alergeno ou alergenos proteicos, dos quais o péptido recombitope é derivado, modificar a resposta alérgica do indivíduo ao referido alergeno ou alergenos proteicos.
24 - Péptido recombitope isolado, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por após administração a um indivíduo alérgico ao referido alergeno ou alergenos proteicos dos quais o péptido recombitope é derivado, modificar a resposta alérgica do indivíduo ao referido alergeno ou alergenos proteicos.
25 - Péptido recombitope isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as regiões serem

74 488

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-55seleccionadas do grupo consistindo no péptido X, péptido Y, péptido Z, péptido A, péptido B, e péptido C, como se seguem:

X KRDVDLFLTGTPDEYVEQVAQYKALPV

Y KALPVVLENARILKNCVDAKMTEEDKE

Z FFAVANGNELLLDLSLTKVNATEPER

A EEDKENALSLLDKIYTSPL

B MGEAVQNTVEDLKLNTLGR

C TEEDKENALSLLDKIYTSPL
26 - Péptido recombitope isolado, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por as regiões compreenderem o péptido X, péptido Y, e péptido Z, tais como apresentados na reivindicação 25.
27 - Péptido recombitope isolado, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por as regiões compreenderem o péptido X, péptido Y, péptido Z, péptido A e péptido B, cada péptido tal como apresentado na reivindicação 25.
28 - Péptido recombitope YZX, caracterizado por compreender o péptido Y, o péptido Z, o péptido X, em ordem sequencial, cada péptido como apresentado na reivindicação 25.
29 - Péptido recombitope isolado, de AYZXB, caracterizado por compreender o péptido A, o péptido Y, o péptido Z, o péptido Y e o péptido B por ordem sequencial, cada péptido como apresentado na reivindicação 25.
30 - Péptido recombitope isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por incluir um sítio proteolítico inserido entre pelo menos duas das referidas regiões.

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31 - Péptido recombitope isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as regiões compreenderem cada uma pelo menos dois epitopos de células T de um alergeno proteico.
32 - Péptido isolado, de um alergeno proteico do género Felis. caracterizado por o referido péptido compreender pelo menos um epitopo de célula T do referido alergeno proteico, compreendendo o referido péptido uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo na sequência de aminoácidos, como apresentada na reivindicação 25, do péptido A e péptido B.
33 - Sequência de ácido nucleico que codifica um péptido recombitope, ou o equivalente funcional da referida sequência de ácido nucleico, caracterizada por ser uma sequência que codifica um péptido recombitope de acordo com a reivindicação 1 .
34 - Sequência de ácido nucleico que codifica um péptido recombitope, ou o equivalente funcional da referida sequência de ácido nucleico, caracterizada por ser uma sequência que codifica um péptido recombitope de acordo com a reivindicação 5.
35 - Péptido recombitope isolado, caracterizado por compreender pelo menos duas regiões derivadas do mesmo ou de diferentes antigênios proteicos, possuindo o referido péptido recombitope actividade estimuladora de células T humanas.
36 - Péptido recombitope isolado, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado por os antigênios proteicos compreenderem alergenos proteicos.
37 - Péptido recombitope isolado, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado por compreender pelo menos três regiões.
38 - Péptido recombitope isolado, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado por as regiões estarem arranjadas numa configuração diferente de uma configuração das

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-57regiões do antigénio proteico, que ocorre naturalmente.
39 - Péptido recombitope isolado, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado por as regiões serem derivadas do mesmo antigénio proteico.
40 - Péptido recombitope isolado, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado por as regiões serem derivadas do mesmo antigénio proteico e por as regiões estarem arranjadas numa configuração não contígua.
41 - Péptido recombitope isolado, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado por as regiões não contíguas serem definidas por aminoácidos e por o antigénio proteico do qual as regiões derivaram, compreender aminoácidos arranjados numa ordem sequencial a partir de uma extremidade amino até uma extremidade carboxi, e por as referidas regiões não contíguas do péptido recombitope estarem arranjadas numa ordem não sequencial.
42 - Composição terapêutica caracterizada por compreender um péptido recombitope de acordo com a reivindicação 1 e um diluente ou portador farmaceuticamente aceitável.
43 - Composição terapêutica caracterizada por compreender um péptido recombitope de acordo com a reivindicação 5 e um diluente ou portador farmaceuticamente aceitável.
44 - Composição terapêutica caracterizada por compreender um péptido recombitope de acordo com a reivindicação 7 e um diluente ou portador farmaceuticamente aceitável.
45 - Composição terapêutica caracterizada por compreender um péptido recombitope de acordo com a reivindicação 35 e um diluente ou portador farmaceuticamente aceitável.
46 - Composição terapêutica caracterizada por compreender um péptido recombitope de acordo com a reivindicação 36 e um

58diluente ou portador farmaceuticamente aceitável.

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IPC-027
47 - Composição terapêutica caracterizada por compreender um péptido recombitope de acordo com a reivindicação 40 e um diluente ou portador farmaceuticamente aceitável.
48 - Processo de concepção do péptido recombitope de acordo com a reivindicação 35, caracterizado por compreender os passos de:

a) rever a estrutura proteica conhecida de um antigénio;

b) dividir teoricamente o antigénio em pelo menos duas regiões peptídicas com os comprimentos desejados;

c) arranjar teoricamente as referidas, pelo menos duas, regiões peptídicas, para formar pelo menos um péptido recombitope em que as regiões peptídicas são rearranjadas numa ordem não contígua;

d) produzir pelo menos um péptido recombitope possuindo a configuração do, pelo menos um, péptido recombitope do passo (c); e

e) determinar se o referido, pelo menos um, péptido recombitope do passo (d) tem actividade estimuladora de célula T humana.
49 - Processo de acordo com a reivindicação 48, caracterizado por compreender ainda o passo de:

f) determinar se o péptido recombitope em que se verificou actividade estimuladora de célula T humana no passo (e) se liga à imunoglobulina E específica para o antigénio do passo (a).
50 - Processo de acordo com a reivindicação 48, caracterizado por no passo (b), o antigénio ser dividido em duas regiões sobrepostas com os comprimentos desejados.
51 - Processo de acordo com a reivindicação 48, caracterizado por ser conhecido pelo menos um epitopo da célula T do antigénio, ou pelo menos uma região do antigénio possuindo actividade estimuladora de célula T humana e por no passo (b), a referida região possuindo actividade estimuladora de célula T

Γί -. /s— '

-, Z/ ' /' —59—

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IPC-027 humana ou o referido epitopo da célula T serem utilizados como pelo menos uma das referidas regiões peptídicas.
52 - Processo de acordo com a reivindicação 48, caracterizado por no passo (b) o antigénio ser dividido em regiões de acordo com um algoritmo.
53 - Processo de acordo com a reivindicação 48, caracterizado por o antigénio proteico compreender um alergeno proteico e por o passo (b) compreender ainda produzir as referidas regiões peptídicas e determinar se as referidas regiões peptídicas se ligam à imunoglobulina E específica para o alergeno do passo (a), e se essas regiões peptídicas se ligam a IgE, quando essas ligações causam a libertação de mediadores pelos mastócitos ou basófilos e por no passo (c) as regiões peptídicas que se ligam à imunoglobulina E específica para o alergeno do passo (a) e causam a libertação de mediadores pelos mastócitos ou basófilos não estarem incluídas nas regiões peptídicas arranjadas para formar o péptido recombitope (pelo menos um).
54 - Péptido recombitope isolado, caracterizado por compreender pelo menos dois epitopos de células T derivados do mesmo ou de diferentes antigénios proteicos.
55 - Péptido recombitope isolado, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado por compreender pelo menos três epitopos de células T.
56 - Composição caracterizada por compreender pelo menos dois péptidos recombitope isolados, compreendendo cada um dos referidos péptidos recombitope pelo menos dois epitopos de células T derivados do mesmo ou de diferentes antigénios proteicos.
57 - Composição caracterizada por compreender pelo menos dois péptidos recombitope isolados, compreendendo cada um dos referidos péptidos recombitope pelo menos duas regiões,

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IPC-027 possuindo cada um actividade estimuladora de célula T humana, compreendendo cada uma das referidas regiões pelo menos um epitopo de células T de um antigénio proteico, sendo as referidas regiões derivadas do mesmo ou de diferentes antigénios proteicos.
58 - Composição caracterizada por compreender pelo menos dois péptidos recombitope isolados, compreendendo cada um dos referidos péptidos recombitope pelo menos duas regiões derivadas do mesmo ou de diferentes antigénios proteicos, possuindo cada um dos referidos péptidos recombitope actividade estimuladora de célula T humana.
59 - Péptido recombitope isolado, caracterizado por compreender pelo menos duas regiões, possuindo cada uma actividade estimuladora de célula T humana, compreendendo cada uma das referidas regiões pelo menos um epitopo de célula T de um antigénio proteico.
60 - Péptido recombitope isolado, de acordo com a reivindicação 59 caracterizado por o antigénio proteico ser um autoantigénio.
61 - Péptido recombitope isolado, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado por o autoantigénio ser seleccionado do grupo consistindo de: insulina; proteína mielina básica; factor rh; receptores de acetilcolina; receptores de células de tiróide; proteínas da base da membrana; proteínas da tiróide; PM-1; descarboxilase do ácido glutâmico (64 K); e carboxipeptidase H.
62 - Péptido recombitope isolado, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado por as regiões estarem arranjadas numa configuração diferente de uma configuração das regiões de um antigénio proteico, que ocorre naturalmente.
63 - Péptido recombitope isolado, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado por as regiões estarem

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IPC-027

-61arranjadas numa configuração não contígua.
64 - Péptido recombitope isolado, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado por as regiões não contíguas estarem definidas por aminoácidos, e o antigénio proteico do qual as regiões derivam compreenderem aminoácidos arranjados numa ordem sequencial da extremidade amino para a extremidade carboxi e por as referidas regiões não contíguas do péptido recombitope estarem arranjadas numa ordem não sequencial.
65 - Péptido recombitope isolado, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado por não se ligar a imunoglobulina específica para o referido antigénio proteico numa percentagem substancial de indivíduos sensíveis ao referido antigénio proteico.
66 - Péptido recombitope isolado, de acordo com a reivindicação 60 caracterizado por as regiões estarem arranjadas numa configuração diferente da configuração das regiões de um antigénio proteico, que ocorre naturalmente.
67 - Péptido recombitope isolado, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado por as regiões estarem arranjadas numa configuração não contígua.
68 - Péptido recombitope isolado, de acordo com a reivindicação 67, caracterizado por as regiões não contíguas serem definidas por aminoácidos e por o antigénio proteico do qual as regiões derivam compreender aminoácidos arranjados numa ordem sequencial de uma extremidade amino para uma extremidade carboxi e por as referidas regiões não contíguas do péptido recombitope estarem arranjadas numa ordem não sequencial.
69 - Péptido recombitope isolado, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado por não se ligar a imunoglobulina específica para o referido autoantigénio numa percentagem substancial de indivíduos sensíveis ao referido antigénio proteico.

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IPC-027
70 - Sequência de ácido nucleico que codifica um péptido recombitope ou o equivalente funcional da referida sequência de ácido nucleico, caracterizada por codificar um péptido recombitope de acordo com a reivindicação 59.
71 - Composição terapêutica caracterizada por compreender um péptido recombitope da reivindicação 65 e um portador ou diluente farmaceuticamente aceitável.
72 - Composição terapêutica caracterizada por compreender um péptido recombitope da reivindicação 63 e um portador ou diluente farmaceuticamente aceitável.
73 - Composição terapêutica caracterizada por compreender um péptido recombitope da reivindicação 67 e um portador ou diluente farmaceuticamente aceitável.
74 - Composição terapêutica caracterizada por compreender um péptido recombitope da reivindicação 69 e um portador ou diluente farmaceuticamente aceitável.
75 - Composição caracterizada por compreender pelo menos dois péptidos recombitope isolados, compreendendo cada um dos referidos péptidos recombitope pelo menos duas regiões, possuindo cada uma actividade estimuladora de célula T humana, compreendendo as referidas regiões pelo menos um epitopo de célula T de um antigénio proteico.
76 - Processo de determinação em indivíduos da presença de imunoglobulinas específicas para um antigénio proteico e a capacidade das células T dos indivíduos para responder ao(s) epitopo(s) de células T do referido antigénio proteico, caracterizado por compreender os passos de:

a) combinação de uma primeira amostra de sangue ou pelo menos de uma porção de uma primeira amostra de sangue obtida de um indivíduo com o referido antigénio proteico ou uma sua porção, ou uma forma modificada do referido antigénio proteico ou uma sua porção, cada um dos quais liga imunoglobulinas

74 488 IPC-027 específicas para o referido antigénio proteico, sob condições apropriadas para a ligação de componentes do sangue ao referido antigénio proteico, antigénio proteico modificado ou uma porção de quaisquer dos referidos antigénios;

b) determinação da ocorrência da ligação;

c) combinação de uma segunda amostra de sangue ou de uma segunda porção da referida primeira amostra de sangue obtida de um indivíduo em que foi verificada a ligação de componentes do sangue no passo (b), com um péptido recombitope compreendendo pelo menos duas regiões derivadas do referido antigénio proteico, possuindo o referido péptido recombitope actividade estimuladora de células T humanas para o referido antigénio proteico e não se ligando a imunoglobulinas específicas para o referido antigénio proteico numa percentagem substancial de uma população de indivíduos sensíveis ao antigénio; e

d) determinação da ocorrência da estimulação das células T.
77 - Composição caracterizada por compreender pelo menos dois péptidos isolados seleccionados do grupo consistindo do péptido X; péptido Y; péptido Z; péptido A; péptido B; e péptido C, cada um como apresentado na reivindicação 25.
78 - Composição de acordo com a reivindicação 77 caracterizada por os referidos dois péptidos isolados compreenderem péptido X e péptido Y.
79 - Péptido recombitope isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as regiões serem seleccionadas do grupo consistindo num péptido compreendendo todos os resíduos de aminoácido 84-106 da MPB humana ou uma sua porção; um péptido compreendendo todos os resíduos de aminoácido 84-102 da MBP humana ou uma sua porção; um péptido compreendendo todos os resíduos de aminoácido 89-101 de MPB humana ou uma sua porção; um péptido compreendendo todos os resíduos de aminoácido 140-172 da MPB humana ou uma sua porção; e um péptido compreendendo todos os resíduos de aminoácido 143-168 da MPB humana ou uma sua porção.

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80 - Composição caracterizada por compreender pelo menos dois péptidos isolados, sendo os referidos péptidos seleccionados do grupo consistindo de um péptido compreendendo todos os resíduos de aminoácido 84-106 da MPB humana ou uma sua porção; um péptido compreendendo todos os resíduos de aminoácido 84-102 da MBP humana ou uma sua porção; um péptido compreendendo todos os resíduos de aminoácido 89-101 de MPB humana ou uma sua porção; um péptido compreendendo todos os resíduos de aminoácido 140-172 da MPB humana ou uma sua porção; e um péptido compreendendo todos os resíduos de aminoácido 143-168 da MPB humana ou uma sua porção.