DE69233720T2 - Verfahren zum Entwurf von Rekombitopen Peptiden - Google Patents

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • T-Lymphozyten können sowohl die spezifischen als auch die nicht spezifischen Effektormechanismen der Immunantworten vermitteln und regulieren. CD4+-T-Lymphozyten bieten Hilfe für die Antikörperproduktion und sezernieren Cytokine, die das Wachstum von anderen T-Zellen sowie das Wachstum und die Differenzierung von anderen Immunzellen wie z. B. Monozyten und Granulozyten modulieren. Funktionale und biochemische Untersuchungen haben gezeigt, dass die Erzeugung von zellulären Immunantworten von den Antigenrezeptoren auf T-Zellen abhängen, die Peptidfragmente von fremden Proteine erkennen, die mit Produkten des Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) assoziiert sind, die auf antigenpräsentierenden Helferzellen exprimiert werden. Jüngste Fortschritte in der Technologie haben es möglich gemacht, antigenspezifische humane und Maus-T-Zelllinien und Klone in vitro effizient zu kultivieren. Außerdem ist es jetzt möglich, große Mengen an Proteinantigenen oder ihren Fragmenten unter Verwendung von rekombinanter DNA-Technologie oder Festphasen-Peptidsynthesen zu produzieren. So haben in den letzten Jahren mehrere Forschungsgruppen damit begonnen, die linearen Aminosäuresequenzen von antigenen Proteinen zu bestimmen, die von T-Zellen im Zusammenhang mit MHC erkannt werden (T-Zell-Epitope).
  • Peptide, die von einer Vielzahl an Proteinantigenen abstammen, einschließlich bakterieller und viraler Pathogene, Autoantigene, Allergene und anderer experimenteller Antigene wie z. B. Hühnerei-Lysozym (HEL), Ovalbumin (OVA) und Lambda-Repressor (cl), wurden auf die Fähigkeit, antigenspezifische T-Zellen zu stimulieren, untersucht. Von einem breiten Spektrum an Peptiden wurde berichtet, dass sie als T-Zell-Epitope dienen. Zum Beispiel wurde bei den Aminosäureresten 324–339 von OVA (Shimonkevitz, R. et al., J. Immunol. 133: 2167 (1984)), den Aminosäureresten 74–96 von HEL (Shastri, N. et al., J. Exp. Med. 164: 882–896 (1986)) und den Aminosäureresten 12–26 des Lamba-Repressors (cl) (Lai, M.-Zet al., J. Immunol. 139: 3973–3980 (1987)) gezeigt, dass sie effizient ganze proteinstimulierte T-Zellen initiieren. Bei einem vom Hepatitis B-Oberflächenantigen abstammenden Peptid (Aminosäurereste 19–33 von HBsAg) wurde kürzlich gezeigt, dass es T-Zellantworten in einer Mehrheit von menschlichen Subjekten stimuliert, die mit einem rekombinanten Hepatitis B-Vakzin immunisiert wurden (Schad, V. C. et al. Seminars in Immunol. 3: 217–224 (1991)). Ein 65 kD-Protein des mykobakteriellen Hauptantigens wurde ebenfalls Epitop kartiert (Lamb, J. R. et al., EMBO J., 6(5): 1245– 1249 (1987)). Es wurden T-Zell-Epitope in den Peptiden identifiziert, die aus den Aminosäureresten 112–132 und 437–459 des 65 kD-Proteins bestehen. Basisches Myelinprotein (MBP), ein Autoantigen, das experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) induziert und vermutlich das Autoantigen bei Multipler Sklerose (MS) ist, wurde ebenfalls Epitop kartiert, und zwar sowohl bei humanen (Ota, K. et al., Nature, 346: 183–187 (1990)) als auch bei Nagetiersystemen (Zamvil et al., Nature 324: 258–260 (1986)). Ota et al. haben ein Haupt-T-Zell-Epitop identifiziert, dass von MS-Patienten erkannt wurde, die Aminosäurereste 84–102 von MBP. Es wurden auch Nebenepitope (Aminosäurereste 143–168, 61–82, 124–42 und 31–50 von MBP) beschrieben, die von T-Zellen von MS-Patienten erkannt wurden. Zamvil et al. haben gezeigt, dass die Aminosäurereste 1–11 von MBP das/die Haupt-T-Zell-Epitop(e) enthalten, die in anfälligen Nagetierstämmen EAE verursachen.
  • Erst vor kurzem wurden T-Zell-Epitope, die in allergenen Proteinen vorkommen, beschrieben (O' Hehir, R. et al., Ann. Rev. Immunol. 9: 67–95 (1991)). Es wurde nachgewiesen, dass einige Peptide, die vom Hausstaubmilben-Allergen Der p I abstammen, T-Zell-reaktiv sind (Thomas, W. R., et al. In Epitopes of Atopic Allergens Proceedings of Workshop from XIV Congress of the European Academy of Allergy and Clinical Immunology. Berlin (Sept 1989) pp. 77–82; O' Hehir, R. E., et al., Annual Review Immunology, 9: 67–95 (1991); Stewart, G. A., et al., In: Epitopes of Atopic Allergens, Proceedings of Workshop from XIV Congress of the European Academy of Allergy and Clinical Immunology, Berlin (Sept. 1989) pp 41–47; und Vessel, H. et al. In: T Cell Activation in Health and Disease: Discrimination Between Immunity and Tolerance. Conference 22–26 (Sept 1990) Trinity College, Oxford U. K.). Es wurde auch von einem T-Zell-stimulierenden Peptid berichtet, dass von den Aminosäureresten 54–65 des Amb a I-Allergens aus Ambrosia artemisiifolia abstammt (Rothbard, J. B. et al., Cell, 52: 515–523 (1988)). Unter Verwendung eines Panels von T-Zellklonen, die von einem auf Weidelgras (Ryegras) allergischen Individuum abstammten, wiesen Perez et al. nach, dass innerhalb der Aminosäurereste 191–210 des Proteinallergens Lol p I T-Zell-Epitope enthalten sind (Perez, M. et al., J. Biol. Chem., 265(27): 16210–16215 (1990)).
  • WO91/06571 offenbart ein Verfahren zum Entwerfen von isolierten Peptiden mit T-Zellen stimulierender Aktivität, umfassend die Schritte: (i) Überprüfen der bekannten Proteinstruktur eines Proteinallergens; (ii) Unterteilen des Proteinallergens in min destens zwei Regionen; iii) Bestimmen, ob Peptide, die diesen mindestens zwei Regionen entsprechen, T-Zellen stimulierende Aktivität besitzen.
  • Verfahren zum Entwerfen von rekombitopen Peptiden, isolierten Peptiden mit T-Zellen stimulierender Aktivität, bei denen das Proteinantigen, auf das das Individuum empfindlich ist, unbekannte oder schlecht definierte T-Zell-Epitope hat (z. B. einige oder die gesamten Peptidregionen des Proteinantigens, die auf das Proteinantigen humane T-Zellen stimulierende Aktivität haben, wurden nicht durch standardmäßige biologische T-Zell-Techniken definiert, z. B. Current Protocols in Immunology, herausgegeben von Coligan, J. E. et al., Volume 1, (1991), oder die genauen humanen T-Zell-Epitope des Proteinantigens wurden nicht mittels Feinkartierungstechniken definiert). Gemäß einem Verfahrens wird die bekannte Proteinstruktur eines Allergens oder eines anderen Proteinantigens überprüft und das Allergen oder das andere Antigen wird theoretisch in mindestens zwei Peptidregionen von gewünschter Länge unterteilt. Mit theoretisch ist etwas gemeint, dass nicht tatsächlich stattfindet, sondern eher ein gedanklicher Prozess ist, der z. B. auf dem Papier oder im Kopf passiert. Diese Unterteilung kann willkürlich sein, kann gemäß einem Algorithmus erfolgen oder kann vollständig oder teilweise auf Regionen des Proteinantigens erfolgen, von denen bekannt ist, dass sie T-Zellen stimulierende Aktivität, vorzugsweise humane T-Zellen stimulierende Aktivität aufweisen. Wenn nur wenige Regionen eines Proteinantigens, die T-Zellen stimulierende Aktivität haben, bekannt sind, oder wenn alle Regionen des Proteinantigens, die humane T-Zellen stimulierende Aktivität haben, unbekannt sind, werden vorzugsweise mindestens 50% und mehr bevorzugt das gesamte Protein in Peptidregionen von gewünschter Länge unterteilt. Die Peptidregionen werden dann theoretisch angeordnet, um mindestens ein rekombitopes Peptid zu bilden, in dem die Regionen in einer nicht zusammenhängenden Reihenfolge neu angeordnet sind. Anschließend wird mindestens ein rekombitopes Peptid mit einer neu angeordneten Konfiguration hergestellt und die Fähigkeit des rekombitopen Peptids, humane T-Zellen zu stimulieren, wird bestimmt. In einer weiteren Ausführungsform wird die Fähigkeit eines rekombitopen Peptids, das nachweislich eine humane T-Zellen stimulierende Aktivität besitzt, untersucht, um seine Fähigkeit zur Bindung von für das Allergen oder das andere Antigen spezifischem Immunglobulin zu bestimmen, oder es wird auf die Abwesenheit von weiteren unerwünschten Eigenschaften (z. B. Proteaseaktivität) untersucht.
  • Kurze Beschreibung der Abbildungen
  • 1 ist die Nucleinsäuresequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz der Kette 1 des humanen T-Zell-reaktiven Katzenproteins (TRFP), einschließlich der Leadersequenzen A und B.
  • 2 ist die Nucleinsäuresequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz der Kette 2 von TRFP, einschließlich einer Leadersequenz.
  • 3 ist eine graphische Darstellung, die die Antwort von T-Zellen zeigt, die aus gegen Katzen allergischen Patienten isoliert und mit affinitätsgereinigtem TRFP stimuliert wurden, auf überlappende TRFP-Peptide, die mittels der in eine Rangfolge gebrachten Summe der Peptidantworten analysiert wurde.
  • 4 ist die Aminosäuresequenz von Peptid X, Peptid Y, Peptid Z, Peptid A und Peptid B von TRFP, wobei jedes Peptid mindestens ein T-Zell-Epitop von TRFP enthält.
  • 5 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion eines rekombitopen Peptids YZX unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion-(PCR-)Techniken.
  • 6 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion eines rekombitopen Peptids AYZXB unter Verwendung von PCR-Techniken.
  • 7 sind die Nucleinsäuresequenzen der Oligonucleotide C, D, E, F, G, H und I, die zur Konstruktion des rekombitopen Peptids YZX verwendet wurden, und der Oligonucleotide J, K, L, M, N und O, die zur Konstruktion des rekombitopen Peptids AYZXB verwendet wurden.
  • 8 ist die Nucleinsäuresequenz (unter Verwendung von Expressionscodons von E. coli) und die abgeleitete Aminosäuresequenz, die das rekombitope Peptid YZX enthält. Eine Thrombin-Spaltungsstelle ist gezeigt.
  • 9 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion eines rekombitopen Peptids YZX unter Verwendung von PCR-Techniken mit aus TRFP isolierter cDNA als Matrize.
  • 10 sind die Nucleinsäuresequenzen von Primern, die zur Konstruktion der rekombitopen Peptide XZY, YXZ und ZXY verwendet wurden.
  • 11 ist eine graphische Darstellung der Aminosäuresequenz der einzelnen Primer, die zur Konstruktion der rekombitopen Peptide XZY, YXZ und ZXY verwendet wurden.
  • 12 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion eines rekombitopen Peptids, das von Phospholipase A2 abstammt, welche schlecht definierte T-Zell-Epitope aufweist.
  • 13 ist eine Darstellung der Ergebnisse von SDS/PAGE-Western-Immunoblot-Analysen, mit denen die Bindung von humanem IgE, das aus einem gegen Katzen allergischen Individuum gewonnen wurde, an verschiedene Proteinproben, einschließlich der rekombitopen Peptide XYZ, XZY, YXZ, YZX, ZXY und ZYX, nachgewiesen wurde.
  • 14 ist eine graphische Darstellung der Ergebnisse von ELISA-Analysen, die die Bindung von humanem IgE, das aus einem gegen Katzen allergischen Individuum gewonnen wurde, an verschiedene Proteinproben, einschließlich der rekombitopen Peptide XYZ, XZY, YXZ, YZX, ZXY und ZYX erläutern.
  • 15a, 15b und 15c sind graphische Darstellungen, die die Antworten von T-Zelllinien aus drei Patienten zeigen, die in vitro mit TRFP, rekombitopem Peptid YXZ oder rekombitopem Peptid YZX stimuliert wurden, und auf Antworten auf verschiedene Peptide analysiert wurden.
  • 16 ist eine graphische Darstellung, die Antworten von murinen T-Zellen zeigt, die mit rekombitopem Peptid YZX immunisiert und auf Antwort in vitro auf Kulturen mit dem rekombitopen Peptid YZX analysiert wurden, gemessen durch IL-2-Produktion.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Entwerfen von isolierten Peptiden, die rekombitope Peptide genannt werden, mit T-Zellen stimulierender Aktivität, wie z. B. der Induktion von T-Zellproliferation, Lymphokinsekretion und/oder T-Zell-Anergie/Tolerisierung. Rekombitope Peptide haben vorzugsweise humane T-Zellen stimulierende Aktivität und sind bei der Diagnose und Behandlung von Überempfindlichkeit bei einem Individuum auf ein Proteinallergen, Autoantigen oder ein anderes Proteinantigen von Nutzen. Im Allgemeinen enthalten bevorzugte rekombitope Peptide mindestens zwei Regionen, die von dem gleichen oder von unterschiedlichen Proteinallergenen oder anderen Proteinantigenen abstammen, wobei jede Region vorzugsweise eine humane T-Zellen stimulierende Aktivität besitzt, nachgewiesen durch standardmäßige biologische T-Zell-Techniken, und somit mindestens ein T-Zell-Epitop enthält. Um die genauen T-Zell-Epitope durch, zum Beispiel, Feinkartierungstechniken zu bestimmen, können die Peptidregionen, die mindestens ein T-Zell-Epitop enthalten, das mittels standardmäßiger biologischer T-Zell-Techniken definiert wurde, durch Addition oder Deletion von Aminosäureresten entweder am Amino- oder am Carboxyterminus der Peptidregionen modifiziert und untersucht werden, um eine Veränderung der T-Zellreaktivität am modifizierten Peptid nachzuweisen. Des Weiteren können, wenn bei zwei oder mehr Peptidregionen, die ein Überlappungsgebiet teilen, humane T-Zellen stimulierende Aktivität gefunden wird, nachgewiesen durch standardmäßige biologische T-Zell-Techniken, zusätzliche Peptide hergestellt werden, die alle oder einen Teil solcher Peptidregionen enthalten, und diese zusätzlichen Peptide können durch das oben erwähnte Feinkartierungsverfahren untersucht werden. Als Folge der Feinkartierung kann ein Satz an humanen T-Zell-Epitopen hergestellt werden, die Aminosäurereste enthalten, die für die T-Zell-Erkennung wesentlich sind.
  • Rekombitope Peptide können mittels DNA-Rekombinationstechniken in einer Wirtszelle, die mit einer für ein solches rekombitopes Peptid kodierenden Nucleinsäuresequenz transformiert ist, oder mittels chemischer Synthese, oder in bestimmten, beschränkten Situationen mittels chemischer Spaltung eines Proteinallergens oder eines anderen Proteinantigens hergestellt werden. Wenn durch solche Rekombinationstechniken hergestellt, werden Wirtszellen, die mit einer für ein rekombitopes Peptid kodierenden Nucleinsäure transformiert wurden, in einem für die Zellen geeigneten Medium kultiviert und rekombitope Peptide können aus dem Zellkulturmedium, den Wirtszellen oder beiden unter Verwendung von Techniken gereinigt werden, die auf dem Gebiet für die Reinigung von Peptiden oder Proteinen bekannt sind, einschließlich Ionenaustauschchromatographie, Isoelektrischer Fokussierung, Gelfiltrationschromatographie, Ultrafiltration, Elektrophorese oder Immunreinigung mit Antikörpern, die für das rekombitope Peptid, das Proteinallergen oder das andere Antigen, von dem das rekombitope Peptid abstammt, oder einen Teil davon spezifisch sind. Somit schafft ein Aspekt dieser Erfindung ein rekombitopes Peptid, das in einer Wirtszelle hergestellt wird, die mit einer für ein rekombitopes Peptid kodierenden Nucleinsäuresequenz oder dem funktionalen Aquivalent der Nucleinsäuresequenz transformiert wurde. Erfindungsgemäße rekombitope Peptide werden isoliert, so dass das rekombitope Peptid im Wesentlichen frei von zellulärem Material oder Kulturmedium ist, wenn es mittels DNA-Rekombinationstechniken hergestellt wird, oder im Wesentlichen frei von chemischen Precursoren oder anderen Chemikalien ist, wenn es chemisch synthetisiert oder mittels chemischer Spaltung eines Proteinallergens oder eines anderen Proteinantigens erhalten wurde.
  • Um die bevorzugten erfindungsgemäßen rekombitopen Peptide zu erhalten, die mindestens zwei T-Zell-Epitope eines Proteinallergens oder eines anderen Proteinantigens oder mindestens zwei Regionen enthalten, wobei jede Region mindestens ein T-Zell-Epitop eines Proteinallergens oder eines anderen Antigens enthält, werden die T-Zell-Epitope oder die Regionen, die T-Zell-Epitope) enthalten, in einer solchen Konfiguration angeordnet, dass sie sich von einer natürlich vorkommenden Konfiguration von T-Zell-Epitopen oder Regionen in dem Allergen oder Antigen unterscheidet. Zum Beispiel können die T-Zell-Epitope oder Regionen, die T-Zell-Epitop(e) enthalten, in einer nicht zusammenhängenden Konfiguration angeordnet werden, und können vorzugsweise vom gleichen Proteinallergen oder dem anderen Antigen abstammen. Nicht zusammenhängend ist definiert als eine Anordnung von Aminosäuren, die T-Zell-Epitope oder T-Zell-Epitop(e) enthaltende Regionen umfassen, die sich von der einer Aminosäuresequenz unterscheidet, die in dem Proteinallergen oder dem anderen Proteinantigen, aus dem die Epitope oder Regionen abstammen, vorkommt. Des weiteren können die nicht zusammenhängenden T-Zell-Epitope oder T-Zell-Epitope enthaltenden Regionen in einer nicht sequenziellen Reihenfolge angeordnet werden (z. B. in einer Reihenfolge, die sich von der Reihenfolge der Aminosäuren des nativen Proteinallergens oder des anderen Proteinantigens unterscheidet, aus dem T-Zell-Epitope oder T-Zell-Epitope) enthaltende Regionen abstammen, in denen Aminosäuren von einem Aminoterminus zu einem Carboxyterminus angeordnet sind). Ein bevorzugtes rekombitopes Peptid enthält mindestens 15%, mehr bevorzugt mindestens 30%, noch mehr bevorzugt mindestens 50% und am meisten bevorzugt bis zu 100% der T-Zell-Epitope eines Proteinallergens oder des anderen Proteinantigens.
  • In der Situation, in der die T-Zell-Epitope des Proteinallergens oder des anderen Proteinantigens unbekannt oder schlecht definiert sind (z. B. wurden einige oder alle der Peptidregionen des Proteinantigens, die humane T-Zellen stimulierende Aktivität besitzen, nicht mittels standardmäßiger biologischer T-Zell-Techniken definiert oder die genauen humanen T-Zell-Epitope des Proteinantigens wurden nicht mittels Feinkartierungstechniken definiert), kann ein rekombitopes Peptid durch Überprüfen der bekannten Proteinstruktur eines Allergens oder eines anderen Antigens und der theoretischen Aufteilung des Allergens oder Antigens in mindestens zwei Peptidregionen mit gewünschter Länge erhalten werden. Zum Beispiel kann die Proteinsequenz des Allergens oder des anderen Antigens systematisch in mindestens zwei nicht überlappende Peptidregionen mit gewünschten Längen oder mindestens zwei überlappende Peptidregionen mit gewünschten Längen unterteilt und theoretisch angeordnet werden, um mindestens ein rekombitopes Peptid zu bilden, in dem die mindestens zwei Regionen in einer nicht zusammenhängenden und vorzugsweise nicht sequenziellen Reihenfolge neu angeordnet werden. Diese Unterteilung in Peptidregionen kann willkürlich sein, kann gemäß einem Algorithmus erfolgen oder kann vollständig oder teilweise auf Regionen des Proteinantigens basieren, von denen bekannt ist, dass sie mindestens ein T-Zell-Epitop enthalten.
  • Wenn nur wenige der Peptidregionen des Proteinallergens oder des anderen Proteinantigens, die mindestens ein T-Zell-Epitop enthalten, bekannt sind oder wenn alle Regionen des Proteinallergens oder des anderen Proteinantigens, die humane T-Zellen stimulierende Aktivität besitzen, unbekannt sind, werden vorzugsweise mindestens 50% der gesamten Proteinsequenz des Proteinallergens oder des anderen Proteinantigens und mehr bevorzugt die gesamte Proteinsequenz des Proteinallergens oder des anderen Proteinantigens aufgeteilt und zu einem oder mehreren rekombitopen Peptiden neu angeordnet. Der Zweck hinter der Verwendung eines solch großen Anteils der Proteinsequenz des Proteinantigens bei der Bildung des rekombitopen Peptids ist der, dass das resultierende rekombitope Peptid mindestens 15%, mehr bevorzugt mindestens 30%, noch mehr bevorzugt mindestens 50% und am meisten bevorzugt mindestens 100% der T-Zell-Epitope des Proteinantigens enthält. Wenn die wenigen Peptidregionen des Proteinantigens, von denen jeweils bekannt ist, dass sie mindestens ein T-Zell-Epitop enthalten, den oben genannten Anteil der T-Zell-Epitope des Proteinantigens darstellen, und solche Peptidregionen nicht mindestens 50% der gesamten Proteinsequenz des Proteinantigens ausmachen, ist es selbstverständlich nicht notwendig, einen so großen Anteil der gesamten Proteinsequenz bei der Bildung des rekombitopen Peptids zu verwenden. Gemäß diesem Verfahren können rekombitope Peptide anschließend rekombinant oder synthetisch hergestellt werden und die Fähigkeit des rekombitopen Peptids, humane T-Zellen zu stimulieren, kann bestimmt werden. Wenn das rekombitope Peptid Regionen enthält, die von einem Proteinallergen abstammen, können die einzelnen Peptidregionen hergestellt und untersucht werden, um zu bestimmen, welche Regionen für das Allergen spezifisches Immunglobulin E binden, und welche dieser Regionen die Freisetzung von Mediatoren (z. B. Histamin) aus Mastzellen oder Basophilen verursachen würden. Diejenigen Peptidregionen, bei denen eine Bindung von Immunglobulin E und die Verursachung einer Freisetzung von Mediatoren aus Mastzellen oder Basophilen bei mehr als ungefähr 10–15% der untersuchten allergischen Seren nachgewiesen wurde, werden vorzugsweise nicht in die Peptidregionen eingeschlossen, die für die Bildung von rekombitopen Peptiden angeordnet werden.
  • Die Konstruktion eines rekombitopen Peptids, das von Phospholipase A2 abstammt, einem Hauptallergen aus dem Gift der Honigbiene, kann als ein erläuterndes Beispiel der Konstruktion eines rekombitopen Peptids verwendet werden, wenn die Proteinstruktur eines Proteinantigens bekannt ist, aber die T-Zell-Epitope unbekannt oder schlecht definiert sind. Phospholipase A2 ist aus 134 Aminosäuren zusammengesetzt, wie mittels cDNA-Klonierung definiert (Kuchler, K. et al. Eur. J. Biochem. 184: 249–254). Diese Aminosäuresequenz kann in Regionen unterteilt werden, wobei jede vorzugsweise 20 bis 35 Aminosäurereste enthält und jede Region vorzugsweise mit einer weiteren Region um etwa 10 Aminosäuren überlappt (siehe 12). Obwohl 12 die gesamte Proteinsequenz des Proteins unterteilt in Regionen zeigt, kann die gesamte Sequenz, die zur Bildung von mindestens einem rekombitopen Peptid verwendet wird, im Wesentlichen weniger als die gesamte Proteinsequenz sein. Um die Möglichkeit des Einschlusses von T-Zell-Epitopen in dem konstruierten rekombitopen Peptid zu maximieren, können Überlappung und Länge jeder Region so entworfen werden, dass das Vorhandensein von unter Verwendung von Algorithmen vorhergesagten T-Zell-Epitopen beibehalten wird (Rothbard, J. und Taylor, W. R. EMBO J. 7: 93–100 (1988); Berzofsky, J. A. Philos. Trans R. Soc. Lond. 323: 535–544 (1989)). Vorzugsweise können humane T-Zell-Epitope innerhalb eines Proteinallergens unter Verwendung von bekannten spezifischen Aminosäureresten, die spezifisch HLA Klasse II binden, vorhergesagt werden. Des Weiteren kann, um die Wahrscheinlichkeit, dass das konstruierte rekombitope Peptid humanes allergenes IgE binden wird, zu minimieren, die Aminosäuresequenz des resultierenden rekombitopen Peptids unterschiedlich zu der der nativen Struktur von Phospholipase A, gemacht werden, indem die Regionen durcheinandergebracht werden und/oder indem aminoterminale Regionen oder carboxyterminale Regionen an das entgegengesetzte Ende des Moleküls umgesetzt werden (d. h. Aminosäurereste, die am Aminoterminus des nativen Proteins lokalisiert sind, können am Carboxyterminus des rekombitopen Peptids platziert werden). Ein ähnliches Verfahren kann verwendet werden, um ein rekombitopes Peptid zu konstruieren, das von einem Autoantigen mit bekannter Proteinstruktur aber mit undefinierten T-Zell-Epitopen wie zum Beispiel Glutaminsäure-Decarboxylase (z. B., Samama, J. P. und Mallet, J. Journal of Neurochemistry 54: 703–705 (1990)) oder Insulin abstammt (Joslin's Diabetes Mellitus. 12. Auflage, Hrsg. A. Marble et al., Lea & Febiger, Philadelphia, S. 67 (1985)), usw. In dieser Situation werden die Peptidregionen in einer Konfiguration angeordnet, die sich von einer natürlich auftretenden Konfiguration der Regionen in dem Autoantigen unterscheidet, um eine unerwünschte Eigenschaft des Autoantigens wie zum Beispiel Immunglobulinbindung oder enzymatische Aktivität zu eliminieren.
  • Rekombitope Peptide, die mindestens zwei Regionen enthalten, die von einem Allergen oder einem anderen Antigen abstammen, werden untersucht, um solche rekombitopen Peptide mit T-Zellen stimulierender Aktivität zu bestimmen (d. h. Proliferation, Lymphokinsekretion und/oder Induktion der T-Zell-Anergie/Tolerisierung), und die somit mindestens ein T-Zell-Epitop enthalten. Zum Beispiel kann die humane T-Zellen stimulierende Aktivität untersucht werden, indem T-Zellen, die von einem gegenüber einem Proteinallergen oder Proteinantigen sensiblen Individuum erhalten wurden (d. h. einem Individuum, das eine Immunantwort auf das Proteinallergen oder Proteinantigen aufweist), mit einem rekombitopen Peptid, das von einem Proteinallergen oder Antigen abstammt, kultiviert werden, und das Vorhandensein von T-Zellproliferation als Antwort auf das rekombitope Peptid bestimmt wird. Wie im Detail in den Beispielen beschrieben, können Stimulationsindizes für T-Zellantworten auf rekombitope Peptide als die maximalen Zählimpulse pro Minute (CPM, counts per minute) als Antwort auf das rekombitope Peptid geteilt durch die CPM des Kontrollmediums berechnet werden. In dieser Anmeldung wird die humane T-Zellen stimulierende Aktivität durchgängig als ein Stimulationsindex von mindestens 2,0 definiert. Ein Stimulationsindex von mindestens 2,0 wird als positiv für die Zwecke der Definierung von rekombitopen Peptiden betrachtet, die als immuntherapeutische Mittel von Nutzen sind. Bevorzugte rekombitope Peptide haben einen Stimulationsindex von mindestens 2,5, mehr bevorzugt von mindestens 3,5 und am meisten bevorzugt von mindestens 5,0.
  • Außerdem binden bevorzugte, erfindungsgemäße rekombitope Peptide, die von Proteinallergenen abstammen, nicht Immunglobulin E (IgE) oder binden IgE in einem wesentlich geringeren Ausmaß als das/die Proteinallergen(e), von denen die Peptide abstammen, IgE bindet/binden. Die Hauptkomplikationen einer standardmäßigen Immuntherapie sind systemische Antworten wie Anaphylaxie. Immunglobulin E ist ein Vermittler für anaphylaktische Reaktionen, die eine Folge der Bindung und Vernetzung von Antigen mit IgE auf Mastzellen oder Basophilen und der Freisetzung von Vermittlern (z. B. Histamin, Serotonin, eosinophile chemotaktische Faktoren) sind. Somit könnte Anaphylaxie vermieden werden, indem ein rekombitopes Peptid, das kein IgE bindet, verwendet wird, oder wenn das rekombitope Peptid IgE bindet, eine derartige Bindung nicht zur Freisetzung von Vermittlern (z. B. Histaminen, usw.) aus Mastzellen oder Basophilen führt. Außerdem sind rekombitope Peptide, die eine minimale IgE stimulierenden Aktivität haben, für therapeutische Wirksamkeit besonders erwünscht. Minimale IgE stimulierende Aktivität bezieht sich auf eine IgE-Produktion, die geringer ist als die Menge an IgE-Produktion und/oder IL-4-Produktion, die durch das gesamte Proteinallergen stimuliert wird.
  • Ein erfindungsgemäßes aus einem Proteinallergen stammendes, rekombitopes Peptid kann bei Verabreichung an ein Individuum, das auf das Proteinallergen empfindlich reagiert, die allergische Antwort des Individuums auf das Allergen modifizieren. Insbesondere können rekombitope Peptide, die mindestens zwei T-Zell-Epitope eines Proteinallergens oder mindestens zwei, von einem Proteinallergen stammende Regionen enthalten, wobei jede Region vorzugsweise mindestens ein T-Zell-Epitop enthält, bei Verabreichung an ein Individuum, das gegen das Allergen empfindlich ist, die T-Zellantwort des Individuums auf das Allergen modifizieren. So wie hierin verwendet, kann Modifizierung der allergischen Antwort eines Individuums, das gegen ein Proteinallergen empfindlich ist, als Nicht-Empfindlichkeit oder Verminderung der Symptome auf das Allergen definiert werden, so wie mittels standard mäßiger klinischer Verfahren bestimmt (siehe z. B. Varney et al., British Medical Journal 302: 265–269 (1990)).
  • Als Folge der hierin beschriebenen Arbeit wurden rekombitope Peptide hergestellt, die von Proteinallergenen oder anderen Proteinantigenen abstammen und T-Zellen stimulierende Aktivität besitzen oder vorzugsweise zwei Regionen enthalten, die jeweils mindestens ein T-Zell-Epitop aufweisen. Man nimmt an, dass T-Zell-Epitope an der Initiierung und Aufrechterhaltung der Immunantwort auf ein Proteinallergen oder ein anderes Proteinantigen beteiligt sind, das jeweils für die klinischen Symptome einer Allergie oder einer anderen Erkrankung verantwortlich ist. Diese T-Zell-Epitope lösen vermutlich frühe Ereignisse auf dem Niveau der T-Helferzellen aus, indem sie an ein geeignetes HLA-Molekül auf der Oberfläche einer antigenpräsentierenden Zellen binden und die betreffende T-Zell-Subpopulation stimulieren. Diese Ereignisse (ihren zu T-Zellproliferation, Lymphokinsekretion, lokalen Entzündungsreaktionen, Rekrutierung von zusätzlichen Immunzellen an der Stelle und Aktivierung der B-Zell-Kaskade, was zur Produktion von Antikörpern führt. Ein Isotyp dieser Antikörper, IgE, ist von grundlegender Bedeutung für die Entwicklung von allergischen Symptomen und seine Produktion wird früh in der Ereigniskaskade, auf dem Niveau der T-Helferzellen, durch die Art der sezernierten Lymphokine beeinflusst. Ein T-Zell-Epitop ist das Grundelement oder die kleinste Erkennungseinheit für einen T-Zell-Rezeptor, wobei das Epitop die Aminosäuren enthält, die für die Rezeptorerkennung notwendig sind, und kann in der Aminosäuresequenz des Proteins zusammenhängend und/oder nicht zusammenhängend sein. Ein T-Zell-Epitop, so wie hierin verwendet, hat einen Stimulationsindex von mindestens 2,0, mehr bevorzugt von mindestens 2,5, noch mehr bevorzugt von mindestens 3,5 und am meisten bevorzugt von mindestens 5,0. Aminosäuresequenzen, die solche T-Zell-Epitope nachahmen und die allergische Antwort auf Proteinallergene modifizieren, sind innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung.
  • Exposition von Patienten gegenüber rekombitopen Peptiden der vorliegenden Erfindung, die von Proteinallergenen oder anderen Proteinantigenen abstammen, können geeignete T-Zell-Subpopulationen anergisieren oder tolerisieren, so dass sie gegenüber dem Proteinallergen oder dem anderen Antigen unreaktiv werden und nicht mehr an der Stimulierung einer Immunantwort bei einer solchen Exposition teilnehmen. Außerdem kann die Verabreichung eines rekombitopen Peptids der vorliegenden Erfindung, das von einem Proteinallergen abstammt, das Lymphokin sekretionsprofil im Vergleich zur Exposition gegenüber dem natürlich vorkommenden Proteinallergen oder einem Teil davon modifizieren (z. B. führt sie zu einer Verminderung von IL-4 und/oder einem Anstieg von IL-2). Darüber hinaus kann die Exposition gegenüber dem rekombinanten Peptid T-Zell-Subpopulationen beeinflussen, die normalerweise an der Reaktion auf das Allergen teilnehmen, so dass diese T-Zellen von der/den Stelle(n) der normalen Exposition gegenüber dem Allergen (z. B. Nasenschleimhaut, Haut und Lunge) weg zu (einer) Stelle(n) der therapeutischen Verabreichung des rekombitopen Peptids gezogen werden. Diese Umverteilung der T-Zell-Subpopulationen kann die Fähigkeit des Immunsystems des Individuums, die übliche Immunantwort an der Stelle der normalen Exposition gegenüber dem Allergen zu stimulieren, verbessern oder vermindern, was zu einer Verminderung der allergischen Symptome führt.
  • Erfindungsgemäße rekombitope Peptide enthalten vorzugsweise mindestens zwei T-Zell-Epitope (z. B. enthält das rekombitope Peptid mindestens etwa acht Aminosäurereste und vorzugsweise mindestens fünfzehn Aminosäurereste). Andere erfindungsgemäße rekombitope Peptide enthalten mindestens zwei Regionen, die von den gleichen oder von verschiedenen Proteinallergenen oder anderen Proteinantigenen abstammen, wobei diese rekombitopen Peptide T-Zellen stimulierende Aktivität besitzen und jede Region vorzugsweise humane T-Zellen stimulierende Aktivität besitzt und demzufolge mindestens ein T-Zell-Epitop eines Proteinallergens oder eines anderen Proteinantigens enthält. Im Allgemeinen enthält jede solche Region eines rekombitopen Peptids mindestens etwa sieben Aminosäurereste von mindestens einem Proteinallergen. Jede einer solchen Region eines rekombitopen Peptids enthält vorzugsweise mindestens zwei T-Zell-Epitope (z. B. enthält das rekombitope Peptid mindestens etwa acht Aminosäurereste und vorzugsweise mindestens fünfzehn Aminosäurereste). Erfindungsgemäße rekombitope Peptide können so viele Aminosäurereste wie gewünscht enthalten und enthalten vorzugsweise mindestens etwa 7, mehr bevorzugt mindestens etwa 15, noch mehr bevorzugt mindestens etwa 30 und am meisten bevorzugt mindestens etwa 40 Aminosäurereste eines Proteinallergens oder eines anderen Proteinantigens. Eine Region eines rekombitopen Peptids enthält vorzugsweise bis zu 45 Aminosäurereste an Länge, mehr bevorzugt bis zu 40 Aminosäurereste an Länge und am meisten bevorzugt bis zu 30 Aminosäurereste an Länge, da Erhöhungen der Länge einer Region eines rekombitopen Peptids zu Schwierigkeiten bei der Peptidsynthese sowie eine Beibehaltung einer unerwünschten Eigenschaft zur Folge haben können (z. B. Immunglobulinbindung oder enzymatische Aktivität), aufgrund einer Aufrechterhaltung einer konformationellen Ähnlichkeit zwischen der Region und dem Proteinallergen oder dem anderen Proteinantigen, von dem sie abstammt. Wenn gewünscht, können die Aminosäuresequenzen der Regionen hergestellt und durch einen Linker miteinander verbunden werden, um die Sensitivität gegenüber der Prozessierung durch antigenpräsentierende Zellen zu erhöhen. Ein solcher Linker kann jegliche Nicht-Epitop-Aminosäuresequenz oder ein anderes geeignetes verknüpfendes oder verbindendes Mittel sein.
  • Wenn rekombitope Peptide von Proteinallergenen abstammen, können sie mindestens zwei Regionen enthalten, die von verschiedenen Proteinallergenen aus der gleichen Gattung abstammen, wie z. B. der Gattung Dermatophagoides, der Gattung Felis, der Gattung Ambrosia, der Gattung Lolium, der Gattung Cryptomeria, der Gattung Alternaria, der Gattung Alder, der Gattung Betula, der Gattung Quercus, der Gattung Olea, der Gattung Artemisia, der Gattung Plantago, der Gattung Parietaria, der Gattung Canine, der Gattung Blattella, der Gattung Apis, and der Gattung Periplaneta. Außerdem können rekombitope Peptide mindestens zwei Regionen enthalten, die aus kreuzreaktiven Spezies abstammen, z. B. eine Region, die von Dermatophagoides pteronussinus abstammt, und eine Region, die von Dermatophagoides farinae abstammt. In einer weiteren Ausführungsform können die Regionen von der gleichen Spezies abstammen (z. B. stammt eine Region von Der p I ab und eine andere Region stammt von Der p II ab; eine Region stammt von Der f I ab und eine Region stammt von Der f II ab; eine Region stammt von Amb a I ab und eine Region stammt von Amb a II ab; eine Region stammt von Lol p I ab und eine Region stammt von Lol p IX ab; und eine Region stammt von Cry j I ab und eine Region stammt von Cry j II ab). Darüber hinaus können rekombitope Peptide mindestens zwei Regionen enthalten, die von verschiedenen Proteinallergenen aus der gleichen Gruppe abstammen, wie z. B. eine Region, die von einem Gruppe I-Proteinallergen von Dermatophagoides pteronussinus (d. h. Der p I) abstammt, und eine Region, die von einem Gruppe I-Proteinallergen von Dermatophagoides farinae (d. h. Der f I) abstammt. Alternativ können die Regionen von verschiedenen Proteinallergenen aus der gleichen Familie abstammen (z. B., Amb a 1.1, Amb a 1.2, Amb a 1.3 und Amb a 1.4). Besonders bevorzugte rekombitope Peptide zur Behandlung von Überempfindlichkeit auf Felis domesticus stammen von der Gattung Felis ab und enthalten Regionen, die aus den Peptiden X, Y, Z, A und B von TRFP, wobei die Aminosäuresequenzen von jedem Peptid in 4 gezeigt sind, und Modifizierungen davon ausgewählt werden, wie z. B. Peptid C, das eine Aminosäure-Addition an Peptid A und in 4 gezeigt ist. Bevorzugte rekombitope Peptide enthalten Peptid YZX und Peptid AYZXB. Durch die Anmeldung hindurch beziehen sich die Buchstaben X, Y, Z, A, B und C jeweils auf Peptid X, Peptid Y, Peptid Z, Peptid A, Peptid B und Peptid C und wenn die Buchstaben zusammen verwendet werden (z. B. YZX), bezieht sich das auf ein rekombitopes Peptid, das Peptid Y, Peptid Z und Peptid X in der angegebenen Sequenzreihenfolge enthält (d. h., YZX bezieht sich auf ein rekombitopes Peptid, das die Aminosäuresequenz von Peptid Y direkt gefolgt, ohne irgendwelche eingeschobenen Aminosäurereste, von der Aminosäuresequenz von Peptid Z, direkt gefolgt, ohne irgendwelche eingeschobenen Aminosäurereste, von der Aminosäuresequenz von Peptid X). Die erfindungsgemäßen rekombitopen Peptide, z. B. YZX, können zusätzliche Aminosäurereste entweder am Amino- oder am Carboxyterminus des rekombitopen Peptids enthalten.
  • Erfindungsgemäße rekombitope Peptide können von anderen Proteinantigenen außer Proteinallergenen abstammen, wenn eine Verstärkung oder Unterdrückung einer antigenspezifischen Immunantwort gewünscht wird. Zum Beispiel können Regionen mit humane T-Zellen stimulierender Aktivität eines bekannten Autoantigens, das an der Pathogenese einer Autoimmunerkrankung beteiligt ist, oder T-Zell-Epitope eines bekannten Autoantigens identifiziert und in einem rekombitopen Peptid kombiniert werden, um die Antikörperantwort auf das Autoantigen zu vermindern, die Effizienz zu stören und/oder die mit dem Immunkomplex verbundenen Nebenwirkungen vermindern. Um die T-Zell-Reaktivität des Autoantigen zu bewahren, könnten Regionen des Autoantigens mit humane T-Zellen stimulierender Aktivität mittels standardmäßiger biologischer T-Zell-Techniken definiert werden, oder wenn gewünscht, können genaue T-Zell-Epitope mittels Feinkartierungstechniken definiert werden, und es wird ein rekombitopes Peptid hergestellt, das mindestens zwei Regionen enthält, die jeweils humane T-Zellen stimulierende Aktivität aufweisen und jeweils mindestens ein T-Zell-Epitop enthalten. Zum Beispiel könnten, wenn drei Regionen mit humane T-Zellen stimulierender Aktivität oder drei T-Zell-Epitope in einem Autoantigen in einer sequentiellen und zusammenhängenden Reihenfolge 1, 2, 3 von einem Aminoterminus zu einem Carboxyterminus gefunden würden, sechs mögliche rekombitope Peptide, die jede Region oder jedes T-Zell-Epitop einmal verwenden, hergestellt werden, die die drei Regionen oder T-Zell-Epitope in verschiedenen Reihenfolgen enthalten (z. B. 213, 312,132, 321,123, 231). Diese sechs rekombitopen Peptide könnten auf die Fähigkeit, T-Zell-Aktivität zu stimulieren, und auf die Abwesenheit einer in dem Autoantigen vorkommenden unerwünschten Eigenschaft, z. B. der Unfähigkeit des/der rekombitopen Peptids/Peptide, Autoantikörper zu binden, untersucht werden. Alternativ können, wie vorher beschrieben, rekombitope Peptide aus einem Autoantigen konstruiert werden, ohne dass bekannt ist, welche Regionen T-Zellen stimulierende Aktivität besitzen oder welches die genauen T-Zell-Epitope sind. Die rekombitopen Peptide, die T-Zellen stimulieren und keine unerwünschten Eigenschaften des Autoantigens haben (z. B. in einem wesentlichen Anteil der gegenüber dem Autoantigen empfindlichen Individuen keine Antikörper binden), werden für die Verwendung als Immuntherapeutika oder diagnostische Mittel ausgewählt. In der Form einer therapeutischen Zusammensetzung würde das rekombitope Peptid in einem physiologisch unbedenklichen Vehikel in der Abwesenheit eines Adjuvans transportiert, um dem rekombitopen Peptid zu ermöglichen, antigenspezifische Toleranz gegenüber dem Autoantigen, von dem das Rekombitop abstammt, zu induzieren und jegliche potenziell schädigende Immunantwort zu regulieren. Unter den Autoantigenen, die für die Herstellung von rekombitopen Peptiden von Nutzen sind, sind Insulin, Glutaminsäure-Decarboxylase (64K), PM-1 und Carboxypeptidase bei Diabetes; basisches Myelinprotein bei Multipler Sklerose; rh-Faktor bei Erythroblastosis fetalis; Acetylcholin-Rezeptoren bei Myasthenia gravis; Thyroid-Rezeptoren bei Morbus Basedow, Basalmembran-Proteine beim Goodpasture-Syndrom; und Thyroid-Proteine bei Thyroiditis. Zum Beispiel können Regionen mit humane T-Zellen stimulierender Aktivität des basischen Myelinproteins (MBP), z. B. eine Region, die alle oder einen Teil der Aminosäurereste 84–106 und mehr bevorzugt 84–102 und mehr bevorzugt 89–101 des humanen MBP enthält, und eine Region, die alle oder einen Teil der Aminosäurereste 140–172 und mehr bevorzugt 143–168 des humanen MBP enthält, ein rekombitopes erfindungsgemäßes Peptid für die Verwendung bei der Behandlung von Multipler Sklerose enthalten.
  • Es ist auch möglich, die Struktur der rekombitopen Peptide für solche Zwecke wie einer Erhöhung der Löslichkeit, Verstärkung der therapeutischen oder vorbeugenden Wirksamkeit oder Stabilität (z. B. Haltbarkeitsdauer ex vivo und Beständigkeit gegenüber proteolytischem Abbau in vivo) zu modifizieren. Ein modifiziertes rekombitopes Peptid kann hergestellt werden, in dem die Aminosäuresequenz verändert wurde, wie z. B. durch Aminosäure-Substitution, Deletion oder Addition, um die Immunogenität und/oder Allergenizität zu modifizieren, oder an das ein Bestandteil für den gleichen Zweck addiert wurde. Zum Beispiel können die Aminosäurereste, die für die T-Zell-Epitopfunktion wesentlich sind, unter Verwendung von bekannten Techniken (z. B. Substitution von jedem Rest und Bestimmung des Vorhandenseins oder der Abwesenheit von T-Zellreaktivität) bestimmt werden. Diejenigen Reste, die nachweislich wesentlich sind, können modifiziert werden (z. B. durch Ersetzen durch eine andere Aminosäure, deren Gegenwart nachweislich die T-Zellreaktivität verstärkt), wie auch diejenigen, die nicht für T-Zellreaktivität erforderlich sind (zum Beispiel durch Ersetzen durch eine andere Aminosäure, deren Einbau die T-Zellreaktivität verstärkt, aber nicht die Bindung an den relevanten MHC vermindert). Ein weiteres Beispiel für eine Modifizierung von rekombitopen Peptiden ist die Substitution von Cysteinresten, vorzugsweise durch Alanin oder Glutaminsäure, oder alternativ durch Serin oder Threonin, um Dimerisierung über Disulfidbindungen zu minimieren. Um die Stabilität und/oder Reaktivität zu verstärken, können rekombitope Peptide auch modifiziert werden, so dass ein oder mehrere Polymorphismen in der Aminosäuresequenz eines Proteinallergens eingebaut werden, die eine Folge der natürlichen Allelvariationen sind. Außerdem können D-Aminosäuren, nicht natürliche Aminosäuren oder Nicht-Aminosäure-Analoga substituiert oder addiert werden, um ein modifiziertes Peptid innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung herzustellen. Darüber hinaus können rekombitope Peptide unter Verwendung des Polyethylenglykol-(PEG-)Verfahrens von A. Sehon und Mitarbeitern (Wie et al. supra) modifiziert werden, um ein mit PEG konjugiertes Peptid herzustellen. Modifizierungen von rekombitopen Peptiden können auch Reduktion/Alkylierung (Tarr in: Methods of Protein Microcharacterization. J. E. Silver Hrsg. Humana Press, Clifton, NJ, S. 155–194 (1986)); Acylierung (Tarr, supra): Veresterung (Tarr, supra); chemische Kopplung an einen geeigneten Träger (Mishell und Shiigi, Hrsg. Selected Methods in Cellular Immunology. WH Freeman, San Francisco, CA (1980); U.S. Patent 4,939,239 ); oder milde Formalinbehandlung umfassen (Marsh International Archives of Allergy and Applied Immunology 41: 199–215 (1971)).
  • Um die Reinigung zu vereinfachen und möglicherweise die Löslichkeit der rekombitopen Peptide zu erhöhen, ist es möglich, eine oder mehrere Reportergruppen an das Peptidgrundgerüst zu addieren. Zum Beispiel kann Polyhistidin an ein rekombitopes Peptid addiert werden, um das rekombitope Peptid auf immobilisierter Metallionen-Affinitätschromatographie zu reinigen (Hochuli, E. et al., Bio/Technology,. 6: 1321–1235 (1988)). Außerdem können, wenn gewünscht, spezifische Endoprotease-Spaltungsstellen zwischen einer Reportergruppe und Aminosäuresequenzen eines rekombitopen Peptids eingeführt werden, um die Isolierung der rekombitopen Peptide frei von irrelevanten Sequenzen zu erleichtern. Um ein Individuum gegenüber einem Proteinantigen erfolgreich zu desensibilisieren, kann es erforderlich sein, die Löslichkeit eines rekombitopen Peptids durch Addition von funktionellen Gruppen an das Peptid oder durch das nicht Einschließen von hydrophoben T-Zell-Epitopen oder Regionen, die hydrophobe Epitope enthalten, in die rekombinanten Peptide zu erhöhen.
  • Um möglicherweise eine korrekte Prozessierung von T-Zell-Epitopen innerhalb eines rekombitopen Peptids zu unterstützen, können anerkannte proteasesensitive Stellen rekombinant oder synthetisch zwischen Regionen hergestellt werden, die jeweils mindestens ein T-Zell-Epitop enthalten. Zum Beispiel können während der rekombinanten Konstruktion des rekombitopen Peptids geladene Aminosäurepaare wie z. B. KK oder RR zwischen Regionen innerhalb eines rekombitopen Peptids eingeführt werden. Das resultierende rekombitope Peptid kann gegenüber der Spaltung durch Cathepsin und/oder andere trypsin-ähnliche Enzyme empfänglich gemacht werden, um Teile des rekombitopen Peptids zu erzeugen, die ein oder mehrere T-Zell-Epitope enthalten. Außerdem können solche geladenen Aminosäurereste zu einer Erhöhung der Löslichkeit eines rekombitopen Peptids (führen.
  • Ortsgerichtete Mutagenese von für ein rekombitopes Peptid kodierender DNA kann für die Modifizierung der Struktur des rekombitopen Peptids verwendet werden. Solche Verfahren können PCR (Ho et al., Gene 77: 51–59 (1989)) oder die Totalsynthese von mutierten Genen (Hostomsky,. Z et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 161: 1056–1063 (1989)) umfassen. Um die bakterielle Expression zu verstärken, können die vorgenannten Verfahren in Verbindung mit anderen Verfahren verwendet werden, um die eukaryotischen Codons in für rekombitope Peptide kodierenden DNA-Konstrukten in solche umzuwandeln, die vorzugsweise in E. coli verwendet werden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch Nucleinsäuresequenzen bereit, die für die erfindungsgemäßen rekombitopen Peptide kodieren. Nucleinsäuresequenzen, die in einer beliebigen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können cDNA so wie hierin beschrieben sein, oder alternativ können sie eine beliebige Oligodeoxynucleotidsequenz mit der ganzen oder einem Teil einer hierin vorgestellten Sequenz oder deren funktionale Äquivalente sein. Solche Oligodeoxy nucleotidsequenzen können chemisch oder mechanisch unter Verwendung von bekannten Techniken hergestellt werden. Ein funktionales Äquivalent einer Oligonucleotidsequenz ist eine, die 1) eine Sequenz ist, die an ein komplementäres Oligonucleotid hybridisieren kann, an das die Oligonucleotidsequenz (oder die entsprechenden Sequenzteile) oder Fragmente davon hybridisiert, oder 2) die Sequenz (oder der entsprechende Sequenzteil) ist, die zu der Oligonucleotidsequenz komplementär ist, und/oder 3) eine Sequenz ist, die für ein Produkt kodiert (z. B. ein Protein, ein Polypeptid oder ein Peptid), das die gleichen funktionalen Eigenschaften des Produkts hat, das durch die Oligonucleotidsequenz (oder einen entsprechenden Sequenzteil) kodiert wird. Ob ein funktionales Äquivalent ein oder mehrere Kriterien erfüllen muss, wird von seiner Verwendung abhängen (z. B. wenn es nur als eine Sonde für Hybridisierung verwendet wird, muss es nur das erste oder zweite Kriterium erfüllen, und wenn es verwendet werden soll, um ein Peptid der vorliegenden Erfindung herzustellen, muss es nur das dritte Kriterium erfüllen).
  • Wie in den folgenden Beispielen beschrieben, wurden Ketten 1 und 2 des humanen T-Zellreaktiven Katzenproteins (TRFP) (1 und 2) rekombinant in E. coli exprimiert und gereinigt. T-Zell-Epitopstudien unter Verwendung von überlappenden Peptidregionen, die von der TRFP-Aminosäuresequenz abstammen, wurden verwendet, um multiple T-Zell-Epitope in jeder Kette von TRFP zu identifizieren. Wie im Detail in Beispiel 2 beschrieben, wurden DNA-Konstrukte zusammengebaut, in denen drei Regionen (als Peptid X, Peptid Y und Peptid Z bezeichnet), die jeweils mindestens ein humanes Haupt-T-Zell-Epitop von TRFP enthielten, in sechs möglichen Kombinationen verknüpft, um sechs DNA-Konstrukte herzustellen, die für rekombitope Peptide kodieren, die die drei Regionen in sechs unterschiedlichen Konfigurationen enthalten.
  • Da Peptid × 5 Aminosäuren an seinem Carboxyterminus mit 5 Aminosäuren am Aminoterminus von Peptid Y gemeinsam hat, hätten die rekombitopen Peptide XYZ und ZXY mit oder ohne Verdopplung der genannten 5 Aminosäuren konstruiert werden können (siehe 11, wo ZXY ohne Verdopplung der Sequenz aus 5 Aminosäuren konstruiert wurde). In den folgenden Beispielen wurden die rekombitopen Peptide zusammenhängend aufgebaut, ohne Verdopplung der Sequenz aus 5 Aminosäuren. Zusätzlich zu den drei Regionen X, Y und Z konnten auch weitere Regionen, die jeweils mindestens ein humanes T-Zell-Epitop enthalten, in die rekombitopen Peptide eingefügt werden und es wurden DNA-Konstrukte mit vier oder mehr Regionen (mit N! Konfigurationen, wobei N = Anzahl an Regionen) hergestellt. Alternativ können eine oder mehrere Regionen für Peptid X, Peptid Y oder Peptid Z substituiert werden, wie z. B. Peptid A oder B, wie in 4 dargestellt, um zum Beispiel rekombitopes Peptid AXY herzustellen.
  • Es werden detaillierte Protokolle für die Spaltung und Entfernung von fremden Sequenzen beschrieben, die zur Unterstützung der Reinigung an die rekombitopen Peptide addiert wurden. Gereinigte rekombitope Peptide wurden auf die Bindung von IgE von humanen, gegenüber Katzen allergischen Patienten auf Western Blots untersucht und mit der IgE-Bindung der rekombinanten Ketten 1 und 2 von TRFP verglichen. Es wurde ein ELISA durchgeführt, um die allergische IgE-Bindung an rekombitope Peptide bezogen auf natives TRFP, rekombinante Kette 1 und rekombinante Kette 2 zu untersuchen. Die hierin beschriebene Arbeit zeigt, dass die rekombitopen Peptide der vorliegenden Erfindung T-Zellen stimulierende Aktivität besitzen, obwohl ihre Epitopkonfiguration sich allgemein von der in der nativen TRFP-Proteinsequenz gefundenen unterscheidet. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Verwendung von rekombitopen Peptiden als Vorbeugungsmittel Mäuse gegenüber einer Antigenherausforderung durch natives TRFP, der rekombinanten Kette 1 oder Kette 2 von TRFP oder dem verwendeten rekombitopen Peptid unempfänglich macht.
  • Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert.
  • Beispiel 1 T-Zell-Epitop-Untersuchungen mit überlappenden TRFP-Peptiden
  • Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) wurden durch Ficoll-Hypaque-Zentrifugation von 60 ml heparinisiertem, peripherem Blut von gegen Katzen allergischen Patienten, die klinische Symptome der Katzen-Allergie zeigten und deren Hauttest auf Katzenextrakt positiv war, gereinigt. Es wurden 10 Millionen PBMC von jedem Patienten in 10 ml RPMI-1640 (Gibco), das 5% vereinigtes humanes AB-Serum enthielt und mit Glutamin, Penicillin, Streptomycin und HEPES-Puffer ergänzt war (vollständiges RPMI-1640), in der Gegenwart von 20 μg affinitätsgereinigtem nativen TRFP/ml der Kultur bei 37°C 7 Tage lang kultiviert. Lebensfähige Zellen wurden anschließend durch Ficoll-Hypaque-Zentrifugation gereinigt und weitere 2 Wochen lang in vollständigem RPMI-1640, das 5 Einheiten rekombinantes humanes IL-2/ml und 5 Einheiten rekombinantes humanes IL-4/ml enthielt, kultiviert. Die aus der Kultur resultierenden, ruhenden T-Zellen wurden anschließend in einem zweiten Proliferationsassay unter Verwendung einer 96-Well-Mikrotiterplatte untersucht, um die T-Zellantworten auf die verschiedenen TRFP-Peptide oder -Proteine (TRFP-Antigene) zu bewerten, wie in 3 gezeigt. Für das Assay wurden 2 × 104 ruhende T-Zellen in vollständigem RPMI-1640 3 Tage lang bei 37°C in der Gegenwart von 5 × 104 mit autologen PBMC (3500 Rads) als antigenpräsentierende Zellen mit verschiedenen Konzentrationen von einem der TRFP-Antigene in jedem Well in einer Menge von 200 μl pro Well kultiviert. Jeder Well erhielt anschließen 16 Stunden lang 1 μCi tritiummarkiertes Thymidin. Die eingebauten Zähler wurden auf Glasfaserfiltern gesammelt und für eine flüssige Sczintillationszählung verarbeitet. Die Stimulationsindizes für Antworten auf jedes Peptid wurden dann als die maximalen CPM als Antwort auf das Peptid geteilt durch die CPM des Kontrollmediums berechnet. Ein Stimulationsindex von 2,5 wurde als eine positive T-Zellantwort betrachtet. (In dieser Anmeldung wird die humane T-Zellen stimulierende Aktivität durchgängig als ein Stimulationsindex von mindestens 2,0 definiert. Der Stimulationsindex der T-Zell-Epitope oder Regionen, die für die Herstellung eines erfindungsgemäßen Rekombitops zu verwenden sind, beträgt jedoch mindestens 2,0, vorzugsweise mindestens 2,5, mehr bevorzugt mindestens 3,5 und am meisten bevorzugt mindestens 5,0.) Eine Zusammenfassung der Ergebnisse von 34 solcher Experimente ist in 3 dargestellt. Die fünf höchsten Peptidantworten auf den überlappenden Satz an TRFP-Peptiden, die Kette 1 und Kette 2 des TRFP abdecken, durch die T-Zelllinie, die von jedem Patienten abstammt, wurde eingestuft, wobei der höchsten positiven Antwort eine 5, der nächst höheren positiven Antwort eine 4 usw. zugeordnet wurde. Die Summe der für jedes Peptid erhaltenen Einstufung wurde dann berechnet und ist im Histogramm in 3 dargestellt. Diese Art von Analyse beleuchtet die relative Bedeutung der verschiedenen Regionen des TRFP-Moleküls bei der T-Zellantwort auf das intakte Protein. Die Ergebnisse deuten daraufhin, dass die Hauptregionen der T-Zellreaktivität in diesem Patientenpanel (in der Reihenfolge ihrer Bedeutung) in Fel-14.2 (Kette 1, Aminosäurereste 29–42), Fel-3.1 (Kette 1, Aminosäurereste 18–32), Fel-2 (Kette 1, Aminosäurereste 9–25), Fel-21 (Kette 1, Aminosäurereste 56–70), Fel-29 (Kette 1, Aminosäurereste 56–70), Fel-1.2 (Kette 1, Aminosäurereste 1–17), Fel-4 (Kette 1, Aminosäurereste 37–55), Fel-18 (Kette 2, Aminosäurereste 23–48), Fel-25 (Kette 2, Aminosäurereste 49–68) Fel-16 (Kette 2, Aminosäurereste 1–22) und Fel 23 (Kette 1, Aminosäurereste 51–66) eingeschlossen sind. Anschließend wurde ein Satz an Peptiden entworfen, um diese Regionen abzudecken. Teile von Fel-1.2, Fel- 2, Fel-3.1 und Fel-14.2 enthalten Peptid X (Kette 1, Aminosäurereste 7–33). Teile von Fel-3.1, Fel-14.2 und Fel-4 enthalten Peptid Y (Kette 1, Aminosäurereste 29–55). Teile von Fel-16, Fel-17 und Fel-18 enthalten Peptid Z (Kette 2, Aminosäurereste 14–39). Teile von Fel-4, Fel 21 und Fel-23 enthalten Peptid A. Teile von Fel-29 enthalten Peptid B. Peptide X, Y, Z, A und B sind in 4 dargestellt.
  • Beispiel 2 Konstruktion und Expression von rekombitopen Peptiden
  • PCR-Verfahren (Polymerasekettenreaktion) unter Verwendung von synthetischen Oligonucleotiden wurden verwendet, um DNAs zu konstruieren, die für die Sequenzen der Peptide X, Y und Z kodieren. Mit dem Ziel der Verstärkung der Expression in E. coli, wurden Codons in den Oligonucleotiden aus einer Tabelle von solchen ausgewählt, die in hoch exprimierenden E. coli-Proteinen vorwiegen. Sharp, P. M. et al., Nucl. Acids Res. 16: 8207 (1988). Die Oligonucleotide und PCR-Arbeitsschritte, die zur Konstruktion von rekombitopen Peptiden verwendet wurden, sind unten folgend detailliert beschrieben.
  • Oligonucleotide wurden mit von E. coli bevorzugten Codons entworfen, wie schematisch in 5 und 6 dargestellt. Diese Oligonucleotide (C, D, E, F, G, H, I, J, K, L, M, N und O, dargestellt in 7), wurden unter Verwendung eines Perkin Elmer/Cetus Gene Amp-Kits in zwei getrennten PCR-Reaktionen amplifiziert (PCR#1 bzw PCR#2, wobei PCR#1 zu der Synthese des 5'-Teils des für das rekombitope Peptid kodierende DNA-Moleküls führte und PCR#2 zu der Synthese des 3'-Teils des für das rekombitope Peptid kodierende DNA-Molekül führte). Diese Vorgehensweise wurde aufgrund des Vorhandenseins einer Sequenz (KALPV) sowohl in Peptid X als auch in Peptid Y gewählt, von der festgestellt wurde, dass sie bei der korrekten PCR-Erzeugung des Rekombitops YZX stört, wenn eine einzelne PCR-Reaktion mit den Oligonucleotiden (C–I) durchgeführt wurde. Bei der Herstellung des rekombitopen Peptids AYZXB, wie in 6 gezeigt, waren die in PCR#1 verwendeten Oligonucleotide N, J, K und C–I und die in PCR#2 verwendeten Oligonucleotide waren C–I und L, M, O. Bei der Herstellung des rekombitopen Peptids YZX, wie in 5 gezeigt, waren die in PCR#1 verwendeten Oligonucleotide C, D, E und F und die in PCR#2 verwendeten Oligonucleotide waren F, G, H und I. Jede Reaktionsmischung (10 μg) erzeugte die 5'-Hälfte bzw. die 3'-Hälfte der beabsichtigten YZX-Strkutur (5). Diese PCR-Mischungen wurden nach der Zugabe von Taq-Polymerase dem folgenden Programm aus Zyklen von Denaturierung, Hybridisierung und Polymerisierung unterzogen:
    SCHRITT # TEMPERATUR DAUER
    1 94°C 1 MINUTE
    2 50°C 1,5 MINUTEN
    3 75°C 2 MINUTEN
    4 WIEDERHOLUNG SCHRITTE 1–3 (4 MAL)
    5 94°C 1 MINUTE
    6 60°C 1,5 MINUTEN
    7 75°C 2 MINUTEN
    8 WIEDERHOLUNG SCHRITTE 5–7 (20 MAL)
    9 HALTEN BEI 4°C
  • Nach Vollendung der PCR#1- und PCR#2- Reaktionen bei der Konstruktion der YZX-Struktur, wurden Aliquots von jedem (100 pmol der 10 μg Gesamtreaktionsmischung; 1/100 Volumen) zu einer dritten PCR-Reaktionsmischung gegeben, die einen Satz aus 5'- und 3'-Primern enthielt (100 pmol der Primer C und I). Eine dritte PCR-Reaktion (PCR#3) wurde unter Verwendung dieser dritten PCR-Reaktionsmischung durchgeführt, wie vorher für die PCR-Reaktionen #1 und #2 beschrieben, außer dass die Hybridisierungstemperatur in Schritt 6 auf 65°C erhöht wurde. Der Abschluss von PCR#3 erzeugte die für das rekombitope Peptid YZX kodierende DNA. Das PCR#3-Reaktionsverfahren ähnelt dem in Horton, R. M., et al. Gene 77: 61 (1989) beschriebenen. Die gesamte in PCR#3 verwendete Reaktionsmischung wurde auf einem 2%igem Agarosegel fraktioniert und die Bande mit der richtigen Größe (230 bp) wurde aus dem Gelstreifen elektroeluiert und ausgefällt. Die isolierte, für das rekombitope Peptid YZX kodierende DNA wurde einer weiteren PCR-Reaktion unter Verwendung von überschüssigen 5'- und 3'-Amplifizierungsprimern (C und I) unterzogen. Dieses Endprodukt wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI verdaut und dann in den Vektor pET11d unter der Transkriptionskontrolle des Phagen T7 gn 10 lac 0-Fusionspromotors einkloniert. Studier, F. W. et al. Methods in Enzymol. 185: 60 (1990).
  • Ein für sechs aufeinander folgende Histidine kodierender Polylinker, (CAC)6, wurde "in-frame" an das 5'-Ende der für das rekombitope Peptid YZX kodierenden DNA einkloniert. Die „Sechs Histidin"-(H6- oder His6-)Leadersequenz ermöglicht die Reinigung des exprimierten rekombitopen Peptids unter Verwendung von QIAGEN NTA-Agarose (Diagen Gmbh, Düsseldorf, Deutschland), einem Ni2+-chelatisierenden Träger. Hochuli, E., et al., BioTechnology 6: 1321 (1988). Für ortsspezifische enzymatische Spaltungsstellen kodierende DNA (z. B. Thrombin, Faktor Xa, usw.) kann unter Verwendung von PCR-Verfahren zwischen die für das Polyhistidin (H6) kodierende Sequenz und die für das Grundgerüst des rekombitopen Peptids kodierende DNA eingefügt werden. Im Fall des rekombitopen Peptids YZX wurde eine Thrombinerkennungsstelle (LVPRGS) eingefügt. Uhlen, M., and Moks, T. Methods in Enzymol. 185: 129 (1990), Chang, J.-Y. Eur. J. Biochem., 151: 217 (1985).
  • Eine ähnliche Prozedur wie die, die oben für die Konstruktion von für das rekombitope Peptid YZX kodierender DNA beschrieben wurde, wurde für die Konstruktion von für die rekombitopen Peptide XYZ und ZYX kodierender DNA verwendet. Außerdem können andere T-Zell-Epitope enthaltende Peptide an die bestehende rekombitope Grundgerüststruktur, wie z. B. YZX (wie oben beschrieben hergestellt), addiert werden, was bei der Konstruktion des rekombitopen Peptids AYZXB der Fall war (siehe 6 und 7). Alternativ können T-Zell-Epitope enthaltende Peptide ohne die Verwendung eines bestehenden rekombitopen Grundgerüsts unter Verwendung der hier dargelegten Verfahren hergestellt werden. Um das rekombitope Peptid AYZXB herzustellen, wurden Oligonucleotidprimer (J–M) mit überlappenden Regionen an jedem Ende des rekombitopen Peptids YZX und ein 5'- und 3'-Amplifizierungsprimer (N und O) hergestellt. (Wie in 6 dargestellt, der verdunkelte Teil des Moleküls ist die überlappende Sequenz). Die PCR-Reaktionen wurden wie oben beschrieben durchgeführt. Das resultierende AYZXB-Fragment wurde isoliert und in den pET11d H6 TH-Vektor subkloniert.
  • Eine alternative Prozedur wurde für die Konstruktion der für die rekombitopen Peptide XZY, YXZ und ZXY kodierenden DNA verwendet. Jede der für die rekombitopen Peptide XZY, YXZ und ZXY kodierende DNA wurde an dem Codon, der für die N-terminalste Aminosäure des rekombitopen Peptids kodiert, mit der für die Leadersequenz MGHHHHHHEF kodierenden DNA ligiert (wobei die Aminosäuren EF durch die EcoRI-Restriktionsstelle GAATTC kodiert werden). Für die drei rekombitopen Peptide kodierende DNA-Segmente wurden mittels konsekutiver PCR zusammengesetzt, im Wesentlichen so wie bei Horton et al., (1989) Gene 77: 61–68, beschrieben. Die für die Peptide X, Y und Z kodierende DNA (gezeigt in 4) wurden aus den Fel d I cDNAs amplifiziert, die in Morgenstern et al., (1991) Proc. Nad. Acad. Sci. U.S.A. 88: 9690–9694 beschrieben wurden. Wie in 9 dargestellt, die ein spezifisches Beispiel für die Konstruktion der für das rekombitope Peptid XZY kodierenden Sequenz zeigt, wurden Oligonucleotidprimer mit einer DNA-Sequenz synthetisiert, die nicht nur ein spezifisches für die Peptide X, Y oder Z kodierendes DNA-Segment amplifizieren würde, sondern auch ein kleines Segment (9–18 Basenpaare) des für das benachbarte Peptid X, Y oder Z kodierenden DNA-Segments kovalent verknüpfen würde. Die PCR wurde unter Verwendung von VentTM-Polymerase gemäß den Anweisungen von New England Biolabs mit einem Amplifizierungsprogramm von 30 Zyklen durchgeführt (94°C 1 min/60°C 1 min 30 sec/72°C 1 min.). Die für PCR-Amplifizierungen verwendeten Primer sind in 10 dargestellt. Einzelne für rekombitope Peptide kodierende/Linker-DNA-Fragmente aus den PCR-Amplifizierungen wurden mittels präparativer Gelelektrophorese in 3 Gew.-% NuSieve-Agarose (FMC) gereinigt. Diese einzelnen PCR-Fragmente wurden dann in einer zweiten PCR-Reaktion verknüpft, um ein für XZY kodierendes DNA-Konstrukt zu bilden, wie in 9 und 11 dargestellt. Um diese PCR-Fragmente zu verknüpfen, wurden Gelstreifen aus 3%igem NuSieve, welche die anfänglichen PCR-Produkte enthielten, bei 70°C aufgeschmolzen und es wurde jeweils 1 μl davon zu einer VentTM PCR-Polymerase-Reaktion gegeben, bei der die 5'-RI(NH2-terminal) und 3'-Bam-Primer (COOH-terminal) eingesetzt werden.
  • Aufgrund der in dem Expressionsvektor pET11d (Studier et al. 1990) vorkommenden Restriktionsstellen wiesen alle äußeren 5'-Primer für EcoRI kodierende Stellen [GAATTC] in-frame mit der für die NH2-terminalen Aminosäuren kodierenden DNA des bestimmten Rekombitops auf, während die äußeren 3'-Primer für BamHI kodierende Stellen [GGATCC] aufwiesen. Für die rekombitopen Peptide XZY, YXZ und ZXY kodierende DNA-Konstrukte, die aus der sekundären PCR hergestellt wurden, wurden EcoRI/BamHI verdaut und mittels eines 0,5 Gew.-% SeaPlaque-Agarosegels (FMC) elektrophoriert. Gelstreifen, welche die DNA-Konstrukte enthielten, wurden bei 70°C aufgeschmolzen und zu einer Ligationsreaktion mit EcoRI/BamHI verdautem Bluescript KS Plasmid (Stratagene) gegeben. Die Ligation wurde in kompetente XL-1 Blue Bakterien (Stratagene) transformiert und rekombinante Plasmide mit Einschüben wurden mittels diagnostischem Restriktionsverdau nach Isolierung unter Verwendung des Qiatop-Kits (Diagen GmbH) identifiziert. Die Sequenz der Einschübe wurde mittels Dideoxy-Kettenterminationssequenzanalyse unter Verwendung eines Sequenase II-Kits (United States Biochemicals) überprüft.
  • Bluescript KS-Plasmide, die für die rekombitopen Peptideinschübe XZY, YXZ und ZXY kodierende DNA-Konstrukte mit korrekter Nucleotidsequenz beherbergen, wurden EcoRI/BamHI verdaut und die DNA-Konstrukte wurden aus 0,6% SeaPlaque-Gel für Subklonierung in den Expressionsvektor pET11d in frame mit der für den NH2-terminalen Leader MGHHHHHHEF kodierenden DNA isoliert, wie oben erwähnt. Die Konstrukte wurden in den EcoRI/BamHI verdauten pET11d His6 Amb a I.1 HR subkloniert. Diese Ligation dient dazu, das DNA-Konstrukt durch einen Einschub auszutauschen, in diesem Fall die cDNA des Hauptallergens aus Ambrosia, Amb a 1.1 (Rafnar et al., (1991) J. Biol. Chem. 226: 1229–1236). pET11d His Amb a 1.1 ΔHR wurde von pET11d in zwei Schritten abgeleitet. Zuerst wurde pET11d mit EcoRI/HinDIII verdaut, mit dem Klenow-Fragment von E. coli DNA-Polymerase geglättet und wieder an sich selbst ligiert, um pET11d ΔHR zu erzeugen: ein pET11d-Plasmid, dem die HindIII- und EcoRI-Stellen fehlen. Dann wurde pET11d His6 Amb a I.1 ΔHR durch Ausschneiden der H6 Amb aI.1-Kassette aus dem Expressionsvektor pET11d His6 Amb aI.1 als ein NcoI/BamHI-Fragment gebildet und in durch NcoI/BamHI verdautes pET11d ΔHR ligiert. Rekombinante Plasmide wurden mittels diagnostischem Restriktionsverdau nach Isolierung mittels eines Qiatip-Kits identifiziert und positive Plasmide wurden für die Expression in kompetente BL21-Bakterien [DE3] transformiert. BL21 [DE3] enthält ein rekombinantes Phage 1-Lysogen, DE3, mit einem Phage T7 RNA-Polymerasegen unter der Transkriptionskontrolle des lac UV5-Promotors. T7 RNA-Polymerasegen-Expression wird durch die Zugabe von IPTG induziert, die ihrerseits zu einer Expression auf hohem Niveau des rekombinanten Gens führt, das 3' des T7 gn 10 lac 0-Fusionspromotors des pET-Vektors subkloniert wurde.
  • PCR-abgeleitete DNA-Fragmente, die für (H6)-Fusionen von reifen Ketten 1 und 2 von TRFP kodieren und in pSEM (U.S.S.N. 662,276, eingereicht am 28. Februar 1991) subkloniert wurden, wurden ausgeschnitten und in pET11d ligiert. Dies wurde erreicht, indem BelI-Linker an die PstI-Stellen an den 3'-Enden der beiden Ketten geknüpft wurden, am 5'-Ende mit NcoI verdaut und das 5' NcoI/3' BelI-Fragment in mit 5' NcoI/3' BamHI verdautes pET11d insertiert wurde.
  • Die rekombinanten Peptidketten 1 und 2 von TRFP sowie die rekombitopen Peptide XYZ, XZY, YZX, ZYX, ZXY und YXZ wurden in E. coli exprimiert und im Wesentlichen wie unten dargelegt gereinigt. BL21 DE3-Wirtsbakterien, welche die von pET11d exprimierten DNA-Konstrukte beherbergen, wurden frisch auf eine BHI-Agarplatte (3,7 Gew.-% Difco Brain Heart Infusion; 1,5 Gew.-% Agar, Difco) ergänzt mit 200 μg/ml Ampicillin, ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert. Eine einzelne Kolonie wurde in 2 ml des BHI-Mediums mit 200 μg/ml Ampicillin (3,7 Gew.-% Brain Heart Infusion, Difco) inokuliert und mit 300 U/min bei 37°C geschüttelt, bis sie trübe, aber nicht gesättigt war. Die 2 ml-Kultur wurde dann zu 100 ml des BHI-Mediums mit 200 μg/ml Ampicillin gegeben, mit 300 U/min bei 37°C geschüttelt, bis sie trübe, aber nicht gesättigt war; an diesem Punkt wurde die Kultur in 18 × 250 ml (4,5 liter) des BHI-Mediums mit 200 μg/ml Ampicillin aufgeteilt und mit 300 U/min bei 37°C geschüttelt. Wenn die OD595 der Kultur 1,0 erreicht hatte, wurde die Expression der rekombinanten Peptide als (His)6-Fusionspeptide durch die Zugabe von IPTG zu 400 μM induziert und wurde zwei Stunden lang fortgesetzt.
  • Bakterien wurde mittels 15-minütigem Zentrifugieren mit 10.000 × g geerntet und in 1/50 Volumen von 6 M Guanidin·HCl, 100 mM 2-Mercaptoethanol, 100 mM NaPO4, 10 mM Tris bei pH 8,0 resuspendiert. Die rekombinante Kette 1 und Kette 2 sowie rekombitope Peptide (rekombinante Peptide) wurden mittels einstündigem kräftigem Schütteln der resuspendierten Bakterien bei 25°C extrahiert. Diese Suspension wurde einer Zentrifugation bei 15.000 × g unterzogen, der Üerstand entfernt, mit 10 N NaOH auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und auf eine NTA-Agarosesäule gegeben, die in 6 M Guanidin·HCl, 100 mM NaPO4, 10 mM Tris bei pH 8,0 äquilibriert wurde, bis die OD280 des ausfließenden Mediums den Hintergrund erreichte. Der Säulenpuffer wurden dann auf 8 M Harnstoff, 100 mM NaPO4, 10 mM Tris bei pH 8,0 umgestellt. Nach der quilibrierung wurde ein stringenteres Waschen mit 8 M Harnstoff, 100 mM NaOAc, 10 mM Tris pH 6,3 durchgeführt, bis die OD280 des ausfließenden Mediums den Hintergrund erreichte. Jedes rekombinante Peptid (als eine His6-Fusion) wurde dann in 8 M Harnstoff, 100 mM NaOAc, 10 mM Tris bei pH 4,5 eluiert und in Aliquots gesammelt, deren OD280-Profil überwacht wurde. Der Peptidpeak wurde dreimal in 500 Volumina PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) für Analyse gewaschen. Die Ausbeute lag im Bereich von 2 bis 25 mg der rekombinanten Peptid-(His6)-Fusion pro Liter mit einer Reinheit (bestimmt durch densitometrisches Scannen der SDS-Polyacrylamidgele) von im Allgemeinen mehr als 90%.
  • Die oben dargelegten rekombinanten Peptide (TRFP Kette 1, TRFP Kette 2, XYZ, YZX und ZYX) besitzen jeweils eine N-terminale Sequenz, die als eine Hilfe zur Reinigung und Expression addiert wurde (z. B. MGHHHHHHLVPRGS-). Diese irrelevante N-terminale Sequenz kann mittels proteolytischem Verdau entfernt werden, da die Sequenz eine Thrombinerkennungsstelle (LVPRGS) enthält, die zwischen der Polyhistidinsequenz und der rekombitopen Sequenz eingefügt wurde. (Siehe 8, der Pfeil gibt die Thrombin-Spaltungsstelle an.) Thrombin wurde verwendet, um die irrelevante Sequenz abzuspalten, sodass nur zwei zusätzliche Aminosäurereste, GS, am N-Terminus der TRFP Ketten 1 und 2 und der rekombitopen Peptide XYZ, YZX und ZYX verbleiben (Chang, J.-Y. Eur. Biochem. 151: 217–224 (1985)). Effiziente Spaltung des Fusionsproteins kann durch Verwendung eines Verhältnis von Protein zu Thrombin von 1000 zu 1 über 2 Stunden bei 25°C erreicht werden. Das Spaltungs- und Reinigungsschema, das zur Konstruktion des rekombitopen Peptids YZX verwendet wurde, ist unten dargestellt:
    • 1) rekombitopes Peptid MGHHHHHHLVPRGS-YZX
    • 2) Dialyse in PBS, pH 8,0
    • 3) Thrombinspaltung Peptid:Thrombin = 1000:1 25°C, 2 Stunden
    • 4) Reduktion mit 100 mM Dithiothreitol in 5 M Guanidin·HCL 37°C, 30 Minuten
    • 5) C4 Umkehrphasen-HPLC, pH 2,0
    • 6) Lyophilisierung
  • Analytische Umkehrphasen-HPLC wurde auf einer VYDAC 214 TP54-Säule mit einem Bettvolumen von 42 ml durchgeführt. Die Säule wurde mit 340 μg rekombitopem Peptid YZX beladen. Halbpräparative HPLC wurde unter Verwendung einer VYDAC 214 TP1022-Säule mit einem Bettvolumen von 95 ml und beladen mit 90 mg Protein durchgeführt. Der Gradient startete mit 0% bis 30% Acetonitril, das 0,1% Trifluoressigsäure enthielt, über die ersten 10 Minuten, gefolgt von 30% bis 43% Acetonitril über 15 Minuten. Die mobile Phase wurde 10 Minuten lang bei 43% Acetonitril gehalten. Das gereinigte rekombitope Peptid YZX wurde bei 43% Acetonitril eluiert. Die Spaltung und Reinigung wurde mittels SDS-PAGE überwacht. Die Identifizierung und Reinigung des rekombitopen Peptids YZX wurde mittels Proteinsequenzanalyse unter Verwendung eines Applied Biosystem Inc. Protein Sequenators Modell 477A bestimmt.
  • Beispiel 3 Direktes Bindungsassay von IgE an TRFP-Proteine und Rekombitope
  • Es wurde eine Western Immunoblot-Analyse der in Beispiel 2 hergestellten rekombitopen Peptide durchgeführt. Die Konzentration aller Proteinproben (z. B. TRFP, rekombinante Kette 1 von TRFP, rekombinante Kette 2 von TRFP, rekombitopes Peptid XYZ, rekombitopes Peptid XZY, rekombitopes Peptid YXZ, rekombitopes Peptid YZX, rekombitopes Peptid ZXY und rekombitopes Peptid ZYX) für die Gelelektrophorese wurde mittels des BCA-Verfahrens (Pierce Co.) bestimmt. Alle Proteinproben wurden mit 5 μg/Spur auf das Gel geladen, außer TRFP, das mit 10 μg/Spur geladen wurde. Die Proteintrennung wurde auf einem 15%igen Acrylamidgel durchgeführt und der Transfer wurde mittels Elektroblotting bei 1,5 Amps 1,5 Stunden lang auf Nitrocellulosepapier (Schleicher und Schuell, 0,1 Microns) in einer Hoefer-Apparatur gemäß dem Protokoll von Towbin, H., T. Stachlin, und J. Gordon, PNAS 76: 4350 (1979) durchgeführt. Die Proteine wurden mit Blotlösung (25 mM Tris-HCl 7,5, 0,171 M NaCl und 0,5 ml/l Tween 20) gespült. Der Blot wurde dann eine Stunde lang in einer Blockierlösung blockiert (1% Milch in Blotlösung). Plasma von Patient #417, das als Hauptantikörperquelle verwendet wurde, wurde in Blockierlösung auf 10% verdünnt und 1,5 Stunden lang mit nicht genutzter Nitrocellulose vorabsorbiert (2 cm × 15 cm). Das präparierte Humanplasma wurde dann über Nacht auf einem Rundschüttler mit dem Blotabschnitt des interessierenden Protein inkubiert. Im Anschluss an die erste Antikörperinkubation wurde der Blotabschnitt dreimal gewaschen, wobei jeder Waschvorgang eine fünfzehnminütige Inkubation in Blotlösung umfasste. Der zweite, für humanes IgE spezifische Antikörper (biotinyliertes Anti-Human-IgE der Ziege, KPL Inc.) wurde auf 1:2500 in Blotlösung verdünnt und die Inkubation zwei Stunden lang fortgesetzt. Überschüssiger zweiter Antikörper wurde nachfolgend mittels dreier 15-minütiger Inkubationen mit Blotlösung entfernt. Mit 125I iodiertes Streptavidin (Amersham) wurde auf 1:2500 in Blotlösung verdünnt und 1 Stunde lang mit Blots bei 2 μCi in einem 50 ml Inkubationsvolumen inkubiert. Die Blotabschnitte wurden anschließend mit Blotlösung gewaschen, bis die detektierbare Radioaktivität in der Abfalllösung auf Hintergrundniveau abnahm. Der Blotabschnitt wurden dann in Klarsichtfolie eingewickelt und über Nacht zum Filmen mit einer Cronex Verstärkerfolie bei –80°C ausgesetzt. Das in 13 dargestellte IgE-Bindungsmuster zeigt die Reaktivität von gereinigter TRFP-Kette 1 (Spur 1), Molekulargewicht 6 KD und Kette 2, ≥ 16 KD. Die rekombinante Kette 1 zeigt starke IgE-Bindung (Spur 2), während die Reaktivität der rekombinanten Kette 2 verglichen mit Kette 1 (Spur 3) vermindert ist. Die rekombitopen Peptide, die IgE-Bindung zeigen, sind die rekombitopen Peptide XYZ und ZXY (Spuren 4 bzw. 8). Alle anderen rekombitopen Peptide sind mittels dieses Analyseverfahrens bei der IgE-Bindung negativ.
  • Spezifische Bindung von IgE an rekombitope Peptide wurde auch in ELISA-Assays nachgewiesen. Assayplatten von Corning (#25882-96) wurden jeweils mit 10 ng/ml Beschichtungsantigen (d. h., TRFP, Kette 1 (rekombinante Kette 1 von TRFP), Kette 2 (rekombinante Kette 2 von TRFP), rekombitopes Peptid XYZ, rekombitopes Peptid XZY, rekombitopes Peptid YXZ, rekombitopes Peptid YZX, rekombitopes Peptid ZXY und rekombitopes Peptid ZYX), aufgeführt in 14, mit 50 μl/Well beschichtet und über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Beschichtungsantigene wurden entfernt und die Wells wurden mit 0,5% Gelatine in PBS, 200 μl/Well 2 Stunden lang bei Raumtemperatur blockiert. Plasma von Patient #669 wurde seriell mit PBS-Tween 20 (PBS mit 0,05% nichtionischem Detergens Tween-20 Sigma, St Louis MO) verdünnt und es wurden 100 μl/Well zugegeben und über Nacht bei 4°C inkubiert (Plasmaverdünnungen werden in zweifacher Ausführung getestet). Der zweite Antikörper (biotinyliertes Anti-Human-IgE der Ziege, 1:1000, Kirkegaard & Perry Laboratories Inc. Gaithersburg, MD) wurde mit 100 μl/Well eine Stunde lang bei Raumtemperatur zugegeben. Diese Lösung wurde entfernt und dann wurde Streptavidin-HRPO, 1:10.000 (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL) mit 100 μl/Well eine Stunde lang bei Raumtemperatur zugegeben (alle Wells wurden zwischen jedem Inkubationsschritt dreimal mit PBS-Tween gewaschen). Ein TMB-Membran-Peroxidase-Substratsystem (Kirkegaard & Perry Laboratories) wurde frisch gemischt und mit 100 μl/Well zugegeben. Die Farbe durfte sich 2–5 Minuten lang entwickeln. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 100 μl/Well 1 M Phosphorsäure gestoppt. Die Platten wurde auf einem Microplate EL 310 Autoreader (Biotek Instruments, Winooski, VT) mit einem 450 nm-Filter ausgelesen. Die Extinktionsniveaus der Wells in doppelter Ausführung wurden gemittelt. Die graphisch aufge tragenen Ergebnisse (log der Verdünnung gegen Extinktion) der ELISA-Assays sind in 14 dargestellt.
  • Die in 14 gezeigten ELISA-Ergebnisse zeigen ein hohes Niveau von IgE-Bindung an TRFP und eine etwas geringere Bindung an die rekombinante TRFP Kette 1 (Kette 1) und Kette 2 (Kette 2). Die beiden rekombinanten Ketten zeigen äquivalente Bindung mit dem IgE des spezifischen Patienten. Nur das rekombitope Peptid ZXY zeigt eine klare Reaktivität mit IgE. Die Bindung der anderen rekombitopen Peptide ist am oder nahe am Hintergrundniveau mit einem geringfügigen Signal vom rekombitopen Peptid XYZ. Um nachzuweisen, dass rekombitope Peptide in gleichen Mengen sowohl im ELISA- als auch im Western-Assay vorhanden waren, wurden Anti-Peptid-Antiseren als eine positive Kontrolle verwendet und diese ergaben recht äquivalente Signale bei allen Spuren und Wells mit rekombitopen Peptiden.
  • Beispiel 4 Humane T-Zell-Epitopantwort auf rekombitope Peptide
  • Die humane katzenallergische T-Zellantwort auf rekombitope Peptide wurde untersucht. Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) wurden durch Ficoll-Hypaque-Zentrifugation von 60 ml heparinisiertem, peripherem Blut von gegen Katzen allergischen Patienten, die klinische Symptome der Katzen-Allergie zeigten und deren Hauttest auf Katzenextrakt positiv war, gereinigt. Es wurden 10 Millionen PBMC eines einzelnen Patienten in 10 ml RPMI-1640 (Gibco), das 5% vereinigtes humanes AB-Serum enthielt und mit Glutamin, Penicillin, Streptomycin und HEPES-Puffer ergänzt war, in der Gegenwart von 10 μg affinitätsgerenigtem nativem TRFP/ml der Kultur oder mit 25 μg gereinigtem, ungespaltenem rekombitopem Peptid YXZ/ml der Kultur oder mit 25 μg gereinigtem, gespaltenem rekombitopem Peptid YZX/ml der Kultur bei 37°C 7 Tage lang kultiviert. Rekombitopes Peptid YZX wurde wie in Beispiel 2 beschrieben mit Thrombin gespalten. Lebensfähige Zellen wurden anschließend durch Ficoll-Hypaque-Zentrifugation gereinigt und für weitere 2 Wochen in RPMI-1640/5% AB-Serum, das 5 Einheiten rekombinantes humanes IL-2/ml und 5 Einheiten rekombinantes humanes IL-4/ml enthielt, kultiviert. Die ruhenden T-Zellen wurden dann in einem zweiten Proliferationsassay unter Verwendung einer 96-Well-Mikrotiterplatte untersucht, um die T-Zellantworten auf die verschiedenen TRFP-Proteine oder -Peptide (TRFP-Antigene) zu bewerten. Für das Assay wurden 2 × 104 ruhende T-Zellen 3 Tage lang bei 37°C in der Gegenwart von 2 × 104 mit autologem Estein-Barr-Virus transformierten B-Zellen (25.000 Rads) als antigenpräsentierende Zellen mit verschiedenen Konzentrationen an Antigen in 200 μl pro Well kultiviert. Jeder Well erhielt anschließend 16 Stunden lang 1 μCi tritiummarkiertes Thymidin. Die eingebauten Zähler wurden auf Glasfaserfiltern gesammelt und für eine flüssige Sczintillationszählung verarbeitet. Die Stimulationsindizes für Antworten auf jedes Antigen wurden dann als die maximalen CPM als Reaktion auf das Antigen geteilt durch die CPM des Kontrollmediums berechnet. Ein Stimulationsindex von 2,5 wurde als eine positive T-Zellantwort betrachtet. Eine Zusammenfassung der Ergebnisse von 3 solcher Experimente (Patienten 522, 519 und 386) ist in 15a, 15b und 15c dargestellt. Verglichen mit den in 15a und 15b gezeigten Experimenten, wurde in dem in 15c gezeigten Experiment Fel-1.4 (Kette 1, Aminosäurereste 6–17) durch Fel-1.2 (Kette 1, Aminosäurereste 1–17) ersetzt und Fel-33.3 (Kette 2, Aminosäurereste 26–40) wurde durch Fel-18 (Kette 2, Aminosäurereste 23–48) ersetzt, um den konstituierenden Aminosäuren der Peptide X und Z mehr zu ähneln. Außerdem wurde in diesem Experiment ein von der Y-Z-Verbindung des rekombitopen Peptids YZX abgeleitetes Peptid (Aminosäurereste 50–55 der Kette 1 von TRFP und Aminosäurereste 14–19 von Kette 2 von TRFP) und ein von der Z-X-Verbindung des rekombitopen Peptids YZX (Aminosäurereste 34–39 von Kette 2 von TRFP und Aminosäurereste 7–12 von Kette 1 von TRFP) abgeleitetes Peptid synthetisiert und untersucht. Diese Verbindungspeptide wurden hergestellt, um zu bestimmen, ob diese Gebiete des rekombitopen Peptids YZX ein nicht-natives Epitop erzeugen, wenn sie in dem rekombitopen Peptid gebildet werden.
  • Die Ergebnisse deuten daraufhin, dass T-Zellen von Patient 522, die mit nativem TRFP stimuliert wurden, positiv auf natives TRFP, rekombitopes Peptid YXZ, Peptide Y, Fel-14.2 und Fel-17 reagieren. Im Gegensatz dazu reagieren mit rekombitopem YXZ stimulierte T-Zellen weniger gut auf natives TRFP, reagieren jedoch in einem ähnlichen Ausmaß oder besser auf eine Anzahl an synthetischen Peptiden, die Teilen des TRFP-Moleküls entsprechen, einschließlich Peptid X, Peptid Y, Peptid Z, Fel-4, Fel-3.1, Fel-2, Fel-14.2, Fel-17 und Fel-18. Ähnliche Ergebnisse eines Experiments mit T-Zellen von Patient 519 sind in 15b dargestellt. Mit nativem TRFP stimulierte T-Zellen dieses Patienten reagieren auf natives TRFP, rekombitopes Peptid YXZ und Peptide Y. Wurden die Zellen des gleichen Patienten mit rekombitopen Peptid YXZ stimuliert, wurden positive Reaktionen auf natives TRFP, rekombitopes Peptid YXZ, Peptid X, Peptid Y, Peptid Z, Fel-3.1, Fel-4 und Fel-17 nachgewiesen. 15c zeigt ein ähnliches Experiment, das gereinigtes gespaltenes Rekombitop YZX als stimulierendes Antigen umfasste. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass T-Zellen von Patient 386, die mit nativem TRFP stimuliert wurden, positiv auf natives TRFP, rekombitopes Peptid YZX, Peptid X, Peptid Y, Fel-3.1 und Fel-14.2 reagieren. Im Gegensatz dazu reagieren mit rekombitopen YZX stimulierte T-Zellen in einem ähnlichen Ausmaß oder besser auf natives TRFP, rekombitopes Peptid YZX, Peptid X, Peptid Y, Fel-2, Fel-3.1, Fel-14.2 und Fel-17. Diese Daten deuten daraufhin, dass mindestens bei drei dieser Patienten T-Zellen effizient TRFP-T-Zell-Epitope erkennen können, wenn sie als ein rekombitopes Peptid präsentiert werden. Es werden keine in diesen Experimenten untersuchten, im nativen TRFP-Molekül vorhandenen Epitope im Zusammenhang des rekombitopen Peptids YXZ zerstört. Die Fähigkeit der rekombitopen Peptide YXZ oder YZX, TRFP-Epitope in diesen Experimenten zu präsentieren, scheint verglichen mit dem nativen Molekül größer zu sein. Die Ergebnisse von Patient 386 zeigen, dass Peptide, die aus den Verbindungsbereichen des Rekombitops YZX stammen (YZ-Verbindungspeptide und ZX-Verbindungspeptid), nicht von T-Zellen erkannt werden, wenn sie in einem rekombitopen Peptid vorkommen; daher werden in den Verbindungsbereichen keine nicht-nativen Epitope erzeugt.
  • Beispiel 5 Murine T-Zell-Antwort auf rekombitope Peptide
  • Mäuse wurden mit rekombitopen Peptid YZX immunisiert, um zu bestimmen, ob die in dem von TRFP abgeleiteten rekombitopen Peptid enthaltenen T-Zell-Epitope eine T-Zellantwort stimulieren können. Das Assay bestimmte die Fähigkeit von Lymphknotenzellen, sowohl auf die einzelnen rekombitopen Peptide als auch auf das immunisierende Antigen zu reagieren.
  • 10 B6CBAF1-Mäuse wurden subkutan an der Schwanzbasis und in der Schenkelregion mit 100 μg rekombitopem Peptid YZX in kompletten Freundschem Adjuvans immunisiert. Nach 10 Tagen wurden die inguinalen, paraaortischen und poplitealen Knoten der immunisierten Mäuse entfernt und vereinigt. Die Lymphknotenzellen wurden in kaltem RPMI-1640 mit 1% fötalem Rinderserum (FBS) mittels Passage durch ein Stahlnetz aus rostfreiem Stahl suspendiert. Die Zellen wurden 2 Mal mit kaltem RPMI-1640 gewaschen, das 1% FBS enthielt, und bei 4°C gehalten.
  • Die Lymphknotenzellen wurden mit 4 × 106 Zellen/ml in RPMI-1640 mit 10% FBS, 250 μg/ml Penicillin G, 100 μg/ml Streptomycin, und 5 × 10–5 M 2-Mercaptoethanol ausplattiert. Die Zellen wurden mit Antigen (d. h., rekombitopes Peptid YZX, rekombitopes Peptid ZYX, rekombitopes Peptid XZY, Peptid X, Peptid Y, Peptid Z, Peptide X, Y und Z und Amb a I) wie angegeben (16) kultiviert. Nach 24 Stunden wurden 50 μl des Überstands aus jeder Kultur entfernt und über Nacht eingefroren, um eine Verschleppung von lebenden Zellen zu beseitigen. Der Überstand wurde auf 37°C erwärmt und gewaschen. CTLL-2-Indikatorzellen (ATCC # TIB 214) wurden zugegeben (5 × 103 Zellen/Well). Diese Indikatorzelllinie benötigt IL-2 für fortgesetztes Wachstum. Nach 24 Stunden wurde H3-Thymidin (1 μCi/Well) zugegeben und die Zellen wurden weiterhin 4 Stunden lang inkubiert. Die Platten wurden eingefroren und aufgetaut, auf einem Tomtec 96-Well-Harvester (Tomtec, Orange, Con.) geerntet und auf einem Betaplate-Betazähler (Pharmacia, Gaithersburg, MD.) gezählt.
  • Die vereinigten Lymphknotenzellen reagieren gut in vitro als Antwort auf Kultur mit rekombitopem Peptid YZX, gemessen durch IL-2-Produktion (16). Der Hintergrund aus Medium allein wies durchschnittlich 1500 cpm auf. Die T-Zellantwort auf das rekombitope Peptid YZX kann eine Folge einer oder einer Kombination von Antworten auf die einzelnen im Peptid enthaltenen Epitope sein, die zur Konstruktion des rekombitopen Peptids verwendet wurden (d. h., Peptide X, Y und Z). Weitere rekombitope Peptide sowie die einzelnen Peptide X, Y und Z wurden mit den Lymphknotenzellen kultiviert und die T-Zellantwort wurde bestimmt. Es gab eine signifikante Antwort auf jedes der Peptide X, Y und Z, die konstituierenden Peptide. Es gab starke T-Zellantworten auf mehrere andere rekombitope Peptide ZYX und XZY. Es gab eine kleine, aber signifikante T-Zellantwort auf ein rekombinantes Amb a I-Präparat, das die gleiche aminoterminale Leadersequenz wie die rekombitopen Peptide aufwies.
  • Beispiel 6 Anwendung der Rekombitope auf die Diagnose von allergischen Erkrankungen
  • Die rekombitopen Peptide können als eine neue Form der Diagnose der Überempfindlichkeit auf ein Proteinallergen oder ein Proteinantigen von Nutzen sein. Zum Beispiel können, obwohl bevorzugte erfindungsgemäße rekombitope Peptide IgE nicht binden, bestimmte, von Proteinallergenen abstammende rekombitope Peptide in der Lage sein, IgE von allergischen Patienten zu binden. Diese rekombitopen Peptide könnten für Hauttests als ein genaues Assay für spezifische Hypersensitivität vom Sofort-Typ (ITH, Immediate Type Hypersensitivity) in einem Individuum auf das Proteinallergen, aus dem das rekombitope Peptid stammt, verwendet werden. Die Allergene für das Hervorrufen der ITH-Antwort könnten auch rekombinant hergestellte Allergene, biochemisch gereinigte Allergene aus natürlichen Quellen zusätzlich zu rekombitopen Peptiden sein, wobei die einzige Vorraussetzung ist, dass sie ein hohes Maß an spezifischer IgE-Reaktivität zeigen. Rekombitope Peptide, die keine, oder eine sehr geringe, Reaktivität mit humanem IgE zeigen, aber T-Zell-Epitope enthalten, die mit einem Proteinallergen reagieren, können verwendet werden, um eine Hypersensitivität vom verzögerten Typ (DTH, Delayed Typ Hypersensitivity) in einem Individuum hervorzurufen, das auf das Allergen, aus dem die Epitope stammen, empfindlich reagiert. Die allergenen Formen zur Erzeugung der DTH-Antwort können isolierte rekombitope Peptide, rekombinante Allergene oder chemisch modifizierte natürliche oder rekombinanten Allergene sein (z. B. mit KOH behandeltes TRFP). Wiederum ist eine Hauptanforderung des DTH-provozierenden Allergens/Antigens das Fehlen von IgE-Bindungsreaktivität, oder wenn eine solche Bindung auftritt, das Fehlen von Mediatorfreisetzung aus Mastzellen oder Basophilen und der Fähigkeit, T-Zellen in einem Individuum bei Verabreichung zu stimulieren. Eine positive DTH deutet auf T-Zellen im Individuum hin, die für die Epitope innerhalb des rekombitopen Peptids spezifisch sind. Im Allgemeinen sind rekombitope Peptide größere Moleküle als Peptide, die ein einzelnes T-Zell-Epitop enthalten, und sind daher für den DTH-Test vorteilhaft. Da die rekombitopen Peptide größere Moleküle sind, wird angenommen, dass sie in der Haut verbleiben sollten (Injektionsstelle), was das Einströmen von T-Lymphozyten und anderen Zellen, die zur DTH-Hauptantwort beitragen, ermöglicht.
  • Die ITH-Antwort, die innerhalb von 15 bis 30 Minuten des Hauttests auftritt, kann zusammen mit einer DTH-Antwort verwendet werden, wobei die DTH-Antwort 48–72 Stunden später auftritt. Genau diese Kombination dieser Assays für zwei unterschiedliche Arten von mit allergischen Erkrankungen verbundenen Reaktivitäten stellt eine neue diagnostische Formulierung dar. Das Aufbringen eines rekombitopen Peptids auf die Haut während eines Hauttests kann ein unterschiedliches Format zum Hervorrufen einer Antwort gegenüber einer anderen erfordern (ITH versus DTH). Zum Beispiel kann die ITH-Antwort in einem Individuum durch einen Pricktest mit einer sehr geringen Menge einer therapeutischen Zusammensetzung hervorgerufen werden, die ein rekombitopes Peptid (in diesem Fall ein IgE-reaktives rekombitopes Peptid) und einen pharmazeutisch unbedenklichen Träger oder Verdünnungsmittel umfasst. Um eine DTH-Antwort hervorzurufen, wird eine große Menge einer therapeutischen Zusammensetzung, die ein rekombitopes Peptid (in diesem Fall ein nicht-IgE-reaktives rekombitopes Peptid) und einen pharmazeutisch unbedenklichen Träger oder Verdünnungsmittel umfasst, mittels einer intradermalen Injektion oder einem Tine-Test (Stempeltest) aufgebracht (beide Formen werden für TB-Tests durch DTH verwendet). Siehe Immunology (1985) Roitt, I. M., Brostoff, J., Male, D. K. (Hrgs.), C. V. Mosby Co., Gower Medical Publishing, London, NY, S. 19.2–19.18; pp. 22.1–22.10. Im Anschluss an die Diagnose mit erfindungsgemäßen rekombitopen Peptiden können Individuen für eine spezifische Desensibilisierungstherapie ausgewählt werden, in dem in einer Testreihe IgE-Reaktivität und T-Epitop-Reaktivität definiert wird.
  • SEQUENZPROTOKOLLE
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  • SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (14)

  1. Verfahren zum Entwerfen eines isolierten Peptids mit einem Aminoterminus und einem Carboxyterminus, enthaltend: mindestens zwei Regionen, die von unterschiedlichen Proteinallergenen aus der gleichen Gattung abstammen; mindestens zwei Regionen, die von unterschiedlichen Proteinallergenen aus kreuzreaktiven Spezies abstammen; mindestens zwei Regionen, die von unterschiedlichen Proteinallergenen aus der gleichen Spezies abstammen; mindestens zwei Regionen, die von unterschiedlichen Proteinallergenen aus der gleichen Gruppe abstammen; oder mindestens zwei Regionen, die von unterschiedlichen Proteinallergenen aus der gleichen Familie abstammen; wobei jede Region einen Stimulationsindex für humane T-Zellen von mindestens 2,0 aufweist und mindestens ein T-Zellepitop eines Proteinallergens enthält, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Dermatophagoides pteronyssinus I (Der p I), Dermatophagoides pteronyssinus II (Der p II), Dermatophagoides farinae I (Der f I), Dermatophagoides farinae II (Der f II), Ambrosia artemisiifolia I (Amba I), Ambrosia artemisiifolia II (Amba II), Lolium perenne I (Lol p I) und Lolium perenne II (Lol p IX), und wobei diese Regionen vom Aminoterminus zum Carboxyterminus in einer unterschiedlichen Reihenfolge als die Regionen in dem natürlich auftretenden Proteinallergen angeordnet sind, umfassend die Schritte: a) Üerprüfen der bekannten Proteinstruktur eines Proteinallergens; b) Unterteilen des Proteinallergens in mindestens zwei Regionen; c) Bestimmen, ob die Regionen aus Schritt (b) T-Zell-stimulierende Aktivität haben; d) Anordnen der Regionen, um mindestens ein Peptid zu bilden, in dem die Regionen vom Aminoterminus zum Carboxyterminus in einer unterschiedlichen Reihenfolge als die Regionen in dem natürlich auftretenden Proteinallergen angeordnet sind; und e) Herstellen von mindestens einem Peptid mit der Konfiguration der Regionen aus Schritt (d).
  2. Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend den Schritt der Bestimmung, ob das Peptid aus Schritt (e) eine T-Zell-stimulierende Aktivität hat.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend den Schritt der Bestimmung, ob das Peptid für das Proteinallergen aus Schritt (a) spezifisches Immunglobulin E bindet.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Schritt (b) das Proteinallergen in überlappende Regionen unterteilt wird.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt (c) weiterhin die Bestimmung umfasst, ob diese Regionen für das Allergen aus Schritt (a) spezifisches Immunglobulin E binden, und die Freisetzung von Mediatoren aus Mastzellen oder Basophilen verursacht.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Peptid rekombinant hergestellt wird.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Peptid synthetisch hergestellt wird.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Peptid weiterhin eine proteolytische Stelle enthält, die zwischen mindestens zwei dieser Regionen eingefügt wird.
  9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei jede Region mindestens zwei T-Zellepitope des Proteinallergens enthält.
  10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei jede Region mindestens etwa dreißig Aminosäurereste des Proteinallergens enthält.
  11. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Peptid mindestens etwa vierzig Aminosäurereste des Proteinallergens enthält.
  12. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Peptid mindestens etwa fünfzehn Prozent der T-Zellepitope des Proteinallergens enthält.
  13. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Peptid mindestens etwa dreißig Prozent der T-Zellepitope des Proteinallergens enthält.
  14. Verfahren zum Entwerfen eines isolierten Peptids mit einem Aminoterminus und einem Carboxyterminus, enthaltend mindestens zwei Regionen, die jeweils Stimulierungsaktivität für humane T-Zellen aufweisen, wobei jede Region eine Aminosäuresequenz enthält, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sequenz X (SEQ ID NO: 7), Sequenz Y (SEQ ID NO: 8), Sequenz Z (SEQ ID NO: 9), Sequenz A (SEQ ID NO: 10), und Sequenz B (SEQ ID NO: 11), und wobei diese Regionen vom Aminoterminus zum Carboxyterminus in einer unterschiedlichen Reihenfolge als die Regionen in dem natürlich auftretenden Proteinallergen angeordnet sind, umfassend die Schritte: a) Überprüfen der bekannten Proteinstruktur eines Proteinallergens; b) Unterteilen des Proteinallergens in mindestens zwei Regionen; c) Bestimmen, ob die Regionen aus Schritt (b) T-Zell-stimulierende Aktivität haben; d) Anordnen der Regionen, um mindestens ein Peptid zu bilden, in dem die Regionen vom Aminoterminus zum Carboxyterminus in einer unterschiedlichen Reihenfolge als die Regionen in dem natürlich auftretenden Proteinallergen angeordnet sind; und e) Herstellen von mindestens einem Peptid mit der Konfiguration der Regionen aus Schritt (d).
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