DE69932711T2

DE69932711T2 - Proteine mit modulatorischer aktivität gegenüber dem immunsystem und behandlungen für immunologische erkrankungen

Info

Publication number: DE69932711T2
Application number: DE69932711T
Authority: DE
Inventors: Koichiro Fujita; Makoto Ohashi; Nisshin Flour Milling Co. Shinjirou IMAI
Original assignee: Nisshin Seifun Group Inc
Current assignee: Nisshin Seifun Group Inc
Priority date: 1998-03-31
Filing date: 1999-03-30
Publication date: 2007-08-16
Anticipated expiration: 2019-03-31
Also published as: EP1069135A4; WO1999051633A1; EP1069135B1; EP1069135A1; DE69932711D1; US6521232B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Proteine mit immunmodulativer Wirkung und therapeutische Mittel für Immunerkrankungen. Spezieller betrifft die vorliegende Erfindung Proteine, welche von einem Protein stammen, das von einem Helminth produziert wird, und das Immunsystem eines Wirts modulieren.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Herkömmlich sind zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen, so genannten schwer heilbaren Erkrankungen, und Allergosen Mittel eingesetzt worden, die Steroide und Immunsuppressiva, wie z.B. Cyclosporin, enthalten. Diese Mittel dienen jedoch nur zur Symptombehandlung, und noch ist kein wirksames Mittel entwickelt worden, das eine ausgesprochen günstige Wirkung zeigt. Außerdem bringen die Steroide und Cyclosporine Probleme mit sich, einschließlich starker Nebenwirkungen und Arzneimittelresistenz.
In jüngster Zeit hat der rasche Fortschritt der Molekularbiologie und Immunologie den genauen Mechanismus des Immunsystems, verschiedene in diesem Mechanismus involvierte Faktoren und Rezeptoren, die diese Faktoren erkennen, bestimmt und deren Funktionen und Rollen im Immunsystem offenbart. Beispiele für diese Faktoren umfassen Zytokine, wie z.B. verschiedene Interleukine, Zytokin-erkennende Rezeptoren, Antikörper gegen Zytokine und Rezeptoren, Adhäsionsmoleküle und Antikörper gegen Adhäsionsmoleküle.
Zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen und Allergien sind z.B. mehrere Versuche unternommen worden, die oben genannten Faktoren als so genannte "Biopharmazeutika" in der Behandlung von Erkrankungen einzusetzen, die aus der Fehlfunktion dieser Faktoren resultieren.
Jedoch zielen diese Versuche nur auf die Behandlung von anomal funktionierenden Faktoren ab. Diese Versuche stellen daher nur eine lokale immunologische Behandlung bereit und werden als Erweiterung herkömmlicher symptomatischer Behandlungen angesehen.
Dementsprechend besteht Bedarf an einem therapeutischen Mittel, das auf einer neuen Idee basiert, die durch den Mechanismus des Immunsystem als Ganzes gestützt wird, um die oben angeführten schwer behandelbaren Erkrankungen vollständig zu heilen.
Hingegen haben Parasitologen beobachtet, dass Patienten, die mit parasitischen Helminthen infiziert sind, basierend auf der epidemiologischen Verbindung zwischen Helmintheninfektion und Allergie tendenziell weniger anfällig für Allergien sind. Sie haben auch festgestellt, dass Patienten mit systemischen Lupus erythematodes durch eine Parasiteninfektion gelinderte Symptome aufweisen.
Jedoch behaupten einige Allergologen, dass eine solche epidemiologische Verbindung gegenstandslos ist und absolut jeder Grundlage entbehrt, weil die von Parasitologen festgestellte Tendenz nicht wissenschaftlich bewiesen ist.
Was von Helminthen stammende Moleküle betrifft, haben Fujita et al. berichtet, ein Allergen von Dirofilaria immitis gefunden zu haben [Fujita et al. (1979)], und Horii et al. haben einen neutrophilen chemotaktischen Faktor von Dirofilaria immitis (DiNCF) entdeckt und seine Aminosäuresequenz bestimmt [Horii et al. (1986)].
Außerdem haben C.B. Poole et al. DiNCF als ein von Dirofilaria immitis stammendes kutikuläres Antigen isoliert und seine Teilgensequenzen geklont, was darauf schließen ließ, dass DiNCF eine Struktur aufwies, bei welcher sich die Antigenmoleküle in Tandem wiederholten [C.B. Poole, Molecular and Biochemical Parasitology 82, 51–56 (1992)].
Es ist auch z.B. von J. Culpepper [J. Culpepper, Molecular and Biochemical Parasitology 54, 51–56 (1992)], Owhashi et al. [Owhashi et al., Molecular Immunology 20, 1315–1320 (1993)] und C.B. Poole et al. [C.B. Poole et al., PNAS 89, 5986–5990 (1996)] die cDNA-Klonierung von DiNCF berichtet worden. Außerdem kann von der Datenbank Uniprot unter der Zugriffsnummer Q94509 die Aminosäuresequenz eines neutrophilen chemotaktischen Faktors (Fragment) bezogen werden.
Diese Berichte gehen nicht auf die in der vorliegenden Erfindung definierte immunmodulative Wirkung der von Helminthen stammenden Moleküle ein, weil sie ihren Schwerpunkt nur auf die neutrophile chemotaktische Aktivität und/oder Antigenität der Moleküle legen.
WO 93/23077 betrifft eine Impfung anfälliger Wirte gegen nichtangepasste Parasiten und beschreibt die Immunisierung feliner Wirte gegen Herzwurm (Dirofilaria immitis).
Yamaoka et al., Immunonology 81, 507–512 (1994), betrifft die Analyse jener Faktoren, welche mittels einer exkretorisch-sekretorischen Komponente (ESC) von Dirofilaria immitis die IL-4-induzierte Synthese bei Helminthen-Infektionen regulieren. Die ESC wurde hergestellt, indem sie erwachsenen Würmern entnommen und dann teilweise gereinigt wurde. Die ESC hatte ein augenscheinliches Molekulargewicht von 20.000.
WO 96/29082 betrifft ein Verfahren zur Verlängerung der Lebensdauer eines Allotransplantats durch die Verringerung der Th1-Aktivität im Organismus, z.B. unter Einsatz einer Nematode oder eines Nematodenextrakts.
Ledingham et al., Transplantation 61, 184–188 (1996), betrifft die Verlängerung der Lebensdauer eines Nierentransplantats bei Ratten durch Nematoden, z.B. unter Einsatz eines löslichen Wurmprodukts.
Es ist schon länger bekannt gewesen, dass ein Extrakt eines parasitischen Helminths B-Zellproliferation verursacht. Zum Beispiel ist von einem löslichen Molekül von Ascaris suum, das in der Herstellung von IgE involviert ist [T.D.G. Lee et al. (1993)], von einem rohen Antigen von Toxocara canis mit der Fähigkeit, die Zahl peripherer Blutzellen beim Menschen zu erhöhen (Inuo et al. (1995)], und von einem Antigen von Ascaris suum, das über Mitogenese verfügt [T.D.G. Lee et al. (1995)], berichtet worden.
Jedoch wurde bei jedem Experiment jeder dieser Extrakte ohne weitere Isolierung verwendet, sodass von keinem einzigen aus den Extrakten isolierten Molekülen berichtet worden ist, dass es unabhängig von den T-Zellen B-Zellproliferation induziert.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
In Anbetracht des Vorangegangenen gibt es unter Wissenschaftern verschiedenster Fachgebiete immer noch große Diskussionen, und bisher haben diese noch keine klare Schlussfolgerung gezogen. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben ihre Forschungsbemühungen darauf konzentriert, herauszufinden, wie die parasitische Helmintheninfektion das Immunsystem eines Wirts beeinflusst, und sie haben bewiesen, dass ein von einem parasitischen Helminth stammendes Molekül bei der Behandlung von Immunerkrankungen wirkungsvoll ist, und haben so letztlich die Erfindung vervollständigt.
Die vorliegende Erfindung basiert auf dem Selbstverteidigungsmechanismus, den Parasiten im Laufe mehrerer Milliarden Jahre erworben haben, um sich selbst gegen die Immunreaktion ihrer Wirte zu schützen. Die vorliegende Erfindung stellt ein Mittel bereit, das gemäß diesem Konzept, d.h. einer ganz neuen Idee, ausgebildet ist.
Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung eines oder mehrerer Proteine zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Abstoßungsreaktionen bereit, die bei Organtransplantation auftreten, worin besagte Proteine aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt sind: einem Protein der folgenden Formel (I) mit der Aktivität der Stimulierung nichtspezifischer Immunoglobulinproduktion: X-Y-Z (I)worin X für eine Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 1 oder 2 steht und Y und Z jeweils nicht vorhanden sind oder für eine Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 1 oder 2 stehen;
einem rekombinanten Protein mit einer aus den Seq.-ID Nr. 1–15 ausgewählten Aminosäuresequenz; und
einem rekombinanten Protein mit einer aus den Seq.-ID Nr. 1–15 ausgewählten Aminosäuresequenz, in der eine Aminosäure deletiert, substituiert oder addiert ist.
Die vorliegende Erfindung stellt auch die Verwendung eines oder mehrerer Proteine zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Immunerkrankung bereit, worin die besagten Proteine aus der aus dem Folgenden bestehenden Gruppe ausgewählt sind:
einem Protein der folgenden Formel (I) mit der Aktivität der Stimulierung nichtspezifischer Immunglobulinproduktion: X-Y-Z (I)worin X für eine Aminosäurensequenz der Seq.-ID Nr. 1 oder 2 steht und Y und Z jeweils nicht vorhanden sind oder für eine Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 1 oder 2 stehen;
einem rekombinanten Protein mit einer aus den Seq.-ID Nr. 1–15 ausgewählten Aminosäuresequenz; und
einem rekombinanten Protein mit einer aus den Seq.-ID Nr. 1–15 ausgewählten Aminosäuresequenz, in der eine Aminosäure deletiert, substituiert oder addiert ist;
worin die Immunerkrankung eine TH1-dominante Autoimmunerkrankung, ausgewählt aus der aus multipler Sklerose, insulinabhängigem Diabetes mellitus, Morbus Crohn, Uveitis, chronischem Rheumatismus und systemischem Lupus erythematodes bestehenden Gruppe, ist.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem die Verwendung eines oder mehrerer Proteine zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von allergischen Erkrankung bereit, worin die besagten Proteine aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt sind:
einem Protein der folgenden Formel (I) mit der Aktivität der Stimulierung nichtspezifischer Immunglobulinproduktion: X-Y-Z (I)worin X für eine Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 1 oder 2 steht und Y und Z jeweils nicht vorhanden sind oder für eine Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 1 oder 2 stehen;
einem rekombinanten Protein mit einer aus den Seq.-ID Nr. 1–15 ausgewählten Aminosäuresequenz; und
einem rekombinanten Protein mit einer aus den Seq.-ID Nr. 1–15 ausgewählten Aminosäuresequenz, in der eine Aminosäure deletiert, substituiert oder addiert ist.
Die allergischen Erkrankungen umfassen chronische Bronchitis, atopische Dermatitis, Pollinosis (Rhinitis allergica), allergische Angiitis, Heuschnupfen, allergische Gastroenteritis, allergische Hepatopathie, allergische Zystitis und Purpura anaphylactoides.
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend genauer beschreiben.
Wie hierin verwendet steht "immunmodulative Aktivität" für die Stimulierung nichtspezifischer Immunglobulinproduktion aus B-Zellen und die Modulation Th1- und Th2-vermittelter Immunreaktionen.
Wie hierin verwendet bedeutet "Stimulierung nicht-spezifischer Immunglobulin-Produktion aus B-Zellen", dass B-Zellen stimuliert werden, um nicht-spezifische Immunglobuline (Ig) zu produzieren, besonders nicht-spezifische IgE, nicht, um Immunglobuline gegen spezielle Antigene zu produzieren. Bei der Produktion von Ig sollten B-Zellen im Allgemeinen in Blasten umgewandelt werden (d.h. Blastenbildung), wenn sie von Antigen-präsentierenden Zellen stimuliert werden, welche spezielle Antigene auf ihrer Oberfläche präsentieren. Jedoch verursachen die Proteine der vorliegenden Erfindung keine Blastenbildung, sodass reife B-Zellen proliferieren und folglich nicht-spezifisches Immunglobulin produzieren.
Wie hierin verwendet steht "Modulation von Th1- und Th2-vermittelten Immunreaktionen" dafür, dass das Muster der Immunreaktion aus Zellimmunität in humorale Immunität geändert wird und vice versa, indem die Zytokinproduktion jeder T-Zellen-Untereinheit Th1 und Th2 gehemmt wird oder indem Zytokine aus einer Untereinheit, die von der anderen Untereinheit produzierte Zytokine hemmt, induziert werden.
Wie hierin verwendet steht "Immunerkrankung" für eine Erkrankung, die aus einer Fehlfunktion des Immunsystems resultiert, eine Fehlfunktion der Verteidigungsmechanismen im Körper, einschließlich Erkrankungen, die durch abnorme humorale Immunität und Zellimmunität verursacht sind. Dieser Terminus umfasst auch Autoimmunerkrankungen, die durch Autoantikörper, autoimmunisierte Lymphozyten oder Immunkomplexe verursacht sind, sowie Transplantat-Wirt-Erkrankungen verursacht durch Transplantat-Wirt-Reaktionen (GVH-Reaktionen), bei welchen Abstoßungen des Transplantats erfolgen. Der Terminus umfasst auch allergische Erkrankungen und dergleichen.
Wie hierin verwendet bezieht sich "Th1-dominante Autoimmunerkrankung" auf eine Autoimmunerkrankung, bei welcher eine erhöhte Zytokinproduktion aus Th1-Zellen auftritt, einschließlich IFN-γ, IL-2, GM-CSF, TNF-α und IL-3. Spezielle Beispiele umfassen Multiple Sklerose, insulinabhängigen Diabetes mellitus, Morbus Crohn, Uveitis, chronischen Rheumatismus und systemischen Lupus erythematodes.
Wie hierin verwendet bezieht sich "Autoimmunerkrankung, von der keine Th1-Dominanz bekannt ist" auf eine Autoimmunerkrankung, von der nicht bekannt ist, dass sie erhöhte Zytokinproduktion aus Th1-Zellen mit sich bringt. Spezielle Beispiele umfassen Sclerodermia, Polymyositis, Vaskulitis-Syndrom, Sharp-Syndrom, Sjögren-Syndrom, Hyperthyreose, Hashimoto-Thyreoiditis, Myasthenia gravis (pseudoparalytica), Guillain-Barré-Syndrom, Autoimmun-Hepatopathie, Colitis ulcerosa, Autoimmun-Nephropathie, Autoimmun-Hämatopathie, idiopathische interstitielle Pneumonitis, hyperempfindliche Pneumonitis, Autoimmun-Dermatose, Autoimmun-Kardiopathie, Autoimmun-Infertilität und Behçet-Krankheit.
Wie hierin verwendet bezieht sich "allergische Erkrankung" auf eine Erkrankung, die mit einer allergischen Reaktion in Zusammenhang steht. Spezielle Beispiele umfassen chronische Bronchitis, atopische Dermatitis, Pollinosis (Rhinitis allergica), allergische Angiitis, Heuschnupfen, allergische Gastroenteritis, allergische Hepatopathie, allergische Zystitis und Purpura anaphylactoides.
Wie hierin verwendet stehen "Deletion, Substitution oder Addition einer oder mehrerer Aminosäuren" oder "eine oder mehrere Aminosäuren werden deletiert, substituiert oder addiert" sowohl für natürlich auftretende Modifikation als auch künstlich herbeigeführte Modifikation unter Einsatz von ortsspezifischer Mutagenese [Nucleic Acids Research, Vol. 20, Nr. 20, 6487–6500 (1982)] etc.
Die hierin beschriebenen immunmodulativen Proteine weisen folgende obige Formel (1) auf: X–Y–Z. In der Formel steht X für eine Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 1 oder 2, Y und Z sind jeweils nicht vorhanden oder stehen für eine Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 1 oder 2. Die Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 1 wird nachstehend V1 genannt, während die Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 2 als V2 bezeichnet wird.
Bei Expression unter Einsatz von V1 und V2 umfassen die Proteine der vorliegenden Erfindung V1 (Seq.-ID Nr. 1), V2 (Seq.-ID Nr. 2), V1+V2 (Seq.-ID Nr. 3), V2+V1 (Seq.-ID Nr. 4), V1+V2+V1 (Seq.-ID Nr. 5), V2+V1+V2 (Seq.-ID Nr. 6), V1+V1 (Seq.-ID Nr. 7), V2+V2 (Seq.-ID Nr. 8), V1+V1+V1 (Seq.-ID Nr. 9), V1+V1+V2 (Seq.-ID Nr. 10), V1+V2+V2 (Seq.-ID Nr. 11), V2+V2+V2 (Seq.-ID Nr. 12), V2+V2+V1 (Seq.-ID Nr. 13), und V2+V1+V1 (Seq.-ID Nr. 14).
Die Aminosäuresequenz-Homologie zwischen V1 und V2 ist relativ hoch, und die Aminosäuren 1–61 in diesen Sequenzen sind zueinander homolog. Diese homologe Sequenz ist in Seq.-ID Nr. 15 dargestellt.
Sowohl V1 als auch V2 der vorliegenden Erfindung haben ihren Proteinursprung in Dirofilaria immitis, einer Art parasitischem Helminth. Durch die Kombination folgender Techniken kann das Protein von Dirofilaria immitis erhalten werden: Extraktion von Proteinen von Dirofilaria immitis, Anionenaustauschchromatographie, Gelpermeationschromatographie etc.
Das Protein von Dirofilaria immitis, nachstehend DiNCF genannt, weist meutrophile chemotaktische Aktivität auf und umfasst eine wiederholte Sequenz, in welcher zwei Arten von Dutzenden DiNCF-V1- und DiNCF-V2-Molekülen in Tandem wiederholt werden. Ohashi et al. haben cDNA für DiNCF geklont (Ohashi, s.o.), und so sind für DiNCF V1 und DiNCF V2 Aminosäuresequenzen bestimmt worden.
Diese Aminosäuresequenzen entsprechen V1 bzw. V2. V1 enthält 129 Aminosäuren, während V2 131 Aminosäuren enthält (Seq.-ID Nr. 1 und 2).
Die hierin beschriebenen Proteine können Heterodimere und Heterotrimere umfassen, in welchen V1 und V2 in Tandem wiederholt werden, sowie Homodimere und Homotrimere, in welchen entweder V1 oder V2 in Tandem wiederholt werden. Die Homodimere und Homotrimere sind beide nicht-natürlich auftretende Proteine.
Bei diesen beiden Proteinen sind deren N-terminale Seiten, d.h. die Aminosäuren 1 bis 61, zueinander homolog, die übrigen Aminosäuren sind jedoch weniger homolog zueinander.
Die hierin beschriebenen Proteine können nicht nur Proteine umfassen, die über V1- und V2-Sequenzen voller Länge verfügen, sondern auch ein Protein, welches die Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 15 enthält.
Die Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 15 entspricht den Aminosäuren 1–61 von V1 und V2 und kann mithilfe von Substitution, Deletion oder Addition einer oder mehrerer Aminosäuren modifiziert werden, solange das resultierende Protein immunmodulative Aktivität zeigt.
Ferner umfassen bevorzugte Aminosäuresequenzen die Aminosäuren 1–76 der in den Seq.-ID Nr. 1 oder 2 dargestellten Aminosäuresequenz.
Diese Aminosäuresequenzen können auf dieselbe Art und Weise wie für das Protein mit der Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 15 durch Substitution, Deletion oder Addition einer oder mehrerer Aminosäuren modifiziert werden.
Um ein Gen zu erhalten, welches für das Protein der vorliegenden Erfindung kodiert, kann ein DiNCF-Gen-tragender Vektor unter Verwendung von Primern, von denen jeder über eine geeignete Restriktionsstelle verfügt, einem PCR-Verfahren unterzogen werden, um das Gen von Interesse zu amplifizieren; der Vektor kann mit einem geeigneten Restriktionsenzym behandelt werden, um ein DNA-Fragment mit dem gewünschten Molekulargewicht zu isolieren, welches dann an einen geeigneten Linker ligiert wird; oder jede für DiNCF V1 oder DiNCF V2 kodierende DNA kann basierend auf der Nucleotidsequenz der für das Dirofilaria-immitis-Protein kodierenden DNA gemäß Standardverfahren chemisch synthetisiert werden, und diese DNAs können dann gegebenenfalls aneinander gebunden werden, um die oben angeführten Sequenzen zu bilden.
Das auf diese Art und Weise erhaltene DNA-Fragment, d.h. das Gen, welches für das Protein der vorliegenden Erfindung kodiert, kann an einen geeigneten Vektor ligiert werden, der mit einem Restriktionsenzym behandelt wird, um einen rekombinanten Vektor zur Proteinexpression zu erhalten.
Dieser rekombinante Vektor kann dazu verwendet werden, einen geeigneten Wirt zu transformieren. Der gewünschte Transformant kann ausgewählt und dann gezüchtet werden, um einen Vektor zu erhalten, der das Protein von Interesse produziert.
Beispiele für den DiNCF-Gen-tragenden Vektor umfassen die Vektoren pDi6, pDi18 und pD-4, welche die Nucleotidsequenzen jener DNAs tragen, die für DiNCF V1 und DiNCF V2 kodieren, von denen jeder gleichzeitig mit dem Klon pD-4 zum Zwecke des Klonierens von DiNCF konstruiert wurde [siehe Maruyama, H., et al., 30 (14), 1315–1320 (1993)]. Der Vektor pDi6 wird gegebenenfalls bevorzugt eingesetzt, weil er sowohl V1- als auch V2-Gene enthält.
Der Vektor pDi6 wurde gemäß dem in Ohashi beschriebenen Verfahren (Ohashi M. et al., Mol. Immunol. 30 (14), 1315–1320 (1993)] konstruiert. Erwachsene Dirofilaria immitis wurde dem Herz eines auf natürliche Weise mit Dirofilaria immitis infizierten Hundes entnommen und auf Eis in kleine Stücke geschnitten, und die aus ihr entnommene mRNA wurde mithilfe des mRNA-Reinigungssets (Parmacia) gereinigt.
Aus dieser mRNA wird mithilfe eines cDNA-Synthesesets (Pharmacia) cDNA synthetisiert und dann in eine EcoRI-Stelle des λgt11-Vektors insertiert [Promega Biotec,. Madison, Wisconsin, USA]. Die DNA dieses λgt11-Vektors mit insertierter cDNA wird unter Verwendung von Gigapack (Stratagene, La Jolla, Kalifornien, USA) In-vitro-Verpackung unterworfen, um eine cDNA-Bank zu schaffen.
Der Klon von Interesse wird unter Verwendung eines Anti-DiNCF-Antikörpers gemäß dem in Huynh, T.V., et al., A Practical Approach, Vol. 1, 49–78, Glover D.M. (Hrsg.), IRL Press, Oxford, beschriebenen Verfahren aus dieser cDNA-Bank ausgewählt.
Der gewählte Klon wird mit EcoRI verdaut, um das insertierte Gen von der Phagen-DNA auszuschneiden. Das aisgeschnittene Gen wird dann an der EcoRI-Stelle des Phagemid-Vektors pBluscript SK (–) insertiert, um das Plasmid pDi6 zu konstruieren.
Um eine DNA zu erhalten, z.B. V1+V2, in welcher die Gene in Tandem wiederholt werden, kann vorzugsweise das Restriktionsenzym NspV eingesetzt werden, weil die Consensus-Sequenz über nur eine Stelle verfügt, welche dieses Enzym erkennen soll.
Alternativ dazu kann die chemische Synthese des oben angeführten DNA-Fragments auf bekannte Art und Weise ausgeführt werden, wie z.B. mithilfe eines Phosphoramidit-Verfahrens oder eines Phosphittriester-Verfahrens.
Der für die Herstellung des rekombinanten Vektors zur Proteinexpression eingesetzte Vektor umfasst Plasmidvektoren, wie z.B. pET3a, pTrc und pKK2B-3; Phagenvektoren wie z.B. λgt11 und M13, pBluescript II, oder Phagemidvektoren wie z.B. pcDNA2.1. Vorzugsweise kann der Plasmidvektor pET3a eingesetzt werden, weil er zu einer guten Ausbeute führt.
Der zu transformierende Wirt umfasst E. coli und dergleichen. Vorzugsweise kann E. coli aufgrund seiner einfachen Manipulation eingesetzt werden, insbesondere der HMS-174-(DE3-) Stamm kann eine hohe Proteinexpressionseffizienz bereitstellen.
Der Wirt kann unter Einsatz von standardisierten Verfahren einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Calciumchloridverfahren oder Elektroporationsverfahren, welche beide aufgrund ihrer hohen Transformationseffizienz bevorzugt sind, transformiert werden.
Die Transformanten, welche durch die Transformation mit dem Vektor erhalten werden, der das Gen trägt, das für das Protein der vorliegenden Erfindung kodiert, können auf ihre Antibiotikaresistenz gescreent werden. Das als Screeningmarker eingesetzte Antibiotikum umfasst Ampicillin, Tetracyclin, Kanamycin und dergleichen. Vorzugsweise kann Ampicillin eingesetzt werden, da der bevorzugte Vektor pET3a ist.
Der gewählte Transformant kann gezüchtet werden, um das Protein der vorliegenden Erfindung zu erhalten.
Das DNA-Fragment mit jener Nucleotid-Sequenz, welche für das Protein der vorliegenden Erfindung kodiert, kann durch ortsgerichtete Mutagenese modifiziert werden, um an einer beliebigen Stelle im DNA-Fragment eine Mutation einzuführen. Eine solche DNA-Modifikation kann verschiedene modifizierte Proteine bereitstellen.
Die vorliegende Erfindung wird in Hinblick auf Sequenz V1 weiter beschrieben.
Der Plasmidvektor pDi6, der ein für die DiNCF-V1-Region kodierendes Gen trägt (bereitgestellt von Prof. Makoto Ohashi von der Tokushima Universität), wird als Matrize eingesetzt. Unter Einsatz dieses Matrizenvektors und der Verwendung von Primern, jeder eine Restriktionsstelle und ein Stoppcodon umfassend, wird PCR-Amplifikation durchgeführt. Unter Einsatz eines solchen Restriktionsstellen-umfassenden Primers kann das Fragment von Interesse in einen Expressionsvektor stromab seines Initiationscodons in der gewünschten Orientierung und im Raster eingeführt werden. Dies ermöglicht dem Protein von Interesse, exprimiert zu werden.
Durch den Einsatz eines der folgenden Primer wird eine effiziente Amplifikation der Nucleotidsequenz von Interesse erreicht:
N-terminaler Primer:
5'-GCATATGAATGATCATAATTTAGAAAGC-3' (Seq.-ID Nr. 16) und
C-terminaler Primer:
5'-CTAAAGGATCCTATCACCGCTTACGCCGTTCATTCATTG-3' (Seq.-ID Nr. 17).
Diese Primer können chemisch synthetisiert werden, z.B. durch ein Phosphoramidit-Verfahren, oder es kann ein Unternehmen (z.B. Biologica Co.) beauftragt werden, diese Primer zu synthetisieren.
PCR kann unter Einsatz der oben angeführten Primer, unter Verwendung von DiNCF V1 als Matrize, von Ex-Taq-DNA-Polymerase und einem Puffer und dNTP (gleichwertiges Gemisch aus dATP, dGTP, dCTP, dTTP), enthalten in "Ex Taq Kit" (Takara Shuzo Co., Ltd.), etc. durchgeführt werden.
Das resultierende amplifizierte Fragment kann mithilfe von MicroSpin-Säulen und dergleichen gereinigt werden, mit Nde I und BamH I verdaut, wieder gereinigt und dann in einen Expressionsvektor insertiert werden. Zu diesem Zwecke wird pET3a mit Nde I und BamH I verdaut und unter Einsatz von MicroSpin-Säule S400 (Pharmacia) gereinigt, um sein Hauptsegment als Expressionsvektor zu erhalten.
Das oben angeführte PCR-amplifizierte Fragment wird mithilfe eines DNA-Ligation-Sets (Takara Shuzo Co., Ltd.) den Bedienungsanleitungen gemäß an dieses verdaute pET3a ligiert, um die ringförmige DNA von Interesse zu erhalten.
Die ringförmige DNA wird mithilfe eines Calciumchloridverfahrens in den E.-coli-Stamm JM 109 eingeführt, um den Stamm JM 109 zu transformieren. Die resultierenden Transformanten werden in LB-Medium mit Ampicillin kultiviert. In diesem Medium gezüchtete Zellen werden mithilfe von Zentrifugation gewonnen und einem alkalischen SDS-Verfahren unterworfen, um ein pDP5 genanntes Plasmid zu isolieren und zu erhalten.
Die Nucleotid-Sequenz des resultierenden Plasmids kann unter Einsatz eines Sequenase-Sets (United States Biochemical Corporation, USA) untersucht werden, um zu bestätigen, ob das Insert von Interesse korrekt in den Vektor insertiert ist und ob vor und nach dem Insert irgendwelche unerwarteten Veränderungen zu beobachten sind.
Um das Dimer- oder Trimerprotein der vorliegenden Erfindung zu erhalten, kann ein wie unten für Dimer V1+V1 beschriebener Expressionsvektor konstruiert werden.
Das Plasmid pDP5, das wie oben beschrieben gebildet wird, wird mit Nsp V verdaut, mit Phenol durch Standard-Verfahren behandelt, unter Einsatz alkalischer Phosphatase aus dem Kälberdarm (calf intestine alkaline phosphatase, CIP) dephosphoryliert und dann mit Phenol behandelt, um das Enzym zu deaktivieren.
Inzwischen wird das Plasmid pDi6 mit demselben Restriktionsenzym verdaut und auf Agarosegel Elektrophorese unterworfen, um eine Bande mit dem gewünschten Molekulargewicht zu reinigen. GENECLEAN-II-Set (Funakoshi Co., Ltd.) etc. kann für diesen Zweck eingesetzt werden.
Das gereinigte Fragment wird an den linearisierten Vektor gebunden, welcher mit CIP auf die zuvor beschriebene Art und Weise behandelt wurde. Die ligierte DNA wird dazu eingesetzt, den E.-coli-Stamm JM 109 zu transformieren, um Transformanten zu erhalten.
Die transformierten Klone werden auf geeignete Weise aufgenommen und über Nacht in einem Medium mit Ampicillin kultiviert. Die in dem Medium gezüchteten Zellen werden mittels Zentrifugation gewonnen, ihre Vektor-DNAs werden mithilfe eines alkalischen SDS-Verfahrens isoliert und gereinigt. Jeder der auf diese Weise erhaltenen Vektoren wird mit einem geeigneten Restriktionsenzym verdaut und mithilfe von Elektrophorese analysiert, um den Vektor von Interesse zu erhalten.
Dieser Vektor wird eingesetzt, um E. coli HMS 174 (DE3) auf die zuvor beschriebene Art und Weise zu transformieren. Jeder der resultierenden Transformanten wird kultiviert, bis das Absorptionsvermögen A₅₅₀ 0,8 erreicht. Wenn das Absorptionsvermögen A₅₅₀ 0,8 erreicht, wird die Kultur unter Hinzufügung von IPTG (Isopropylthiogalactosid) fortgesetzt.
Die Zellen werden mithilfe von Zentrifugation vom Kulturfluid getrennt, in einer Lösung, die 8 M Harnstoff und 0,1 M Tris-HCl (pH 7,0) enthält, suspendiert und daraufhin mit Ultraschall behandelt und zentrifugiert, um den Überstand zu erhalten.
Dieser Überstand wird SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese unterworfen, welche Phast-System (Pharmacia) einsetzt. Ein E.-coli-Stamm, der mit normalem pET3a transformiert wurde, dient als Kontrolle.
Mithilfe der zuvor beschriebenen Verfahren kann die Produktion des gewünschten Proteins beschrieben werden.
Jeder der auf diese Art und Weise erhaltenen Transformanten wird kultiviert und die gezüchteten Zellen mittels Zentrifugation gewonnen. Eine vorgegebene Zellenmenge wird mit Salzsäure extrahiert, um ein Salzsäureextrakt zu erhalten.
Nach der Neutralisation mit Natriumhydroxid wird dieser Extrakt mit Ammoniumsulfat gemischt und zentrifugiert, um gefällte Produkte zu trennen. Diese gefällten Produkte werden in PBS (in physiologischem Phosphatpuffer) gelöst und mittels Gelpermeationschromatographie gereinigt, um das gereinigte Endprodukt zu erhalten.
Die auf diese Art und Weise erhaltenen Proteine können auch dazu eingesetzt werden, DNAs mit Nucleotidsequenzen, welche für diese Proteine kodieren, gemäß verschiedenen bekannten Techniken herzustellen. Bei der vorliegenden Erfindung können DNAs, die über diese Nucleotidsequenzen verfügen, modifiziert werden, um Substitution, Deletion, Addition oder Insertion einer oder mehrerer Basen, z.B. gemäß ortsgerichteter Mutagenese [Zoller et al., Nucleic Acids Research, Vol. 10, Nr. 20, 6487–6500 (1982)], einzuführen. Fachleute können diese modifizierten DNAs einfach herstellen. Die vorliegende Erfindung kann die Verwendung der von diesen DNAs kodierten Proteine umfassen, solange die von diesen kodierten Proteine eine immunmodulative Aktivität zeigen.
Physiologische Funktionen dieser Proteine können wie folgt untersucht werden. Eine Maus wird getötet, indem ihre Halswirbel disloziert werden, und ihre Milz wird entfernt, um Lymphozyten zu erhalten. Diese Milzlymphozyten werden zentrifugiert, um den Überstand zu entfernen, mit ACT-Lösung [0,83% NH₄Cl, 170 mM Tris-HCl (pH 7,6)] gewaschen und dann in einem RPMI-1640-Medium mit fötalem Kälberserum (FCS) suspendiert, um eine Milzlymphozytensuspension zu bilden.
Dann werden wie folgt B-Zellen hergestellt. Diese Milzlymphozyten werden mit einem Anti-Thy-1,2-Antikörper inkubiert, der diesen bei 4°C hinzugefügt wird, und dann nach Waschung in einem RPMI 1640-Medium mit 5% fötalem Kälberserum (FCS) suspendiert. Diese Suspension wird gut gemischt und mit einer handelsüblichen, aus Kaninchen usw. hergestellten Komplementlösung bei etwa 37°C etwa eine Stunde lang umgesetzt. Nach Waschung werden diese Lymphozyten wieder in einem RPMI-1640-Medium mit 5% FCS mit einer vorgegebenen Zelldichte (B-Zellen-Suspension) suspendiert. Die für eine proliferative Reaktion auf Stimulation geeignete Zelldichte beträgt 1 × 10⁵ Zellen/ml bis 5 × 10⁶ Zellen/ml.
Die proliferative Reaktion auf Stimulation kann wie folgt nachgewiesen werden.
Die B-Zellsuspension, die wie oben beschrieben hergestellt wurde, wird auf jeden Well einer 24-Well-Platte aufgeteilt und in einem RPMI-1640-Medium mit 5% FCS einen vorgegebenen Zeitraum lang kultiviert. Zur Durchführung eines MTT-Tests wird jedes Protein in einer vorgegebenen Konzentration hinzugefügt und die Kultur weitere 48 Stunden fortgeführt. Das Protein der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise in einer Konzentration von 0,1 bis 1.000 μg/ml eingesetzt, weil dieser Konzentrationsbereich eine signifikante Reaktion im MTT-Test bereitstellt, bevorzugter in einem Bereich von 10 bis 100 μg/ml, weil so eine höhere Reaktion beobachtet werden kann.
MTT-Tests können wie folgt durchgeführt werden. Die Zellsuspension (500 μl) wird inkubiert und mit zugesetzter MTT-Lösung (50 μl) bei 37°C 4 Stunden lang umgesetzt und dann mit zugesetzter Stopp-Lösung (450 μl) inkubiert bei Raumtemperatur 30 Minuten lang inkubiert, um die Reaktion zu stoppen. Das Absorptionsvermögen bei 630 nm und 570 nm (A₆₃₀ bzw. A₅₇₀ genannt) wird gemessen, um den Grad der proliferativen Reaktion zu bestimmen.
Die MTT-Lösung wird hergestellt, indem MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid, Sigma) in PBS in einer Konzentration von 5 mg/ml gelöst wird. Die Stopp-Lösung ist Isopropanol, das 0,04 N Salzsäure enthält.
Für einen Blindversuch wird das Medium alleine der gleichen Behandlung wie der oben beschriebenen unterworfen und auf sein Absorptionsvermögen bei 630 nm und 570 nm (A0₆₃₀ bzw. A0₅₇₀ genannt) getestet. MTT-Testwerte können basierend auf diesen gemessenen Werten mit der folgenden Gleichung berechnet werden: MTT-Testwert = (A570 – A630) – (A0570 – A0630).
Lipopolysaccharid (LPS) kann als positive Kontrolle eingesetzt werden.
Jedes der Peptide kann wie folgt auf seine Fähigkeit getestet werden, IgE-Produktion zu induzieren. Zum Beispiel wird einer Maus intraperitoneal ein Gemisch aus DiNCF V1 in einer vorgegebenen Menge und Aluminiumhydroxid-Adjuvans (Alaun) verabreicht.
Aus der Schwanzarterie der Maus wird mit einer heparinisierten Röhre vor Verabreichung und an den Tagen 7, 14 und 21 nach Verabreichung Blut abgenommen. Plasma wird getrennt und darin enthaltenes IgE mithilfe einer Enzymantikörpertechnik detektiert. Enzymantikörpertechnik kann gemäß den folgenden Verfahrensschritten durchgeführt werden, ist aber nicht auf diese beschränkt.
Bei dieser Technik werden folgende Materialien eingesetzt: Anti-DNP-IgE als Standard-IgE, monoklonaler Anti-Maus-IgE-ε-Rattenantikörper als primärer Antikörper, Peroxidase-markierter polyklonaler Anti-Maus-IgE-Antikörper als sekundärer Antikörper, ein geeigneter Blocker, ein Reaktionspuffer, wie z.B. PBS, welches ein 0,1% bovines Serumalbumin enthält, und PBS-Tween, welches 0,05% Tween 20 in PBS enthält.
Der primäre Antikörper wird mit Natriumcarbonatpuffer (pH 9,5) auf eine vorgegebene Konzentration verdünnt und an die Oberfläche jedes Wells einer 96-Well-Mikrotiter-Platte gebunden. Jeder Well wird mithilfe einer Blockierungslösung blockiert und dann mit PBS-Tween gewaschen.
Das Protein oder Standard-IgE wird zu jedem Well z.B. in einer Menge von 100 μl/Well zugesetzt und bei Raumtemperatur über einen geeigneten Zeitraum, z.B. 3 Stunden, inkubiert. Die Platte wird zwei- oder dreimal mit PBS-Tween gewaschen. Der sekundäre Antikörper wird gegebenenfalls mit dem Reaktionspuffer verdünnt und in einer Menge von 100 μl/Well zu jedem Well hinzugefügt. Die Inkubationen werden bei Raumtemperatur etwa 3 Stunden lang fortgesetzt. Die Platte wird mit PBS-Tween gewaschen.
Die Substratlösung wird dann zu jedem Well hinzugefügt und zur Entwicklung von Farbe wenige Minuten lang im Dunkeln inkubiert. Nach Entwicklung einer detektierbaren Farbe wird zu jedem Well eine Stopp-Lösung hinzugefügt. Die Platte wird dann mithilfe eines Mikroplattenlesegeräts bei 490 nm gelesen, um die im Plasma enthaltene IgE-Konzentration basierend auf einer aus dem Standard-IgE hergestellten Kalibrierungskurve zu berechnen.
Jedes Peptid kann auf seine in-vivo-immunmodulative Aktivität unter Einsatz eines Rattenmodels mit Autoimmunenzephalomyelitis getestet werden.
Einer Ratte wird nämlich über die Fußballen ihrer Hinterfüße das Protein der vorliegenden Erfindung in einer Menge von 10 bis 1.000 μg/Ratte, bevorzugt 100 μg/Ratte, verabreicht. Der Kontrollgruppe wurde auf ähnliche Art und Weise PBS verabreicht. Diese Verabreichung dauert 41 Tage an. Am 41. Tag nach Beginn der Verabreichung wird den Test- und Kontrollgruppen außerdem basisches Myelinproteinpeptid von Meerschweinchen (GPE), das mit einem geeigneten Adjuvans emulgiert ist, in einer Menge von etwa 2 bis 10 μg/Ratte, bevorzugt 5 μg/Ratte, verabreicht. Bevorzugte Adjuvanzien umfassen abgetötetes Mycobacterium tuberculosis und dergleichen.
Am 14. Tag nach GPE-Verabreichung werden Veränderungen der klinischen Symptome beider Gruppen gemäß den folgenden in Tabelle 1 dargestellten Kriterien beurteilt. Tabelle 1 Kriterien zur Beurteilung klinischer Symptome

* "Anormaler Stehreflex" steht dafür, dass ein Versuchstier nicht sofort aufstehen kann, wenn es auf den Rücken gedreht wird, oder seinen Schwanz nicht halten kann, wenn er angehoben und dann losgelassen wird.

Jedes Protein der vorliegenden Erfindung, das auf seine immunmodulative Aktivität getestet wird, kann zur Herstellung eines therapeutischen Mittels gegen Immunerkrankungen mit jedem beliebigen pharmazeutisch annehmbaren Bestandteil formuliert werden. Der pharmazeutisch annehmbare Bestandteil umfasst einen Arzneimittelträger, ein Bindemittel, ein Desintegrationsmittel, einen Farbstoff, einen Geschmacksstoff, ein Korrektivmittel, ein Lösungsmittel, einen Emulgator, einen Konservierungsstoff, ein Suspensionsmittel, einen Stabilisator, ein isotonisierendes Mittel und einen Puffer.
Insbesondere umfasst der Arzneimittelträger Stärke oder Laktose zur Formulierung von Feststoffen und Wasser zur Formulierung von Fluiden. Das Bindemittel umfasst Gummi Arabicum, Stärke, Carboxymethylcellulose-Natrium (CMC-Na), Wasser, Ethanol und einfachen Sirup. Das Desintegrationsmittel umfasst verschiedene Tenside, Carbonat oder dergleichen. Die Farbstoffe umfassen natürliche und synthetische, vom Lebensmittelgesetz akzeptierte Farbstoffe.
Die Geschmacksstoffe umfassen verschiedene ätherische Öle, wie z.B. Orangenöl, Zitronenöl und Korianderöl. Das Korrektivmittel umfasst einfachen Sirup und Saccharose. Die Lösungsmittel umfassen gehärtete Polyoxyethylen-Rizinusöl-Derivate, Natriumbenzoat und Ethylendiamin.
Die Emulgatoren umfassen verschiedene Arten von Span, wie z.B. Span 20 und Span 60, verschiedene Arten von Tween, wie z.B. Tween 20 und Tween 80. Die Konservierungsstoffe umfassen Phenol, Thimerosal und Chlorbutanol.
Die Suspensionsmittel umfassen CMC-Na, Methylcellulose, simplen Sirup oder Glycerin. Die Stabilisatoren umfassen Albumin, Gelatine und Sorbit.
Die isotonisierenden Mittel umfassen Glucose und Natriumchlorid. Die Puffer umfassen Phosphate.
Diese Inhaltsstoffe können für die Formulierung alleine oder in Kombination verwendet werden.
Das Peptid der vorliegenden Erfindung kann in jeder beliebigen Dosierungsform formuliert werden, einschließlich, aber nicht ausschließlich, in Tabletten-, Granulat-, Kapsel-, Injektionsform oder dergleichen.
Da das Protein der vorliegenden Erfindung wie oben beschrieben die T-Zellen-Untereinheit Th2 betrifft, sind Immunerkrankungen, die mit therapeutischen Mitteln gegen Immunerkrankungen behandelt werden können, jene, von denen angenom men wird, dass sie Th1-dominant sind. Insbesondere umfassen Immunerkrankungen, die Th1-dominant sein sollen, Multiple Sklerose, insulinabhängigen Diabetes Mellitus, Morbus Crohn, Uveitis, chronischen Rheumatismus und systemischen Lupus erythematodes.
Das Protein der vorliegenden Erfindung kann auch als ein die IgE-Produktion stimulierendes Mittel zur Behandlung von allergischen Erkrankungen eingesetzt werden. Das bedeutet, es ermöglicht reifen B-Zellen, d.h. polyklonalen B-Zellen, zu proliferieren, wodurch eine erhöhte nicht-spezifische IgE-Produktion ausgelöst wird, jedoch keine monoklonale IgE-Produktion durch Blastenbildung wie sie für gewöhnlich bei Erhöhung des IgE-Spiegels zu beobachten ist.
Wenn das Protein der vorliegenden Erfindung als Mittel zur Stimulation der IgE-Produktion eingesetzt wird, umfassen die zu behandelnden allergischen Erkrankungen chronische Bronchitis, atopische Dermatitis, Pollinosis (Rhinitis allergica), allergische Angiitis, Heuschnupfen, allergische Gastroenteritis, allergische Hepatopathie, allergische Zystitis und Purpura anaphylactoides.
Das Mittel, welches die IgE-Produktion stimuliert und das Protein der vorliegenden Erfindung umfasst, kann auch zur Behandlung von Abstoßungsreaktionen bei Organtransplantation eingesetzt werden. Wie hierin verwendet steht "Organtransplantation" für die Transplantation von Organen, einschließlich Niere, Leber, Lunge und Herz. Es können auch andere Organe, wie z.B. Knochen, Haut und Sehnen, eingeschlossen sein. Das die IgE-Produktion stimulierende Mittel der vorliegenden Erfindung kann nach Organtransplantationen auftretende Abstoßungsreaktionen lindern, weil es die Produktion von nicht-spezifischem IgE stimuliert.
Nachfolgend ist ein Beispiel für eine Formulierung angeführt, welches von den Proteinen der vorliegenden Erfindung V1+V1 verwendet.
Injektionsformulierung
Es wurden 10 mM Phosphatpuffer (9ml, pH 7,4) als Puffer und menschliches Serumalbumin (10 mg) als Stabilisator zugesetzt und in 1 mg/ml V1+V1-Lösung gelöst. Die resultierende Lösung wurde zu 1 ml in 5-ml-Glassphiolen aufgeteilt.

V1+V1 0,1 mg

Phosphatpuffer 0,9 ml

menschliches Serumalbumin 1 mg
Jede Phiole wurde bei –20°C gefriergetrocknet und dann versiegelt, um eine Injektionsformulierung zu erhalten. Wenn sie eingesetzt werden soll, kann die Injektionsformulierung mit 1 ml destilliertem Wasser zu Injektionszwecken (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) wieder hergestellt werden.
Diese Beschreibung umfasst einen Teil des oder den gesamten in der Beschreibung und/oder den Zeichnungen der Japanischen Patent-Anmeldung Nummer 10-87189, das ein Prioritätsdokument der vorliegenden Anmeldung ist, offenbarten Inhalts/Inhalt.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Bildung von Vektor pPD5 zur Expression des Proteins gemäß der vorliegenden Erfindung.
2 zeigt die Bildung von Vektor pPD4 zur Expression des Proteins gemäß der vorliegenden Erfindung.
3 zeigt die Bildung der Vektoren pPD17 und pPD18 zur Expression der Proteine gemäß der vorliegenden Erfindung.
4 zeigt die Bildung der Vektoren pPD7 und pPD9 zur Expression der Proteine gemäß der vorliegenden Erfindung.
5 zeigt die Bildung von Vektor pPD27 zur Expression des Proteins gemäß der vorliegenden Erfindung.
6 zeigt Veränderungen des IgE-Spiegels im Blut bei Verabreichung von V1.
7 zeigt die Suppression einer passiven anaphylaktischen Reaktion bei einer Ratte, welcher das Protein gemäß der vorliegenden Erfindung verabreicht wurde.
DIE BESTEN AUSFÜHRUNGSARTEN DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung wird nun detaillierter beschrieben, ist aber nicht darauf beschränkt.
Beispiel 1: Herstellung eines E.-coli-Stamms, welcher DiNCF produziert, das ein von Dirofilaria immitis stammendes Protein ist.
Ein Vektor pDP5, ein DiNCF-V1-Expressionsplasmidvektor, wurde wie folgt hergestellt (1).
Gemäß den Verfahren von Ohashi (Ohashi, M., et al., Mol. Immunol. 30 (14), 1315–1320 (1993)) wurde ein pDi6 hergestellt. Aus dem Herzen eines Hundes, welcher auf natürliche Weise mit D. immitis infiziert worden war, wurden 100 mg erwachsene Würmer gewonnen, diese mit physiologischer Salzlösung gewaschen und auf Eis in Stücke geschnitten. Unter Einsatz eines mRNA-Reinigungssets (Pharmacia) wurde mRNA aus diesen Stücken gereinigt.
Unter Einsatz dieser mRNA wurde mithilfe des cDNA-Synthesesets (Pharmacia) cDNA synthetisiert. Die cDNA wurde in eine EcoRI-Stelle eines λgt11-Vektors (Promega Biotec, Madison, Wisconsin, USA) insertiert. 5 μg der DNA dieses cDNA- insertierten λgt11 wurde unter Einsatz von Gigapack (Stratagene, La Jolla, Kalifornien, USA) in-vitro-verpackt, wodurch eine cDNA-Bank geschaffen wurde.
Der Klon von Interesse wurde wie folgt aus dieser cDNA-Bank ausgewählt. Das Blut eines mit D. immitis infizierten Hundes wurde mit 50 mM Natriumcarbonatpuffer (pH 9,5) in einem Verhältnis von 1:1.000 verdünnt. Unter Einsatz von Anti-DiNCF-Antikörpern, die aus dieser Verdünnung gewonnen wurden, wurde aus 2 × 10⁵ Klonen mithilfe des Verfahrens von Huynh et al. (Huynh, T.V., et al., A Practical Approach, Vol. 1, 49–78, Glover D.M. (Hrsg.), IRL Press, Oxford) der Klon von Interesse ausgewählt.
Zum Beispiel wurden die Antikörper an die Oberfläche einer Kunststoff-Petrischale gebunden und die Schale unter Einsatz von z.B. einem Block A (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) blockiert. Zur Bildung von Lysaten wurden in einer Lösung, welche eine 10-fache Verdünnung von Block A enthielt, Phagen suspendiert. Die resultierenden Lysate wurden zu der Petri-Schale zugesetzt und zwei Stunden lang bei 37°C inkubiert. Nachdem die Petri-Schale mit PBS, welches 0,1% Tween 20 enthielt, gewaschen worden war, wurden zu der Petri-Schale 100 mM Triethylamin zugesetzt, sodass die Phagen eluiert wurden.
Die Phagen, die wie zuvor beschrieben erhalten wurden, wurden wieder mit E. coli infiziert und konnten dann gemeinsam mit E. coli proliferieren. Diese Manipulation wurde mehrere Male wiederholt, wobei positive Klons ausgewählt wurden.
10 μg der ausgewählten Klone wurden mit 100 U/μl EcoRI verdaut, sodass 0,1 μg DiNCF, ein Teil der zu insertierenden Gene, aus der Phagen-DNA ausgeschnitten wurden. 1 μg des Phagemidvektors pBluescript SK(–) wurde mit 10 U/μl EcoRI verdaut. Die 0,1 μg des DiNCF-Gens, das wie oben beschrieben geschnitten wurde, wurden in die EcoRI-Stelle dieses verdauten Phagemidvektors insertiert, wodurch ein Plasmid pDi6 geschaffen wurde.
(1) Amplifikation der DiNCF-V1-Region mit einer hinzugefügten Restriktionsenzym-Spaltungsstelle.
Die DiNCF-V1-Region wurde mittels PCR unter Einsatz von pDi6 als Matrize und der folgenden zwei Primer amplifiziert:
N-Terminaler Primer:
5'-GCATATGAATGATCATAATTTAGAAAGC-3' (Seq.-ID Nr. 16) und
C-terminaler Primer:
5'-CTAAAGGATCCTATCACCGCTTACGCCGTTCATTCATTG-3' (Seq.-ID Nr. 17).
Die zwei Primer wurden erhalten, indem Biologica CO., LTD. um die Synthese gebeten wurde.
Unter Einsatz von "PROGRAM TEMP CONTROL SYSTEM PC-700" (ASTEC CO., LTD.) wurde eine PCR unter folgender Bedingung durchgeführt.
Es wurden 0,5 μl von fünf Einheiten Ex-Taq-DNA-Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.) und die oben genannten Primer, aufgelöst zu 25 nmol/ml mit destilliertem Wasser, eingesetzt. Es wurden Puffer, Substrate und andere an Ex Taq^TM (Takara Shuzo Co., Ltd.) gebundene Mittel verwendet.
Matrizen-DNA: pDi6 (bereitgestellt von Prof. Makoto Ohashi von der Tokushima University) wurde in einer Konzentration von 100 ng/ml eingesetzt. Reaktionszusammensetzung:

Matrizen-DNA 1 μl

Destilliertes Wasser 37,5 μl

dNTP 4 μl

N-terminaler Primer 1 μl

C-terminaler Primer 1 μl

× 10 PCR-Puffer 5 μl

Ex Taq 0,5 μl
Reaktionsschritte
Der N-terminale Primer verfügt über eine hinzugefügte Ndel-Stelle und der C-terminale Primer über eine hinzugefügte BamHI-Stelle. Die amplifizierten Gene wurden mit beiden Restriktionsenzymen (Takara Shuzo Co., Ltd.) verdaut. Der Verdau wurde unter Einsatz von 10 Einheiten Restriktionsenzyme pro μg DNA bei 37°C 2 Stunden lang durchgeführt. Der spezielle an die Restriktionsenzyme gebundene Puffer wurde als Reaktionszusammensetzung gemäß den Gebrauchsanweisungen des Herstellers verwendet. In den folgenden Beispielen wurden, wenn nicht anders angegeben, dieselben oben beschriebenen Verdaubedingungen für Restriktionsenzyme angewendet.
Die DNAs an beiden Enden, die über keine V1-Region verfügten, wurden unter Einsatz von MicroSpin-Säule S400 (Pharmacia) entfernt.
(2) Herstellung der ringförmigen DNA von Interesse
An einem Expressionsvektor pET3a wurde unter Einsatz von Nde I und BamH I doppelter Verdau ausgeführt. Dann wurde unter Einsatz der oben angeführten MicroSpin-Säule S400 ein Hauptsegment des Vektors gereinigt.
Das mit Nde I und BamH I verdaute pET3a wurde an die oben genannten Fragmente ligiert, die mithilfe von PCR unter Einsatz eines DNA-Ligationsets (Takara Shuzo Co., Ltd.) gemäß den Anweisungen im Anhang amplifiziert wurden, wodurch die ringförmige DNA von Interesse hergestellt wurde.
Beispiel 2: Transformation von E. coli mit pDP5
Durch das Einführen eines E.-coli-Stamms JM109 in die in Beispiel 1 erhaltene ringförmige DNA wurde eine Transformation durchgeführt, durch welche ein Transformant erhalten wurde. Diese Transformation wurde gemäß dem CaCl₂-Transformationsverfahren [siehe Hanahen, D., J. Mol. Biol. 166, 557–580 (1983)] durchgeführt.
Dieser Transformant wurde in einem LB-Medium, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, in einem Inkubator über Nacht bei 37°C kultiviert. Die Zellen wurden mittels Zentrifugation bei 10.000 × g 10 Minuten lang bei 4°C aus dem Kulturfluid gewonnen.
Aus den resultierenden Zellen wurde gemäß dem alkalischen SDS-Verfahren (Birnboim, H. C., und Doly, J., Nucleic Acid Research 7, 1513–1523 (1979)) ein Plasmid extrahiert und gereinigt. Das bedeutet, die Zellen wurden in Glukosepuffer suspendiert und in 1% SDS, 0,4 N NaOH lysiert. Nach Neutralisierung mit Kaliumacetat wurde die Lösung zentrifugiert. Dann wurden die Niederschläge gewonnen, mit Phenol behandelt und ihnen dann Ethanol hinzugefügt, wodurch ein Plasmid ausgefällt wurde.
Die Nucleotidsequenz des resultierenden Plasmids pDP5 wurde mithilfe eines Sequenase-Sets (United States Biochemical Corporation, U.S.) gemäß einem Didesoxyverfahren getestet, um nachzuweisen, dass das Insert von Interesse korrekt insertiert wurde und vor und nach dem Insert keine unerwarteten Veränderungen aufgetreten sind. Der Terminus "Veränderung" umfasst auch jene Veränderung, bei welcher das Insert gekürzt wird.
Beispiel 3: Herstellung eines DiNCF-V2-Expressionsvektors
Ein DiNCF-V2-Expressionsvektor wurde gemäß einem Verfahren hergestellt, das grundsätzlich jenem zur Herstellung von DiNCF V1 ähnlich war. Das bedeutet, der DiNCF-V2-Expressionsvektor wurde auf dieselbe Art und Weise hergestellt wie der Expressionsvektor von DiNCF V1, mit der Ausnahme, dass ein C-terminaler Primer sich von jenem unterschied, der in den Schritten zur Amplifikation insertierter Gene in PCR verwendet wurde. Dieser hierin verwendete C-terminale Primer war wie folgt:
5'-CTAAAGGATCCTATCACCGCTTACGCCTTTCATGTATCA-3' (Seq.-ID Nr. 18)
Der DiNCF-V2-Expressionsvektor, welcher unter Einsatz des oben genannten C-terminalen Primers erhalten wurde, wurde pDP4 genannt.
Die Sequenz wurde auf dieselbe Art und Weise wie oben beschrieben nachgewiesen. Die Sequenz von Expressionsvektoren, welche in den folgenden Beispielen hergestellt wurden, wurde auf dieselbe Art und Weise nachgewiesen.
Beispiel 4: Herstellung von Vektoren zur Expression von DiNCF V1+V1 (V1+V1) und DiNCF V2+V1 (V2+V1)
5 μg von pDPS, einem Vektor zur Expression von DiNCF V1, wurden mit 50 Einheiten des Restriktionsenzyms Nsp V vollständig verdaut.
Diese verdauten Fragmente wurden gemäß Standard-Verfahren mit Phenol behandelt und dann unter Einsatz von 20 Einheiten alkalischer Phosphatase aus Rinderdärmen (CIP, SIGMA) behandelt. Nach dieser Behandlung wurde Phenol als Denaturierungsmittel eingesetzt, und die resultierenden Produkte wurden in eine wässrige Phase, welche die verdauten Fragmente enthielt, und eine Phenolphase getrennt. Dann wurde die wässrige Phase untersucht. Diese Phenolbehandlung deaktivierte die Enzyme.
Hingegen wurden 5 μg von pDI6, einem Vektor, der DiCNF-Gene enthielt, die in Tandem in der Reihenfolge von V1-, V2- und V1-Regionen miteinander verbunden waren, mit 20 Einheiten eines Restriktionsenzyms Nsp V verdaut. Die verdauten Produkte wurden einer 2%igen Agarosegelelektrophorese unterworfen, wodurch unter Einsatz eines "Gene Clean II"-Sets (Funakoshi Co., Ltd.) eine etwa 400-bp-Bande gereinigt wurde.
Das zuvor genannte 400-bp-Fragment wurde an das oben linearisierte pDP5 ligiert, welches mit CIP behandelt worden war. Diese Ligation wurde auf dieselbe Art und Weise wie oben beschrieben durchgeführt. Unter Einsatz der ligierten DNA wurde E. coli JM 109 transformiert.
Die verschiedenen Stämme der resultierenden Transformantenklone wurden auf geeignete Art und Weise ausgewählt und in LB-Medium über Nacht bei 37°C in Gegenwart von 50 μg/ml Ampicillin kultiviert. Die Zellen wurden mittels 10-minütiger Zentrifugation der Kulturlösung bei 10.000 × g bei 4°C gewonnen. Plasmid-DNAs wurden aus den Zellen extrahiert und mithilfe eines alkalischen SDS-Verfahrens (wie oben beschrieben) gereinigt.
Jedes erhaltene Plasmid wurde mit Nde I und BamH I verdaut und dann mittels 1,5%iger Agarosegelelektrophorese analysiert.
Für ein Gen, bei dem V2 an V1 oder V2 gebunden war, erschien wie erwartet eine etwa 800-bp-Bande. Ein Plasmid des Klons, für welchen die 800-bp-Bande erschienen ist, wurde mit 10 Einheiten des Restriktionsenzyms AlwN I verdaut. Die verdaute DNA wurde mit 1,2%iger Agarosegelelektrophorese analysiert.
Diese Enzymbehandlung führte zur der Erzeugung von drei Banden, 2,9 kbp, 2,1 kbp bzw. 0,4 kbp für V1+V1. Für V2+V1 wurden zwei Banden von 3,3 kbp bzw. 2,1 kbp erzeugt. Die Erzeugung dieser Banden wurde als ein analytischer Indikator angesehen, dass zwei Plasmide von Interesse erhalten wurden.
Der V1+V1-Expressionsvektor wurde pDP18 genannt, der V2+V1-Expressionsvektor wurde pDP17 genannt.
Beispiel 5: Herstellung eines Vektors zur Expression von DiNCF V1+V2 (V1+V2) und DiNCF V2+V2 (V2+V2)
Vektoren zur Expression von DiNCF V1+V2 und DiNCF V2+V2 wurden in etwa auf dieselbe Art und Weise hergestellt wie im Verfahren zur Produktion der oben angeführten Vektoren für DiNCF V1+V1 und DiNCF V2+V1. Der Unterschied bestand darin, dass im ersten Schritt in Beispiel 4 pDP5 mit Nsp V verdaut wurde, in diesem Beispiel aber pDP4 mit Nsp V verdaut wurde. Mit Ausnahme dieses Unterschieds wurden die Vektoren auf dieselbe Art und Weise hergestellt wie in Beispiel 4.
Als die oben angeführten Vektoren zur Expression von DiNCF V1+V2 und DiNCF V2+V2 hergestellt wurden, wurden für V1+V1 bei Elektrophorese drei Banden von 2,9 kbp, 2,1 kbp und 0,4 kbp und für V2+V1 zwei Banden von 3,3 kbp und 2,1 kbp beobachtet.
Jedoch wurden für den Vektor zur Expression von DiNCF V1+V2 zwei Banden mit einem Molekulargewicht von 2,9 kbp bzw. 2,5 kbp und eine Bande für DiNCF V2+V2 beobachtet.
Das Auftreten dieser Banden wurde als Indikator angesehen, wodurch zwei Plasmide erhalten wurden. Der V1+V2-Expressionsvektor wurde pDP7 genannt, und der V2+V2-Expressionsvektor wurde als pDP9 bezeichnet.
Beispiel 6: Herstellung von Vektoren zur Expression von DiNCF V1+V2+V1 (V1+V2+V1)
(1) Produktion eines zu insertierenden Fragments
10 μg pDi6 wurden teilweise mit 8 Einheiten eines Restriktionsenzyms Nsp V bei 25°C 30 Minuten lang verdaut.
Dieses teilweise verdaute pDi6 wurde einer 1,5%igen Agarosegelelektrophorese unterworfen, und ein Fragment mit einer Bande von etwa 800 bp, welche auf dem Gel beobachtet wurde, wurde unter Einsatz des "Gene Clean II"-Sets (Funakoshi Co., Ltd.) gereinigt.
Dieses gereinigte 800-bp-Fragment wurde auf dieselbe Art und Weise wie in Beispiel 1 unter Einsatz eines Ligationsets (Takara Shuzo Co., Ltd.) an pDP4 ligiert, das schon mit Nsp V verdaut und mit CIP wie im Verfahren zur Herstellung der oben genannten Vektoren zur Expression von DiNCF V1+V1 und DiNCF V2+V1 beschrieben behandelt worden war.
(2) Transformation und Gewinnung des Vektors von Interesse
Unter Einsatz jener DNA, die durch Ligation wie oben beschrieben erhalten wurde, wurde E. coli JM109 mittels CaCl₂-Transformationsverfahren transformiert. Das bedeutet, die DNA wurde in einer Konzentration von 10 ng/ml zu 0,1 ml von handelsüblichen JM109-kompetenten Zellen hinzugefügt, dann wurde das Gemisch in Wasser 30 Minuten lang stehen gelassen. Daraufhin wurde das Gemisch 45 Sekunden lang bei 42°C inkubiert, dann 1 bis 2 Minuten lang auf Eis stehen gelassen. SOC-Medium (LIFE TECHNOLOGIES ORIENTAL, INC.), das zuvor auf 37°C erhitzt wurde, wurde zu dem Gemisch zugesetzt, um 1 ml des resultierenden Gemisches zu erhalten, und dann 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert. Darauf folgend wurden 100 μl dieser Lösung auf LB-Agar-Medium inokuliert und dann über Nacht bei 37°C stehen gelassen, wodurch ein D050-Transformantenstamm erhalten wurde.
Einige der D050-Transformantenstämme wurden auf geeignete Art und Weise ausgewählt und in LB-Medium (5 ml), das 50 μg Ampicillin enthielt, bei 37°C über Nacht kultiviert. Dieses Kulturfluid wurde bei 10.000 × g 10 Minuten lang bei 4°C zentrifugiert, dann wurden die Zellen gewonnen. Die Plasmid-DNAs von Interesse wurden aus den Zellen extrahiert und mithilfe des alkalischen SDS-Verfahrens gereinigt [Birnboim, H.C., und Doly, J., Nucleic Acid Research 7, 1513–1523 (1979)].
Jedes der erhaltenen Plasmide wurde mit Nde I und BamH I verdaut, dann mithilfe von 1,5%iger Agarosegelelektrophorese analysiert.
Ein Plasmid, welches das V1+V2+V1-Gen von Interesse enthält, führt zur Erzeugung einer etwa 1.200-bp-Bande. Dementsprechend wurden von Klonen erhaltene Plasmide, für welche eine 1.200-Bande aufgetreten ist, mit 10 Einheiten eines Restriktionsenzyms AlwNl 2 Stunden lang bei 37°C verdaut.
Folglich wurde DNA, die wie oben beschrieben verdaut wurde, mithilfe von 1,2%iger Agarosegelelektrophorese analysiert.
Im oben angeführten Verfahren variiert das Molekulargewicht abhängig von der Richtung eines zu insertierenden Fragments. Das bedeutet, ein Fragment wird nicht immer in einer erwarteten Richtung, 5' zu 3', insertiert, sondern auch in der entgegengesetzten Richtung 3' zu 5'. Zum Beispiel wurden, als das AlwNl-verdaute Fragment in der erwarteten Richtung insertiert wurde, drei Banden, 2,9 kbp, 2,1 kbp und 0,8 kbp, beobachtet. Als das Fragment in der entgegengesetzten Richtung insertiert wurde, wurden drei Banden, 3,2 kbp, 2,1 kbp und 0,3 kbp, beobachtet. Es wurden Klone ausgewählt, für welche die drei Banden, 2,9 kbp, 2,1 kbp und 0,8 kbp, auftraten, wenn das Fragment in der erwarteten Richtung insertiert wurde. Der Klon wurde pDP27 genannt.
Beispiel 7: Herstellung verschiedener Expressionstransformanten
E. coli HMS174 (DE3) wurde unter Einsatz von sieben Vektoren, pDP4, pDPS, pDP7, pDP9, pDP17, pDP18 und pDP27, transformiert, die wie in den Beispielen 1 bis 6 beschrieben hergestellt wurden. Die Transformation wurde mithilfe der in den oben angeführten Beispielen beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Die durch diese Transformation erhaltenen Transformanten wurden jeweils D025, D012, D027, D029, D037, D038 bzw. D057 genannt.
Beispiel 8: Nachweis der Expression des Proteins gemäß der vorliegenden Erfindung
Verschiedene in Beispiel 7 erhaltene Transformanten sind in 1.000 ml eines M9ZB-Mediums in einem CO₂-Inkubator bei 37°C kultiviert worden, bis das Absorptionsvermögen A₅₅₀ 0,8 erreichte. Ein M9ZB-Medium ist wie folgt zusammengesetzt.

NZ-Amin 10 g

NaCl 5 g

NH₄Cl 1 g

KH₂PO₄ 3 g

Na₂HPO₄ 6 g

Glukose 10 g

Destilliertes Wasser 1 l
NZ-Amin wurde von WAKO Pure Chemical Industries, Ltd., erworben.
Als das Absorptionsvermögen A₅₅₀ 0,8 erreichte, wurde zu dem Medium IPTG (Isopropylthiogalactosid) zugesetzt, um die Endkonzentration von 0,5 mM zu erreichen, gefolgt von einer 2,5 Stunden dauernden Kultivierung.
Dieses Kulturmedium wurde bei 10.000 × g 10 Minuten lang bei 4°C zentrifugiert, dann wurden Zellen gewonnen. Die Zellen aus 1,5 ml des Kulturfluids wurden in einer Lösung suspendiert, die 0,1 ml 8M Harnstoff und 0,1M Tris-HCl (pH 7,0) enthielt. Diese Suspension wurde unter Einsatz eines Beschallers, wie z.B. Ultraschall, einer Ultraschallbehandlung unterzogen und bei 15.000 U/min (10.000 × g) 5 Minuten lang bei 4°C zentrifugiert, wodurch der Überstand erhalten wurde.
Dieser Überstand wurde unter Einsatz von "Phast System" (Pharmacia) gemäß den Gebrauchsanweisungen des Herstellers einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese unterworfen. Als Kontrolle wurde ein mit einem Vektor pET3a transformierter E.-coli-Stamm eingesetzt.
Der Vergleich des Extrakts und der Kontrolle zeigte die nachstehend angeführten Unterschiede. Für den Zellextrakt aus der Kultur von D025- und D012-Stämmen wurde eine klare Bande mit einem Molekulargewicht von etwa 14.000 nachgewiesen, während für die Kontrolle an derselben Position keine Bande nachgewiesen wurde. Zusätzlich wurde für den Zellextrakt aus der Kultur von D027-, D029-, D037- und D038-Stämmen eine klare Bande mit einem Molekulargewicht von etwa 28.000 nachgewiesen, während für die Kontrolle an derselben Position keine Bande beobachtet wurde. Für den Zellextrakt der Kultur aus dem D057-Stamm wurde eine klare Bande mit einem Molekulargewicht von etwa 43.000 nachgewiesen, während für die Kontrolle an derselben Position keine Bande beobachtet wurde.
Folglich wurde mithilfe der oben genannten Manipulationen nachgewiesen, dass das Protein gemäß der vorliegenden Erfindung produziert wurde.
Beispiel 9: Produktion und Reinigung des Proteins der vorliegenden Erfindung
(1) Produktion des Proteins der vorliegenden Erfindung
Verschiedene in Beispiel 8 erhaltene Transformanten wurden auf ähnliche Art und Weise kultiviert wie im oben beschriebenen Verfahren. IPTG wurde in ähnlicher Weise zur Induktion von Expression zugesetzt.
(2) Extraktion und Reinigung des produzierten Proteins der vorliegenden Erfindung
(2-1) Extraktion des produzierten Proteins der vorliegenden Erfindung
1 l des Kulturfluids wurde bei 10.000 × g 10 Minuten lang bei 4°C zentrifugiert, und dann wurden Zellen gewonnen. 20 ml von 50 mM Salzsäure wurden zu nassen 10 g der gewonnenen Zellen zur Suspendierung zugesetzt. Unmittelbar nach diesem Schritt wurde die Zellsuspension bei 16.000 × g 5 Minuten lang bei 4°C zentrifugiert, wodurch der Überstand entfernt wurde. Danach wurden zu den übrigen Zellen 100 ml von 100mM Salzsäure zugesetzt und dann 15 Minuten bei 4°C stehen gelassen. Folglich wurde das Gemisch bei 16.000 × g 5 Minuten lang bei 4°C zentrifugiert, um den Überstand (Extrakt von Salzsäure) zu erhalten.
(2-2) Reinigung des produzierten Proteins der vorliegenden Erfindung
Nachdem der Extrakt der Salzsäure mit 1 N NaOH neutralisiert worden war, wurde schrittweise Ammoniumsulfat zugesetzt, indem es in der Lösung bis zu 60%iger Sättigung gelöst wurde. Als das Ammoniumsulfat vollständig aufgelöst war, wurde das Gemisch 2 Stunden lang bei 4°C stehen gelassen. Dann wurde das Gemisch bei 16.000 × g 10 Minuten lang bei 4°C zentrifugiert, wodurch der Überstand erhalten wurde.
Schrittweise wurde Ammoniumsulfat zugesetzt, indem es in diesem Überstand bis zu 90%iger Sättigung gelöst wurde. Als das Ammoniumsulfat vollständig gelöst war, wurde das Gemisch 2 Stunden lang bei 4°C stehen gelassen, dann bei 16.000 × g 10 Minuten lang bei 4°C zentrifugiert. Nachdem der Überstand entfernt worden war, wurde das Präzipitat in 5 ml PBS (physiologischem Phosphatpuffer) gelöst, dann getrennt und durch unter Unterziehen des Gemisches einer Superdex-200-Gelfiltrationschromatographie (Pharmacia) gereinigt. Bedingungen für Chromatographie

Elutionslösungsmittel: PBS

Fließgeschwindigkeit: 0,5 ml/min

Detektion: UV 280nm

Säule: 26 mm Φ × 600 mm
Jede Komponente wurde unter den oben beschriebenen Bedingungen getrennt, und jede mittels Absorption detektierte Fraktion wurde untersucht. Diese Fraktionen wurden mittels SDS-Poylacrylamidgelelektrophorese analysiert, sodass Fraktionen, die nur die Bande von Interesse enthielten, als gereinigte Endprodukte erhalten werden konnten.
Beispiel 10: Aufklärung der physiologischen Wirkungen des Proteins der vorliegenden Erfindung
(1) Herstellung von Lymphozyten
7 Wochen alte männliche BALB/c-Mäuse (3 Mäuse pro Gruppe) wurden durch Dislokation der Wirbelsäule getötet, und dann wurde ihre Milz aseptisch entfernt. Die Milz wurde mit sterilisiertem PBS gewaschen, auf Mattglas zerkleinert, in PBS suspendiert, mit einem Nylonnetz filtriert, und dann wurden z.B. die Gewebefragmente entfernt.
Das resultierende Filtrat wurde bei 500 × g 5 Minuten lang bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde zur Entnahme von Zellen entfernt. Die Zellen wurden abermals in PBS suspendiert. Dieser Schritt wurde dreimal wiederholt, um die Zellen zu waschen.
1 ml auf 4°C gekühlter ACT-Lösung wurde zu den einer Milz entsprechenden Zellen zugesetzt und dann gut gerührt. Sofort nach dem Rührvorgang wurde das Gemisch gekühlt, bei 500 × g 5 Minuten lang bei 4°C zentrifugiert und dann dreimal mit PBS gewaschen. Das Waschen erfolgte auf ähnliche Art und Weise wie in den oben beschriebenen Verfahren. Die einer Milz entsprechenden gewaschenen Zellen wurden in RPMI-1640-Medium (GIBCO), das 1 ml 5% fötales Kälberserum (FCS) enthielt, suspendiert. Die so erhaltenen Zellen wurden als Milzlymphozytenlösung hergestellt.
(2) Herstellung von B-Zellen
10 μl Anti-Thy-1.2-Antikörper (Becton Dickinson Labware, USA) wurden zu der im oben angeführten Schritt (1) erhaltenen Milzlymphozytenlösung zugesetzt und dann 1 Stunde lang bei 4°C stehen gelassen. Das Gemisch wurde einmal mit PBS gewaschen und dann in RPMI-1640-Medium, das 900 μl 5% FCS enthielt, suspendiert.
Zu dieser Suspension wurden 100 μl Komplementlösung (Kaninchen-Antikörper mit geringer Zytotoxizität, hergestellt von Cedarlane Laboratories) zugesetzt. Das Gemisch wurde gut gerührt und konnte dann 1 Stunde lang bei 37°C reagieren. Das Gemisch wurde während der Reaktion alle 15 Minuten gerührt.
Nachdem die Reaktion abgeschlossen war, wurde die Suspension zweimal mit PBS gewaschen, in RPMI-1640-Medium, das 5% FCS enthielt, auf eine Konzentration von 8 × 10⁵/ml suspendiert, sodass eine B-Zellsuspension erhalten wurde.
(3) Proliferative Reaktion auf Stimulation
Die im oben angeführten Schritt (2) hergestellte B-Zellsuspension, 500 μl/Well, wurde zu 24-Well-Platten zugesetzt und in RPMI-1640-Medium, das 5% FCS enthielt, in Gegenwart von 5% CO₂ bei 37°C kultiviert. Eine Stunde nachdem die Kultur begonnen worden war, wurde das Protein dieser Erfindung in einer Konzentration von 1 bis 10 μg/ml zugesetzt. Nach dem Zusetzen des Proteins wurde die Suspension 48 Stunden lang unter den oben beschriebenen Bedingungen kultiviert. Das Ausmaß des Zellwachstums wurde mithilfe eines MTT-Tests [Mosmann, T., et al., J. Immunol. Methods 65, 55–63 (1983)] bestimmt.
Das bedeutet, zu 500 μl der Zellsuspension wurden 50 μl MTT-Lösung, welche über die folgende Zusammensetzung verfügt, zugesetzt und 4 Stunden lang bei 37°C stehen gelassen. Daraufhin wurden zum Stoppen der Reaktion zu dem Gemisch 450 μl Stopplösung mit der nachstehend angeführten Zusammensetzung zugesetzt, und es wurde dann bei Raumtemperatur 30 Minuten stehen gelassen. Dann wurde das Absorptionsvermögen bei 630 nm und 570 nm, als A₆₃₀ und A₆₃₀ bezeichnet, bestimmt.

MTT-Lösung: MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid, Sigma), gelöst in PBS in einer Konzentration von 5 mg/ml.
Stopp-Lösung: Isopropanol, das 0,04 N Salzsäure enthält.

In einem Blindversuch wurde das Medium auf dieselbe Art und Weise behandelt, und das bei 630 nm und 570 nm bestimmte Absorptionsvermögen, als A0630 bzw. A0570 bezeichnet; wurde verwendet. MTT-Testwerte wurden mithilfe der folgenden Formel bestimmt. MTT-Testwert = (A570 – A630) – (A570 – A0630)
Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse der proliferativen Reaktion einer B-Zelle aufgrund des Proteins dieser Erfindung, welche mithilfe des oben beschriebenen Verfahrens bestimmt wurde. LPS wurde als positive Kontrolle verwendet.
Als Kontrolle wurde in (3) eine Kultivierung durchgeführt, bei welcher kein Protein dieser Erfindung zugesetzt wurde, und auf ähnliche Art und Weise wurden MTT-Testwerte bestimmt. Tabelle 2 Ergebnisse des MTT-Tests
Aus den oben angeführten Ergebnissen wurden erhöhte Ergebnisse im MTT-Test, welche die Gegenwart einer proliferativen Reaktion einer B-Zelle auf das Protein dieser Erfindung vorschlagen, nachgewiesen. V1+V1 verursachte eine proliferative Reaktion der B-Zelle auf Stimulation, die fast jener von V1 entsprach. Für V2, V2+V1 und V1+V2+V1 wurde ebenfalls eine proliferative Reaktion der B-Zelle auf Stimulation nachgewiesen.
Beispiel 11: Nachweis inddzierter IgE-Produktion
(1) Induktion der Produktion von IgE
Das Gemisch aus 1 μg DiNCF V1 und 200 μl Alaun wurde 7 Wochen alten männlichen BALB/c-Mäusen (3 Mäuse pro Gruppe) intraperitoneal verabreicht.
Mit einer heparinisierten Röhre wurde vor Verabreichung und an den Tagen 7, 14 und 21 nach Verabreichung aus der Schanzarterie Blut abgenommen. Das abgenommene Blut wurde bei 10.000 × g 5 Minuten lang bei 25°C zentrifugiert, um das Plasma zu trennen.
Das IgE im Plasma wurde mithilfe der Enzymantikörpertechnik bestimmt. Das IgE wurde mithilfe der nachstehend beschriebenen Enzymantikörpertechnik bestimmt.
(2) IgE-Bestimmungsreagenz
Die folgenden Reagenzien wurden als Bestimmungsreagenzien eingesetzt. Anti-DNPIgE (YAMASA CORPORATION) wurde als Standard-IgE eingesetzt. Monoklonaler Anti-Maus-IgE-Fc-ε-Ratten-Antikörper (COSMO BIO Co., Ltd.) wurde als primärer Antikörper eingesetzt, polyklonaler Peroxidase-markierter Anti-Maus-IgE-Antikörper als sekundärer Antikörper. Ein Block A (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) wurde als Blocker eingesetzt. PBS, das 0,1% bovines Serumalbumin enthielt, wurde als Reaktionspuffer eingesetzt. PBS, das 0,05% Tween 20 enthielt, wurde als PBS-Tween verwendet.
(3) IgE-Bestimmung
Die primären Antikörper wurden unter Einsatz von 50 mM Natrumcarbonatpuffer (pH 9,5) hergestellt, um eine Konzentration von 5 μg/ml zu erhalten. Die Antikörper wurden in jeden Well einer 96-Well-Mikrotiterplatte eingeführt, sodass sie an die Oberfläche jedes Wells gebunden waren.
Die 96-Well-Mikrotiterplatte wurde 16 Stunden lang bei 4°C stehen gelassen. Nachdem die Lösung entfernt worden war, wurde ein auf ein Vierfaches mit destilliertem Wasser verdünnter Block A zugesetzt, 300 μl pro Well, um die Platte zu blockieren. Die Platte wurde 1 Stunde lang bei 37°C stehen gelassen und dann dreimal mit PBS-Tween gewaschen.
Zu jedem Well wurden jeweils 100 μl des Proteins der vorliegenden Erfindung oder des Standard-IgE zugesetzt, und dies konnte 3 Stunden lang bei 25°C reagieren. Die Platte wurde dreimal mit PBS-Tween gewaschen. Zu jedem Well wurden jeweils 100 μl der sekundären Antikörper zugesetzt, die mit dem Reaktionspuffer 10.000fach verdünnt worden waren, und jeder Well konnte 3 Stunden lang bei 25°C reagieren und wurde dann dreimal mit PBS-Tween gewaschen.
In jeden Well wurden jeweils 100 μl der Substratlösung eingeführt und dieses dann mehrere Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur stehen gelassen. Als die Farbe geeignet entwickelt war, wurden zu jedem Well jeweils 100 μl Stopp-Lösung zugesetzt. Unter Einsatz eines Plattenlesegeräts wurde die Farbe bei 490 nm detektiert. Die IgE-Konzentration im Plasma wurde aus der mit dem Standard-IgE erhaltenen Kalibrierungskurve berechnet.
6 zeigt die IgE-Konzentration im Plasma, das wie oben beschrieben hergestellt wurde.
Beispiel 12: Beurteilung des Proteins der vorliegenden Erfindung basierend auf einem Modell autoimmuner Enzephalomyelitis
Weibliche Lewis-Ratten wurden in zwei Gruppen eingeteilt, jede drei Ratten umfassend. Jeder Ratte einer Gruppe, welcher V1 verabreicht wurde, wurden über die Ballen der Hinterbeine 100 μg DiNCF verabreicht. Ähnlich wurde einer Kontrollgruppe PBS verabreicht. Diese Verabreichung wurde 41 Tage lang fortgesetzt. Am 41. Tag nach Beginn der Verabreichung wurde sowohl den Testgruppen als auch den Kontrollgruppen weiters basisches Myelinproteinpeptid von Meerschweinchen (GPE), das mit einem vollständigen Freund-Adjuvans emulgiert wurde, in einer Menge von 5 μg pro Ratte verabreicht.
Am 14. Tag nach Verabreichung von GPE wurden zur Beurteilung Veränderungen der klinischen Symptome bewertet. Die Bewertungen wurden basierend auf den in Tabelle 1 dargestellten Kriterien evaluiert.
Die Ergebnisse der oben beschrieben Beurteilung sind in der nachstehenden Tabelle 3 angeführt. Tabelle 3 Beurteilung des Proteins der vorliegenden Erfindung basierend auf dem Modell autoimmuner Enzephalomyelitis

d-41 kennzeichnet Tag 41 vor Immunisierung mit GPE
d0 kennzeichnet einen Tag, an welchem zur Immunisierung GPE verabreicht wurde

Während die Kontrollgruppe die Inzidenzrate von 100% und die klinische Bewertung von 2,7 zeigte, wies die Gruppe, welcher DiNCF verabreicht worden war, die Häufig keitsrate von 33% und die klinische Bewertung von 0,7 auf. Es wurde vorgeschlagen, dass DiNCF V1 das Auftreten autoimmuner Enzephalomyelitis signifikant hemmte.
Beispiel 13: Beurteilung des Proteins der vorliegenden Erfindung basierend auf der Suppression einer Typ-I-Allergie
(1) Verabreichung des Mittels
6 Wochen alte männliche Wistar-Ratten, die nach der Geburt 7 Tage lang unter Quarantäne gestellt worden waren, wurden akklimatisiert und dann mit Ether betäubt. Die Körperbehaarung am Rücken der Ratte wurde abgeschnitten, die Haut entlang des Körpers eingeschnitten, und dann wurde mithilfe einer Pinzette eine etwa 30 mm lange, subkutane Tasche hergestellt. In eine osmotische Pumpe (Typ 2002, ALZA Corporation) wurden 200 μl von 1 mg/ml DiNCF V1, in physiologischem Phosphorsäurepuffer gelöst, eingeführt. Dann wurde die Pumpe in die Tasche insertiert. Für eine Kontrollgruppe wurde nur ein physiologischer Phosphatpuffer eingesetzt. Der eingeschnittene Teil wurde nach der Insertion vernäht.
(2) Induktion passiver Anaphylaxie
Am 21. Tag nach Verabreichung des Mittels wurden Ratten mit Ether anästhesiert und dann die Körperbehaarung ihres Vorderkörpers abgeschnitten. An 10 Stellen wurden mit physiologischer Salzlösung auf das 400fache verdünnte Anti-DNP-Ascaris-Antikörper (LSL, Titer 256:1) subkutan injiziert (0,1 ml/5 Stellen).
48 Stunden nach der Injektion der Antikörper wurde 1 ml 0,5% physiologische Evans-Blau-Salzlösung, die 1 mg der DNP-Ascaris-Antigene enthielt, in die Schwanzvene injiziert.
30 Minuten später wurden die Ratten durch Dislokation der Wirbelsäule getötet und dann die Haut am Rücken abgetrennt. Das Austreten von blauen Pigmenten an jener Stelle, an der Antikörper verabreicht wurden, wurde auf der Rückseite der Haut fotografiert.
(3) Beurteilung
Die Pigmentdichte an der fotografierten Stelle, an welcher Pigmente ausgetreten sind, wurde mit einem Densitometer (Atto Corporation) gemessen und mit der Kontrollgruppe verglichen.
(4) Ergebnisse
Die Ergebnisse, die mithilfe des oben beschriebenen Verfahrens evaluiert wurden, wurden in 7 dargestellt. Diese Ergebnisse wurden aus dem Mittelwert für drei Ratten pro Gruppe berechnet. Folglich wurde bewiesen, dass bei einer Gruppe, welcher DiNCF verabreicht wurde, das durch eine passive Anaphylaxiereaktion verursachte Austreten von blauen Pigmenten im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant gehemmt wurde. Folglich wurde bewiesen, dass DiNCF ebi Typ-I-Allergosen, wie z.B. atopischer Dermatitis, chronischer Bronchitis und Pollinosis, wirkt.
GEWERBLICHE ANWENDBARKEIT
Die vorliegende Erfindung stellt Proteine bereit, welche über eine immunmodulative Aktivität verfügen. Außerdem stellt die Erfindung Proteine bereit, welche die IgE-Produktion stimulieren können. Diese Proteine sind als immunmodulative Mittel nützlich. Das bedeutet, dass diese Proteine dieser Erfindung zur Behandlung verschiedener Erkrankungen, die mit Anomalien im Immunsystem verbunden sind, eingesetzt werden können, wenn sie als immunmodulative Mittel oder als Mittel zur Stimulation der IgE-Produktion hergestellt werden, indem sie mit Komponenten, die für gewöhnlich in anderen pharmazeutischen Zusammensetzungen eingesetzt werden, wie z.B. Trägermitteln oder dergleichen, vermischt werden. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung eines oder mehrerer Proteine zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Abstoßungsreaktionen, die bei Organtransplantation auftreten, worin die Proteine aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt sind: einem Protein der folgenden Formel (I) mit der Aktivität der Stimulierung nichtspezifischer Immunglobulinproduktion: X-Y–Z (I)worin X für eine Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 1 oder 2 steht und Y und Z jeweils nicht vorhanden sind oder für eine Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 1 oder 2 stehen; einem rekombinanten Protein mit einer aus den Seq.-ID Nr. 1–15 ausgewählten Aminosäuresequenz; und einem rekombinanten Protein mit einer aus den Seq.-ID Nr. 1–15 ausgewählten Aminosäuresequenz, in der eine Aminosäure deletiert, substituiert oder hinzugefügt ist.
Verwendung eines oder mehrerer Proteine zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Immunerkrankung, worin die Proteine aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt sind: einem Protein der folgenden Formel (I) mit der Aktivität der Stimulierung nichtspezifischer Immunglobulinproduktion: X-Y-Z (I)worin X für eine Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 1 oder 2 steht und Y und Z jeweils nicht vorhanden sind oder für eine Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 1 oder 2 stehen; einem rekombinanten Protein mit einer aus den Seq.-ID Nr. 1–15 ausgewählten Aminosäuresequenz; und einem rekombinanten Protein mit einer aus den Seq.-ID Nr. 1–15 ausgewählten Aminosäuresequenz, in der eine Aminosäure deletiert, substituiert oder hinzugefügt ist; worin die Immunerkrankung eine TH1-dominante Autoimmunerkrankung, ausgewählt aus der aus multipler Sklerose, insulinabhängigem Diabetes mellitus, Morbus Crohn, Uveitis, chronischem Rheumatismus und systemischem Lupus erythematodes bestehenden Gruppe, ist.
Verwendung eines oder mehrerer Proteine zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von allergischer Erkrankung, worin die Proteine aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt sind: einem Protein der folgenden Formel (I) mit der Aktivität der Stimulierung nichtspezifischer Immunglobulinproduktion: X-Y-Z (I)worin X für eine Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 1 oder 2 steht und Y und Z jeweils nicht vorhanden sind oder für eine Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 1 oder 2 stehen; einem rekombinanten Protein mit einer aus den Seq.-ID Nr. 1–15 ausgewählten Aminosäuresequenz; und einem rekombinanten Protein mit einer aus den Seq.-ID Nr. 1–15 ausgewählten Aminosäuresequenz, in der eine Aminosäure deletiert, substituiert oder hinzugefügt ist.
Verwendung nach Anspruch 3, worin die allergische Erkrankung aus der aus chronischer Bronchitis, atopischem Ekzem, Pollinosis (Rhinitis allergica), allergischer Angiitis, Heuschnupfen, allergischer Gastroenteritis, allergischer Hepatopathie, allergischer Zystitis und Purpura anaphylactoides bestehenden Gruppe ausgewählt ist.